KR20100015363A - 단백질 생산의 개선 - Google Patents

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모닐롤라 올라이오예
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Abstract

본 발명은 단백질 생산 및 세포 배양 기술 분야에 관한 것이다. CERT는 신규 생체내 PKD 기질로서 확인된다. PKD에 의한 세린 132에서의 인산화는 골지체 막에서 CERT의 이의 지질 표적 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트를 향한 친화성을 감소시키고 세라마이드 전이 활성을 저하시켜, PKD가 지질 항상성 조절인자임을 증명한다. 본 발명은 CERT가 결과적으로 PKD 활성화 및 원형질막으로 PKD 의존적인 단백질 화물 수송에 중요하다는 것을 입증한다. 따라서, PKD와 CERT의 상호의존성은 골지체 막 완전성 및 분비 수송의 유지에 중요하다.
단백질 생산 개선, CERT, PKD, 단백질 분비, 골지체

Description

단백질 생산의 개선{Improvement of protein production}
본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이다. 본 발명은 생물약제 제조를 위한 신규 발현 벡터 및 숙주 세포의 생성 방법 뿐만 아니라 단백질 생산 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제학적 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.
사람 치료에 사용되는 생물약제 시장은 계속 고속으로 성장하여 2003년에 270종의 새로운 생물약제가 임상연구로 평가되고 있고 추정 매상이 300억불이다(Werner, 2004). 생물약제는 다양한 숙주 세포계, 예컨대 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 사람 유래의 세포주를 비롯한 포유동물 세포 등으로부터 생산될 수 있다. 현재, 생물약제는 증가하는 수가 사람 단백질을 정확하게 처리하고 변형시키는 능력때문에 진핵생물 세포로부터 생산되고 있다. 따라서, 이러한 세포로부터 생물약제의 성공적이고 높은 수율의 생산은 중요하며, 이 방법에 사용된 재조합 모노클로날 세포주의 특징에 매우 의존적이다. 따라서, 고수율 방법의 기본으로서 높은 비생산성(specific productivity)으로 생산자 세포주를 배양하는 방법을 확립하고 개선된 성질의 새로운 숙주 세포계를 생성하는 것이 절실한 상황이다.
초기 시도들은 공정 디자인과 반응기 디자인에 초점을 맞추었다. 지금은 배지 포뮬레이션 개발과 숙주 세포의 유전자 조작에 의해 주요 개선이 유도되고 있다. 생물약제의 생산을 위한 가장 일반적인 산업용 포유동물 숙주 세포계는 무한증식화된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다(Wurm, 2004). 포유동물 생산 세포주를 개량하기 위한 초기 대사공학 전략은 무혈청 배지 중의 현탁액에서 성장하는 능력에 초점을 맞추었다. CHO-K1 세포에서 트랜스페린 및 인슐린 유사 성장인자 1(IGF-1)의 안정한 발현은 단백질제거된 조건 하에서 증식할 수 있는 세포주를 제공했다(Pak et al., 1996). 생산 세포주를 개량하기 위한 다른 시도들은 전사 핫스팟을 표적으로 하거나 생성하는 것을 목적으로 하는 형질감염 벡터 상에 조절 DNA 요소의 사용을 포함했다. 염색질 구조에 영향을 미치는 S/MAR(Scaffold/matrix-associated region) 및 하우스 키핑 유전자 유래의 UCOE(Ubiquitous chromatin opening element)와 같은 조절 인자들은 둘 모두 CHO 세포주로부터 생산된 재조합 단백질의 비생산성에 양성 효과를 미치는 것으로 밝혀졌다(Barnes and Dickson, 2006).
포유동물 세포배양 생산 과정에서 세포사멸의 주요 원인은 아폽토시스인 것으로 밝혀져 있는 바(al-Rubeai and Singh, 1998), 배양 생육성에 미치는 포유동물 숙주 세포 중의 항아폽토시스 유전자의 발현 효과는 철저하게 연구되었다. 대부분의 항아폽토시스 유전자조작 전략은 bcl-2 패밀리(예, bcl-1 또는 bcl-xL; (Kaufmann and Fussenegger, 2003)의 항아폽토시스 유전자의 과잉발현에 초점을 맞추고 있다. 발효 중의 아폽토시스 자극물, 예컨대 영양소 고갈 및 폐부산물 축적 등에 대한 세포 내성을 증가시키면, 아폽토시스 유전자조작된 세포주를 이용한 생산 공정은 연장된 배양 생육성과 일부 경우에 생산 수율의 증가를 보여주었다(Chiang and Sisk, 2005).
대부분의 생물약제 제품은 생산 공정동안 세포로부터 분비되는 단백질인 바, 생산 세포주의 분비 수송 기구는 신규 숙주 세포 유전자조작 전략에 대한 다른 흥미로운 표적이다.
단백질 분비는 복잡한 다단계 기전이다: 세포외 공간이나 외측 원형질막으로 수송될 운명인 단백질은 먼저 소포체 내로 공동해독(cotranslation)되면서 유입된다. 여기서, 지질 소포에 싸여 골지체로 수송되고, 마지막으로 트랜스골지 네트워크(trans-Golgi network(TGN))로부터 원형질막으로 수송되고, 이 원형질막에서 배양 배지로 방출된다(Seth et al., 2006).
임의의 생물약제 생산 공정의 수율은 주로 공정 조건 하에서 성장 시에 생산 세포가 시간당 분비하는 단백질 산물의 양에 의존적이다. 많은 복잡한 생화학 세포내 공정은 진핵생물 세포로부터 치료 단백질을 합성하고 분비하는데 필요한 것이다. 이러한 모든 단계들, 예컨대 전사, RNA 수송, 해독, 해독후 변형 및 단백질 수송은 야생형 숙주 세포주에서 엄격하게 조절되어, 이 숙주 유래의 임의의 생산자 세포주의 비생산성에 영향을 미칠 것이다.
많은 유전자조작 시도들은 분자 네트워크의 증대되는 이해를 이용하여, 전사 및 해독과 같은 공정을 단백질 생산에서 이들 단계들의 수율을 증가시키도록 유도한다. 하지만, 임의의 다단계 생산 공정에 관한 한, 공정의 초기 단계들 동안에 보 틀넥(bottle-neck)의 확대는 다시 하류에서, 특히 해독 후에 보틀넥을 산출시킬 가능성이 있다. 어떤 한계치까지는 생산 세포의 비생산성은 산물 유전자 전사의 수준과 선형의 상관성이 있는 것으로 보고된 바 있다(Barnes et al., 2007). 하지만, mRNA 수준에서 산물 발현의 추가 증강은 단백질 합성, 폴딩 또는 수송 기구의 과부하로 이어질 수 있고, 결과적으로 단백질 산물의 세포내 축적을 일으킬 수 있다. 사실상, 이것은 현행 제조 공정에서 흔히 관찰할 수 있는 것이다(도 1).
이러한 문제를 해결하고 진핵생물 세포로부터 단백질 산물의 분비를 효과적으로 개선시키기 위한 특정 목표가 정해진 유전자조작 시도는 현재 원형질막으로 단백질의 수송을 유도하는 복잡한 조절 네트워크의 이해 부족으로 인해 방해되었다.
분비형 치료 단백질의 세포내 수송을 유전자조작하는 것에 관한 최초의 연구는 결합 단백질 BiP/GRP78, 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)와 같은 분자 샤페론의 과잉발현을 중심으로 했다. 샤페론은 소포체(ER) 내에 거처하는 세포 단백질로서, 새로 합성된 단백질의 폴딩 및 어셈블리를 돕는다. 포유동물 세포에서 BiP 과잉발현은 예상된 것과 반대로, 연관된 단백질의 분비를 증가시키기 보다는 오히려 감소시키는 것으로 밝혀져 있다(Dorner and Kaufman, 1994). 이와 마찬가지로, CHO 세포에서 PDI 과잉발현은 TNFR:FC 융합 단백질의 발현을 감소시킨 반면(Davis et al., 2000), 항체의 비 생산 속도는 40% 증가시켰다(Borth et al., 2005). 세포의 단백질 폴딩능의 증가가 다시 하류의 생산 보틀넥을 생성한다는 상기 놀라운 발견에 대한 가능한 설명은, CHO 세포주에서의 IFN-감마 생산 시의 ER에서 시스-골지 수송 문제를 설명한 보고서(Hooker et al., 1999)에 의해 지지되고 있다.
포유동물 세포의 분비능을 증가시키기 위한 최근의 다른 시도는 전사 인자 X-박스 결합 단백질 1(XBP-1)의 이종유래의 과잉발현이다. XBP-1은 항체의 다량 생산 및 분비를 위해 최적화된 특별 세포형인 형질세포 분화의 주-조절인자 중 하나이다(Iwakoshi et al., 2003). XBP-1은 광범위한 분비 경로 유전자들의 프로모터들 내에 존재하는 소위 ER 스트레스 반응성 인자(ERSE)에 결합하여 상기 공정을 조절하고, 결과적으로 (i) ER의 물리적 팽창, (ii) 미토콘드리아 질량 및 기능의 증가, (iii) 세포 크기 확대 및 (iv) 총 단백질 합성의 증강을 초래한다(Shaffer et al., 2004).
최근, 비형질세포, 특히 생산세포주에서 XBP-1을 과잉발현시킴으로써 단백질 분비를 증가시키려는 시도가 개시되었다. CHO-K1 세포에서, 두 리포터 단백질(분비형 알칼리성 포스파타제(SEAP) 및 분비형 알파-아밀라제(SAMY))의 생산 수준이 CHO-K1 세포에서 XBP-1 도입 후에 증가하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, HEK293, HeLa 또는 HT-1080 세포와 같은 다른 세포주를 이용한 일시적 연구에서는 어떠한 효과도 증명되지 않았다(Tigges and Fussenegger, 2006). 에일러 에릭(Ailor Eric)에 의한 특허출원 WO2004111194는 고생산성 세포주의 생성에 있어서 XBP-1 또는 ATF6의 과잉발현을 주장한다.
주목할 점은, XBP-1이 형질세포 분화를 조절할 뿐만 아니라 미폴딩 단백질 반응(UPR)에서 중요한 역할을 한다는 것이다(Brewer and Hendershot, 2005). UPR은 소포체(ER)에서의 단백질 폴딩의 억제에 의해 활성화되는 복잡한 시그널 전달 네트 워크를 나타낸다. UPR은 이러한 스트레스 상황에 대한 적응 반응들, 예컨대 ER의 단백질 폴딩능을 증가시키는 ER 내재성 분자 샤페론 및 단백질 폴다제(foldase) 발현의 유도, 인지질 합성 유도, 일반 해독의 약화 및 ER의 미폴딩 단백질 부하량을 감소시키는 ER 관련된 분해의 상향조절 등을 조정한다. 심한 또는 연장된 ER 스트레스 시에, UPR은 궁극적으로 아폽토시스성 세포사멸을 유도한다(Schroder, 2006).
림프구에서 형질세포로의 성숙과 같은 말기 분화 과정은 세포가 자신의 증식능을 상실하고 말기 분화된 분비 세포를 생성시키는 아폽토시스 유사 프로그램으로 일반적으로 간주된다. 실제로, 다량의 단백질 분비를 위해 특별히 설계된 거의 모든 세포 종류(예, 선 세포, 췌장 베타 세포)는 말기 분화되어 증식할 수 없고 최종적으로 프로그램된 세포사멸을 겪기 전에 한정된 수명을 나타낸다(Chen-Kiang, 2003). 따라서, 형질세포 분화 및 UPR의 조절인자로서 XBP-1의 과잉발현은 증식을 억제하고/하거나 아폽토시스를 유도하는 고유의 성질때문에 잠재적으로 불리하다.
이를 종합해보면, 재조합 단백질 생산을 위한 숙주 세포의 분비능을 향상시키기 위한 방안은 여전히 필요하다. 이는 해독후 보틀넥 및 단백질 산물의 세포내 축적을 방지하기 위해 신규 전사 증강 기술 및 고역가 공정과 조합될 때 더욱 중요해질 것이다(도 1). 하지만, 현재 분비 수송 기구의 표적화된 조작에 대한 방법에는 2가지 주요 장애, 즉 기본 조절 기구에 대한 여전히 제한적인 지식 및 생산자 세포의 동반된 성장 억제성 또는 아폽토시스성 반응의 방지 필요성이 있다.
본 발명은 분비 단백질의 원형질막으로의 수송에 있어서 세라마이드(ceramide) 전이 단백질 CERT의 신규하고 놀라운 역할을 설명하고, 나아가 진핵 생물 세포로부터 분비 경로를 통해 수송되는 단백질의 생산을 효과적으로 향상시키는 방법을 제공한다.
CERT(굿파스처 항원결합 단백질이라고도 알려져 있다)는 소포체(ER)의 생산부위로부터, 스핑고미엘린(SM)으로의 전환이 일어나는 골지체 막으로 세라마이드의 비소포성 전달에 필수적인 세포질 단백질이다(Hanada et al., 2003).
CERT는 2가지 이소폼(isoform)이 존재한다: 하나는 26개 아미노산의 세린 풍부 영역이 결여된 더 많이 발현되고 선택적으로 스플라이싱된 형태(서열번호 10, 11)이고, 다른 하나는 CERTL(서열번호 12, 13)로 표시되는 전체 길이 624개 아미노산 단백질이다(Raya et al., 2000). CERT 이소폼은 둘 다 세라마이드 결합 및 수송에 필요하고 충분한 카르복시말단 스테로이드생성 급성 조절(StAR) 관련 지질 전이(START) 도메인을 보유한다(Hanada et al., 2003). START 도메인은 파리와 벌레부터 사람까지 매우 보존적이다(도 2). 이 도메인은 길이가 약 210개 아미노산이고 단량체성 지질을 수용하는 소수성 터널을 형성한다(Alpy and Tomasetto, 2005; Soccio and Breslow, 2003). START 도메인은 15종의 포유동물 단백질에서 발견되고, CERT는 막 사이의 포스파티딜콜린(PC)에 결합하고 셔틀링하는 포스파티딜콜린 전이 단백질 Pctp, 및 PC와 PE에 특이적인 지질 전이 단백질인 StarD10과 가장 밀접한 관련이 있다(Olayioye et al., 2005; Soccio and Breslow, 2003; Wirtz, 2006). START 도메인 외에도, CERT 단백질은 추가로 골지 국재화에 책임이 있는 PI(4)P에 대한 특이성을 가진 아미노말단 PH 도메인(Hanada et al., 2003; Levine and Munro, 2002) 및 ER 내재성 막관통 단백질 VAP-A 및 VAP-B와의 상호작용을 통 해 단백질을 ER로 표적화하는 FFAT 모티프(산성 트랙 중에 2개의 페닐알라닌)(Kawano et al., 0206; Loewen et al., 2003)를 함유한다.
지질 트래피킹(trafficking)에서 CERT의 기본 역할은 돌연변이 비기능성 CERT 단백질의 발현이 세라마이드 수송을 손상시켜 스핑고미엘린의 세포 수준을 감소시키는, 중국 햄스터 난소 세포주 LY-A에서 증명되었다(Hanada et al., 2003). 비소포성 지질 전이는 소위 막 접촉 부위(MCS)에서 일어나는 것으로 생각되며, 여기서 ER은 다른 소기관과 밀접하게 병치하게 된다(Levine and Loewen, 2006). 따라서, CERT는 ER과 골지체 막 사이에서 매우 짧은 거리를 셔틀하거나, 또는 동시에 두 구획과 접촉하고 있을 수도 있다. 과잉발현될 때, CERT의 START 도메인은 골지체로 세라마이드를 전이시키기에 충분하다(Kawano et al., 2006). 하지만, 생리학적 조건 하에서 골지와 ER 표적화 모티프는 둘 다 CERT 기능에 필요하다. LY-A 세포에서는 CERT가 그 PH 도메인(G67E) 내에 돌연변이를 함유하여, PI(4)P 결합성이 결손성인 단백질을 제공하는 것으로 확인되었다(Hanada et al., 2003). CERT 기능에 있어서 PI(4)P의 필요성은 PI4KIII-베타 활성이 골지로의 효과적인 세라마이드 트래피킹에 필수적이라는 최근 보고서(Toth et al., 2006)에 의해서도 지지되었고, 그 효소 활성은 단백질 키나제 D(PKD)에 의해 자극된다.
PKD는 세린-/트레오닌-특이적 단백질 키나제의 서브패밀리(PKD1/PKCμ, PKD2 및 PKD3/PKCυ를 포함한다)에 속하며, 최근에는 골지체 막에서 원형질막으로 단백질 수송을 조절하는데 매우 중요한 것으로 확인되었다((Rykx et al., 2003; Wang, 2006)에서 검토됨). TGN에서 PKD의 동원 및 활성화는 지질 디아실글리세롤(DAG; (Baron and Malhotra, 2002))에 의해 매개되고, DAG의 풀(pool)은 세라마이드와 포스파티딜콜린으로부터 스핑고미엘린 신타제에 의해 생성된다.
본 발명은 PH 도메인에 인접한 세린 132에서 PKD가 CERT를 인산화하고, 이로써 PI(4)P 결합, 골지 표적화 및 세라마이드 전이 활성이 음성적으로 조절된다는 것을 보여준다. 또한, DAG 생산에 필요한 세라마이드를 골지체 막으로 전이시켜, CERT는 PKD 활성을 자극하고, 이로써 구성적 분비 수송의 유지를 보장하는 조절 피드백-루프를 확립시킨다.
중요한 것은, 제시된 데이터가 여러 진핵생물 세포주(COS 7 및 HEK293)에서 CERT를 암호화하는 유전자의 도입을 통해 배양 배지 내로 이종 단백질의 분비를 크게 증강시킨다는 것을 보여준다는 점이다. 이러한 효과는 PKD에 의해 인산화될 수 없는 CERT 돌연변이체를 사용할 때 훨씬 더 현저하다. CERT 내에서 인산화 수용 부위의 결실은 CERT 상의 PKD의 음성적 조절을 중단시키지만, 스핑고미엘린 및 DAG로의 세라마이드 전환의 지지를 통해 PKD에 대한 CERT의 양성 피드백은 본래대로 남겨둔다. 따라서, 본 발명의 분비 증강 기전은 야생형 CERT뿐만 아니라, PKD의 음성적 영향으로부터 CERT를 떼어놓는 CERT의 모든 돌연변이체들, 예컨대 수용체 세린의 점 돌연변이, 이 잔기를 포함하는 결실 뿐만 아니라 CERT 내의 PKD 도킹(docking) 부위의 돌연변이 또는 결실 또는 심지어 START 도메인 단독에 의해서도 발휘될 수 있는 것으로 생각할 수 있다.
CERT는 지질 결합을 위한 START 도메인을 특징으로 하는 StAR 관련 지질 전이 단백질의 패밀리에 속한다(Soccio and Breslow, 2003). CERT의 START 도메인은 CERT 작용에 필요하면서 동시에 충분한 것으로 입증되어 있는 바(Hanada et al., 2003), 이 단백질 패밀리의 다른 구성원을 과잉발현할 때에도 똑같이 CERT의 분비 촉진 효과를 관찰할 수 있을 것이다. 이것은 특히 PCTP(서열번호 26, 27), CERT/GPBP 자체, StarD7 및 StarD10을 포함하는 PCTP 서브패밀리의 근연성이 있는 구성원인 경우에 가능성이 있다. 이 단백질들은 독특한 지질 결합 특이성을 나타내고, 이종 단백질의 분비에 관여하는 소기관의 기능에 똑같이 영향을 미칠 수 있다. 또한, ER 스트레스 시에 유도되는 관련 단백질 STARD4(서열번호 20, 21) 및 STARD5(서열번호 22, 23)의 발현은 생산 공정 동안 세포의 지질 전이의 증가된 요구를 만족시키는 기능을 할 수 있다.
파리, 벌레 및 마우스에서부터 사람에 이르기까지 진핵생물 기관 중에 START 도메인 단백질의 존재는 지질 트래피킹의 기본 기전이 진핵생물계 중에서 보존적임을 시사한다. 더욱이, 본 발명에 기술된 원리, 즉 CERT의 강화된 발현에 의한 분비 증가는 효모를 비롯한 모든 진핵생물 세포에 잘 적용될 수 있다.
이를 정리하면, 본 발명은 CERT, CERT 돌연변이체 또는 START 단백질 패밀리의 다른 구성원의 이종 발현에 의해 진핵생물 세포에 존재하는 단백질의 분비 수송을 증강시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 재조합 단백질 산물의 발현 및 제조를 위한 증강된 생산능을 보유하는 최적화된 숙주 세포계의 생성에 특히 유용하다.
본 발명에 기술된 방법은 여러가지 측면에서 유리하다:
첫째, 본 발명자들은 CERT의 이종 발현이 숙주 세포의 분비능을 증가시켜 재조합 단백질 생산을 증강시키는 전략인 것을 입증한다. 생산자 세포의 비생산성의 증강은 산업적 단백질 생산 공정에서 높은 산물 수율로 해석된다. 고역가 공정 및 더욱 복잡한 발현 증강 기술에 관한 현행 추세와 함께 해독후 보틀넥은 단백질 생산의 분명한 속도제한 단계가 될 것이며, 따라서 분비 조작 시도에 대한 관심 증가를 이끌어낼 것이다.
둘째, CERT의 START 도메인은 씨.엘레강스(C. elegans)에서부터 사람에 이르는 진핵생물에 매우 보존적이다. 이는 본 발명의 방법이 포유동물 숙주 세포계에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 곤충 세포 및 효모 세포를 비롯한 모든 진핵생물 세포에서 단백질 생산에 똑같이 적용할 수 있다는 것을 강력하게 시사한다.
세번째 중요한 특징으로서, 세포질 인자로서 CERT는 미폴딩 단백질 반응의 일부가 아니어서, 단백질 해독의 셧다운(shutdown)을 유도하고 해리되지 않으면 세포 주기 정지 또는 심지어 아폽토시스를 야기하는 세포 스트레스 반응 프로그램에 관여하지 않는다. 이에 반해, 지질 트래피킹에서는 독립된 역할을 수행함으로써 CERT 표적화는 아폽토시스의 동반 유도없이 증강된 단백질 분비를 부여할 수도 있다. 따라서, 생산자 숙주 세포에서 CERT의 과잉발현은 XBP-1을 기초로 한 유전자조작 시도보다 유리할 수도 있다.
