BRPI0808542A2 - Aperfeiçoamento de produção de proteína - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "APERFEIÇOAMENTO DE PRODUÇÃO DE PROTEÍNA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA TÉCNICA A presente invenção refere-se ao campo de tecnologia de cultu

ra celular. A presente invenção refere-se a um método para produção de proteínas bem como um método para gerar novos vetores de expressão e células hospedeira para fabricação biofarmacêutica. A invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas e métodos de tratamento.

ANTECEDENTES

O mercado para biofarmacêuticos para uso em terapia humana continua a crescer em uma taxa com 270 biofarmacêuticos novos sendo avaliados em estudos clínicos e vendas estimadas de 30 bilhões em 2003 (Werner, 2004). Biofarmacêuticos podem ser produzidos a partir de vários 15 sistemas de célula hospedeira, incluindo células bacterianas, células de levedura, células de inseto, células de planta e células de mamífero incluindo linhagens celulares derivadas de ser humano. Atualmente, um número crescente de biofarmacêuticos é produzido a partir de células eucarióticas devido a sua habilidade em processar e modificar corretamente proteínas humanas. 20 Produção bem sucedida e de alto rendimento de biofarmacêuticos a partir dessas células é então crucial e depende muito das características da linhagem de célula monoclonal recombinante usada no processo. Então, há uma necessidade urgente de gerar novos sistemas de célula hospedeira com propriedades aperfeiçoadas e estabelecer métodos para culturar linhagens 25 de célula produtoras com produtividades específicas altas como uma base para processos de alto rendimento.

Abordagens iniciais focaram em elaboração de processo e elaboração de reator. Agora os principais aperfeiçoamentos são dirigidos por desenvolvimento de formulação de meio e engenharia genética de células 30 hospedeira. Os sistemas de célula hospedeira de mamífero industriais mais comuns para a produção de biofarmacêuticos são linhagens de célula de ovário de hamster Chinês (CHO) imortalizadas (Wurm, 2004). Estratégias de engenharia metabólica iniciais para aperfeiçoar produção de linhagens de célula focaram em sua habilidade em crescer em suspensão em meios livres de soro. Expressão estável de transferrina e fator de crescimento 1 do tipo insulina (IGF-1) em células CHO-K1 resultou em uma linhagem de célula capaz de proliferar sob condições livres de proteína (Pak e outros, 1996). Abordagens iniciais para melhorar a produção de linhagens de célula incluíam o uso de elementos de DNA reguladores nos vetores de transfecção pretendidos direcionar ou criar regiões transcripcionais. Elementos reguladores tal como S/MARs (regiões associadas a andaime/matriz - (Andaime/matrix-associated regions)) que afetam a estrutura da cromatina e UCOEs (Elementos de abertura de cromatina ubíquos (Ubiquitous chromatin opening elements) derivados de genes de manutenção foram ambos mostrados afetar positivamente produtividades específicas de proteínas recombinantes produzidas a partir de linhagens de célula CHO (Barnes e Dickson, 2006).

Como apoptose tem sido mostrada ser a causa predominante de morte celular em processos de produção de cultura de célula de mamífero (al-Rubeai e Singh, 1998) o efeito de expressão de genes antiapoptóticos em células hospedeira de mamífero sobre viabilidade de cultura foi investi20 gado a fundo. A maioria das estratégias de engenharia de apoptose é focada na superexpressão de genes antiapoptóticos da família bcl-2 (por exemplo, bcl-1 ou bcl-xL; (Kaufmann e Fussenegger, 2003). Ao aumentar a resistência celular à fermentação durante estímulos apoptóticos, tal como depleção de nutriente e acúmulo de subproduto de refugo, processos de produção com 25 linhagens de célula engenheiradas para apoptose mostraram viabilidade de cultura prolongada e em alguns casos um aumento em rendimento de produto (Chiang e Sisk, 2005).

Uma vez que a maioria dos produtos biofarmacêuticos são proteínas que são secretadas de células durante o processo de produção, o maquinário de transporte secretor da linhagem de célula de produção é outro alvo interessante para novas estratégias de engenharia de célula hospedeira. Secreção de proteína é um mecanismo de multietapa complexo: proteínas destinadas a serem transportadas para o espaço extracelular ou à membrana de plasma externa são primeiro cotraducionalmente importadas para o retículo endoplásmico. A partir daí, elas são embaladas em vesículas 5 de lipídeo e transportadas para o aparelho de Golgi e finalmente da rede trans-GoIgi (TGN) para a membrana de plasma onde elas são liberadas para o meio de cultura (Seth e outros, 2006).

O rendimento de qualquer processo de produção biofarmacêutico depende muito da quantidade de produto de proteína que as células pro10 dutoras secretam por vez quando cultivadas sob condições de processo. Muitos processos intracelulares bioquímicos complexos são necessários para sintetizar e secretar uma proteína terapêutica a partir de uma célula eucariótica. Todas essas etapas tal como transcrição, transporte de RNA, tradução, modificação pós-traducional e transporte de proteína são estritamente 15 reguladas na linhagem de célula hospedeira do tipo selvagem e vão impactar a produtividade específica de qualquer linhagem de célula produtora derivada deste hospedeiro.

Muitas abordagens de engenharia têm empregado a crescente compreensão das redes moleculares que dirigem processos tal como transcrição e tradução para aumentar o rendimento dessas etapas em produção de proteína. No entanto, como para qualquer processo de produção de multietapa, ampliação de um gargalo de garrafa durante as primeiras etapas da cadeia de processo possivelmente cria gargalos de garrafa mais a jusante, especialmente pós-tradução. Até um certo limiar, a produtividade específica de uma célula de produção foi relatada se relacionar linearmente com o nível de transcrição de gene de produto (Barnes e outros, 2007). Aumento adicional de expressão de produto no nível de mRNA, no entanto, pode levar a uma sobrecarga da síntese, enovelamento ou maquinário de transporte de proteína, resultando em acúmulo intracelular do produto de proteína. Na verdade, isto pode ser frequentemente observado em processos de fabricação atuais (Figura 1).

Abordagens de engenharia direcionadas específicas que pretendem se direcionar a este problema e melhorar eficientemente a secreção de produtos de proteína a partir de células eucarióticas são embaraçadas pela presente falta de compreensão da rede de regulagem completa que direciona o transporte de proteínas para a membrana do plasma.

5 Os primeiros estudos sobre engenharia do transporte intracelular

de proteínas terapêuticas secretadas foram centrados na superexpressão de chaperonas moleculares tal como proteína de ligação BiP/GRP78, proteína de dissulfeto isomerase (PDI). Chaperonas são proteínas celulares hospedadas dentro do retículo endoplásmico (ER) e auxiliam no enovelamento e 10 montagem de proteínas recém-sintetizadas. Em contraste com o que poderia ser esperado, superexpressão de BiP em células de mamífero foi mostrada reduzir ao invés de aumentar a secreção de proteínas com a qual ela se associa (Dorner e Kaufman, 1994). Da mesma maneira, superexpressão de PDI em células CHO reduziu a expressão de uma proteína de fusão TN15 FR:FC (Davis e outros, 2000), enquanto a taxa de produção específica de um anticorpo foi aumentada em 40% (Borth e outros, 2005). Uma possível explicação para essas surpreendentes constatações, que o aumento da capacidade de enovelamento de proteína da célula cria um gargalo de garrafa de produção mais a jusante, é apoiada por um trabalho descrevendo pro20 blemas de transporte ER para cis-GoIgi para produção de IFN-gama em uma linhagem de célula CHO (Hooker e outros, 1999).

Outra abordagem recente para aumentar a capacidade de secreção de células de mamífero é a superexpressão heteróloga do fator de transcrição da proteína 1 de ligação de caixa X (XPB-1). XBP-1 é um dos 25 reguladores master na diferenciação de células de plasma, um tipo de célula especializado otimizado para produção e secreção de alto nível de anticorpos (Iwakoshi e outros, 2003). XBP-1 regula este processo através da ligação dos chamados elementos responsivos ao estresse do ER (ERSE) (ER stress responsive elements) dentro dos promotores de um espectro amplo 30 de genes de curso secretor, resultando em (i) uma expansão física do ER, (ii) massa e função mitocondriais aumentadas, (iii) tamanho de célula maior e (iv) síntese de proteína total aumentada (Shaffer e outros, 2004). Recentemente, foram descritas tentativas para aumentar secreção de proteína através de superexpressão de XBP-1 em células de nãoplasma, especialmente produção de linhagens de célula. Em células CHOK1, o nível de produção de duas proteínas repórteres (fosfatase alcalina se5 cretada (SEAP) (secreted alkaline phosphatase) e alfa-amilase secretada (SAMY) (secreted alpha-amylase)) foi mostrado aumentar após introdução de XBP-1 em células CH0-K1. No entanto, nenhum efeito pôde ser demonstrado em estudos transientes com outras linhagens de célula tal como células HEK293, HeLa ou HT-1080 (Tigges e Fussenegger, 2006). O pedido de 10 patente W02004111194 de Ailor Eric reivindica a superexpressão de XBP-1 ou ATF6 para a geração de linhagens de célula altamente produtivas.

Notavelmente, XBP-1 não apenas regula diferenciação de célula de plasma, mas também desempenha um papel importante na resposta de proteína não-enovelada (UPR (unfolded protein response)) (Brewer e Hen15 dershot, 2005). A UPR representa uma rede de transdução de sinal complexa ativada pela inibição de enovelamento de proteína no retículo endoplásmico (ER). A UPR coordena respostas adaptativas a esta situação de estresse, incluindo indução de chaperona molecular residente no ER e expressão de proteína foldase para aumentar a capacidade de enovelamento de 20 proteína do ER, indução de síntese de fosfolipídeo, atenuação de tradução geral e suprarregulagem de degradação associada a ER para diminuir a carga de proteína não-enovelada do ER. Sob estresse do ER severo ou prolongado, a UPR por fim induz à morte de célula apoptótica (Schroder, 2006).

O processo de diferenciação terminal, tal como a maturação a 25 partir de um linfócito para uma célula de plasma, é geralmente considerado um programa tipo apoptose, durante o qual a célula perde sua capacidade proliferativa para dar origem a uma célula secretora terminalmente diferenciada. Na verdade, quase todos os tipos de célula especificamente projetados para secreção de proteína de alto nível (por exemplo, células glandulares, 30 células beta pancreáticas) são terminalmente diferenciados, não são capazes de proliferar e têm expectativa de vida limitada antes de por fim sofrerem morte de célula programada (Chen-Kiang, 2003). Então, superexpressão de XBP-1 como um regulador de ambas a diferenciação de célula de plasma e a UPR é potencialmente desvantajosa devido ao seu risco inerente em inibir proliferação e/ou induzir apoptose.

Tomados juntos, há uma necessidade de melhora da capacida5 de secretora de células hospedeira para produção de proteína recombinante. Isto poderia se tornar ainda mais importante em combinação com novas tecnologias de aumento de transcrição e em processos de título alto a fim de prevenir gargalos de garrafa pós-tradução e acúmulo intracelular do produto de proteína (Figura 1). No entanto, no momento, há dois grandes obstáculos 10 no caminho para manipulação direcionada do maquinário de transporte secretor: o conhecimento ainda limitado sobre os mecanismos reguladores de base e a necessidade de prevenir uma resposta inibidora de crescimento ou apoptótica da célula produtora.

A presente invenção descreve um novo e surpreendente papel 15 para a proteína de transferência de ceramida (CERT (ceramide transfer protein)) no transporte de proteínas secretadas para a membrana de plasma e ainda provê um método para aperfeiçoar eficientemente a produção de proteínas que são transportadas através do curso secretor a partir de células eucarióticas.

A CERT (também conhecida como proteína de ligação de antí

geno Goodpasture) é uma proteína citosólica essencial para a aplicação não-vesicular de ceramida a partir de seu local de produção no retículo endoplásmico (ER) para membranas de Golgi, onde conversão para esfingomielina (SM) acontece (Hanada e outros, 2003).

Existem duas isoformas de CERT: a mais abundantemente ex

pressa, forma alternativamente unida sem uma região rica em serina, de 26 aminoácidos, (SEQ ID NOs: 10, 11) e a proteína de 624 aminoácidos de comprimento completo, chamada CERTl (SEQ ID NOs: 12,13) (Raya e outros, 2000). Ambas as isoformas de CERT possuem um domínio de transfe30 rência de lipídeo (START) relacionado com regulador agudo esteroidogênico (StAR) (steroidogenic acute regulatory) carboxiterminal que é necessário e suficiente para ligação e transporte de ceramida (Hanada e outros, 2003). Domínios START são altamente conservados de mosca e verme para humanos (Figura 2). Eles são de -210 aminoácidos de comprimento e formam um túnel hidrofóbico que acomoda um lipídeo monomérico (Alpy e Tomasetto, 2005; Soccio e Breslow, 2003). Domínios START são encontrados em 15 proteínas de mamífero, com CERT sendo mais intimamente relacionadas com a proteína de transferência de fosfatidilcolina Pctp, que se liga e move fosfatidilcolina (PC) entre as membranas, e StarDI 0, uma proteína de transferência de lipídeo específica para PC e PE (Olayioye e outros, 2005; Soccio e Breslow, 2003; Wirtz, 2006). Em adição ao domínio START, as proteínas CERT contêm ainda um domínio PH amínoterminal com especificidade para Pl(4) que é responsável pela localização em Golgi (Hanada e outros, 2003; Levine e Munro, 2002) e um motivo FFAT (duas fenilalaninas em um trato ácido) que direcionam a proteína ao ER através de interação com as proteínas de tansmembrana residentes em ER VAP-A e VAP-B (Kawano e outros, 2006; Loewen1 2003).

O papel fundamental de CERT em tráfego de lipídeo foi demonstrado na linhagem de célula de ovário de hamster Chinês LY-A, em que a expressão de uma proteína CERT não-funcional mutante prejudicou o transporte de ceramida, então resultando em níveis celulares reduzidos de esfin20 gomielina (Hanada e outros, 2003). Transferência de lipídeo não-vesicular é pensada ocorrer nos chamados sítios de contato de membrana (MCS) (membrane contact sites), em que ER fica em oposição íntima com outras organelas (Levine e Loewen, 2006). CERT pode então se mover a uma distância muito curta entre ER e membranas de Golgi, ou talvez contatar ambos 25 os compartimentos simultaneamente. Quando superexpressa, o domínio START de CERT é suficiente para transferência de ceramida para o aparelho de Golgi (Kawano e outros, 2006). No entanto, sob condições fisiológicas, ambos os motivos de direcionamento de Golgi e ER são essenciais para funcionamento de CERT. Em células LY-A, CERT foi identificada conter 30 uma mutação dentro de seu domínio PH (G67E), tornando a proteína eficaz em ligação de PI(4)P (Hanada e outros, 2003). A necessidade de PI(4)P para funcionamento de CERT é apoiada mais por um recente trabalho que atividade de PI4KIII-beta é necessária para tráfico de ceramida eficiente para o Golgi (Toth e outros, 2006), cuja atividade enzimática é estimulada pela proteína quinase D (PKD (protein kinase D)).

PKD pertence a uma subfamília de proteínas cinases específicas 5 de serina/treonina (compreendendo PKD1/PKCp, PKD2 e PKD3/PKCU) e foi recentemente identificada ser de importância crucial para a regulagem de transporte de proteína da membrana de Golgi para a membrana de plasma (revisto em (Rykx e outros, 2003; Wang, 2006)). Recrutamento e ativação de PKD na TGN são mediados pelo lipídeo diacilglicerol (DAG); (Baron e Ma10 lhotra, 2002)), um grupo do qual é gerado através de esfingomielina sintase de ceramida e fosfatidilcolina.

A presente invenção mostra que PKD fosforila CERT em serina 132 adjacente ao domínio PH1 com o que ligação de PI(4)P, direcionamento de Golgi e atividade de transferência de ceramida são negativamente regu15 lados. Ainda, através de transferência de ceramida que é requerida para produção de DAG para membranas de Golgi, CERT estimula atividade de PKD, então estabelecendo uma alça de feedback reguladora que assegura a manutenção de transporte secretor constitutivo.

Importante, os dados providos adicionalmente mostram que em linhagens de célula eucariótica diferentes (COS7 e HEK293), introdução do gene codificando CERT aumenta significantemente a secreção de uma proteína heteróloga no meio de cultura. Este efeito é ainda mais pronunciado quando usando um mutante de CERT que não pode ser fosforilado por PKD. Deleção do sítio aceitador de fosforilação dentro de CERT interrompe o controle negativo de PKD em CERT, mas deixando o feedback positivo de CERT em PKD intacto através do apoio da conversão de ceramida em esfingomielina e DAG. Pode então ser especulado que o mecanismo de aumento de secreção da presente invenção pode ser exercido não apenas por uma CERT do tipo selvagem, mas também por todos os mutantes de CERT que tiram CERT da influência negativa de PKD, incluindo mutações por ponto do aceitador serina, deleções incluindo este resíduo bem como mutações ou deleção do sítio de ancoragem de PKD dentro de CERT ou até mesmo do domínio START sozinho.

CERT pertence à família de proteínas de Transferência de Lipídeo relacionadas a StAR (Soccio e Breslow, 2003), que são caracterizadas por seus domínios START para ligação de lipídeo. Como o domínio START 5 de CERT foi demonstrado ser ambos requerido e suficiente para ação de CERT (Hanada e outros, 2003), é possível que o efeito de promoção de secreção de CERT pudesse ser igualmente observado quando superexpressando outro membro desta família de proteína. Isto é especialmente provavelmente para os membros intimamente relacionados da subfamília PCTP, 10 compreendendo PCTP (SEQ ID NOs26,27), própria CERT/GPBP, StarD7 e StarDI0. Essas proteínas têm especificidades de ligação de lipídeo distintas e poderiam impactar igualmente o funcionamento de organelas envolvidas na secreção de proteínas heterólogas. Ainda, expressão das proteínas relacionadas STARD4 (SEQ ID N0s:20, 21) e STARD5 (SEQ ID NOs: 22, 23), 15 que são induzidas quando do estresse do ER, pode funcionar para satisfazer à grande demanda de transferência de lipídeo de células durante o processo de produção.

A existência de proteínas do domínio START em organismos eucarióticos de mosca, verme e camundongo para humanos indica que os 20 mecanismos básicos de tráfego de lipídeo são conservados entre o reino eucariótico. Ela ainda sugere que o princípio descrito na presente invenção isto é, secreção alta através da expressão reforçada de CERT - pode ser bem aplicada a todas as células eucarióticas, incluindo levedura.

Sumarizando, a presente invenção provê um método para au25 mento do transporte secretor de proteínas em células eucarióticas através da expressão heteróloga de CERT, mutantes de CERT ou outro membro da família de proteína START. Este método é particularmente útil para a geração de sistemas de célula hospedeira otimizados com capacidade de produção aumentada para a expressão e fabricação de produtos de proteína re30 combinante.

O método descrito na presente invenção é vantajoso em vários

aspectos: primeiro, a requerente demonstrou a expressão heteróloga de CERT ser uma estratégia para aumentar a produção de proteína recombinante através do aumento da capacidade secretora da célula hospedeira. Aumento da produtividade específica de células produtoras se traduz em 5 rendimentos de produto mais altos em processos de produção de proteína industriais. Com a tendência atual para processos de título alto e tecnologias de aumento da expressão mais sofisticadas, gargalos de garrafa póstraducionais se tornarão as etapas de limitação de taxa evidentes em produção de proteína e então vão atrair grande atenção para abordagens de en10 genharia de secreção.

segundo, o domínio START de CERT é altamente conservado em eucariontes de C. elegans para seres humanos. Isto sugere fortemente que o método da presente invenção não pode ser apenas baseado em sistemas de célula hospedeira de mamífero, mas é igualmente aplicável para 15 produção de proteína em todas as células eucarióticas, incluindo células de inseto e células de levedura.

Como uma terceira característica importante, CERT como um fator citosólico não é parte da resposta de proteína não-enovelada e então não está envolvida em um programa de resposta de estresse celular que 20 induz a parada de tradução de proteína e - se não resolvido - leva à parada do ciclo celular ou até mesmo apoptose. Em contraste, ao desempenhar um papel independente em tráfego de lipídeo, direcionamento de CERT poderia conferir secreção de proteína aumentada sem indução concomitante de apoptose. Então, superexpressão de CERT em células hospedeira produtoras 25 poderia ser vantajoso sobre abordagens de engenharia genética baseadas em XBP-1.

quarto, é mostrado na presente invenção que mutação de Ser132 de CERT prejudica a fosforilação de CERT por PKD que livra CERT de uma influência reguladora negativa. Nesse ínterim, a estimulação positiva 30 de PKD por CERT através de DAG é deixada intacta (Figura 3A). Esta constatação põe CERT no curso de sinalização a "montante" de PKD, que foi publicada para ser criticamente envolvida na regulagem de estágios finais de transporte secretor, a saber o transporte da rede trans-GoIgi para a membrana de plasma (Liljedahl e outros, 2001). Com relação ao transporte de proteína, isto quer dizer que CERT age "a jusante" do ER que torna CERT o alvo preferido para manipulação comparado com XBP-1 ou proteínas residindo em ER específicas (Figura 3B).

Uma vez que CERT pode impactar até mesmo as últimas etapas do curso secretor, pode ser especulado que expressão heteróloga de CERT tem o potencial de aumentar a secreção sem criar gargalos de garrafa mais a jusante. Para o conhecimento da requerente, CERT é atualmente o alvo de 10 ação mais a jusante para engenharia genética do curso secretor para aumentar a produção de proteína heteróloga.

Tomados juntos, o impacto da proteína de transferência de lipídeo CERT sobre o transporte secretor de ER para Golgi e do aparelho de Golgi para a membrana de plasma, sem a desvantagem de conexão com 15 uma resposta de estresse de inibição de crescimento ou indução de apoptose, torna CERT, mutantes de CERT e outras proteínas da família START alvos muito atraentes e promissores para abordagens de engenharia genética que objetivam aumentar a capacidade secretora de células eucarióticas. APLICABILIDADE

A manipulação direcionada de CERT que é descrita na presente

invenção pode ser usada para uma faixa de aplicações ampla. Em particular, duas abordagens básicas podem ser distinguidas:

(i) superexpressão e/ou aumento da atividade de CERT ou um derivado de CERT para aumentar a capacidade de transporte secretor de

uma célula, ou

(ii) redução da atividade e/ou expressão de CERT como um meio de terapia de gene a fim de reduzir a proliferação e/ou invasão de câncer.

Aplicabilidade de superexpressão de CERT A invenção descrita descreve um método para gerar células

hospedeira eucarióticas aperfeiçoadas para a produção de proteínas heteróIoqas através da introdução do gene codificando CERT, mutantes de CERT ou outras proteínas da família de proteína START. Isto vai permitir aumentar o rendimento da proteína nos processos de produção com base em células eucarióticas. Ele vai então reduzir o custo de produtos de tais processos e ao mesmo tempo reduzir o número de bateladas que precisam ser produzi5 das para gerar o material necessário para estudos de pesquisa, diagnóstico, estudos clínicos ou fornecimento de mercado de uma proteína terapêutica. A invenção vai então acelerar o desenvolvimento de fármaco uma vez que frequentemente a geração de quantidades suficientes de material para estudos pré-clínicos é um pacote de trabalho crítico com relação à linha de tempo.

A invenção pode ser usada para aumentar a propriedade de to

das as células eucarióticas usadas para a geração de uma ou várias proteínas específicas ou para propósitos de diagnóstico, propósitos de pesquisa (identificação alvo, primeira identificação, primeira otimização) ou fabricação de proteínas terapêuticas ou no mercado ou em desenvolvimento clínico.

Conforme mostrado na presente invenção, expressão heteróloga

de CERT não apenas aumenta secreção de proteína, mas também tem uma influência sobre a abundância de proteínas de transmembrana na superfície celular. Inibição ou expressão reduzida de CERT leva a uma redução drástica da quantidade de receptores de superfície celular tal como o receptor 20 transferrina (Figura 8). Como proteínas secretadas e de transmembrana compartilham os mesmos cursos secretores e são igualmente transportadas em vesículas de lipídeo, esses dados ressaltam a importância de CERT na modulação de secreção bem como o transporte de receptores de superfície celular ligados à membrana.

Então, o método descrito aqui pode ser também usado para pro

pósitos de pesquisa acadêmica e industrial que objetivam caracterizar o funcionamento de receptores de superfície celular. Por exemplo, ele pode ser usado para a produção e subsequente purificação, cristalização e/ou análise de proteínas de superfície. Isto é de importância crucial para o desenvolvi30 mento de novas terapias de fármaco humanas como receptores de superfície celular são uma classe predominante de alvos de fármaco. Além disso, ele poderia ser vantajoso para o estudo de complexos de sinalização intraceIular associados com receptores de superfície celular ou a análise de comunicação célula-célula que é mediada em parte pala interação de fatores de crescimento solúveis com seus receptores correspondentes na mesma ou outra célula.

5 Aplicabilidade de diminuição/inibição de CERT

Na presente invenção, a requerente provê evidência que a redução de expressão de CERT leva à secreção reduzida de proteínas extraceluIares solúveis bem como uma abundância menor de receptores de superfície celular. Isto torna CERT um alvo atraente para manipulação terapêutica.

Um dos marcos na conversão de uma célula saudável normal

para uma célula cancerosa é a aquisição de independência da presença de fatores de crescimento exógenos (Hanahan e Weinberg, 2000). Em contraste com a célula normal, células de tumor são capazes de produzir todos os fatores de crescimento necessários para sua sobrevivência e proliferação 15 por si só. Em adição a este mecanismo autócrino, células cancerosas frequentemente mostram uma expressão supra-regulada de receptores de fator de crescimento em sua superfície, o que leva a uma responsividade alta com relação a fatores de crescimento e de sobrevivência de ação parácrina secretados de células no tecido circundante. Ao se direcionar a CERT em célu20 Ias de tumor, por exemplo, usando abordagens de siRNA, pode ser possível romper mecanismos estimuladores de crescimento e/ou de sobrevivência autócrinos bem como parácrinos de duas maneiras: (i) reduzindo o transporte e secreção de fator de crescimento e (ii) diminuindo a quantidade do receptor de fator de crescimento correspondente em células de tumor. Deste 25 modo ambas a quantidade de sinal de estimulação de crescimento e a habilidade da célula de câncer em perceber e responder a esses sinais serão reduzidas. Inibição de expressão de CERT em células de câncer poderia então representar uma ferramenta poderosa para prevenir proliferação e sobrevivência de célula cancerosa.

CERT poderia então ser um alvo terapêutico potente para su

primir invasão e metástase de tumor. Durante os últimos estágios da maioria dos tipos de câncer humano, tumores primários geram células pioneiras que se mudam, invadem tecidos adjacentes e viajam para sítios distantes onde elas podem ser bem-sucedidas em encontrar novas colônias, conhecidas como metástase.

