CN108060092B - 一种重组菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组菌及其用途。本发明提供的重组菌，为在宿主酵母中表达上述吉玛烯A合成酶基因或其融合蛋白基因，得到的菌；所述融合蛋白基因包括吉玛烯A合成酶基因和尼基焦磷酸合酶基因；本发明的实验证明，本发明在宿主酵母中表达吉玛烯A合成酶基因或其融合蛋白基因，得到重组菌，可以大大提高吉玛烯A的产量，适用于工业化生产β‑榄香烯和/或吉玛烯A，为抗癌原料β‑榄香烯的生物合成方面提供有力菌株及研究基础。

Description

一种重组菌及其用途
技术领域
本发明涉及生物化工领域，尤其涉及一种重组菌及其用途，以及基于重组微生物法合成β-榄香烯。
背景技术
β-榄香烯(beta-elemene)是一种具有郁金香味的挥发性倍半萜化合物，为国家一类肿瘤新药的原料药。目前主要从郁金和莪术等植物中分离提取得到，但这种方法有 较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其 野生资源造成严重破坏等。
利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000 mg/L(Parayil KuMaran AjikuMar et al.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中 达到700mg/L的产量(Effendi Leonard et al.,2010,PNAS,107(31):13654–13659)；在 酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到25 g/L(PaddonC J et al.,2013,Nature,496(7446):528-531)；目前国内在青蒿素，紫杉醇和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究。
自然界中，法尼基焦磷酸(FPP)能被吉玛烯A合成酶(GMAS)催化合成吉玛 烯A，吉玛烯A具有热不稳定性，易发生分子内热重排为β-榄香烯目前已有部分利用 重组菌生产β榄香烯前体吉玛烯A的研究，但产量均较低，达不到工业应用的要求。 例如：高允允等人通过在大肠杆菌中构建吉玛烯A的生物合成途径，得到的重组菌合 成吉玛烯A的最高产量仅为6.32mg/L，距离工业化还有较大的差距[微生物生物合成 β-榄香烯前体—吉马烯A研究，高允允，2012，杭州师范大学]。
发明内容
本发明一个目的是提供一种重组菌。
本发明提供的重组菌，为体内含有或表达吉玛烯A合成酶或吉玛烯A合成酶融合蛋白的酵母菌；
所述吉玛烯A合成酶融合蛋白包括所述吉玛烯A合成酶和法尼基焦磷酸合酶。
上述重组菌中，根据融合蛋白基因宿主来源不同，分为1种或多种，所述融合蛋 白的编码核酸包括所述吉玛烯A合成酶的编码核酸和所述法尼基焦磷酸合酶的编码核 酸；
所述融合蛋白的编码核酸为1种或多种；
多种所述融合蛋白的编码核酸中，至少2种所述吉玛烯A合成酶编码核酸来源宿主不同，且至少2种所述法尼基焦磷酸合酶编码核酸来源宿主不同。
本发明中所述的基因来源宿主不同是指基因的原始来源宿主不同，本发明所述吉玛烯A合成酶(germacrene A synthase)基因可从已知含有吉玛烯A合成酶的植物或 微生物中克隆得到，例如可选自向日葵(Helianthus annuus L.)、小白菊(Tanacetumparthenium)、莴苣(Lactuca sativa Linn.)、青蒿(Artemisia carvifolia)、蓝细菌等，所述法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase)基因可从已知含有吉玛烯A合成酶的植物或微生物中克隆得到，例如可选自丹参(Salvia miltiorrhiza)、酵母菌(Yeast)、刺五加(Acanthopanax senticosus(Rupr.Maxim.)Harms)、杜仲(Euco mMia ulmoidesOliv.)等。
所述吉玛烯A合成酶的编码核酸包括SEQ ID NO.3所示的核酸或SEQ ID NO.12 第13-1686位所示的核酸；
所述法尼基焦磷酸合酶的编码核酸包括SEQ ID NO.2所示的核酸或SEQ ID NO.11第1-1056位所示的核酸。
上述重组菌中，所述融合蛋白还包括用于连接所述吉玛烯A合成酶和所述法尼基焦磷酸合酶的连接肽；
所述连接肽选自GGGS、YGQ(3A001)、PGGH(4A001)、YRSQI(5A002)、 VIPFIS(6A005)、FLYLKF(6B004)、WRFSPKLQ(8A005)或HHVQESQCISTV (12A003)。
上述重组菌中，所述体内含有或表达吉玛烯A合成酶或吉玛烯A合成酶融合蛋 白为将所述吉玛烯A合成酶的编码核酸或所述融合蛋白的编码核酸导入所述酵母菌；
和/或，所述将吉玛烯A合成酶的编码核酸导入所述酵母菌为将含有所述吉玛烯A合成酶的编码核酸表达盒导入所述酵母菌；
所述将融合蛋白的编码核酸导入所述酵母菌为将含有所述融合蛋白的编码核酸表达盒导入所述酵母菌；
和/或，所述含有吉玛烯A合成酶的编码核酸表达盒包括启动子、所述吉玛烯A 合成酶的编码核酸和终止子；
和/或，所述含有融合蛋白的编码核酸表达盒包括启动子、所述融合蛋白的编码核酸和终止子；
或所述启动子选自TEF1或MF1或PGK1；所述终止子为CYC1或ADH1；
或所述启动子为TEF1，且终止子为CYC1；
或所述启动子为MF1，且终止子为CYC1；
或所述启动子为PGK1，且终止子为ADH1。
上述中，启动子TEF1包含SEQ ID NO.4所示的序列；所述启动子MF1包含SEQ IDNO.1所示的序列；所述终止子CYC1t包含SEQ ID NO.5所示的序列。
上述重组菌中，所述重组菌还表达1个或多个标记基因；和/或，所述标记基因选自his3或trp1。
上述重组菌中，所述含有吉玛烯A合成酶的编码核酸表达盒通过表达所述吉玛烯A合成酶的编码核酸表达盒的载体导入所述酵母菌；
所述含有融合蛋白的编码核酸表达盒通过表达所述含有融合蛋白的编码核酸表达盒的载体导入所述酵母菌。
上述重组菌中，所述吉玛烯A合成酶的编码核酸表达盒通过质粒形式导入所述酵母菌；
或，所述融合蛋白的编码核酸表达盒通过质粒形式和/或整合在染色体的形式导入 所述酵母菌。
在本发明的实施例中，
融合蛋白选自如下中至少一种：SynSmFPS-GGGS-STpGMAS， SynSmFPS-YGQ-STpGMAS，SynSmFPS-PGGH-STpGMAS， SynSmFPS-YRSQI-STpGMAS，SynSmFPS-VIPFIS-STpGMAS， SynSmFPS-FLYLKF-STpGMAS，SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS， SynSmFPS-HHVQESQCISTV-STpGMAS，SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS， ERG20-GGGS-LsLTC2；
融合蛋白优选为SynSmFPS-8A005-STpGMAS；
融合蛋白尤其优选为3种融合蛋白：SynSmFPS-WRFSPKLQ(8A005)-STpGMAS、ERG20-GGGS-LsLTC2、SynSmFPS-GGGS-STpGMAS；
表达融合蛋白编码核酸的表达盒选自如下至少一种：
PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1，
PTEF1-SynSmFPS-YGQ-STpGMAS-TCYC1，
PTEF1-SynSmFPS-PGGH-STpGMAS-TCYC1，
PTEF1-SynSmFPS-YRSQI-STpGMAS-TCYC1，
PTEF1-SynSmFPS-VIPFIS-STpGMAS-TCYC1，
PTEF1-SynSmFPS-FLYLKF-STpGMAS-TCYC1，
PTEF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ(8A005)-STpGMAS-TCYC1，
PTEF1-SynSmFPS-HHVQESQCISTV-STpGMAS-TCYC1，
或PMF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ(8A005)-STpGMAS-TCYC1；
表达融合蛋白编码核酸的表达盒优选为：PMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1；
表达融合蛋白编码核酸的表达盒尤其优选为3种： PMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1、PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1和 PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1。
表达吉玛烯A合成酶编码核酸表达盒的载体选自如下：
pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1，
表达吉玛烯A合成酶编码核酸表达盒的载体选自如下：
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-YGQ-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-PGGH-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-YRSQI-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-VIPFIS-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-FLYLKF-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS-TCYC1，
pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-HHVQESQCISTV-STpGMAS-TCYC1，
或pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-WRFSPKLQ-STpGMAS-TCYC1；
上述整合在染色体上的融合蛋白基因表达盒选自 PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1和PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1。
上述重组菌中，所述酵母菌为提高出发酵母菌中乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的含量和/或活性得到的菌。
所述提高出发酵母菌中乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的含量和/或活性得到的菌为增加所述出发酵母菌中乙醇脱氢酶的编码核酸、乙醛脱氢酶的编码 核酸和乙酰辅酶A合成酶的编码核酸的拷贝数；
上述重组菌中，所述增加出发酵母菌中乙醇脱氢酶的编码核酸、乙醛脱氢酶的编码核酸和乙酰辅酶A合成酶的编码核酸的拷贝数为将乙醇脱氢酶的编码核酸表达盒、 乙醛脱氢酶的编码核酸表达盒、乙酰辅酶A合成酶的编码核酸表达盒和另一个所述标 记基因(his3)采用同源重组导入所述出发酵母菌。
上述重组菌中，所述出发酵母菌为酿酒酵母；和/或，所述酿酒酵母为NK2-SQ。
1个所述标记基因为TRP1；另一个所述标记基因为HIS3。
上述乙醇脱氢酶的基因ADH2包含SEQ ID NO.6所示的序列，乙醛脱氢酶的基因ALD6包含SEQ ID NO.7所示的序列，所述乙酰辅酶A合成酶的基因ACS1包含SEQ ID NO.8所示的序列。
本发明的重组菌及各个所需载体和片段的构建见实施例。
在本发明的实施例中，重组菌具体如下：
重组菌ELE-001，为将pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得 到的菌；
重组菌ELE-002，为将pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得 到的菌；