넷째, 본 발명에서는 CERT의 Ser132의 돌연변이가 CERT를 음성적 조절 영향으로부터 유리시키는 PKD에 의한 CERT의 인산화를 방해한다는 것을 보여준다. 한편, DAG를 통한 CERT에 의한 PKD의 양성 자극은 본래 상태로 남아 있다(도 3A). 이러한 발견은 말기 분비 수송, 즉 트랜스-골지 네트워크에서부터 원형질막으로의 수송의 조절에 절대적으로 관여하는 것으로 공지된 바 있는(Liljedahl et al., 2001), PKD의 시그널링 경로 "상류(upstream)"에 CERT를 위치시킨다. 이것은 단백질 수송에 관한 한, CERT가 XBP-1 또는 특정 ER 내재성 단백질에 비해 조작에 바람직한 표적이 되게 하는 ER의 "하류"에서 작용한다는 것을 의미한다(도 3B).
CERT는 심지어 분비 경로의 최후 단계에서 영향을 미칠 수 있기 때문에, CERT의 이종 발현이 더 이상의 하류 보틀넥을 발생시킴이 없이 분비를 증강시키는 잠재성이 있다고 생각할 수 있다. 본 발명자들이 아는 한, CERT는 현재 이종 단백질 생산을 증강시키기 위해 분비 경로를 유전자 조작하기 위한 가장 하류에서 작용하는 표적이다.
이를 종합해보면, 성장 억제 또는 아폽토시스 유도 스트레스 반응과 불리한 연관없이, ER로부터 골지체로, 그리고 골지체로부터 원형질막으로의 분비 수송에 미치는 지질-전이 단백질 CERT의 영향은 진핵생물 세포의 분비능을 향상시키기 위한 목적의 유전자 조작 시도에 CERT, CERT 돌연변이체 및 다른 START 패밀리 단백질이 매우 바람직하고 유망한 표적이 되게 한다.
이용가능성
본 발명에 기술된 CERT의 표적화된 조작은 광범위한 용도들에 사용될 수 있다. 특히, 2가지 기본 시도가 구별될 수 있다: (i) 세포의 분비 수송능을 증가시키기 위한 CERT 또는 CERT 유도체의 과잉발현 및/또는 활성 증강, 또는 (ii) 암세포 증식 및/또는 침입을 감소시키기 위한 유전자요법의 수단으로서 CERT 활성 및/또는 발현의 감소.
CERT 과잉발현의 이용가능성
본 발명은 START 단백질 패밀리의 CERT, CERT 돌연변이체 또는 다른 단백질을 암호화하는 유전자를 도입시켜, 이종 단백질을 생산하는 개량된 진핵생물 숙주 세포를 제조하는 방법을 개시한다. 이는 진핵생물 세포를 기초로 한 생산 공정에서 단백질 수율을 증가시킬 수 있다. 이로써, 이러한 공정의 상품 비용이 줄어들고 동시에 치료 단백질의 연구 조사, 진단학, 임상 조사 또는 시장 공급에 필요한 물질을 제조하기 위해 생산되어야 하는 배치(batch)의 수가 감소할 것이다. 또한, 본 발명은 종종 임상전 조사를 위한 물질을 충분한 양으로 생산하는 것이 시각표를 고려한 중요한 작업 패키지인 경우에 약물 개발을 가속시킬 것이다.
본 발명은 판매용이거나 임상 개발 중인 치료 단백질을 제조하거나, 또는 진단 목적, 연구 목적(표적 확인, 선도물질 확인, 선도물질 최적화)으로 하나 또는 여러 특정 단백질을 생산하는데 사용되는 모든 진핵생물 세포의 성질을 증진시키는데 사용될 수 있다.
본 발명에 제시된 바와 같이, CERT의 이종 발현은 단백질 분비를 향상시킬 뿐만 아니라 세포 표면에 존재하는 막관통 단백질의 풍부함에도 영향을 미친다. CERT의 억제 또는 감소된 발현은 트랜스페린 수용체와 같은 세포 표면 수용체의 양을 급감시킨다(도 8). 분비형 및 막관통 단백질은 동일한 분비 경로를 공유하고 지질-소포에서 똑같이 수송되기 때문에, 상기 데이터는 막결합된 세포 표면 수용체의 수송뿐만 아니라 분비 변화에 있어서 CERT의 중요성을 강조한다.
따라서, 본 명세서에 기술된 방법은 세포 표면 수용체의 기능을 특성규명하는 것을 목적으로 하는 학문적 및 산업 연구 목적에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 당해 방법은 표면 단백질의 생산 및 후속 정제, 결정화 및/또는 분석에 사용될 수 있다. 이것은 세포 표면 수용체가 약물 표적의 주요 클래스인 바, 신규 사람 약물 요법의 개발에 매우 중요하다. 더욱이, 세포 표면 수용체와 결합되는 세포내 시그널링 복합체의 연구, 또는 동일 세포 또는 다른 세포 상의 대응 수용체와 가용성 성장인자의 상호작용에 의해 부분적으로 매개되는 세포-세포 소통(communication)의 분석에 유리할 수 있다.
CERT 감소/억제의 이용가능성
본 발명에서, 본 발명자들은 CERT 발현의 감소가 가용성 세포외 단백질의 분비 감소뿐만 아니라 세포 표면 수용체의 낮은 풍부함을 야기한다는 증거를 제공한다. 이는 CERT를 치료 처치의 매력적인 표적으로 만든다.
정상인 건강 세포로부터 암세포로의 전환을 나타내는 지표중 하나는 외인성 성장인자의 존재로부터의 독립성 획득이다(Hanahan and Weinberg, 2000). 정상 세포와 대조적으로, 종양 세포는 자신의 생존과 증식에 필요한 모든 성장인자를 스스로 생산할 수 있다. 이러한 자가분비 기전 외에도, 암세포는 종종 자신의 표면에서 성장인자 수용체의 상향조절된 발현을 나타내고, 이는 주위 조직의 세포로부터 분비되는 주변분비 작용성 성장 및 생존 인자를 향한 증가된 반응성을 야기한다. siRNA 시도의 사용 등에 의한 종양 세포의 CERT 표적화는 2가지 방식으로 자가분비 뿐만 아니라 주변분비 성장 자극 및/또는 생존 기전을 붕괴시키는 것이 가능할 수 있다: (i) 성장인자 수송 및 분비 감소에 의해, (ii) 종양 세포에 존재하는 대응 성장인자 수용체의 양을 감소시킴으로써. 이러한 2가지 방식에 의해, 성장 자극 시그널의 양과 이 시그널을 인지하고 시그널에 대해 반응하는 암세포의 능력이 감소될 것이다. 따라서, 암세포에서 CERT 발현의 억제는 암세포 증식과 생존을 방지하는 강력한 수단을 나타낼 것이다.
더욱이, CERT는 종양 침입과 전이를 억제하기 위한 강력한 치료 표적일 수 있다. 대부분의 사람 암 종류는 후기에 원시 종양이 낳은 개척(pioneer) 세포는 외부로 나가 인접 조직에 침입하고, 이 세포들이 전이라고 알려진 새로운 콜로니의 설립에 성공할 수 있는 떨어진 부위로 이동한다.
조직 침입의 전제조건으로서, 암세포는 주위 건강한 조직을 통해 기저막을 가로질러 혈류로 유입되고, 마침내 목표 조직으로 침입할 수 있게 하는 모든 프로테아제 세트를 발현한다. 이러한 프로테아제의 몇몇은 막결합 단백질로서 발현되고, 그 예로는 MT-MMP(Egeblad and Werb, 2002) 및 ADAM(Blobel, 2005)이 있다. 이 프로테아제들은 기질 리모델링(matrix remodelling), 성장인자의 발산 및 종양 침입에 중요한 역할을 하기 때문에, 프로테아제 자체가 암 치료법의 약물 표적으로서 논의되고 있다(Overall and Kleifeld, 2006). 본 발명자들은, 종양 세포의 CERT 발현 및/또는 활성의 억제가 표적 세포의 표면에 존재하는 막결합 프로테아제의 양을 감소시킬 것이라고 가정한다. 이것은 성장인자 발산능뿐만 아니라 종양 세포의 침입능도 감소시키거나 또는 심지어 손상시켜, 종양의 침입성 및 전이잠재성을 감소 시킨다. 따라서, CERT 표적화는 후기 종양형성, 특히 양성/고형 결절에서부터 공격성 전이 종양으로의 전환을 방지하는 신규 방법을 제공할 것이다.
치료적 적용을 위해 CERT의 활성 및/또는 발현을 감소 및/또는 억제하는 것이 목표이다. 이는 CERT 기능을 억제함으로써 질환을 치료하는 사람 치료제로서 사용되는 뉴클레오타이드 조성물에 의해 달성될 수 있으며, 이로 인해 약물은 CERT RNA의 서열 모티브를 결합시켜 CERT를 특이적으로 억제하는 RNAi, 및 siRNA 또는 안티센스 RNA를 포함한다. 또한, CERT 유전자의 프로모터에 결합하여 사일런싱시키는 뉴클레오타이드를 함유하는 약물 물질에 의해서도 CERT 활성/발현의 감소/억제가 달성될 수 있다.
또한, 약물 물질 또는 산물은 CERT 발현 또는 활성을 억제하는 새로운 화학적 실체 또는 펩타이드 또는 단백질을 함유할 수 있다. 단백질이 활성 약제학적 화합물인 경우에, 이 단백질은 (i) CERT 프로모터에 결합하여 CERT 발현을 억제하는 단백질, (ii) CERT 또는 PKD에 결합하여 PKD 및 CERT의 결합을 방지하고 PKD에 의한 CERT 인산화를 방해하는 단백질, (iii) CERT와 유사하지만 CERT 기능을 완전히 수행하지 않는 단백질, 즉 "우성-음성(dominant-negative)" CERT 변형체, 또는 (iv) CERT 및 PKD 모두의 스캐폴드로서 작용하여, PKD에 의한 CERT의 억제성 인산화로 인해 비기능성인 PKD에 대한 CERT의 비가역성 결합(=안정한 PKD/CERT 복합체) 및 이 복합체로부터 CERT의 해리 방해를 야기하는 단백질일 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 종래 기술로부터 자명하지 않다. 지금까지는 단백질 CERT에서 이용할 수 있는 유일한 실험 데이터가 소포체로부터 골지체로의 세라마이드의 수송에 스핑고미엘린의 전구체로서의 역할을 지적했다. 본 발명에 기술된 데이터는 단지 진핵생물 세포에서 골지체로부터 원형질막으로의 단백질 수송에서의 CERT의 역할에 대한 새로운 작업 모델을 야기한다. 종래 기술은 CERT 또는 START 도메인 단백질 패밀리의 다른 구성원을 암호화하는 유전자를 도입시킴으로써 진핵생물 세포주에서 단백질의 분비 수송 속도를 향상시킬 가능성에 대하여 어떠한 암시도 제공하지 않는다.
본 발명의 놀랍고 예상치못한 작업 모델은 골지 기능의 중요한 조절인자이며 신규 생체내 PKD 기질로서 CERT를 확인한다.
PKD는 종래 기술에 공지되어 있다. 이는 3가지 구조적 관련 구성원인 PKD1/PKCμ, PKD2 및 PKD3/PKCυ를 포함하는 세린/트레오닌 특이적 단백질 키나제 패밀리이다. PKD는 DAG에 결합하는 2개의 아미노말단 아연 핑거 유사 시스테인 풍부 모티프, PKD 효소적 기능을 음성적으로 조절하는 플렉스트린(pleckstrin) 상동성(PH) 도메인 및 카르복시말단 키나제 도메인을 함유한다.
3개의 PKD 이소폼(isoform)은 세포질, 핵, 골지체 및 원형질막에 국지화하여, 여기서 증식, 분화, 아폽토시스, 세포골격 재구성 및 전이에서부터 소포 트래피킹에 이르기까지 다양한 세포 과정을 조절한다((Rykx et al., 2003; Wang, 2006)에서 검토됨). 지금까지 알려진 생리학적 PKD 기질은 몇가지뿐이며, 그 예로 신경세포 단백질 Kidins220, Ras 작동인자 RIN1, 히스톤 데아세틸라제 5, E-카드헤린 및PI4KIIIβ를 포함한다(Iglesias et al., 2000; Jaggi et al., 2005; Vega et al., 2004; Wang et al., 2002). TGN에서 PKD는 세포 표면으로 가는 도중에 수송 운반체의 분열에 절대적으로 관여한다(Liljedahl et al., 2001; Yeaman et al., 2004). PKD는 이의 시스테인 풍부 영역에 의해 TGN으로 동원되고(Baron and Malhotra, 2002; Hausser et al., 2002; Maeda et al., 2001), 여기서 PKCc 매개의 인산화에 의해 활성화된다(az Anel and Malhotra, 2005).
최근, PI4KIIIa가 확인되었고, 이는 PKD 기질로서 골지체의 구조와 기능에 주요 역할자이다(Hausser et al., 2005). 세린 294에서의 PI4KIIIa의 PKD 매개 인산화는 PI4KIIIa의 지질 키나제 활성을 자극하고, 결과적으로 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트(PI(4)P) 생산 및 원형질막으로 수포성 구내염 바이러스 G-단백질 수송을 증강시킨다(Hausser et al., 2005).
단백질 키나제 D(PKD)는 트랜스-골지-네트워크(TGN)에서 분비 수송의 중요한 조절인자로서 확인되었다. TGN에서 PKD의 동원과 활성화는, 세라마이드와 포스파티딜콜린으로부터 스핑고미엘린 신타제에 의해 풀이 생성되는, 지질 디아실글리세롤(DAG)에 의해 매개된다. 소포체로부터 골지복합체로 세라마이드의 비소포성 전이는 지질 전이 단백질 CERT에 의해 매개된다. 이에 대한 설명은 예컨대 문헌[Hanada et al, 2003, Nature Vol 426, 803-809 및 Hanada 2006, Molecular and Cellular Biochemistry 286, 23-31], 및 대응 특허출원 WO2005004898 및 EP1652530에 기술되어 있다. 하지만, 이러한 서류들 중 어느 하나에서도, 하나다(Hanada)는 진단, 연구 또는 치료 목적으로 단백질을 생산하는 방법에 CERT 발현이나 활성(다른 START 도메인 단백질은 말할 것도 없다)을 변화시키는 암시를 지적하거나 나타낸 적이 없다. 또한, 이러한 서류/특허출원들에는 약제학적 조성물에 CERT 발현 또는 활성을 감소시키거나 완전히 차단시키는 차단제의 사용에 대해 설명된 것이 전혀 없다. 오히려 하나다는 세라마이드 수송을 촉진하는 약물로서 CERT 자체를 사용하고 있다.
그러나, 본 발명은 신규 생체내 PKD 기질로서의 CERT를 밝히고 있다. PKD에 의한 세린 132에서의 인산화는 골지체 막에 있는 지질 표적인 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트를 향한 CERT의 친화성을 감소시키고, 세라마이드 전이 활성을 저하시켜 PKD를 지질 항상성의 조절인자로서 확인시켜준다. 또한, 본 발명은 결과적으로 CERT가 PKD 활성화 및 원형질막으로 PKD 의존적 단백질 화물 수송에 중요하다는 것을 보여준다. 따라서 PKD와 CERT의 상호의존성은 골지체 막 완전성 및 분비 수송의 유지에 중요하다.
도 1: 세포내 산물 축적.
3가지 공정으로 증명한 유가식 발효 동안의 세포내 산물의 증가.
유가식 발효는 사람 IgG 항체를 발현하는 3가지 다른 CHO 생산자 세포 클론을 사용하여 수행했다: 각각 공정 A(원형), B(마름모형) 및 M(삼각형). 격일로 세포 샘플을 취하여 고정시킨 후, 항체 경쇄를 검출하기 위해 직접 면역형광법으로 처리했다. 산물의 양은 FACS로 측정하고 1일째 양과 비교해서 플로팅했다.
도 2: START 도메인 단백질 패밀리
(A) 사람 START 도메인 단백질, (B) 이들의 도메인 기구(4TM, 4개의 막관통; Pre, 미토콘드리아 전구서열; Thio, 아실-CoA 티오에스터라제) 및 (C) 이들의 파리와 벌레 동족체의 계통발생학적 어셈블리.(Soccio and Breslow, 2003에서 인용함).
도 3: CERT는 골지 기능의 중요한 조절인자이며 분비 경로에서 XBP-1의 하류에서 작용한다.
(A) CERT 및 PKD는 조절 피드백-루프로 연결된다. 이 모식도는 PKD가 DAG에 의해 활성화되고 CERT를 인산화한다는 현행 작동 가설을 요약한 것이다. 인산화된 CERT는 PI(4)P로부터 해리되어 목적지 부위에서 세라마이드를 방출시킨다. 골지에서 세라마이드는 최종적으로 PKD 활성화에 필요한 DAG와 스핑고미엘린으로 전환된다. 이 회로는 CERT 인산화 부위의 돌연변이(S132A)에 의해 중단될 수 있다.
(B) 이 모식도는 ER과 골지 구획을 통한 전사 및 해독에서부터 단백질이 최종적으로 세포에서 배지로 방출이 이루어지는 원형질막에 이르기까지의 분비 단백질의 행로를 도시한 것이다. 화살표는 단백질 생산을 향상시키는 것을 목적으로 하는 최근의 유전자공학 시도들을 나타낸다. 많은 노력들이 전사 증강 기술, 및 몇몇은 몇몇은 해독 유전자조작에 초점을 맞추었고, 현재는 ER 내에서 해독후 프로세싱에 관여하는 단백질(BiP, PDI 및 XBP-1)을 표적으로 하는 3가지 예만이 보고되어 있다. CERT는 분비 경로에서 ER의 하류에서 작용하며, 따라서 본 발명자들이 아는 한에 있어서 분비 공정의 후기에서 이루어지는 유전자조작에 대한 최초의 표적이 다.
도 4: CERT는 PKD 기질 항체에 의해 검출된다.
(A) HEK293T 세포는 Flag 표지화된 CERTL 및 CERT를 암호화하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포는 형질감염 후 24시간째 용해시키고 항-Flag 항체로 CERT 이소폼을 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 SDS-PAGE로 처리한 후, PKD 기질 항체로 면역블롯팅(pMOTIF; 상단 패널)하고, 이를 제거한 후 항-Flag 항체로 면역블롯팅했다(하단 패널).
(B) HEK293T 세포를 Flag-CERT 발현 플라스미드, GFP-PKD1 K612W(PKD-KD) 또는 공벡터(empty vector)로 형질감염시켰다. CERT는 (A)에서 기술한 바와 같이 웨스턴 블롯팅으로 분석했다. PKD-KD의 발현은 PKD 특이적 항체로 면역블롯팅하여 확인했다(C20; 하단 패널).
(C) COS7 세포는 Flag-CERT 및 PKD1-GFP 발현 플라스미드로 공동형질감염시키고, 고정시킨 뒤, Flag-특이적 항체로 염색했다(적색). 제시된 이미지는 여러 공초점 단면의 스택이다. 축척, 20㎛.
도 5: PKD는 세린 132에서 CERT를 인산화한다.
(A) PKD 기질 항체를 유발시키는데 사용된 펩타이드 서열의 정렬 및 CERT의 2개의 잠재적 PKD 모티프.
(B) HEK293T 세포는 Flag-태그화된 CERT 야생형(WT), CERT-S132A 및 CERT- S272A를 암호화하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 이 세포를 용해시키고, CERT 단백질을 도 4에서 기술한 바와 같이 면역침전시키고 웨스턴 블롯팅으로 분석했다.
(C) 재조합 GST-Flag-CERT 야생형(WT) 및 S132A 융합 단백질은 정제된 PKD1의 부재(-) 및 존재(+) 하에
Figure 112009060725036-PCT00001
를 함유하는 키나제 완충액에서 30분 동안 항온처리했다. 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고 막으로 전이시켰다. 방사성 포스페이트의 혼입은 PhosphoImager를 사용하여 분석하고(상단), 그 다음 CERT 단백질의 동량 부하를 확인하기 위해 Flag-특이적 항체로 면역블롯팅했다.
(D) 재조합 CERT 단백질은 비방사성 ATP의 존재 하에 (C)에 기술된 바와 같이 정제된 PKD1과 함께 시험관내 키나제로 처리했다. pMOTIF 항체로 면역블롯팅을 수행하고, 제거 후 Flag-특이적 항체로 면역블롯팅하여 CERT 단백질의 동량 부하를 확인했다. PKD1 및 CERT 단백질은 화살표로 표시했고; 별표가 표시된 밴드는 비특이적 결합으로 인한 것이다.
도 6: 세린 132에서의 CERT 인산화는 PI(4)P 결합 및 세라마이드 전이 활성을 변화시킨다.
HEK293T 세포를 GFP태그화된 CERT 야생형(WT, 서열번호 10, 12) 및 CERT-S132A(서열번호 14)를 암호화하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간째 저장성 용해로 세포를 수거하고 100,000xg로 원심분리하여 세포질 분획을 수거했다.
(A) 단백질-지질 오버레이 분석을 위해 동량의 GFP 형광을 함유하는 샘플을 사용했다. CERT 변형체를 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포 유래의 세포질을, 여러 포스포이노시타이드의 농도 구배가 점적된 막과 항온처리하고, 결합된 CERT 단백질을 GFP 태그를 통해 검출했다.
(B) TNPPE 및 피렌-세라마이드를 함유하는 공여체 리포좀을 10배 과량의 미표지된 수용체 리포좀과 혼합했다. 60초 후에 GFP-태그화된 CERT 야생형(WT), S132A 또는 GFP 단독(con)을 일시적으로 발현하는 세포 유래의 세포질을 첨가하고, 395nm에서 피렌 형광도를 기록했다(여기: 340nm). 스펙트럼은 트리톤 X-100의 최대 형광도 및 최대 GFP 형광도로 표준화했다.
도 7: CERT는 PKD 활성화 및 분비 수송을 조절한다.
(A) Flag 태그화된 CERT 야생형(서열번호 10, 12) 또는 CERT 돌연변이체 S132A(서열번호 14)로 형질감염된 HEK293T 세포 유래의 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯. 이 블롯은 인특이적 pS916 PKD 항체(상단 패널), PKD 특이적 항체(중간 패널) 및 Flag 특이적 항체(하단 패널)로 각각 탐침하여 Flag 태그화된 CERT 작제물의 발현을 확인했다.
(B) Flag-ss-HRP 및 공벡터(흑색 막대), PKD1-GFP 키나제 제거(KD, 백색 막대), Flag-CERT 야생형(WT, 음영 막대) 또는 Flag-CERT-S132A(암회색)로 공동형질감염된 HEK293T 세포의 상청액에서의 HRP 활성의 측정. 상대 광도(RLU)는 배지 변화 후에 표시된 시점에서 플로팅했다. 각 값들은 3반복 샘플의 평균에 해당한다, 오차 막대 = SEM.
(C) COS7 세포 중의 GFP-CERT(녹색) 및 시스/중간-골지 마커 GS28(적색)의 공초점 면역형광성. 제시된 이미지는 여러 공초점 단면의 스택이다. 축척, 20㎛.