Como um pré-requisito para invasão de tecido, células de câncer expressam um conjunto integral de proteases que permite que elas migrem através do tecido saudável circundante, cruzar a membrana basal, entrar na corrente sanguínea e finalmente invadir o tecido de destino. Algumas dessas proteases são expressas como proteínas ligadas à membrana, por exemplo, MT-MMPs (Egeblad e Werb, 2002) e ADAMs (Blobel, 2005). Devido ao seu papel crucial em remodelagem de matriz, vazamento de fatores de crescimento e invasão de tumor, proteases em si são discutidas como alvos de fármaco para terapia de câncer (Overall e Kleifeld, 2006). A requerente toma como hipótese que inibição de expressão e/ou atividade de CERT em células de tumor vai reduzir a quantidade de proteases ligadas à membrana sobre a superfície da célula-alvo. Isto poderia diminuir ou até mesmo prejudicar a capacidade invasiva da célula de tumor bem como sua habilidade de vazamento de fator de crescimento, resultando em invasividade e potencial metastático do tumor reduzidos. Então, direcionamento de CERT poderia oferecer um novo modo de prevenir tumorigênese de último estágio, especialmente a conversão de um nódulo benigno/sólido para um tumor metastatizante, agressivo.

Para aplicação terapêutica ela é, então, o alvo para reduzir e/ou inibir a atividade e/ou expressão de CERT. Isto pode ser conseguido ou através de uma composição de nucleotídeo que é usada como agente tera25 pêutico humano para tratar uma doença através da inibição do funcionamento de CERT com o que o fármaco é composto de um RNAi, e siRNA ou um RNA antissentido especificamente inibindo CERT através da ligação de um motivo de seqüência de RNA de CERT. Redução/inibição da atividade/expressão de CERT pode ser também conseguida por uma substância de 30 fármaco contendo nucleotídeos se ligando e silenciando o promotor do gene de CERT.

Ainda, uma substância ou produto de fármaco pode ser composto de uma nova entidade química ou peptídeo ou proteína inibindo expressão ou atividade de CERT. No caso de uma proteína ser o composto farmacêutico ativo ela pode ser uma (i) proteína se ligando ao promotor de CERT deste modo inibindo expressão de CERT, (ii) proteína se ligando a CERT ou 5 PKD então prevenindo ligação de PKD e CERT e impedindo a fosforilação de CERT por PKD, (iii) proteína similar à CERT que no entanto não realiza funções de CERT, que significa uma variante de CERT "dominante-negativa" ou (iv) proteína agindo como andaime para ambas as CERT e PKD, resultando em ligação irreversível de CERT a PKD (= um complexo PKD/CERT 10 estável) que não é funcional devido à fosforilação inibidora de CERT por PKD e o impedimento de dissociação de CERT do dito complexo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção não é óbvia a partir da técnica anterior. Até este ponto os únicos dados experimentais disponíveis sobre a proteína 15 CERT apontaram para um papel em transporte de ceramida a partir do retículo endoplásmico para o aparelho de Golgi como um precursor de esfingomielina. Apenas os dados descritos na presente invenção levam a um novo modelo de trabalho para um papel de CERT em transporte de proteína da membrana de Golgi para membrana de plasma em células eucarióticas. A 20 técnica anterior não dá nenhuma pista sobre a possibilidade de aumento da taxa de transporte secretor de proteínas em linhagens de célula eucariótica através da introdução do gene codificando CERT ou outro membro da família de proteína do domínio START.

O modelo de trabalho surpreendente e inesperado da presente invenção identifica CERT como um substrato de PKD in vivo novo e regulador crucial de funcionamento de Golgi.

PKD é conhecida da técnica anterior. Ela é uma família de proteínas cinases específicas de serina/treonina compreendendo três membros estruturalmente relacionados: PKD1/PKCp, PKD2 e PKD3/PKCI. PKD con30 tém dois motivos ricos em cisteína do tipo dedo de zinco aminoterminais que se ligam a DAG, um domínio de homologia à pleckstrin (PH) que regula negativamente função enzimática de PKD e um domínio quinase carboxiterminal.

As três isoformas de PKD se localizam no citosol, núcleo, complexo de Golgi e membrana de plasma, onde elas regulam processos celulares diversos, variando de proliferação, diferenciação, apoptose, reorganização citoesqueletal e metástase para tráfego de vesícula (revisto em (Rykx e outros, 2003; Wang, 2006)). Até agora, apenas alguns substratos de PKD fisiológicos são conhecidos, que incluem a proteína neuronal Kidins220, o efetor Ras RIN1, histona desacetilase 5, E-caderina e ΡΙ4ΚΙΙβ (Iglesias e outros, 2000; Jaggi e outros, 2005; Vega e outros, 2004; Wang e outros, 2002). Na TGN, PKD está criticamente envolvida na divisão de carreadores de transporte no caminho para a superfície celular (Liljedahl e outros, 2001; Yeaman e outros, 2004). PKD é recrutada para a TGN pelas suas regiões ricas em cisteína (Baron e Malhotra, 2002; Hausser e outros, 2002; Maeda e outros, 2001), onde ela é ativada por fosforilação mediada por PKCç (az Anel e Malhotra, 2005).

Recentemente PI4Klllâ foi identificada, uma peça-chave em estrutura e funcionamento do aparelho de Golgi, como um substrato de PKD nesta organela (Hausser e outros, 2005). Fosforilação mediada por PKD de PI4KIIlâ em serina 294 estimula sua atividade de lipídeo quinase, resultando 20 em produção de fosfatidilinositol 4-fosfato (PI(4)P) aumentada e transporte de proteína G do vírus da estomatite vesicular para a membrana de plasma (Hausser e outros, 2005).

A proteína quinase D (PKD) foi identificada como um regulador crucial de transporte secretor na rede trans-GoIgi (TGN). Recrutamento e 25 ativação de PKD na TGN são mediadas pelo lipídeo diacilglicerol (DAG), um grupo do qual é gerado através de esfingomielina sintase a partir de ceramida e fosfatidilcolina. A transferência não-vesicular de ceramida do retículo endoplásmico para o complexo de Golgi é mediada pela proteína de transferência de lipídeo CERT. Isto é descrito, por exemplo, em Hanada e outros, 30 2003, Nature, Vol. 426, 803-809 e Hanada, 2006, Molecular and Cellular Biochemistry, 286, 23-31, bem como nos pedidos de patente correspondentes W02005004898 e EP1652530. Em qualquer um desses documentos, no entanto, Hanada mostra ou aponta uma implicação de modulação da expressão ou atividade de CERT (sem falar outras proteínas do domínio START) em um método de produção de proteínas para propósitos de diagnóstico, pesquisa ou terapêuticos. Ainda, esses documentos/pedidos de pa5 tente não descrevem de modo algum o uso de um agente de bloqueio que reduza ou bloqueie completamente a expressão ou atividade de CERT em uma composição farmacêutica. Hanada então conclui usar CERT sozinha como um fármaco para promover transporte de ceramida.

A presente invenção, no entanto, identifica CERT como um 10 substrato de PKD in vivo novo. Fosforilação em serina 132 por PKD diminui a afinidade de CERT com relação ao seu lipídeo-alvo fosfatidilinositol 4- fosfato nas membranas de Golgi e reduz atividade de transferência de ceramida, identificando PKD como um regulador de homeostase de lipídeo. A presente invenção também mostra que CERT por sua vez é crítica para ati15 vação de PKD e transporte de carga de proteína dependente de PKD para a membrana de plasma. A interdependência de PKD e CERT é então uma chave para a manutenção da integridade da membrana de Golgi e transporte secretor.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Acúmulo de Produto Intracelular.

Aumento de produto intracelular durante fermentações de do tipo batelada alimentada mostrado para três processos. Fermentação do tipo batelada alimentada foi realizada usando três clones de célula produtoras CHO diferentes expressando anticorpos IgG humanos: Processo A (círcu25 los), B (diamantes) e M (triângulos), respectivamente). Dia sim, dia não, amostras de célula foram obtidas, fixadas e submetidas à imunofluorescência direta para detectar a cadeia leve do anticorpo. A quantidade de produto foi medida através de FACS e posta em gráfico com relação à quantidade no dia 1.

Figura 2: A Família de Proteína de Domínio Start

Montagem filogenética de (A) proteínas do domínio START humanas, (B) sua organização de domínio (4 TM, quatro transmembranas; Pre, pré-sequência mitocondrial; Thio, acil-CoA tioesterase) e (C) seus homólogos em mosca e verme (tomados de (Soccio e Breslow, 2003)).

Figura 3: CERT é um regulador crucial de funcionamento de Golqi e age a montante de XBP-1 no curso secretor.

5 (A) CERT e PKD estão conectadas em uma alça de feedback

reguladora. O esquema sumariza a hipótese de trabalho atual onde PKD é ativada por DAG e fosforila CERT. CERT fosforilada se separada de PI(4)P e libera ceramida no sítio de seu destino. Ceramida no Golgi é convertida em esfingomielina e DAG que por sua vez é necessário para ativação de PKD. 10 Este circuito pode ser interrompido por mutação do sítio de fosforilação de CERT (S132A).

(B) o desenho esquemático mostra o caminho de uma proteína secretada da transcrição e tradução através dos compartimentos de ER e Golgi para a membrana de plasma onde a proteína é finalmente liberada da 15 célula para o meio. As setas representam abordagens de engenharia genética recentes com o objetivo de aumentar a produção de proteína. A maioria dos esforços focou nas tecnologias de aumento de transcrição, poucas sobre engenharia de tradução e no momento apenas três exemplos foram relatados que se direcionam a proteínas envolvidas em processamento pós20 traducional dentro do ER (BiP, PDI e XBP-1). CERT age a jusante do ER no curso secretor e então para o conhecimento da requerente representa o primeiro alvo para engenharia nos últimos estágios do processo de secreção. Figura 4: CERT é detectada por um anticorpo de substrato de PKD.

(A) Células HEK293T foram transfectadas com plasmídeos de 25 expressão codificando CERTL e CERT marcadas com Flag. As células foram Iisadas 24 horas pós-transfecção e isoformas de CERT foram imunoprecipitadas com anticorpo anti-Flag. Proteínas imunoprecipitadas foram submetidas a SDS-PAGE, seguido por immunobloting com anticorpo de substrato de PKD (pMOTIF; painel superior) e, após extirpação, com anti

corpo anti-Flag (painel inferior).

(B) Células HEK293T foram transfectadas com plasmídeo de expressão Flag-CERT, junto com GFP-PKD1 K612W (PKD-KD) ou vetor vazio. CERT foi analisada através de Western blotting conforme descrito em

(A). Expressão de PKD-KD foi verificada através de immunobloting com um anticorpo específico de PKD (C20; painel inferior).

(C) Células COS7 foram cotransfectadas com plasmídeos de expressão FIag-CERT e PKD1-GFP1 fixadas e tingidas com anticorpo específico de Flag (vermelho). As imagens mostradas são pilhas de várias seções confocais. Escala, 20 pm.

Figura 5: PKD fosforila CERT em serina 132.

(A) Alinhamento das seqüências de peptídeo usadas para criar o

anticorpo do substrato de PKD e dois motivos de PKD potenciais em CERT.

(B) Células HEK293T foram transfectadas com plasmídeos de expressão codificando CERT marcada com Flag do tipo selvagem (WT) (Wild type), CERT-S132A e CERT-S272A. As células foram Iisadas e proteínas CERT foram imunoprecipitadas e analisadas através de Western blotting

conforme descrito na Figura 4.

(C) Proteínas de fusão do tipo selvagem (WT) GST-FIag-CERT e S132A recombinantes foram incubadas em tampão de quinase contendo [32P]-ã-ATP na ausência (-) e presença (+) de PKD1 purificada por 30 minutos. As proteínas foram separadas através de SDS-PAGE e transferidas pa

ra membrana. Incorporação de fosfato radioativo foi analisada usando um Phospholmager (parte superior), seguido por immunobloting com anticorpo específico de Flag para verificar carregamento igual das proteínas CERT.

(D) Proteínas CERT recombinantes foram submetidas a uma quinase in vitro com PKD1 purificada conforme descrito em (C) na presença

de ATP fria. Immunoblotting foi realizado com o anticorpo pMOTIF e, após extirpação, com anticorpo específico de FLAG para verificar carregamento igual das proteínas CERT. Proteínas PKD1 e CERT são marcadas com setas; as faixas com asteriscos são devido à ligação não-específica.

Figura 6: Fosforilação de CERT em serina 132 modula ligação de PI(4)P e

atividade de transferência de ceramida.

Células HEK293T foram transfectadas com plasmídeos de expressão codificando CERT marcada com GFP do tipo selvagem (WT, SEQ ID NOs.: 10, 12) e CERT-S132A (SEQ ID NO.:14). As células foram coletadas através de Iise hipotônica 24 horas pós-transfecção e a fração do citosol foi recuperada após centrifugação a 100.000 xg. Amostras contendo quantidades iguais de fluorescência de GFP foram usadas para (A) ensaios de 5 sobreposição de proteína-lipídeo. Citosol de células HEK293T expressando as variantes de CERT foi incubado com membranas salpicadas com um gradiente de concentração dos fosfoinositídeos diferentes e proteínas CERT ligadas foram detectadas através de seu marcador GFP.

(B) Lipossomas doadores contendo TNPPE e pireno-ceramida 10 foram misturados com um excesso de 10 vezes de Iipossomas aceitadores não-marcados. Após 60 segundos, citosol de células transientemente expressando CERT marcada com GFP do tipo selvagem (WT)1 S132A ou GFP sozinho (con) foi adicionado e fluorescência de pireno a 395 nm foi registrada (excitação: 340 nm). Os espectros foram normalizados para fluorescência 15 máxima em Triton X-100 e para fluorescência de GFP máxima.

Figura 7: CERT regula ativação e transporte secretor de PKD.

(A) Western Blot de Iisatos de célula integral de células HEK293T transfectadas ou com CERT marcada com Flag do tipo selvagem (SEQ ID N0s.:10, 12) ou mutante de CERT S132A (SEQ ID NO.:14). A

mancha foi sondada com anticorpo de PKD pS916 fosfoespecífico (painel superior), um anticorpo específico de PKD (painel do meio) e um anticorpo específico de FLAG (painel inferior), respectivamente, para verificar expressão dos construtos de CERT marcados com Flag.

(B) Medição da atividade de HRP nos sobrenadantes de células HEK293T cotransfectadas com Flag-ss-HRP e vetor vazio (barras pretas),

PKD1-GFP quinase morta (KD, barras brancas), FIag-CERT tipo selvagem (WT, barras sombreadas) ou FIag-CERT-SI 32A (cinza escuro). Unidades leves relativas (RLU) foram postas em gráfico nos pontos de tempo indicados após mudança do meio. Os valores correspondem à média de amostras em triplicata, barras de erro = SEM.

(C) Imunofluorescência confocal de GFP-CERT (verde) e o marcador de Golgi cis/médio GS28 (vermelho) em células COS7. As imagens mostradas são pilhas de várias seções confocais. Escala, 20 pm.

(D) Pilhas de imagens confocais mostrando a colocalização de GFP-CERT (verde) e HRP-FIag (vermelho) em células COS7. Escala, 20 μιτι e 5 μιτι (ampliação).

Figura 8: Supra-regulagem de CERT através de interferência de RNA inibe transporte secretor.

(A) Detecção quantitativa de atividade de HRP nos sobrenadantes de células COS7 tratadas ou com oligonucleotídeos de siRNA específicos de simulação (branco), IacZ (cinza claro = siRNA específico de IacZ 10 SEQ ID NO.:9) ou CERT (cinza escuro = siCERTNo.1 SEQ ID NO.: 7 e preto = siCERTNo.2 SEQ ID NO.:8). As unidades leves relativas (RLU) de experimentos em triplicata são mostradas, barras de erro = SEM.

(B) Western Blot dos Iisatos de célula de (A) experimentados com um anticorpo de receptor anti-transferrina. Carregamento igual foi confirmado usando um anticorpo específico anti-Tubulina.

Figura 9: Termos de consenso para o domínio START.

O consenso é dado em relação ao número de proteínas que se encaixa com esta seqüência de consenso e não em relação ao número de aminoácidos que se encaixa. Isto significa que para a seqüência de consen20 so de 80%, 80% das proteínas de domínio START comparadas têm o dado aminoácido em uma posição particular, por exemplo, um aminoácido hidrofóbico abreviado com "h". Esta seqüência de consenso foi gerada usando o programa baseado na WEB "SMART" (vide também Ponting & Aravind, 1999, TIBS 24, páginas 130-132).

(A) seqüência de consenso de 80% (SEQ ID NO.:28) para prote

ínas do domínio START.

(B) A seqüência de consenso do domínio START foi derivada de um alinhamento de aminoácido das proteínas do domínio START. O alinhamento inclui seqüências de consenso de 50 %, 65% e 80%.

Vide o agrupamento de aminoácido que segue para ajudar na

abreviação e classes correspondentes.

Residuos-Chave de Classe álcool ο

S1T

i,l,v

AiC1D1E1F1G1H1IjK1L1MiNiP1QiR1S1TiVjWiY

F1H1W1Y

D1E1H1K1R

A1C1F1G1H1I1K1L1M1R1T1V1W1Y

D1E

C1D1E1H1K1N1Q1R1S1T

H1K1R1

A1C1D1G1N1P1S1T1V

A1G1S

A1C1D1E1G1H1K1N1Q1R1S1T

alifático I

qualquer um . aromático a

carregado c

hidrofóbico h negativo polar p positivo +

pequenos

minúsculo u "turnlike" t

Figura 10: Introdução de CERT aumenta a produção de anticorpo monoclonal.

SA mutante foram estavelmente introduzidos em uma linhagem de célula de produção CHO secretando um anticorpo tipo IgG monoclonal humano. O efeito dos transgenes sobre a produtividade de IgG específico nesses clones estáveis foi então medido (A) em culturas de estoque seriais (B) sob condi20 ções de produção do tipo batelada alimentada como na Figura 11 com n=3-4 para cada genótipo. Barras de erro indicam desvios padrão. Um resultado representativo de três experimentos independentes é mostrado.

Figura 11: CERT heteróloga aumenta a secreção de HSA.

Células CHO secretando albumina de soro humano (HSA) foram estavelmente transfectados ou com um plasmídeo vazio ("Simulação"), CERT do tipo selvagem (CERT-WT) ou o mutante de CERT S132A (CERT-SA). A partir dos grupos de célula estáveis resultantes (n=3 por genótipo), o título de HSA foi determinado durante de 3 a 5 passagens seriais. A produtividade 30 específica para HSA (barras pretas) e o título (barras cinzas) foram calculados para cada genótipo e postos em gráfico como valores médios dos três agrupamentos. Barras de erro representam desvios padrão.

15

Construtos de expressão para simulação CERT-WT ou a CERT

(A) Título e produtividade específica altos em culturas seriais. (B) e (C) as células de (A) foram cultivadas em frascos de agitação por 7 dias e alimentadas a cada 24 horas a partir do dia 3. Amostras do fluido de cultura celular foram obtidas nos dias 3, 5 e 7 e submetidas à medição de título do produto de HSA recombinante. Produtividades específicas 5 (B) e título (C) foram calculadas e postas em gráfico durante o tempo de fermentação. As células que seguem foram comparadas: Células de simulação (- -), CERT-WT (-Á) e CERT-AS (-·-); barras de erro representam os desvios padrão de três grupos estáveis por genótipo.

LEGENDA PARA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA SEQ ID NO. 1: iniciador de PCR para DNA humano CERT-S132A.

SEQ ID NO. 2: iniciador de PCR para DNA humano CERT-S132Arev.

SEQ ID NO. 3: iniciador de PCR para DNA humano CERT-S272A.

SEQ ID NO. 4: iniciador de PCR para DNA humano CERT-S272Arev.

SEQ ID NO. 5: iniciador de PCR para DNA humano CERT-138truncamento. SEQ ID NO. 6: iniciador de PCR para DNA humano CERT138truncamentorev.

SEQ ID NO. 7: siRNA/DNA siCERT-1.

SEQ ID NO. 8: siRNA/DNA siCERT-2.

SEQ ID NO. 9: siRNA/DNA siLacZ.

SEQ ID NO. 10: humano: cDNA de CERT. SEQ ID NO. 11: humano: proteína CERT. SEQ ID NO. 12: humano: cDNA de CERT L. SEQ ID NO. 13: humano: proteína CERT L. SEQ ID NO. 14: humano: cDNAde CERT S132A. SEQ ID NO. 15: humano: proteína CERT S132A. SEQ ID NO. 16: humano: cDNA de CERT de domínio START. SEQ ID NO. 17: humano: Proteína CERT de domínio START. SEQ ID NO. 18: humano: cDNA de CERT L de domínio START. SEQ ID NO. 19: humano: Proteína CERT L de domínio START. SEQ ID NO. 20: humano: cDNA de StarD4. SEQ ID NO. 21: humano: proteína StarD4. SEQ ID NO. 22: humano: cDNA de StarD5. SEQ ID NO. 23: humano: proteína StarD5.

SEQ ID NO. 24: humano: cDNA de StarD6.

SEQ ID NO. 25: humano: proteína StarD6.

SEQ ID NO. 26: humano: cDNA de PCTP.

5 SEQ ID NO. 27: humano: proteína PCTP.

SEQ ID NO. 28: Seqüência de consenso do domínio START (Figura 9). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Modificação pós-traducional de proteínas através de fosforilação é um mecanismo comum para induzir mudanças conformacionais que moduIam atividade enzimática, fazem a mediação de interações proteína-proteína ou regulam localização subcelular. PKD é um regulador-chave no complexo de Golgi com ΡΙ4ΚΙΙΙβ sendo o único substrato local identificado até agora. Para testar se a proteína CERT localizada no complexo de Golgi pode servir como um substrato para PKD, a requerente fez uso de um anticorpo de substrato fosfoespecífico, chamado pMOTIF, criado contra motivos de consenso fosforilados por PKD (Doppler e outros, 2005). Células HEK293T foram transfectadas com vetores de expressão codificando CERT marcada com Flag e CERTl. As isoformas de CERT foram imunoprecipitadas com anticorpos específicos de Flag e analisadas através de Western blotting com o anticorpo pMOTIF (Figura 4Α). Um sinal pMOTIF correspondendo ao peso molecular de CERT e, mais fracamente, àquele de CERTl, foi detectado (Figura 4Α). A detecção mais fraca da isoforma de CERTl fosforilada pode estar relacionada a seu comportamento conhecido em formar agregados, que podem impactar acessibilidade de sítio fosfo para cinases (Raya e outros, 2000). Para investigar se reconhecimento de CERT pelo anticorpo pMOTIF era dependente de PKD, a requerente expressou CERT junto com uma variante de quinase morta de PKD1 (K621W) em células HEK293T. Este mutante foi mostrado se localizar no complexo de Golgi e suprimiu fosforilação de ΡΙ4ΚΙΙΙβ de uma maneira negativa dominante (Hausser e outros, 2005). Coexpressão de PKD inativa aboliu detecção de CERT com o anticorpo pMOTIF, sugerindo que o sinal pMOTIF era na verdade devido à fosforilação de CERT mediada por PKD (Figura 4B). Proteínas de transferência de lipídeo são imaginadas agir em MCS1 que são formados entre o ER e TGN (Levine e Loewen1 2006), onde PKD está localizada. Tingimento com imunofluorescência de CERT marcada com Flag em células COS7 coexpressas com PKD1 marcada com GFP verificou que as duas proteínas se colocalizam no 5 complexo de Golgi (Figura 4C). Experimentos de interferência de RNA sugerem que inativação simultânea de PKD1 e PKD2 foi requerida para reduzir fosforilação de CERT, indicando que essas duas isoformas eram principalmente responsáveis pela fosforilação de CERT, enquanto PKD3 pareceu desempenhar um papel menor (dados não-mostrados). Isto está de acordo 10 com as especificidades de substrato sobrepostas previamente relatadas de PKD1 e PKD2. Por exemplo, PKD1 e PKD2 foram ambas mostradas fosforiIar ΡΙ4ΙΙΙβ, enquanto PKD3 falhou em fazer isso (Hausser e outros, 2005).

Para identificar sítios de reconhecimento de pMOTIF em CERT, a requerente pesquisou motivos de consenso de PKD potenciais caracterizados por um resíduo leucina, isoleucina ou valina na posição 5 e arginina na posição 3 com relação a uma serina ou treonina. Duas serinas nas posições 132 e 272, combinando com o motivo de consenso de PKD e conservadas através das espécies (Figura 5A), foram trocadas por alaninas através de mutagênese direcionada a sítio. Esses mutantes foram expressos em células HEK293T e testados quanto ao reconhecimento pelo anticorpo pMOTIF. Interessantemente, mutação de serina 132 em alanina aboliu a detecção de CERT com o anticorpo pMOTIF e causou um aumento em mobilidade eletroforética, indicativa de perda de fosforilação, enquanto a mutação S272A não afetou o sinal pMOTIF (Figura 5B). Isto sugere que serina 132 é um sítio de fosforilação de PKD especificamente reconhecido pelo anticorpo do substrato de PKD. Para confirmar que PKD era capaz de fosforilar diretamente este resíduo serina em CERT, a requerente realizou ensaios de quinase in vitro com PKD1 purificada e proteínas de fusão GST CERT recombinantes produzidas em E. coli compreendendo os primeiros 138 aminoácidos da proteína. Quando a proteína de fusão CERT do tipo selvagem truncada foi incubada com PKD1 na presença de [γ-32Ρ]-ΑΤΡ, incorporação de radioatividade foi detectada (Figura 5C). Isto foi significantemente prejudicado no caso da proteína de fusão CERT-S132A. Fosforilação de PKD in vitro do tipo selvagem, mas não CERT-S132A, é mostrada adicionalmente gerar um sítio de reconhecimento para o anticorpo pMOTIF (Figura 5D). Tomados juntos, esses resultados provam que CERT é um substrato de PKD 5 genuíno in vitro e in vivo e identificam serina 132 como um sítio de fosforilação de PKD específico em CERT.

Serina 132 está em proximidade muito íntima com o domínio PH de CERT (aminoácidos 23-117), tornando possível que a fosforilação deste sítio afete ligação de PI(4)P através do aumento da carga negativa local. A requerente então quantificou ligação de PI(4)P de CERT do tipo selvagem e do mutante CERT-S132A através da realização de ensaios de sobreposição de proteína-lipídeo. Então, citosol de células HEK293T expressando transientemente as variantes de CERT foi incubado com membranas salpicadas com um gradiente de concentração dos fosfoinositídeos diferentes e proteínas CERT ligadas foram detectadas através de seu marcador GFP. Conforme previamente relatado, a proteína do tipo selvagem de comprimento completo demonstrou ligação fraca para várias espécies de fosfolipídeo, mas mostraram interação forte com PI(4)P (Hanada e outros, 2003; Levine e Munro, 2002). CERT-S132A se ligando a PI(4)P era detectável em concentrações duas a quatro vezes menores comparado com àquela da proteína do tipo selvagem, sugerindo afinidade maior do mutante CERT-S132A para este fosfolipídeo (Figura 6A). Juntos, esses dados implicam que CERT, uma vez ligada ao complexo de Golgi, é fosforilada por PKD. Isto então diminui a afinidade de CERT para PI(4)P e então regula a interação de CERT com membranas de Golgi.