重组菌ELE-011，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1导 入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-012，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-3A001-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-013，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-4A001-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-014，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-5A002-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-015，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-6A005-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-016，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-6B004-STpGMAS-TCYC1导 入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-017，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-018，为将pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-12A003-STpGMAS-TCYC1导入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-019，为将pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1导 入酵母FPP-001得到的菌；
重组菌ELE-020，为将pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-8A005-STpGMAS-TCYC1、 导入酵母FPP-001后，再通过同源重组导入PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1， PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1,rDNA-TRP1-up和rDNA-TRP1-down得到的 菌。
上述酵母FPP-001为将NDT80-HIS3-up、PPGK1-ADH2-TADH1、PTDH3-ACS1-TTPI1、 PTEF1-ALD6-TCYC1和NDT80-HIS3-down导入酿酒酵母中得到的菌。
其中重组菌ELE-020为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.14829也是 本发明保护的范围。
该ELE-020重组菌株于2017年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种 名称：酿酒酵母，拉定名：Saccharomyces cerevisiae，保藏编号：CGMCC No.14829。
上述重组菌在生产β-榄香烯和/或吉玛烯A中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的第3个目的是提供一种生产吉玛烯A的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，得到吉玛烯A；
本发明的第4个目的是提供一种生产β-榄香烯的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)发酵上述的重组菌，得到发酵产物；
2)有机溶液萃取所述发酵产物，收集有机相；
3)将所述有机相加热，得到β-榄香烯。
上述方法中，所述发酵为先将所述重组菌在种子培养基中培养获得种子液；再将所述种子液接种到发酵培养基中发酵培养，将所述发酵培养所述产物记作发酵体系。
上述方法中，在所述发酵培养过程中，向所述发酵体系中添加补料培养基；优选地，待所述发酵体系中的溶氧值大于60％时，向所述发酵体系中加入补料培养基至所 述发酵体系中葡萄糖浓度为5g/L。
上述方法中，每L体积所述种子培养基和所述发酵培养基配方包含：25g葡萄糖，15g硫酸铵，6.15g七水硫酸镁，0.72g七水硫酸锌，8g磷酸二氢钾，2ml氯化钙母 液，10ml微量金属盐母液；12ml维他命母液，1g色氨酸，其余为水。
所述氯化钙母液为19.2g/L二水氯化钙水溶液；
每L体积所述微量金属盐母液的配方包含：19.1g乙二胺四乙酸二钠；10.2g七 水硫酸锌；0.5g四水氯化锰；0.86g六水氯化钴；0.78g五水硫酸铜；0.56g二水钼酸 钠；5.12g七水亚硫酸铁；其余为水。
每L体积维他命母液的配方包含：0.05g生物素；0.2g对氨基苯甲酸纳；1g烟 酸；1g泛酸钙；1g盐酸吡哆醇；1g盐酸硫胺素；25g肌醇；其余为水。
每L体积所述补料培养基的配方含有800g葡萄糖，5.125g七水硫酸镁，3.5g硫 酸钾，0.28g硫酸钠，9g磷酸二氢钾和1g色氨酸；其余为水。
在所述发酵前，还包括如下步骤：
a)在固体选择培养基中活化重组菌；
b)在液体选择培养基中震荡培养后，转入种子培养基培养，得到种子液；
其中，所述固体或液体选择培养基为SD-Ura-His-Leu培养基；
上述步骤b)中培养条件为30℃，250rpm；所述接种步骤为火焰环接种；
上述发酵方法中所述种子液的培养方法具体为重组菌活化后，挑取平板上的单克隆至装有SD-Ura-His-Leu培养基的试管，30℃，250rpm振荡培养过夜；吸取500μ L菌液至装有50ml SD-Ura-His-Leu培养基的250ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡 培养24h；分别吸取2ml菌液至3个装有100ml种子培养基的1L三角瓶中，30℃， 250rpm振荡培养48h。
上述生产β-榄香烯的方法中，所述有机溶剂为正十二烷；所述加热条件为： 100-380℃加热1小时。
本发明的实验证明，本发明在宿主酵母中表达吉玛烯A合成酶基因或其融合蛋白基因，得到重组菌，可以大大提高吉玛烯A的产量，适用于工业化生产β-榄香烯和/ 或吉玛烯A，为抗癌原料β-榄香烯的生物合成方面提供有力菌株及研究基础。
附图说明
图1为吉玛烯A生物合成途径。
图2为GC-MS检测图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为吉玛烯A生物合成途径。
实施例1、目标基因和所用质粒制备
一、目标基因的制备
1、ADH2、ALD6、ASC1、MF1、TEF1和CYC1的获得
提取酵母NK2-SQ(中国中药杂志，林庭庭，王冬，戴住波，张学礼，黄璐琦， 2016，41(6)：1008-1015)的基因组DNA作为模板，用表1中基因扩增所需的引物 进行扩增，得到符合预期大小的片段ADH2、ALD6、ASC1基因、启动子MF1、TEF1 和终止子CYC1。
取PCR扩增试剂盒TAKARA
Figure BDA0001455398630000071
HS DNApolymerase配置扩增体系 (TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，dNTPMix 4μL，引物各1μL，基 因组DNA模板1μL，
Figure BDA0001455398630000072
HS聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，补加蒸馏水至总体 积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退 火15秒、72℃延伸2.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
表1为引物序列
Figure BDA0001455398630000073
Figure BDA0001455398630000081
2、来自丹参的法尼基焦磷酸合酶基因SynSmFPS和来自小白菊的吉玛烯A合成酶基因STpGMA的获得
南京金斯瑞生物科技有限公司依照SynSmFPS(SEQ ID NO.2，来源于丹参)和STpGMAS(SEQ ID NO.3，来源于小白菊)基因序列，设计全长引物，利用OVERLAP 方法形成模版DNA，再利用PCR扩增的方法得到SynSmFPS(SEQ ID NO.2)和 STpGMAS(SEQ ID NO.3)的双链DNA，然后将PCR产物转化克隆至克隆载体pUC57 (南京金斯瑞生物科技有限公司)中，分别构建了含SynSmFPS基因和STpGMAS基 因的克隆型质粒pUC57-SynSmFPS和pUC57-STpGMAS。
3、来自酵母的法尼基焦磷酸合酶基因ERG20-GGGS和来自莴苣的吉玛烯A合成 酶基因GGGS-LsLTC2的获得
提取莴苣叶片200mg用液氮研磨后CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取 总RNA：在1.5ml离心管中加入1ml 2*CTAB提取液(2％CTAB，100mM Tris-HCl PH8.0,20mMEDTA溶液(乙二胺四乙酸),1.4M NaCl溶液)，65℃预热之后，加入 20μl 2-mercaptoethanol(2-巯基乙醇)；加入少量莴苣叶片粉末(约50mg)，混合均匀， 65℃保温10min，摇匀5次；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用等体积 的氯仿/异戊醇抽提；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用等体积的氯仿/异戊 醇抽提；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用1/6体积的氯仿/异戊醇抽提； 4℃，15000rpm离心30min，移出上清，加入1/4体积的10mol/L LiCl，4℃放置 过夜；4℃，15000rpm离心30min，弃去上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次，无水乙 醇洗涤沉淀1次，超净台放置15min(室温)；用20μl milliQ DEPC(溶剂为miliQ纯水， 溶质为diethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯；焦碳酸二乙酯：水的体积比为1:1000)处 理水溶解，加入1/10体积的2mol/L NaAC(pH4.0)，加入2体积的无水乙醇，-20℃放置2h；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤两次，无水乙 醇洗涤沉淀1次；超净台放置15min(室温)，加15μl milliQ DEPC处理水使沉淀充 分溶解，-70℃保存。
第一链反转录-PCR：取无RNA酶PCR管，按第一链反转录试剂盒(宝生物工 程(大连)有限公司)配备体系：Radom 6Mers 2ul、dNTP 1ul、total RNA1ul(200ng)、 H2O 6ul、Total 10ul、瞬间离心，PCR 65℃5min，冰上急冷；再加入以下体系中反 应(第一链反转录试剂盒自带)：5*primer Buffer 4ul、RNAs Inhibiter 0.5ul、 R-Transcription1ul、H2O4.5ul，瞬间离心，PCR仪进行反应：30℃10min、42℃60 min、70℃15min、4℃保温。
分别以NK2-SQ的基因组DNA和莴苣cDNA为模板，用表2中引物分别扩增得 到约1068bp ERG20-GGGS(SEQ ID NO.11中第13-1686为ERG20)和1688bp GGGS-LsLTC2(SEQ IDNO.12中第1-1056为LsLTC2)。
按PCR扩增试剂盒Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer((购自 NEB(北京)有限公司)配置体系。扩增体系均为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-FidelityDNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预 变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸1分钟(30 个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
