CN111100865B - 一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法，本发明提供的工程菌pY26‑CERT不影响菌株的正常生产，并且可以耐受1％丁醇，能够使得在该浓度下的生物量较野生型菌株显著增加19.7％，并且使IPC、MIPC、M(IP)₂C这三种主要的鞘脂组分分别较野生型提高了20％、65％、和56％，另外细胞膜的完整性较野生型菌株提高了27.8％。能够提高在生产过程中对高浓度丁醇的抗压能力，有利于提高发酵产品的产量，也能够节约丁醇在工业化生产中的生产成本，有利于丁醇工业化生产发展。

Description

一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法

技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

丁醇作为一种极强的疏水性物质，具有较强的渗透性，能够与酿酒酵母细胞膜反应，破坏酵母细胞膜的组分与功能。在丁醇工业生产过程中，随着丁醇浓度的不断积累，其对酵母细胞的破坏也不断增加，最终直接导致酵母细胞的生长能力下降，丁醇生产性能减弱。

细胞膜工程作为现阶段改善酵母细胞丁醇耐受能力的主要手段，其主要围绕着膜脂的化学结构多样性与膜脂组分多样性进行改造的。

膜脂化学结构多样性主要由脂质的磷脂头部与脂肪酸尾部决定。不同的磷脂头部具有不同的物理化学特征，磷脂酰乙醇胺具有较小的头部结构并最终形成了圆锥状的磷脂形状，而磷脂酰胆碱具有比乙醇胺稍大的头部结构则形成了圆筒状的磷脂形状，圆筒状结构有利于膜脂的排列而圆锥状结构则增加了膜脂的排列压力改变了膜脂的弯曲程度。不同于磷脂头部化学种类的差异，脂肪酸尾部的差异主要集中在化学结构(脂肪酸饱和度与链长)的变化，高饱和度的脂肪酸类具有较大的空间位阻而使得脂质间的排列较为疏松从而提高了细胞膜的流动性，而较长的脂肪酸链增加了细胞膜的厚度而降低了对物质的通透性。

膜脂组分的多样性是指细胞膜上不同脂质组成的比例的多样性，脂质组分的多样性也决定着细胞膜的不同生理功能，如甾醇含量的增加能有效增强细胞膜的完整性，而改变细胞膜上高不饱和磷脂含量能够增加细胞膜的流动性。

发明内容

为了有效解决酿酒酵母丁醇耐受能力低的问题，使得酿酒酵母菌株在丁醇胁迫条件下生存能力有所提高，本发明通过过量表达人源的神经酰胺转运蛋白CERT(NCBI登录号为：NP_005704)来增强酿酒酵母的丁醇胁迫抗性。

本发明提供一种编码人源的神经酰胺转运蛋白CERT的基因，编码所述蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种人源的神经酰胺转运蛋白CERT，所述蛋白CERT氨基酸序列如SEQID NO.7所示。

本发明提供一种含有所述人源神经酰胺转运蛋白CERT基因的重组质粒，所述重组质粒是将如SEQ ID NO.1所示的基因连接至pY26载体上。

在本发明的一种实施方式中，pY26载体上还含有强启动子TEF1，该强启动子位于CERT基因的上游。

本发明提供一种含有所述人源神经酰胺转运蛋白的重组菌，所述重组菌是以酿酒酵母菌株是Saccharomyces cerevisiae W303-1A为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建步骤为：构建重组质粒pY26-CERT，再将重组质粒pY26-CERT通过醋酸锂方法转入酿酒酵母W303-1A感受态中，通过尿嘧啶缺陷性平板进行筛选，得到菌株W303-1ApY26-CERT。