(D) COS7 세포에서 GFP-CERT(녹색) 및 HRP-Flag(적색)의 공동국재화를 나타내는 공초점 이미지의 스택. 축척, 20㎛ 및 5㎛(확대).
도 8: RNA 간섭에 의한 CERT 하향조절은 분비 수송을 억제한다.
(A) 모의(백색), lacZ-(밝은 회색 = lacZ 특이적 siRNA 서열번호 9) 또는 CERT 특이적 siRNA 올리고뉴클레오타이드(암회색 = siCERT#1 서열번호 7 및 흑색 = siCERT#2 서열번호 8) 중 어느 하나로 처리된 COS7 세포의 상청액 중의 HRP 활성의 정량적 검출. 3반복 실험의 상대광도(RLU)를 제시했다, 오차 막대=SEM.
(B) 항-트랜스페린 수용체 항체로 탐침된 (A) 세포 용해물의 웨스턴 블롯. 동일 부하량은 항-튜불린 특이적 항체를 사용하여 확인했다.
도 9: START 도메인을 위한 컨센서스 용어
컨센서스는 이 컨센서스 서열에 부합하는 단백질의 수에 관하여 제시한 것으로, 부합하는 아미노산의 수에 관한 것이 아니다. 이것은 80% 컨센서스 서열에 있어서, 비교된 START 도메인 단백질의 80%가 특정 위치에서 주어진 아미노산, 예컨대 "h"로 약칭된 소수성 아미노산을 보유한다는 것을 의미한다.
이러한 컨센서스 서열은 WEB 기반 프로그램 "SMART"를 사용하여 생성되었 다(Ponting & Aravind, 1999, TIBS 24, pages 130-132 참조).
(A) START 도메인 단백질에 대해 80% 컨센서스 서열(서열번호 28).
(B) START 도메인 컨센서스 서열은 START 도메인 단백질의 아미노산 정렬로부터 유도되었다. 이 정렬은 50%, 65% 및 80% 컨센서스 서열을 포함한다.
이하 아미노산 그룹은 약어와 해당 클래스에 이해를 돕기 위한 것이다.
클래스 주요 잔기
알콜 o S,T
지방족 l I,L,V
임의 종류 . A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y
방향족 a F,H,W,Y
하전성 c D,E,H,K,R
소수성 h A,C,F,G,H,I,K,L,M,R,T,V,W,Y
음성 - D,E
극성 p C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T
양성 + H,K,R
작은 s A,C,D,G,N,P,S,T,V
아주 작은 u A,G,S
턴유사(turnlike) t A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T
도 10: CERT 도입은 모노클로날 항체 생산을 증가시킨다.
모의, CERT-WT 또는 돌연변이 CERT-SA의 발현 작제물은 사람 모노클로날 IgG형 항체를 분비하는 CHO 생산 세포주로 안정하게 도입시켰다. 그 다음, 이 안정한 클론 중에서 비 IgG 생산성에 미치는 도입유전자의 효과를 (A) 일련의 스톡 배양물에서, (B) 각 유전자형마다 n=3-4로, 도 11에서와 같은 유가식 생산 조건 하에 측정했다. 오차 막대는 표준편차를 나타낸다. 3회의 독립된 실험 중에서 대표적인 1가지 결과를 제시했다.
도 11: 이종 CERT는 HSA 분비를 증가시킨다.
(A) 일련의 배양물에서 증가된 역가 및 비생산성. 사람 혈청 알부민(HSA)을 분비하는 CHO 세포를 공 플라스미드(empty plasmid)("모의"), CERT 야생형(CERT-WT) 또는 CERT 돌연변이 S132A(CERT-SA)로 안정하게 형질감염시켰다. 수득되는 안정한 세포 수집물(유전자형당 n=3)로부터 HSA 역가를 3 내지 5회의 일련의 계대배양 동안 측정했다. HSA의 비생산성(흑색 막대) 및 역가(회색 막대)는 각 유전자형마다 계산하고 3개의 수집물의 평균값으로서 플롯팅했다. 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
(B) 및 (C). (A)의 세포를 진탕 플라스크에서 7일 동안 성장시키고 3일부터는 24시간마다 배지를 공급했다. 세포 배양액 샘플은 3일, 5일 및 7일째 채취하고, 재조합 HSA 산물의 역가 측정을 실시했다. 비생산성(B) 및 역가(C)를 계산하고 발효 시간에 대하여 플롯팅했다. 다음과 같은 세포를 비교했다: 모의(-□-), CERT-WT(-▲-) 및 CERT-SA 세포(-●-); 오차 막대는 유전자형마다 3개의 안정한 풀의 표 준편차를 나탄내다.
서열목록에 대한 설명
서열번호 1 : 사람 DNA CERT-S132A의 PCR 프라이머
서열번호 2 : 사람 DNA CERT-S132Arev의 PCR 프라이머
서열번호 3 : 사람 DNA CERT-S272A의 PCR 프라이머
서열번호 4 : 사람 DNA CERT-S272Arev의 PCR 프라이머
서열번호 5 : 사람 DNA CERT-138절두형의 PCR 프라이머
서열번호 6 : 사람 DNA CERT-138절두형rev의 PCR 프라이머
서열번호 7 : siRNA/DNA siCERT-1
서열번호 8 : siRNA/DNA siCERT-2
서열번호 9 : siRNA/DNA siLacZ
서열번호 10 : 사람: CERT cDNA
서열번호 11 : 사람: CERT 단백질
서열번호 12 : 사람: CERT L cDNA
서열번호 13 : 사람: CERT L 단백질
서열번호 14 : 사람: CERT S132A cDNA
서열번호 15 : 사람: CERT S132A 단백질
서열번호 16 : 사람: START 도메인 CERT cDNA
서열번호 17 : 사람: START 도메인 CERT 단백질
서열번호 18 : 사람: START 도메인 CERT L cDNA
서열번호 19 : 사람: START 도메인 CERT L 단백질
서열번호 20 : 사람: StarD4 cDNA
서열번호 21 : 사람: StarD4 단백질
서열번호 22 : 사람: StarD5 cDNA
서열번호 23 : 사람: StarD5 단백질
서열번호 24 : 사람: StarD6 cDNA
서열번호 25 : 사람: StarD6 단백질
서열번호 26 : 사람: PCTP cDNA
서열번호 27 : 사람: PCTP 단백질
서열번호 28 : START 도메인 컨센서스 서열(도 9)
인산화에 의한 단백질의 해독후 변형은 효소 활성을 조절하거나, 단백질-단백질 상호작용을 매개하거나, 세포하(subcellular) 국재화를 조절하는 일반 기전이다. PKD는 골지 복합체에서의 주요 조절인자이며, PI4KIIIβ는 지금까지 확인된 유일한 국소 기질이다. 골지 복합체에 국재성인 CERT 단백질이 PKD의 기질로서 작용할 수 있는지를 검사하기 위해, 본 발명자들은 PKD에 의해 인산화된 컨센서스 모티프에 대하여 유발된, pMOTIF라 불리는 인특이적 기질 항체를 이용했다(Doppler et al., 2005). HEK293T 세포는 Flag 태그화된 CERT 및 CERTL을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. CERT 이소폼은 Flag 특이적 항체로 면역침전시키고, pMOTIF 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 분석했다(도 4A). CERT의 분자량, 및 이보다 약하게 CERTL의 분자량에 대응하는 pMOTIF 시그널이 검출되었다(도 4A). 인산화된 CERTL 이소폼의 약한 검출은 키나제에 대한 포스포부위 접근성에 영향을 줄 수 있는, 응집체를 형성하는 공지된 작용과 관련이 있을 수 있다(Raya et al., 2000). pMOTIF 항체에 의한 CERT 인식이 PKD에 의존적인지를 조사하기 위해, HEK293T 세포에서 PKD1의 키나제 제거 변형체(K621W)와 함께 CERT를 발현시켰다. 이 돌연변이체는 골지 복합체에 국한되어 있는 것으로 관찰되었고 우성 음성 방식으로 PI4KIIIβ 인산화를 억제했다(Hausser et al., 2005). 불활성 PKD의 공동발현은 pMOTIF 항체에 의한 CERT의 검출을 폐지시켰고, 이는 pMOTIF 시그널이 실제로 PKD 매개의 CERT 인산화에 의한 것이었음을 시사한다(도 4B). 지질 전이 단백질은 PKD가 국재화되어 있는, ER과 TGN 사이에 형성되어 있는(Levine and Loewen, 2006), MCS에서 작용하는 것으로 생각된다. GFP 태그화된 PKD1과 공동발현된 COS7 세포 중의 Flag 태그화된 CERT의 면역형광 염색은 두 단백질이 골지 복합체에 공동국재화되어 있음을 증명했다(도 4C). RNA 간섭 실험은 CERT 인산화를 감소시키기 위해 PKD1과 PKD2의 동시 녹다운(knock-down)이 필요함을 시사했고, 이것은 이들 두 이소폼이 주로 CERT의 인산화에 책임이 있고 이에 반해 PKD3은 미미한 역할을 하는 것으로 보인다는 것을 시사한다(데이터는 미제시). 이는 종래 보고된 PKD1과 PKD2의 중복 기질 특이성과 일치한다. 예를 들어, PKD1과 PKD2는 둘 모두 PI4KIIIβ를 인산화하는 반면, PKD3은 그렇지 못한 것으로 밝혀졌다(Hausser et al., 2005).
CERT에서 pMOTIF 인식 부위를 확인하기 위해, 본 발명자들은 세린 또는 트레오닌에 대해 -5 위치에 있는 류신, 이소류신 또는 발린 잔기와 -3 위치에 있는 아르기닌을 특징으로 하는 잠재력이 있는 PKD 컨센서스 모티프를 조사했다. PKD 컨센서스 모티프와 부합하고 종 보존적인(도 5A) 위치 132와 272에 존재하는 2개의 세린은 부위 지시된 돌연변이유발을 이용하여 알라닌으로 교환시켰다. 이 돌연변이체를 HEK293T 세포에서 발현시키고 pMOTIF 항체에 의한 인식에 대해 검사했다. 흥미롭게도, 세린 132의 알라닌으로의 돌연변이는 pMOTIF 항체에 의한 CERT의 검출을 폐기시켰고, 인산화의 상실을 나타내는 전기영동적 이동성의 증가를 일으킨 반면, S272A 돌연변이는 pMOTIF 시그널에 영향을 미치지 않았다(도 5B). 이것은 세린 132가 PKD 기질 항체에 의해 특이적으로 인식되는 PKD 인산화 부위임을 시사했다. PKD가 CERT에서 상기 세린 잔기를 직접 인산화할 수 있는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 정제된 PKD1과 이 단백질의 처음 138개 아미노산을 함유하는 이.콜라이에서 생산된 재조합 CERT GST-융합 단백질을 가지고 시험관내 키나제 분석을 수행했다. 절두된 야생형 CERT 융합 단백질을 [γ-32P]-ATP의 존재 하에 PKD1과 항온처리했을 때 방사성의 혼입이 검출되었다(도 5C). 이것은 CERT-S132A 융합 단백질의 경우에는 상당히 약했다. 또한, 야생형의 시험관내 PKD 인산화는 pMOTIF 항체의 인식 부위를 발생시키는 것으로 밝혀졌으나, CERT-S132A는 그렇지 못했다(도 5D). 이를 종합해보면, 상기 결과들은 CERT가 시험관내 및 생체내에서 실제 PKD 기질임을 입증하며, CERT 중의 특이적 PKD 인산화 부위로서 세린 132를 확인시켜준다.
세린 132는 CERT PH 도메인에 매우 근접해 있고(아미노산 23-117), 이는 이 부위에서의 인산화가 국소적으로 음전하를 증가시켜 PI(4)P 결합에 영향을 미칠 수 있게 해준다. 따라서, 본 발명자들은 단백질-지질 오버레이 분석을 수행하여 야생형 CERT와 CERT-S132A 돌연변이체의 PI(4)P 결합을 정량분석했다. 여기서, CERT 변형체를 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포 유래의 세포질을, 여러 포스포이노시타이드의 구배 농도가 점적된 막과 항온처리하고, 결합된 CERT 단백질을 이들의 GFP 태그를 통해 검출했다. 종래 보고된 바와 같이, 전체 길이의 야생형 단백질은 여러 인지질 종에 대해 약한 결합을 나타냈지만, PI(4)P와는 강한 상호작용을 나타냈다(Hanada et al., 2003; Levine and Munro, 2002). PI(4)P에 대한 CERT-S132A 결합은 야생형 단백질에 비해 2 내지 4배 낮은 농도에서 검출할 수 있었으며, 이는 이 인지질에 대한 CERT-S132A 돌연변이체의 증가된 친화성을 시사한다(도 6A). 이를 종합하면, 상기 데이터들은 CERT가 일단 골지 복합체에 결합되면 PKD에 의해 인산화된다는 것을 시사한다. 이것은 그 다음 CERT의 PI(4)P에대한 친화성을 감소시키고, 이로써 골지체 막과 CERT의 상호작용을 조절한다.
CERT 단백질은 지질 전이 단백질로서 작용하는 것으로 밝혀져 있다(Hanada et al., 2003). 따라서, 본 발명자들은 세린 132에서의 CERT 인산화가 결합능에 영향을 미치고 막 간에 세라마이드를 전이시키는지를 조사했다. 이를 위해, 야생형 CERT 및 CERT-S132A의 GFP 태그화 형태들을 HEK239T 세포에서 일시적으로 발현시키고, 세포질 분획을 가지고 FRET 기반 분석을 이용하여 세라마이드 특이적 지질 전이 활성을 분석했다(도 6B). 이 분석에 형광 공여체로서 피렌 표지된 세라마이드를 함유하는 작은 단층 소포와 반응정지량의 헤드그룹-표지된 TNP-PE를 이용했다(Olayioye et al., 2005; Somerharju, 2002). 이러한 공여체 리포좀을 과량의 미표지된 수용체 리포좀과 혼합했을 때, 피렌 형광도의 증가는 무시할 정도였으며, 이는 수용체 막으로 세라마이드 전이가 최소의 자발적 전이임을 시사한다(데이터는 미제시). 야생형 CERT 함유 세포질을 첨가한 후에는 형광도의 안정된 증가가 관찰되었고, 이는 벡터-형질감염된 세포의 대조군 세포질을 사용했을 때에는 관찰되지 않았다(도 6B). 야생형 단백질과 비교했을 때, CERT-S132A는 피렌 형광도의 더욱 빠른 증가로 분명한 고속의 지질 전이를 나타냈다(도 6B). 이것은 세린 132에서의 CERT 인산화가 막과 단백질의 결합을 감소시켜 세라마이드 전이 활성을 하향조절한다는 것을 시사한다. 종래 데이터에서는 이미 PKD가 골지 복합체에서 PI4KIIIβ의 인산화 매개 활성화를 통해 PI(4)P의 수준을 조절한다는 것을 밝힌 바 있다(Hausser et al., 2005). 흥미롭게도, PI4KIIIβ는 ER과 골지 복합체 사이에서 세라마이드 수송에 중요하다(Toth et al., 2006). 따라서, 여기에 제시되는 데이터와 종합해보면, 골지체 막의 지질 항상성을 유지하는데 있어서 PKD의 이중 역할이 CERT의 결합속도(on-rate)(PI(4)P 수준을 통해) 및 해리속도(직접 인산화를 통해)를 조절함으로써 나타난다는 것이 분명해진다.
ER로부터 TGN으로 세라마이드의 전이는 이 구획에서 SM 합성에 필수적이다(Hanada et al., 2003). 골지에 국재성인 SM 신타제 1(SMS1)은 세라마이드와 PC를 이용하여 SM과 DAG를 생산하고(Perry and Ridgway, 2005), DAG는 PKD 동원과 활성화에 전제조건이다(Baron and Malhotra, 2002). TGN에서 DAG 생성을 차단하는 화합물은 TGN 세포막에 PKD가 결합하는 것을 억제하고 분비성 수송을 방해한다(Baron and Malhotra, 2002). 따라서, CERT의 과잉발현에 의한 ER에서 TGN으로의 증가된 세라마이드 전이가 상승된 국소 DAG 풀을 야기해야 하고 결과적으로 PKD 활성 및 분비 수송을 자극할 수 있을 것이다. 이러한 가설을 검사하기 위해, 본 발명자들은 HEK293T 세포에서 CERT 야생형과 CERT-S132A를 일시적으로 발현시켰고, 내인성 PKD의 자가인산화를 분석했다. 대조군과 비교했을 때, CERT 야생형과 CERT-S132A 모두의 발현은 인특이적 PKD 항체를 이용한 분석에 의해 나타나는 것처럼 PKD 활성을 증가시켰다(도 7A). 이는 PKD 활성화가 아마도 세라마이드 전달의 증가 및 SM/DAG 합성의 강화로 인하여 CERT 단백질에 의해 조절된다는 것을 보여준다. 이와 유사한 기능은 최근 골지체에서 CDP-콜린 경로의 조절을 통해 DAG 수준을 유지하는 지질 전이 단백질 Nir2에 대해서 기술된 바 있다(Litvak et al., 2005). Nir2의 RNAi 매개의 녹다운은 골지 복합체에서 DAG와 PKD의 수준을 감소시켰고 분비 수송을 차단시켰다. 흥미롭게도, 이러한 효과는 외인성 C6-세라마이드의 첨가에 의해 구제될 수 있으며(Litvak et al., 2005), 이는 골지 복합체에서 PKD 동원과 DAG 합성에 있어서 세라마이드의 중요한 역할을 시사한다.
CERT 매개의 PKD 활성화가 실제로 분비 수송의 증강으로 해석되는지의 의문을 해결하기 위해, 본 발명자들은 시그널 서열(ss)에 융합된 양고추냉이 퍼옥시다제를 암호화하는 플라스미드를 이용했다. 융합 단백질 ss-HRP는 구성적 단백질 분비의 리포터로서 사용될 수 있다(Bard et al., 2006). 대조군 세포에서, ss-HRP의 분비는 1시간 이내에 검출할 수 있었고 시간이 지날수록 증가했다(도 7B). 화물 단백질의 분비 수송을 억제하는 키나제 제거된 PKD1의 공동발현(Hausser et al., 2005; Liljedahl et al., 2001)은 상청액 내로 ss-HRP의 분비를 거의 완전하게 폐지시켰다. 이것은 HRP가 당해 분석에서 PKD 의존적 방식으로 분비되었음을 확인시켜주었다. CERT 야생형과 CERT-S132A의 공동발현은 분비 HRP의 양을 강력하게 증대시켰다(도 7B). 흥미롭게도, 본 발명자들은 CERT 야생형 단백질에 의해 관찰되는 것과 비교했을 때 CERT-S132A 돌연변이에 의한 분비가 약간만 증가한다는 것을 검출할 수 있었다. 이것은 CERT와 CERT-S132A에 의한 PKD의 비슷한 활성화에 따른 것이나(도 7A), CERT 돌연변이체의 유의적으로 증강된 시험관내 지질 전이 활성의 측면에서는 예상치 못한 것이었다(도 6B). 그러나, 세라마이드의 증가된 수준은 DAG 합성이 PC의 유용성과 SM 신타제의 활성에 의해 제한될 수 있기 때문에 반드시 동등한 DAG 증가로 해석할 수는 없다. 세라마이드의 축적은 골지체 막 안정성에 영향을 미치고 소포 분열을 유도하는 것으로 알려져 있다(Fukunaga et al., 2000; Weigert et al., 1999). 따라서, 본 발명자들은 CERT-S132A 돌연변이체의 과잉발현이 이의 국재화에 영향을 미치고/미치거나 골지체의 형태적 변화를 유발하는지를 조사했다. CERT는 시스/중간 골지 마커 GS28과 공동국재화하는 것으로 증명되어 있다(Hanada et al., 2003). COS7 세포에서 발현된 GFP 태그화된 CERT의 면역형광분석은 이 단백질이 GS28 양성 골지 영역에 국재화되어 있음을 보여주었다(도 7C). 이에 반해, 골지 복합체에서 GS28과의 부분 공동국재화 외에도, CERT-S132A 돌연변이체 단백질은 분산된 반점 염색을 나타냈다. 특히, 이러한 소포 구조들의 일부는 화물 단백질 ss-HRP를 함유하는 것으로 발견되었고, 이는 이들 구조가 사실상 골지 유래의 수송 운반체라는 증거를 제공한다(도 7D). 이러한 발견은 세라마이드 수준의 국소 증가로 인한 골지체 막 구조의 관찰된 변화와 일치하는 것이다(Fukunaga et al., 2000; Weigert et al., 1999).
결론적으로, 본 발명자들은 PKD 기질로서 CERT를 확인했고 막 지질 생물발생과 단백질 분비간에 새로운 관계에 대한 증거를 제공한다. 본 발명자들은 CERT가 골지체 막에서 PKD 활성인자 DAG의 합성을 위한 기질로서 세라마이드를 제공하여 소포성 수송 과정에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 이 시스템이 음성 피드백 루프에 의해 엄격하게 조절된다는 것을 증명한다: 활성 PKD는 세린 132에서 CERT를 인산화하여, CERT의 지질 표적인 PI(4)P를 향한 CERT의 친화성을 감소시켜 ER에서 골지 구획으로의 지질 전이가 연속해서 순환하도록 한다.
본 발명의 데이터는 CERT의 과잉발현이 단백질 분비를 증강시킨다는 것을 분명하게 증명한다. 또한, 그 반대도 사실인지를 조사하기 위해, 즉 CERT 발현 감소가 분비 감소를 초래하는지를 조사하기 위해 siRNA 실험을 수행했다. HRP의 활성은 3시간 후에 검출되었고 두 대조군 세포에서 동등한 유사 수준을 나타냈다. 이에 반해, 임의의 CERT 특이적 siRNA 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서는 HRP 활성의 급감이 측정되었다(도 8). 이것은 감소된 CERT 수준이 세포로부터 HRP 분비 감소로 이어지고, 나아가 분비 수송에 있어서 CERT의 중요 역할을 강조하는 것임을 시사한다.
흥미롭게도, CERT 감소는 단백질 분비뿐만 아니라 막관통 단백질 트랜스페린 수용체의 풍부함에도 영향을 미쳤다(도 8B). 도 8A의 세포를 모아서 용해물을 웨스턴 블롯 실험으로 트랜스페린 수용체 특이적 항체로 탐침했을 때, 트랜스페린 수용체 양은 분명하게 급감한 반면, 트랜스페린 수용체는 유사한 수준이 두 대조군 세포에서 검출되었다. 이러한 발견은 지질 전이 단백질 CERT가 분비 단백질뿐만 아니라 막 지지성(membran-standing) 세포 표면 단백질의 수송에도 관련되어 있음을 시사한다. 이것은 상기 두 종류의 단백질이 지질 소포에서 ER로부터 골지를 통해 원형질막으로 동일하게 수송되어, 본 발명에서 최초로 증명하는 바와 같이 CERT가 영향을 미치는 동일한 세포 유출 경로를 이용하는 바, 놀랍지 않을 수 있다.