表2引物序列
Figure BDA0001455398630000091
Figure BDA0001455398630000101
二、重组质粒的构建
1、pM2-ADH2质粒
用SexA1(购自NEB(北京)有限公司)和Asc1(购自NEB(北京)有限公司)分别 对上述“一、目标基因的制备”中扩增得到的ADH2以及质粒pM2-tH MG1(记载在 中国专利ZL201310399947.X中)进行双酶切，得到1052bpADH2酶切产物和4738bp 质粒pM2-tH MG1酶切后骨架；再将ADH2酶切产物与质粒pM2-tH MG1酶切后骨架 连接，得到重组质粒pM2-ADH2。
2、pM4-ACS1质粒
用SexA1和Asc1分别对上述“一、目标基因的制备”中扩增得到的ACS1以及质 粒pM4-AtCPR1(记载在中国专利ZL201310399947.X中)进行双酶切；得到2201bp ACS1酶切产物、和5061bp质粒pM4-AtCPR1酶切后骨架；再将ACS1酶切产物与质 粒pM4-AtCPR1酶切后骨架连接，得到重组质粒pM4-ACS1。
3、pM3-ALD6质粒
用SexA1和Asc1分别上述“一、目标基因的制备”中扩增得到的ALD6以及质 粒pM3-ERG9(记载在中国专利申请ZL201310399947.X中)进行双酶切；得到1511bp ALD6酶切产物和4598bp质粒pM3-ERG9酶切后骨架；再将ALD6酶切产物与质粒 pM3-ERG9酶切后骨架连接，得到重组质粒pM3-ALD6。
4、pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1和pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1质粒的构建
SexA1酶切上述“一、目标基因的制备”中扩增得到的TEF1，得到440bpTEF1 酶切产物；
Asc1酶切上述“一、目标基因的制备”中扩增得到的CYC1，得到322bpCYC1 酶切产物；
SexA1和Asc1酶切pUC57-STpGMAS，回收1694bp的STpGMAS；
将酶切产物TEF1、CYC1和STpGMAS各50ng加入连接体系：2μL 10×T4DNA LigaseReaction Buffer(NEB公司)、1μL T4DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物；
取1μL连接产物加入PCR体系(Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HFBuffer试剂盒，NEB公司)：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、 DNA模板20ng、加入表3引物Sac11-TEF1和CYC1-Sac11(10μM)各1.5μL、Phusion High-FidelityDNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件 为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸 1.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。得到2456bp的PCR扩增产物。
将扩增产物纯化，然后用SacII酶切，割胶回收目的片段 SacII-TEF1-STpGMAS-CYC1-SacII，备用。
用SacII分别酶切质粒pRS313(Sikorski,R.S.and Hieter,P.1989,Genetics 122(1):19-27)和pRS425(Sikorski,R.S.and Hieter,P.1989,Genetics 122(1):19-27)，得到4967bp的pRS313载体片段和6849bp的pRS425载体片段；再分别加入4μL NEB buffer、 1μLCIP去磷酸化酶(NEB公司)，补充蒸馏水至40μL，37℃处理1h，加入终浓度 为10μmol的EDTA，65℃30min终止反应，割胶回收pRS313-SacII载体片段和 pRS425-SacII载体片段。
将上述“一、目标基因的制备”步骤所得载体片段pRS313-SacII、pRS425-SacII 分别和SacII-TEF1-STpGMAS-CYC1-SacII各50ng加入连接体系：2μL 10×T4DNA LigaseReaction Buffer(NEB公司)、1μL T4DNA Ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连接产物，转入Trans10感 受态细胞中和测序验证，得到pRS313-HIS3-PTEF1-STpGMAS-TCYC1和pRS425-LEU2 -PTEF1-STpGMAS-TCYC1质粒。
以pRS313-HIS3-PTEF1-STpGMAS-TCYC1质粒为模板，用引物表3中引物，扩增 6692bp质粒骨架pRS313-TEF1-STpGMAS-CYC1；
用pRS425为模板，用引物表3中引物，扩增LEU2(1808bp)。
扩增体系均为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA 模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)； 98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸4分钟(30个循环)；72℃延伸10分 钟(1个循环)。
割胶纯化目的片段。在产物LEU2片段中加入2μL 10×T4DNA Ligase ReactionBuffer(NEB公司)、1μL T4Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至20μL， 37℃磷酸化1h，割胶回收后同pRS313-PTEF1-STpGMAS-TCYC1用T4DNA连接酶(NEB 公司)连接，转化，测序验证后得到质粒：pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1。
表3引物序列
Figure BDA0001455398630000121
5、pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1质粒的构建
以pUC57-SynSmFPS和pUC57-STpGMAS为模板，用表4中引物分别扩增得到1080bpSynSmFPS-GGGS和1704bp GGGS-STpGMAS。
扩增体系均为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA 模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)； 98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸10分 钟(1个循环)。
对SynSmFPS-GGGS和GGGS-STpGMAS共同作为模板，用表4中引物 (SexA1-SynSmFPS和STpGMAS-Asc1)扩增得到2767bp SynSmFPS-GGGS-STpGMAS片段。
扩增体系均为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA 模板SynSmFPS-GGGS和GGGS-STpGMAS各20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-FidelityDNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件 为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸 2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将扩增产物纯化，然后用SexA1和Asc1酶切，割胶回收目的片段 SexA1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-Asc1(2760bp)，备用。
将前述第“4”项中所构建质粒pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1用SexA1和 Asc1酶切，割胶回收7602bp大片段，得到载体pRS425-LEU2-PTEF1-...-TCYC1；将载体 pRS425-LEU2-PTEF1-...-TCYC1与SexA1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-Asc1各50ng加入 连接体系：2μL 10×T4DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μLT4DNA Ligase (NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时 得到连接产物，转入Trans10感受态细胞中，提取质粒测序验证，得到 pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1质粒。
表4引物序列
Figure RE-GDA0001623347860000131
6、pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1质粒的构建
用BamH1(购自TaKaRa公司)和SexA1分别对上述“一、目标基因的制备” 得到的MF1和前述第“5”项所构建的质粒 pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1进行双酶切；割胶纯化814bp 目标启动子基因MF1和9898bp载体片段 pRS425-LEU2-...-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1，并将二者加入连接体系(各 50ng)：2μL10×T4DNA Ligase ReactionBuffer(NEB公司)、1μL T4DNA Ligase(NEB 公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μL，室温反应2小时得到连 接产物，转化Trans10感受态细胞中，提取质粒测序验证，将得到的序列正确的质粒 命名为pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1。
7、.pM2-ERG20-GGGS-LsLTC2质粒的构建
对ERG20-GGGS和GGGS-LsLTC2共同作为模板，用表5中引物(SexA1-ERG20 和LsLTC2-Asc1)扩增得到约2744bp ERG20-GGGS-LsLTC2片段。
扩增体系均为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA 模板ERG20-GGGS和GGGS-LsLTC2各20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件 为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸 2分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
将扩增产物纯化，然后用SexA1和Asc1酶切，割胶回收目的片段SexA1- ERG20-GGGS-LsLTC2-Asc1(约2744bp)，然后将其与载体与质粒pM2-tH MG1酶切 后骨架连接，得到重组质粒pM2-ERG20-GGGS-LsLTC2。
表5引物序列
Figure BDA0001455398630000141
8、pEASY-NDT80-HIS3质粒的构建
分别以NK2-SQ的基因组DNA和pRS313模板，用引物表6中引物，扩增得到1252bpNDT80(SEQ ID NO.13)和1168bp HIS3(SEQ ID NO.14)。
扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模 板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)； 98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸10分 钟(1个循环)。
将扩增产物NDT80克隆到pEASY-Blunt Simple克隆载体(pEASY克隆载体，北 京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)转化Trans10感受态细胞中，提取质 粒测序验证，得到质粒pEASY-NDT80。
表6引物
Figure BDA0001455398630000151
PmeI(购自NEB(北京)有限公司))酶切pEASY-NDT80，割胶纯化5122bp目的 片段(30ng)，4μL NEB buffer(反应缓冲液，购自NEB(北京)有限公司)、1μL CIP 去磷酸化酶(NEB公司)，补充蒸馏水至40μL，37℃处理1h，加入终浓度为10μmol 的EDTA，65℃30min终止反应，割胶回收5122bp目的片段pEASY-NDT80，备用。
割胶纯化HIS3(30ng)，加入4μL 10×T4DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μL T4Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至40μL，37℃磷酸化1h，割 胶回收后，与pEASY-NDT80用T4DNA连接酶连接(NEB公司)，转化Trans10感受 态细胞，测序验证，得到质粒pEASY-NDT80-HIS3。
上述构建的各质粒信息如下表7所示：
表7质粒信息
Figure BDA0001455398630000152
Figure BDA0001455398630000161
9、pEASY-rDNA-TRP1质粒的构建
分别以NK2-SQ的基因组DNA和pRS314(Sikorski,R.S.and Hieter,P.1989,Genetics 122(1):19-27)模板，用引物表8中引物，扩增得到约rDNA(SEQ ID NO.9)和TRP1(SEQ ID NO.10)。
扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA模 板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)； 98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸10分 钟(1个循环)。
将扩增产物rDNA克隆到pEASY-Blunt Simple克隆载体转化Trans10感受态细胞中，提取质粒测序验证，得到质粒pEASY-rDNA。
表8引物
Figure BDA0001455398630000162
PmeI酶切pEASY-rDNA，割胶纯化5122bp目的片段(30ng)，4μL NEB buffer、1μLCIP去磷酸化酶(NEB公司)，补充蒸馏水至40μL，37℃处理1h，加入终浓度为10μmol 的EDTA，65℃30min终止反应，割胶回收5122bp目的片段pEASY-rDNA，备用。
割胶纯化TRP1(30ng)，加入4μL 10×T4DNA Ligase Reaction Buffer(NEB公司)、1μL T4Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至40μL，37℃磷酸化1h，割 胶回收后，与pEASY-rDNA用T4DNA连接酶(NEB公司)连接，转化Trans10感受 态细胞，测序验证，得到质粒pEASY-rDNA-TRP1。
实施例2、重组菌的构建
一、酵母感受态的制备
将出发菌分别于相应培养基(表13)中30℃，250rpm过夜培养，取1ml(OD 约0.6-1.0)分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌 水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mM LiAc(醋 酸锂)；10mM DTT(二硫苏糖醇)；0.6M sorbitol(山梨糖醇)；10mM Tris-HCl(三 羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液，pH 7.5),处理液使用时才加DTT)，25℃下放置20min。 离心，弃上清，菌体中加入1ml 1M sorbitol(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心， 弃上清(用1M sorbitol重悬二次)，到最终体积约为90μL。
二、FPP-001菌株的构建
1、NDT80-HIS3-up,PPGK1-ADH2-TADH1，PTDH3-ACS1-TTPI1，PTEF1-ALD6-TCYC1和 NDT80-HIS3-down的制备
PPGK1-ADH2-TADH1，PTDH3-ACS1-TTPI1，PTEF1-ALD6-TCYC1分别为携带有乙醇脱氢 酶2、乙酰辅酶A合成酶1和乙醛脱氢酶6的表达盒；NDT80-HIS3-up和 NDT80-HIS3-down分别为HIS3的上游同源臂和下游同源臂；分别按照如下方法 扩增片段：
分别用表9描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块：698bpM1 (NDT80-HIS3-up)，2081bp M2(PPGK1-ADH2-TADH1)，3519bp M3 (PTDH3-ACS1-TTPI1)，2376bp M4(PTEF1-ALD6-TCYC1)，1835bp M5 (NDT80-HIS3-down)。
扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、 DNA模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分 钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用2分钟(30 个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。
表9引物
Figure BDA0001455398630000181
Figure BDA0001455398630000191
2、FPP-001菌株的构建
出发菌酿酒酵母NK2-SQ于SD-Ura液体培养基(0.8％酵母选择培养基 SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％His， 0.01％Trp)中过夜培养后制备感受态。然后，加入表9中转化用片段M1，M2，M3， M4和M5共5μg(摩尔比＝1:1:1:1:1)，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加 入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于SD-Ura-His培养基，30℃，培养36h以 上。筛选培养基成分为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-His(北京泛基诺(功能 基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.01％Trp。PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名 为菌株FPP-001。
三、ELE-001和ELE-002菌株的构建
出发菌酿酒酵母FPP-001于SD-Ura-His液体培养基中过夜培养后制备感受态。然后，分别加入质粒pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1和 pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加 入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂布于SD-Ura-His-Leu培养基，30℃，培养36h 以上。筛选培养基成分为：0.8％酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-His(北京泛基诺(功 能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.01％Trp。PCR鉴定出正确的阳性克隆，分 别命名为菌株ELE-001(转入质粒pRS313-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1)和ELE-002 (转入质粒pRS425-LEU2-PTEF1-STpGMAS-TCYC1)。
四、ELE-011菌株的构建
按照上述三中步骤制备FPP-001感受态。然后，加入质粒 pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1，混匀后转移至电转杯中， 2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1Msorbitol，30℃复苏1h，涂布于SD-Ura-His-Leu培养 基30℃，培养36h以上。PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株ELE-011。
五、ELE-012-ELE-019菌株的构建
以pRS425-LEU2-PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1质粒为模板，用表11 的引物分別进行PCR扩增，得到不同引物对应的扩增产物；再分别将不同引物对 应的扩增产物转入酵母FPP-001中进行自身同源重组，分别得到重组菌 ELE-012-ELE-018，使该载体中的融合蛋白SynSmFPS-GGGS-STpGMAS之间的连接 肽GGGS分别替换成3A001、4A001、5A002、6A005、6B004、8A005、12A003 (表10所示)。
以pRS425-LEU2-PMF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1质粒为模板，用表10 中连接肽为8A005的引物(表11)进行PCR扩增，得到不同引物对应的扩增产物； 再分别将不同引物对应的扩增产物转入酵母FPP-001中进行自身同源重组，得到 重组菌ELE-019，使该载体中的融合蛋白SynSmFPS-GGGS-STpGMAS之间的连接 肽GGGS替换成8A005。
表10为连接肽核苷酸序列和氨基酸序列
Figure BDA0001455398630000211
具体反应条件如下：
上述扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1 μL、DNA模板20ng、引物(表11所示)(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为： 98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸 均用5.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。
扩增产物经纯化后，利用Fermentas公司的DpnI酶进行消化处理，其体系为： 5×Fast Digest Green Buffer 4μL，纯化产物34μL，DpnI 2μL。酶切温度和反应时 间分别为37℃和1h，最后割胶回收保存。
表11引物
Figure BDA0001455398630000212
Figure BDA0001455398630000221
按照上述三中步骤制备FPP-001感受态。然后，分别加入上步所得割胶回收产物，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，分 别涂布于SD-Ura-His-Leu培养基30℃，培养36h以上。PCR鉴定出正确的阳性克隆， 分别命名为菌株ELE-012-ELE-019。
六、ELE-020重组菌株的构建
1、PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1，PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS- TCYC1，rDNA-TRP1-up,和rDNA-TRP1-down的制备
PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1和PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1分 别为携带有酵母法尼基焦磷酸合酶与莴苣来源吉玛烯A合酶的融合蛋白和密码子优化 后的丹参来源的的法尼基焦磷酸合酶与密码子优化后的小白菊来源吉玛烯A合酶的融 合蛋白表达盒；rDNA-TRP1-up和rDNA-TRP1-down分别为rDNA的上游同源臂和下 游同源臂；分别按照如下方法扩增片段：
分别用表12描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块：
M1(rDNA-TRP1-up)，
M2(PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1)，
M3(PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1)，
M4(rDNA-TRP1-down)。
扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL、dNTP(10mM each dNTP)1μL、DNA 模板20ng、引物(10μM)各1.5μL、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.5μL、补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)； 98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用2分钟(30个循环)；72℃延伸 10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存。
表12引物
Figure RE-GDA0001623347860000231
Figure BDA0001455398630000241
出发菌酿酒酵母ELE-019于SD-Ura-His-Leu液体培养基中过夜培养后制备感受态。然后，加入表12中转化用片段M1，M2，M3和M4共4μg(摩尔比＝1:1:1:1)， 混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml 1M sorbitol，30℃复苏1h，涂 布于SD-Ura-His-Leu-Trp培养基，30℃，培养36h以上。筛选培养基成分为：0.8％酵 母选择培养基SD-Ura-His-Leu-Trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％ 葡萄糖。PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株ELE-020。
该ELE-020重组菌株于2017年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种 名称：酿酒酵母，拉定名：Saccharomyces cerevisiae，保藏编号：CGMCC No.14829。
上述所有的工程菌株信息如表13所示。
表13工程菌株信息
Figure BDA0001455398630000251
Figure BDA0001455398630000261
实施例3、重组菌在生产β-榄香烯中的应用
1、工程菌培养及产物提取
在相应固体选择培养基SD-Ura-His-Leu中活化实施例2制备的所有酵母工程菌株，于相应液体选择培养基SD-Ura-His-Leu中制备种子液(30℃，250rpm，16h)， 以1％的接种量接种于含15ml相应液体选择培养基的100ml三角瓶中，30℃，250 rpm振荡培养1天，然后加入1.5ml正十二烷，继续震荡培养5天。最后，将三角瓶 中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集有机相备用。
2、β-榄香烯转化及其定性定量分析
1)β-榄香烯转化
将上述有机相样品在通风厨内中经100-380℃(180℃)油浴加热1小时，得到转 化后物质。
2)检测
将转化后物质用正己烷稀释10倍，过有机尼龙膜(0.22μm)，用GC-MS检测。检 测仪器：安捷伦气质联用仪Agilent 7890A/5975C。GC-MS测定条件：进样口温度250℃， 进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0.25mM)；色谱条 件：45℃，1min，10℃/min到300℃保温5min；MS条件：F ull Scan:50-750 amu。用β-榄香烯的标准品进行定性定量，β-榄香烯标准品在中国药品生物制品检 定所购买(货号：100268)。图2为实施例2制备的所有酵母工程菌株生产β-榄香烯 的GC-MS检测图。
结果各工程菌发酵6天时产量如下：
在FPP-001的基础上分别引入低、高拷贝数的STpGMAS，得到工程菌株ELE-001 和ELE-002。其中，ELE-001的β-榄香烯产量达9.3mg/L，ELE-002的β-榄香烯产 量达22.1mg/L；
在FPP-001的基础上引入高拷贝数的融合蛋白基因SynSmFPS-GGGS-STpGMAS，得到工程菌株ELE-011，其β-榄香烯的产量达101.1mg/L；
在FPP-001的基础上分别引入高拷贝数的融合蛋白基因 SynSmFPS-Linker-STpGMAS，得到工程菌株ELE-012-ELE-019(启动子和Linker分别 为TEF1和3A001、TEF1和4A001、TEF1和5A002、TEF1和6A005、TEF1和6B004、 TEF1和8A005、TEF1和12A003、MF1和8A005)。
在ELE-019的基础上重组导入融合蛋白基因PPGK1-ERG20-GGGS-LsLTC2-TADH1和PTEF1-SynSmFPS-GGGS-STpGMAS-TCYC1，得到工程菌株ELE-020。
利用ELE-012-ELE-020菌株制备β-榄香烯的产量分别达2.2mg/L(相对于培养液)、35.5mg/L、110.4mg/L、108.6mg/L、73.6mg/L、109.7mg/L、48.3mg/L、 158.1mg/L和469mg/L。
3、生物反应器发酵培养
1)培养基配置
氯化钙母液：19.2g/L二水氯化钙。
微量金属盐母液：19.1g/L乙二胺四乙酸二钠；10.2g/L七水硫酸锌；0.5g/L四水氯化锰；0.86g/L六水氯化钴；0.78g/L五水硫酸铜；0.56g/L二水钼酸钠；5.12g/L 七水亚硫酸铁。
维他命母液：0.05g/L生物素；0.2g/L对氨基苯甲酸纳；1g/L烟酸；1g/L泛酸钙；1g/L盐酸吡哆醇；1g/L盐酸硫胺素；25g/L肌醇。
种子培养基和发酵培养基：25g/L葡萄糖，15g/L硫酸铵，6.15g/L七水硫酸镁，0.72g/L七水硫酸锌，8g/L磷酸二氢钾，2ml/L氯化钙母液，10ml/L微量金属盐母液； 12ml/L维他命母液，1g/L色氨酸，其余为水。
补料培养基：800g/L葡萄糖，5.125g/L七水硫酸镁，3.5g/L硫酸钾，0.28g/L硫 酸钠，9g/L磷酸二氢钾，1g/L色氨酸，其余为水。
2)工程菌ELE-019发酵
按1方法活化工程菌ELE-019。挑取平板上的单克隆至装有SD-Ura-His-Leu培 养基的试管，30℃，250rpm振荡培养过夜；吸取500μL菌液至装有50ml SD-Ura-His-Leu培养基的250ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养24h；
分别吸取2ml菌液至3个装有100ml种子培养基的1L三角瓶中，30℃，250rpm 振荡培养48h；最后经火焰接种环，将种子液加入含3L发酵培养基的7L发酵罐(德 国Eppendorf公司，型号：
Figure BDA0001455398630000281
320)中。
发酵过程中参数设定值分别为：温度30℃，pH 5.0，溶氧30％，空气流量3-20L/min，搅拌转速300-1000rpm，溶氧与搅拌转速、通气级联。当溶氧值大于60％时， 向发酵罐中加入补料培养基至发酵液中葡萄糖浓度为5g/L。
在发酵结束前3小时，添加10％(相对于培养液体积)的正十二烷，发酵结束后 分离有机相。
按2中转化方法和检测方法处理，并进行定性定量分析，工程菌ELE-019高密度 发酵96小时后能得到2g/L(相对于培养液)β-榄香烯。
符合本发明目的的重组菌，包括但不限于表13中记载的具体实验例，均可按照“3”项下所述的发酵方法进行发酵培养，得到吉玛烯A。
序列表
<110>一种重组菌及其用途
<120>中国科学院天津工业生物技术研究所 中国中医科学院中药研究所
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 808
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gggaagacat gcttaacaag aagatataat tatataatat atatattatt aataataaca 60
tccttactgc agtcctgttg tgggagaaaa tggagagaga ctatgtttcg tatcaattcc 120
taaaatcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagtt aaacaagcac tcgctgttca tttgttttac 180
aagtattcat actctaatag gtcattgagc ttcttttctt gaggagagat ccaatttgaa 240
gtcggaataa gatttgcttt cattagcgta ggcaataatt atgagataaa tggtgcagca 300
ctattaagta gtgtggattt caataatttc cgaattagga ataaatgcgc taaatagaca 360
tcccgttctc tttggtaatc tgcataattc tgatgcaata tccaacaact atttgtgcaa 420
ttatttaaca aaatccaatt aactttccta attagtcctt caatagaaca tctgtattcc 480
ttttttttat gaacaccttc ctaattaggc catcaacgac agtaaatttt gccgaattta 540
atagcttcta ctgaaaaaca gtggaccatg tgaaaagatg catctcattt atcaaacaca 600
taatattcaa gtgagcctta cttcaattgt attgaagtgc aagaaaacca aaaagcaaca 660
acaggttttg gataagtaca tatataagag ggccttttgt tcccatcaaa aatgttactg 720
ttcttacgat tcatttacga ttcaagaata gttcaaacaa gaagattaca aactatcaat 780
ttcatacaca atataaacga ttaaaaga 808
<210> 2
<211> 1071
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
acctggtaaa acaatggcta atttgaatgg tgaatctgct gatttgagag caacattttt 60
gggtgtttac tctgttttga agtcagaatt gttgaatgat ccagcatttg aatggacaga 120
tggttcaaga caatgggttg aaagaatgtt ggattacaac gttccaggtg gtaaattgaa 180
cagaggtttg tctgttattg attcatacaa attgttgaag ggtggtaaag atttgactga 240
tgatgaagtt ttcttggctt ctgcattagg ttggtgtgtt gaatggttac aagcatactt 300
tttggttttg gatgatatca tggataactc acatacaaga agaggtcaac catgttggtt 360
tagagttcca aaagttggta tgatcgcaat taatgatggt atcatcttga gaaatcatat 420