在本发明的一种实施方式中，具体步骤为：(1)将酿酒酵母W303-1A接种至20～60mL YPD培养基中25～35℃过夜培养，使得菌液OD₆₀₀＞1.2，然后将菌液接种至新的培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达到0.3～1.0；(2)将该菌液离心富集后去上清，加去离子水重悬，再离心富集；(3)将步骤(2)重复3次；(4)在步骤(3)最终得到的悬液中加入LiAc，混匀后离心，去上清；(5)将混合液加入步骤(4)中离心后去上清的离心管中；(6)28～35℃培养25～35min后，再在40～45℃培养35～45min后，2500～4500rpm离心0.5～1.5min，去上清后用150～250uL无菌水重悬，将重悬液涂布于营养缺陷型培养基平板。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)和(3)所述的离心条件为3500rpm～4500rpm，4～8min；步骤(2)中去离子水添加量为25～35mL；(3)步骤(4)中的LiAc浓度为0.3～0.6mol/L，添加量为0.5～1.5mL，离心条件为10000～15000rpm离心5～15s。

在本发明的一种实施方式中，步骤(5)所述转化液制备方法为：200～250μL 50％的PEG，30～40μL 1mol/L LiAc，45～55μLssDNA，20～25μL DNA水溶液按混合液按顺序加入。

在本发明的一种实施方式中，步骤(6)所述平板为尿嘧啶缺陷性培养基平板。

本发明还提供一种提高酿酒酵母细胞膜完整性的方法，所述方法是过表达基因CERT。

本发明提供一种能够耐受高浓度丁醇的酿酒酵母在能源、化工方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括在制备丁醇中的应用。

有益效果：本发明提供了一种能够增强酵母的丁醇耐受能力的工程菌及其构建方法，本发明提供的工程菌(pY26-CERT)不影响菌株的正常生产，并且可以耐受1％丁醇，能够使得在该浓度下的生物量较野生型和pY26-NVJ2菌株分别显著增加19.7％、18.4％，并且使IPC、MIPC、M(IP)₂C这三种主要的鞘脂组分分别较野生型提高了20％、65％、和56％，另外细胞膜的完整性较野生型和pY26-NVJ2菌株提高了27.8％和25％。能够提高在生产过程中对高浓度丁醇的抗压能力，有利于提高发酵产品的产量。

附图说明

图1为各菌株在正常条件和0％，1％，2％丁醇条件下的平板生长实验。

图2为各菌株在正常条件和0％，1％，2％丁醇条件下的生长曲线；A为正常条件下(YNB+0％丁醇)各菌株的生长曲线；B为1％丁醇条件下各菌株的生长曲线；C为2％丁醇条件下各菌株的生长曲线。

图3为各菌株在正常条件与0％，1％，2％丁醇条件下鞘脂(主要包含三类：IPC，MIPC，M(IP)₂C)含量的变化

图4为各菌株在正常条件和0％，1％，2％丁醇条件下的细胞膜完整性测定。

具体实施方式

配制YNB培养基：酵母基础氮源培养基购于生工生物工程(上海)股份有限公司，添加6.7g到1L培养液中使得其终浓度为6.7g/L，添加葡萄糖使得其终浓度为20g/L。

配制含YNB+丁醇培养基：在YNB培养基的基础上添加0％，1％，2％(体积比)的丁醇。

配制尿嘧啶缺陷性培养基：组氨酸、亮氨酸、腺嘌呤、色氨酸终浓度分别为200mg/L、1000mg/L、200mg/L、200mg/L。

实施例1：过表达菌株的构建

以如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，以P1/P2为引物扩增目的基因CERT，构建反应PCR扩增体系：PrimerSTAR酶0.5μL、5×PrimerSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL、两条引物各1μL、模板1μL，加水补足至50μL；PCR反应条件为：①95℃、2min，②98℃、10s，③55℃、15s，④68℃、2min⑤72℃、5min，②～④反应扩增30个循环。

将扩增产物(通过生工生物工程(上海)股份有限公司的胶回收试剂盒回收后)与质粒PY26用相同的限制性内切酶SacIⅠ和NotⅠ消化(消化体系为：内切酶各10μL，扩增产物30μL、质粒20μL、10×T Buffer20μL；反应条件为：37℃、120min)，通过T4连接酶将基因CERT连接到PY26，该载体参见Chen X et al,Metabolic engineering of Torulopsisglabrata for malate production.Metabolic engineering,2013,19:10-16，由强启动子TEF1启动转录翻译。

