CN1886508B - 来自绿叶刺蕊草的倍半萜合酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及来自植物绿叶刺蕊草(广藿香)的倍半萜合酶，以及其制备方法和用途，在一个实施方式中，本发明提供了含有正如这里所描述的编码至少一种倍半萜合酶的核苷酸序列的核酸。在另外的一个实施方式中，本发明同样提供了倍半萜合酶及其制备方法及使用这些酶的方法。例如，本发明的倍半萜合酶可被用于将焦磷酸法呢酯转化为各种倍半萜，包括绿叶醇，γ-姜黄烯及其它的大根香叶烷型倍半萜。
Description
技术领域
本发明涉及来自植物绿叶刺蕊草(广藿香)的倍半萜合酶，以及其制备方法和用途，在一个实施方式中，本发明提供了含有一个正如这里所描述的编码至少一种倍半萜合酶的核苷酸序列的核酸。在另外的一个实施方式中，本发明同样提供了倍半萜合酶及其制备方法及使用这些酶的方法。例如，本发明的倍半萜合酶可被用于将焦磷酸法呢酯转化为各种倍半萜，包括绿叶醇，γ-姜黄烯及其它的大根香叶烷型倍半萜。
背景技术
萜类化合物或萜类作为一族自然产品发现于大多数的生物体中(细菌，真菌，动物，植物)。萜类化合物由五碳单元(又称为异戊二烯单元)组成，其可以通过在其结构中异戊二烯单元的数量被分类：单萜类(C10)，倍半萜(C15)，二萜类(C20)，三萜类(C30)，四萜类(C40)以及多萜类(Cn)。植物界含有最高多样性的单萜类及倍半萜。
单萜类和倍半萜是结构差异最大的类异戊二烯。它们通常是易挥发性的化合物且主要发现于植物中而且其中对抵抗病原体的入侵及食草动物的攻击，传粉吸引及植物之间的交流起到重要作用。
一些植物，例如芳香类植物及精油类植物，在它们的叶子中累积了大量的单萜类及倍半萜。在这些植物中，萜类经常在位于
叶子及茎表面的专门的解剖学结构，腺香毛簇或分泌腔内进行合成及累积。这类植物的典型例子是属于薄荷科的成员例如薰衣草，薄荷，鼠尾草，罗勒，绿叶刺蕊草。
单萜和倍半萜累积植物因为其香味及芬芳特性以及其美容的，医药的及抗微生物的作用为人类所感兴趣数千年。累积在植物中的萜类可以通过各种手段进行提取例如蒸汽蒸馏其可以产生含有浓缩的萜类的所谓的精油，这些自然植物提取物是调料及香料产业上的重要的成分。
许多倍半萜化合物可用于香料制造(例如绿叶醇，努特卡酮，檀香醇，岩兰酮，甜橙醛)且许多可以从植物中进行提取。植物自然提取物的价值及可用性依赖于该植物的丰度，油类的产量以及地理起源。因为其结构的复杂性，通过化学合成单个的萜分子经常受限于制造成本因而不常有化学上及财政上的可行性。最近在了解植物体内萜生物合成的进展及现代生物技术的使用打开了一个新的生产萜分子的机会。萜类生产中生物催化剂的使用需要更清楚地理解萜类的生物合成以及涉及具体的生物合成步骤中的酶的编码基因的分离。
植物中萜类的生物合成已经被深入的进行了研究。对于所有的萜类来说共同的五碳前体是异戊烯焦磷酸酯(IPP)。大多数催化导向IPP的步骤的酶类已经被克隆且被鉴定。两种不同的IPP生物合成途径共存于植物体内。甲羟戊酸途径发现于细胞溶质及内质网中且非甲羟戊酸途径(或称为deoxyxylulose(DXP)途径)发现于质体中。在下一个步骤中，IPP通过异戊二烯基转移酶反复浓缩以形成无环异戊二烯焦磷酸酯萜前体，对每一类萜类来说的前体，例如对于单萜来说为牻牛儿基焦磷酸(GPP)，对于倍半萜来说为焦磷酸法尼酯(FPP)，对于二萜来说为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸
(GGPP)。这些前体作为萜类合酶或环化酶的作用底物，其对于每一类萜是特殊的类，例如，单萜，倍半萜或二萜合酶。萜合酶对合成多步环化进行催化以形成大量的具有不同碳骨架的萜化合物。反应随着二磷酸基团的离子化以形成烯丙位阳离子而开始。所述底物在酶活性位点的控制下然后进行异构化及重排。产物可以是无环状的，或具有一个或多个环的环状物。反应通过碳正离子的脱质子化作用或通过捕获一个水分子而被终止且释放萜烃或醇。一些萜合酶产生一个单一产物但大多数产生多个产物。这些酶负责数量极大的萜骨架。最终，在萜类化合物的生物合成的最后阶段，萜分子经过数个二级酶转换例如羟基化反应，异构化作用，氧化还原作用及酰化作用，导致数万不同萜分子的产生。
本发明涉及编码倍半萜合酶的核酸分子的分离。倍半萜合酶将焦磷酸法呢酯转化为不同的倍半萜骨架。超过300个倍半萜烃及3000个倍半萜化合物已经被鉴别(Joulain，D.，and W.A.倍半萜烃光谱数据集，EB Verlag，Hamburg，1998；Connolly，J.D.，Hill R.A.萜类化合物词典，Vol 1，Chapman and Hall(出版商)，1991)，且许多新的结构每年都在证实。植物界事实上存在着无穷尽的倍半萜合酶，所有这些酶使用着相同的底物但却具有不同的产物轮廓。
来自不同植物来源的数个编码倍半萜合酶的cDNA或基因已经被克隆且鉴定，例如5-表-马兜铃烯(5-epi-aristolochene)合酶，其来自烟草(Facchini，P.J.and Chappell，J.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，11088-11092.)以及来自辣椒(Back，K.，等(1998)Plant CellPhysiol.39(9)，899-904)，一种来自埃及莨菪的vetispiradiene合酶(Back，K.and Chappell，J.(1995)J.Biol.Chem.270(13)，7375-7381)，来自欧薄荷及香橙(Citrus junos)的(E)-β-法呢烯合酶(Crock，J.，等