이러한 발견과 이에 따른 본 발명에 기술된 골지 복합체로부터 원형질막으로 분비 단백질 수송을 조절하기 위한 신규 모델은 생물약제학 단백질 제조에 적용할 수 있다. CERT의 과잉발현은 항체, 사이토카인, 성장인자(예컨대, 에리트로포이에틴 또는 인슐린), 표면 수용체(예, 상피성장인자) 및 막결합 프로테아제와 같은 다양한 단백질의 생물약제학적 단백질 생산을 증가시킨다.
본 발명에 기술된 방법은 모든 단백질 생산 공정에 보편적으로 적용될 수 있지만, 생산되는 단백질 양의 증가로 평가되는 이 전략의 성공도는 관심 단백질의 특성에 따라 확실하게 달라질 수 있다. CHO 또는 다른 생산자 세포는 CERT, StarD4 또는 StarD5 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체와 같은 START 도메인 단백질을 암호화하는 발현 작제물로 형질감염된다. 특히, 최고의 역가는 인산화할 수 없는 CERT 돌연변이 S132A를 발현하는 세포에서 검출된다. CHO 세포에서 CERT 및 특히 돌연변이 CERT의 이종 발현은 일시적 형질감염 수준에서 모노클로날 항체 등의 단백질 분비를 향상시킬 수 있다. 이것은 약제학적 연구 및 개발에 필요한 약물 후보 또는 약물 표적을 소량으로 신속하게 생산하는데 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 생산자 세포주는 앞에서와 같은 동일한 DNA 작제물로 형질감염되고, 이어서 선택되어 안정한 세포 풀을 수득한다. 선택 절차에 이어 6회의 세포 배양 계대를 위해, 배양 상청액을 수집하여 관심 단백질의 함량을 분석한다. 모노클로날 항체인 경우에, 단백질 산물의 농도는 ELISA로 측정하고 평균세포수로 나누어 비생산성을 계산한다. 역시 최고의 값은 CERT 돌연변이체를 보유하는 세포 풀에서 관찰된다. START 도메인 작제물을 함유하는 세포에서 관심 단백질의 발현은 모의 또는 미형질감염된 세포에 비해 유의적으로 향상된다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, START 도메인 단백질의 과잉발현은 안정하게 형질감염된 CHO 세포주뿐만 아니라 일시적으로 항체, 단일 세포 단백질 및 표면 수용체의 향상된 발현을 야기하는데, 이는 START 도메인 단백질, 예컨대 CERT 또는 StarD4 및 StarD5가 발효 조건 하에서 세포의 특이적 생산능을 향상시킬 수 있음을 시사한다.
정의
"포함하는" 또는 "포함한" 일반 양태는 "~로 이루어진" 더욱 구체적 양태를 포괄하는 것이다. 게다가, 단수 및 복수 형태는 제한 방식으로 사용되지 않는다.
본 발명의 과정에서 사용된 용어는 다음과 같은 의미이다:
"START 도메인"이란 용어는 스테로이드생성 급성 조절 단백질(StAR) 관련 지질 전이(START) 도메인을 나타낸다. 약 200 내지 210개 아미노산의 이 도메인은 처음에는 지질 결합 도메인으로서 확인되었다(Soccio and Breslow, 2003; Tsujishita and Hurley, 2000). START 도메인의 길이는 START 도메인 패밀리 구성원에 따라서 116개 내지 250개 아미노산, 또는 180개 내지 223개 아미노산, 또는 더욱 구체적으로 219개 내지 223개 아미노산 사이일 수 있다. START 도메인 구조의 가장 놀라운 특징은 콜레스테롤과 같이 큰 친지성 화합물의 단일 분자를 결합시키는데 사용되는 단백질의 거의 전길이에 걸쳐 뻗어 있는 주로 소수성인 터널이다. START 도메인 패밀리 구성원 MLN64-START의 구조 분석은 9 가닥의 꼬인 역평행 β시트와 4개의 α-나선구조로 이루어진 α/β형 구조를 나타냈다(Tsujishita and Hurley, 2000). 다양한 진핵생물 단백질에서 발견되는 도메인은 '전형적인 START 도메인'(CSD)이라 불리는 반면, 식물에 특이적인 유사 도메인은 Birch 알레르기항원 START 도메인(BA-START)으로 알려져 있다.
"CERT"란 용어는 2가지 스플라이스 형태, 즉 CERT:CERT(서열번호 11) 및 CERT:CERTL(서열번호 13)을 포함한다. 또한, "CERT"란 용어는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열에서 유래되는 CERT의 임의의 다른 가능한 스플라이스 형태도 포함한다.
"CERT"란 용어는 또한 hCERT 단백질 및 이의 재조합체, hCERT, hCERTA, PH 단백질, hCERT A MR 단백질 및 hCERTA ST단백질, 및 추가로 PHhCERT 단백질, MRhCERT 단백질 및 SThCERT 단백질도 포함한다(EP1652530, (Hanada, 2006), (Hanada et al., 2003)도 참조).
"유도체"란 용어는 일반적으로 본 발명의 계획된 용도를 실현하기에 적합한 서열, 즉 세포에서 분비 수송의 증가를 매개하는 서열을 포함한다. 본 발명에 사용된 "유도체"란 용어는 원 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 70% 서열 동일성이 있는 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자를 의미한다. 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자는 원 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 80% 서열 동일성인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자는 원 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 90% 서열 동일성인 것이다. 폴리펩타이드 분자 또는 핵산 분자는 원 서열과 동일하거나 유사한 효과를 나타내고 원 서열 또는 이의 상보성 서열과 적어도 95% 서열 동일성인 것이 가장 바람직하다.
서열 차이는 다른 유기체 유래의 상동성 서열 중의 차이에 근거한 것일 수 있다. 또한, 서열 차이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환, 삽입 또는 결실에 의한 서열의 표적화된 변형에 근거할 수도 있다. 결실, 삽입 또는 치환은 부위 특이적 돌연변이유발 및/또는 PCR 기반의 돌연변이유발 기술에 의해 생성될 수 있다. 해당 방법은 문헌 Lottspeich and Zorbas, 1998, 챕터 36.1과 추가 참고문헌들에 기술되어 있다. 참조 서열(본 발명에서, 예컨대 START 도메인 서열번호 16, 17 또는 18, 19)의 서열 동일성은 예컨대 표준 "정렬" 알고리듬, 예를 들어 "BLAST"((Altschul et al., 1990); (Madden et al., 1996); (Zhang and Madden, 1997))를 사용하여 측정할 수 있다. 서열은 그 서열들이 함께 일치할 때 정렬되고, 표준 "정렬" 알고리듬의 도움으로 동일함을 증명할 수 있다.
또한, 본 발명에서 "유도체"란 용어는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26에 하이브리드화하거나, 이의 단편이나 유도체와 또는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26에 상보성인 서열과 하이브리드화하는 핵산 분자를 의미한다. 하이브리드화는 엄중한 하이브리드화 및 세척 조건(예컨대, 5x SSC 함유 완충액에서 65℃에서 하이브리드화; 0.2x SSC/0.1% SDS를 사용하여 42℃에서 세척)을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 해당 기술은 문헌 Ausubel et al., 2002 에 예시되어 있다.
또한, "유도체"란 용어는 단백질 결실 돌연변이체, 인산화 돌연변이체, 특히 세린, 트레오닌 또는 타이로신 위치에서의 돌연변이체, PKD 결합 부위의 결실 또는 CERT Ser132A 돌연변이를 의미한다.
"활성"이란 용어는 세포 내에서 또는 시험관내 분석에서 단백질의 생물학적 기능을 나타내고 정량분석한다.
"활성"을 측정하는 방법의 예는 막 유래의 세라마이드 방출 촉진 활성을 검출하는 특허출원 EP 1652530(Hanada et al.)에 기술되어 있다. 세라마이드를 함유하는 지질 막은 난황에서 유래되는 4:1 비율의 포스파티딜콜린과 포스파티딜에탄올아민으로 이루어진 혼합 지질을 기준으로, [팔미토일-1-I4C] N-팔미토일-D-에리트로-스핑고신(이하, I4C-세라마이드라 지칭하기도 한다) 샘플당 1.25nCi(225pmol)를 함유하도록 제조해야 한다. 따라서, 세라마이드의 농도는 2.5mg/ml이다. 활성 측정 샘플 하나당 상기 지질막은 20pL의 양이 필요하다. 활성 측정에 필요한 지질 양을 에펜도르프 튜브에 분배한 후, 질소 기체를 분무하여 건조해야 한다. 그 후, 건조된 지질막에 완충액 1[50mM NaCl 및 1mM EDTA가 첨가된 20mM Hepes-NaOH 완충액(pH 7.4)]을 농도가 2.5mg/ml가 되도록 첨가해야 한다. 완만한 초음파 처리는 배쓰형 초음파 발생기[Model 221 0, Branson, Co., Ltd. 제품]를 사용하여 수행해야 한다. 초음파 처리는 25℃에서 3분 동안 수행해야 한다. 그 다음 샘플은 30초동안 혼합(볼텍스)해야 하고, 다시 초음파 처리를 3분간 반복한다. 이런 방식으로 제조된 지질막은 세라마이드 방출 분석에 사용한다. 지질막의 세라마이드 방출 반응과 이의 검출은 다음과 같이 수행한다: CERT 단백질 또는 이의 재조합 단백질(표준 조건 하에서, 공여체 막에 함유된 세라마이드의 2배 몰 당량인 450 피코몰에 해당하는 단백질의 양을 사용했다)을 완충액 2[100mM NaCl 및 0.5mM EDTA가 첨가된 50mM Hepes-NaOH 완충액(pH 7.4)]를 사용하여 30pL 이하로 혼합한다. 여기서, 반응은 세라마이드 함유 지질막 20pL를 첨가하여 개시시킨다. 인지질의 최종 농도는 1mg/ml이다. 세라마이드는 총 인지질 양 대비 약 0.3%의 비율로 함유되어 있다. 이 혼합물을 37℃에서 30분 동안 항온처리한 후, 50,000xg에서 30분 동안 원심분리하고, 지질막을 침전시켰다. 이.콜라이 유래의 CERT 단백질이 사용된 경우에는 상기 단백질의 대부분은 상기 원심분리 조건 하에서 상청액에 남아 있는다. 따라서, 이 CERT 단백질에 14C-세라마이드가 결합할 때, 세라마이드는 지질 막에서 방출하여 상청액 분획으로 전이된다. CERT에 의한 세라마이드 방출의 촉진 활성은 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 상청액 분획의 1%의 방사성 활성을 측정하여 계산한다.
"활성"을 측정하는 또 다른 가능성은 CERT를 함유하는 세포 용해물이나 재조합 물질을 이용하는 시험관내 세라마이드 전이 분석이다. 여기서, SUV 간에 세라마이드의 단백질 매개 전이는 종래 기술된 바와 같이 측정한다(Olayioye et al., 2005). 이 전이 분석 혼합물은 돼지 뇌 지질(Avanti Polar Lipids), 피렌 표지된 C16-세라마이드 및 2,4,6-트리니트로페닐포스파티딜에탄올아민(TNP-PE)(88.6:0.4:11 mol%)으로 구성되고 피.소머하주(P.Somerharju)가 제공한 공여체 소포(2nmol 지질/ml) 및 돼지 뇌 지질로 구성된 10배 과량의 수용체 소포를 함유했다. 형광 강도는 GFP 태그화된 CERT 야생형과 S132A 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포 유래의 75㎍ 세포질을 첨가하기 전과 후에 395nm(여기 345nm; 슬릿 폭, 4nm)에서 기록한다(상기 참조). 형광 강도는 (i) Triton X-100(0.5% 최종 농도)을 첨가한 후 수득되는 최대 강도 및 (ii) 최대 GFP 형광에 대해 표준화하여, 여러 단백질 발현 수준을 나타낸다.
"활성"을 측정하는 또 다른 가능성은 항포스포 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 등에 의한 CERT S132A의 인산화 상태 분석이다. 전세포 추출물은 세포를 NP40 추출 완충액(NEB)[50mM Tris(pH7.5), 150mM NaCl, 1% NP40, 1mM 소듐 오르토바나데이트, 10mM 플루오르화나트륨 및 20mM β-글리세로포스페이트 + 완전 프로테아제 억제제]에 용해시켜 수득한다. 용해물은 16,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 정화한다. 전세포 추출물 또는 면역침전된 단백질은 샘플 완충액에서 비등처리하고 SDS-PAGE로 처리한다. 단백질은 폴리비닐리딘 디플루오라이드 막(Roth) 위에 블롯팅한다. 필터는 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 중의 0.5% 블로킹 시약(Roche)으로 차단시킨 후, PKD에 의해 인산화된 컨센서스 모티프에 대하여 유발된, pMOTIF라 불리는 인특이적 기질 항체와 같은 인특이적 항체로 탐침한다(Doppler et al., 2005). 단백질은 강화 화학발광 검출 시스템(Pierce)을 사용하여 퍼옥시다제 결합된 2차 항체로 가시화한다.
"활성"을 측정하는 또 다른 분석법은 모델 단백질, 항체 또는 관심 단백질 등에 대한 분비 분석이다. 세포는 ss-HRP-Flag 플라스미드와 공벡터, pEGFP-N1-PKD1KD 및 CERT를 암호화하는 플라스미드, 임의의 START 패밀리 단백질의 CERT 변형체를 각각 1:6.5의 비율로 사용하여 공동형질감염시킨다. 24시간 형질감염후 세포는 무혈청 배지로 세척하고 ECL 시약과 정화된 세포 상청액을 항온처리하여 0시간, 1시간, 3시간 및 6시간 후에 정량분석한다. 측정은 루미노미터(Lucy2, Anthos)를 사용하여 450nm에서 수행한다.
"활성"을 측정하는 또 다른 방식은 Bodipy-표지된 C5-세라마이드와 같은 형광 세라마이드 유사체를 이용하여 완전 세포에서 추적 실험을 수행하고 골지복합체 내에 단백질의 축적을 측정한다.
골지와 ER 간에 BODIPY® FL C5-세라마이드 분포의 정량:
형광 세라마이드의 수송은 획득 후에 Metamorph 소프트웨어의 라인스캔 기능을 사용하여 정량분석했다. 라인은 여러 시점에서 촬영한 공초점 사진에서 세포를 통해 작도하고, 형광 강도는 세포의 세포질 내 및 골지 복합체 전체에서 측정했다. "흡수비"는 골지에서 측정된 형광 강도를 세포질에서 측정된 강도로 나누어 계산했다. 최대 흡수비는 37℃에서 25분 항온배양한 후 대조군 세포에서 측정했고, 이 값을 100%로 정했다. 정량화는 공초점 사진을 20회의 다른 시점에서 촬영하고 각 시점에서 7개의 세포를 분석한 3회의 독립 실험의 데이터로부터 이루어졌다.
"생산성" 또는 "비생산성"이란 용어는 일정한 수의 세포에 의해서 일정한 시간 내에 생산된 특정 단백질의 양을 나타낸다. 따라서, 비생산성은 관심 단백질을 발현/합성/생산하는 세포의 역량에 대한 정량적 척도이다. 산업상의 제조 상황에서, 비생산성은 일반적으로 1일마다 세포당 생산되는 피코그램의 단백질 양으로 표현된다('pg/세포*일' 또는 'pcd'). 분비 단백질의 "비생산성"을 측정하는 1가지 방법은 효소면역측정법(ELISA)으로 배양 배지로 분비된 관심 단백질의 양을 정량적으로 측정하는 것이다. 이 목적을 위해, 세포는 새로운 배양 배지에 일정한 밀도로 접종한다. 일정 시간, 예컨대 24시간, 48시간 또는 72시간 후, 세포 배양액 샘플을 취해서 ELISA 측정을 수행하여 관심 단백질의 역가를 결정한다. 비생산성은 역가를 평균 세포수와 시간으로 나누어 결정할 수 있다.
세포의 "비생산성"을 측정하는 방법의 다른 예는 균질 시간차 형광(HTRF®) 분석에 의해 제공된다.
또한, 세포내 단백질, 막결합 단백질 또는 막관통 단백질에 대한 세포의 "생산성"은 웨스턴 블롯팅으로 검출하고 정량분석할 수 있다. 세포는 먼저 세척하고, 이어서 Triton-X, NP-40 또는 SDS와 같은 세정제 또는 고염 농도 중 어느 하나를 함유하는 완충액에서 용해한다. 세포 용해물 내의 단백질은 SDS-PAGE로 크기별로 분리하고, 나일론 막으로 전이시킨 다음, 특정 항체를 이용하여 관심 단백질을 검출하고 가시화한다.
세포의 "비생산성"을 측정하는 또 다른 방법은 관심 단백질에 대해 유발된 형광 표지된 항체로 관심 단백질을 면역학적으로 검출하고 흐름세포측정기에서 형광 시그널을 정량분석하는 것이다. 세포내 단백질인 경우에는 먼저 세포를 파라포름알데하이드 완충액 등에 고정시키고, 검출 항체가 세포로 침투하도록 투과화한다. 세포 표면 단백질은 사전 고정이나 투과화의 필요없이 생세포에서 정량분석될 수 있다.
세포의 "생산성"은 또한 관심 단백질과 융합 단백질로서, 또는 관심 단백질과 동일한 mRNA로부터 2중, 3중 또는 다중 발현 유닛의 일부로서 발현되는 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 리포터 단백질의 발현을 측정하여 간접적으로 측정할 수도 있다.
"생산성의 증강/증가"란 용어는 세포의 비생산성을 증가/증강시키는 방법을 포함한다. 비생산성은 각 대조군 세포에 비해 연구 중인 세포에서 생산성이 더 높고 이러한 차이가 통계적으로 유의하다면 증가 또는 증강된 것이다. 연구 중인 세포는 처리된 세포, 형질감염된 세포 또는 유전자 변형 세포의 이종 집단 또는 클론성 세포주일 수 있고; 미처리, 미형질감염 또는 미변형된 세포는 대조군 세포로서 제공될 수 있다.
본 발명에 사용된 "저해제" 또는 "억제제"란 용어는 CERT와 같은 START 도메인 단백질의 발현이나 활성을 저해하거나 억제하는 작용을 하는 임의의 분자를 의미한다. 이 용어는 작은 화학적 화합물, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA 또는 siRNA와 같은 핵산, CERT 전사 및 해독을 차단하는 단백질 및 단일쇄 항체 뿐만 아니라 CERT와 같은 START 도메인 단백질의 지질 결합을 방해하는 펩타이드 또는 단백질을 포함한다.
본 발명의 목적에서 "숙주 세포"는 햄스터 세포와 같은 세포, 바람직하게는 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44 세포 또는 이러한 임의의 세포주의 유도체/자손이다. 특히, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21이 바람직하고, CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 더욱 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에서, 숙주 세포는 쥐 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포 또는 이러한 임의의 세포주의 유도체/자손을 의미한다. 본 발명의 목적에서 사용될 수 있는 쥐 및 햄스터 세포의 예는 이하 표 1에 정리했다. 하지만, 이러한 세포들의 유도체/자손, 다른 포유동물 세포, 예컨대 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주(이에 국한되지 않는다), 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모, 곤충 및 식물 세포(이에 국한되지 않는다)도 본 발명의 목적에, 특히 생물약제학적 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
진핵생물 생산세포주
세포주 주문번호
NS0 ECACC No. 85110503
Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-1581
BHK21 ATCC CCL-10
BHK TK- ECACC No. 85011423
HaK ATCC CCL-15
2254-62.2 (BHK-21 유도체) ATCC CRL-8544
CHO ECACC No. 8505302
CHO 야생형 ECACC 00102307
CHO-K1 ATCC CCL-61
CHO-DUKX (= CHO duk-, CHO/dhfr-) ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B11 ATCC CRL-9010
CHO-DG44 (Urlaub et al., 1983)
CHO Pro-5 ATCC CRL-1781
V79 ATCC CCC-93
B14AF28-G3 ATCC CCL-14
HEK 293 ATCC CRL-1573
COS-7 ATCC CRL-1651
U266 ATCC TIB-196
HuNS1 ATCC CRL-8644
CHL ECACC No. 87111906
숙주 세포는 무혈청 조건 하에서, 경우에 따라 동물 기원의 임의의 단백질/펩타이드가 없는 배지에서 확립, 순응 및 완전 배양되었을 때 가장 바람직하다. 시중에서 입수용이한 배지, 예컨대 Ham's F12(Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640(Sigma), Dulbecco's Modified Eagle 배지(DMEM; Sigma), 최소 필수 배지(MEM; Sigma), Iscove's Modified Dulbecco's 배지(IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invitrogen), 무혈청 CHO 배지(Sigma), 및 무단백질 CHO 배지(Sigma)는 적당한 영양소 용액의 예이다. 임의의 배지는 필요하면 다양한 화합물이 보충될 수 있고, 그 예로는 호르몬 및/또는 다른 성장인자(예, 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자, 인슐린 유사 성장인자), 염(예, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충액(예, HEPES), 뉴클레오사이드(예, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 등가의 에너지원, 항생제, 미량원소가 있다. 다른 필요한 임의의 보충물도 당업자에게 공지된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 본 발명에서는 무혈청 배지의 사용이 바람직하지만, 적당한 양의 혈청이 보충된 배지도 숙주 세포의 배양에 사용될 수 있다. 선택성 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포의 성장과 선택을 위하여, 적당한 선택 제제를 배양 배지에 첨가한다.
"단백질"이란 용어는 아미노산 잔기 서열 또는 폴리펩타이드와 호환 사용되고 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미한다. 이 용어들은 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화 또는 단백질 프로세싱을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 반응을 통해 해독후 변형된 단백질도 포함한다. 변형 및 변화, 예컨대 다른 단백질과의 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은 폴리펩타이드의 구조에 이루어질 수 있지만, 이 분자는 생물학적 기능적 활성을 유지한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 이의 기본 핵산 암호 서열에는 특정 아미노산 서열 치환이 이루어질 수 있고 유사 성질을 가진 단백질이 수득될 수 있다.
"폴리펩타이드"란 용어는 10개보다 많은 아미노산을 가진 서열을 의미하고, "펩타이드"란 용어는 10개 이하의 아미노산 길이의 서열을 의미한다. 본 발명은 생물약제학적 폴리펩타이드/단백질을 생산하는 숙주 세포의 생성에 적합하다. 본 발명은 증강된 세포 생산성을 나타내는 세포를 이용하여 다수의 여러 관심 유전자를 고수율로 발현시키는데 특히 적합하다.