A proteína CERT foi mostrada funcionar como uma proteína de transferência de lipídeo (Hanada e outros, 2003). A requerente então investigou se fosforilação de CERT em serina 132 influenciou sua habilidade em se ligar e transferir ceramida entre as membranas. Para esta finalidade, ver30 sões marcadas com GFP de CERT do tipo selvagem e CERT-S132A foram transientemente expressas em células HEK293T e a fração de citosol foi analisada quanto à atividade de transferência de lipídeo específico de ceramida usando um ensaio baseado em FRET (Figura 6B). Neste ensaio, vesículas unilamelares pequenas contendo cera mida marcada com pireno como um doador fluorescente e quantidades de extinção de TNP-PE marcado com grupo principal foram empregadas (Olayioye e outros, 2005; Somerharju, 5 2002). Quando esses Iipossomas doadores foram misturados com um excesso de Iipossomas aceitadores não-marcados, o aumento em fluorescência de pireno era desprezível, indicando transferência de ceramida espontânea mínima para membranas aceitadoras (dados não-mostrados). Quando da adição de citosol contendo CERT do tipo selvagem, um aumento unifor10 me em fluorescência foi notado, o que não foi observado quando citosol controle de células transfectadas com vetor foi usado (Figura 6B). Comparado à proteína do tipo selvagem, CERT-S132A mostrou uma taxa maior de transferência de lipídeo, evidente a partir de um aumento mais rápido em fluorescência de pireno (Figura 6B). Isto sugere que fosforilação de CERT em seri15 na 132 sub-regula atividade de transferência de ceramida através da diminuição da associação da proteína a membranas. Dados anteriores já mostraram que PKD regula o nível de PI(4)P no complexo de Golgi através de ativação mediada por fosforilação de ΡΙ4ΚΙΙΙβ (Hausser e outros, 2005). Interessantemente, ΡΙ4ΚΙΙΙβ é crítico para o transporte de ceramida entre o ER e 20 o complexo de Golgi (Toth e outros, 2006). Deste modo, junto com os dados apresentados aqui, um papel duplo para PKD na manutenção de homeostase de lipídeo de membranas de Golgi se torna aparente através do controle da taxa de ativação (através dos níveis de PI(4)P) e da taxa de desativação (através de fosforilação direta) de CERT.

A transferência de ceramida a partir do ER para a TGN é essen

cial para síntese de SM neste compartimento (Hanada e outros, 2003). SM Sintase 1 localizada em Golgi (SMS1) utiliza ceramida e PC para gerar SM e DAG (Perry e Ridgway, 2005), a última sendo um pré-requisito para recrutamento e ativação de PKD (Baron e Malhotra, 2002). Compostos que blo30 queiam produção de DAG na TNG inibem a ligação de PKD a membranas de TGN e interferem com transporte secretor (Baron e Malhotra, 2002). Então, transferência de ceramida grande do ER para a TGN através de superexpressão de CERT deve resultar em um agrupamento de DAG local elevado e pode consequentemente estimular atividade de PKD e transporte secretor. Para testar esta hipótese, a requerente expressou transientemente CERT do tipo selvagem e CERT-S132A em células HEK293T e analisaram 5 autofosforilação de PKD endógena. Comparado ao controle, expressão de ambas as CERT do tipo selvagem e CERT-S132A aumentou atividade de PKD, conforme revelado através de análises com um anticorpo de PKD fosfoespecífico (Figura 7A). Isto mostra que ativação de PKD é regulada por proteínas CERT, provavelmente devido à aplicação de ceramida grande e 10 síntese de SM/DAG reforçada. Uma função similar foi recentemente descrita para a proteína de transferência de lipídeo Nir2 na manutenção dos níveis de DAG no aparelho de Golgi através da regulagem do curso de CDP-colina (Litvak e outros, 2005). Inativação de Nir2 mediada por RNAi diminuiu os níveis de DAG e PKD no complexo de Golgi e bloqueou transporte secretor. 15 Interessantemente, este efeito poderia ser resgatado através da adição de C6-ceramida exógena (Litvak e outros, 2005), indicando um papel crítico para ceramida em síntese de DAG e recrutamento de PKD para o complexo de Golgi.

Para se dirigir à questão de se ativação de PKD mediada por CERT na verdade se traduziu em transporte secretor maior, a requerente fez uso de um plasmídeo codificando peroxidase de rábano silvestre fundido a uma seqüência de sinal (ss). A proteína de fusão ss-HRP pode ser usada como um repórter para secreção de proteína constitutiva (Bard e outros, 2006). Em células controle, secreção de ss-HRP poderia ser detectada dentro de 1 hora e aumentou com o tempo (Figura 7B). Coexpressão de PKD1 quinase morta, que inibe transporte secretor de proteína cargo (Hausser e outros, 2005; Liljedahl e outros, 2001), quase totalmente anulou a secreção de ss-HRP no sobrenadante. Isto confirmou que HRP era secretada de uma maneira dependente de PKD no ensaio da requerente. Coexpressão de CERT tipo selvagem e CERT-S132A fortemente aumentou a quantidade de HRP secretada (Figura 7B). Interessantemente, a requerente pôde apenas detectar um ligeiro aumento em secreção com o mutante CERT-S132A comparado a um observado com a proteína do tipo selvagem CERT. Isto está de acordo com a ativação comparável de PKD por CERT e CERTS132A (Figura 7A), mas era inesperado à Iuz da atividade de transferência de lipídeo in vitro significantemente maior do mutante CERT (Figura 6B). No 5 entanto, níveis altos de ceramida podem não necessariamente se traduzir em aumentos equivalentes em DAG1 porque síntese de DAG poderia ser limitada pela disponibilidade de PC e a atividade de SM sintase. Acúmulo de ceramida é conhecido afetar estabilidade de membrana de Golgi e induz fissura de vesícula (Fukunaga e outros, 2000; Weigert e outros, 1999). A re10 querente então investigou se superexpressão do mutante CERT-S132A afetou sua localização e/ou causou mudanças morfológicas do aparelho de Golgi. CERT foi demonstrada se colocalizar com o marcador de Golgi cis/médio GS28 (Hanada e outros, 2003). Análise de imunofluorescência de CERT marcada com GFP expressa em células COS7 mostrou que a proteí15 na se localizou em regiões de Golgi positivas para S28 (Figura 7C). Em contraste, em adição à colocalização particular com GS28 no complexo de Golgi, a proteína mutante CERT-S132A mostrou um tingimento pontuado, disperso. Importante, algumas dessas estruturas vesiculares foram verificadas conter a proteína cargo ss-HRP, provendo evidência que essas estruturas na 20 verdade representam carreadores de transporte derivados de Golgi (Figura 7D). Esta constatação está de acordo com as mudanças observadas em estrutura de membrana de Golgi devido a aumentos locais em níveis de ceramida (Fukunaga e outros, 2000; Weigert e outros, 1999).

Concluindo, a requerente identificou CERT como um substrato 25 de PKD e provê evidência de uma nova relação entre biogênese de lipídeo de membrana e secreção de proteína. A requerente também mostrou que CERT desempenha um papel importante em processos de transporte vesicular através da provisão de ceramida como um substrato para a síntese do ativador de PKD DAG em membranas de Golgi. A requerente ainda demons30 tra que o sistema é firmemente regulado por uma alça de feedback negativo: PKD ativa fosforila CERT na serina 132, então diminuindo a afinidade de CERT com relação a seu alvo de lipídeo PI(4)P para assegurar rodadas contínuas de transferência de lipídeo do ER para o compartimento de Golgi.

Os dados da presente invenção demonstram claramente que superexpressão de CERT aumenta secreção de proteína. Para investigar se também o oposto é verdadeiro, significando que expressão de CERT reduzi5 da resultaria em secreção menor, experimentos de siRNA foram realizados. A atividade de HRP foi detectada após 3 horas e mostrou níveis comparáveis iguais em ambas as células controle. Em contraste, uma redução drástica de atividade de HRP foi medida em células que tinham sido tratadas com qualquer um dos oligonucleotídeos de siRNA específicos de CERT (Figura 10 8). Isto indica que níveis de CERT reduzidos levam à secreção de HRP reduzida a partir das células e ressalta mais o papel importante de CERT no transporte secretor.

Interessantemente, não apenas secreção de proteína, mas também a abundância do receptor de transferrina da proteína de transmembrana foi afetada pela redução de CERT (Figura 8B). Quando as células da Figura 8A foram agrupadas e os Iisatos examinados com anticorpos específicos de receptor de transferrina em experimentos Western blot, uma forte diminuição na quantidade de receptor de transferrina ficou aparente, enquanto níveis de receptor de transferrina similares foram detectados em ambas as células controle. Esta constatação sugere que proteína de transferência de lipídeo CERT não está apenas implicada no transporte de proteínas secretadas, mas também de superfície de célula de localização na membrana. Isto poderia não ser surpreendente uma vez que ambos os tipos de proteínas são igualmente transportados em vesículas de lipídeo do ER através do Golgi para a membrana de plasma e então usam as mesmas vias de exportação celular que - conforme a requerente demonstrou na presente invenção pela primeira vez - são influenciadas por CERT.

As constatações e o novo modelo resultante para regulagem de transporte de proteína secretora a partir do complexo de Golgi para a membrana do plasma descritos na presente invenção podem ser aplicados à fabricação de proteína biofarmacêutica. Superexpressão de CERT aumenta a produção de proteína biofarmacêutica de proteínas diversas tal como anticorpos, citocinas, fatores de crescimento tal como eritropoietina ou insulina, receptores de superfície tal como fator de crescimento epitelial e proteases ligadas à membrana.Embora o método descrito na presente invenção possa ser geralmente aplicado a todos os processos de produção de proteína, o 5 grau de sucesso desta estratégia conforme medido pelo aumento na quantidade de proteína produzida pode certamente depender da natureza particular da proteína de interesse. CHO ou outras células produtoras são transfectadas com um construto de expressão codificando uma proteína de domínio START tal como CERT, StarD4 ou StarD5 ou um mutante derivado da mes10 ma. Notavelmente, os títulos mais altos são detectados em células expressando mutante de CERT não-fosforilável S132A. Expressão heteróloga de CERT, e especialmente CERT mutante, em células CHO pode aumentar a secreção de proteína, por exemplo, de um anticorpo monoclonal, no nível de transfecção transiente. Isto pode ser particularmente útil para produção rápi15 da de quantidades menores de candidatos a fármaco ou alvos de fármaco necessários em pesquisa e desenvolvimento farmacêuticos. Em uma modalidade adicional da presente invenção, uma linhagem de célula produtora é transfectada com os mesmos construtos de DNA que acima e subsequentemente submetidas à seleção para obter agrupamentos de célula estáveis. 20 Para seis passagens de cultura celular subsequentes ao procedimento de seleção, sobrenadante de cultura é coletado para ser analisado quanto ao teor de proteína de interesse. No caso de um anticorpo monoclonal, a concentração do produto de proteína é determinada através de ELISA e dividida pelo número médio de células para calcular a produtividade específica. No25 vãmente, os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando o mutante de CERT. Em células contendo um construto de domínio START expressão da proteína de interesse é significantemente aumentada comparado a SIMULAÇÃO ou células não-transfectadas. Vários resultados similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos 30 a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada. Em cada um desses ajustes, superexpressão de proteínas do domínio START leva à expressão aumentada de anticorpos, proteínas de célula simples e receptores de superfície em linhagens de célula CHO transientemente bem como estavelmente transfectadas, indicando que as proteínas do domínio START tal como CERT ou StarD4 e StarD5 são capazes de aumentar a capacidade de produção específica das células sob condições de fermentação.

5 DEFINIÇÕES

A modalidade geral "compreendendo" ou "compreendido" compreende a modalidade mais específica "consistindo em". Ainda, formas no singular e no plural não são usadas de uma maneira limitante.

Termos usados no curso da presente invenção têm o significado

que segue.

O termo "domínio START" significa domínio de transferência de lipídeo relacionado à proteína reguladora aguda esteroidogênica (StaR). Este domínio de cerca de 200 a 210 aminoácidos foi identificado inicialmente como domínio de ligação de lipídeo (Soccio e Breslow, 2003; Tsujishita e 15 Hurley, 2000). O comprimento do domínio START pode variar entre 116 a 250 aminoácidos ou entre 180 a 223 aminoácidos ou mais especificamente entre 219 a 223 aminoácidos dependendo do membro da família do domínio START. A característica mais impressionante da estrutura do domínio START é um túnel predominantemente hidrofóbico se estendendo quase o 20 comprimento todo da proteína que é usado para ligar uma molécula única de compostos lipofílicos grandes, tal como colesterol. A resolução estrutural do membro da família do domínio START MLN64-START revelou uma estrutura tipo α/β consistindo em nove folhas β antiparalelas enroladas de nove fitas e quatro hélices α (Tsujishita e Hurley, 2000). O domínio encontrado em várias 25 proteínas eucarióticas é referido como 'domínio START clássico' (CSD) enquanto um domínio similar específico para plantas é conhecido como domínio START alérgeno Birch (BA-START).

O termo "CERT" compreende ambas as formas unidas de CERT: CERT (SEQ ID NO.:11) e CERTl (SEQ ID NO.:13). O termo "CERT" compreende ainda qualquer outra forma unida possível de CERT derivada da seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO.:12. O termo "CERT" compreende ainda proteína hCERT e seus recombinantes, hCERT, hCERTA, proteína PH, proteína hCERT A MR e proteína ST hCERTA e, ainda, proteína PHhCERT, proteína MRhCERT e proteína SThCERT (vide também EP1652530 (Hanada, 2006) (Hanada e outros, 2003)).

O termo "derivado" em geral inclui seqüências adequadas para realização do uso pretendido da presente invenção, que significa que as seqüências fazem a mediação do aumento em transporte secretor em uma célula. O termo "derivado" conforme usado na presente invenção significa uma molécula de polipeptídeo ou uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 70% idêntica em seqüência à seqüência original ou sua seqüência complementar. De preferência, a molécula de polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico é pelo menos 80% idêntica em seqüência à seqüência original ou sua seqüência complementar. Com mais preferência, a molécula de polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico é pelo menos 90% idêntica em seqüência à seqüência original ou sua seqüência complementar. Mais preferida é uma molécula de polipeptídeo ou uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica em seqüência à seqüência original ou sua seqüência complementar e mostra o mesmo efeito ou um similar sobre secreção que a seqüência original.

Diferenças em seqüência podem ser baseadas em diferenças 20 em seqüências homólogas de organismos diferentes. Elas poderiam ser também baseadas em modificação direcionada de seqüências através de substituição, inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 ou 10. Mutantes de deleção, inserção ou substituição podem ser gerados usando técnicas de mutagênese especí25 fica de sítio e/ou metagênese baseada em PCR. Métodos correspondentes são descritos por (Lottspeich e Zorbas, 1998) no Capítulo 36.1 com referências adicionais.

A identidade de seqüência de uma seqüência de referência (na presente invenção sendo, por exemplo, domínio START SEQ ID NO.:16, 17 ou 18, 19) pode ser determinada usando, por exemplo, algoritmos de "alinhamento" padrão, por exemplo, "BLAST" (Altschul e outros, 1990); (Madden e outros, 1996); (Zhang e Madden1 1997). Seqüências são alinhadas quando elas se encaixam em sua seqüência e são identificáveis com a ajuda de algoritmos de alinhamento-padrão.

Ainda, na presente invenção o termo "derivado" significa uma molécula de ácido nucleico (de fita simples ou dupla) que hibridiza para SEQ 5 ID NO.: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou com fragmentos ou derivados das mesmas ou com seqüências que são complementares às SEQ ID NO.: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26. De preferência, a hibridização é realizada sob condições de hibridização e lavagem estringentes (por exemplo, hibridização a 65° C em um tampão contendo 5x SSC; lavagem a 42° C usando 10 0,2x SSC/SDS 0,1%). Técnicas correspondentes são descritas exemplar em (Ausubel e outros, 2002).

O termo "derivados" significa ainda mutantes de deleção de proteína, mutantes de fosforilação especialmente na posição serina, treonina ou tirosina, a deleção de um sítio do domínio PKD ou a mutação Ser132A de CERT.

O termo "atividade" descreve e quantifica as funções biológicas da proteína dentro da célula ou em ensaios in vitro.

Um exemplo de como medir "atividade" é descrito no pedido de patente EP1652530 (Hanada e outros), que detecta atividade de promoção de liberação de ceramida a partir de membranas. A membrana de lipídeo contendo ceramida tem que ser preparada de modo que ela contenha 12,5 nCi (225 pmol) por amostras de [palmitoil-1 I4-C] N-palmitoil-D-eritroesfigosina (daqui em diante pode ser referida como l4C-ceramida) com base em um lipídeo misto consistindo em fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina em uma razão de 4:1 derivado de gema de ovo. Sua concentração de ceramida então é 2,5 mg/ml_. Para uma amostra da atividade medição desta membrana de lipídeo é requerida na quantidade de 20 pL. Após a quantidade de lipídeo requerida para medição da atividade ter sido posta em um tubo Eppendorf, ele tem que ser seco através de pulverização de gás nitrogênio. Após isso, o tampão 1 [tampão Hepes- NaOH 20 mM (pH 7,4) ao qual NaCI a 50 mM e EDTA a 1 mM foram adicionados] tem que ser adicionado à membrana de lipídeo seca, de modo que a concentração fica 2,5 mg/mL. Um tratamento supersônico suave tem que ser realizado usando gerador supersônico do tipo banho [Modelo 221 0 fabricado pela Branson, Co., Ltd.]. O tratamento supersônico tem que ser realizado a 25° C por 3 minutos. A amostra tem que ser misturada (vortexada) por 30 segundos e então o tratamento supersônico é repetido por 3 minutos. A membrana de lipídeo preparada deste modo é usada em um ensaio de liberação de ceramida. A reação de liberação de ceramida para a membrana de lipídeo e sua detecção são realizadas como segue: proteína CERT ou proteína recombinante da mesma (sob as condições-padrão, a quantidade de proteína correspondendo a 450 picomoles, que é quantidade 2 vezes molar de ceramida contida na membrana de doação, foi usada) é misturada até 30 pL usando tampão 2 [tampão Hepes- NaOH 50 mM (pH 7,4) ao qual NaCI 100 mM e EDTA 0,5 mM foram adicionados]. Aqui, a reação é iniciada através da adição de 20 pL de membrana de lipídeo contendo ceramida. A concentração final de fosfolipídeos é 1 mg/mL. Ceramida está contida em uma razão de cerca de 0,3% comparando à quantidade de fosfolipídeo total. Após a mistura desses ter sido incubada a 37° C por 30 minutos, ela é centrifugada a 50.000 xg por 30 minutos e a membrana de lipídeo é precipitada. No caso onde proteína CERT de E. coli for usada, a maioria da proteína permanece no sobrenadante sob essas condições de centrifugação. Então, quando ceramida 14C se liga à proteína CERT, ela é liberada da membrana de lipídeo e transferida para a fração de sobrenadante. A atividade para promoção de liberação de ceramida com CERT é calculada através da medição da atividade radioativa de 1% na fração de sobrenadante usando um contador de cintilação líquida. Uma possibilidade adicional para medir "atividade" é um ensaio

de transferência de ceramida in vitro usando material recombinante ou Iisato de célula contendo CERT. Então, a transferência mediada por proteína de ceramida entre SUVs é medida conforme previamente descrito (Olayioye e outros, 2005). A mistura de ensaio de transferência continha vesículas doa30 doras (2 nmols lipídeo/ml) compostas de lipídeos de cérebro de porco (Avanti Polar Lipids), ceramida Ci6 marcada com pireno e 2,4,6-trinitrofenilfosfatidiletanolamina (TNP-PE) (88,6:0,4:11% em mol), provida por P. Somerharju e um excesso de 10 vezes de vesículas aceitadoras compostas de lipídeos de cérebro de porco. Intensidade de fluorescência é registrada a 395 nm (excitação, 345 nm; larguras da fenda, 4 nm) antes e após a adição de 75 pg de citosol de células HEK293T transientemente expressando prote5 ínas CERT marcadas com GFP do tipo selvagem e S132A (vide acima). Intensidades de fluorescência são normalizadas para (i) a intensidade máxima obtida após a adição de Triton X-100 (concentração final de 0,5%) e (ii) a fluorescência de GFP máxima, para explicar os níveis de expressão de proteína diferentes.

Outra possibilidade para medir "atividade" é uma análise do es

tado de fosforilação de CERT S132A, por exemplo, usando um anticorpo específico antifosfo em um Western folot. Extratos de célula integral são obtidos através da solubilização de células em tampão de extração NP40 (NEB) [Tris 50 mM (pH 7,5), NaC1150 mM, NP40 1%, ortovanadato de sódio 1 mM, 15 fluoreto de sódio 10 mM e β-gIicerofosfato a 20 mM mais Inibidores de protease completa]. Lisatos são clarificados através de centrifugação a 16.000 x g por 10 minutos. Extratos de célula integral ou proteínas imunoprecipitadas são fervidos em tampão de amostra e submetidos à SDS-PAGE. As proteínas são manchados em membranas de difluoreto de polivinilidina (Roth). 20 Após bloquear com reagente de bloqueio 0,5% (Roche) em PBS contendo Tween 20 0,1%, filtros são experimentados com um anticorpo específico de fosfo tal como anticorpo de substrato fosfoespecífico, chamado pMOTIF, criado contra motivos de consenso fosforilados por PKD (Doppler e outros, 2005). As proteínas são visualizadas com anticorpo secundário acoplado à 25 peroxidase usando o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Pierce).

Ainda outra ensaio para medição da "atividade" é um ensaio de secreção, por exemplo, para uma proteína modelo, um anticorpo ou uma proteína de interesse. Células são cotransfectadas com um plasmídeo ss30 HRP-FIag e vetor vazio, pEGFP-N1-PKD1KD e um plasmídeo codificando CERT, uma variação de CERT de qualquer proteína da família START em uma razão de 1:6,5, respectivamente. 24 horas pós-transfecção células são lavadas com meio livre de soro e secreção de HRP é quantificada após 0, 1, 3 e 6 horas através de incubação de sobrenadante de célula clarificado com reagente ECL. Medições são feitas com um luminômetro (Lucy2, Anthos) a 450 nm.

5 Outro meio de medir a "atividade" é usando um análogo de ce

ramida fluorescente, por exemplo, ceramida C5 marcada com Bodipy, realizar experimentos de fenda em células intactas e medir o acúmulo de proteína no complexo de Golgi.

Quantificação da distribuição de ceramida C5 BODIPY® FL entre o Golgi e o ER: o transporte da ceramida fluorescente foi quantificado pósaquisição usando a função Iinescan do software Metamorph. Uma linha foi desenhada através das células nas fotos confocais tiradas em pontos de tempo diferentes e a intensidade de fluorescência foi medida no citoplasma e no complexo de Golgi das células. A "razão de absorção" foi calculada a partir da intensidade de Iuz fluorescente no Golgi dividida pela intensidade medida no citoplasma. A razão de absorção máxima foi medida em células controle após 25 minutos de incubação a 37° C e este valor foi tomado como 100 por cento. A quantificação foi feita a partir dos dados de três experimentos independentes onde fotos confocais foram tiradas em doze pontos de tempo diferentes e em cada ponto de tempo 7 células foram analisadas.

O termo "produtividade" ou "produtividade específica" descreve a quantidade de uma proteína específica que é produzida por um número definido de células dentro de um tempo definido. A produtividade específica é então uma medida quantitativa para a capacidade de células em expres25 sar/sintetizar/produzir uma proteína de interesse. No contexto de fabricação industrial, a produtividade específica é geralmente expressa como quantidade de proteína em picograma produzida por célula e dia ('pg/célula*dia' ou 'pcd'). Um método para determinar a produtividade específica de uma proteína secretada é quantitativamente medir a quantidade de proteína de inte30 resse secretada no meio de cultura através do ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Para este propósito, as células são semeadas em meio de cultura fresco em densidades definidas. Após um tempo definido, por exemplo, após 24, 48 ou 72 horas, uma amostra do fluido de cultura celular é obtida e submetida à medição ELISA para determinar o título da proteína de interesse. A produtividade específica pode ser determinada dividindo o título pelo número de célula médio e o tempo.

5 Outro exemplo de como medir a "produtividade específica" é

provido pelo ensaio de fluorescência resolvida no tempo homogênea (HTFR®).

"Produtividade" de células para uma proteína intracelular, associada à membrana ou transmembrana, pode ser também detectada e quanti10 ficada através de Western Blotting. As células são primeiro lavadas e subsequentemente Iisadas em um tampão contendo ou detergentes tal como Triton-X, NP-40 ou SDS ou concentrações de sal altas. As proteínas dentro do Iisato de célula são então separadas por tamanho em SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de náilon onde a proteína de interesse é subse15 quentemente detectada e visualizadas usando anticorpos específicos.

Outro método para determinar a "produtividade específica" de uma célula é detectar imunologicamente a proteína de interesse através de anticorpos fluorescentemente marcados contra a proteína de interesse e quantificar o sinal de fluorescência em um citômetro de fluxo. No caso de 20 uma proteína intracelular, as células são primeiro fixadas, por exemplo, em um tampão de paraformaldeído, e então permeabilizadas para permitir penetração do anticorpo de detecção na célula. Proteínas de superfície celular podem ser quantificadas na célula viva sem a necessidade de fixação ou permeabilização prévia.

A "produtividade" de uma célula pode ser ainda determinada in

diretamente através da medição da expressão de uma proteína repórter tal como a proteína fluorescente verde (GFP) que é expressa ou como uma proteína de fusão com a proteína de interesse ou a partir do mesmo mRNA que a proteína de interesse como parte de uma unidade de expressão bi-, tri- ou múltipla.

O termo "aumento de produtividade" compreende métodos para aumentar a produtividade específica de células. A produtividade específica é aumentada se a produtividade for maior nas células sob investigação comparado às respectivas células controle e se esta diferença for estatisticamente significante. As células sob investigação podem ser populações heterogêneas ou linhagens de célula clonal de células tratadas, transfectadas ou ge5 neticamente modificadas; células não-tratadas, não-transfectadas ou nãomodificadas podem servir como células controle.

O termo "inibidor" ou "supressor" conforme usado na presente invenção significa qualquer molécula que age para inibir ou suprimir a expressão ou atividade de uma proteína do domínio START tal como CERT. O 10 termo inclui compostos químicos pequenos, ácidos nucleicos tal como DNA de antissentido, RNA ou siRNA de antissentido, anticorpos e proteínas de cadeia simples que bloqueiam a transcrição e tradução de CERT bem como peptídeos ou proteínas que interferem com ligação de lipídeo de proteínas do domínio START tal como CERT.