P1：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCGGATAATCAGAGCTG(SEQ ID NO.2)

P2：TCCCCGCGGCTAGAACAAAATAGGCTTTCCT(SEQ ID NO.3)，(下划线处为酶切位点)

将上述重组质粒pY26-CERT通过醋酸锂方法转入酿酒酵母W303-1A感受态中，(操作步骤参照文献Gietz RD,Schiestl RHJNp.High-efficiency yeast transformationusing the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.2007,2(1):31.)，具体操作如下，

(1)将酿酒酵母W303-1A接种至20mL YPD培养基中，30℃过夜培养(OD₆₀₀>1.5)，转接到50ml的YPD中，接种1-2mL，待OD₆₀₀达到0.5左右时，停止培养，约培养6-8小时；

(2)取30mL4000rpm，4℃离心5min；

(3)去上清，加入30mL预冷的去离子水重悬，4000rpm离心5min；

(4)重复步骤(3)一次；

(5)将菌体重悬于1mL的0.5mol/L的LiAc(将10.202g LiAc溶于100mL去离子水中，用醋酸调节至pH7.5，121℃灭菌20min)中；

(6)转移上述悬液至1.5ml EP管中，12000rpm离心10s，去上清。

(7)将菌体重悬于0.5ml 0.1mol/L的LiAc中；

(8)将上述悬液分装与1.5EP管中，每管50μL，12000rpm离心10s，去上清。

(9)将制备好的ssDNA(购自Sigma Aldrich公司，浓度为2mg/mL)在沸水中放置5min后置于冰上冷却待用，(ssDNA沸水5min后，冰上迅速冷却)；

(10)配制转化混合液：240μL 50％的PEG，36μL 1mol/L LiAc，50μLssDNA，34μLDNA水溶液按混合液按顺序加入；

(11)将上步制备好的混合液0.36mL装到第8步去离心取上清后的离心管中，混匀；

(12)30℃培养30min后，再在42℃培养40min；

(13)3000～4000rpm离心1min，去上清，用200uL的无菌水中重悬，涂营养缺陷型平板。将上述涂布了菌液的平板，在30℃培养48h，挑取在尿嘧啶缺陷性平板上生长的单菌落，然后挑选单菌落接种于YNB液体培养基中，30℃培养12h，后提取质粒(使用生工生物工程(上海)股份有限公司生产的酵母质粒提取试剂盒)，双酶切验证正确后送去测序，验证正确的即为菌株W303-1ApY26-CERT。

实施例2：各菌株生长性能的测定

(1)平板生长实验：将验证正确的菌株的菌液以体积比1％的接种量接种于新鲜的YNB培养基中30℃、200rpm培养至对数期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD₆₀₀＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上(YNB+0％丁醇、YNB+1％丁醇、YNB+2％丁醇)，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照(图1)。

(2)生长曲线测定：菌株具体活化方式同步骤(1)，将活化后的菌液转接到相应的YNB液体培养基中(YNB+0％丁醇、YNB+1％丁醇、YNB+2％丁醇)，控制起始OD₆₀₀＝0.1，30℃200rpm摇床培养，每隔2小时取样测定OD值，绘制生长曲线(图2)。

(3)菌株对不同浓度丁醇耐受性：

平板生长实验和生长曲线分析丁醇对菌株W303-1A，PY26-CERT生长的影响。正常条件下(YNB+0％丁醇)，过表达CERT并不影响菌株的生长；在浓度为1％的丁醇条件下，过表达CERT促进了菌株的生长，基因CERT能够调节细胞对丁醇的耐受能力。

实施例3：各菌株细胞膜鞘脂成分检测

(1)将菌株W303-1A，PY26-CERT单菌落培养至OD₆₀₀为1，以体积比1％的接种量接种于不同丁醇浓度条件下(YNB+0％丁醇、YNB+1％丁醇、YNB+2％丁醇)30℃、200rpm过夜培养，各取1mL菌液在4℃、5000rpm离心5min，将5mL预冷的(4℃)氯仿/甲醇(体积比为2:1)加入上述收集的菌体中，并将体系中加入1mL的酸洗玻璃珠后快速混匀；