"관심 유전자"(GOI), "선택된 서열" 또는 "산물 유전자"는 본 명세서에서 동일한 의미를 나타내며, "목적 산물"이란 용어로 언급되기도 하는 관심 산물 또는 "관심 단백질"을 암호화하는 임의의 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 선택된 서열은 전체 길이 또는 절두된 유전자, 융합 또는 태그화된 유전자일 수 있고, cDNA, 게놈 DNA 또는 DNA 단편, 바람직하게는 cDNA일 수 있다. 이 서열은 천연 서열, 즉 자연 발생 형태(들)이거나, 또는 변이되거나, 바람직하다면 다른 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 변형으로는 선택된 숙주 세포에 코돈 용법의 최적화를 위한 코돈 최적화, 사람화 또는 태그화를 포함한다. 선택된 서열은 분비형, 세포질, 핵, 막 결합된 또는 세포 표면의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
"관심 단백질"은 선택된 숙주 세포에서 모두 발현될 수 있는 단백질, 폴리펩타이드, 이의 단편, 펩타이드를 포함한다. 목적 단백질은 에컨대 항체, 효소, 사이토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체 또는 이의 유도체 또는 단편, 및 작동물질 또는 길항물질로서 작용할 수 있고/있거나 치료 또는 진단 용도를 나타내는 임의의 다른 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 목적 단백질/폴리펩타이드의 예는 이하에 제시된다.
모노클로날 항체와 같은 더욱 복잡한 분자인 경우에, GOI는 두 항체 사슬 중 하나 또는 둘 모두를 암호화한다.
또한, "관심 산물"은 안티센스 RNA일 수 있다.
"관심 단백질" 또는 "목적 단백질"은 위에서 언급한 것이다. 특히, 목적 단백질/폴리펩타이드 또는 관심 단백질은 예컨대 인슐린, 인슐린 유사 성장인자, hGH, tPA, 사이토카인, 예컨대 인터루킨(IL), 예, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN) 알파, IFN 베타, IFN 감마, IFN 오메가 또는 IFN 타우, 종양 괴사인자(TNF), 예컨대 TNF 알파 및 TNF 베타, TNF 감마, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 에리트로포이에틴 또는 임의의 다른 호르몬 성장인자의 생산도 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 항체 또는 이의 단편의 생산에 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 단편은, 예컨대 Fab 단편(항원 결합 단편 = Fab)을 포함한다. Fab 단편은 인접 불변 영역에 의해서 함께 유지되는 두 사슬의 가변 영역으로 이루어진다. 이 단편은 종래 항체로부터 파파인 등과 같은 프로테아제 분해로 형성될 수도 있지만, 그와 동시에 유전자 조작에 의해서도 유사한 Fab 단편이 생산될 수 있다. 또한, 항체 단편으로는 펩신에 의한 단백분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편도 포함한다.
관심 단백질은 바람직하게는 분비형 폴리펩타이드로서 배양 배지에서 회수되거나, 분비 시그널없이 발현된다면 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 관심 단백질은 관심 단백질의 거의 균일한 제조물이 수득되도록 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 정제하는 것이 필요하다. 제1 단계로서, 세포 및/또는 미립자형 세포 파편은 배양 배지 또는 용해물로부터 회수한다. 그 다음, 관심 단백질은 불순 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터, 면역친화성 또는 이온교환컬럼, 에탄올 침전, 역상 HPLC 세파덱스 크로마토그래피, 실리카 크로마토그래피 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 크로마토그래피로 정제한다. 일반적으로, 숙주 세포에 의해 발현된 이종 단백질을 정제하는 방식을 당업자에게 교시하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예컨대 (Harris and Angal, 1995) 또는 (Robert Scopes, 1988)에 기술되어 있다.
유전자조작 방법을 이용하면 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역들로만 이루어진 단축된 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이것은 Fv 단편(가변 단편 = 가변부 단편)이라 불린다. 이러한 Fv 단편은 불변 사슬의 시스테인에 의한 두 사슬의 공유 결합이 없기 때문에 Fv 단편은 종종 안정화되기도 한다. 즉, 중쇄 및 경쇄가변 영역을 짧은 펩타이드 단편, 예컨대 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개 아미노산의 단편으로 결합시키는 것이 유리하다. 이러한 방식에 따르면, 펩타이드 링커에 의해 결합된 VH와 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일쇄-Fv(scFv)라 알려져 있다. 종래 기술에 공지된 이러한 종류의 scFv 항체 단백질의 예는 (Huston et al., 1988)에 기술되어 있다.
최근, scFv를 다량체성 유도체로 제조하는 다양한 전략이 개발되었다. 이는 특히 재조합 항체를 증가된 결합 친화도뿐만 아니라 개선된 약동학적 성질 및 생체분포 성질을 가진 재조합 항체를 생산하고자 한 것이다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해, scFv는 다량체화 도메인을 보유한 융합 단백질로 제조했다. 다량체화 도메인은, 예컨대 IgG의 CH3 영역 또는 코일형 코일 구조(나선 구조), 예컨대 류신-지퍼 도메인일 수 있다. 하지만, scFv의 VH/VL 영역 간에 상호작용이 다량체화(예컨대, 디아바디, 트리아바디 및 펜타바디)에 사용되는 전략도 있다. 디아바디라 하면, 당업자는 2가의 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자 내의 링커를 5 내지 10개의 아미노산으로 단축시키면, 사슬간 VH/VL 중첩(superimposition)이 일어나는 동종이량체의 형성이 야기된다. 디아바디는 또한 디설파이드 가교의 혼입에 의해 안정화되기도 한다. 종래 기술의 디아바디-항체 단백질의 예는 (Perisic et al., 1994)에서 찾아볼 수 있다.
미니바디라 하면, 당업자는 2가의 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. 이는 힌지 영역(예, IgG1 유래) 및 링커 영역을 통해 scFv에 결합되는 이량체화 영역으로서, 면역글로불린, 바람직하게는 IgG 및 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 종래 기술의 미니바디-항체 단백질의 예는 (Hu et al., 1996)에서 찾아볼 수 있다.
트리아바디라 하면, 당업자는 3가의 동종삼량체 scFv 유도체를 의미한다(Kortt et al., 1997). VH-VL이 링커 서열없이 직접 융합된 scFv 유도체는 삼량체의 형성을 야기한다.
"스캐폴드 단백질"이라 하면, 당업자는 다른 기능을 가진 단백질의 일부 또는 다른 단백질과 공동해독 과정에 의해 또는 유전자 클로닝에 의해 커플링되는 단백질의 임의의 기능성 도메인을 의미한다.
또한, 당업자라는 2가, 3가, 또는 4가 구조를 보유하고 scFv에서 유래되는 소위 미니항체를 잘 알고 있을 것이다. 다량체화는 이량체, 삼량체 또는 사량체 코일형 코일 구조들에 의해 실시된다(Lovejoy et al., 1993; Pack et al., 1993; Pack et al., 1995).
정의상, 숙주 세포로 도입되는 임의의 서열 또는 유전자는 도입된 서열 또는 유전자가 숙주 세포 내의 내인성 서열 또는 유전자와 동일할지라도, 숙주 세포에 관하여 "이종 서열", "이종 유전자" 또는 "도입유전자(transgene)"라 한다.
따라서, "이종" 단백질은 이종 서열로부터 발현된 단백질이다.
이종 유전자 서열은 "발현 벡터", 바람직하게는 진핵생물 발현 벡터, 더욱 더 바람직하게는 포유동물 발현 벡터를 사용하여 표적 세포로 도입시킬 수 있다. 벡터를 작제하는데 사용되는 방법은 당업자에게 공지되어 있고 다양한 공보에도 기술되어 있다. 특히, 기능성 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 시그널, 선택 마커, 복제 기원 및 스플라이싱 시그널의 설명을 비롯하여 적당한 벡터를 작제하는 기술은 (Sambrook et al., 1989) 및 여기에 인용된 문헌에 상당히 상세하게 검토되어 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 파지미드, 코스미드, 합성/미니 염색체(예, ACE), 또는 바이러스 벡터, 예컨대 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 레트로바이러스, 박테리오파지를 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 진핵생물 발현 벡터는 또한 세균의 선택을 위한 항생제 내성 유전자 및 복제 오리진과 같이 세균에서 벡터의 전파를 촉진하는 원핵생물 서열을 일반적으로 함유할 것이다. 폴리뉴클레오타이드가 작동가능하게 결합될 수 있는 클로닝 부위를 함유하는 다양한 진핵생물 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 일부는 스트라타진(Stratagene, La Jolla, CA); 인비트로겐(Invitrogen, Carlsbad, CA); 프로메가(Promega, Madison, WI) 또는 비디 바이오사이언시스 클론테크(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)와 같은 회사에서 시판하고 있다.
바람직한 양태에 따르면, 발현 벡터는 관심 펩타이드/폴리펩타이드/단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 전사 및 해독에 필요한 조절 서열인 적어도 하나의 핵산 서열을 함유한다.
본 명세서에 사용된 "발현"이란 용어는 숙주 세포 내에서의 이종 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 의미한다. 숙주 세포에서 관심 목적 산물/단백질의 발현 수준은 그 세포 내에 존재하는 대응하는 mRNA의 양 또는 본 실시예들에서와 같이 선택된 서열에 의해 암호화된 관심 목적 폴리펩타이드/단백질의 양 중 어느 하나를 기초로 해서 측정할 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 하이브리드화, 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 원위치 하이브리드화 또는 PCR에 의해 정량분석될 수 있다((Sambrook et al., 1989); (Ausubel et al., 2002) 신판 참조). 선택된 서열에 의해 암호화된 단백질은 다양한 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 방사성면역분석법, 면역침전, 단백질의 생물학적 활성 분석, 단백질의 면역염색과 후속 FACS 분석((Sambrook et al., 1989); (Ausubel et al., 2002) 신판 참조), 또는 균질 시간차 형광(HTRF) 분석으로 정량분석할 수 있다.
유전자 변형 세포 또는 돌연변이유전자 세포를 야기하는 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 이용한 진핵생물 숙주 세포의 "형질감염"은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있으며, 예컨대 문헌 (Sambrook et al., 1989) 또는 (Ausubel et al., 2002) 신판에 기술되어 있다. 형질감염 방법은 리포좀 매개 형질감염, 인산칼슘 공동침전, 전기침투(electroporation), 다가양이온(예, DEAE-덱스트란) 매개 형질감염, 원형질 융합, 바이러스 감염 및 미량주사 등을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 형질감염은 안정한 형질감염인 것이 바람직하다. 특정 숙주 세포주와 종류에서 이종 유전자의 최적의 형질감염 빈도와 발현을 제공하는 형질감염 방법이 유리하다. 적당한 방법은 통상의 절차에 의해 결정될 수 있다. 안정한 형질감염체를 위해, 작제물은 숙주 세포의 게놈 또는 합성 염색체/미니염색체 내로 통합시키거나 또는 숙주 세포 내에서 안정하게 유지되도록 에피솜에 위치시킨다.
본 발명의 실시는 별다른 언급이 없는 한 세포생물학, 분자생물학, 세포배양, 면역학 등, 당업자의 기술에 속하는 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 현행 문헌에 충분히 개시되어 있다. 예컨대 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, 신판); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Presss (1995); Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (신판); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Puhler ed., VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), 및 Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987) 참조.
구체예
본 발명은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계 및 상기 관심 단백질의 발현을 실시하는 단계를 포함하여, 세포 내에서 이종 관심 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 방법은 이종 단백질이 막 단백질 또는 분비 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 START 도메인 단백질이 PCTP(서열번호 27), StarD7, GPBP, StarD10, StarD8, StarD13, DLC-1, StarD4(서열번호 21), StarD6(서열번호 25), StarD5(서열번호 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH 또는 StarD9 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체와 같은 포유동물 START 도메인 패밀리 구성원인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 방법은 START 도메인 단백질이 ER 스트레스 시에 유도되는 것을 특징으로 하고/하거나 구조적으로 START 도메인, 예컨대 StarD4(서열번호 21), StartD5(서열번호 23), StartD6(서열번호 25) 또는 포스파티딜콜린 전이 단백질(PCTP)(서열번호 27)로만 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 방법은 START 도메인 단백질이 CERT(서열번호 11 또는 13), StarD4(서열번호 21) 및 StarD5(서열번호 23)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 방법은 START 도메인 단백질이 StarD6(서열번호 25)인 것을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, StarD6은 서열번호 24의 뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 START 도메인이 적어도 CERTL의 219개 아미노산 START 도메인(서열번호 19), 또는 적어도 CERT 및 CERT S132A의 223개 아미노산 START 도메인(서열번호 17), 또는 적어도 StarD4의 START 도메인(서열번호 21) 또는 적어도 StarD5의 START 도메인(서열번호 23) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 본 방법은 START 도메인 단백질이 세라마이드 전이 단백질 CERT(CERT=서열번호 11 또는 CERTL=서열번호 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 방법은 START 도메인 단백질이 돌연변이된 세라마이드 전이 단백질 CERT이고, 상기 돌연변이가 CERT의 임의의 세린, 트레오닌 또는 타이로신 위치에서 인산화 부위를 불능화 및/또는 결실시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 방법은 START 도메인 단백질이 돌연변이된 세라마이드 전이 단백질 CERT이고, 상기 돌연변이가 위치 132에서 CERT의 단백질 키나제 D(PKD) 인산화 부위를 불능화 및/또는 결실시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 본 방법은 돌연변이된 CERT가 CERTS132A(서열번호 15)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 방법은 상기 세포에서 관심 단백질의 비 세포 생산성(specific cellular productivity)을, 관심 단백질을 발현하지만 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유하는 단백질의 증가된 발현 또는 활성을 나타내지 않는 대조군 세포에 비해 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 방법은 생산성의 증가가 약 5% 내지 약 10%, 약 11% 내지 약 20%, 약 21% 내지 약 30%, 약 31% 내지 약 40%, 약 41% 내지 약 50%, 약 51% 내지 약 60%, 약 61% 내지 약 70%, 약 71% 내지 약 80%, 약 81% 내지 약 90%, 약 91% 내지 약 100%, 약 101% 내지 약 149%, 약 150% 내지 약 199%, 약 200% 내지 약 299%, 약 300% 내지 약 499% 또는 약 500% 내지 약 1000%인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 상기 세포가 효모, 식물, 벌레, 곤충, 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체예에서, 본 방법은 상기 세포가 동물 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 방법은 상기 세포가 씨.엘레강스(C. elegans)와 같은 후생동물인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 방법은 상기 세포가 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)와 같은 좌우대칭동물 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 방법은 상기 세포가 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물 세포와 같은 척추동물 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체예에서, 본 방법은 상기 세포가 사람 세포, 예컨대 사람 골수종 세포주 U266, HEK293, HeLa, HepG2 또는 HT1080인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 상기 세포가 쥐 NSO, Sp2/0 또는 Ag8653 세포, YO 또는 YB2.0과 같은 설치류 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 방법은 상기 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장 CV1, 원숭이 신장 COS, 사람 수정체 상피 PER.C6TM, 사람 배아 신장, HEK293, 어린 햄스터 신장, 아프리카 녹색 원숭이 신장, 사람 자궁경부 암종, 개 신장, 버팔로 래트 간, 사람 폐, 사람 간, 마우스 유방암 또는 골수종 세포, 개, 돼지 또는 마카크 세포, 래트, 토끼, 고양이, 염소, 바람직하게는 CHO 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 상기 CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, 바람직하게는 CHO DG44인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 관심 단백질이 막 단백질 또는 분비 단백질인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 관심 단백질이 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 본 방법은 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 포유동물 항체, 쥐 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, 영장류화된 항체, 영장류 항체, 사람 항체 또는 항체 단편 또는 이의 유도체, 예컨대 항체, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄, Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc 융합 단백질, Fv, 단일쇄 Fv, 단일 도메인 Fv, 4가 단일쇄 Fv, 디설파이드 결합된 Fv, 도메인 결실형, 미니바디, 디아바디 또는 상기 단편들 중 하나와 또 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드, Fc-펩타이드 융합체, Fc-독소 융합체, 스캐폴드 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 세포에서 관심 막단백질 또는 분비 단백질의 분비를 증가시키는 방법으로서, 상기 관심 단백질을 발현시키는 단계 및 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유하는 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 가진 단백질의 발현을 증가시키는 단계 및 관심 단백질을 발현시키는 단계를 포함하여, 그 순서 또는 단계 a 및 b가 역전될 수 있는, 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 단계 a)가 단계 b) 전에 수행되는 것을 특징으로 한다. 또 다른 본 발명의 구체예에서, 본 방법은 단계 a)와 b)가 동시에 수행되는 것을 특징으로 한다. 또 다른 본 발명의 구체예에서, 본 방법은 단계 b)가 단계 a) 전에 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 관심 단백질을 회수하는 추가 단계를 포함한다.
특히 바람직한 본 발명의 구체예에서, 본 방법은 관심 단백질의 분리 및 정제하는 추가 단계를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질감염시켜 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현을 증가시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드로 상기 세포를 형질감염시키는 단계 및 상기 세포를 관심 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법의 START 도메인 단백질은 ER 스트레스 시에 유도되는 것을 특징으로 하고/하거나 StarD4(서열번호 21), StarD5(서열번호 23), StarD6(서열번호 25) 또는 PCTP(서열번호 27)와 같은 START 도메인외에 다른 구조 모티프가 없는 것을 구조적 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 바람직하게는 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드로 상기 세포를 형질감염시켜, 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현을 증가시키고, 여기서 증가는 형질감염되지 않은 세포와 비교하여 측정하는 단계, 및 상기 세포를 관심 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 방법은 단계 a) 및 b)에서 발현된 단백질이 동일하지 않은 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 내에서 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현을 증가시키는 단계 및 상기 세포 내에서 관심 단백질을 발현시키는 단계를 포함하여, 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포 내에서 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현을 증가시키는 단계 및 상기 세포 내에서 관심 단백질을 발현시키는 단계를 포함하여, 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이전에 형질감염되었으나, 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 증가된 발현을 나타내지 않는 대조군 세포에 비해, 상기 세포 내에서 관심 단백질의 비 세포 생산성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 본 방법은 관심 단백질이 골지 복합체를 통해 통과하는 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 하나 이상의 벡터계를 세포 내로 도입시켜, 제1 폴리뉴클레오타이드는 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하고 제2 폴리뉴클레오타이드는 관심 단백질을 암호화하여, 관심 단백질과 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질이 상기 세포에 의해 발현되도록 하여, 상기 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질의 비 세포 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질감염시키는 단계, 이어서 관심 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드로 상기 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하고 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드가 상이한 벡터계에 위치하는, 상기 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질을 발현하는 세포의 형질감염 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 동일한 발현 작제물 또는 다른 플라스미드에 위치하는, 관심 단백질에 융합되었을 수 있는, GFP, YFP, HRP, SEAP 또는 LacZ와 같은 리포터 유전자를 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는 세포의 형질감염 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 관심 단백질의 검출 또는 리포터 유전자의 발현에 의해 형질감염 효율을 검출 및/또는 측정하는 단계를 단계를 추가로 포함하여 세포의 형질감염 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 관심 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드인 2개의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 구체예에서, 발현 벡터는 START 도메인 단백질이 PCTP(서열번호 27), StarD7, GPBP, StarD10, StarD8, StarD13, DLC-1, StarD4(서열번호 21), StarD6(서열번호 25), StarD5(서열번호 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH 또는 StarD9 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체와 같은 포유동물 START 도메인 패밀리 구성원인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 발현 벡터는 START 도메인 단백질이 세라마이드 전이 단백질 CERT(CERT = 서열번호 11 또는 CERTL = 서열번호 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 발현 벡터는 돌연변이된 CERT가 CERTS132A(서열번호 15)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 발현 벡터는 제1 폴리뉴클레오타이드가 분비 경로를 통해 세포에서 단백질 수송을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 발현 벡터는 START 도메인 단백질이 돌연변이된 세라마이드 전이 단백질 CERT이고, 이 돌연변이가 CERT 단백질 내의 임의의 세린, 트레오닌 또는 타이로신 위치에서 인산화 부위를 불능화 및/또는 결실시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 발현 벡터는 START 도메인 단백질이 돌연변이된 세라마이드 전이 단백질 CERT이고, 이 돌연변이가 위치 132에서 CERT의 단백질 키나제 D(PKD) 인산화 부위를 불능화 및/또는 결실시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 함유하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 구체예에서, 세포는 효모, 식물, 벌레, 곤충, 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체예에서, 세포는 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 세포는 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장 CV1, 원숭이 신장 COS, 사람 수정체 상피 PER.C6TM, 사람 배아 신장, HEK293, 어린 햄스터 신장, 아프리카 녹색 원숭이 신장, 사람 자궁경부 암종, 개 신장, 버팔로 래트 간, 사람 폐, 사람 간, 마우스 유방암 또는 골수종 세포, 개, 돼지 또는 마카크 세포, 래트, 토끼, 고양이, 염소, 바람직하게는 CHO 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체예에서, 세포는 상기 CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, 바람직하게는 CHO DG44인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 세포는 상기 세포가 동물 세포, 바람직하게는 씨.엘레강스(C. elegans)와 같은 후생동물인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포는 상기 세포가 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)와 같은 좌우대칭동물 세포, 바람직하게는 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물 세포와 같은 척추동물 세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구체예에서, 세포는 상기 진핵생물 세포가 포유동물 세포, 바람직하게는 사람 세포, 예컨대 사람 골수종 세포주 U266, HEK293, HeLa, HepG2 또는 HT1080, 더욱 바람직하게는 쥐 NSO, Sp2/0 또는 Ag8653 세포, YO 또는 YB2.0과 같은 설치류 세포인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 기술된 임의의 방법에 의해 생산된 관심 단백질, 바람직하게는 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현을 차단하거나 감소시키는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 START 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현을 차단하거나 감소시키는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구체예에서, 약제학적 조성물은 START 도메인 서열이 세라마이드 전이 단백질 CERT(CERT = 서열번호 11 또는 CERTL = 서열번호 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 START 도메인이 서열번호 17 또는 19 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 약제학적 조성물은 폴리뉴클레오타이드 서열이 RNAi, siRNA 또는 안티센스 RNA인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 START 도메인 단백질이 PCTP(서열번호 27), StarD7, GPBP, StarD10, StarD8, StarD13, DLC-1, StarD4(서열번호 21), StarD6(서열번호 25), StarD5(서열번호 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH 또는 StarD9 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체와 같은 포유동물 START 도메인 패밀리 구성원인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 상기 폴리뉴클레오타이드가 CERT 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부, 특히 START 도메인에 상보성인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 상기 폴리뉴클레오타이드가 CERT 유전자 또는 CERT 프로모터에 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약제학적 조성물은 상기 폴리뉴클레오타이드가 CERT 유전자 또는 이의 일부에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인, 바람직하게는 CERT(서열번호 11 또는 서열번호 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 저해제 또는 억제제를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 구체예에서, 약제학적 조성물은 상기 저해제 또는 억제제가 화학적 물질 또는 펩타이드-억제제 또는 억제성 단백질, 예컨대 (i) CERT 프로모터에 결합하여 CERT 발현을 저해하는 단백질, (ii) CERT 또는 PKD에 결합하여 PKD 및 CERT의 결합을 방지하고 PKD에 의한 CERT 인산화를 방해하는 단백질, (iii) CERT와 유사하지만 CERT 기능을 완전히 수행하지는 않는 단백질, 즉 "우성-음성(dominant-negative)" CERT 변형체, 또는 (iv) CERT 및 PKD 모두의 스캐폴드로서 작용하여, PKD에 의한 CERT의 억제성 인산화로 인해 비기능성인 PKD에 대한 CERT의 비가역성 결합(=안정한 PKD/CERT 복합체) 및 이 복합체로부터 CERT의 해리 방해를 야기하는 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 약제학적 조성물은 상기 저해제 또는 억제제가 CERT 활성의 저해제 또는 억제제인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체, 바람직하게는 CERT를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 제공하는 단계, 이러한 단계 a)의 단백질을 시험 제제와 접촉시키는 단계, 세포 표면 단백질의 증가 또는 감소된 단백질 분비 또는 발현과 관련된 효과를 측정하는 단계를 포함하여, START 도메인 단백질 기능, 바람직하게는 CERT 기능의 조절자(modulator)를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 암 치료를 위해 기술된 바와 같은 약제학적 조성물의 적용을 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 관심 단백질의 생산 및/또는 분비를 증가시키는데 사용되는 START 도메인 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 START 도메인 단백질의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 기술된 바와 같은 임의의 방법, 발현 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 진단학적 용도에 관한 것이다.