tccaagaatt ttgaagaaac attttagaac taaaccatac tacgttgatt tgttggattt 480
gtttaatgaa gttgaattcc aaacagcttc tggtcaaatg atcgatttga tcactacaat 540
cgaaggtgaa aaggatttgt ctaagtactc attgccattg catagaagaa tcgttcaata 600
caagactgct tattactcat tttacttgcc agttgcttgt gcattgttaa tggcaggtga 660
agatttggaa aaacatccaa cagttaagga tgttttgatt aatatgggta tctatttcca 720
agttcaagat gattacttag attgttttgg tgaaccagaa aagattggta aaatcggtac 780
tgatatcgaa gatttcaagt gttcttggtt ggttgttaaa gcattggaat tgtgtaacga 840
agaacaaaag aaaactttat ttgaacatta tggtaaagaa gatccagctg atgttgcaaa 900
gattaaagtt ttgtacaacg aaattaattt gcaaggtgtt ttcgcagaat tcgaatctaa 960
gtcatacgaa aaattgaatt cttcaattga agctcatcca tctaagtcag ttcaagcagt 1020
tttgaaatca tttttgggta aaatctataa aagacaaaaa taaggcgcgc c 1071
<210> 3
<211> 1701
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
acctggtaaa acaatggcag cagtacaagc aaccacaggt attcaagcaa acacaaaaac 60
ttccgcagaa ccagtaagac cattagccaa tttcccacca tccgtttggg gtgacagatt 120
tttatccttc agtttggaca agagtgaatt cgaaagatac gctatcgcaa tggaaaagcc 180
aaaggaagat gttagaaagt taatcgttga ttctactatg gactcaaacg aaaaattggg 240
tttgatctat tccgttcata gagtcggttt gacatacatg ttcttgcaag aaatagaatc 300
ccaattggat aaattgttta atgaattcag tttgcaagat tacgaagaag tagacttgta 360
cactatctca attaacttcc aagttttcag acacttaggt tacaaattgc cttgtgatgt 420
ttttaaaaag tttaaagacg ctatatccgg tacttttaaa gaatccataa ccagtgatgt 480
tagaggcatg ttgggtttgt acgaaagtgc tcaattgaga attagaggtg aaaagatatt 540
ggatgaagca tccgttttca ttgagggtaa attgaagagt gttgtcaaca cattggaggg 600
taacttggcc caacaagtca agcaatcatt aagaagacca ttccatcagg gtatgcctat 660
ggtagaagca agattgtatt tctctaacta cgaagaagaa tgctcttcac atgattcatt 720
gtttaaatta gcaaagttgc acttcaagta tttggaattg caacaaaagg aagaattgag 780
aatcgtcacc aagtggtaca aggatatgag attccaagaa actacaccat acatcagaga 840
cagagttcct gaaatctact tatggatttt gggtttgtac ttcgaaccaa gatactcttt 900
ggctagaata atcgcaacca agatcacttt gttcttagta gttttggatg acacttatga 960
tgcctacgct acaatcgaag aaatcagatt gttgaccgat gctatgaata agtgggacat 1020
ttctgcaatg gaacaaatcc cagaatacat cagacctttc tacaaggttt tgttggatga 1080
atacgctgaa ataggtaaaa gaatggcaaa ggaaggtaga gccgatactg ttatcgcctc 1140
taaagaagca tttcaagaca ttgcaagagg ttatttggaa gaagccgaat ggacaaactc 1200
tggttatgtt gcatcattcc cagaatacat gaagaatggt ttaatcacct cagcctataa 1260
cgtcatttct aaatcagctt tggtcggtat gggtgaaatt gtatctgaag atgcattagc 1320
ctggtacgaa tcacacccaa agcctttgca agcatctgaa ttgatcagta gattgcaaga 1380
tgacgttatg acttaccaat tcgaaagaga aagaggtcaa tctgctaccg gtgttgatgc 1440
atacatcaag acttacggtg tctcagaaaa gaaagcaatc gatgaattga agatcatgat 1500
cgaaaacgcc tggaaggaca ttaacgaagg ttgtttgaaa ccaagacaag tttctatgga 1560
tttgttagcc cctatattga atttggctag aatgatcgac gtcgtatata gatacgatga 1620
cggttttaca ttcccaggtt ccacattgaa agaatacata aacttgttgt tcgtagattc 1680
cttgccagtc tgaggcgcgc c 1701
<210> 4
<211> 430
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa tgtttctact ccttttttac tcttccagat 60
tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat 120
ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa 180
aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg 240
tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga tttttttctc tttcgatgac ctcccattga 300
tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta 360
ttacaacttt ttttacttct tgctcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt 420
taattacaaa 430
<210> 5
<211> 307
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ccgctgatcc tagagggccg catcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct 60
ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 120
atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 180
ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 240
gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc aagctgcggc cctgcattaa tgaatcggcc 300
aacgcgc 307
<210> 6
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atgtctattc cagaaactca aaaagccatt atcttctacg aatccaacgg caagttggag 60
cataaggata tcccagttcc aaagccaaag cccaacgaat tgttaatcaa cgtcaagtac 120
tctggtgtct gccacaccga tttgcacgct tggcatggtg actggccatt gccaactaag 180
ttaccattag ttggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240
aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300
tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360
acccacgacg gttctttcca agaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420
cctcaaggta ctgacttggc tgaagtcgcg ccaatcttgt gtgctggtat caccgtatac 480
aaggctttga agtctgccaa cttgagagca ggccactggg cggccatttc tggtgctgct 540
ggtggtctag gttctttggc tgttcaatat gctaaggcga tgggttacag agtcttaggt 600
attgatggtg gtccaggaaa ggaagaattg tttacctcgc tcggtggtga agtattcatc 660
gacttcacca aagagaagga cattgttagc gcagtcgtta aggctaccaa cggcggtgcc 720
cacggtatca tcaatgtttc cgtttccgaa gccgctatcg aagcttctac cagatactgt 780
agggcgaacg gtactgttgt cttggttggt ttgccagccg gtgcaaagtg ctcctctgat 840
gtcttcaacc acgttgtcaa gtctatctcc attgtcggct cttacgtggg gaacagagct 900
gataccagag aagccttaga tttctttgcc agaggtctag tcaagtctcc aataaaggta 960
gttggcttat ccagtttacc agaaatttac gaaaagatgg agaagggcca aattgctggt 1020
agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047
<210> 7
<211> 1503
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
atgactaagc tacactttga cactgctgaa ccagtcaaga tcacacttcc aaatggtttg 60
acatacgagc aaccaaccgg tctattcatt aacaacaagt ttatgaaagc tcaagacggt 120
aagacctatc ccgtcgaaga tccttccact gaaaacaccg tttgtgaggt ctcttctgcc 180
accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgacc gtgctttcca cgacactgaa 240