(2)往混合液中加入1mL预冷的(4℃)0.034％MgCl₂溶液，并充分混匀；

(3)室温下1000g离心3min，此时混合液会分成上水相与下有机相，同时移除上水相；

(4)往提取物中加入2mL甲醇/水/氯仿(体积比48:47:3)混合液，并快速涡旋振荡；

(5)室温下1000g离心3min，此时混合液会分成上水相与下有机相，同时移除上水相；

(6)将下有机相转移至另一离心管中；往残留的下有机相的玻璃珠中加入2mL预冷的(4℃)氯仿/甲醇(2:1)混合液、1mL甲醇/水/氯仿(体积比48:47:3)混合液，并快速涡旋振荡；

(7)室温、1000g离心3min，此时混合液会分成上水相与下有机相，同时移除上水相；

(8)将下有机相转移至离心管中，在通风橱中使用氮吹仪加速有机溶剂挥发；

(9)往干燥后的脂质内加入1mL预冷的(4℃)氯仿/甲醇(体积比2:1)混合液，并转移至玻璃管中，并用UHPLC-QTOF-MS检测各菌株中复杂鞘脂成分的变化情况。

结果如图3所示：在1％丁醇处理条件下过表达CERT显著增强了细胞膜上磷酰基神经酰胺(IPC)、甘露酰肌醇神经酰胺(MIPC)、甘露酰二肌醇神经酰胺(M(IP)₂C)的含量，使得这三种神经酰胺在重组菌中的含量较野生型酿酒酵母分别提高了20％、65％、和56％。以上结果表明，基因CERT能够调节细胞膜上复杂鞘脂的组分。

实施例4：各菌株细胞膜完整性的测定

本实验采用测定被SYTOX-green染色的方法来表征细胞膜完整性。具体方法是取对数期培养的酵母细胞1g，用无菌水清洗两次后，然后用0％，1％，2％丁醇于30℃处理4h，离心后弃去上清，用无菌水清洗两遍后，加入SYTOX-green(成品购自于Sigma Aldrich公司)避光处理20min，离心后弃去上清，用无菌水清洗两遍后，过尼龙滤网膜加入到流式小管中，用流式细胞仪检测被SYTOX-green染色的细胞占被检测总细胞的比例，(测定条件参见Wu C,et al,CgHog1-mediated CgRds2 phosphorylation alters glycerophospholipidcomposition to coordinate osmotic stress in Candida glabrata.2019,85(6):e02822-02818.)。

结果如图4所示：(1)在正常条件下(YNB+0％丁醇)，出发菌株W303-1A，过表达菌株PY26-CERT细胞膜完整性无明显差异；(2)在1％丁醇条件下，过表达菌株PY26-CERT较pY26-NVJ2菌株提高25％，较对照组(野生型)提高27.8％。结果表明神经酰胺转运蛋白对于酵母提高细胞膜完整性有重要作用。其抗丁醇胁迫作用可能是通过提高菌株的细胞膜完整性来适应丁醇胁迫的。

对比例1

菌株具体构建方式参见实施例1，区别在于，将CRET基因替换为来源于酿酒酵母的Nvj2基因(为酿酒酵母本源编码神经酰胺转运蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，构建得到含Nvj2的重组菌pY26-Nvj2，利用P3/P4为引物，以酿酒酵母W303-1A基因组为模板扩增Nvj2(酿酒酵母本源的神经酰胺转运蛋白)，并通过限制性内切酶SacIⅠ和NotⅠ消化将Nvj2扩增片段连接到质粒PY26上，并由强启动子TEF1启动转录翻译。

P3：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGGCTAGCTTGAAGGTATTTC(SEQ ID NO.5)

P4：TCCCCGCGGTCACAGTTTGGGCTCTCG(SEQ ID NO.6)，(下划线处为酶切位点)