"Células hospedeira" no sentido da presente invenção são célu

las tal como células de hamster, de preferência células BHK21, BHK TK-1, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX B1 e CHO-DG44 ou os derivados/progênies de qualquer uma de tal linhagem de célula. Particularmente preferidas são CHO-DG44, CHO-DUKX, CH0-K1 e BHK21, e com mais preferência ainda células CHO-DG44 e CHO-DUKX. Em uma modalidade adicional da presente invenção células hospedeira também significam células mieloma de murino, de preferência células NSO e Sp2/0 ou os derivados/progênies de qualquer tal linhagem de célula. Exemplos de células de murino e hamster que podem ser usadas no sentido da presente invenção são também sumarizados na Tabela 1. No entanto, derivados/progênies dessas células, outras células de mamífero, incluindo, mas não limitado a, linhagens de célula humana, de camundongo, rato, macaco e roedor, ou células eucarióticas, incluindo, mas não limitado a células de levedura, inseto e planta, podem ser também usados no sentido da presente invenção, particularmente para a produção de proteínas biofarmacêuticas. TABELA 1: Linhagens de célula de produção eucarióticas

LINHAGEM DE CÉLULA NÚMERO DE ORDEM NSO ECACC No. 85110503 Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-1581 BHK21 ATCC CCL-10 BHK TK' ACACC No. 85011423 HaK ATCC CCL-15 2254-62.2 (derivado de BHK-21) ATCC CRL-8544 CHO ECACC No. 8505302 CHO tipo selvagem ECACC 00102307 CH0-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX (=CHO duk', CHO/dhfr) ATCC CRL-9096 CHO-DUKX B11 ATCC CRL-9010 CHO-DG44 (Urlaub e outros, 1983) CHO Pro5 ATCC CRL-1781 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 HEK 293 ATCC CRL-1573 COS-7 ATCC CRL-1651 U266 ATCC Tl B-196 HuNSI ATCC CRL-8644 CHL ECACC No. 87111906 Células hospedeira são mais preferidas, quando sendo estabe

lecidas, adaptadas e completamente cultivadas sob condições livres de soro, e opcionalmente em meios que são livres de qualquer proteína/peptídeo de 5 origem animal. Meios comercialmente disponíveis tal como F12 da Ham (Sigma, Deisenhofen, Alemanha), RPMI-1640 (Sigma), Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco (DMEM; Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM; Sigma), Meio da Dulbeco Modificado com da Iscove (IMDM; Sigma), CDCHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S-Invitrogen), Meio CHO livre de soro 10 (Sigma) e meio CHO livre de proteína (Sigma) são soluções nutrientes apropriadas exemplares. Qualquer um dos meios pode ser suplementado conforme necessário com uma variedade de compostos cujos exemplos são hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferrina, fator de crescimento epidermal, fator de crescimento tipo insulina), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleosídeos (tal como adenosina, timidina), glutamina, glicose ou outras fontes de energia, antibióticos, elementos traço equivalentes. Quais5 quer outros suplementos necessários podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas daqueles versados na técnica. Na presente invenção o uso de meio livre de soro é preferido, mas meios suplementados com uma quantidade adequada de soro podem ser também usados para o cultivo de células hospedeira. Para o cultivo e seleção de cé10 lulas geneticamente modificadas expressando o gene selecionável um agente de seleção adequado é adicionado ao meio de cultura.

O termo "proteína" é usado intercomutavelmente com seqüências de resíduo de aminoácido ou polipeptídeo e refere-se a polímeros de aminoácido de qualquer comprimento. Esses termos também incluem prote15 ínas quê são pós-traducionalmente modificadas através de reações que incluem, mas não estão limitadas a, glicosilação, acetilação, fosforilação ou processamento de proteína. Modificações e mudanças, por exemplo, fusões com outras proteínas, substituições, deleções ou inserções de seqüência de aminoácido, podem ser feitas na estrutura de um polipeptídeo enquanto a 20 molécula mantém sua atividade funcional biológica. Por exemplo, certas substituições de seqüência de aminoácido podem ser feitas em um polipeptídeo ou sua seqüência de codificação de ácido nucleico de base e uma proteína pode ser obtida com propriedades similares.

O termo "polipeptídeo" significa uma seqüência com mais de 10 25 aminoácidos e o termo "peptídeo" significa seqüências de até 10 aminoácidos de comprimento. A presente invenção é adequada para gerar células hospedeira para a produção de polipeptídeos/proteínas farmacêuticos. A invenção é particularmente adequada para a expressão de alto rendimento de um grande número de genes diferentes de interesse por células mostran30 do uma produtividade de célula maior.

"Gene de interesse" (GOI), "seqüência selecionada" ou "gene de produto" têm os mesmos significados aqui e referem-se a uma seqüência de polinucleotídeo de qualquer comprimento que codifica um produto de interesse ou "proteína de interesse", também mencionado pelo termo "produto desejado". A seqüência selecionada pode ser um gene de comprimento completo ou truncado, um gene de fusão ou marcado, e pode ser um cDNA, 5 um DNA genômico, ou um fragmento de DNA, de preferência, um cDNA. Ela pode ser a seqüência nativa, isto é, forma(s) de ocorrência natural, ou pode ser mutada ou de outro modo modificada conforme desejado. Essas modificações incluem otimizações de códon para otimizar uso de códon na célula hospedeira selecionada, humanização ou marcação. A seqüência seleciona10 da pode codificar um polipeptídeo secretado, citoplásmico, nuclear, ligado à membrana ou de superfície celular.

A "proteína de interesse" inclui proteínas, polipeptídeos, fragmentos dos mesmos, peptídeos, todos eles podem ser expressos na célula hospedeira selecionada. Proteínas desejadas podem ser, por exemplo, anti15 corpos, enzimas, citocinas, linfocinas, moléculas de adesão, receptores e derivados ou fragmentos dos mesmos, e quaisquer outros polipeptídeos que podem servir como agonistas ou antagonistas e/ou ter uso terapêutico ou de diagnóstico. Exemplos para uma proteína/polipeptídeo desejado são também dados abaixo.

No caso de moléculas mais complexas tal como anticorpos mo

noclonais o GOI codifica uma ou ambas as duas cadeias de anticorpos.

O "produto de interesse" pode também ser um RNA antissentido.

"Proteínas de interesse" ou "proteínas desejadas" são aquelas mencionadas acima. Especialmente, proteínas/polipeptídeos desejados ou 25 proteínas de interesse são, por exemplo, mas não limitado a, insulina, fator de crescimento do tipo insulina, hGH, tPA, citocinas, tal como interleucinas (IL), por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN) alfa, IFN beta, IFN gama, IFN ômega ou IFN tau, fator de necrose de tumor (TNF), tal como 30 TNF alfa e TNF beta, TNF gama, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 e VEGF. Também incluída está a produção de eritropoietina ou quaisquer outros fatores de crescimento de hormônio. O método de acordo com a invenção pode ser também vantajosamente usado para produção de anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Tais fragmentos incluem, por exemplo, fragmentos Fab (Fragmento de ligação de antígeno = Fab). Fragmentos Fab consistem nas regiões variáveis de ambas cadeias que são mantidas juntas 5 pela região constante adjacente. Esses podem ser formados através de digestão de protease, por exemplo, com papaína, a partir de anticorpos convencionais, mas fragmentos Fab similares podem também ser produzidos no tempo médio através de engenharia genética. Fragmentos de anticorpo adicionais incluem fragmentos F(ab')2, que podem ser preparados através de 10 clivagem proteolítica com pepsina.

A proteína de interesse é de preferência recuperada do meio de cultura como um polipeptídeo secretado, ou ela pode ser recuperada dos Iisatos de célula hospedeira se expressa sem um sinal secretor. É necessário purificar a proteína de interesse de outras proteínas recombinantes e pro15 teínas de célula hospedeira de um modo que preparações substancialmente homogêneas da proteína de interesse são obtidas. Como uma primeira etapa, células e/ou restos de célula em partícula são removidos do meio de cultura ou lisato. O produto de interesse em seguida é purificado das proteínas, polipeptídeos e ácidos nucleicos solúveis contaminantes, por exemplo, atra20 vés de fracionamento em colunas de imunoafinidade ou troca de íon, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia Sephadex, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de cátion tal como DEAE. Em geral, métodos ensinando uma pessoa versada na técnica como purificar uma proteína heteróloga expressa por células hospedeira são bem25 conhecidos na técnica. Tais métodos são, por exemplo, descritos por (Harris e Angal, 1995) ou (Robert Scopes, 1988).

Usando métodos de engenharia genética, é possível produzir fragmentos de anticorpo encurtados que consistem apenas nas regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL). Esses são referidos como frag30 mentos Fv (Variável de fragmento = fragmento da parte variável). Uma vez que esses fragmentos Fv não têm a ligação covalente das duas cadeias pelas cisteínas das cadeias constantes, os fragmentos Fv são frequentemente estabilizados. É vantajoso ligar as regiões variáveis das cadeias pesada e leve por um fragmento de peptídeo curto, por exemplo, de 10 a 30 aminoácidos, de preferência 15 aminoácidos. Deste modo uma única fita de peptídeo é obtido consistindo em VH e VL, ligado por um Iigante de peptídeo. Uma 5 proteína de anticorpo deste tipo é conhecida como um Fv de cadeia simples (scFv). Exemplos de proteínas de anticorpo scFv deste tipo conhecidos da técnica anterior são descritos em (Huston e outros, 1988).

Nos últimos anos, várias estratégias foram desenvolvidas para preparação de scFv como um derivado multimérico. Isto é pretendido levar, 10 em particular, a anticorpos recombinantes com propriedades farmacocinéticas e biodistribuição aperfeiçoadas bem como com avidez por ligação maior. A fim de atingir multimerização do scFv, scFv foram preparados como proteínas de fusão com domínios de multimerização. Os domínios de multimerização podem ser, por exemplo, a região CH3 de um IgG ou estrutura espira15 Iada (estruturas de hélice) tal como domínios Leucina-zíper. No entanto, há também estratégias onde a interação entre as regiões VHA/L de scFv são usadas para a multimerização (por exemplo, dia-, tri- e pentacorpos). Por diacorpo a pessoa versada na técnica quer dizer um derivado de scFv homodimérico bivalente. O encurtamento do Ligante em uma molécula de scFv 20 para 5-10 aminoácidos leva à formação de homodímeros onde uma superposição VH/VL intercadeia acontece. Diacorpos podem adicionalmente ser estabelecidos pela incorporação de pontes dissulfeto. Exemplos de proteínas diacorpo-anticorpo da técnica anterior podem ser encontrados em (Perisic e outros, 1994).

Por minicorpo a pessoa versada na técnica quer dizer um deri

vado de scFv homodimérico, bivalente. Ele consiste em uma proteína de fusão que contém a região CH3 de uma imunoglobulina, de preferência IgG, com mais preferência IgGI como a região de dimerização que é conectada ao scFv através de uma Região de impedimento (por exemplo, também de 30 IgGI) e uma Região de ligação. Exemplos de proteínas minicorpo-anticorpo da técnica anterior podem ser encontrados em (Hu e outros, 1996).

Por triacorpo o versado na técnica quer dizer: um derivado de scFv homotrimérico trivalente (Kortt e outros, 1997). Derivados de scFv onde VH-VL são fundidas diretamente sem uma seqüência Iigante levam à formação de trímeros.

Por "proteínas de andaime" um versado na técnica quer dizer 5 qualquer domínio funcional de uma proteína que é acoplada através de clonagem genética ou através de processos cotraducionais com outra proteína ou parte de uma proteína que tem outra função.

O versado na técnica será também familiar com os chamados minianticorpos que têm uma estrutura bi-, tri- ou tetravalente e são derivados de scFv. A multimerização é realizada por estrutura enroladas di-, tri- ou tetraméricas (Lovejoy e outros, 1993; Pack e outros, 1993; Pack e outros, 1995).

Por definição quaisquer seqüências ou genes introduzidos em uma célula hospedeira são chamados "seqüências heterólogas" ou "genes heterólogos" ou "transgenes" com relação à célula hospedeira, mesmo se a seqüência ou gene introduzido for idêntico a uma seqüência ou gene endógeno na célula hospedeira.

Uma proteína "heteróloga" é então uma proteína expressa a partir de uma seqüência heteróloga.

Seqüências de gene heterólogas podem ser introduzidas em

uma célula-alvo usando um "vetor de expressão", de preferência um vetor de expressão eucariótico e com mais preferência ainda um mamífero. Métodos usados para construir vetores são bem-conhecidos de um versado na técnica e descritos em várias publicações. Em particular técnicas para construção 25 de vetores adequados, incluindo uma descrição dos componentes funcionais tal como promotores, aumentadores, sinais de terminação e poliadenilação, marcadores de seleção, origens de replicação e sinais de união, são revistas em detalhes consideráveis em (Sambrook e outros, 1989) e referências citadas nele. Vetores podem incluir, mas não estão limitados a, vetores de 30 plasmídeo, fagemídeos, cosmídeos, cromossomos artificiais/mini (por exemplo, ACE) ou vetores virais tal como baculovírus, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociado, vírus herpes simplex, retrovírus, bacteriófagos. Os vetores de expressão eucarióticos vão tipicamente conter também seqüências procarióticas que facilitam a propagação do vetor em bactérias tal como uma origem de replicação e genes de resistência a antibiótico para seleção em bactérias. Uma variedade de vetores de expressão eucarióticos, contendo 5 um sítio de clonagem onde um polinucleotídeo pode ser operavelmente ligado, é conhecida na técnica e alguns estão comercialmente disponíveis de companhias tal como Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, Wl ou BD Bioscience Clontech1 Palo Alto, CA.

Em uma modalidade preferida o vetor de expressão compreende pelo menos uma seqüência de ácido nucleico que é uma seqüência reguladora necessária para transcrição e tradução de seqüências de nucleotídeo que codificam um peptídeo/polipeptídeo/proteína de interesse.

O termo "expressão" conforme aqui usado refere-se à transcrição e/ou tradução de uma seqüência de ácido nucleico heteróloga dentro de uma célula hospedeira. O nível de expressão de um produto/proteína desejado de interesse em uma célula hospedeira pode ser determinado com base ou na quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula ou a quantidade do polipeptídeo/proteína desejado de interesse codificado pela seqüência selecionada como nos presentes exemplos. Por exemplo, mRNA transcrito a partir de uma seqüência selecionada pode ser quantificado através de hibridização Northern blot, proteção de RNA de ribonuclease, hibridização in situ para RNA celular ou através de PCR (vide (Sambrook e outros, 1989); (Ausubel e outros, 2002) atualizado). Proteínas codificadas por uma seqüência selecionada podem ser quantificadas através de vários métodos, por exemplo, através de ELISA, através de Western blotting, através de radioimunoensaios, através de imunoprecipitação, através de ensaio quanto à atividade biológica da proteína, através de imunotingimento da proteína seguido por análise FACS (vide (Sambrook e outros, 1989); (Ausubel e outros, 2002) atualizado) ou através de ensaios de fluorescência resolvida no tempo homogênea (HTRF).

"Transfecção" de células hospedeira eucarióticas com um polinucleotídeo ou vetor de expressão, resultando em células geneticamente modificadas ou células transgênicas, pode ser realizada através de qualquer método bem-conhecido na técnica e descrito, por exemplo, em (Sambrook e outros, 1989) ou (Ausubel e outros, 2002) atualizado. Métodos de transfecção incluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por lipossoma, 5 coprecipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, transfecção mediada por policátion (tal como DEAE-dextrano), fusão de protoplasto, infecções virais e microinjeção. De preferência, a transfecção é uma transfecção estável. O método de transfecção que provê frequência e expressão de transfecção ótimas dos genes heterólogos na linhagem e tipo de célula hospedeira parti10 cular é favorecido. Métodos adequados podem ser determinados através de procedimentos de rotina. Para transfectantes estáveis os construtos são ou integrados ao genoma da célula hospedeira ou um cromossomo artificial/minicromossomo ou epissomalmente localizados de modo a serem estavelmente mantidos dentro da célula hospedeira.

A prática da presente invenção vai empregar, a menos que de

outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia celular, biologia molecular, cultura celular, imunologia e similar que estão na habilidade de um versado na técnica. Essas técnicas são descritas integralmente na presente literatura. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A 20 Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology (1987, atualizado); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell e outros, eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukar25 yotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu e outros, eds., Recombinante DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson e outros, PCR: A Practical Approach, IRL Press na Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Veetor for Mammalian 30 Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard e outros, eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney e outros, eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach1 IRL Press na Oxoford University Press (1995); Meiamed e outros, eds., Flow Cytometry and Sorting, WileyLiss (1990); Current Procolos in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (atualizado); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animais Cells, em: Bioteehno5 Iogy Vol. 2, Puhler ed., VCH, Weinheim 663-744; a série Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.) e Harlow e outros, eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987).

MODALIDADES

A invenção refere-se a um método de produção de uma proteína 10 heteróloga de interesse em uma célula compreendendo aumento da expressão ou atividade de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, e realização da expressão da dita proteína de interesse. Em uma modalida15 de preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína heteróloga é uma proteína de membrana ou secretada.

Em uma modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é um membro da família do domínio START de mamífero tal como PCTP (SEQ ID NO.: 20 27), StarD7, GPBP, Starl0, Starô, StarDI3, DLC-1, StarD4 (SEQ ID NO.:21), Starô (SEQ ID NO.: 25), StarD5 (SEQ ID NO.: 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH ou StarD9 ou um derivado ou mutante da mesma.

Em uma modalidade específica adicional da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é 25 caracterizada por ser induzida quando do estresse de ER e/ou é estruturalmente caracterizada por consistir apenas em um domínio START tal como StarD4 (SEQ ID NO.: 21), StarD5 (SEQ ID NO.: 23), StarD6 (SEQ ID NO.: 25) ou proteína de transferência de fosfatidilcolina (PCTP) (SEQ ID NO.: 27).

Em outra modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é selecionada do grupo consistindo em CERT (SEQ ID NO.: 11 ou 13), StarD4 (SEQ ID NO.: 21) e StarD5 (SEQ ID NO.: 23). Em uma modalidade adicional da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é StarD6 (SEQ ID NO.:25). Em uma modalidade preferida StarD6 é codificada por um nucleotídeo com a SEQ ID NO.: 24.

5 Em uma modalidade preferida da presente invenção o método é

caracterizado pelo fato de que o domínio START compreende pelo menos o domínio START de 219 aminoácidos de CERTl (SEQ ID NO.: 19) ou pelo menos o domínio START de 223 aminoácidos de CERT e CERT S132A (SEQ ID NO.: 17) ou pelo menos o domínio START de StarD4 (SEQ ID NO.: 10 21) ou pelo menos o domínio START de StarD5 (SEQ ID NO.: 23) ou um derivado ou mutante da mesma.

Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida CERT (CERT=SEQ ID NO. 11 ou CERTl=SEQ ID NO. 13) ou um derivado ou mutante da mesma.

Em outra modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida mutada CERT e a dita mutação desabilita e/ou deleta um sítio de fosforilação em qualquer posição serina, treonina ou tirosina de CERT.

Em uma modalidade específica adicional da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida mutada CERT e a dita mutação desabilita e/ou deleta o sítio de fosforilação de proteína quinase D (PKD) de CERT na posição 132.

Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que CERT mutada é CERTS132A (SEQ ID NO.: 15).

Em outra modalidade da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que o dito método resulta em produtividade celular específica maior da dita proteína de interesse na dita célula em comparação a uma célula controle expressando a dita proteína de interesse, mas com o que a dita célula controle não tem expressão ou atividade maior de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma.

5 Em outra modalidade específica da presente invenção o método

é caracterizado pelo fato de que o aumento em produtividade é cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 11% a cerca de 20%, cerca de 21% a cerca de 30%, cerca de 31% a cerca de 40%, cerca de 41% a cerca de 50%, cerca de 51% a cerca de 60%, cerca de 61% a cerca de 70%, cerca de 71% a cerca 10 de 80%, cerca de 81% a cerca de 90%, cerca de 91% a cerca de 100%, cerca de 101% a cerca de 149%, cerca de 150% a cerca de 199%, cerca de 200% a cerca de 299%, cerca de 300% a cerca de 499% ou cerca de 500% a cerca de 1000%.

Em uma modalidade preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula eucariótica tal como uma célula de levedura, planta, verme, inseto, ave, peixe, réptil ou mamífero. Em uma modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula animal. Em uma modalidade específica adicional da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula metazoa tal como C. elegans. Em outra modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula bilateria tal como Drosophila melanogaster. Em uma modalidade adicional da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula de vertebrado tal como uma célula de ave, peixe, réptil ou mamífero. Em uma modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula humana tal como a linhagem de célula de mieloma humano U266, HEK293, HeLa, HepG2 ou HT1080. Em uma modalidade preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula é uma célula de roedor tal como células NOS, Sp2/0 ou Ag8653 de murino, YO ou YB2.0.

Em uma modalidade adicional da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula eucariótica é uma célula de mamífero.

Em uma modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula de mamífero é uma célula de 5 Ovário de Hamster Chinês (CHO), CV1 de rim de macaco, COS de rim de macaco, PER.C6TM de epitélio de lente humano, rim embriônico humano, HEK293, rim de hamster bebê, rim de macaco verde Africano, carcinoma cervical humano, rim canino, fígado de rato búfalo, pulmão humano, fígado humano, tumor mamário de camundongo ou mieloma, uma célula de cachor10 ro, porco ou macaco, rato, coelho, gato, cabra, de preferência uma célula CHO.

Em uma modalidade preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a dita célula CHO é CHO do tipo selvagem, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, de preferência CHO DG44.

Em uma modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é uma proteína de membrana ou secretada. Em uma modalidade preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

Em uma modalidade preferida adicional da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monoclonal, policlonal, de mamífero, murino, quimérico, humanizado, primatizado, primata, ser humano ou um fragmento de anticorpo ou derivado do mesmo tal como anti25 corpo, cadeia leve de imunoglobulina, cadeia pesada de imunoglobulina, cadeias leve e pesada de imunoglobulina, Fab, F(ab')2, Fe, proteínas de fusão Fc-Fc, Fv, Fv de cadeia simples, Fv de domínio simples, Fv de cadeia simples tetravalente, Fv ligado por dissulfeto, de domínio deletado, minicorpo, diacorpo ou um polipeptídeo de fusão de um dos fragmentos acima com 30 outro peptídeo ou polipeptídeo, fusão de Fc-peptídeo, fusão de Fc-toxina, proteínas de andaime.

A invenção refere-se ainda a um método para aumento da seereção de proteína de membrana ou secretada de interesse em uma célula compreendendo expressão da dita proteína de interesse e expressão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroi5 dogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma.

A invenção refere-se ainda a um método de produção de uma proteína de membrana ou secretada de interesse em uma célula compreendendo aumento da expressão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacio10 nado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, e afetando a expressão da dita proteína de interesse, com o que a ordem ou etapas a e b podem ser revertidas.

Em uma modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado adicionalmente pelo fato de que a etapa a) é realizada antes 15 da etapa b). Em uma modalidade específica adicional da presente invenção o método é caracterizado mais pelo fato de que a etapa a) e a etapa b) são realizadas simultaneamente. Em outra modalidade da presente invenção o método é caracterizado mais pelo fato de que a etapa b) é realizada antes da etapa a). Em uma modalidade preferida da presente invenção o método 20 compreende ainda uma etapa adicional de recuperação da proteína de interesse. Em uma modalidade especialmente preferida da presente invenção o método compreende ainda uma etapa adicional de isolamento e purificação da proteína de interesse.

Em uma modalidade específica da presente invenção o método 25 compreende aumento da expressão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma através de transfecção de uma célula com um polinucleotídeo codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compre30 endendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma.

Em uma modalidade específica da presente invenção o método compreende transfecção da dita célula com um primeiro polinucleotídeo codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma e transfec5 ção da dita célula com um segundo polinucleotídeo codificando uma proteína de interesse.

Em uma modalidade específica da presente invenção a proteína do domínio START do método é caracterizada pelo fato de ser induzida quando do estresse de ER e/ou ser estruturalmente caracterizada por não 10 ter quaisquer motivos estruturais adicionais além do domínio START tal como StarD4 (SEQ ID NO.: 21), StarD5 (SEQ ID NO.: 23), StarD6 (SEQ ID NO.: 25) ou PCTP (SEQ ID NO.: 27).

Em uma modalidade preferida da presente invenção o método compreende aumento da expressão de uma proteína tendo uma seqüência 15 de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, de preferência através de transfecção da dita célula com um primeiro polinucleotídeo codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo rela20 cionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, com o que o aumento é medido em comparação a uma célula não-transfectada, transfecção da dita célula com um segundo polinucleotídeo codificando uma proteína de interesse.

Em uma modalidade preferida da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que as proteínas expressas nas etapas a) e b) não são idênticas.

A invenção refere-se ainda a um método de produção de uma proteína de membrana ou secretada de interesse em uma célula compreendendo: aumento da expressão de uma proteína tendo uma seqüência de 30 aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma na dita célula e afetando a expressão da dita proteína de interesse na dita célula.

A invenção refere-se ainda a um método de produção de uma proteína de membrana ou secretada de interesse em uma célula compreendendo aumento da expressão de uma proteína tendo uma seqüência de a5 minoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma na dita célula e expressão da dita proteína de interesse na dita célula.

Em uma modalidade específica da presente invenção o método 10 é caracterizado pelo fato de que o dito método resulta em produtividade celular específica maior da dita proteína de interesse na dita célula em comparação a uma célula controle previamente transfectada com um polinucleotídeo codificando a proteína de interesse, mas com o que a dita célula controle não tem expressão maior de uma proteína tendo uma seqüência de ami15 noácido compreendendo um regulador agudo esteroidogênico

Em uma modalidade específica da presente invenção o método é caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é uma proteína que está passando pelo complexo de Golgi.

A invenção refere-se ainda a um método de aumento da produtividade celular específica de uma proteína de membrana ou secretada de interesse em uma célula compreendendo introdução em uma célula de um ou mais sistemas de vetor compreendendo seqüências de ácido nucleico codificando pelo menos dois polipeptídeos com o que um primeiro polinucleotídeo codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma e um segundo polinucleotídeo codifica uma proteína de interesse e com o que a proteína de interesse e a proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a reguIador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma são expressas pela dita célula.

A invenção refere-se ainda a um método de aumento da eficiência de transfecção de uma célula expressando uma proteína de membrana ou secretada de interesse em uma célula compreendendo transfecção da dita célula com um primeiro polinucleotídeo codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência 5 de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, subsequentemente transfectando a dita célula com um segundo polinucleotídeo codificando uma proteína de interesse, com o que os ditos primeiro e segundo polinucleotídeos estão localizados em sistemas de vetor diferentes.

Em uma modalidade adicional a invenção refere-se a um método

de aumento da eficiência de transfecção de uma célula compreendendo a etapa adicional de transfecção de um gene repórter tal como GFP, YFP, HRP, SEAP ou LacZ, que poderia ser fundido à proteína de interesse, localizado no mesmo construto de expressão ou em um plasmídeo separado.

Em uma modalidade preferida a invenção refere-se a um método

de aumento da eficiência de transfecção de uma célula compreendendo a etapa adicional de detecção e/ou medição da eficiência de transfecção ou através da detecção da proteína de interesse ou da expressão do gene repórter.

A invenção refere-se ainda a um vetor de expressão compreen

dendo dois polinucleotídeos, um primeiro polinucleotídeo codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma e um segundo polinucleotídeo codificando uma proteína de interesse.