(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 94(24)，12833-12838；Maruyama等(2001)Biol.Pharm.Bull.24(10)，1171-1175)，来自北美冷杉(Abies grandis)的δ-蛇床烯合酶及γ-葎草烯合酶(Steele，C.L.，等(1998)J.Biol.Chem.273(4)，2078-2089)，来自亚洲棉(Gossypium arboretum)的δ-杜松烯合酶(Chen，X.Y.，等(1995)Arch.Biochem.Biophys.324(2)，255-266；Chen，X.Y.，等(1996)J.NatProd.59，944-951.)，来自北美冷杉的E-α-红没药烯合酶(Bohlmann，J.，等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(12)，6756-6761.)，来自番茄的大根香叶烯C合酶(Colby，S.M.，等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)，2216-2221.)，来自黄花蒿的表-雪松醇合酶及紫穗槐-4，11-二烯合酶(Mercke，P.，等(1999)Arch.Biochem.Biophys.369(2)，213-222；Mercke，P.，等(2000)Arch.Biochem.Biophys.381(2)，173-180.)，来自番茄的大根香叶烯D合酶(van der Hoeven，R.S.，Monforte，A.J.，Breeden D.，Tanksley，S.D.，and Steffens J.C.(2000)The Plan cell 12，2283-2294)及来自莴苣(Lactuca sativa)，菊苣(Cichorium intybus)及加拿大一枝黄花(Solidago Canadensis)的大根香叶烯A合酶(Bennett，M.H.，等(2002)Phytochem.60，255-261；Bouwmeester，H.J.，等(2002)Plant Physiol.129(1)，134-144；Prosser 1，等(2002)Phytochem.60，691-702)。
本发明的一个实施方式涉及到从植物绿叶刺蕊草中分离编码倍半萜合酶的核酸的方法。绿叶油是一种香料原材料其可以通过蒸汽蒸馏来自植物广藿香(绿叶刺蕊草)(一种生活在热带地区的薄荷科植物)的叶子而获得。这种油类，其具有可持续很长时间的有木香，壤香或类似樟脑香型的怡人的气味，大量应用于香料制造中。在植物绿叶刺蕊草中生物合成及储存这种油类与解剖学上专门的结构相关：发现于叶子表面或在整个植物的内部结构的腺结
构。油类的生物合成发生于叶子发育的早期阶段(Henderson，W.，Hart，J.W.，How，P，and Judge J.(1969)Phytochem.9，1219-1228)。这种油中富含倍半萜。倍半萜绿叶醇(图1)是主要成分(5至40％)且被认为对典型的香型起相当大的作用。
在绿叶刺蕊草(广藿香)的叶子中的绿叶醇的生物合成已经被研究且阐明。Croteau及其同伴使用绿叶刺蕊草叶子的提取物研究了绿叶醇的生物合成的机理并完成了绿叶醇合酶的纯化及鉴定(Croteau等(1987)Arch.Biochem.Biophys.256(1)，56-68；Munckand Croteau(1990)Arch.Biochem.Biophys.282(1)，55-64)。单一的倍半萜合酶负责从焦磷酸法呢酯生物合成绿叶醇。来自绿叶刺蕊草的绿叶醇合酶是一个多产物酶，其合成绿叶醇作为主要产品及一些二级产品包括α-布藜烯，α-愈创木烯，α-绿叶烯，β-绿叶烯(图1)(Croteau等(1987)Arch.Biochem.Biophys.256(1)，56-68；Munckand Croteau(1990)Arch.Biochem.Biophys.282(1)，55-64)。化学合成绿叶醇及结构相关化合物涉及到大量的步骤，因此其没有商业上感兴趣的化学合成过程。因此，生产绿叶醇的生化途径应该是最感兴趣的。设计绿叶醇生产的生化途径需要分离编码绿叶醇合酶的基因。
本发明的一个实施方式提供了分离自绿叶刺蕊草叶子且编码倍半萜合酶的核酸。本发明的另一个实施方式涉及到使用本发明的分离的核酸转化细菌，包括产生最终的重组的倍半萜合酶。例如，本发明的一个实施方式就涉及到使用重组的倍半萜合酶以产生倍半萜的混合物，其中绿叶醇是主要产品。本发明的其它的实施方式涉及到使用另外的重组的倍半萜合酶以产生γ-姜黄烯作为主要产品，及其它的重组倍半萜合酶以产生大根香叶烷型倍半萜(图1)。本发明的另外的实施方式涉及到体内使用倍半萜合酶以
产生至少一种萜类化合物，例如绿叶醇。
发明内容