구체예에서, 본 발명은 이하에 열거된 바와 같은 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 컨센서스 서열 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계 및 상기 관심 단백질을 발현시키는 단계를 포함하여, 세포 내에서 이종 관심 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다:
컨센서스/80% (서열번호 28)
Figure 112009060725036-PCT00002
여기서 클래스 주요 잔기는 다음과 같다 (1문자 아미노산 코드로 나타냄):
알콜 o S,T
지방족 l I,L,V
임의의 아미노산 n A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y
방향족 a F,H,W,Y
하전성 c D,E,H,K,R
소수성 h A,C,F,G,H,I,K,L,M,R,T,V,W,Y
음성 - D,E
극성 p C,D,E,H,K,N,Q,R,S,T
양성 + H,K,R
작은 s A,C,D,G,N,P,S,T,V
아주 작은 u A,G,S
턴유사(turnlike) t A,C,D,E,G,H,K,N,Q,R,S,T
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 이전 임의의 구체예들(예, 발현 벡터, 세포, 단백질, 약제학적 조성물, 방법 및 용도)에서 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인을 함유하는 아미노산 서열을 보유한 단백질이 위에 열거한 바와 같은 START 도메인 컨센서스 서열 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체(서열번호 28; 도 9 참조)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
위에서 개괄적으로 기술한 본 발명은 이하 실시예를 참고로 하면 더욱 쉽게 이해될 것이며, 이러한 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 단지 예시하는 것이다. 이하 실시예는 제한하는 것이 아니다. 이 실시예는 단지 본 발명의 가능한 구체예를 나타낸다. 당업자는 다른 구체예들에 적용하기 위해 조건들을 쉽게 조정할 수 있을 것이다.
실험
재료 및 방법
항체 및 시약
항체는 토끼 항-PKD 기질 폴리클로날 항체(Cell Signaling), 마우스 항-Flag 모노클로날 항체(Sigma-Aldrich), 마우스 항-GFP 모노클로날 항체(Roche), 토끼 항-PKD 폴리클로날 항체(C-20, Santa Cruz Biotechnology), 마우스 항-GS28(BD Biosciences) 및 마우스 항-튜불린(Neomarkers)이다. PKD 자가인산화를 모니터하는 인특이적 항-pS916 PKD 항체는 타문헌(Hausser et al., 2002)에 기술되어 있다. 퍼옥시다제 표지된 2차 항마우스 및 항토끼 IgG 항체는 아머샴 제품이고, 알칼리성 포스파타제 표지된 2차 항마우스 IgG 항체는 시그마 제품이며, Alexa Fluor 488- 및 546- 표지된 2차 항마우스 및 항래트 IgG 항체는 몰리큘라 프로브스(Molecular Probes) 제품이다.
DNA 작제물
전체 길이의 CERT cDNA는 EcoRI 제한부위를 함유하는 프라이머와 주형으로서 pcDNA3-Flag-CERT를 사용하여 PCR로 증폭시키고 pEGFPC1 벡터에 클로닝시킨다. CERT의 점 돌연변이는 제조자의 지시(Stratagene)에 따라 Quikchange 부위 지시된 PCR 돌연변이유발법으로 발생시킨다. 절두된 CERT 변형체는 STOP 코돈을 삽입하여 발생시킨다. 다음 올리고뉴클레오타이드가 사용된다: CERT-S132A (서열번호 1: 5'-cgtcgacatggcgcaatggtgtccctgg-3'), CERT-S132A rev (서열번호 2: 5'-ccagggacaccattgcgccatgtcgacg-3'), CERT-S272A (서열번호 3: 5'-ggttaaacgtgaggacgcctggcagaagagactgg-3'); CERT-S272Arev (서열번호 4: 5'-ccagtctcttctgccaggcgtcctcacgtttaacc-3'), 아미노산 138에서의 절두형 CERT (서열번호 5: 5'-ggtgtccctggtgtcttgagcaagtggctactc-3'); 절두형 CERT-138 rev (서열번호 6: 5'-gagtagccacttgctcaagacaccagggacacc-3'). Flag-CERT cDNA는 EcoRI 제한효소 부위를 사용하여 pGEX6P1에 서브클로닝한다. pEGFP-N1-PKD 및 pEGFP-N1-PKDK612W는 종래 기술된 바 있다(Hausser et al., 2005). ss-HRP-Flag를 암호화하는 플라스미드는 친절하게도 비벡 말호트라(Vivek Malhotra(UCSD))가 제공한 것이다.
cDNA 및 단백질
사람: CERT cDNA(서열번호 10):
Figure 112009060725036-PCT00003
Figure 112009060725036-PCT00004
사람: CERT 단백질 (서열번호 11)
Figure 112009060725036-PCT00005
Figure 112009060725036-PCT00006
사람: CERT L cDNA (서열번호 12)
Figure 112009060725036-PCT00007
Figure 112009060725036-PCT00008
사람: CERT L 단백질 (서열번호 13)
Figure 112009060725036-PCT00009
Figure 112009060725036-PCT00010
사람: CERT S132A cDNA (서열번호 14)
Figure 112009060725036-PCT00011
Figure 112009060725036-PCT00012
사람: CERT S132A 단백질 (서열번호 15)
Figure 112009060725036-PCT00013
Figure 112009060725036-PCT00014
사람: START 도메인 CERT cDNA (서열번호 16)
Figure 112009060725036-PCT00015
Figure 112009060725036-PCT00016
사람: START 도메인 CERT 단백질 (서열번호 17)
Figure 112009060725036-PCT00017
사람: START 도메인 CERT L cDNA (서열번호 18)
Figure 112009060725036-PCT00018
사람: START 도메인 CERT L 단백질 (서열번호 19)
Figure 112009060725036-PCT00019
사람: StarD4 cDNA (서열번호 20)
Figure 112009060725036-PCT00020
Figure 112009060725036-PCT00021
사람: StarD4 단백질 (서열번호 21)
Figure 112009060725036-PCT00022
사람: StarD5 cDNA (서열번호 22)
Figure 112009060725036-PCT00023
사람: StarD5 단백질(서열번호 23)
Figure 112009060725036-PCT00024
사람: StarD6 cDNA (서열번호 24)
Figure 112009060725036-PCT00025
사람: StarD6 단백질 (서열번호 25)
Figure 112009060725036-PCT00026
사람: PCTP cDNA (서열번호 26)
Figure 112009060725036-PCT00027
Figure 112009060725036-PCT00028
사람: PCTP 단백질 (서열번호 27)
Figure 112009060725036-PCT00029
세포 배양 및 형질감염
HEK293T 및 COS7 세포는 5% CO2를 함유하는 가습 대기 하에 10% 태아송아지 혈청(FCS)이 보충된 RPMI에서 성장시킨다. HEK293T 세포는 TransIT293 시약(Mirus)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 형질감염시킨다. 면역형광을 위해, COS7 세포는 유리 커버슬립 위에서 24시간 동안 성장시키고 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)으로 형질감염시킨다.
사람 혈청 알부민(HSA) 또는 사람 모노클로날 IgG 항체를 생산하는 CHO 세포 및 CHO 유래 세포주는 37℃, 5% CO2 함유 대기 하의 진탕 플라스크(Nunc, Denmark) 또는 항온배양기(Thermo, Germany) 중의 표면 호기성 T 플라스크(Nunc, Denmark)에서 무혈청 배지 중의 현탁액 상태로 배양했다. 씨드스톡 배양물은 2-3E5 세포/ml의 접종 밀도로 2 내지 3일마다 계대배양했다. 세포 농도는 모든 배양물에서 혈구계수기를 사용하여 측정한다. 생육성은 트립판 블루 배제 방법으로 평가한다. 모든 CHO 생산 세포는 BI-독점 배지에서 배양하고 그 조성은 공개되지 않을 수 있다. CHO 유래 세포는 Lipofectamine™ 및 PLUS™ Reagents(둘 모두 Invitrogen, Germany)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 형질감염시킨다.
유가식 배양
세포는 항생제 또는 MTX(Sigma-Aldrich, Germany) 없이 BI-독점 생산 배지 30ml가 담긴 125ml 진탕 플라스크에 3E05 세포/ml로 접종한다. 배양물은 37℃, 5% CO2 (이후 세포수가 증가하면 2%로 감소시킴) 하에 120rpm으로 교반한다. pH, 글루코스 및 락테이트 농도를 비롯한 배양 파라미터는 매일 측정하고 pH는 필요하면 NaCO3를 이용하여 pH 7.0으로 조정한다. BI-독점 유가 용액은 24시간마다 첨가한다. 세포 밀도 및 생육성은 자동 CEDEX 세포 정량 시스템(Innovatis)을 사용하여 트립판 블루 배제 실험으로 측정한다. 세포 배양액에서 샘플을 3일, 5일 및 7일째 수거하여, ELISA로 역가를 측정한다.
ELISA
세포 클론의 상청액에 존재하는 IgG 분자의 정량은 샌드위치 ELISA 기술로 수행한다. ELISA 평판은 항사람 IgG Fc-단편 항체(Dianova, Germany)를 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅한다. 1% BSA 용액으로 평판을 세척하고 차단한 후, 샘플을 첨가하여 1.5시간 동안 항온배양한다. 세척한 후, 검출 항체(알칼리성-포스파타제 접합된 염소 항사람 카파 경쇄 항체)를 첨가하고, 기질로서 4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨염 6수화물(Sigma, Germany)과 항온배양하여 비색 검출을 수행한다. 암실에서 20분간 항온배양한 후, 반응을 정지시키고, 즉시 흡광도를 흡광성 판독기(Tecan, Germany)로 405/492nm에서 측정한다. 농도는 각 평판마다 존재하는 표준 곡선에 따라 계산한다.
배양 샘플에서 분비된 HSA의 정량적 측정은 Human Albumin ELISA 정량 키트(Bethyl Labs, Texas, USA)에 함유된 항체를 사용하여 제조자의 지시에 따라 유사하게 수행한다.
면역형광 검경
세포는 마그네슘과 칼슘을 함유하는 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드에 실온에서 10분 동안 고정시킨 뒤, 세척하고 0.1M 글리신을 함유하는 PBS와 15분 동안 항온처리한다. 그 다음, 세포를 0.1% 트리톤을 함유하는 PBS로 5분 동안 투과화시킨 후, 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS 중의 5% 염소 혈청으로 30분 동안 차단시킨다. 세포를 차단 완충액에 희석된 1차 항체와 2시간 동안 항온처리한 후, 차단 완충액에 희석된 2차 항체와 1시간 동안 항온처리한다. Fluoromount G(Southern Biotechnology)에 커버슬립을 장착하고, 세포를 공초점 레이저 스캐닝 현미경(TCS SL, Leica)에서 488nm 및 543nm 여기 파장 및 40.0/1.25 HCX PL APO 대물 렌즈를 사용하여 분석한다. 이미지는 아도브 포토샵으로 처리한다.
단백질 추출, 면역침전 및 웨스턴 블롯팅
전체 세포 추출물은 세포를 NP40 추출 완충액(NEB)[50mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP40, 1mM 소듐 오르토바나데이트, 10mM 플루오르화나트륨 및 20mM β-글리세로포스페이트 + 완전 프로테아제 억제제]에 용해시켜 수득한다. 용해물은 16,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 정화한다. 면역침전을 위해, 동량의 단백질을 특정 항체와 얼음 위에서 2시간 동안 항온처리한다. 면역 복합체는 단백질 G-세파로스(GE Healthcare)로 수거하고 NEB(상기 참조)로 3회 세척한다. 전체 세포 추출물 또는 면역침전된 단백질은 샘플 완충액에서 비등 처리하고 SDS-PAGE로 처리한다. 단백질은 폴리비닐리딘 디플루오라이드 막(Roth) 위에 블롯팅한다. 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS 중의 0.5% 차단 시약(Roche)으로 차단한 후, 필터를 특정 항체로 탐침한다. 단백질은 강화 화학발광 검출 시스템(Pierce)을 사용하여 퍼옥시다제 커플링된 2차 항체로 가시화한다. 막의 스트리핑은 SDS 완충액[62.5mM Tris(pH 6.8), 2% SDS 및 100mM β-머캅토에탄올]에서 60℃ 하에 30분 동안 수행한다. 그 다음, 제시된 항체로 막을 재탐침한다.
재조합 단백질 정제 및 시험관내 키나제 분석
BL21 세균은 pGEX6P-Flag-CERT(1-138) 및 CERT-S132A(1-138) 벡터로 형질전환시킨다. 발현은 0.5mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노사이드로 30℃에서 4시간 동안 유도한다. 세균을 수거하고, 50㎍/ml 리소자임, 완전 프로테아제 억제제(Roche), 10mM 플루오르화나트륨 및 20mM β-글리세로포스페이트를 함유하는 PBS에 재현탁시킨다. 초음파 처리하기 전에 트리톤 X-100을 최종 농도 1%로 첨가한다. GST-CERT 융합체는 정화된 용해물로부터 글루타티온 수지(GE Healthcare)로 정제한다. 단백질 제조물의 순도는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 확인한다. 재조합 단백질은 키나제 완충액[50mM Tris, pH 7.5, 10mM MgCl2 및 1mM DTT] 중에서 2μCi[γ-32P]-ATP 또는 75μM 비방사성 ATP의 존재 하에 정제된 PKD1과 30분 동안 항온처리한다. 샘플은 SDS-PAGE로 분리한 뒤, 막 위에 블롯팅하고 PhosphoImager(Molecular Dynamics)로 분석하고 항-PKD 기질 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 분석한다.
PIP 어레이
GFP 태그화된 CERT 변형체를 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포는 저장성 완충액[50mM Tris, pH 7.4, 완전 프로테아제 억제제(Roche), 1mM PMSF, 5mM β-글리세로포스페이트 및 5mM 플루오르화나트륨 함유]에 수거하고, 25G/16mm 게이지 바늘을 통해 통과시켜 전단 처리한다. 세포질 분획은 1시간 동안 100,000 x g 원심분리한 후 수득하고, 단백질 발현량은 480-550nm(여기 466nm)에서 GFP 피크 방출을 측정하여 정량분석한다. PIP 어레이(Echelon)는 3% 지방산 제거된 BSA(Roth)를 함유하는 TBS-T[10mM Tris, pH 8, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20]로 차단시킨 다음, 5ml 차단 완충액 중에 동량의 GFP 단백질을 함유하는 500㎍ 세포질(형질감염되지 않은 세포 유래의 세포질로 조정함)과 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 결합된 단백질은 항-GFP 항체 및 그 다음 HRP 접합된 2차 항체와 항온처리한 후 검출한다.
시험관내 세라마이드 전이 분석
SUV 간에 세라마이드의 단백질 매개 전이는 종래 설명된 바와 같이 측정한다(Olayioye et al., 2005). 전이 분석 혼합물은 돼지 뇌 지질(Avanti Polar Lipids), 피렌 표지된 C16-세라마이드 및 2,4,6-트리니트로페닐포스파티딜에탄올아민(TNP-PE)(88.6:0.4:11 mol%)으로 구성되고 피.소머하주(P.Somerharju)가 제공한 공여체 소포(2nmol 지질/ml) 및 돼지 뇌 지질로 구성된 10배 과량의 수용체 소포를 함유했다. 형광 강도는 GFP 태그화된 CERT 야생형과 S132A 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포 유래의 75㎍ 세포질을 첨가하기 전과 후에 395nm(여기 345nm; 슬릿 폭, 4nm)에서 기록한다(상기 참조). 형광 강도는 (i) Triton X-100(0.5% 최종 농도)을 첨가한 후 수득되는 최대 강도 및 (ii) 최대 GFP 형광에 대해 표준화하여, 여러 단백질 발현 수준을 나타낸다.
HRP 수송 분석
HEK293T 세포는 ss-HRP-Flag 플라스미드 및 공벡터, pEGFP-N1-PKD1KD 및 pcDNA3-Flag-CERT wt 및 pcDNA3-Flag-CERT-S132A를 각각 1:6.5의 비율로 사용하여 공동형질감염시킨다. 24시간 형질감염후 세포는 무혈청 배지로 세척하고 ECL 시약과 정화된 세포 상청액을 항온처리하여 0시간, 1시간, 3시간 및 6시간 후에 HRP 분비를 정량분석한다. 측정은 루미노미터(Lucy2, Anthos)를 사용하여 450nm에서 수행한다.
siRNA 분석
COS7 세포는 ssHRP-Flag를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, 8시간 후 수거한 뒤, 3반복 웰에 다시 플레이팅한 후, CERT-특이적 siRNA 올리고뉴클레오타이드(siCERT#1, 서열번호 7: 5'-ccacaugacuuacucauuatt3'; siCERT#2, 서열번호 8: 5'-gaacagaggaagcauauaatt-3')로 Oligofectamine™ 시약(Invitrogen)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 형질감염시킨다. 대조군 세포는 모의 형질감염시키거나, lacZ-특이적 siRNA(서열번호 9: 5'-gcggcugccggaauuuacctt-3')로 형질감염시킨다. 48시간 후 세포는 세척하고, 새로운 배지를 첨가한다. 상청액 내로 분비된 HRP 양은 전술한 바와 같은 화학발광 분석으로 측정한다. 마지막으로, 세포는 용해하고, 3반복 용해물을 모아, 튜불린- 및 트랜스페린 수용체-특이적 항체로 면역블롯팅하여 분석한다.
실시예 1: 세포내 산물 축적은 분비 보틀넥을 나타낸다.
유가식 방법은 사람 IgG 항체를 발현하는 3가지 다른 CHO 생산자 세포 클론을 사용하여 수행한다(각각, 방법 A, B 및 M, 도 1 참조). 세포 샘플은 2일마다 채취하고 세포내 항체의 양은 FACS 분석으로 측정한다. 요컨대, 세포는 PBS/4% PFA로 고정시키고, 투과화시킨 뒤, FITC 접합된 항-사람 카파 경쇄 항체로 염색한다. 처음 4일 동안, 세포내 IgG 함량은 일정한 수준을 유지한다. 하지만, 5일부터 9일까지, 세포내 산물의 수준은 일정하게 상승하는데, 이는 미스폴딩된 경쇄 또는 심지어 완전 항체 산물의 세포내 축적을 시사한다. 이러한 데이터는 다른 생산자 세포 클론 및 산물의 독립된 3가지 생산 과정의 결과로서, 이는 세포가 배지로 분비되는 단백질보다 더 많은 항체 RNA를 전사하여, 생산된 항체의 완전한 분비를 방해하는 해독후 보틀넥의 증거임을 강력히 시사한다(도 1).
실시예 2: CERT는 PKD 기질 항체에 의해 검출된다.
PKD는 PI4KIIIβ가 지금까지 확인된 유일한 국소 기질인 골지 복합체의 주요 조절인자이다. 골지 복합체 국재성인 CERT 단백질(서열번호 11 및 13)이 PKD의 기질로서 작용할 수 있는지를 시험하기 위해, PKD에 의해 인산화된 컨센서스 모티프에 대해 유발된 pMOTIF라 지칭한 인특이적 기질 항체를 이용한다(Doppler et al., 2005). HEK293T 세포는 Flag 태그화된 CERT(서열번호 10) 및 CERTL(서열번호 12)을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시킨다. CERT 이소폼은 Flag 특이적 항체로 면역침전시키고 pMOTIF 항체로 웨스턴 블롯팅하여 분석한다(도 4A). CERT의 분자량(서열번호 11) 및 약하게는 CERTL의 분자량(서열번호 13)에 해당하는 pMOTIF 시그널이 검출된다. 인산화된 CERTL 이소폼의 약한 검출은 키나제에 대한 인 부위 접근성에 영향을 미칠 수 있는 응집체를 형성하는 공지된 작용과 관련이 있을 수 있다(Raya et al., 2000).
pMOTIF 항체에 의한 CERT 인식이 PKD에 의존적인지를 조사하기 위해, HEK293T 세포에서 CERT를 PKD1의 키나제 제거된 변형체(K621W)와 함께 발현시킨다. 이 돌연변이체는 골지 복합체에 국재화하는 것으로 밝혀져 있으며 우성 음성 방식으로 PI4KIIIβ 인산화를 억제했다(Hausser et al., 2005). 불활성 PKD의 공동발현은 pMOTIF 항체가 CERT를 검출하지 못하게 하며, 이것은 pMOTIF 시그널이 실제로 PKD 매개의 CERT 인산화 때문이라는 것을 시사한다(도 4B).