Em uma modalidade específica da presente invenção o vetor de expressão é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é um membro da família do domínio START de mamífero tal como PCTP (SEQ ID NO.: 27), StarD7, GPBP, StarDI0, StarD8, StarDI3, DLC-1, StarD4 30 (SEQ ID NO.: 21), StarD6 (SEQ ID NO.: 25), StarD5 (SEQ ID NO.: 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH ou StarD9 ou um derivado ou mutante da mesma. Em outra modalidade da presente invenção o vetor de expressão é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida CERT (CERT=SEQ ID NO.: 11 ou CERTL=SEQ ID NO.: 13) ou um derivado ou mutante da mesma.

5 Em uma modalidade específica da presente invenção o vetor de

expressão é caracterizado pelo fato de que a CERT mutante é CERT S132A (SEQ ID NO.: 15).

Em uma modalidade específica da presente invenção o vetor de expressão é caracterizado pelo fato de que o dito primeiro polinucleotídeo aumenta o transporte de proteína em uma célula através do curso secretor.

Em uma modalidade específica da presente invenção o vetor de expressão é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida mutada CERT e a dita mutação desabilita e/ou deleta um sítio de fosforilação em qualquer posição serina, treonina ou tirosina dentro da proteína CERT.

Em outra modalidade da presente invenção o vetor de expressão é caracterizado pelo fato de que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida mutada CERT e a dita mutação desabilita e/ou deleta o sítio de fosforilação de proteína quinase D (PKD) de CERT na posição 132.

A presente invenção refere-se ainda a uma célula compreendendo o vetor de expressão da invenção. Em uma modalidade específica da presente invenção a célula é caracterizada pelo fato de que a dita célula é uma célula eucariótica tal como uma célula de levedura, planta, verme, inse25 to, ave, peixe, réptil ou mamífero. Em uma modalidade específica da presente invenção a célula é caracterizada pelo fato de que a dita célula eucariótica é uma célula de mamífero.

Em uma modalidade específica da presente invenção a célula é caracterizada pelo fato de que a dita célula de mamífero é uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), CV1 de rim de macaco, COS de rim de macaco, PER.C6TM de epitélio de lente humano, rim embriônico humano, HEK293, rim de hamster bebê, rim de macaco verde Africano, carcinoma cervical humano, rim canino, fígado de rato búfalo, pulmão humano, fígado humano, tumor mamário de camundongo ou mieloma, uma célula de cachorro, porco ou macaco, rato, coelho, gato, cabra, de preferência uma célula CHO. Em uma modalidade específica da presente invenção a célula é carac5 terizada pelo fato de que a dita célula CHO é CHO do tipo selvagem, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, de preferência CHO DG44.

Em uma modalidade específica da presente invenção a célula é caracterizada pelo fato de que a dita célula é uma célula animal, de preferência uma célula metazoa tal como C. elegans. Em uma modalidade adicio

nal da presente invenção a célula é caracterizada pelo fato de que a dita célula é uma célula bilateria tal como Drosophila meianogaster, de preferência uma célula de vertebrado tal como uma célula de ave, peixe, réptil ou mamífero. Em uma modalidade específica da presente invenção a célula é caracterizada pelo fato de que a dita célula eucariótica é uma célula de mamífero, 15 de preferência uma célula humana tal como a linhagem de célula de mieloma humano U266, HEK293, HeLa, HepG2 ou HT1080, com mais preferência uma célula de roedor tal como célula SNO, Sp2/0 ou Ag8653 de murino, YO ou YB2.0.

A invenção refere-se ainda a uma proteína de interesse, de preferência um anticorpo produzido através de qualquer um dos métodos descritos.

A invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo útil para bloqueio ou redução da expressão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido 25 compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma. A invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo que bloqueia ou reduz a expressão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um 30 domínio START ou um derivado ou mutante da mesma.

Em uma modalidade específica da presente invenção a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que a seqüência do domínio START é proteína de transferência de ceramida CERT (CERT=SEQ ID NO.:

11 ou CERTl=SEQ ID NO.: 13) ou um derivado ou mutante da mesma. Em outra modalidade específica da presente invenção a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que o domínio START é (SEQ ID NO.: 17 ou 19) ou um derivado ou mutante da mesma.

Em uma modalidade específica da presente invenção a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeo é RNAi1 siRNA ou RNA de antissentido.

Em uma modalidade preferida da presente invenção a composi10 ção farmacêutica é caracterizada pelo fato de que a proteína do domínio START é membro da família do domínio START de mamífero tal como PCTP (SEQ ID NO.: 27), StarD7, GPBP1 StarDIO1 StarD8, StarDI3, DLC-1, StarD4 (SEQ ID NO.: 21), StarD6 (SEQ ID NO.: 25), StarD5 (SEQ ID NO.: 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH ou StarD9 ou um derivado ou mutante da 15 mesma.

Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que o dito polinucleotídeo é complementar à seqüência de nucleotídeo de CERT ou partes da mesma, especialmente ao domínio START.

Em uma modalidade mais preferida da presente invenção a

composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que o dito polinucleotídeo se liga ou ao gene de CERT ou ao promotor de CERT.

Em uma modalidade adicional da presente invenção a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que o dito polinucleotídeo é oligonucleotídeo de antissentido para o gene de CERT ou partes do mesmo.

A invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor ou supressor de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado 30 ou mutante da mesma, de preferência CERT (SEQ ID NO.: 11 ou SEQ ID NO.: 13) ou um derivado ou mutante da mesma.

Em uma modalidade específica da presente invenção a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que o dito inibidor ou supressor é uma substância química ou um inibidor de peptídeo ou uma proteína inibidora tal como: (i) proteína se ligando a promotor de CERT deste modo inibindo expressão de CERT, (ii) proteína se ligando à CERT ou PKD en5 tão prevenindo ligação de PKD e CERT e impedindo fosforilação de CERT por PKD, (iii) uma proteína similar à CERT que, no entanto, não realiza funções de CERT, que significa uma variante de CERT "dominante-negativa" ou (iv) uma proteína agindo como andaime para ambas as CERT e PKD, resultando em ligação irreversível de CERT à PKD (= um complexo PKD/CERT 10 estável) que não é funcional devido à fosforilação inibidora de CERT por PKD e o impedimento de dissociação de CERT a partir do dito complexo.

Em uma modalidade específica da presente invenção a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que o dito inibidor ou supressor é um inibidor ou supressor de atividade de CERT.

A invenção refere-se ainda a um método para identificação de

um modulador de funcionamento de proteína de domínio START compreendendo provisão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, de 20 preferência CERT, contato da dita proteína da etapa a) com um agente de teste, determinação de um efeito relacionado à secreção ou expressão de proteína maior ou menor de proteínas de superfície celular.

A invenção refere-se ainda a um método compreendendo aplicação de uma composição farmacêutica conforme descrito para o tratamento de câncer.

A invenção refere-se ainda ao uso de uma proteína do domínio START ou polinucleotídeo codificando uma proteína do domínio START para aumentar a secreção e/ou produção de uma proteína de interesse.

A invenção refere-se ainda a um uso para diagnóstico de qualquer com qualquer um dos métodos, vetores de expressão, células ou composições farmacêuticas conforme descrito.

Em uma modalidade específica a invenção refere-se ainda a um método de produção de uma proteína heteróloga de interesse em uma célula compreendendo aumento da expressão ou atividade de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo uma seqüência de consenso de domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo es5 teroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma conforme listado abaixo.

CONSENSO/80% (SEQ ID NO.: 28)

nhnntnnntahtnhhntnnn Wrmnnn nnnnnrmrurmnnhhthnnnnrmnMmnnnnrmnnn+hnthhnniiimnnhrm ishhntnnniuintltpprihnnnnrinniinnnnnhthlpnhtnsnnnririnnBnlnhnnntimhnnnhnsfiRhhnXtahprmnannnnnnnttnhhlhnnohpnintnRnnnnnnnUihRapbhnshhhhpnnttannnnnnnnnnnnsp hhhlnnh-htsnnnnnnnpnhhpnhhtnthimhhpnrmnhttlaptntnp

Com o que os resíduos-chave de classe são (representados no código de aminoácido de uma letra): álcool o S,T

alifático I I1L1V

qualquer n . A1C1D1E1F1G1H1I1K1L1M1N1P1Q1R1S1T1V1W1Y

aromático a F1H1W1Y

carregado c D1E1H1K1R

hidrofóbico h A1C1F1G1H1I1K1L1M1R1T1V1W1Y

negativo - D1E

polar p C1D1E1H1K1N1Q1R1S1T

positivo + H1K1R1

pequeno s A1C1D1G1N1P1S1T1V

minúsculo u A1G1S

"turnlike" t A1C1D1E1G1H1K1N1Q1R1S1T

e afetando a expressão da dita proteína de interesse.

Em modalidades preferidas adicionais da invenção a proteína 25 tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado a regulador agudo esteroidogênico (START) em qualquer uma das modalidades anteriores (por exemplo, vetores de expressão, células, proteínas, composições farmacêuticas, métodos e usos) é definida compreendendo uma seqüência de consenso de domínio START ou 30 um derivado ou mutante da mesma conforme acima listado (SEQ ID NO.: 28; vide também Figura 9). A invenção geralmente descrita acima será compreendida mais prontamente através de referência aos exemplos que seguem, que são aqui incluídos apenas para o propósito de ilustração de certas modalidades da presente invenção. Os exemplos que seguem não são limitantes. Eles ape5 nas mostram modalidades possíveis da invenção. Uma pessoa versada na técnica poderia facilmente ajustar as condições para aplicá-las a outras modalidades.

EXPERIMENTAL MATERIAIS E MÉTODOS Anticorpos e reaqentes

Anticorpos são: anticorpo policlonal de substrato anti-coelhoPKD (Cell Signaling), anticorpo monoclonal anti-Flag de camundongo (Sigma-Aldrich), anticorpo monoclonal anti-GFP de camundongo (Roche), anticorpo policlonal anti-PKD de coelho (C-20, Santa Cruz Biotechnology), anti15 GS28 de camundongo (BD Biosciences) e anti-tubulina de camundongo (Neomarkers). O anticorpo de PKD anti-pS916 fosfoespecífico monitorando autofosforilação de PKD é descrito em outro local (Hausser e outros, 2002). Anticorpos IgG anticamundongo e anti-coelho secundários marcados com peroxidase são da Amersham; anticorpo IgG anticamundongo secundário 20 marcado com fosfatase alcalina é da Sigma; anticorpos IgG anticamundongo e antirrato secundários marcados com Alexa Flúor 488 e 546 são da Molecular Probes.

Construtos de DNA

cDNA de CERT de comprimento integral é amplificado através 25 de PCR usando pcDNA3-Flag-CERT como um molde com iniciadores contendo sítios de restrição EcoRI e clonado no vetor pEGFPCI. Os mutantes por ponto de CERT são gerados através de metagênese de PCR direcionada a sítio Quikchange seguindo as instruções do fabricante (Stratagene). Variantes de CERT truncadas são geradas através de inserção de códons 30 STOP. Os oligonucleotídeos que seguem são usados: CERT-S132A (SEQ ID NO.: 1: 5'-cgtcgacatggcgcaatggtgtccctgg-3'), CERT-S132A rev (SEQ ID NO.: 2: 5'-ccagggacaccattgcgccatgtcgacg-3'); CERT-S272A (SEQ ID NO.: 3; 5'-ggttaaacgtgaggacgcctggcagaagagactgg-3'); CERT-S272Arev (SEQ ID NO.: 4: 5'-ccagtctcttctgccaggcgtcctcacgtttaacc-3'), truncamentos de CERT no aminoácido 138 (SEQ ID NO.: 5: 5'-ggtgtccctggtgtcttgagcaagtggctactc-3'); truncamento de CERT-138 (SEQ ID NO.: 6 5'5 gagtagccacttgctcaagacaccagggacacc-3'). O cDNA de FIag-CERT é subclonado em pGEX6P1 usando sítios de restrição EcoRI. pEGFP-N1-PKD e pEGFP-N1-PKDK612W são descritos anteriormente (Hausser e outros, 2005). O plasmídeo codificando ss-HRP-Flag é gentilmente provido pela Vivek Malhotra (UCSD).

cDNAs e proteínas

humano: cDNA de CERT (SEQ ID NO.: 10)

atgteggiôta «tcâgagctg güactcgteg ggctcggagg eggatccaga gaeggagfcei 60 WScgccCgi c9<3«tcctc agíaaatgç® cíMet#c»t tcataa-afcge 120 ca Wktcgtt gggtasjtttt tjctct-gísqet &vA <s(.:aaet Ic tqA«q t j<f 3 80 gctgcaflaeg atceetctgt ett*gre*«<?g ctqt cot c»c· *CCt< i T 2 m tttgatgaat gtcgatttga tattagtgta aat gatagç g %ttggt ate r. tcqtgctçag 300 gãtccagate atagacagca atggatagat gccattgaae agcacaagac tgaatctgga 2 GO tatggatctg aatccagctt gcgtcgacat ggctcaatgg tgtccctggt gtctggagea 420 agtggctact ct.-gca.acat c cacctcttca ttcaagaaag gccacagttt acgtgagaag 430 ttggctçaaa tggaaacatt tag-agacatc ttatgtagac aagttgacac gctacagaag 54 0 ta-ctttgatg cctgtgctga tgccgtctct aa-ggatgaac t tcaaaggga taaagtggta 600 áagáfc9»ctt tcetaceácg e>gttetg*tg gtgecttctt gcat«<at*cc 660 aaeagcaata aagaaaagtt atttccaeat gtgacaeeaa aaggaattaa tggtatagac 720 tttaaagggg aagegataae ttttaaagca actaetgcr-g gaatccttgc aacactttct 780 cattgtattg aactaatggt taaacgtgag gacagctgae agaagagact ggataaqgaa 840 actgagaaga aaagaagaaç agaggaagca tat-aaaaat.g çaatgacaga acttaagaaa 900 aaatcccact t tggaggacc aq<j-taicsaa g-aaggcccta acagtctgat taatgaagaa 96D gagttctttg atgcfcgttga aacrqrtctt gacagacaag ataaaataga. agaacagtea IOiSO cagagtgaaa aggtgagatt acattggcct acatccttgo CGt-Ctggaga tgcottttct IO1S 0 tctgtgggga eaiúAtagatt tgtccaaaàg g ItgaaaaiM tggtgcagaa ccacüiEgíict 1143 t*ctcatt«c SqgiSttFtaijg cggag^T gi It gtjf I.: I •gq· 1 gt cig.i «güítqqcigaoi 1200 atgadgiitM:. acaqarttjat,·» ΟΊIgqtfJ I “ '5 T tctijcjat'· ^ t Híjeiicsgri 1260 aceea ttaaaggcçt caeaggaeat. gaagtefcgea attatttctg gaatgfctgac 1320 gtçegcaaCg aetgggaaac aacvatagaa Cggtggaaae attagctgat 1380 aatgcaatea t-catttatca aacaeacaag ag-ggtgtgsc ctgcttctca gcgagacgta 1440 tt&tatcttx ctgfccattcg aaaçatacca gccttgactg aaaatgaccc tgaaacttgg 1500 atagtttgta attfcttctgt ggatcatgac agtgctcctc íaaacaaccg atgtgt ccgt 1560 gccaaaataa atgtegctat gatttg-caa accttggíaa gcccaccaga gggaaaccag 162 0 gaaatt a.gc*a gggacaacat tctatgcaag aitacatíitg tagctaatgt gaaccctgga 1680 ggatgggcsc cagcctcagt sLtaagggea gt-5gcâe«iic gagagtôtcc K I*1c* ü ΓΜ0 aaacgtttta c~tcttacçt COfSuiCJ ò & <5. «â ar:tgeagQaa agcctatttt. c* f ^ 15

humano: proteína CERT (SEQ ID NO.: 11) Met Ser Asp Asn Gln Ser Trp Asn Ser Ser Gly Ser Glu Glu Asp Pro -31 u Thr Giy Ser Sly Peo Pro VaI SIu Ar* Cys Giy Val L«Ü Ser Lys Trp Thr ASfi Tyr IU His Gly ΊΧψ -Slri hsp Arg Trp Vdl Val l*u lys Asn SSft Ala Lcu ser Tyr Tyr Lys ser Oiu Asp Giu Thr Glu Tyr <31 y cys Mg Giy Sei X l€ Cys Le-J Ser Lys Ala VaJ Ile Thl' Pro HlS ASp Phe Aap Glu Cys Rxq Phe Asp He Ser Val Asn Asp Ser vai Trp Tyr Leu Arg Ala GIn Asp Pxo Asp Mis Arg Gln Gln Trp Ile Asp Ala Ile Glu Gln His Lya Thr Giu Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Ser Ser Leu Arg Axg His Gly Ser Met Val Ser Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Tyr Ser AIa Tlir Sez Thr Ser Ser Phe Lya Lys Gly His Ser Leu Arg Gly Lys Leu Ala Gly Met Glu Thr Phe Arg Asp Ile Le-J Cys Arg Gln Val Asp ThE LOU Gl r, lys Tyr Phe Aep Ala Cys AJa Asp AIa Va1 S« l,ys Aep Oiu Leu ein Arg Aap Lya Val VaI Glu Aitp Aep Glu Asp Asp Phe E-JfO Thr Thr Arg Ser Asp Sly Aep Phe Leu HiS Ser Thr Asn 61 y Keri Lys GlU Lys £»he Pro HiS Val Thr Pro Lys Gly Ile Asn Gly lie Asp Phe Lys Gly Glu Ma Ile Thr Phe Lye Ala Thr Thr Ala Gly Ile Leu ALa Thr Lea Ser Bia Cys Ile Glu Leu Het Val Lys Arg Glu Asp Ser Trp Glrs Lys Arg Leu Asp Lys Glu Thr Glu Iys Lys Arg Arg Thr Glu Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Ser His Phe Sly Gly P£0 ASp Tyr Glu Glu Gly Pro Asn Ser LM 11* Ase, GIy GlN QIu Phe Phe Asp Ma vai Glu Ala Ala I*» Rep hrg Sln Aap Lys He Slu Glu Gln ser Gln Ser Gly Lys V£l Arg Leu His Trp Pro Xhr Ser Leu Pro Ser Gly Aap AIa Phe Ser Ser Val Gly Thr His Arg Phe Vsl GLn Lys Val Glu Glu Met Val GIn Asn His Met Thr Tyr Ser Leu Glrt Asp Val Gly Gly Asp Ma Asri Trp GXn Leu Val Vai Glu Glu Gly Glu Met Lys Val Tyx Arg Arg Glu Vai GIu Glu Asn Gly Ile Val Lea Asp Pro Lrf=-IS !»ys Ala Thr eis Ala Vsl Lys GIy Val Thr GIy His Glu Val Cy- ΛΜ 7yx Pbs Trp As» v*l Aep Val Mg Aen Aep Trp Glu Xhr Thr Il** U 1« Aga Phe Hia va I Val Glu Thr Lea AIa Aap A3K AIa He He He Tyr Gln Thr Hiâ Lya Arg Vai Trp Pro Alá ser Gln Arg Asp Val Leu Tyr l<eu Ser Val He Arg Lys Ile Pro Ala Leu Thr Glu Asri Aap Pro Giu Thr Trp Ile Val Cys Asn Phe Ser Val Asp His Asp Ser Ala Peo Leu Asn Asri Arg Cys Val Arg Aia Lys Ile Asrt Val Ala Ket Ile Cys Gin Thr Leu Val Ser Pro Pro GIu GIy Asri Gln Glu Ile Ser Arg Asp ASfi Ile Leu Cys Lys Ile 1Thr Tyr Val Ala Asn Val ASft Pto QIy Sly Trp «1« ?ÍO Ala Sei Vai, LeU AN) Alá Vá! Ala Lys Ate GJu Tyr Pro Lys Phe Leii Lys htq Phe Thr SOJJ Tyr Vftl Gln GlU Lys Thr AU Cly Lye Pro 11« Leu Phe Humano: cDNA de CERT (SEQ ID NO.: 12)

gcaçgaagat gçcgçrcQcrtèfc gcggaggtgt gagtggacgc gggactcagc ggccggatfct 60 tCtCttCCCt tcttttccct tttccttccc tatttgaaat t-ggcatogag ggggctaagt 120 tcçíwtíigea «acgcoçpwcg «MtcgcaçKW gtcaofge<3« cggo0gc®gc ggctgacggc :í 80 tqgaaggeta ggettcstte aecgetcgtc CtCCttGCtC gctccgctcg gtgtcaggeg 2« eggeggeggç gegqegggcg gaettegtcc ctcçteetçü tccçccccac »ccgg&gcgg 300 aeaetetteg crtogccate eçccçsaccct tcaeecegag qactgggegc ctcçtccggc 360 geagçtgagq gagegggggc çggtctcetg eteggttgt.c gagcetccat qtcggataat. 420 cagagctoga actegtcefg ctc-ggaggag gatcoagaga cggagtctgg gccgectgrg 4 SO gagcgctgeç gggccctcag taaçtggaca aactacattc atggçtggca ggaEcgttgg 540 t 1 1 1 11" ctgag-.tac tacaaatctg sagatgaaac agagtatggc 600 7 -J 1 * 1 < : íi-i: .ΐ -Sn:·*·"1 ■ ■·.· I<; r.-lCM'' rrl.írnrgnt t r fcM cgatttgata ttagigtaaa tga-agtgtt tggtatctfcc gtgctcagga tccagatcat 720 agacagcaat. ggatagatsjc eattga-acag cacaag&etg a,stctggata tggatctgaa im tccagcttgc gtcgacatgg cteaatggtg tccctggtgt ctggagcaag tggctactct 040 gcaacatcca cctcttc-att caagaaaggc oacagtttac gtgagaagtt ggctgaaatg 900 gaaacattta gagacatctt atgtagacaa gfctgacaogc cacagaagta ctttgatgcc 360 tgtgctgatg ctgtctctaa ggatgaactfc c-aa&gggata aagtggtaga agatgatgaa 1020 g&tgactttc ctacaacgcg ttctgatggt gacttcttgc atagtaccaa. cggcaataaa 10S0 g«-ea*gttát tí-ccácatf t gaeaecaaaa. ggaafctaatg gtatagactt tàaàgfggaa 1140 gcgataactt ttaaagcaac taetgctgga atcettgcaa cactttctca ttgtaitgaa 1200 ctaatggtta aacgtgagga çagetggcag aagagaetgg ataaggaaac tgagaagaaa 1260 agaagaacag aggaagcata tsaaaacgça atgacagaac çtaagaaaaa atcccacttt 1320 gga-ggaccag attatgaaga aggcce-taac agtctgatta atgaagaaga gttctttgat 1380 gctgttgaag ctgctcttga cagacaagat aaaatagaag aacagtcaca gagtgaaaag 1440 gtgagattac attggcc-tac atcct tgccc tctggagatg ccttttcttc tgtggggaca 1500 eatagatttg tccaaaagcc etatagtcgc tcttcctcca tgtetLcueL tgatctagtc 1560 agtgeetctg «fcgatgttea cagattcagc tcccaggttg aagagaiifgt gcagaaccac 1 62 0 atgácttact eattaeagg* tgtaggegga gatgceaatt ggcftqlIqgt tgtagaagaa i mo ggerçsaaatga aggtatacag aagaçwagta gaagaaaefcg ggatlgtlct ggatccttfca nm aaagctaccc atgcagttaa aggcgtcaea ggacatgaag cctgcaatta tttctggaat 1S00 gttgacgttc gcaatgactg gqaaacaact atagaaaact ttcatgtggt ggaaacatta 1860 gctgataatg caatcatcat ttateaaaca cacaagaggg tgtggcctgc tt-ctcagcga 1920 gaogtattat atctttctgt cattcgaaag ataccagect tgactgaaaa tgaccctgaa 1980 acttggatag tttgtaattt ttcigtggafc CTtgacagfcg ctcctctaaa caaccgatgt 2040 gtccgt-gcc-a aaataaafgt igctatgatt tgtcaaacct tggtaagccc accagaggga 2100 aAceaçjçeeü tfcagcaggga caacatieta tgce«gatta Catatgtage tôÁtglgmc. 2160 cctflflaggac gggcaceagc ctcagtgtta agggcagcgg caaaecgaga gtãtcctãêã 2220 tt f.ctaaaac gttttaettc ttacgtccaa gaaaaaactg caggaaagce tattttgttc 22 SO tagtattaa-c aggtactaga agat.at.gtt. r. tatctttttt taacttcatt tgact-aat-at 23-4S gaetgtcaat aetaaaattt agttgttgaa agtatttact atgtttt.tt 23-S9 Humano: proteína CERT L (SEQ ID NO.: 13)

Met Ser Asp Asn Gln Ser Trp- Asn Ser Ser Gly Ser Slu Glu Asp l*rc

Slu Thr Gla Sex Sly Pro Pro Val Slu Arg Cys Gly Val Leii Ser Lya

Trp Thr Asri Tyr He His Gly Trp -Sln Asp Arg Trp Val Val Leu Lys

Aen rT M - hêü Se*: Tyr Tyr Lys Se; ι sp GJ u T c i Tyt Gly

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Ala Thr Ser Thr Ser Ser Phe Lys Lya- Gly Hia Ser Leu Arg Glu Lys