在一个实施方式中，本发明涉及到编码倍半萜合酶的分离的核酸。正如这里所使用的，倍半萜合酶也可以指该酶通过与无环焦磷酸酯萜前体例如焦磷酸法呢酯接触所产生的至少一种化合物。在一个实施方式中其是所产生的主要产品。例如，能产生绿叶醇的倍半萜合酶是其中一种产品，例如，该主要产品可以是指绿叶醇合酶。按照常规，涉及到本发明的核酸的实施例包括编码γ-姜黄烯合酶(PatTpsA)的cDNA(SEQ ID NO：1)；编码(-)-大根香叶烯D合酶(PatTpsBF2)的cDNA(SEQ ID NO：2)；编码(+)-大根香叶烯A合酶(PatTpsCF2)的cDNA(SEQ ID NO：3)；及编码另一个(-)-大根香叶烯D合酶(PatTpsB 15)的cDNA(SEQ ID NO：4)；及编码绿叶醇合酶(PatTps 177)的cDNA(SEQ ID NO：5)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种编码绿叶醇合酶的分离的核酸。
在另一个实施方式中，提供了一种编码γ-姜黄烯合酶的分离的核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的核酸，其选自：(a)包含实质上如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的核酸；(b)编码实质上如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10所示的多肽的核酸；及(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)的核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶的活性。在一个实施方式中，限定的条件是中度严谨条件且在另一个实施方式中所限定的条件是高度严谨条件。其它的实施
方式包括：由本发明的核酸所编码的多肽或获自制备一种编码改进的倍半萜合酶的核酸的方法的多肽；包含本发明核酸的宿主细胞；经修饰已包含本发明核酸的非人生物体；及产生多肽的方法，包含培养本发明的宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明提供了一种分离的绿叶醇合酶。在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的γ-姜黄烯合酶。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种含有至少一种本发明所述核酸的载体。
而在另一个实施方式中，本发明提供了制备一种编码改进的倍半萜合酶的核酸的方法。
其它的实施方式包括，制备重组宿主细胞的方法，包含将本发明的载体导入宿主细胞。
在一个实施方式中，本发明提供了一种制备至少一种倍半萜合酶的方法，包括在有助于生产至少一种倍半萜合酶的条件下培养经修饰已含有至少一种核酸序列的宿主细胞，其特征在于所述至少一种核酸是本发明所述的核酸。
在另一个实施方式中本发明提供了一种制备至少一种萜类化合物的方法，包括：A)将至少一种无环焦磷酸酯萜前体与至少一种由本发明所述的核酸编码的多肽接触，以及B)非强制性选择地，分离至少一种在A)中产生的萜类化合物。在一个实施方式中，该方法是在活体内进行的。例如，至少一种合酶产生于活体，例如，一种包含至少一种无环焦磷酸酯萜前体的植物或微生物。优选地，至少一种萜类化合物选自倍半萜。更优选地，该至少一种无环焦磷酸酯萜前体是焦磷酸法呢酯。由本发明所述的方法所产生的倍半萜包括，但并不限于绿叶醇，γ-姜黄烯，及其它的大根香叶型倍半萜(图1)。在一个实施方式中，至少一种萜类化合物是选自γ
-姜黄烯和/或绿叶醇的倍半萜。
应该理解不管是前述的一般描述还是后面的详细描述都是仅仅起到示例及解释作用的，且对本发明主张的权利不起到限制作用。参考文献将被详细描述以示例本发明所述的实施方式。
附图说明
图1：文中所引用的倍半萜分子的结构。
图2：两组倍半萜合酶(SEQ ID NO S 13-24，分别按出现的顺序)的氨基酸序列排列的中央部分，其用于设计倍半萜合酶特异的简并性引物(SEQ ID NO S 25-30，分别按出现的顺序)。每一排列下面的箭头显示可用于设计每一引物及其定向的排列区域。
图3：由3′RACE产品(SEQ ID NOS 31-33，分别按出现的顺序)所推导的氨基酸序列的排列。黑色背景上的白色字母及灰色背景上的黑色字母分别代表来自三组序列中两组的相同或相似的残基。
图4：由5’RACE产品(SEQ ID NOS 34-36，分别按出现的顺序)所推导的氨基酸序列的排列。黑色背景上的白色字母及灰色背景上的黑色字母分别代表来自三组序列中两组的相同或相似的残基。
图5：由本发明所分离的cDNA(SEQ ID NOS 6-10和12，分别按出现的顺序)推导的氨基酸序列的排列。黑色背景上的白色字母及灰色背景上的黑色字母分别表示六组序列中四组的相同或相似的残基。
图6：本发明所分离的cDNA(SEQ ID NOS 1-5和11，分别按出现的顺序)的开放阅读框的核苷酸序列的排列。黑色背景上的白色字母代表六组序列中四组的保守的核苷酸。可被用于设计简并性
引物的区域用箭头在排列下面标记，且引物的名称也被指出。
图7：偶联的气相色谱质谱连用仪(GC-MS)分析由PatTpsA(SEQ ID NO：6)所产生的倍半萜。A：总的离子色谱图。法呢醇峰(保留时间16.15)归于存在于粗蛋白提取物中的大肠杆菌碱性磷酸酶对FPP的水解作用。除了峰1其它的所有峰都是来自培养基的污染物或用于提取的溶剂的污染物。B：峰1的质谱及计算出的保留指数。