tgggctaccc aagacccaag agaaagaggc cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300
gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360
ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420
gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480
gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540
tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600
acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660
gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720
agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780
tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840
gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900
aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960
gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020
gacaaggcta acttccaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080
tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagttggt 1140
gacaagggtt acttcatcag accaaccgtt ttctacgatg ttaatgaaga catgagaatt 1200
gttaaggaag aaatttttgg accagttgtc actgtcgcaa agttcaagac tttagaagaa 1260
ggtgtcgaaa tggctaacag ctctgaattc ggtctaggtt ctggtatcga aacagaatct 1320
ttgagcacag gtttgaaggt ggccaagatg ttgaaggccg gtaccgtctg gatcaacaca 1380
tacaacgatt ttgactccag agttccattc ggtggtgtta agcaatctgg ttacggtaga 1440
gaaatgggtg aagaagtcta ccatgcatac actgaagtaa aagctgtcag aattaagttg 1500
taa 1503
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<213> Artificial sequence
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ttgaaagcaa aaatgtccca gtctgccgcc actgcgcagc agaagaagga acatgagtat 120
gaacatttga cttcggtcaa gatcgtgcca caacggccca tctcagatag actgcagccc 180
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<211> 1264
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<213> Artificial sequence
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atgagagtag caaacgtaag tctaaaggtt gttttatagt agttaggatg tagaaaatgt 60
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Val His Arg Val Gly Leu Thr Tyr Met Phe Leu Gln Glu Ile Glu Ser
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Gly Tyr Lys Leu Pro Cys Asp Val Phe Lys Lys Phe Lys Asp Ala Ile
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Leu Tyr Glu Ser Ala Gln Leu Arg Ile Arg Gly Glu Lys Ile Leu
165 170 175
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210 215 220
Asn Tyr Glu Glu Glu Cys Ser Ser His Asp Ser Leu Phe Lys Leu Ala
225 230 235 240
Lys Leu His Phe Lys Tyr Leu Glu Leu Gln Gln Lys Glu Glu Leu Arg
245 250 255
Ile Val Thr Lys Trp Tyr Lys Asp Met Arg Phe Gln Glu Thr Thr Pro
260 265 270
Tyr Ile Arg Asp Arg Val Pro Glu Ile Tyr Leu Trp Ile Leu Gly Leu
275 280 285
Tyr Phe Glu Pro Arg Tyr Ser Leu Ala Arg Ile Ile Ala Thr Lys Ile
290 295 300
Thr Leu Phe Leu Val Val Leu Asp Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Ala Thr
305 310 315 320
Ile Glu Glu Ile Arg Leu Leu Thr Asp Ala Met Asn Lys Trp Asp Ile
325 330 335
Ser Ala Met Glu Gln Ile Pro Glu Tyr Ile Arg Pro Phe Tyr Lys Val
340 345 350
Leu Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Ile Gly Lys Arg Met Ala Lys Glu Gly
355 360 365
Arg Ala Asp Thr Val Ile Ala Ser Lys Glu Ala Phe Gln Asp Ile Ala
370 375 380
Arg Gly Tyr Leu Glu Glu Ala Glu Trp Thr Asn Ser Gly Tyr Val Ala
385 390 395 400
Ser Phe Pro Glu Tyr Met Lys Asn Gly Leu Ile Thr Ser Ala Tyr Asn
405 410 415
Val Ile Ser Lys Ser Ala Leu Val Gly Met Gly Glu Ile Val Ser Glu
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435 440 445
Glu Leu Ile Ser Arg Leu Gln Asp Asp Val Met Thr Tyr Gln Phe Glu
450 455 460
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465 470 475 480
Tyr Gly Val Ser Glu Lys Lys Ala Ile Asp Glu Leu Lys Ile Met Ile
485 490 495
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500 505 510
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Leu Lys Glu Tyr Ile Asn Leu Leu Phe Val Asp Ser Leu Pro Val
545 550 555
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<212> PRT
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Met Ala Ala Val Asp Thr Asn Ala Thr Ile Gln Glu Lys Thr Thr Ala
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Glu Pro Val Arg Pro Leu Ala Asn Phe Pro Pro Ser Val Trp Gly Asp
20 25 30
Arg Phe Leu Ser Phe Thr Leu Asp Asn Ser Glu Leu Glu Gly Tyr Ala
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Arg Leu Gly Leu Thr Tyr Leu Phe Leu Gln Glu Ile Glu Ala Gln Leu
85 90 95
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Leu Tyr Thr Thr Ser Ile Asn Phe Gln Val Phe Arg His Leu Gly Tyr
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Tyr Glu Ser Ser Gln Leu Arg Thr Arg Gly Glu Ser Ile Leu Asp Glu
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Ala Ser Ser Phe Thr Glu Thr Lys Leu Lys Ser Val Val Asn Asn Leu
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Ser Lys Trp Trp Lys Asp Met Arg Phe Gln Glu Thr Thr Pro Tyr Ile
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Arg Asp Arg Val Pro Glu Ile Tyr Leu Trp Ile Leu Gly Leu Tyr Phe
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435 440 445
Ile Ser Arg Leu Gln Asp Asp Val Met Thr Tyr Gln Phe Glu Arg Glu
450 455 460
Arg Gly Gln Ser Ala Thr Gly Val Asp Ala Tyr Ile Lys Thr Tyr Gly
465 470 475 480
Val Ser Glu Lys Glu Ala Ile Asp Glu Leu Lys Ile Met Ile Glu Asn
485 490 495
Ala Trp Lys Asp Ile Asn Glu Gly Cys Leu Lys Pro Arg Glu Val Ser
500 505 510
Met Asp Leu Leu Ala Pro Ile Leu Asn Leu Ala Arg Met Ile Asp Val
515 520 525
Val Tyr Arg Tyr Asp Asp Gly Phe Thr Phe Pro Gly Lys Thr Met Lys
530 535 540
Glu Tyr Ile Thr Leu Leu Phe Val Gly Ser Val Ser Met
545 550 555
<210> 17
<211> 349