Leu Ala Gla Net Clu Thr Flte Arg Asp He Leu Cys Arg Qln Val Asp

Thr Leu Gln Lys Tyr Phe Asp Ala Cys AIa Asp Ala Val Ssr Lys Asp

Glu Leu Gla Arg Asp Lye Val Vai Ole Asp Asp Glu Asp Asp Phe Pro Thr Thr Arg Ser Asp Gly Asp Phe Leu His Ser Thr Asn Giy Asri Lys Siu Lys Jteu Fhe Txo His Vai Thr Pro Lys ei’/ Ile ASft Gly He Aap Fh* Lys Sly Slu Ala Iie Xhr Phe Lya AIa Tfar Thr Aia Gly íIj* Leu Ala Thr Mia Sar Hig Cya Hii Glw Leu Met Val Lya Arg Glii Asp $er Trp Gin Lys Arg Leu Agp Iys Glo Thr Glu Lys Lye Atg Arg Thr Gla Slu Aia Tyr Lys Asn Aia Met íhr Slu Leu Lys Lys Lys Ser His Phe Gly Giy Pro Asp Tyr Giu Gly Gly Pro Asn Ser Leu Ile Asn Glu Glu Slu Phe Phe Asp Ala Val Gla Ala Ala Leu Asp Arg Gin Asp Lys He Slu Glij Gln Ser Gih Set Glu Lya vai Atg Lea Hia Ttp Pto Thi Set Leu Pto S«r Gly Dsp Ala Phe ser Set Val Gly Tbt His Atg Phê val Gin IrV» Pte lyt S« Arf sm ser S«r mt 5«* 5«r 11« Asp ietí vai Ser Aia $** Asp Asp Val His ftrg Phe Set Stft Gin Val GJa Glu Met Val Sirs Asn Mis Met Thr Tyr Ser Lau Gin Asp Val Siy Gly Asp Ala Aan Trp Gln Leu Val Val GIq Glu Sly Glu Met Lys Val Tyr Arg Arg Slu Val Clu Glu Asn Gly He VaI Leu Aap Pro Leu Lys Ala Thr His Ala Val Lys Gly Val Thr Gly His Slu Val Cys Asn Tyr Fhe Trp Asn Val Asp Val Arg Asn Asp Trp Glu Thr Thr He Glu Asn Phe His Vai Val Giu Thi- Leu Ala Asp Agsn Ala He He He Tyr Slfl Thr His Lys Axg Val Trp Pre Ala Ser Gln Arq Aap Val Leu Tyr Leu Ser Val He Arq Lys He Pro Ala Leu Thr Glu Aan Asp Pro Glu Thr Trp He VaI Cys Asn Phe Ser Val As-p His Asp Ser Ala Pro Leu Asn Asri Arg Cys Val Arg Ala Lys He Asti Vai Ala Met He Cys Gln Thr Leu Val Ser Pro Pro Gla Gly Asn GiR Gl« Ile Ser Arg Assp Asn He Leu Cys Lys Ile Thr fyr Val Aia Asn Vai Asn Pro Gly Gly Trp- Ala Pro Ala Ser Val L«m Arg Ai* v*l Aia Lys Arg Giu Tyr Pro Lys Ph* Lmu Lys Arg Phe Thr ser Tyr vai Gin Gla Lys Thr Ala GIy Lya pj:c? He Leu Phe

humano: cDNA de CERT S132A (SEQ ID NO.: 14)

atgtcggata ateagagctg gaactcgteq ggctoggagg a-ggatccaga. gacçjga-çjtct. €Q

gggecgcctg tggagcgctg cggggtcctc agtaagtgg* caaaeMCat tcatgggtgg 120

caggatcgtt flgfltaetrtt geoaaataat gctctgegtt aetácaaatc tgaagatgaa 3 80 acagagtatg getgcagagg atecatetgt ctfcagcaagg ctgecaecac *eet«a.cget 240

tttfdtfaat gtcgatttga tattagtgta aatgatagtg tttggtatct tcgtgctcag 300

gaturcagatc «tagacaçca atggatagat gçcattgaac agcacaagac tgaatctgga 360

tatggatctíj aatccagctt gcgt.cgacâí ggcgcaatgg tgtccecggt gtctggagca 42δ

agtggctact ctgeaaeatc cacetettca ttcaagaaag gceacagttt acgtgagaag A2J

ttggctgaaa tggaaacatt tagagacatc tlatqtagac aagttgacac gctacagaag 540

tacttfcgatg cctgtgctg® tgcfcgtctct aaggatqaac ttcaaaggga taaagtggta 600

gaagabgatg aagatgactt tccfcacaaog ogttctgatg gtgactíctt gcatagtacc 660

aaeçrgcaata aagaaaagfct atttccecet gtgacaccaa aaggaattaa tggtatagac 720

ttxaaagggg aagcgataac ttttaaagca aetactgctg gaetcscttgc aacactttct 780

caxtgtattg aaetaatgçt taaaegtgag gacagctggc agaagagaet ggataaggaa 840

aecgagaaga aaagaagaac agaggaagea tataaaaatg caatgaeaga acttaagaaa 900

aaatcccact ttggaggaec agattatgaa gaaggpcer.a acagt.et.gat taatgaagaa 960

gsgttctttg atgctgttga agctgctctt gacagacaag ataaaataga agaacagtca 1020

cagagtgaaa aggtgagfltt acafctggcce acatccttgc cctctggaga tgcafctttct 1C80

tctgtgggga cacatagatt tgtccaaaag gttgaagag* tggtgc-agaa ceacatgact 1140

!«ctcttttac: «ggaigtaçg eggagatgec âáttggcagt wjgttgiágü (sgaaggagfra IiOCi .StgAaggtat acagaegaga ά O · à O '.' -í .·! ' I H ri aatggeattg ttctggatce tttaaaagct 1268 àcccãtgcag ttaaaggçgt cacaggacac. gaagtctgca attatttetg gaatgttgac 1320 gttcgcaatç actggçaaac aactatagaa aactetcatg tggtggaaac attagctgat 1380 aatgcaafcca tcatitatca aacacacaag agggtgtggc ctgcttctca gcgagacgta 1440 ttatatcttt ctgtcatícg aaagatacca gccttgactg aaaatgaccc tgaaacttgg 1500 ategtttgta atttttctgt ggatcatgac agtgctccto taaacaaccg atgtgtccgt 1560 gccaaaataa atgtigctat çatfctgtcaa acctt-ggtaa gcccaccaga gggaaaccag 1620 f**ateagea 999ACaacat tctatgcaag «çteeatatg tagctaatgfc g&accetgqa 1680 Sjgatgggcae ea-gcetcagt gttaagggca gtggcaaagc gagagtatcc taaattteta r?40 aaacgtttta cttectaogt ccaagaaaaa actgcaggaa agcctatttt gttet.ag 1T07 humano: proteína CERT S132A (SEQ ID NO.: 15)

Met Se-t Aap Asti Bln Sêr Trp teu Se.* Smr Gly Ser Slu Glu Asp Pto

Slu Thr Gla Se* Slf Pfo Pro Val Glu A*-f Cy* Gl;/ y«l Leu Ser Ly«

Trp Tht Asm Tyt Tl* His Gly leis Sln Asp a»<j Trp vai v«:] i^u iye

Aen Asn Ale Ieu Ser Tyr Tyr Iys Ser Slu Asp <31u Thr Slu Tyr Gly

Cya Atg Gly Ser He Cys Leu Ser Lys Ala Val He Thr Pi:q Mis Asp Plie Asp Glu Cya Arg Phe Aep He Ser Val Asn Asp Ser Val Trp Tyr Leu Arg Ala Gln Asp Pro Asp Hia Arg Gla Gln Trp He Aap Ala Ile -Slu GIn His Iys Thr Glu Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Ser Ser Leu Arg Arg His Sly Ala Met Val Ser Ieu Val Ser Gly Ala Ssr Gly Tyr Ser AXa Thr Ser Thr Ser Ser Pbe Lys Lys Gly His Ser Leu Arg Slu Lys l»u Ale Gla Met Slu Thr Phe âtrsj As? Ile tma Cys Atg Gln Val Asp Thr LeiU Gln Ly* Tyr Phe Aap Ala Cye Ala Aep Ale Val S*t Lys Asp Clii Leu Glri Arg Asp Lys Vâl Val -Glu Aep Asp Gla JWsp Rsp Phe Pr© Thr Thr Arg Ser Aap Giy Aep Phe Len Hia- Ssr Thr Aaa Gly Asri Lya Slu Lys Um Phe fro ai» Val Thr íto Lys Gly II® Asn Gly He Asp Fhe Lys Gly Glu Ala He Thr Ptae- Lys AIe Tfer Thr Ala Gly He Len Ala Ihr 'Leu Ser fSis Cys He Glu Len Met Val Lys Arg Glii Asp Ser Trp GIn Lys Arg Leu Asp hys Glu Tlir Glij Lys Lys Axg Arg Thr Glti Glu Ala Iyt Ly* .teu Aia Met Thr Siu L«u Lye Ly* Lys See His Pbe

<51 y Gly Pro Asp Tyr GlB Çlu Gly Pro Aen JSer LfiiJ He Agn Glu Gia glu Phe Phe Assp Ala Val Çlu Ala Ala Leu Asp Arg Slri Asp Lya Ile GlU Glu Gln Ser Gln Ser Glu Lya Val Arg Leu His Trp Fro Thr Ser Leu Pro Ser Gly Asp Ala Pha Ser Ser Val Sly Thr Kis Arg Phe Val Gln L y 3 Val Glu Slu Met Val Gln Asn His «et Thr Tyr Ser Lea Gln Asp Val Gly Gly Asp Ala Assn Trp Gin Leu Vai Vai Glu Glu Sly GIu Met Lys Val Tyr Arg Arg Sla Val Glu Qlu Asn Sly Ile Val Lieu Asp Pro Ls-U Lys Al* Thr His tts Val Lys Gly Val Thr Sly ILis 01« Vai Cya Asn Tyr Phe Trp Asa Val Asp Val Arg Asn ASp Trp Glu Thr Thr Ile Giu Asn Phe Kis vai vai Slu Thr L«üU Ale ASp Aen Ala He Ile 11« Tyr Gln Thr Hia Lys Arg Vai Trp Pro Ala Ser -Sln Arg Asp Vai Leu Tyr Leu Ser Val He Arg Lys Ile Bro Ala Leu Tfa-E Glu Asrt Asp Pro Glu Thr Trc He Val Cys Asn Fhe Ssr Val Asp Bia Asp Sar Ala Prc Lsu Aso Asn Arg Cys Val Arg Ala Lys !Ie Asn Val Ala Met Ile Cye Gln Thr Lea Val Sér Pro Pro Siu Giy Asn GiS Gltt Me 3-« Asg Aep Rsn 11« Leu Cys Ly í* Ilv Thr Tyr Ve S Aie Ajs η Vi I Λ ! : Frj Cl 1 - I ■” I F Ϊ í ? ^ . 5 i Ί J S Leu ílKÇJ ' I j cs Ala X. I G1 j T p*. S · - Hi* Lf ií rt r P1 - Trir r T r . 1 I I S Il l -j. - -. t 3Iy Lys i>ro :I l.e Leu Kne humano: cDNA de CERT de Domínio START ( SEQ ID NC agatttgtc-c aaaaggttga agagatggtg cagaaccaca tgecttactc attacaggat 60 Wtaggcggag atgceaattg geagttggtt gt-iigaagaeg gagaaatgaa ggtatecaga 120 agagaagtag aagaaaatgg gattgttctg gatcctttaa aagctaccca tgcagttaaa 180 ijgçgtcaeag gacatgaagt Ctgcaattat ttctggaatg ttgacgttcg caatgactgg 240 gi& àiãca-iiç tagaaaaett tcatgtggtg gaaacattag ctgataatgc ^atcatcatt 300 tateaaacac açaagagggt gtggcctgct tctcagcgag acgtat-tata tctttctgtc 360 atLcgaaaga taccagcctt gactgaasat gacoctgaaa cttggatagt ttgtaatttt 420 tctgtggatc atgacagtgc tccicfcaaac aaccgatgtg tccgtgccaa aeteaatgtt 480 gciatgattt gteaaacctt ggtaagccce ccagaggg** âccaggaaat t«gcaggg*c 540 aaeattctat gcaagattee atacgtaget aatgtgaaee etggaggatg ggeaeeagce 600 tcagtgttaa gggcagtggc aaagcgagag tatcctaaat ttctaaaacg ttttactt.ct eea tacgtccaa 659 Humano: Proteína CERT de Domínio START (SEQ ID NO.: 17)

Arg Piie Vai Giri Lys Vel Giy Glu Met Vel Gin Asft Hi* Met Thr Tyi:

Ser ' Cl- Glii Asp Val Gly Gly Asp Aie Asb Trp Gln Leu Val Vel Glu Slu Sly Glu Het Lya Val Tyr Arg Arg Qia Val Giu Slu Aeo Sly Ile Val L.&U Asp Pro Leu Lys Ala Thr Kia Aia Val Lya í;ly Vai Thr Gly His GIu Val Cys Asn Tyr Phe Trp Asn %%1 Asp Vei Arg Ase Asp Trp Glu Thr Thr He Slu Ase Phe Mis Val Val Glu Thr Leu. Ala Asp Asn Ala He SJe He Tyr Gln Thr Hie Lys Arg Val Trp Fro Ala Ser Gin Arg- Asp Val Leu Tyr Leo Ser Val He Arg Lys He Pro Ala teu Thr GlU ASrt Asp Pto Slu Th; Trp He Vel Cy« A*B Ph« Ser Vai Asp Hie Asp s«r ala p*o íeu Aer Λϊτι Arg Cye vel Arg Ale i<ys il® Asn vai Al* M*t 11« Cys Sin Thr Ιι»λ Val s<sí Pro Pro Glis Sly Aen Gln Glu II# Set- Arg Asp Asn Ile í<eu Cye hys i,le Tbr Tyr Va2 Ala Asn v*l Aan Pro Oiy Giy Tzp Ala Pro Ala Ser Val hmt Arg Ala Vai Ala Lya Axg Gio Tyr Pro Lya Phe teu Lys Arg Phe Thx Ser Tyr Vai Gin

humano: cDNA de CERT L de Domínio START (SEQ ID NO.: 18)

caggttgaag àgatggegcá gaaecacatg acttaeteat tacagçwtgt aggeggagat 60

gccaattgge agttggttgt agaagaagga gaaatgaagg tatecegaeg agaagtagaa 12!)

q&Saatqgga ttgttctgga tcctttaaaa getacecatg cagttaaagg egtcacagga 1$Ç>

catgsagtct gcaattattt etggaatgtt gacgctcgca atgactggga aacaectata 240

■gaaaactttc atgtggtgga ascattaget gataatgcaa tcatcattta tcaaacacae 3 OCi

aagagggtgt ggcccgcttc tcagegagac gtattatatc cttctgtcat togaaagata 360

ccagccttga ctgaaaatga ccccgaaact tggatagttt gtaatfctttc tgtggatcat 420

geeagtgetc ccctaaacaa cegatgtgtc egtgccaeaa teeatgttgc tatgatttgt 480

ceaacettgg tsiígcccacc agagiggaaac «aggeaatta gcegggeeae cettctatge MO

aegattacat atgfcagcfcaa tgtsaeecet egaçwatggg caccagcctc agfcgtfcaegg 600

gcagtggcaa agcgagagta tcceaaattt. ctaaeaegtt íteettctte cgtceaag 658

Humano: proteína CERT L de Domínio START (SEQ ID NO.: 19)

Gln Val Blu Glu Met Val Gln Aen His Met Thr Tyr Ser Lmu Sln Asp

Val Giy SIy Asp Ai-a Asa Trp Gln Leu Val VaI Giy Glu Gly G1Het Lys Vel Tyr Arg Arg Glu Val Giu Giu Asb Giy Iie VAl Léu Asp Btú IrfSU Lvs Ai* Tbr Kis Alo Vftl Lys Qly Vai ?hr Giy Bis Gla Vel Cys Aan Tyr Phe Xrp- Aan Val Asp Val Arg Agn Asp Trp Giu Thr Thr Iie Giu As r. Phe His Val Val Gia Thr Leu Ala Aep Asn Ala Iie !le 3le Tyr Gir- Thr Hia Lys Ara Val Trp l>ro Ala Ser filn Arg Asp Val Leu Tyr Leu Ser Val He Arg l.ys Ile Pra Ala Leu Thr Slu Asn Asp Pra

Slu Thr Trp He Val Cys Asn Phe Ser Val Asp His Asp Ser Ala Pro

Leu Aan Asn Arg Cys Val Arg Al a Lys He Asn VaI AIa Met He Cya Sin Tiit :,!SJ Vel Sms Pro Pro Gla Sly Ãim Glfi Glu IJe S«r A*g Asp

A*n 1-c --eu Cys Lys He Thr Tyr Val Ala Asn Vai Aeti Pro Glji Sljt

Trp sia P;to Ald 5« vai im Atq Ma Val Ala Lye Atq Gltt Tyi Pirci

I,ys Phe Leu t.ys Arg Phe Thr Ser Tyr Val Gln

humano: cDNA de StarD4 (SEQ ID NO.: 20)

acfgttgaga goggtgtgag gtgcttggta gcgcgccgfca gctgettcca cgtccttgct 6-0 tcacctcagg taaagagaga agtaatggaa ggcctgtctg atgttgcttc ttttgcaact 120 aaacttaâàa acaetctcat ceagtaccat agc*ttgâag aagatàagtg gcgagttgct ISO aagaaaacga aagatgtaaç tgtttggaga aaacectcag aagaatttaa tggatatctc 240 tacaaaaçcc aaggigttat agatgaççtt gtetatagt.a taatagaeca tatacgceca 300 gggect tgtc gtttggattg ggaeagcttg atgacttctt tggatattet ggagaacttt 360 gaagagaatt gctgtgtgat gcgttacact actgctggtc agctttggaa tataatttcc 420 ccaaga-gaat ttgttgattt ctcctataet gtgggctata aagaagggct tttatcttgt 480 ggaata&gtc ttgactgg-ga tgaaaagaga ccagaatttg Ctcgaggata taaccatccc 54C« tgtggttggt tttg£gttcc aetcaaagac aacccaâacc agagtctttt gacaggatat 600 atce«gaeag »tc tgeg tr|e ga tgat tcet CAiJtCtgogpg Cagataoagc eacggcaagc f>6<» acttfcaacea acttctatag tgatttaega aaagctttat gaça^gcaaa atacattcaa Ί7Λ acttgtagta ctaeagaí ca. actctctcag ctacatggcc tgtaaaaatc attga11cca ■tm cttttctgcA tagceggtag aaaaacttga aatgtttttg gttcactagt. àcaatgtt tg 840 gttttattce taaagtaaat agctatcta# gagagegcat tttcactttt tttCttttaa SOO attttgagac aggetctoae tctgttgcce atgctggagg gcagtggtat gatcacagct §60 cactgcagct ttgatctgac cgctcaaggg gttattctac: ctcagcctcc tgaatagctg 1020 ggaatacagg tgcacgccac tatgcacggc taatttttgt ttaatttttt gtagagatgt IOSO ggtcacactg tgttgcccag gctggtcttg aactcctggc otcaagtcat tccccacctt 1140 agcctcccaa. agtgttggga ttataagcgt gsgccaccat gcctggcccc aatttaaaat 1200 gtg<jísa.ttea gttggtgice aagacttafcc ttgagactct taaaagcatc agtctgtaac 1260 tagaacaaaç aeagtettag atttacceaa gt-gcetagat stcattttat aatgattaga 1320 attgagtat~ gtgggteecc taattctgtg ggtgccttaa gtgagaattt ctaaatgatt 1380 ttcacatteS aaatgacttt gggtttcgaa ctctccatct agtttacttc taaaatggga 1440 acttgaggçía attcaggrat ecaggcaaat ctttgtatat atttttttgt gtacatgcac 1500 acatctcgaa atcc-atttcc gtgtttaatg tcagttgttt atgtgttagt attcctgtgt 1560 ctactgtttt gttgttgtts atatgggtaa agtgagccct g-ia^tacat i ctaaacaaga 1620 catgaaattc agAaaggtac ntaatqtttc «agtgcatgg ta Itttqal c tgtgttttae 16S0 ·ΐ'ί· I ít Cl IrJcitJt ■V #g aataaatcaa é 3i r i tr *f acccattttg Π40 ac«e« Jt1JfIe* íCagí :ig<i(jí; l(j! · I i tge ttttgttttt a! I rti ' t U tgccectggt 1 »00 gafcgatagat ttcaaaaaac aaaaggtggc agcagcacaa tgttcatggt gaattatctc 1660 atagtatcta gattgatcaa gstctgacag aaggaatgca caaaggatte tatattctta 1320 atgatttatt aattaocagg atecttttet. aaattgaatg tactrttgaa ttactaggtt 13S0 tcttcttttc ttttgttctg caatagfcgaa agaaaactca gtagtttagt ttcagtttct 2040 CStggaaatt ggtaaatgtt agtxttgaet teatctattt tttatttgtt tttattagcg 210*3 tagagtagga agtc-Catat tctactgttc tatctaggat oataaaattc caaaggtgcc 2160 taactt agggatttg tgacaagata gtacacatta. ct roaiggc tattatttcc 2220 {q -i c: í 3 tceetaaa* íjeá»atí»»ísc tgeccactat í ’ s ‘ «64 humano: proteína StarD4 (SEQ ID NO.: 21) Met Glu CSly Leu Ser Asp Val Ala Ser Khe Ala Thr Lys Leu Lys Asn Thr Leu Ile Gln Tyr His Ser Ile Slu Glu Asp Lys Trp Arg Val Ala Lys Lys fhr Lys Asp Val Thr VaI Trp Sxg Lys Pr o Ser Glu Glu Phe Asn GIy Leu Tyti Lys Ala Gln Cly Vel 11® Asp Asf> L®ü Val Tyr $et He IIe Aes Kig He Arg Pro Gly Pro Cys Atg Leu Aap Trp A Sssr Leu Ket Thr Ser Leu Λ »p 11« Leu Glu Asn Phe SliJ Glu Asrs Cys Cys Val Ket Arg Tyr Thr Thr Ala Sly Gln Lea Trp Asn Ile Ile Ser Pro Arg GIo Phe Val Asp Phe Ser Tyr Thr Val Gly Tyr Lys Glu Gly Leu Leu 3-e.r Cys Gly Ile Ser L©i*i Aap Trp Asp Glu Lys Arg Pro Glu Phe Val Arg Qly Tyr Asr, His Pro Cys Gly Trp Phe Cys Val Pro Leu Lys Asp Asn Pro Asn GIr ■Ser Leu Lsu Thr GXy Tyr Ile Gln Thr Asp Leu Ai;q Giy Het 11« PtO Gln SM Ala Val Asp Thr KlA Het Al« s«r Thr teu Thr Asn Phe Tyr Oly Asp Leu Arg Lys A1& Leu humano: cDNA de StarD5 (SEQ ID NO.: 22)

gagctccagc etceaggcac ccgggaεcca gcgcegcogc tcataacacc cgcgaccccg 60 càfctaágcg cagctccef» eseaatggae ecgg<S0cfc9g eagece»$« ga«eg«gget 120 çtggeegaga agatgctcea gfcaccggegg gaeacagcag gctggeagat ttgccqggaa 180 ettcwjrtttc etggaggeca tctgtgga^t ttceagggea cetgtac«sga 240 ggagaaggca ttgtatatgg gacactagag Wgtgtggg actgtgtgaa gccagctgtt 300 ggaggectac gagtgaagtg ggatgagaat gtgaccggtt ttgaaattat ccaaagcatc 360 ac tgacacoc tgtgtgtaag cagaacctoc actccctccg ctgceatgaa gctcatttct 420 cccagagatt ttgtggactt ggtgctagtc aagagatatg aggatgggac oatcagttcc 480 aa.cgccactc atgtggagca teogttatgt cccccgaagc caggttttgt gagaggattt 540 aaccatcctt gtggttgctt ctgtgaacct cttccagggrg aacccaccaa ga-ccaacct-g 600 gtcacattcfc tccatacega cctcagcggt tacctcccac agaacgtggt ggactccttc 660 t teeeccgca geatgaceeg fttt.tar.gcc sacettcaga aagcagtgaa gcaatfcceat 720 gagtaatgct atcgttactt et CggcaMq aactcccgtg aetcatcgag gagictccagc im tgttgggaca ccaaggagcc tgggagcacg cagag-gcctg Sgttcactçt ttggaaeaag 840 ctgatggact gegcatetct gagaatgc«* aecagaggcg gcagccca.cc cttcctgcct 900 cctgccecac tcagggtfcgg cgtgtgatga gccaetcatg tgtxccaaac tccatctgcc 960 tgttacceaa acacgcctct cetggoaggg tagacccaçg cctctaacca. tctgacagag 1G-2Õ actcggcctg gacaccatgc gatgcactct ggcaccaagg ctt Satgtgc ccatcactct 1080 cagagaccac gt ttccctga ctgtcataga gaatcatcat cgccactgaa aaccaggccc 1140 tgttgccttt taageatgta ecgctccctc sqtcctqtqc tgeagcccce cee,Atatstt 1200 ttcetgatat agaccttgta tatggcttta atgccgeaaa atafcttattt ttccttaaaa 1260 aaggtgtcaa Cttggaaata atggtttaaa aacaggataa gcar.taagga aanacaaaaa íiZíj aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ããci.B. 1344 Humano: Proteína StarDõ (SEQ ID NO.: 23)

Hel Aep Pro Ala Leu AI a M& CUn Met Ser Gly Ma Va .1 A-líi GJa Lys MAt L-TiU Glri Tyr Axg Arg ASP Thr Al a Gly Trp Lya Iift Cys Arg aiu Siy Aim Gly VaZ Ser Val Ser Trp A»j Pre ser Vei Glu Fhe Pro Gly Aan Leu Iyr Arg Gly GIu Gly He Val Tyr Gly Thr Leu Glii 61a Vai T-P Aap Cys Val Lys Pro Ala Val siy c-iy Leu ,Arg Val Lys Trp AS p Slu Asd Val Tbr Sly Piie Gl-J Ile Xle GIb Sex Ile Thr Asp Thr Leu Cya Val Sex Arg Tlir Ser Thr rro Ser AIa Ala Met Lys Leu Ile Ser Prs Sra Asp Pbè Val Ssp Lèü Vís i Leu Val Lys Arg Tyr GJ u »p GJy Thr Iie 3«.: Btsr Ria Tij ί- H i s Vo 1 Giii H ! S Fro Leu Cy r Pro P1J-O I.yes Pto C33V Phvi Vá .1 Ο- Jy Phc A.S n I, «■ Pr O Cys Gl y Cys Piw Cys GlU Fro í»ô'J Pro oiy Giü Pro Thr Ly- " .U iCi .1,8« Va J Thr Fhe ?he 10

HiB Thr Α$ρ Lea Sei: Gly Ty*: Leu Pro Gln λ&η Val Val Α.$ρ Ser Ph« l °he í2 xc< Arg Ser Het Thr Arg Phe Tyr A.la Asn Leu GIn Lys- Ala Vad Lys Gin Pha His OXu

humano: cDNA de StarD6 (SEQ ID NO.: 24)

*tgga«ttca aggcaattgc cc**Cíi*act geecaagaag ttttaggtta çaatcgagat 6?)

acatcaggct. ggaaagtggt t»í«rtt« aaaaagataa ctgtttccag taaggcttct 120

agaaaattec atggaaatct atatcgtgtt gaagggataa çtccagaatc aoeagctaaa 180

ctatctgatt. tcctctacca aactggagac agaattacat gggataaatc atfcgcaagtg 240

tataatatgg tacaeaggat tgatteggac acattcatat gtcatacoat taoaeaaagt 300

tttgccgtgg gctccatttc cectcgagac tttatcgact tagtgtaoat eaagogctac 360

gaaggaaata tgaacattat cagttctaaa agtgtggatt ttccagaata tcctccatct 420

tcaa«tt«t* tccgcggtt* taaccatcct tgtggetttg tatgtteaec aaCggaagaa 480

aacecageat attecaaaet agtgatgtte gteeatjecag aaatgagagg aaaattgtcc 540

ccatcaataa ttgeaaaaae eafcgeettcc aactfcagtaa «ctteetect caatgtfaaaa 600

gatggaataa aggcacacag aaetceatea agaegtggat ttcatcataa tagteatfcca 660

T,ga 663

humano: Proteína StarD6 (SEQ ID NO.: 25)