图8：偶联的气相色谱质谱连用仪(GC-MS)分析由PatTpsBF2(SEQ ID NO：7)所产生的倍半萜。A：总的离子色谱图。法呢醇峰(保留时间16.16)归于存在于粗蛋白提取物中的大肠杆菌碱性磷酸酶对FPP的水解作用。除了峰1其它的所有峰都是来自培养基的污染物或用于提取的溶剂的污染物。B：峰1的质谱及计算出的保留指数。
图9：偶联的气相色谱质谱连用仪(GC-MS)分析由PatTpsCF2(SEQ ID NO：8)所产生的倍半萜。A：总的离子色谱图。法呢醇峰(保留时间16.16)归于存在于粗蛋白提取物中的大肠杆菌碱性磷酸酶对FPP的水解作用。用号码标记的峰为倍半萜。B，C，D，E：倍半萜被鉴别的峰的质谱及计算出的保留指数。峰5是一个倍半萜烃且峰6是一个倍半萜醇，分子结构参见图1。
图10：偶联的气相色谱质谱连用仪(GC-MS)分析由PatTpsB-15(SEQ ID NO：9)所产生的倍半萜。A：总的离子色谱图。用号码标记的峰为倍半萜。B，C，D，E，F，G：倍半萜被鉴别的峰的质谱及计算出的保留指数。峰4，5，7，8，9及12是倍半萜烃。峰13及14是倍半萜醇。分子结构参见图1。
图11：偶联的气相色谱质谱连用仪(GC-MS)分析由PatTps 177(SEQ ID NO：10)所产生的倍半萜。总的离子色谱图被表示。使用
号码标记的峰是倍半萜。在所标记的峰中(除了峰3，4，11，13及17外)，所有倍半萜均能够被鉴别。
图12：来自偶联的气相色谱质谱连用仪(GC-MS)对由PatTps 177(SEQ ID NO：10)所产生的倍半萜的分析中所挑选的峰的质谱。对于倍半萜被鉴别的每一峰显示出其质谱图、化合物的名称及计算出的保留指数。(-)-绿叶醇(纯化自绿叶油)的权威标准的质谱同样被表示。分子结构参见图1。
图13：PatTpsA(一种γ-姜黄烯合酶)的DNA序列(SEQ ID NO：1)及氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图14：PatTpsBF2(一种(-)-大根香叶烯D合酶)的DNA序列(SEQ ID NO：2)及氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图15：PatTpsCF2(一种(+)-大根香叶烯A合酶)的DNA序列(SEQ ID NO：3)及氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图16：PatTpsB 15(另一(-)-大根香叶烯D合酶)的DNA序列(SEQ ID NO：4)及氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。
图17：PatTps 177(一种绿叶醇合酶)的DNA序列(SEQ ID NO：5)及氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
图18：PatTpsC 16(一种倍半萜合酶)的部分DNA序列(SEQ IDNO：11)及氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。
所使用的缩写
bp 碱基对。
DNA 脱氧核糖核酸。
cDNA 互补DNA。
DTT 二硫苏糖醇。
EDTA 乙二胺四乙酸。
FPP 焦磷酸法呢酯。
IPP 异戊烯焦磷酸。
IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷。
PCR 聚合酶链式反应。
RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应。
3′-/5′-RACE cDNA末端的3′及5′快速扩增。
RNA 核糖核酸。
mRNA 信使核糖核酸。
SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
具体实施方式
萜是一种基于异戊二烯单元(C5H8)的不饱和烃，其可以是无环的也可以是环状的。萜衍生物包括但并不限于樟脑，薄荷醇，萜品醇，龙脑，香叶醇，努特卡酮，雪松醇，以及绿叶醇。萜类或萜类化合物，正如这里所使用到的包括萜类或萜衍生物，其包含这样的化合物，该化合物经过一个或多个诸如羟基化作用、异构化作用、氧化还原反应或酰化作用的功能化作用的步骤。正如这里所使用的，倍半萜是一个基于C15结构的萜，其包括倍半萜及倍半萜衍生物，包括这样的化合物，该化合物经过一个或多个诸如羟基化作用、异构化作用、氧化还原反应或酰化作用的功能化作用的步骤。
正如这里所使用的，衍生物指的是任意获自已知或假定化合物的化合物，且含有母体物质的基本元素。
正如这里所使用到的，倍半萜合酶是催化倍半萜的合成的任意酶。
术语″同一的″，″实质上同一的″或″实质上如所示″意指一个有关的序列其与给定序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，