参见实施例2，测定菌株的生长性能：

(1)平板生长实验结果：在正常条件下(YNB+0％丁醇)下各菌株的生长能力基本一致，并无显著差异；在YNB+1％丁醇条件下，pY26-CERT菌株较对菌株与pY26-NVJ2菌株的生长能力显著提升；在YNB+2％丁醇条件下，各菌株的生长能力均有减弱，且各菌株间的生长差异并不显著(图1)。

(2)生长曲线测定结果：在正常条件下(YNB+0％丁醇)下各菌株的最终生物量基本一致，并无显著差异；在YNB+1％丁醇条件下，pY26-CERT菌株较对菌株与pY26-NVJ2菌株的最终生物量分别提高了19.7％、18.4％；在YNB+2％丁醇条件下，各菌株的生长能力均有减弱，且各菌株间的生长差异并不显著(图2)。

(3)菌株对不同浓度丁醇耐受性：过表达NVJ2对细胞的生长并无促进作用，与对照组无显著差异。

对比例2

具体实施方式参见实施例3，对重组菌pY26-NVJ2、pY26-CERT分别在0％丁醇、1％丁醇、2％丁醇条件下的细胞膜鞘脂成分进行检测，结果在1％丁醇条件下pY26-CERT菌株的鞘脂水平较pY26-NVJ2具有显著变化，pY26-CERT菌株的IPC含量较pY26-NVJ2提高了9.28％，MIPC含量提高了33.3％，M(IP)₂C含量提高了38.6％；而在0％丁醇、2％丁醇条件下的鞘脂含量并无显著变化(图3)。

对比例3

具体实施方式参见实施例4，对菌株细胞膜完整性进行测定，结果显示1％丁醇条件下pY26-CERT菌株的细胞膜完整性较pY26-NVJ2具有显著变化，其中pY26-CERT菌株的细胞膜完整性较pY26-NVJ2提高了27.8％，而在0％丁醇、2％丁醇条件下的细胞膜完整性并无显著变化(图4)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1875

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctgaca accaatcttg gaactcttct ggttctgaag aagacccaga aactgaatct 60