Me ε Asp Pbe Lj1S Ãlâ rle Ala Slfi -Slft Thi Ma Qln Qlu VAl Leu Gly Tyr Asa Arg hsp Thr Ser GJy Trp I.ys Va I Vftl Lys Thr Ser 'Lys i.ys He Thr Vã X Ser Set Lys Ala Se i Rtg Lye Phe Hia Qly ASfi Lee Tyr Arg Val GX^ Sly Ile He Pro Slu Ser Pro Ala Lya Leu Ser Asp- Phe Leu Hyr Gln Thr Sly Asp Arg Ue Thr Trp Asp Lys Ser Leu Gln VaI Tyr Aan Kôt Val Kia Arg I Ie hsp Ssr Asp Thi Phe Ils Cys- .His Thr Ile Thr Gln Ser Phe AIa Val ^ly Ser Ile Ser Pro Axq Asp Phe Ile Asp Lea Val Tyr Ile Lys Arg Tyr Glu Gly Asn Mat Asn Ile Ile Ser Ser lyt, Và I Asp Phe Pre Gl u Tyr Pro Pro Sar Ser AStt Tyr 3 Ϊ:*ί Artj GIy tyt Asri Kis Pio C^s Giy Ph* Va i Cy i. Sei Pro Met GH) GlU A-Srt Pro hi -S Ty .r SM' fcy» L-tjU Vai M«t Phe vai Sln Tht Gílí Het Acg G \ '■} hys· !<€>» Sm Pr© 3«r I 3 Θ 1:1« ÔIu Lys- Thr Met Fro ser Asn leu vai Asn Fhe ii« Leu Ask Ala Lys Asp Oly He Lys Ala Hí ÍS Mg Tbr Psro Ser Arg Arg Gly Phe fiis His Asn Ser HiS Sei Humano: cDNA de PCTP (SEQ ID NO.: 26) eeggactgcg gaaggatgga gctggcegcc ggaaget tct oggaggagea gtcetgggag 60 gcetgegceg agctccagea geecgctctg gceggggccg aRtggcagct cer-sgtggag 120 acctcgggca tcageatcta ceggetgctg gacaagaaga ctgqacttca tgagtataaa ISO gtctttggtg ttctggagga ctgcteacca actctactgg cegacatcta t.atggactca .240 gartacagaa aacaatggga ccaqtatgtc aaagaact-ct atgaacaaga atgcaacgga 300 gagaetgtgg tctactggga agtgaagtac ccttttccca tgtccaacag agactatgtc 360 taccttcggc agcggcgaga cctggacotg gaagggagga a.gatccatgt gatcct-ggcc. 420 Gggagcacct ccatgcctca ^cttggcgag aggtctyggg Egatccgçgt gaageaatac ■3 SO aagcagagcc tggcgattg* gagtgacggc ôí>f<*aí|sjg«ft gceeagtttt coxai. íj 1.1 ic S40 11-«,ataacc; cqggtggi:ea tottecqtee tggcicacta aeCqfgccge -Ί “j/íLqq,! 60D 3t.íeet.»*ct: tGttgaôa.f* c:at<Í^Cíü.ííi3í3 M ::. r:!, cri aClrtcüf-CAe tJàaa«ecCâ<j 660 ç&a&gagaac tgggaac&tt gcatccatgg gttgatgtct etggaagtgc aaccacccaa 720

tgtctctgga «gtgccacct ggaagtgeca eetggaagtg tctctggaag agcaeccacc 7Ô0

actgttcage cttccccxgc tgtttccgcc ttcagaggcc taeacactac cacatccttt 840

ctaagcatgt ttgcctgaca tccagctcac tojtctgctt cctttctcgc tccccccatc 900

ctgggctggg ctgccttctt ctacagttca atatggggca. gectaggsj&a acctttgctt 960

gottaotatt aggaggggaa ^tcttcagta gggaacacga teattccatt gtgcaatttt 1020

aGggggatgg gtgggoggag ggacacaaca aaatttaaga atgactattt gggcgggctg 1080

gctctcttgc ^gcttgtgat ttcttccagc tígggâggtjg -ctgciggasg tggcâtttcg 1140

ttcagagctg aeittçagtg eâcççaaaçt, ggatgaegtg çceatgrcc# tttgecttftt 1200

getttgtgga getgattagei ctgggatttg aggtgataat ccagtaagEc tttcetcgtt 1260

cctacttgtg gagqateagt agctgttatg at-gccagaec atttggaga# gtatçagagg 1.320

cct-gaecgga cacataat.ae gacaaccaca tttttcctca tcaiceatga ggaaatggat 1.3.80

-gatttctett tt.ccatat.gt cactggggga. aaggctgcst gtacctctea agctttgeat 1440

tttaotgga-a actgaçgcgt caagatggct gtggcagcía gcaaaagcaa agatgctttg 15-00

tgeatagect tgtgaa&Aag tatctttcta tgcaataa<3à egaattttcc tcccagaáía 1560

tttee«a*t<í t a-gíS(i>-q'íftt· aacaçjfctcae agccaggtea aatfefcaaetg gt^gctt&at 1620

gaetcfcge&e c* l L*. t t*>ca ggaattetqc ctaagttgtc t^ccttt tct «ccaccoaaá 1689

agacttttâíj ttttctatge tttetcetga atttt«gt«Ç ^gtaagtatt tetafcgtcaa Π40

aggcacagce ttgatgatct eagggaaaaa ttttaatcac tgtgtataat gatactgaac 1800

cttgattaat aacagaaatt cagsjatgtaa agccacagaa tgggatttat taatgtggga 1 SéO

tacctcagac tgtttgtttt ctttctçrgga agaaaagtgt gttetataat gaataaatat 1920 agagtggttc tt 1932

humano: Proteína PCTP (SEQ ID NO.: 27)

Met Giu ím Ala ala Gly 5«r Phe Ser ély GIw Oln Phe Trp Glu Ala Cys Aia Glu Leu Gln GIk Pra Ala Leu Ala Gly Ala íusp Ttp Gls Leu Leu Vai. Glu Thr Ser fíiy He S^x He Tyr Arg LetJ Leu Asp Iiys Lyg Thr Gly Leu Hia Glix Tyr Lys Val PI» Gly Val Iexi Gla Asp Cys Sei Pro Thr Leu Leu Ala Asp He Syi Met Asp Ser Asp Tyr Arg íys Gln Txp Asp Gln Tyr Val Lys Gls Leu Tyr Glu Gla Glu Cys Asn Gly Glu Thr Val Val -Jyr Trp Glu Val Lys Tjr Pxo Phe Feo Met Seir Asn Airg Aap Tyr Val Tyr Leu Arg Gln Arg Arg Asp Lau Asp Met Glu Gly Arg Lya Iie Hls V*1 Ile Lea Alft Arg Ser Thr Stst Met 9to Glfi trfsu Gly Glu Arg Ser Gly Val He Arg Val Lys Gln Tyr Lys Gln Ser Leu Ala IXe GIu Ser Asp Gly Lys Lys Gly Ser Lys Val Phe Met Tyr Tyr Pha Asp Asn Pro Gly Gly Glxs II® Pto Ser Trp Ley He Asn Trp Ala Ala Lys Aan Gly Val Pro Asb Phe Len Lys Asp Met Ala Arg- Ala Cyc Sln Asn Tyr Lea Lys Lys Thr

Cultura e transfeccão celular

Células HEK293T e COS7 cultivadas em RPMI suplementado 10 com soro bovino fetal 10% (FCS) em uma atmosfera umidificada contendo CO2 a 5%. Células HEK293T são transfectadas usando reagente TranslT293 (Mirus) de acordo com as instruções do fabricante. Para imunofluorescência, células COS7 são cultivadas em tampas de vidro por 24 horas e transfectadas com reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Células CHO bem como linhagens de célula derivadas de CHO

produzindo albumina de soro humano (HSA) ou um anticorpo IgG monoclonal humano são cultivadas em suspensão em meio livre de soro em frascos T aerados na superfície (Nunc, Dinamarca) e incubadoras (Thermo, Alemanha) ou frascos de agitação (Nunc, Dinamarca) em uma temperatura de 37° C e em uma atmosfera contendo CO2 a 5%.

5 Culturas de estoque de semente são subcultivadas a cada 2 a 3

dias com densidade de semeadura de 2-3E5 células/mL. A concentração celular é determinada em todas as culturas usando um hemocitômetro. A viabilidade é avaliada através do método de exclusão de azul tripano. Todas as células de produção CHO são culturadas em meios da proprietária BI e sua composição não pode ser revelada.

Células derivadas de CHO são transfectadas usando Reagentes Lipofectamine® e PLUS® (ambos Invitrogen, Alemanha) de acordo com as orientações providas pelo fabricante.

Cultivo Do tipo batelada alimentada As células são semeadas a 3E05 células/ml em frascos de agi

tação de 125 ml em 30 ml de meio de produção da proprietária BI sem antibióticos ou MTX (Sigma-Aldrich, Alemanha). As culturas são agitadas a 120 rpm em 37° C e CO2 a 5% que é mais tarde reduzido para 2% como aumento de números de célula. Parâmetros de cultura incluindo pH, concentrações 20 de glicose e Iactato são determinados diariamente e o pH é ajustado para pH 7,0 usando NaCO3 conforme necessário. Solução de alimentação da proprietária BI é adicionada a cada 24 horas. Densidades e viabilidade celular são determinadas através de exclusão de azul tripano usando um sistema de quantificação de célula CEDEX automático (Innovatis). Amostras do fluido 25 de cultura celular são coletadas nos dias 3, 5 e 7 e submetidas à medição de título através de ELISA.

ELISA

Quantificação de moléculas de IgG no sobrenadante dos clones de célula é realizada através de tecnologia ELISA sanduíche. Placas ELISA são revestidas usando anticorpo Fragmento Fe de IgG anti-humano de cabra (Dianova, Alemanha) a 4o C da noite para o dia. Após lavagem e bloqueio das placas com solução de BSA 1%, as amostras são adicionadas e incubadas por 1,5 hora. Após lavagem, o anticorpo de detecção (fosfatase alcalina conjugada com anticorpo de cadeia leve kappa anti-humano de cabra conjugado) é adicionado e detecção colorimétrica é realizada através de incubação com hexaidrato de sal de dissódio de 4-nitrofenil fosfato (Sigma, Alema5 nha) como substrato. Após incubação por 20 minutos no escuro, a reação é parada e a absorbância é imediatamente medida usando um leitor de absorbância (Tecan, Alemanha) com 405/492 nm. A concentração é calculada de acordo com a curva-padrão que está presente em cada placa.

Determinação quantitativa de HSA secretada em amostras de cultura é realizada similarmente, usando os anticorpos contidos no Human Albumin ELISA Quantitation Kit (Bethyl Labs, Texas, USA) e as instruções dos fabricantes que seguem.

Microscopia de imunofluorescência

As células são lavadas com PBS contendo magnésio e cálcio, fixadas em paraformaldeído 4% em temperatura ambiente por 10 minutos, lavadas e incubadas com PBS contendo glicina 0,1 M por 15 minutos. As células são então permeabilizadas com PBS contendo Triton 0,1% por 5 minutos e então bloqueadas com soro de cabra 5% em PBS contendo Tween-20 0,1% por 30 minutos. As células são incubadas com anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio por 2 horas, seguido por incubação com anticorpos secundários diluídos em tampão de bloqueio por 1 hora. Tampas são montadas em Fluoromount G (Southern Biotechnology) e células são analisadas em um microscópio de varredura a laser confocal (TCS SL, Leica) usando excitação a 488 e 543 nm e uma lenta objetiva 40,0/1,25 HCX PL APO. As imagens são processadas com Adobe Photoshop.

Extração de proteína, imunoprecipitacão e Western blotting

Extratos de célula integral são obtidos através de solubilização de células em tampão de extração NP40 (NEB) [Tris 50 nM (pH 7,5), NaCI 150 mM, NP40 1%, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 10 mM e 30 β-glicerofosfato 20 mM mais inibidores de protease completos]. Os Iisatos são clarificados através de centrifugação a 16.000 x g por 10 minutos. Para imunoprecipitações, quantidades iguais de proteína são incubadas com anticorpos específicos por 2 horas em gelo. Imunocomplexos são coletados com proteína G-Sepharose (GE Healthcare) e lavados três vezes com NEB (vide acima). Extratos de célula integral ou proteínas imunoprecipitadas são fervidos em tampão de amostra e submetidos a SDS-PAGE. As proteínas são 5 manchados em membranas de difluoreto de polivinilidina (Roth). Após bloqueio com reagente de bloqueio 0,5% (Roche) em PBS contendo Tween 20 em 0,1%, filtros são experimentados com anticorpos específicos. Proteínas são visualizadas com anticorpo secundário acoplado à peroxidase usando o sistema de detecção de quimioluminescência elevada (Pierce). Extirpação 10 de membranas é realizado em tampão SDS [Tris 62,5 mM (pH 6,8), SDS em 2% e β-mercaptoetanol 100 mM] por 30 minutos a 60° C. As membranas são então experimentadas com os anticorpos indicados.

Purificação de proteína recombinante e ensaios de quinase in vitro

Bactérias BL21 são transformadas com vetores pGEX6P-FlagCERT(1-138) e CERT-S132A(1-138). Expressão é induzida com isopropil-βD-1-tiogalactopiranosídeo 0,5 mM por 4 horas a 30° C. As bactérias são coletadas e ressuspensas em PBS contendo 50 pg/ml de lisozima, Inibidores de protease completos (Roche), fluoreto de sódio 10 mM e glicerofosfato 20 mM. Triton X-100 é adicionado para uma concentração final de 1% antes da sonificação. Fusões GST-CERT são purificadas de Iisato clarificado com resina glutationa (GE Healthcare). A pureza das preparações de proteína é verificada através de SDS-PAGE e tingimento Coomassie. Proteínas recombinantes são incubadas com PKD1 purificada em tampão quinase [Tris 50 mM, pH 7,5, MgCI2 10 mM e DTT 1 mM] na presença ou de 2 pCi [γ-32Ρ]ATP ou 75 μΜ de ATP frio por 30 minutos. Amostras são resolvidas através de SDS-PAGE, manchadas em membrana e analisadas em um Phospholmager (dinâmica molecular) ou através de Western blotting com anticorpo de substrato anti-PKD.

Disposições PIP

Células HEK293T expressando transientemente variantes de

CERT marcadas com GFP são coletadas em tampão hipotônico [Tris 50 mM, pH 7,4, contendo Inibidores de protease completos (Roche), PMSF 1 mM, β-glicerofosfato 5 mM e fluoreto de sódio 5 mM] e cisalhadas por passagem através de uma agulha de 25G/6 gauge. A fração de citosol é obtida após centrifugação 100.OOOxg por 1 hora e a quantidade de proteína expressa é quantificada através da medição de emissão de pico de GFP a 480-550 5 nm (excitação 466 nm). Disposições PIP (EcheIon) são bloqueadas em TBST [Tris 10 mM, pH 8, NaCI 150 mM, Tween-20 em 0,1%] contendo BSA livre de ácido graxo 3% (Roth), seguido por incubação com 500 pg de citosol contendo quantidades iguais de proteínas GFP (ajustado com citosol de células não-transfectadas) em 5 ml de tampão de bloqueio por 1 hora em temperatu10 ra ambiente. Proteínas ligadas são detectadas através de incubação com anticorpo anti-GFP, seguido por anticorpo secundário conjugado com HRP. Ensaio de transferência de ceramida in vitro

Transferência mediada por proteína de ceramida entre SUVs é medida conforme previamente descrito (Olayioye e outros, 2005). A mistura do ensaio de transferência continha vesículas doadoras (2 nmoles de lipídeo/ml) compostas de lipídeos de cérebro de porco (Avanti Polar Lipids), cerâmica C16 marcada com pireno e 2,4,6-trinitrofenil-fosfatidiletanolamina (TNP-PE) (88,6:0,4:11% em mol) provida por P. Somerharju e um excesso de 10 vezes de vesículas aceitadoras compostas de lipídeos de cérebro de porco. A intensidade de fluorescência é registrada a 395 nm (excitação 345 nm; larguras da fenda, 4 nm) antes e após adição de 75 pg de citosol de células HEK293T expressando transientemente a CERT marcada com GFP do tipo selvagem e proteínas S132A (vide acima). Intensidades de fluorescência são normalizadas para (i) a intensidade máxima obtida após a adição de Triton X-100 (concentração final em 0,5%) e (ii) fluorescência de GFP máxima, para explicar níveis de expressão de proteína diferentes.

Ensaio de transporte de HRP

Células HEK293T são cotransfectadas com plasmídeo ss-HRPFlag e vetor vazio, pEGFP-N1-PKD1KD, pcDNA3-FlagCERT wt e pcDNA3- FIag-CERT-SI 32A em uma razão de 1:6,5, respectivamente. 24 horas póstransfecção as células são lavadas com meio livre de soro e secreção de HRP é quantificada após 0, 1, 3 e 6 horas através de incubação de sobrenadante de célula clarificado com reagente ECL. Medições são feitas com um luminômetro (Lucy2, Anthos) a 450 nm.

Ensaio de siRNA

Células COS7 são transfectadas com um vetor codificando ssHRP-Flag, coletadas após 8 horas, novamente postas em placa em cavidades em triplicada e então transfectadas com oligonucleotídeos de siRNA específicos de CERT (siCERT # 1, SEQ ID NO.: 7, 5’-ccacaugacuuacucauuatt3'; siCERT # 2, SEQ ID NO.: 8: 5'-gaacagaggaagcauauaatt-3') usando reagente Oligofectamine® (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Células controle ou são falso transfectadas ou transfectadas com um siRNA específico de IacZ (SEQ ID NO.: 9: 5'-gcggcugccggaauuuacctt-3'). 48 horas depois, as células são lavadas e meio fresco é adicionado. A quantidade de HRP secretada no sobrenadante é medida através de um ensaio quimioluminescente conforme acima descrito. Finalmente, as células são lisadas, Iisatos em triplicada são agrupados e analisados através de immunoblotting usando anticorpos específicos de tubulina e receptor de transferrina.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: ACÚMULO DE PRODUTO INTRACELULAR INDICA GARGALO DE GARRAFA SECRETOR.

Um processo em batelada alimentada é realizado usando três clones de célula produtora CHO diferentes expressando anticorpo IgG humano (Processos A, B e M, respectivamente, vide Figura 1). Amostras de célula são obtidas dia sim, dia não e a quantidade de anticorpo intracelular é 25 determinada através de análise FACS. Em suma, as células são fixadas usando PBS/PFA em 4%, permeabilizadas e tingidas com anticorpo de cadeia leve kappa anti-humano conjugado com FITC. Dentro dos primeiros quatro dias, o teor de IgG intracelular permanece em um nível constante. No entanto, do dia 5 ao dia 9, o nível de produto intracelular aumenta constantemen30 te, indicando um acúmulo ou de cadeia leve enovelada com erro ou até mesmo o produto de anticorpo completo dentro da célula. Esses dados representam os resultados de três processos de produção independentes com clones e produtos de célula produtora diferentes e eles sugerem fortemente que a célula transcreve mais RNA de anticorpo do que proteínas secretadas no meio e então aponta para um gargalo de garrafa pós-tradução que impede a secreção completa do anticorpo produzido (Figura 1).

EXEMPLO 2: CERT É DETECTADA ATRAVÉS DE ANTICORPO DE SUBSTRATO DE PKD.

PKD é um regulador-chave no complexo de Golgi com ΡΙ4ΚΙΙΙβ sendo o único substrato local identificado até agora. Para testar se a proteína CERT localizada no complexo de Golgi (SEQ ID NOs.: 11 e 13) pode servir como um substrato para PKD, a requerente faz uso de um anticorpo de substrato fosfoespecífico, chamado pMOTIF, criado contra motivos de consenso fosforilados por PKD (Doppler e outros, 2005). Células HEK293T são transfectadas com vetores de expressão codificando CERT marcada com Flag (SEQ ID NO.: 10) e CERTl (SEQ ID NO.: 12). As isoformas de CERT são imunoprecipitadas com anticorpos específicos de Flag e analisadas através de Western blotting com o anticorpo pMOTIF (Figura 4A). Um sinal pMOTIF correspondendo ao peso molecular de CERT (SEQ ID NO.: 11) e, mais fracamente, àquele de CERTl (SEQ ID NO.: 13) é detectado. A detecção mais fraca da isoforma de CERTl fosforilada pode ser relacionada com seu comportamento conhecido de formar agregados, o que pode impactar acessibilidade de sítio fosfo para quinase (Raya e outros, 2000).

Para investigar se reconhecimento de CERT pelo anticorpo pMOTIF é dependente de PKD, a requerente expressou CERT junto com uma variante morta de quinase de PKD1 (K621W) em células HEK293T. 25 Este mutante foi mostrado estar localizado no complexo de Golgi e suprimiu fosforilação de ΡΙ4ΚΙΙΙβ de uma maneira dominante negativa (Hausser e outros, 2005). Coexpressão de PKD inativa abole detecção de CERT com o anticorpo pMOTIF, sugerindo que o sinal de pMOTIF é na verdade devido à fosforilação de CERT mediada por PKD (Figura 4B).

Proteínas de transferência de lipídeo são imaginadas agir em

sítios de contato de membrana, que são formados entre o ER e TGN (Levine e Loewen, 2006), onde PKD está localizada. Tingimento com imunofluorescência de CERT marcada com Flag em células COS7 coexpressas com PKD1 marcada com GFP verifica que as duas proteínas se colocalizam no complexo de Golgi (Figura 4C). Juntos, esses dados confirmam que CERT é um substrato de PKD no aparelho de Golgi.

EXEMPLO 3: PKD FOSFORILA CERT EM SERINA 132.

Para identificar sítios de reconhecimento por pMOTIF em CERT, a requerente pesquisou motivos de consenso de PKD potenciais caracterizados por um resíduo leucina, isoleucina ou valina na posição 5 e arginina na posição 3 com relação à serina ou treonina. Duas serinas nas posições 10 132 e 272, combinando com o motivo de consenso de PKD e conservadas entre as espécies (Figura 5A), são trocadas por alanina através de mutagênese direcionada ao sítio. Esses mutantes são expressos em células HEK293T e testados quanto a reconhecimento pelo anticorpo pMOTIF. Interessantemente, mutação de serina 132 para alanina abole detecção de 15 CERT com o anticorpo pMOTIF e causa um aumento em mobilidade eletroforética, indicativo de perda de fosforilação, enquanto a mutação S272A não afeta o sinal de pMOTIF (Figura 5B). Isto sugere que serina 132 é um sítio de fosforilação de PKD especificamente reconhecido pelo anticorpo de substrato de PKD. Para confirmar que PKD é capaz de fosforilar diretamente este 20 resíduo serina em CERT, a requerente realizou ensaios de quinase in vitro com PKD1 purificada e proteínas de fusão com GST CERT recombinantes produzidas em E. coli compreendendo os primeiros 138 aminoácidos da proteína. Quando a proteína de fusão CERT do tipo selvagem truncada é incubada com PKD1 na presença de [γ-32Ρ]-ΑΤΡ, incorporação de radioatividade 25 é detectada (Figura 5C). Isto é significantemente prejudicado no caso da proteína de fusão CERT-S132A. Fosforilação por PKD in vitro de CERT do tipo selvagem, mas não CERT-S132A (SEQ ID NO.: 15), é mostrada ainda gerar um sítio de reconhecimento para o anticorpo pMOTIF (Figura 5D). Tomados juntos, esses resultados provam que CERT é um substrato de PKD 30 genuíno in vitro e in vivo e identificam serina 132 como um sítio de fosforilação de PKD específico em CERT.

EXEMPLO 4: FOSFORILAÇÃO DE CERT EM SERINA 132 MODULA LlGACÃO DE PI(4)P E ATIVIDADE DE TRANSFERÊNCIA DE CERAMIDA.

Serina 132 está em proximidade muito íntima com o domínio PH de CERT (aminoácidos 23-117), tornando possível que fosforilação neste sítio afete ligação de PI(4)P através do aumento da carga negativa local. A requerente então quantificou PI(4)P de CERT do tipo selvagem e do mutante de CERT-S132A (SEQ ID NO.: 15) através da realização de ensaios de sobreposição de proteína-lipídeo. Então, citosol de células HEK293T expressando transientemente as variantes de CERT é incubado com membranas salpicadas com um gradiente de concentração dos fosfoinositídeos diferentes e proteínas CERT ligadas são detectadas com seu marcador GFP. Conforme previamente relatado, a proteína do tipo selvagem de comprimento completo demonstra ligação fraca com várias espécies de fosfolipídeo, mas mostra interação forte com PI(4)P (Hanada e outros, 2003; Levine e Munro, 2002). CERT-S132A se ligando a PI(4)P é detectável em concentrações de duas a quatro vezes menores comparado com aquela da proteína do tipo selvagem, sugerindo afinidade maior do mutante CERT-S132A com este fosfolipídeo (Figura 6A). Juntos, esses dados implicam que CERT, uma vez ligada ao complexo de Golgi, é fosforilada por PKD. Isto então aumenta a afinidade de CERT para PI(4)P e então regula a interação de CERT com membranas de Golgi.

Como CERT foi mostrada funcionar como uma proteína de transferência de lipídeo (Hanada e outros, 2003). A requerente investigou se fosforilação de SERT em serina 132 influenciou sua habilidade em se ligar e transferir ceramida entre as membranas. Para esta finalidade, versões mar25 cadas com GFP de CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10) e CERTS132A (SEQ ID NO.: 14) são transientemente expressas em células HEK239T e a fração do citosol é analisada quanto à atividade de transferência de lipídeo específica de ceramida usando um ensaio à base de FRET (Figura 6B). Neste ensaio, vesículas unilamelares pequenas contendo cera30 mida marcada com pireno como um doador fluorescente e quantidades de extinção de TNP-PE marcado com grupo principal são empregadas (Olayioye e outros, 2005; Somerharju, 2002). Quando esses Iipossomas doadores são misturados com um excesso de Iipossomas aceitadores não-marcados, o aumento em fluorescência de pireno é desprezível, indicando transferência de ceramida espontânea mínima para membranas aceitadoras (dados nãomostrados). Quando da adição de citosol contendo CERT do tipo selvagem, 5 um aumento uniforme em fluorescência é notado, o qual não é observado quando citosol controle de células transfectadas com vetor é usado (Figura 6B). Comparado com a proteína do tipo selvagem, CERT-S132A (SEQ ID NO.: 15) mostra uma taxa maior de transferência de lipídeo, evidente a partir de um aumento mais rápido em fluorescência de pireno. Isto sugere que fos10 forilação de CERT em serina 132 subregula atividade de transferência de ceramida através da diminuição da associação da proteína com membranas.

Dados anteriores já mostraram que PKD regula o nível de PI(4)P no complexo de Golgi através da ativação mediada por fosforilação de ΡΙ4ΚΙΙΙβ (Hausser e outros, 2005). Interessantemente, ΡΙ4ΚΙΙΙβ é crítico para 15 o transporte de ceramida entre o ER e o complexo de Golgi (Toth e outros, 2006). Deste modo, junto com os dados apresentados aqui, um papel duplo para PKD na manutenção de homeostase de lipídeo de membranas de Golgi se torna aparente através do controle da taxa de ativação (através dos níveis de PI(4)P) e desativação (através de fosforilação direta) de CERT.

EXEMPLO 5: CERT REGULA ATIVAÇÃO DE PKD E TRANSPORTE SECRETOR.