92％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性。经由实施例，该序列可以是等位基因变体或衍生自不同种类的序列或其可以通过对给定序列的切割，缺失，氨基酸取代或增加而获得。对于多肽，比较序列的长度一般至少为20，30，50，100或更多的氨基酸。对于核酸，比较序列的长度一般至少为50，100，150，300或更多的核苷酸。两个序列之间的百分比同一性由标准排列算法确定，例如基本的局部序列对比工具(BLAST)描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.，48：444-453的算法，或Meyers等(1988)Comput.Appl.Biosci.，4：11-17的算法。
本发明因此在一个实施方式中提供了一个选自如下的分离的核酸：(a)包含实质如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的核酸；(b)编码实质如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的多肽的核酸；以及(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)所述核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶的活性。在一个实施方式中，所限定的条件是中度严谨条件，在另一个实施方式中，所限定的条件是高度严谨条件。
正如这里所使用到的，本发明的一个实施例所描述的酶鉴定实验可以确定本发明的核酸所编码的多肽是否具有倍半萜合酶的活性。
正如这里所使用到的，术语杂交或在确定条件下杂交意指描述的杂交及洗涤的条件，在该条件下具有高度的同一性及相似性的核苷酸序列互相之间结合在一起。这种条件下那些具有至少大约70％，例如至少大约80％以及其至少大约85-90％的同一性的序列保持互相的结合。低度，中度及高度严谨杂交条件的定义在这
里给出。
合适的杂交条件应该为本领域技术人员经过最低限度的实验而选择的，正如Ausubel等(1995)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，第2，4，及6部分中所例示的。此外，严谨条件描述于Sambrook等(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor出版社，第7，9，及11章。正如这里所使用到的，所定义的低度严谨条件如下所述。含有DNA的滤膜在40℃条件下，在含有35％的甲酰胺，5×SSC，50mM Tris-HCI(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，以及500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的溶液中预处理6小时。杂交在具有如下变化的相同的溶液中进行：0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20×106 32P-标记探针。滤膜在40℃条件下在杂交混合液中孵育18-20小时，然后在含有2xSSC，25mM Tris-HCI(pH7.4)，5mM EDTA，以及0.1％SDS的溶液中在55℃条件下洗涤1.5小时。使用新鲜溶液取代洗液然后再在60℃条件下洗涤1.5小时。滤膜被吸干后暴露用于放射自显影。
正如这里所使用到的，所定义的中度严谨条件如下所述。含有DNA的滤膜在50℃条件下，在含有35％的甲酰胺，5×SSC，50mM Tris-HCI(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，以及500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的溶液中预处理7小时。杂交在具有如下变化的相同的溶液中进行：0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20x106 32P-标记探针。滤膜在50℃条件下在杂交混合液中孵育30小时，然后在含有2xSSC，25mM Tris-HCI(pH7.4)，5mM EDTA，以及0.1％SDS的溶液中在55℃条件下洗涤1.5
小时。使用新鲜溶液取代洗液然后再在60℃条件下洗涤1.5小时。滤膜被吸干后暴露用于放射自显影。
正如这里所使用到的，所定义的高度严谨条件如下所述。含有DNA的滤膜的预杂交是在由6xSSC，50mM Tris-HCI(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA及500μg/ml的变性鲑鱼精子DNA组成的缓冲液中在65℃条件下8小时至过夜进行的。滤膜在含有100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA及5-20×106 cpm的32P-标记探针的预杂交的混合液中在65℃条件下杂交48小时。滤膜在含有2xSSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll，及0.01％BSA的溶液中在37℃条件下洗涤1小时。并随后在0.1xSSC的溶液中在50℃条件下洗涤45分钟。其它的低度，中度及高度严谨条件为本领域技术人员所熟知(例如，用于种间杂交的条件)，如果上述条件不合适时其也可以被应用。