지질 전이 단백질은 PKD가 국재화되어 있는 ER과 TGN 사이에 형성되는(Levine and Loewen, 2006) 막 접촉 부위에서 작용하는 것으로 생각된다. GFP 태 그화된 PKD1과 공동발현된 COS7 세포 내의 Flag 태그화된 CERT의 면역형광 염색은 두 단백질이 골지 복합체에 함께 국재화되어 있음을 입증한다(도 4C). 이를 종합해보면, 상기 데이터는 CERT가 골지체에서 PKD 기질임을 확인시켜준다.
실시예 3: PKD는 세린 132에서 CERT를 인산화한다.
CERT의 pMOTIF 인식 부위를 확인하기 위해, 세린 또는 트레오닌에 상대적으로, -3 위치에 아르기닌 및 -5 위치에 류신, 이소류신 또는 발린 잔기를 특징으로 하는 잠재적인 PKD 컨센서스 모티프를 조사한다. PKD 컨센서스 모티프에 부합하고 종을 따라 보존적인 위치 132와 272에 2개의 세린(도 5A)을 부위 지시된 돌연변이유발법으로 알라닌으로 교환한다. 이 돌연변이체는 HEK293T 세포에서 발현시키고, pMOTIF 항체에 의해 인식에 대해 검사한다. 흥미롭게도, 세린 132의 알라닌으로의 돌연변이는 pMOTIF 항체가 CERT를 검출하지 못하게 하여, 인산화 상실을 시사하는 전기영동적 이동성의 증가를 유발하는 반면, S272A 돌연변이는 pMOTIF 시그널에 영향을 미치지 않는다(도 5B). 이것은 세린 132가 PKD 기질 항체에 의해 특이적으로 인식되는 PKD 인산화 부위임을 시사한다. PKD가 CERT에 상기 세린 잔기를 직접 인산화할 수 있는지를 확인하기 위해, 단백질의 처음 138개 아미노산을 함유하는 이.콜라이에서 생산된 재조합 CERT GST-융합 단백질과 정제된 PKD1을 이용한 시험관내 키나제 분석을 수행한다. 절두된 야생형 CERT 융합 단백질을 [γ-32P]-ATP의 존재하에 PKD1과 항온처리할 때, 방사성의 혼입이 검출된다(도 5C). 이것은 CERT-S132A 융합 단백질의 경우에 상당히 약하다. CERT-S132A(서열번호 15)가 아닌 야생형의 시험관내 PKD 인산화는 pMOTIF 항체의 인식 부위를 나타낸다는 것을 입증한다(도 5D). 이를 종합해보면, 이러한 결과는 CERT가 시험관내 및 생체내에서 실제 PKD 기질임을 입증하고 CERT의 특이적 PKD 인산화 부위로서 세린 132를 증명한다.
실시예 4: 세린 132에서 CERT 인산화는 PI(4)P 결합 및 세라마이드 전이 활성을 조절한다.
세린 132는 CERT PH 도메인(아미노산 23-117)과 매우 근접하게 위치하여, 이 부위의 인산화가 국소적으로 음전하를 증가시켜 PI(4)P 결합에 영향을 미칠 수 있게 해준다. 따라서, 본 발명자들은 단백질-지질 오버레이 분석을 수행하여 야생형 CERT와 CERT-S132A 돌연변이체(서열번호 15)의 PI(4)P 결합을 정량분석한다. 여기서, CERT 변형체를 일시적으로 발현하는 HEK293T 세포 유래의 세포질을, 여러 포스포이노시타이드의 구배 농도가 점적된 막과 항온처리하고, 결합된 CERT 단백질을 이들의 GFP 태그를 통해 검출한다. 종래 보고된 바와 같이, 전체 길이의 야생형 단백질은 여러 인지질 종에 대해 약한 결합을 나타내지만, PI(4)P와는 강한 상호작용을 나타낸다(Hanada et al., 2003; Levine and Munro, 2002). PI(4)P에 대한 CERT-S132A 결합은 야생형 단백질에 비해 2 내지 4배 낮은 농도에서 검출할 수 있으며, 이는 이 인지질에 대한 CERT-S132A 돌연변이체의 증가된 친화성을 시사한다(도 6A). 이를 종합하면, 상기 데이터들은 CERT가 일단 골지 복합체에 결합되면 PKD에 의해 인산화된다는 것을 시사한다. 이것은 그 다음 CERT의 PI(4)P에 대한 친화성을 감소시키고, 이로써 골지체 막과 CERT의 상호작용을 조절한다.
CERT는 지질 전이 단백질로서 작용하는 것으로 밝혀져 있다(Hanada et al., 2003). 따라서, 본 발명자들은 세린 132에서의 CERT 인산화가 결합능에 영향을 미치고 막 간에 세라마이드를 전이시키는지를 조사했다. 이를 위해, 야생형 CERT의 GFP 태그화된 형태(서열번호 10) 및 CERT-S132A의 GFP 태그화 형태(서열번호 14)를 HEK239T 세포에서 일시적으로 발현시키고, 세포질 분획을 가지고 FRET 기반 분석을 이용하여 세라마이드 특이적 지질 전이 활성을 분석했다(도 6B). 이 분석에 형광 공여체로서 피렌 표지된 세라마이드를 함유하는 작은 단층 소포와 반응정지량의 헤드그룹-표지된 TNP-PE를 이용했다(Olayioye et al., 2005; Somerharju, 2002). 이러한 공여체 리포좀을 과량의 미표지된 수용체 리포좀과 혼합했을 때, 피렌 형광도의 증가는 무시할 정도였으며, 이는 수용체 막으로 세라마이드 전이가 최소의 자발적 전이임을 시사한다(데이터는 미제시). 야생형 CERT 함유 세포질을 첨가한 후에는 형광도의 안정된 증가가 관찰되었고, 이는 벡터-형질감염된 세포의 대조군 세포질을 사용했을 때에는 관찰되지 않았다(도 6B). 야생형 단백질과 비교했을 때, CERT-S132A(서열번호 15)는 피렌 형광도의 더욱 빠른 증가로 분명한 고속의 지질 전이를 나타냈다. 이것은 세린 132에서의 CERT 인산화가 막과 단백질의 결합을 감소시켜 세라마이드 전이 활성을 하향조절한다는 것을 시사한다.
종래 데이터에서는 이미 PKD가 골지 복합체에서 PI4KIIIβ의 인산화 매개 활성화를 통해 PI(4)P의 수준을 조절한다는 것을 밝힌 바 있다(Hausser et al., 2005). 흥미롭게도, PI4KIIIβ는 ER과 골지 복합체 사이에서 세라마이드 수송에 중요하다(Toth et al., 2006). 따라서, 여기에 제시되는 데이터와 종합해보면, 골지 체 막의 지질 항상성을 유지하는데 있어서 PKD의 이중 역할이 CERT의 결합속도(on-rate)(PI(4)P 수준을 통해) 및 해리속도(직접 인산화를 통해)를 조절함으로써 나타난다는 것이 분명해진다.
실시예 5: CERT는 PKD 활성화 및 분비 수송을 조절한다.
본 발명자들은 세라마이드 전이에 의한 CERT 과잉발현이 DAG 수준을 상승시키고 결과적으로 PKD 활성을 자극할 수 있을 것으로 생각한다. 이를 시험하기 위해, Flag 태그화된 CERT 야생형(서열번호 10) 및 CERT-S132A(서열번호 14)를 HEK293T 세포에서 일시적으로 발현시킨다. 전체 세포 용해물은 형질감염 후 24시간째 제조하고 SDS-PAGE로 처리한다. PKD 활성화는 인특이적 pS916 PKD 항체로 면역블롯팅하여 분석한다(도 7A, 상단 패널). 동일 부하량은 PKD 특이적 항체로 재탐침하여 확인한다(도 7A, 중간 패널). CERT 단백질의 발현은 Flag 특이적 항체로 면역블롯팅하여 확인한다(도 7A, 하단 패널). 이 대조군과 비교했을 때, CERT 야생형 및 CERT-S132A의 발현은 둘 다 인특이적 PKD 항체를 이용한 분석에서 밝혀지는 바와 같이 PKD 활성을 증가시켰다. 이것은 PKD 활성화가 아마도 증가된 세라마이드 전달 및 강화된 SM/DAG 합성으로 인하여, CERT 단백질에 의해 조절된다는 것을 보여준다.
CERT 매개의 PKD 활성화가 실제로 분비 수송의 증강으로 해석되는지의 의문을 해결하기 위해, 본 발명자들은 구성적 단백질 분비의 리포터로서 사용될 수 있는 분비형 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP-ss)를 암호화하는 플라스미드를 이용했다. HEK293T 세포는 Flag-ss-HRP를 암호화하는 발현 플라스미드 또는 공벡터, 및 PKD1-GFP 키나제 제거된 벡터(KD), Flag-CERT 야생형(WT) 및 Flag-CERT-S132A로 각각 공동형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간째, 세포를 세척하고 새로운 배지를 첨가한다. 상청액은 0시간, 1시간, 3시간 및 6시간 후에 화학발광으로 퍼옥시다제 활성을 분석한다. 대조군 세포에서, ss-HRP의 분비는 1시간 내에 검출할 수 있었고, 시간이 경과함에 따라 증가했다(도 7B). 화물 단백질의 분비 수송을 억제하는 키나제 제거된 PKD1의 공동발현은 상청액 내로 ss-HRP의 분비를 거의 완전하게 폐지시켰다. 이것은 HRP가 당해 분석에서 PKD 의존적 방식으로 분비된다는 것을 확인시켜주었다. 이에 반해, CERT 야생형과 CERT-S132A의 공동발현은 분비 HRP의 양을 크게 증대시켰고(도 7B), 심지어 돌연변이체가 야생형 CERT보다 약간 더 높은 수치를 나타낸다. 이 실험은 CERT 과잉발현이 PKD 인산화를 자극하고 기능성 분석에서 배양 배지로 세포외 단백질의 분비를 약 2배까지 증가시킨다는 것을 증명한다.
또한, 본 발명자들은 CERT-S132A 돌연변이체의 과잉발현이 이의 국재화에 영향을 미치고/미치거나 골지체의 형태적 변화를 유발하는지를 조사했다. CERT는 시스/중간 골지 마커 GS28과 공동국재화하는 것으로 증명되어 있다(Hanada et al., 2003). COS7 세포에서 발현된 GFP 태그화된 CERT의 면역형광분석은 이 단백질이 GS28 양성 골지 영역에 국재화되어 있음을 보여주었다(도 7C). 이에 반해, 골지 복합체에서 GS28과의 부분 공동국재화 외에도, CERT-S132A 돌연변이체 단백질은 분산된 반점 염색을 나타냈다. 특히, 이러한 소포 구조들의 일부는 화물 단백질 ss-HRP를 함유하는 것으로 발견되었고, 이는 이들 구조가 사실상 골지 유래의 수송 운반 체라는 증거를 제공한다(도 7D). 이러한 발견은 세라마이드 수준의 국소 증가로 인한 골지체 막 구조의 관찰된 변화와 일치하는 것이다(Fukunaga et al., 2000; Weigert et al., 1999).
실시예 6: RNA 간섭에 의한 CERT 하향조절은 분비 수송을 저해한다.
본 발명에서 지금까지 제시된 데이터는 분명하게 CERT의 과잉발현이 단백질 분비를 증강시킨다는 것을 입증했다. 그 반대도 사실인지를 조사하기 위해, 즉 감소된 CERT 발현이 분비를 저하시키는지를 조사하기 위해, siRNA 실험을 수행했다. COS7 세포를 ssHRP-Flag를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, 8시간 후 수거한 다음, 3반복으로 웰에 다시 플레이팅한 다음 CERT 특이적 siRNA 올리고뉴클레오타이드(서열번호 7 및 8) 또는 모의 또는 lacZ-특이적 siRNA(서열번호 9)를 대조군으로 형질감염시켰다. 48시간 후, 세포를 세척하고, 새로운 배지로 피복한 뒤, 상청액 내로 분비되는 HRP의 양을 제시된 시간 후에 측정했다.
도 8A에 도시된 바와 같이, HRP의 활성은 3시간 후에 검출되었고 두 대조군 세포에서 동등한 유사 수준을 나타냈다. 이에 반해, 임의의 CERT 특이적 siRNA 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포에서는 HRP 활성의 급감이 측정되었다. 이것은 감소된 CERT 수준이 세포로부터 HRP 분비 감소로 이어지고, 나아가 분비 수송에 있어서 CERT의 중요 역할을 강조하는 것임을 시사한다.
흥미롭게도, CERT 감소는 단백질 분비뿐만 아니라 막관통 단백질 트랜스페린 수용체의 풍부함에도 영향을 미쳤다(도 8B). 도 8A의 세포를 모아서 용해물을 웨스 턴 블롯 실험으로 트랜스페린 수용체 특이적 항체로 탐침했을 때, 트랜스페린 수용체 양은 분명하게 급감한 반면, 트랜스페린 수용체는 유사한 수준이 두 대조군 세포에서 검출되었다.
이러한 발견은 지질 전이 단백질 CERT가 분비 단백질뿐만 아니라 막 지지성(membran-standing) 세포 표면 단백질의 수송에도 관련되어 있음을 시사한다. 이것은 상기 두 종류의 단백질이 지질 소포에서 ER로부터 골지를 통해 원형질막으로 동일하게 수송되어, 본 발명에서 최초로 증명하는 바와 같이 CERT가 영향을 미치는 동일한 세포 유출 경로를 이용하는 바, 놀랍지 않을 수 있다.
실시예 7: CERT 의 과잉발현은 항체의 생물약제학적 단백질 생산을 증가시킨다.
(a) 사람화된 항-CD44v6 IgG 항체 BIWA 4를 분비하는 항체생산성 CHO 세포주(CHO DG44)는 공벡터(모의 대조군) 또는 야생형 CERT(서열번호 10 및 12) 또는 점 돌연변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시키고, 이어서 선택 처리를 통해 안정한 세포 풀을 수득한다. 6회 연속 계대배양동안, 모든 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 채취하고, IgG 역가를 ELISA로 측정하고, 세포의 평균수로 나누어 비생산성을 계산한다(도 10A). 최고의 수치는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 보유하는 세포 풀, 그 다음 야생형 CERT(서열번호 10 또는 12) 보유 세포 풀에서 관찰된다. 둘 모두, IgG 발현은 모의 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수 득될 수 있다(도 10B). 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 항체 분비를 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
b) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 야생형 CERT(서열번호 10 또는 12)를 암호화하는 벡터 또는 점돌연변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 압력으로 처리하고 CERT 또는 CERT 돌연변이체의 이종 발현을 입증하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주와 동시에 CHO DG 44 야생형 세포를, 관심 유전자로서 사람화된 항-CD44v6 IgG 항체 BIWA 4를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차선택 후, 6회 연속 계대배양 동안 모두 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 취해서, IgG 역가를 ELISA로 측정하고 세포의 평균수로 나누어 비생산성을 계산했다. 최고의 수치는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 보유하는 세포 풀, 그 다음 야생형 CERT(서열번호 10 또는 12) 보유 세포 풀에서 관찰된다. 둘 모두, IgG 발현은 CERT 또는 CERT 돌연변이체의 이종 발현을 보유하지 않는 세포에 비해 현저하게 증강되어 있다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 항체 분비를 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
이것은 CERT, 및 특히 돌연변이 CERT의 이종 발현이 안정하게 형질감염된 CHO 세포주는 물론 일시적으로 형질감염된 CHO 세포주에서도 항체 분비를 증강시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 8: CERT의 과잉발현은 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1)의 생물약제학적 단백질 생산을 증가시킨다.
(a) 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1)을 분비하는 CHO 세포주(CHO DG44)는 공벡터(모의 대조군) 또는 야생형 CERT(서열번호 10 및 12) 또는 점 돌연변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시키고, 이어서 선택 처리를 통해 안정한 세포 풀을 수득한다. 6회 연속 계대배양동안, 모든 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 채취하고, MCP-1 역가를 ELISA로 측정하고, 세포의 평균수로 나누어 비생산성을 계산한다. 최고의 수치는 CERT 돌연변이체를 보유하는 세포 풀, 그 다음 야생형 CERT 보유 세포 풀에서 관찰된다. 둘 모두, IgG 발현은 모의 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 MCP-1 분비를 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
b) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 야생형 CERT(서열번호 10 또는 12)를 암호화하는 벡터 또는 점돌연변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 압력으로 처리하고 CERT 또는 CERT 돌연변이체의 이종 발현을 입증하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주와 동시에 CHO DG 44 야생형 세포를, 관심 유전자로서 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1)을 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차선택 후, 6회 연속 계대배양 동안 모두 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 취해서, MCP-1 역가를 ELISA로 측정하고 세포의 평균수로 나누어 비생산성을 계산했다. 최고의 수치는 CERT 돌연변이체를 보유하는 세포 풀, 그 다음 야생형 CERT 보유 세포 풀에서 관찰된다. 둘 모두, MCP-1 발현은 CERT 또는 CERT 돌연변이체의 이종 발현을 보유하지 않는 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 항체 분비를 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
이것은 CERT, 및 특히 돌연변이 CERT의 이종 발현이 안정하게 형질감염된 CHO 세포주는 물론 일시적으로 형질감염된 CHO 세포주에서도 단일 세포 단백질의 분비를 증강시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 9: CERT의 과잉발현은 막관통 단백질 상피성장인자 수용체(EGFR)의 생물약제학적 단백질 생산을 증가시킨다.
(a) CHO 세포주(막관통 단백질 상피성장인자 수용체(EGFR)를 발현하는 CHO DG44)는 공벡터(모의 대조군) 또는 야생형 CERT(서열번호 10 및 12) 또는 점 돌연 변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시키고, 이어서 선택 처리를 통해 안정한 세포 풀을 수득한다. 6회 연속 계대배양동안, 모든 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 채취하고, EGFR의 발현 수준을 FACS 또는 웨스턴 블롯팅으로 측정한다. 최고의 수치는 CERT 돌연변이체를 보유하는 세포 풀, 그 다음 야생형 CERT 보유 세포 풀에서 관찰된다. 둘 모두, EGFR 발현은 모의 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 EGFR 발현을 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
b) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 야생형 CERT(서열번호 10 또는 12)를 암호화하는 벡터 또는 점돌연변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 압력으로 처리하고 CERT 또는 CERT 돌연변이체의 이종 발현을 입증하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주와 동시에 CHO DG 44 야생형 세포를, 관심 유전자로서 EGFR을 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차선택 후, 6회 연속 계대배양 동안 모두 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 취해서, EGFR의 발현 수준을 FACS 또는 웨스턴 블롯팅으로 측정했다. 최고의 수치는 CERT 돌연변이체를 보유하는 세포 풀, 그 다음 야생형 CERT 보유 세포 풀에서 관찰된다. 둘 모두, EGFR 발현은 CERT 또는 CERT 돌연변이 체의 이종 발현을 보유하지 않는 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 EGFR 발현을 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
이것은 CERT, 및 특히 돌연변이 CERT의 이종 발현이 안정하게 형질감염된 CHO 세포주는 물론, 일시적으로 형질감염된 CHO 세포주에서도 표면 수용체의 발현을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 10: STARD4의 과잉발현은 항체의 생물약제학적 단백질 생산을 증가시킨다.
(a) 사람화된 항-CD44v6 IgG 항체 BIWA4를 분비하는 항체 생산성 CHO 세포주(CHO DG44)는 공벡터(모의 대조군) 또는 StarD4(서열번호 20)를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시키고, 이어서 선택 처리를 통해 안정한 세포 풀을 수득한다. 6회 연속 계대배양동안, 모든 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 채취하고, IgG 역가를 ELISA로 측정하고 평균세포수로 나누어 비생산성을 계산한다. 최고의 수치는 StarD4를 보유하는 세포 풀에서 관찰된다. IgG 발현은 모의 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, StarD4의 과잉발현은 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
b) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 StarD4를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 압력으로 처리하고 StarD4의 이종 발현을 입증하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주와 동시에 CHO DG 44 야생형 세포를, 관심 유전자로서 사람화된 항-CD44v6 IgG 항체 BIWA 4를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차선택 후, 6회연속 계대배양 동안 모두 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 취해서, IgG 역가를 ELISA로 측정하고 평균세포수로 나누어 비생산성을 계산한다. 최고의 수치는 StarD4를 보유하는 세포 풀에서 관찰된다. IgG 발현은 StarD4의 이종 발현을 보유하지 않는 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, StarD4의 과잉발현은 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있다.
이것은 StarD4의 이종 발현이 안정하게 형질감염된 CHO 세포주는 물론 일시적으로 형질감염된 CHO 세포주에서도 항체 분비를 증강시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 11: CERT의 과잉발현은 사람 혈청 알부민(HSA)의 생물약제학적 단백질 생산을 증가시킨다.
(a) 단일쇄 단백질 HSA를 분비하는 CHO 세포주(CHO DG44)는 공벡터(모의 대조군) 또는 야생형 CERT(서열번호 10 및 12) 또는 점 돌연변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 발현 작제물로 형질감염시키고, 이어서 선택 처리를 통해 안정한 세포 풀을 수득한다. 4회 연속 계대배양동안, 모든 안 정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 채취하고, HSA 역가는 ELISA로 측정한 뒤, 평균 세포수로 나누어 비생산성을 계산한다(도 11A).
둘 모두, HSA 역가 및 HSA 생산 세포의 비생산성은 두 CERT 변형체의 이종 발현에 의해, 모의 형질감염된 세포에 비해 현저하게 증강된다. 최고의 수치는 대조군보다 51%의 비생산성의 증가 및 46%의 HSA 역가의 증가를 야기하는 CERT 돌연변이체를 보유한 세포 풀, 및 그 다음 49%의 비생산성을 증가시키는 야생형 CERT에서 관찰된다.
안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다(도 11B). 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 HSA 분비를 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양과 같은 산업적 생산 조건 하에 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
(b) 및 (c) CHO 숙주 세포(CHO DG44)는 먼저 야생형 CERT(서열번호 10 또는 12)를 암호화하는 벡터 또는 점돌연변이 Ser132A를 보유하는 CERT 돌연변이체(서열번호 14)를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 세포를 선택 압력으로 처리하고 CERT 또는 CERT 돌연변이체의 이종 발현을 입증하는 세포주를 채취한다. 이어서, 이 세포주와 동시에 CHO DG 44 야생형 세포를, 관심 유전자로서 사람 혈청 알부민을 암호화하는 벡터로 형질감염시킨다. 2차선택 후, 6회 연속 계대배양 동안 모두 안정한 세포 풀의 씨드스톡 배양물로부터 상청액을 취해서, HSA 역가를 ELISA로 측정하고(도 11C), 평균세포수로 나누어 비생산성을 계산한다(도 11B).