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 17
Met Ala Asn Leu Asn Gly Glu Ser Ala Asp Leu Arg Ala Thr Phe Leu
1 5 10 15
Gly Val Tyr Ser Val Leu Lys Ser Glu Leu Leu Asn Asp Pro Ala Phe
20 25 30
Glu Trp Thr Asp Gly Ser Arg Gln Trp Val Glu Arg Met Leu Asp Tyr
35 40 45
Asn Val Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Ile Asp Ser
50 55 60
Tyr Lys Leu Leu Lys Gly Gly Lys Asp Leu Thr Asp Asp Glu Val Phe
65 70 75 80
Leu Ala Ser Ala Leu Gly Trp Cys Val Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe
85 90 95
Leu Val Leu Asp Asp Ile Met Asp Asn Ser His Thr Arg Arg Gly Gln
100 105 110
Pro Cys Trp Phe Arg Val Pro Lys Val Gly Met Ile Ala Ile Asn Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Leu Arg Asn His Ile Pro Arg Ile Leu Lys Lys His Phe
130 135 140
Arg Thr Lys Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Leu Asp Leu Phe Asn Glu Val
145 150 155 160
Glu Phe Gln Thr Ala Ser Gly Gln Met Ile Asp Leu Ile Thr Thr Ile
165 170 175
Glu Gly Glu Lys Asp Leu Ser Lys Tyr Ser Leu Pro Leu His Arg Arg
180 185 190
Ile Val Gln Tyr Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala
195 200 205
Cys Ala Leu Leu Met Ala Gly Glu Asp Leu Glu Lys His Pro Thr Val
210 215 220
Lys Asp Val Leu Ile Asn Met Gly Ile Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp
225 230 235 240
Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Glu Pro Glu Lys Ile Gly Lys Ile Gly Thr
245 250 255
Asp Ile Glu Asp Phe Lys Cys Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu
260 265 270
Leu Cys Asn Glu Glu Gln Lys Lys Thr Leu Phe Glu His Tyr Gly Lys
275 280 285
Glu Asp Pro Ala Asp Val Ala Lys Ile Lys Val Leu Tyr Asn Glu Ile
290 295 300
Asn Leu Gln Gly Val Phe Ala Glu Phe Glu Ser Lys Ser Tyr Glu Lys
305 310 315 320
Leu Asn Ser Ser Ile Glu Ala His Pro Ser Lys Ser Val Gln Ala Val
325 330 335
Leu Lys Ser Phe Leu Gly Lys Ile Tyr Lys Arg Gln Lys
340 345
<210> 18
<211> 352
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 18
Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe
1 5 10 15
Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met
20 25 30
Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr
35 40 45
Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala
50 55 60
Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe
85 90 95
Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln
100 105 110
Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala
195 200 205
Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu
260 265 270
Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly
275 280 285
Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp
290 295 300
Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys
305 310 315 320
Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys
325 330 335
Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys
340 345 350

Claims (18)

1.一种重组菌，为体内含有或表达吉玛烯A合成酶融合蛋白的酵母菌；
所述吉玛烯A合成酶融合蛋白由吉玛烯A合成酶、法尼基焦磷酸合酶和用于连接所述吉玛烯A合成酶和所述法尼基焦磷酸合酶的连接肽组成；
所述酵母菌为提高出发酵母菌中乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的含量和/或活性得到的菌；
所述吉玛烯A合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示；
所述法尼基焦磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：
所述吉玛烯A合成酶的编码核酸为SEQ ID NO.3所示的核酸或SEQ ID NO.12第13-1686位所示的核酸；
所述法尼基焦磷酸合酶的编码核酸为SEQ ID NO.2所示的核酸或SEQ ID NO.11第 1-1056位所示的核酸。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述连接肽选自GGGS、YGQ、PGGH、YRSQI、VIPFIS、FLYLKF、WRFSPKLQ或HHVQESQCISTV。
4.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：
所述体内含有或表达吉玛烯A合成酶融合蛋白为将所述融合蛋白的编码核酸导入所述酵母菌；
所述将融合蛋白的编码核酸导入所述酵母菌为将含有所述融合蛋白的编码核酸表达盒导入所述酵母菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述含有融合蛋白的编码核酸表达盒包括启动子、所述融合蛋白的编码核酸和终止子；
所述启动子选自TEF1或MF1或PGK1；所述终止子为CYC1或ADH1。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述启动子为TEF1，且终止子为CYC1；
或，所述启动子为MF1，且终止子为CYC1；
或，所述启动子为PGK1，且终止子为ADH1。
7.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌还表达标记基因。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述标记基因选自his3或trp1。
9.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：
所述含有融合蛋白的编码核酸表达盒通过表达所述含有融合蛋白的编码核酸表达盒的载体导入所述酵母菌。
10.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述融合蛋白的编码核酸表达盒通过质粒形式和/或整合在染色体的形式导入所述酵母菌。
11.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：
所述提高出发酵母菌中乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的含量和/或活性得到的菌为增加所述出发酵母菌中乙醇脱氢酶的编码核酸、乙醛脱氢酶的编码核酸和乙酰辅酶A合成酶的编码核酸的拷贝数。
12.根据权利要求11所述的重组菌，其特征在于：所述增加出发酵母菌中乙醇脱氢酶的编码核酸、乙醛脱氢酶的编码核酸和乙酰辅酶A合成酶的编码核酸的拷贝数为将乙醇脱氢酶的编码核酸表达盒、乙醛脱氢酶的编码核酸表达盒、乙酰辅酶A合成酶的编码核酸表达盒和另一个所述标记编码核酸采用同源重组导入所述出发酵母菌。
13.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述出发酵母菌为酿酒酵母。
14.权利要求1所述重组菌，为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）CGMCCNo.14829。
15.权利要求1-14中任一所述重组菌在生产β-榄香烯和/或吉玛烯A中的应用。
16.一种生产吉玛烯A的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1-14中任一所述重组菌，得到吉玛烯A。
17.一种生产β-榄香烯的方法，包括如下步骤：
1）发酵权利要求1-14中任一所述重组菌，得到发酵产物；
2）有机溶液萃取所述发酵产物，收集有机相；
3）将所述有机相加热，得到β-榄香烯。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：
所述发酵的方法为：先将所述重组菌在种子培养基中培养获得种子液；再将所述种子液接种到发酵培养基中发酵培养，将所述发酵培养所述产物记作发酵体系；
在所述发酵培养过程中，向所述发酵体系中添加补料培养基；
待所述发酵体系中的溶氧值大于60 %时，向所述发酵体系中加入补料培养基至所述发酵体系中葡萄糖浓度为5 g/L；
每L体积所述种子培养基和所述发酵培养基配方：25 g葡萄糖，15 g硫酸铵，6.15 g七水硫酸镁，0.72 g七水硫酸锌，8 g磷酸二氢钾，2 ml氯化钙母液，10 ml微量金属盐母液；12ml维他命母液，1 g色氨酸，余量为水；
所述氯化钙母液为19.2 g/L二水氯化钙水溶液；
每L体积所述微量金属盐母液的配方：19.1 g乙二胺四乙酸二钠；10.2 g七水硫酸锌；0.5 g四水氯化锰；0.86 g六水氯化钴；0.78 g五水硫酸铜；0.56 g二水钼酸钠；5.12 g七水亚硫酸铁，余量为水；
每L体积维他命母液的配方：0.05 g生物素；0.2 g对氨基苯甲酸纳；1 g烟酸；1 g泛酸钙；1 g盐酸吡哆醇；1 g盐酸硫胺素；25 g肌醇，余量为水；
和/或，每L体积所述补料培养基的配方800 g葡萄糖，5.125 g七水硫酸镁，3.5 g硫酸钾，0.28 g硫酸钠，9 g磷酸二氢钾和1 g色氨酸，余量为水；
所述有机溶剂为正十二烷；
所述加热条件为：100-380 ℃加热1小时。
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