在本发明的核酸的一个实施方式中，核酸选自(a)包含有实质如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的核酸；(b)编码实质如SEQ IDNO：10所示的多肽的核酸；以及(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)的核酸杂交的核酸，其中所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶的活性。
在本发明的核酸的另一个实施方式中，核酸选自(a)包含有实质如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸；(b)编码实质如SEQID NO：6所示的多肽的核酸；以及(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)的核酸杂交的核酸，其中所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶的活性。
在一个实施方式中，核酸与核苷酸SEQ ID NO：5和/或1具有至少70％，至少85％，至少90％或至少95％的同一性，优选地，步骤(c)的核酸在中等，更好地是在高度严谨条件下与上述(a)或(b)
的核酸杂交。
优选地，本发明的核酸和/或多肽分离自绿叶刺蕊草(广藿香)。在一个实施方式中，核酸分离自绿叶刺蕊草的叶子。
优选地，本发明的核酸包含SEQ ID NO：5。更优选地，核酸包含SEQ ID NO：10。
在一个具体的实施方式中，发明涉及到某种分离的核苷酸序列，其包括那些实质上无内源材料污染的核苷酸。术语″核酸″或″核酸分子″指的是单链形式或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，而且除非另外的限制，其包括已知的天然核苷酸的类似物，其与天然核苷酸具有类似的功能。″核苷酸序列″同样也指一个以分离片段形式出现的或以一个大的核酸的一个组分出现的多聚核苷酸分子或寡聚核苷酸分子。核苷酸序列或分子同样也可以指一个″核苷酸探针″。本发明的一些核酸分子获自至少一次以实质上纯化的形式分离的DNA或RNA，并且为能够使用标准生化方法鉴别、操控及回收其核苷酸序列组分的数量或浓度。这样的一些方法的实施例，包括这里可被用到的PCR的实验方法，其揭示于Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，由F.A.Ausubel等编辑的Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley及Sons，Inc.(1987)，以及Innis，M.等编辑的PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，AcademicPress(1990)。
正如这里所使用的，本发明的核酸分子包括以单链和双链形式出现的DNA以及与其互补的RNA。DNA包括，例如cDNA，基因组DNA，化学合成DNA，由PCR扩增的DNA，及其组合。基因组DNA，包括翻译区及非翻译区以及控制区，其可以使用传
统技术进行分离例如使用本发明的任意cDNA或其合适的片段作为探针，去鉴别基因组DNA的一部分，其然后可使用本领域已知的方法进行克隆。一般而言，本发明范围内的核酸分子包括在上述杂交及洗涤条件下以及在低于本发明的序列的DNA双螺旋的熔解温度以下5℃，10℃，15℃，20℃，25℃或30℃的条件下(包括在这些条件范围内的任意条件)与本发明的序列杂交的序列。
在另一个实施方式中，本发明的核酸包含一个实质如SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5所示的序列。在一个实施方式中，该核酸与核苷酸序列SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5具有至少70％，至少85％，至少90％，或至少95％的同一性。在一个实施方式中，核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3， SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5。在另一个实施方式中，核酸编码一个具有如实施例的酶法分析所证明倍半萜合酶活性的蛋白。本发明同样提供在不同物种间含有保守区域的核酸。
在另一实施方式中，核酸包含有至少50，100，250，500，或750个SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5的连续核苷酸的连续序列。这些核苷酸的连续片段也可以含有至少一个突变只要突变序列保留有原始序列的功能，且能在低度或高度严谨条件下(例如在中度或高度严谨条件下)与这些核苷酸杂交的能力。这些片段可以是衍生的，例如，来自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，或SEQID NO：5的核苷酸位点(nt)200至nt1600，从nt800至nt1600，从nt1000至nt1600，从nt200至nt1000，从nt200至nt800，从nt400至nt1600，或从nt400至nt1000。