최고의 수치는 CERT 돌연변이체를 보유하는 세포 풀, 그 다음 야생형 CERT 보유 세포 풀에서 관찰된다. 둘 모두, HSA 발현은 CERT 또는 CERT 돌연변이체의 이종 발현을 보유하지 않는 세포에 비해 현저하게 증강된 것이다. 안정한 형질감염체를 회분식 또는 유가식 발효로 처리하면 매우 유사한 결과가 수득될 수 있다. 이러한 각 환경에서, 야생형 및 돌연변이체 CERT의 과잉발현은 항체 분비를 증가시키고, 이것은 CERT가 연속 배양 또는 생물반응기 회분식 또는 유가식 배양에서 성장한 세포의 비 생산능을 증강시킬 수 있음을 시사한다.
이것은 CERT, 및 특히 돌연변이 CERT의 이종 발현이 안정하게 형질감염된 CHO 세포주는 물론, 일시적으로 형질감염된 CHO 세포주에서도 단일쇄 단백질의 분비를 증강시킬 수 있음을 시사한다.
참고문헌
Figure 112009060725036-PCT00030
Figure 112009060725036-PCT00031
Figure 112009060725036-PCT00032
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gaccaacctg 600 gtcacattct tccataccga cctcagcggt tacctcccac agaacgtggt ggactccttc 660 ttcccccgca gcatgacccg gttttatgcc aaccttcaga aagcagtgaa gcaattccat 720 gagtaatgct atcgttactt cttggcaaag aactcccgtg actcatcgag gagctccagc 780 tgttgggaca ccaaggagcc tgggagcacg cagaggcctg tgttcactct ttggaacaag 840 ctgatggact gcgcatctct gagaatgcca accagaggcg gcagcccacc cttcctgcct 900 cctgccccac tcagggttgg cgtgtgatga gccattcatg tgttccaaac tccatctgcc 960 tgttacccaa acacgcctct cctggcaggg tagacccagg cctctaacca tctgacagag 1020 actcggcctg gacaccatgc gatgcactct ggcaccaagg ctttatgtgc ccatcactct 1080 cagagaccac gtttccctga ctgtcataga gaatcatcat cgccactgaa aaccaggccc 1140 tgttgccttt taagcatgta ccgctccctc agtcctgtgc tgcagccccc caaatatatt 1200 tttctgatat agaccttgta tatggcttta atgccgcaaa atatttattt ttccttaaaa 1260 aaggtgtcaa cttggaaata atggtttaaa aacaggataa gcattaagga aaaacaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1344 <210> 23 <211> 213 <212> PRT <213> human: StarD5 protein <400> 23 Met Asp Pro Ala Leu Ala Ala Gln Met Ser Glu Ala Val Ala Glu Lys 1 5 10 15 Met Leu Gln Tyr Arg Arg Asp Thr Ala Gly Trp Lys Ile Cys Arg Glu 20 25 30 Gly Asn Gly Val Ser Val Ser Trp Arg Pro Ser Val Glu Phe Pro Gly 35 40 45 Asn Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Ile Val Tyr Gly Thr Leu Glu Glu Val 50 55 60 Trp Asp Cys Val Lys Pro Ala Val Gly Gly Leu Arg Val Lys Trp Asp 65 70 75 80 Glu Asn Val Thr Gly Phe Glu Ile Ile Gln Ser Ile Thr Asp Thr Leu 85 90 95 Cys Val Ser Arg Thr Ser Thr Pro Ser Ala Ala Met Lys Leu Ile Ser 100 105 110 Pro Arg Asp Phe Val Asp Leu Val Leu Val Lys Arg Tyr Glu Asp Gly 115 120 125 Thr Ile Ser Ser Asn Ala Thr His Val Glu His Pro Leu Cys Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Gly Phe Val Arg Gly Phe Asn His Pro Cys Gly Cys Phe Cys 145 150 155 160 Glu Pro Leu Pro Gly Glu Pro Thr Lys Thr Asn Leu Val Thr Phe Phe 165 170 175 His Thr Asp Leu Ser Gly Tyr Leu Pro Gln Asn Val Val Asp Ser Phe 180 185 190 Phe Pro Arg Ser Met Thr Arg Phe Tyr Ala Asn Leu Gln Lys Ala Val 195 200 205 Lys Gln Phe His Glu 210 <210> 24 <211> 663 <212> DNA <213> human: StarD6 cDNA <400> 24 atggacttca aggcaattgc ccaacaaact gcccaagaag ttttaggtta taatcgagat 60 acatcaggct ggaaagtggt taaaacttca aaaaagataa ctgtttccag taaggcttct 120 agaaaattcc atggaaatct atatcgtgtt gaagggataa ttccagaatc accagctaaa 180 ctatctgatt tcctctacca aactggagac agaattacat gggataaatc attgcaagtg 240 tataatatgg tacacaggat tgattcggac acattcatat gtcataccat tacacaaagt 300 tttgccgtgg gctccatttc ccctcgagac tttatcgact tagtgtacat caagcgctac 360 gaaggaaata tgaacattat cagttctaaa agtgtggatt ttccagaata tcctccatct 420 tcaaattata tccgcggtta taaccatcct tgtggctttg tatgttcacc aatggaagaa 480 aacccagcat attccaaact agtgatgttt gtccagacag aaatgagagg aaaattgtcc 540 ccatcaataa ttgaaaaaac catgccttcc aacttagtaa acttcatcct caatgcaaaa 600 gatggaataa aggcacacag aactccatca agacgtggat ttcatcataa tagtcattca 660 tga 663 <210> 25 <211> 220 <212> PRT <213> human: StarD6 protein <400> 25 Met Asp Phe Lys Ala Ile Ala Gln Gln Thr Ala Gln Glu Val Leu Gly 1 5 10 15 Tyr Asn Arg Asp Thr Ser Gly Trp Lys Val Val Lys Thr Ser 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gctggccgcc ggaagcttct cggaggagca gttctgggag 60 gcctgcgccg agctccagca gcccgctctg gccggggccg actggcagct cctagtggag 120 acctcgggca tcagcatcta ccggctgctg gacaagaaga ctggacttca tgagtataaa 180 gtctttggtg ttctggagga ctgctcacca actctactgg cagacatcta tatggactca 240 gattacagaa aacaatggga ccagtatgtt aaagaactct atgaacaaga atgcaacgga 300 gagactgtgg tctactggga agtgaagtac ccttttccca tgtccaacag agactatgtc 360 taccttcggc agcggcgaga cctggacatg gaagggagga agatccatgt gatcctggcc 420 cggagcacct ccatgcctca gcttggcgag aggtctgggg tgatccgggt gaagcaatac 480 aagcagagcc tggcgattga gagtgacggc aagaagggga gcaaagtttt catgtattac 540 ttcgataacc cgggtggcca aattccgtcc tggctcatta actgggccgc caagaatgga 600 gttcctaact tcttgaaaga catggcaaga gcctgtcaga actacctcaa gaaaacctaa 660 gaaagagaac tgggaacatt gcatccatgg gttgatgtct ctggaagtgc aaccacccaa 720 tgtctctgga agtgccacct ggaagtgcca cctggaagtg tctctggaag agcacccacc 780 actgttcagc cttcccctgc tgtttctgtc ttcagaggcc tacacactac cacatccttt 840 ctaagcatgt ttgcctgaca tccagctcac tcgtctgctt cctttctcgc tccccccatc 900 ctgggctggg ctgccttctt ctacagttca atatggggca gactagggaa acctttgctt 960 gcttactatt aggaggggaa gtcttcagta gggaacacga tcattccatt gtgcaatttt 1020 acggggatgg gtgggcggag ggacacaaca aaatttaaga atgactattt gggcgggctg 1080 gctcttttgc agcttgtgat ttcttccagc ttgggagggg ctgctggaag tggcatttcg 1140 ttcagagctg actttcagtg cacccaaact ggatgacgtg ccaatgtcca tttgccttat 1200 gctttgtgga gctgattagg ctgggatttg aggtgataat ccagtaagtc tttcctcgtt 1260 cctacttgtg gaggatcagt agctgttatg atgccagacc atttggagaa gtatcagagg 1320 cctgaccgga cacataatac gacaaccaca tttttcctca tcatccatga ggaaatggat 1380 gatttctctt ttccatatgt cactggggga aaggctgcct gtacctctca agctttgcat 1440 tttactggaa actgaggcgt caagatggct gtggcagcta gcaaaagcaa agatgctttg 1500 tgcatagcct tgtgaaaaag tatctttcta tgcaataaga tgaattttcc tcccagaata 1560 tttagaaatg tagaagggat aacagttcac agccaggtaa aatttaactg gtggcttaat 1620 gactctgcac ctttttctca ggaattctgc ctaagttgtc tgccttttct accaccaaaa 1680 agacttttag ttttctatgc tttctcctga attttggtag ggtaagtatt tctatgtcaa 1740 aggcacagcc ttgatgatct cagggaaaaa ttttaatcac tgtgtataat gatactgaac 1800 cttgattaat aacagaaatt caggatgtaa agccacagaa tgggatttat taatgtggga 1860 tacctcagac tgtttgtttt ctttctggga agaaaagtgt gttctataat gaataaatat 1920 agagtggttt tt 1932 <210> 27 <211> 214 <212> PRT <213> human: PCTP protein <400> 27 Met Glu Leu Ala Ala Gly Ser Phe Ser Glu Glu Gln Phe Trp Glu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Glu Leu Gln Gln Pro Ala Leu Ala Gly Ala Asp Trp Gln Leu 20 25 30 Leu Val Glu Thr Ser Gly Ile Ser Ile Tyr Arg Leu Leu Asp Lys Lys 35 40 45 Thr Gly Leu His Glu Tyr Lys Val Phe Gly Val Leu Glu Asp Cys Ser 50 55 60 Pro Thr Leu Leu Ala Asp Ile Tyr Met Asp Ser Asp Tyr Arg Lys Gln 65 70 75 80 Trp Asp Gln Tyr Val Lys Glu Leu Tyr Glu Gln Glu Cys Asn Gly Glu 85 90 95 Thr Val Val Tyr Trp Glu Val Lys Tyr Pro Phe Pro Met Ser Asn Arg 100 105 110 Asp Tyr Val Tyr Leu Arg Gln Arg Arg Asp Leu Asp Met Glu Gly Arg 115 120 125 Lys Ile His Val Ile Leu Ala Arg Ser Thr Ser Met Pro Gln Leu Gly 130 135 140 Glu Arg Ser Gly Val Ile Arg Val Lys Gln Tyr Lys Gln Ser Leu Ala 145 150 155 160 Ile Glu Ser Asp Gly Lys Lys Gly Ser Lys Val Phe Met Tyr Tyr Phe 165 170 175 Asp Asn Pro Gly Gly Gln Ile Pro Ser Trp Leu Ile Asn Trp Ala Ala 180 185 190 Lys Asn Gly Val Pro Asn Phe Leu Lys Asp Met Ala Arg Ala Cys Gln 195 200 205 Asn Tyr Leu Lys Lys Thr 210 <210> 28 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> START domain consensus sequence <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (3)..(4) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (6)..(8) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (14)..(15) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (18)..(20) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (22)..(38) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (39)..(40) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (41)..(41) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (42)..(42) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (43)..(61) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (62)..(62) <223> positive amino acid: His, Lys, Arg or any modified positive amino acid <220> <221> X <222> (63)..(63) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (64)..(64) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (65)..(65) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (66)..(67) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (68)..(74) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (75)..(75) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (76)..(78) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (79)..(80) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (81)..(81) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (82)..(82) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (83)..(88) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (89)..(89) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (91)..(92) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (93)..(93) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (94)..(94) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (95)..(107) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (108)..(108) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (109)..(109) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (110)..(110) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (111)..(111) <223> aliphatic amino acid: Ile, Leu, Val or any modified aliphatic amino acid <220> <221> X <222> (112)..(112) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (113)..(113) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (114)..(114) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (115)..(115) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (116)..(116) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (117)..(117) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (118)..(124) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (125)..(125) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (126)..(126) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (127)..(127) <223> aliphatic amino acid: Ile, Leu, Val or any modified aliphatic amino acid <220> <221> X <222> (128)..(128) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (129)..(129) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (130)..(132) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (133)..(133) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (134)..(135) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (136)..(136) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (137)..(139) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (140)..(140) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (141)..(141) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (142)..(142) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (143)..(143) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (145)..(145) <223> negative amino acid: Asp, Glu or any modified negative amino acid <220> <221> X <222> (146)..(147) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (148)..(148) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (149)..(149) <223> aliphatic amino acid: Ile, Leu, Val or any modified aliphatic amino acid <220> <221> X <222> (151)..(151) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (152)..(152) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (153)..(153) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (154)..(164) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (165)..(166) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (167)..(167) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (168)..(169) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (170)..(170) <223> aliphatic amino acid: Ile, Leu, Val or any modified aliphatic amino acid <220> <221> X <222> (171)..(171) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (172)..(173) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (174)..(174) <223> alcohol amino acid: Ser, Thr or any modified alcohol amino acid <220> <221> X <222> (175)..(175) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (176)..(176) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (177)..(178) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (179)..(179) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (180)..(188) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (189)..(189) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (190)..(191) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (193)..(193) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (194)..(194) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (195)..(196) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (197)..(197) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (198)..(198) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (199)..(202) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (203)..(203) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (204)..(205) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (206)..(207) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (208)..(208) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (209)..(220) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (221)..(221) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (222)..(222) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (223)..(225) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (226)..(226) <223> aliphatic amino acid: Ile, Leu, Val or any modified aliphatic amino acid <220> <221> X <222> (227)..(228) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (229)..(229) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (230)..(230) <223> negative amino acid: Asp, Glu or any modified negative amino acid <220> <221> X <222> (231)..(231) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (232)..(232) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (233)..(233) <223> small amino acid: Ala, Cys, Asp, Gly, Asn, Pro, Ser, Thr, Val or any modified small amino acid <220> <221> X <222> (234)..(240) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (241)..(241) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (242)..(242) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (243)..(244) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (245)..(245) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (246)..(246) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (247)..(248) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (249)..(249) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (250)..(250) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (251)..(251) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (252)..(252) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (253)..(254) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (255)..(256) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (257)..(257) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (258)..(261) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (262)..(262) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (263)..(264) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (265)..(265) <223> hydrophobic amino acids: Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Arg, Thr, Val, Trp, Tyr or any modified hydrophobic amino acid <220> <221> X <222> (266)..(266) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <220> <221> X <222> (267)..(267) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (268)..(268) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (269)..(269) <223> turnlike amino acids: Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified turnlike amino acid <220> <221> X <222> (270)..(270) <223> any amino acid: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val or any modified amino acid <220> <221> X <222> (271)..(271) <223> polar amino acid: Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr or any modified polar amino acid <400> 28 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 260 265 270

Claims (38)

  1. 세포 내에서 이종 관심 단백질을 생산하는 방법으로서,
    a. 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START; steroidogenic acute regulatory related lipid transfer) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키고,
    b. 상기 관심 단백질을 발현시킴
    을 포함하여, 세포 내에서 이종 관심 단백질을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, START 도메인 단백질이 PCTP(서열번호 27), StarD7, GPBP, StarD10, StarD8, StarD13, DLC-1, StarD4(서열번호 21), StarD6(서열번호 25), StarD5(서열번호 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH 또는 StarD9 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체와 같은 포유동물 START 도메인 패밀리 구성원인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, START 도메인 단백질이 ER 스트레스 시에 유도되는 것을 특징으로 하고/하거나 구조적으로 StarD4(서열번호 21), StartD5(서열번호 23), StartD6(서열번호 25) 또는 포스파티딜콜린 전이 단백질(PCTP)(서열번호 27)과 같은 START 도메인으로만 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, START 도메인 단백질이 적어도 START 도메인 컨센서스 서열(서열번호 28), 또는 적어도 CERTL의 219개 아미노산 START 도메인(서열번호 19), 또는 적어도 CERT 및 CERT S132A의 223개 아미노산 START 도메인(서열번호 17), 또는 적어도 StarD4의 START 도메인(서열번호 21) 또는 적어도 StarD5의 START 도메인(서열번호 23) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, START 도메인 단백질이 세라마이드 전이 단백질 CERT(서열번호 11 또는 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체인 방법.
  6. 제5항에 있어서, START 도메인 단백질이, 돌연변이된 세라마이드 전이 단백질 CERT이고, 상기 돌연변이가 CERT의 임의의 세린, 트레오닌 또는 타이로신 위치에서 인산화 부위를 불능화 및/또는 결실시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, START 도메인 단백질이, 돌연변이된 세라마이드 전이 단백질 CERT이고, 상기 돌연변이가 위치 132에서 CERT의 단백질 키나제 D(PKD) 인산화 부위를 불능화 및/또는 결실시키는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 돌연변이된 CERT가 CERTS132A(서열번호 15)인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서의 관심 단백질의 비 세포 생산성(specific cellular productivity)이, 상기 관심 단백질을 발현하지만 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유하는 단백질의 증가된 발현 또는 활성을 나타내지 않는 대조군 세포에 비해 증가되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 생산성의 증가가 약 5% 내지 약 10%, 약 11% 내지 약 20%, 약 21% 내지 약 30%, 약 31% 내지 약 40%, 약 41% 내지 약 50%, 약 51% 내지 약 60%, 약 61% 내지 약 70%, 약 71% 내지 약 80%, 약 81% 내지 약 90%, 약 91% 내지 약 100%, 약 101% 내지 약 149%, 약 150% 내지 약 199%, 약 200% 내지 약 299%, 약 300% 내지 약 499% 또는 약 500% 내지 약 1000%인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 효모, 식물, 벌레, 곤충, 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장 CV1, 원숭이 신장 COS, 사람 수정체 상피 PER.C6TM, 사람 배아 신장, HEK293, 어린 햄스터 신장, 아프리카 녹색 원숭이 신장, 사람 자궁경부 암종, 개 신장, 버팔로 래트 간, 사람 폐, 사람 간, 마우스 유방암 또는 골수종 세포, 개, 돼지 또는 마카크 세포, 래트, 토끼, 고양이, 염소, 바람직하게는 CHO 세포인 방법.
  14. 제13항에 있어서, CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, 바람직하게는 CHO DG44인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질이 막 단백질 또는 분비 단백질인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 관심 단백질이 항체 또는 항체 단편인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 포유동물 항체, 쥐 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, 영장류화된 항체, 영장류 항체, 사람 항체 또는 항체 단편 또는 이의 유도체, 예컨대 항체, 면역글로불린 경쇄, 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄, Fab, F(ab')2, Fc, Fc-Fc 융합 단백질, Fv, 단일쇄 Fv, 단일 도메인 Fv, 4가 단일쇄 Fv, 디설파이드 결합된 Fv, 도메인 결실형, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 또는 상기 단편들 중 하나와 또 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드, Fc-펩타이드 융합체, Fc-독소 융합체, 스캐폴드 단백질인 방법.
  18. 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터계를 세포 내로 도입시킴을 포함하여, 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질의 비 세포 생산성을 증가시키는 방법으로서, 여기서
    a. 제1 폴리뉴클레오타이드는 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하고
    b. 제2 폴리뉴클레오타이드는 관심 단백질을 암호화하여,
    c. 상기 관심 단백질 및 상기 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질이 상기 세포에 의해 발현되는,
    세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질의 비 세포 생산성을 증가시키는 방법.
  19. 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질을 발현하는 세포의 형질감염 효율을 증가시키는 방법으로서,
    a. 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드로 상기 세포를 형질감염시키고,
    b. 이어서 관심 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드로 상기 세포를 형질감염시키며,
    c. 이때, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드가 상이한 벡터계에 위치함
    을 포함하는, 세포 내에서 관심 막 단백질 또는 분비 단백질을 발현하는 세포의 형질감염 효율을 증가시키는 방법.
  20. 2개의 폴리뉴클레오타이드, 즉
    a. 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및
    b. 관심 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하는 발현 벡터.
  21. 제20항에 있어서, START 도메인 단백질이 PCTP, StarD7, GPBP, StarD10, StarD8, StarD13, DLC-1, StarD4, StarD6, StarD5, MLN64, StAR, THEA-2, CACH 또는 StarD9 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체와 같은 포유동물 START 도메인 패밀리 구성원인 발현 벡터.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, START 도메인 단백질이 세라마이드 전이 단백질 CERT(서열번호 11 또는 서열번호 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체인 발현 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 돌연변이된 CERT가 CERTS132A(서열번호 15)인 발현 벡터.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드가 분비 경로를 통해 세포의 단백질 수송을 증가시키는 발현 벡터.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 세포.
  26. 제25항에 있어서, 세포가 효모, 식물, 벌레, 곤충, 조류, 어류, 파충류 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포인 세포.
  27. 제26항에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 세포.
  28. 제27항에 있어서, 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO), 원숭이 신장 CV1, 원숭이 신장 COS, 사람 수정체 상피 PER.C6TM, 사람 배아 신장, HEK293, 어린 햄스터 신장, 아프리카 녹색 원숭이 신장, 사람 자궁경부 암종, 개 신장, 버팔로 래트 간, 사람 폐, 사람 간, 마우스 유방암 또는 골수종 세포, 개, 돼지 또는 마카크 세포, 래트, 토끼, 고양이, 염소, 바람직하게는 CHO 세포인 세포.
  29. 제28항에 있어서, CHO 세포가 CHO 야생형, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, 바람직하게는 CHO DG44인 세포.
  30. 제1항 내지 제29항에 따른 어느 한 방법에 의해 생산된 관심 단백질, 바람직하게는 항체.
  31. 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 발현을 차단하거나 감소시키는데 유용한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, START 도메인 서열이 세라마이드 전이 단백질 CERT(서열번호 11 또는 서열번호 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체인 약제학적 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열이 RNAi, siRNA 또는 안티센스 RNA인 약제학적 조성물.
  34. 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인, 바람직하게는 CERT(서열번호 11 또는 서열번호 13) 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질의 저해제 또는 억제제를 포함하는 약제학적 조성물.
  35. a. 스테로이드생성 급성 조절 관련 지질 전이(START) 도메인 또는 이의 유도체 또는 돌연변이체, 바람직하게는 CERT를 포함하는 아미노산 서열을 보유한 단백질을 제공하고,
    b. 상기 단계 a)의 단백질을 시험 제제와 접촉시키고,
    c. 세포 표면 단백질의 증가 또는 감소된 단백질 분비 또는 발현과 관련된 효과를 측정함을 포함하여,
    START 도메인 단백질 기능, 바람직하게는 CERT 기능의 조절자(modulator)를 확인하는 방법.
  36. 암 치료를 위한 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 적용을 포함하는 방법.
  37. 관심 단백질의 생산 및/또는 분비를 증가시키기 위한, START 도메인 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 START 도메인 단백질의 용도.
  38. 제1항 내지 제38항에 따른 어느 한 방법, 발현 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 진단학적 용도.
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