ggtccaccag ttgaaagatg tggtgttttg tctaagtgga ctaactacat ccacggttgg 120

caagacagat gggttgtttt gaagaacaac gctttgtctt actacaagtc tgaagacgaa 180

actgaatacg gttgtagagg ttctatctgt ttgtctaagg ctgttatcac tccacacgac 240

ttcgacgaat gtagattcga catctctgtt aacgactctg tttggtactt gagagctcaa 300

gacccagacc acagacaaca atggatcgac gctatcgaac aacacaagac tgaatctggt 360

tacggttctg aatcttcttt gagaagacac ggttctatgg tttctttggt ttctggtgct 420

tctggttact ctgctacttc tacttcttct ttcaagaagg gtcactcttt gagagaaaag 480

ttggctgaaa tggaaacttt cagagacatc ttgtgtagac aagttgacac tttgcaaaag 540

tacttcgacg cttgtgctga cgctgtttct aaggacgaat tgcaaagaga caaggttgtt 600

gaagacgacg aagacgactt cccaactact agatctgacg gtgacttctt gcactctact 660

aacggtaaca aggaaaagtt gttcccacac gttactccaa agggtatcaa cggtatcgac 720

ttcaagggtg aagctatcac tttcaaggct actactgctg gtatcttggc tactttgtct 780

cactgtatcg aattgatggt taagagagaa gactcttggc aaaagagatt ggacaaggaa 840

actgaaaaga agagaagaac tgaagaagct tacaagaacg ctatgactga attgaagaag 900

aagtctcact tcggtggtcc agactacgaa gaaggtccaa actctttgat caacgaagaa 960

gaattcttcg acgctgttga agctgctttg gacagacaag acaagatcga agaacaatct 1020

caatctgaaa aggttagatt gcactggcca acttctttgc catctggtga cgctttctct 1080

tctgttggta ctcacagatt cgttcaaaag ccatactcta gatcttcttc tatgtcttct 1140

atcgacttgg tttctgcttc tgacgacgtt cacagattct cttctcaagt tgaagaaatg 1200

gttcaaaacc acatgactta ctctttgcaa gacgttggtg gtgacgctaa ctggcaattg 1260

gttgttgaag aaggtgaaat gaaggtttac agaagagaag ttgaagaaaa cggtatcgtt 1320

ttggacccat tgaaggctac tcacgctgtt aagggtgtta ctggtcacga agtttgtaac 1380

tacttctgga acgttgacgt tagaaacgac tgggaaacta ctatcgaaaa cttccacgtt 1440

gttgaaactt tggctgacaa cgctatcatc atctaccaaa ctcacaagag agtttggcca 1500

gcttctcaaa gagacgtttt gtacttgtct gttatcagaa agatcccagc tttgactgaa 1560

aacgacccag aaacttggat cgtttgtaac ttctctgttg accacgactc tgctccattg 1620

aacaacagat gtgttagagc taagatcaac gttgctatga tctgtcaaac tttggtttct 1680

ccaccagaag gtaaccaaga aatctctaga gacaacatct tgtgtaagat cacttacgtt 1740

gctaacgtta acccaggtgg ttgggctcca gcttctgttt tgagagctgt tgctaagaga 1800

gaatacccaa agttcttgaa gagattcact tcttacgttc aagaaaagac tgctggtaag 1860

ccaatcttgt tctaa 1875

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<212> DNA

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<212> DNA

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cgcgatatag acccagagtt taaagcacgc aagctagaag agcaattagg tgtcaaagtt 240

tttaacaagg gttggatcac cgtcactaag caatattatt atcattcttc agaagtggct 300

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gctgcggcag cctcagatat gaataatact agtgctaagg aacacttaga agcacttcaa 1620

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gaaaacctaa aagatcttgt tgacgcatct ggagtggcaa cgaaaactac aacccagaca 1740

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gcttcaaaga tgtttgcgaa caaagaaaat agaaagtttt ctgtatcctc aaatgattct 2160

cagaattcgc tcaaaaatgg tgatccccat gtgaaagctt caaaacttga aagctctcaa 2220

gcttttgtta agaagacctc tcagaatcgt tttaatgacg gctttttcaa gcaagattta 2280

gaatttgaag aacagcgaga gcccaaactg tga 2313

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaggaaaaaa gcggccgcat ggctagcttg aaggtatttc 40

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccccgcggt cacagtttgg gctctcg 27

<210> 7

<211> 624

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Met Ser Asp Asn Gln Ser Trp Asn Ser Ser Gly Ser Glu Glu Asp Pro

1 5 10 15

Glu Thr Glu Ser Gly Pro Pro Val Glu Arg Cys Gly Val Leu Ser Lys

20 25 30

Trp Thr Asn Tyr Ile His Gly Trp Gln Asp Arg Trp Val Val Leu Lys

35 40 45

Asn Asn Ala Leu Ser Tyr Tyr Lys Ser Glu Asp Glu Thr Glu Tyr Gly

50 55 60

Cys Arg Gly Ser Ile Cys Leu Ser Lys Ala Val Ile Thr Pro His Asp

65 70 75 80

Phe Asp Glu Cys Arg Phe Asp Ile Ser Val Asn Asp Ser Val Trp Tyr

85 90 95

Leu Arg Ala Gln Asp Pro Asp His Arg Gln Gln Trp Ile Asp Ala Ile

100 105 110

Glu Gln His Lys Thr Glu Ser Gly Tyr Gly Ser Glu Ser Ser Leu Arg

115 120 125

Arg His Gly Ser Met Val Ser Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Tyr Ser