正如上所述，本发明的核酸所编码的多肽也包含在本发明中。本发明的分离的核酸也可以选自编码实质上如SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10所示多肽的核酸。在一个实施方式中，该多肽具有与SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10至少70％，至少85％，至少90％，或至少95％的同一性。
在一个实施方式中，本发明的多肽包含有如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，该多肽包含有实质如SEQID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ IDNO：10所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，该多肽包含有与SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10至少80％、至少85％的同一性，至少90％或至少95％的同一性的氨基酸序列。在一个实施方式中，该多肽具有倍半萜合酶的活性，正如下述的实施例所描述的酶法分析所证明的那样。
优选的是，多肽是实质如SEQ ID NO：6和/或10所示的多肽。更优选的是，该多肽包含与SEQ ID NO：6和/或10的氨基酸序列具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％的同一性或完全等同的氨基酸序列。
由于遗传密码的简并性，其中超过一个的密码子可以编码相同的氨基酸，所以多个DNA序列可以编码相同的多肽。这种DNA序列的变异体可以获自遗传漂变或人工操纵(例如，在PCR扩增中所发生的或自然序列的人为诱变产品)。本发明因而包含任意可以编码获自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4，或SEQ ID NO：5或其变异体的蛋白的核酸。
自然序列的人为诱变可以使用本领域已知的多种技术进行。
例如，可以应用寡聚核苷酸定点特异性诱变操作程序，尤其是需要诱变一个基因以至于预定限定的核苷酸或密码子通过取代，缺失或插入的方式进行改变。进行这种改变的方法的例子揭示于Walder等(Gene 42：133，1986)；Bauer等。(Gene 37：73，1985)；Craik(BioTechniques，January 12-19，1985)；Smith等。(GeneticEngineering：Principles and Methods，Plenum Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488，1985)；Kunkel等(Methods inEnzymol.154：367，1987)；以及美国专利号Nos.4,518,584及4,737,462。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽。正如这里所使用的，术语″多肽″指的是包含这里所鉴别的氨基酸序列的多肽或肽片段。可选择地，多肽可以以其与本发明所述核苷酸序列编码的任一多肽具有抗原亲缘关系的方式来定义。这样，在一个实施方式中，本发明范围内的多肽以一个与本发明核酸序列编码的任一多肽分享的一个线性或三维的抗原决定部位的氨基酸序列的方式来定义。可以选择的是，本发明范围内的多肽可以被特异性识别本发明的核苷酸序列编码的任一多肽的抗体进行识别。抗体如果与本发明的多肽以大于或等于大约107M-1的Ka值例如大于或等于108M-1进行结合的话其被定义为特异性结合。
这里所述的多肽″变异体″意指一个多肽其与天然多肽具有实质性的同源性，但是却具有与因为一个或多个的核苷酸的缺失，插入或取代而使得本发明的任一核酸序列所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
变异体可以包含有保守性取代的序列，意指一个给定的氨基酸残基被一个具有相似的生理化学特征的残基所取代。保守性取代的例子包括一个脂肪族残基被另一个所取代，例如Ile，Val，Leu，
或Ala的相互取代，或一个极性残基被另一个所取代，例如在Lys及Arg之间的取代；Glu及Asp之间；或Gln与Asn之间的取代。参见Zubay，Biochemistry，Addison-Wesley Pub.Co.，(1983)。这种取代的效果可以通过取代得分矩阵例如如Altschul，(J.Mol.Biol.219：555-65，1991)所述的PAM-120，PAM-200，及PAM-250来进行计算。其它的这种保守性取代，例如，整个具有相似的疏水性的特性的区域的取代，已为大家公知。
天然的肽变异体同样也包含在本发明中。这种变异体的例子为来源于mRNA替代拼接事件的蛋白质或来源于这里所描述的多肽的蛋白水解裂解的蛋白质。因为蛋白水解而产生的变异体包括，例如由于本发明序列所编码的多肽的一个或多个末端氨基酸的蛋白水解去除的原因而在不同种类的宿主细胞中表达的蛋白质的N-末端或C-末端的差异。