A requerente tomou como hipótese que a superexpressão de CERT através de transferência de ceramida deve resultar em níveis de DAG elevados e estimularia consequentemente atividade de PKD. Para testar is25 so, CERT do tipo selvagem marcada com Flag (SEQ ID NO.: 10) e CERTS132A (SEQ ID NO.: 14) são transientemente expressas em células HEK293T. Lisatos de célula integral são preparados 24 horas póstransfecção e submetidos a SDS-PAGE. Ativação de PKD é analisada através de immunoblotting com anticorpo de PKD pS916 fosfoespecífico (Figura 30 7A, painel superior). Carregamento igual é verificado através de novo exame com anticorpo específico de PKD (FGURA 7A painel do meio). Expressão de proteínas CERT é verificada através de immunoblotting com anticorpo específico de Flag (Figura 7 A painel inferior). Comparado com o controle, expressão de ambas CERT do tipo selvagem e CERT-S132A aumentou a atividade de PKD, conforme revelado através de análises com um anticorpo de PKD fosfoespecífico. Isto mostra que ativação de PKD é regulada por proteínas 5 CERT, provavelmente devido à aplicação de ceramida maior e síntese de S M/D AG reforçada.

Para se dirigir à questão de se ativação de PKD mediada por CERT na verdade se traduz em transporte secretor maior, a requerente fez uso de um plasmídeo codificando peroxidase de rábano silvestre secretada 10 (HRP-ss) que pode ser usado como repórter para secreção de proteína constitutiva. Células HEK293T são cotransfectadas com um plasmídeo de expressão codificando Flag-ss-HRP ou vetor vazio, e quinase morta de (KD)PKDI-GFP, FIag-CERT do tipo selvagem (WT) e FIag-CERT-SI32A, respectivamente. 24 horas pós-transfecção, as células são lavadas e meio 15 fresco é adicionado. O sobrenadante é analisado quanto à atividade de peroxidase após 0, 1, 3 e 6 horas através de quimioluminescência. Em células controle, secreção de ss-HRP poderia ser detectada dentro de 1 hora e aumentou com o tempo (Figura 7B). Coexpressão de quinase morta PKD1, que inibe transporte secretor de proteína cargo, quase totalmente aboliu a secre20 ção de ss-HRP para o sobrenadante. Isto confirma que HRP é secretada de uma maneira dependente de PKD neste ensaio. Em contraste, coexpressão de CERT do tipo selvagem e CERT-S132A aumentou fortemente a quantidade de HRP secretada (Figura 7B), o mutante mostrando até mesmo valores ligeiramente maiores do que CERT do tipo selvagem. Este experimento 25 demonstra que superexpressão de CERT estimula fosforilação de PKD e em um ensaio funcional aumenta a secreção de uma proteína extracelular no meio de cultura em torno de 2 vezes.

A requerente ainda investigou se a superexpressão de mutante CERT-S132A afetou sua localização e/ou causou mudanças morfológicas no aparelho de Golgi. CERT foi demonstrada ser colocalizar com marcador de Golgi cis/médio GS28 (Hanada e outros, 2003). Análise de imunofluorescência de CERT marcada com GFP expressa em células COS7 mostra que a proteína se localizou para regiões de Golgi positivas para GS28 (Figura 7C). Em contraste, em adição à colocalização parcial com GS28 no complexo de Golgi, a proteína mutante CERT-S132A mostra um tingimento pontuado, disperso. De nota, algumas dessas estruturas vesiculares são verificadas 5 conter proteína cargo ss-HRP, provendo evidência que essas estruturas na verdade representam carreadores de transporte derivados de Golgi (Figura 7D). Esta constatação está de acordo com as mudanças observadas em estrutura de membrana de Golgi devido a aumentos locais em níveis de ceramida (Fukunaga e outros, 2000; Weigert e outros, 1999).

EXEMPLO 6: SUBREGULAGEM DE CERT ATRAVÉS DE INTERFERÊNCIA DE RNA INIBE TRANSPORTE SECRETOR

Os dados apresentados até agora na presente invenção demonstraram claramente que superexpressão de CERT aumenta a secreção de proteína. Para investigar se também o oposto é verdadeiro, significando 15 que expressão de CERT reduzida resultaria em secreção menor, experimentos de siRNA são realizados. Células COS7 são transfectadas com um vetor codificando ssHRP-Flag, coletadas após 8 horas, postas em placa novamente em cavidades em triplicata e então transfectadas com oligonucleotídeos de siRNA específicos de CERT (SEQ ID NOs.: 7 e 8) ou siRNA simulado ou 20 específico de IacZ (SEQ ID NO.: 9) como controles. 48 horas depois, as células são lavadas, cobertas com meio fresco e a quantidade de HRP secretada no sobrenadante é medida após os momentos indicados.

Conforme mostrado na Figura 8A, atividade de HRP é detectada após 3 horas e mostrou níveis comparáveis iguais em ambas as células con25 trole. Em contraste, uma redução drástica de atividade de HRP é medida em células que tinham sido tratadas com qualquer um dos oligonucleotídeos de siRNA específicos de CERT. Isto indica que níveis de CERT reduzidos levam à secreção de HRP reduzida a partir das células e ressalta mais o papel importante de CERT no transporte secretor.

Interessantemente, não apenas secreção de proteína, mas tam

bém a abundância do receptor de transferrina de proteína de transmembrana é afetada pela redução de CERT (Figura 8B). Quando as células da Figura 8Α são agrupadas e os lísatos experimentados com anticorpos específicos de receptor de transferrina em experimentos de Western blot, uma forte diminuição na quantidade de receptor de transferrina fica aparente, enquanto níveis de receptor de transferrina similares são detectados em ambas as 5 células controle.

Esta constatação sugere que a proteína de transferência de lipídeo CERT está não apenas implicada no transporte de proteínas secretadas, mas também de superfície celular de localização em membrana. Isto não seria surpreendente uma vez que ambos os tipos de proteínas são i10 gualmente transportados em vesículas de lipídeo do ER através do Golgi para a membrana de plasma e então usam as mesmas vias de exportação celular que - como a requerente demonstrou na presente invenção pela primeira vez - são influenciadas por CERT.

EXEMPLO 7: SUPEREXPRESSÃO DE CERT AUMENTA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA BIOFARMACÊUTICA DE UM ANTICORPO.

(a) Um anticorpo produzindo linhagem de célula CHO (CHO DG44) secretando anticorpo IgG anti-CD44v6 BIWA4 é transfectado com um vetor vazio (controle SIMULADO) ou construtos de expressão codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NOs.: 10 e 12) ou um mutante de CERT 20 carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ ID NO.: 14) e subsequentemente submetido à seleção para obter agrupamentos de célula estáveis. Durante seis passagens subsequentes, sobrenadante é retirado de culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis, o título de IgG é determinado através de ELISA e dividido pelo número médio de 25 células para calcular a produtividade específica (Figura 10A). Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula hospedeira carregando o mutante de CERT (SEQ ID NO.: 14), seguido pela CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 ou 12). Em ambos, expressão de IgG é acentuadamente maior comparado com células simuladas ou não-transfectadas. Resultados 30 muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada (Figura 10B). Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas as CERT do tipo selvagem e mutante leva à secreção de anticorpo maior, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator.

b) Células hospedeira CHO (CHO DG44) são primeiro transfec

tadas com vetores codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 ou 12) ou um mutante de CERT carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ ID NO.: 14). As células são submetidas à pressão de seleção e são pegas linhagens de célula que demonstram expressão heteróloga de CERT ou o mutante de CERT. Subsequentemente essas linhagens de célula e em paralelo células do tipo selvagem CHO DG 44 são transfectadas com vetores codificando anticorpo IgG anti-CD44v6 humanizado BIWA 4 como o gene de interesse. Após uma segunda rodada de seleção, sobrenadante é obtido de culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis durante um período de seis passagens subsequentes, o título de IgG é determinado através de ELISA e dividido pelo número médio de células para calcular a produtividade específica. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando o mutante de CERT (SEQ ID NO.: 14), seguido pela CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 ou 12). Em ambos, expressão de IgG é acentuadamente maior com células que não têm expressão heteróloga de CERT ou mutante de CERT. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada de tipo batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas CERT do tipo selvagem e mutante leva à secreção de anticorpo maior, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica de células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator. Isto indica que expressão heteróloga de CERT, e especialmente CERT mutante, pode aumentar a secreção de anticorpo em linhagens de célula CHO estavelmente transfectadas.

EXEMPLO 8: SUPEREXPRESSÃO DE CERT AUMENTA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA BIOFARMACÊUTICA DE PROTEÍNA 1 QUIMIOATRAENTE DE MQNÓCITO (MCP-11

(a) Uma linhagem de célula CHO (CHO DG44) secretando proteína 1 quimioatraente de monócito (MCP-1) é transfectada com um vetor vazio (controle SIMULADO) ou construtos de expressão codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NOs.: 10 e 12) ou um mutante de CERT carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ ID NO.: 14) e subsequentemente submetida à seleção para obter agrupamentos de célula estáveis. Durante seis passagens subsequentes, sobrenadante é obtido de culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis, o título de MCP-1 é determinado através de ELISA e dividido pelo número médio de células para calcular a produtividade específica. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando o mutante de CERT, seguido por CERT do tipo selvagem. Em ambos, expressão de IgG é acentuadamente maior comparado com células SIMULADAS ou não-transfectadas. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas as CERT do tipo selvagem e mutante leva à secreção de MCP-1 maior, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator.

b) Células hospedeira CHO (CHO DG44) são primeiro transfectadas com vetores codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 ou 12) ou uma CERT mutante carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ 25 ID NO.: 14). As células são submetidas à pressão de seleção e são pegas as linhagens de célula que demonstram expressão heteróloga de CERT ou o mutante de CERT. Subsequentemente essas linhagens de célula e em paralelo células do tipo selvagem CHO DG 44 são transfectadas com um vetor codificando proteína 1 quimioatraente de monócito (MCP-1) como o gene de 30 interesse. Após uma segunda rodada de seleção, sobrenadante é obtido das culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis durante um período de seis passagens subsequentes, o título de MCP-1 é determinado através de ELISA e dividido pelo número médio de células para calcular a produtividade específica. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando o mutante de CERT, seguido por CERT do tipo selvagem. Em ambos, expressão de MCP-1 é acentuadamen5 te maior comparado com células que não têm expressão heteróloga para CERT ou mutante de CERT. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas as CERT do tipo selvagem e mutante leva à secreção de 10 anticorpo maior, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou em batelada alimentada de biorreator.

Isto indica que expressão heteróloga de CERT, e especialmente CERT mutante, pode aumentar a secreção de proteínas de célula única em linhagens de célula CHO transientemente bem como estavelmente transfectadas.

EXEMPLO 9: SUPEREXPRESSÃO DE CERT AUMENTA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA BIOFARMACÊUTICA DE RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO EPITELIAL DE PROTEÍNA DE TRANSMEMBRANA (EGFR)

(a) Uma linhagem de célula CHO (CHO DG44) expressando receptor de fator de crescimento epitelial de proteína de transmembrana (EGFR) é transfectada com um vetor vazio (controle SIMULADO) ou construtos de expressão codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 e 12) ou 25 um mutante de CERT carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ ID NO.: 14) e subsequentemente submetida à seleção para obter agrupamentos de célula estáveis. Durante seis passagens subsequentes, as células são obtidas de culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis e o nível de expressão de EGFR é determinado através de 30 FACS ou Western blotting. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando o mutante de CERT, seguido por CERT do tipo selvagem. Em ambos, expressão de EGFR é acentuadamente aumentada comparado com células SIMULADAS ou não-transfectadas. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou em batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas CERT do tipo selvagem e mu5 tante leva à expressão de EGFR maior, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator.

b) Células hospedeira CHO (CHO DG44) são primeiro transfectadas com vetores codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 ou 12) ou um mutante de CERT carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ ID NO.: 14). As células são submetidas à pressão de seleção e são pegas linhagens de célula que demonstram expressão heteróloga de CERT ou o mutante de CERT. Subsequentemente essas linhagens de célula e em paralelo células CHO DG 44 do tipo selvagem são transfectadas com um vetor codificando EGFR como o gene de interesse. Após uma segunda rodada de seleção, as células são obtidas de culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis por seis passagens consecutivas e o nível de expressão de EGFR é determinado através de FACS ou Western blotting. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando o mutante de CERT, seguido por CERT do tipo selvagem. Em ambos, a expressão de EGFR é acentuadamente aumentada comparado com células que não têm expressão heteróloga de CERT ou mutante de CERT. Resultados muito similares podem ser obtidos se transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada e do tipo batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas as CERT do tipo selvagem e mutante leva à expressão de EGFR aumentada, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator. Isto indica que a expressão heteróloga de CERT, e especialmente CERT mutante, pode aumentar a expressão de receptores de superfície em linhagens de célula CHO transientemente bem como estavelmente transfectadas.

EXEMPLO 10: SUPEREXPRESSÃO DE STARD4 AUMENTA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA BIOFARMACÊUTICA DE UM ANTICORPO.

(a) Um anticorpo produzindo linhagem de célula CHO (CHO DG44) secretando anticorpo IgG anti-CD44v6 humanizado BIWA4 é transfectado com um vetor vazio (controle SIMULADO) ou construtos de expressão codificando StarD4 (SEQ ID NO.: 20) e subsequentemente submetido à seleção para obter agrupamentos de célula estáveis. Durante seis passagens subsequentes, sobrenadante é obtido de culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis, o título de IgG é determinado através de ELISA e dividido pelo número médio de células para calcular a produtividade específica. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando StarD4. Expressão de IgG é acentuadamente aumentada comparado com células SIMULADAS ou não-transfectadas. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão de StarD4 é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator.

b) Células hospedeira CHO (CHO DG44) são primeiro transfectadas com vetores codificando StarD4. As células são submetidas à pressão de seleção e são pegas linhagens de célula que demonstram expressão heteróloga de StarD4. Subsequentemente essas linhagens de célula e em pa25 ralelo células CHO DG 44 do tipo selvagem são transfectadas com vetores codificando anticorpo de IgG anti-CD44v6 humanizado BIWA 4 como o gene de interesse. Após uma segunda rodada de seleção, sobrenadante é obtido de culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis durante um período de seis passagens subsequentes, o título de IgG 30 é determinado através de ELISA e dividido pelo número médio de células para calcular a produtividade específica. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando StarD4. Expressão de IgG é acentuadamente aumentada comparado com células que não têm expressão heteróloga de StarD4. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão 5 de StarD4 é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator. Isto indica que expressão heteróloga de StarD4 pode aumentar a secreção de anticorpo em linhagens de célula CHO transientemente bem como estavelmente transfectadas.

EXEMPLO 11: SUPEREXPRESSÃO DE CERT AUMENTA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA BIOFARMACÊUTICA DE ALBUMINA DE SORO HUMANO (HSA)

(a) Uma linhagem de célula CHO (CHO DG44) secretando a proteína de cadeia única HSA é transfectada com um vetor vazio (controle Si15 mulado) ou construtos de expressão codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 e 12) ou um mutante de CERT carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ ID NO.: 14) e subsequentemente submetida à seleção para obter agrupamentos de célula estáveis. Durante 4 passagens subsequentes, sobrenadante é obtido de culturas de estoque de semente de todos 20 os agrupamentos de célula estáveis, o título de HSA é determinado através de ELISA e dividido pelo número médio de células para calcular a produtividade específica (Figura 11 A).

Ambos os títulos de HSA e a produtividade específica das células produtoras de HSA são significantemente aumentados através da ex25 pressão heteróloga de ambas as variantes de CERT comparado com o controle transfectado Simulado. Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos celulares carregando o mutante de CERT, que leva a um aumento na produtividade específica de 51% e um aumento no título de HSA de 46% acima do controle, seguido por CERT do tipo selvagem, que aumenta a pro30 dutividade específica em 49%. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada (Figura 11B). Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas a CERT do tipo selvagem e mutante leva à secreção de HSA maior, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou sob condições de produção industrial tal como em culturas em batela5 da ou do tipo batelada alimentada de biorreator.

(b) e (c) Células hospedeira CHO (CHO DG44) são primeiro transfectadas com vetores codificando CERT do tipo selvagem (SEQ ID NO.: 10 ou 12) ou um mutante de CERT carregando a mutação por ponto Ser132A (SEQ ID NO.: 14). As células são submetidas à pressão de seleção 10 e são pegas linhagens de célula que demonstram expressão heteróloga de CERT ou do mutante de CERT. Subsequentemente essas linhagens de célula e em paralelo células do tipo selvagem CH DG 44 são transfectadas com um vetor codificando albumina de soro humano como o gene de interesse. Após uma segunda rodada de seleção, sobrenadante é obtido das 15 culturas de estoque de semente de todos os agrupamentos de célula estáveis durante um período de seis passagens subsequentes, o título de HSA é determinado através de ELISA (Figura 11C) e dividido pelo número médio de células para calcular a produtividade específica (Figura 11B).

Os valores mais altos são vistos nos agrupamentos de célula carregando o mutante de CERT, seguido por CERT do tipo selvagem. Em ambos, a expressão de HSA é acentuadamente aumentada comparado com células que não têm expressão heteróloga para CERT ou mutante de CERT. Resultados muito similares podem ser obtidos se os transfectantes estáveis forem submetidos a fermentações em batelada ou do tipo batelada alimentada. Em cada um desses ambientes, superexpressão de ambas as CERT do tipo selvagem e mutante leva à secreção de anticorpo aumentada, indicando que CERT é capaz de aumentar a capacidade de produção específica das células cultivadas em culturas seriais ou em culturas em batelada ou do tipo batelada alimentada de biorreator. Isto indica que a expressão heteróloga de CERT, e especialmente CERT mutante, pode aumentar a secreção de proteínas de cadeia única em linhagens de célula CHO transientemente bem como estavelmente transfectadas. Referências

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Claims (38)

1. Método de produção de uma proteína heteróloga de interesse em uma célula compreendendo: a. Aumento da expressão ou atividade de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, e b. Realização da expressão da dita proteína de interesse.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, com o que a proteína do domínio START é um membro da família do domínio START de mamífero tal como PCTP (SEQ ID NO.: 27), StarD7, GPBP1 StarDI0, StarD8, StarDI3, DLC-1, StarD4 (SEQ ID NO.: 21), StarD6 (SEQ ID NO. 25), StarD5 (SEQ ID NO.: 23), MLN64, StAR, THEA-2, CACH ou StarD9 ou um derivado ou mutante da mesma.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, com o que a proteína do domínio START é caracterizada por ser induzida quando do estresse de ER e/ou é estruturalmente caracterizada por consistir apenas em um domínio START tal como StarD4 (SEQ ID NO.: 21), StarD5 (SEQ ID NO.: 23), StarD6 (SEQ ID NO.: 25) ou proteína de transferência de fosfatidilcolina (PCTP) (SEQ ID NO.: 27).

4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3, com o que o domínio START compreende pelo menos a seqüência de consenso do domínio START (SEQ ID NO.: 28) ou pelo menos o domínio START de 219 aminoácidos de CERTl (SEQ ID NO.: 19) ou pelo menos o domínio START de 223 aminoácidos de CERT e CERT S132A (SEQ ID NO.: 17) ou pelo menos o domínio START de StarD4 (SEQ ID NO.: 21) ou pelo menos o domínio START de StarDõ (SEQ ID NO.: 25) ou um derivado ou mutante da mesma.

5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, com o que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida (SEQ ID NO.: 11 ou SEQ ID NO.: 13) ou um derivado ou mutante da mesma.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, com o que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida mutada CERT e a dita mutação desabilita e/ou deleta um sítio de fosforilação em qualquer posição serina, treonína ou tirosina de CERT.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, com o que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida mutada CERT e a dita mutação desabilita e/ou deleta o sítio de fosforilação de proteína quinase (PKD) de CERT na posição 132.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, com o que a CERT mutada é CERT S132A (SEQ ID NO.: 15).

9. Método de acordo com as reivindicações 1 a 8, com o que o dito método resulta em produtividade celular específica maior da dita proteína de interesse na dita célula em comparação com uma célula controle expressando a dita proteína de interesse, mas com o que a dita célula controle não tem expressão ou atividade aumentada de uma proteína tendo uma sequência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, com o que o aumento em produtividade é cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 11% a cerca de 20%, cerca de 21% a cerca de 30%, cerca de 31% a cerca de 40%, cerca de 41% a cerca de 50%, cerca de 51% a cerca de 60%, cerca de 61% a cerca de 70%, cerca de 71% a cerca de 80%, cerca de 81% a cerca de90%, cerca de 91% a cerca de 100%, cerca de 101% a cerca de 149%, cerca de 150% a cerca de 199%, cerca de 200% a cerca de 299%, cerca de300% a cerca de 499% ou cerca de 500% a cerca de 1000%.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, com o que a dita célula é uma célula eucariótica tal como uma célula de levedura, planta, verme, inseto, ave, peixe, réptil ou mamífero.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, com o que a dita célula eucariótica é uma célula de mamífero.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, com o que a dita célula de mamífero é uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), CV1 de rim de macaco, COS de rim de macaco, PER.C6TM de epitélio de lente humano, rim embriônico humano, HEK293, rim de hamster bebê, rim de macaco verde Africano, carcinoma cervical humano, rim canino, fígado de rato búfalo, pulmão humano, fígado humano, tumor mamário de camundongo ou mieloma, uma célula de cachorro, porco ou macaco, rato, coelho, gato, cabra, de preferência uma célula CHO.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, com o que a dita célula é CHO do tipo selvagem, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKX-B11, CHO Pro-5, de preferência CHO DG44.

15. Método de acordo com as reivindicações 1 a 14, com o que a proteína de interesse é uma proteína de membrana ou secretada.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, com o que a proteína de interesse é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, com o que o anticorpo é monoclonal, policlonal, de mamífero, murino, quimérico, humanizado, primatizado, primata, humano ou um fragmento de anticorpo ou derivado do mesmo tal como anticorpo, cadeia leve de imunoglobulina, cadeia pesada de imunoglobulina, cadeias leve e pesada de imunoglobulina, Fab, F(ab')2, Fe, proteínas de fusão Fc-Fc, Fv, Fv de cadeia simples, Fv de domínio simpies, Fv de cadeia simples tetravalente, Fv ligado por dissulfeto, de domínio deletado, minicorpo, diacorpo ou um polipeptídeo de fusão de um dos fragmentos acima com outro peptídeo ou polipeptídeo, fusão de Fc-peptídeo, fusão de Fc-toxina, proteínas de andaime.

18. Método de aumento da produtividade celular específica de uma membrana ou proteína secretada de interesse em uma célula compreendendo introdução em uma célula de um ou mais sistemas de vetor compreendendo seqüências de ácido nucleico codificando pelo menos dois polipeptídeos com o que: a. um primeiro polinucleotídeo codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma e b. um segundo polinucleotídeo codifica uma proteína de interesse c. e com o que a proteína de interesse e a proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma são expressas pela dita célula.

19. Método de aumento da eficiência de transfecção de uma célula expressando uma proteína de membrana ou secretada de interesse em uma célula compreendendo: a. transfecção da dita célula com um primeiro polinucleotídeo codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, b. subsequentemente transfecção da dita célula com um segundo polinucleotídeo codificando uma proteína de interesse, c. com o que os ditos primeiro e segundo polinucleotídeos estão localizados em sistemas de vetor diferentes.

20. Vetor de expressão compreendendo dois polinucleotídeos, a. um primeiro polinucleotídeo codificando uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma e b. um segundo polinucleotídeo codificando uma proteína de interesse.

21. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 20, com o que a proteína do domínio START é um membro da família do domínio START de mamífero tal como PCTP, StarD7, GPBP, StarDI 0, StarD8, StarDI3, DLC-1, StarD4, StarD6, StarDõ, MLN64, StAR1 THEA-2, CACH ou StarD9 ou um derivado ou mutante da mesma.

22. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 20 ou 21, com o que a proteína do domínio START é proteína de transferência de ceramida CERT (SEQ ID NO.: 11 ou SEQ ID NO.: 13) ou um derivado ou mutante da mesma.

23. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 22, onde a CERT mutada é CERT S132 A (SEQ ID NO.: 15).

24. Vetor de expressão de acordo com as reivindicações 20 a23, com o que o dito primeiro polinucleotídeo aumenta o transporte de proteína em uma célula através do curso secretor.

25. Célula compreendendo o vetor de expressão das reivindicações 20 a 24.

26. Célula de acordo com a reivindicação 25, com o que a dita célula é uma célula eucariótica tal como uma célula de levedura, planta, verme, inseto, ave, peixe, réptil ou mamífero.

27. Célula de acordo com a reivindicação 26, com o que a dita célula eucariótica é uma célula de mamífero.

28. Célula de acordo com a reivindicação 27, com o que a dita célula de mamífero é uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), CV1 de rim de macaco, COS de rim de macaco, PER.C6TM de epitélio de lente humano, rim embriônico humano, HEK293, rim de hamster bebê, rim de macaco verde Africano, carcinoma cervical humano, rim canino, fígado de rato búfalo, pulmão humano, fígado humano, tumor mamário de camundongo ou célula de mieloma, uma célula de cachorro, porco ou macaco, rato, coelho, gato, cabra, de preferência uma célula CHO.

29. Célula de acordo com a reivindicação 28, com o que a dita célula CHO é CHO do tipo selvagem, CHO K1, CHO DG44, CHO DUKXB11, CHO Pro-5, de preferência CHO DG44.

30. Proteína de interesse, de preferência um anticorpo produzido através de qualquer um dos métodos como definidos nas reivindicações 1 a29.

31. Composição farmacêutica compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo útil para bloqueio ou redução da expressão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma.

32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31, com o que a seqüência do domínio START ê proteína de transferência de ceramida CERT (SEQ ID NO.: 11 ou SEQ ID NO.: 13) ou um derivado ou mutante da mesma.

33. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31 ou 32, com o que a seqüência de polinucleotídeo é RNAi, siRNA ou RNA de antíssentido.

34. Composição farmacêutica compreendendo um inibidor ou supressor de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START), de preferência CERT (SEQ ID NO.: 11 ou SEQ ID NO.: 13) ou um derivado ou mutante da mesma.

35. Método para identificação de um modulador da função da proteína do domínio START, de preferência função CERT, compreendendo: a. provisão de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido compreendendo um domínio de transferência de lipídeo relacionado com regulador agudo esteroidogênico (START) ou um derivado ou mutante da mesma, de preferência CERT, b. contato da dita proteína da etapa a) com um agente de teste, c. determinação de um efeito relacionado com secreção ou expressão de proteína maior ou menor de proteínas de superfície de célula.

36. Método compreendendo aplicação de uma composição farmacêutica como definida nas reivindicações 31 a 34 para o tratamento de câncer.

37. Uso de uma proteína do domínio START ou um polinucleotídeo codificando uma proteína do domínio START para aumentar a secreção e/ou produção de uma proteína de interesse.

38. Uso para diagnóstico de qualquer um dos métodos, vetores de expressão, células ou composições farmacêuticas como definidos nas reivindicações 1 a 36.