130 135 140

Ala Thr Ser Thr Ser Ser Phe Lys Lys Gly His Ser Leu Arg Glu Lys

145 150 155 160

Leu Ala Glu Met Glu Thr Phe Arg Asp Ile Leu Cys Arg Gln Val Asp

165 170 175

Thr Leu Gln Lys Tyr Phe Asp Ala Cys Ala Asp Ala Val Ser Lys Asp

180 185 190

Glu Leu Gln Arg Asp Lys Val Val Glu Asp Asp Glu Asp Asp Phe Pro

195 200 205

Thr Thr Arg Ser Asp Gly Asp Phe Leu His Ser Thr Asn Gly Asn Lys

210 215 220

Glu Lys Leu Phe Pro His Val Thr Pro Lys Gly Ile Asn Gly Ile Asp

225 230 235 240

Phe Lys Gly Glu Ala Ile Thr Phe Lys Ala Thr Thr Ala Gly Ile Leu

245 250 255

Ala Thr Leu Ser His Cys Ile Glu Leu Met Val Lys Arg Glu Asp Ser

260 265 270

Trp Gln Lys Arg Leu Asp Lys Glu Thr Glu Lys Lys Arg Arg Thr Glu

275 280 285

Glu Ala Tyr Lys Asn Ala Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Ser His Phe

290 295 300

Gly Gly Pro Asp Tyr Glu Glu Gly Pro Asn Ser Leu Ile Asn Glu Glu

305 310 315 320

Glu Phe Phe Asp Ala Val Glu Ala Ala Leu Asp Arg Gln Asp Lys Ile

325 330 335

Glu Glu Gln Ser Gln Ser Glu Lys Val Arg Leu His Trp Pro Thr Ser

340 345 350

Leu Pro Ser Gly Asp Ala Phe Ser Ser Val Gly Thr His Arg Phe Val

355 360 365

Gln Lys Pro Tyr Ser Arg Ser Ser Ser Met Ser Ser Ile Asp Leu Val

370 375 380

Ser Ala Ser Asp Asp Val His Arg Phe Ser Ser Gln Val Glu Glu Met

385 390 395 400

Val Gln Asn His Met Thr Tyr Ser Leu Gln Asp Val Gly Gly Asp Ala

405 410 415

Asn Trp Gln Leu Val Val Glu Glu Gly Glu Met Lys Val Tyr Arg Arg

420 425 430

Glu Val Glu Glu Asn Gly Ile Val Leu Asp Pro Leu Lys Ala Thr His

435 440 445

Ala Val Lys Gly Val Thr Gly His Glu Val Cys Asn Tyr Phe Trp Asn

450 455 460

Val Asp Val Arg Asn Asp Trp Glu Thr Thr Ile Glu Asn Phe His Val

465 470 475 480

Val Glu Thr Leu Ala Asp Asn Ala Ile Ile Ile Tyr Gln Thr His Lys

485 490 495

Arg Val Trp Pro Ala Ser Gln Arg Asp Val Leu Tyr Leu Ser Val Ile

500 505 510

Arg Lys Ile Pro Ala Leu Thr Glu Asn Asp Pro Glu Thr Trp Ile Val

515 520 525

Cys Asn Phe Ser Val Asp His Asp Ser Ala Pro Leu Asn Asn Arg Cys

530 535 540

Val Arg Ala Lys Ile Asn Val Ala Met Ile Cys Gln Thr Leu Val Ser

545 550 555 560

Pro Pro Glu Gly Asn Gln Glu Ile Ser Arg Asp Asn Ile Leu Cys Lys

565 570 575

Ile Thr Tyr Val Ala Asn Val Asn Pro Gly Gly Trp Ala Pro Ala Ser

580 585 590

Val Leu Arg Ala Val Ala Lys Arg Glu Tyr Pro Lys Phe Leu Lys Arg

595 600 605

Phe Thr Ser Tyr Val Gln Glu Lys Thr Ala Gly Lys Pro Ile Leu Phe

610 615 620

Claims (3)

1.一种提高酿酒酵母丁醇耐受能力的方法，其特征在于，在酿酒酵母中表达人源神经酰胺转运蛋白CERT；所述CERT蛋白是以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将人源神经酰胺转运蛋白CERT通过TEF1强启动子进行表达。

3.氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的人源神经酰胺转运蛋白CERT或核苷酸序列如SEQID NO.1所示的基因在提高酿酒酵母丁醇耐受能力方面的应用。

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