本发明的倍半萜合酶的变异体可被用于获得预期的增强或减弱的酶活性，修饰的区域化学或立体化学特征，或改变了的底物的使用或其产物的分布。另外，可以制备变异体使其具有至少一种被修饰了的特性，例如对底物的亲和力提高，产出一个或更多的预期化合物的特异性提高，不同的产物分布，不同的酶活性，酶反应速率升高，在特定环境(pH、温度、溶剂等)中的活性和稳定性增加，或在预期表达系统中的表达水平提高。变异体或定点突变可以通过本领域已知的的方法获得。正如上所述，本发明提供了重组的和非重组的、分离及纯化的多肽，例如来自植物绿叶刺蕊草。天然多肽的变异体和衍生体可以通过分离其它的或相同的植物品系或物种的天然发生的变异体或该变异体的核苷酸序列来获得或通过人工设计编码天然绿叶刺蕊草多肽的核苷酸序列的突变来实现。天然氨基酸序列的改变可以通过许多常规方法中的
任意一种来实现。
因此，本发明提供了一种制备变异功能的倍半萜合酶的方法，该方法包括下述步骤：(a)从包含有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5的组中选择任一核酸，(b)改变核酸序列以获得一个突变的核酸的群，及(c)使用突变的核酸转化宿主细胞以表达多肽，及(d)筛选多肽以获得具有至少一种修饰特性的功能性多肽，修饰特性可以为任一预期的特性，例如上面提到的特性。对选择核酸的改变可以通过诸如随机突变，定点突变或DNA重排等来实现。例如，改变可以是至少一个点突变，缺失或插入。例如，具有获自重排技术的涉及至少任一SEQ IDNO：1-5的核酸编码的氨基酸序列的多肽，也包含在本发明中。本发明所述实施方式的方法步骤，例如筛选多肽以获得功能性多肽的步骤，对于想常规采纳已知的方法来获取预期的特定的修饰特性的本领域技术人员来说是已知的。
例如，突变可以通过合成含有突变序列的寡聚核苷酸在具体位点引入，然后通过限制性酶切位点使得天然序列片段连接。连接后，产生的重组序列编码一个具有预期氨基酸插入，取代或缺失的类似体。可选择地，寡聚核苷酸定点特异性诱变程序可以被用于提供一个改变的基因，其中预定的密码子可以通过取代，缺失或插入而改变。本发明同样提供了包含获自本发明的核酸改变后的核酸，例如，用于获取一个变异的多肽。
在一个实施方式中，本发明设计：含有本发明核酸的载体。例如，含有至少一种选自下述核酸的载体：(a)包含实质如SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的核酸；(b)编码实质如SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的多肽
的核酸；以及(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)所述核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶的活性。
这里所使用的载体包括任一重组载体，其包含但并不限于病毒载体，噬菌体及质粒。
含有本发明核酸序列的重组表达载体可以使用已知的方法进行制备。在一个实施方式中，表达载体含有一个编码可操作连接至一个适当的转录或翻译调控核苷酸序列(例如那些获自哺乳动物，微生物，病毒，植物或昆虫的基因)的多肽的cDNA序列。调控序列的具体例子包括转录启动子，操纵子，或增强子，mRNA核糖体结合位点以及调控转录及翻译的起始和终止的合适的序列。当调控序列功能性地涉及到本发明的cDNA序列时核苷酸序列是″可操作连接″的。这样，如果启动子核苷酸序列控制cDNA序列的转录时，启动子核苷酸序列就是可操作连接至一个cDNA序列上的。在预期宿主细胞中复制的能力通常由复制起始区给予，经由其转化体被鉴别的所选择的基因此外可以被整合进一个表达载体中去。
此外，与本发明的多肽并不自然关联的编码适当的信号肽的序列可以被整合进表达载体中，例如，编码信号肽(分泌前导肽)的一个DNA序列可以被框内融合进入本发明的核苷酸序列中去，因此本发明的多肽以含有信号肽的融合蛋白起始开始翻译。在目的宿主细胞中有功能的信号肽提高了所表达多肽的胞外分泌。该信号肽可以从分泌自细胞的多肽中切割开。可选择的，信号肽可以适于将多肽导向胞内位置，例如特定的细胞区室或细胞器。
在本发明的多肽的氨基及羧基末端融合附加多肽序列例如可被用于提高多肽的表达，有助于该蛋白的纯化，或在预期的环境及表达系统中提高多肽的酶活性。
在一个实施方式中，本发明包括了一个含有本发明核酸的宿主细胞。本发明另一个实施方式是包括在宿主细胞中导入本发明的载体的制备重组宿主细胞的方法。在进一步的实施方式中，设计了一种包括在产生所述多肽的条件下培养本发明的宿主细胞的生产多肽的方法。在一个实施方式中多肽被回收。本发明的方法包括制备至少一种本发明的倍半萜合酶的方法，其包括培养含有本发明核酸的宿主细胞并回收其所累积的倍半萜合酶。
用于表达本发明多肽的合适的宿主细胞包括原核细胞，酵母，或更高级的真核细胞。例如适宜的宿主细胞是植物细胞。与细菌，真菌，酵母或哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆及表达载体也描述于例如Pouwels等，Cloning Vectors：A LaboratoryManual，Elsevier，New York，(1985)。无细胞翻译系统通过使用获自这里所揭示的DNA构建体的RNA同样可以被应用以产生所公开的多肽。
原核细胞包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，大肠杆菌或杆菌。用于转化的合适的原核宿主细胞包括，例如，大肠杆菌，枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，以及各种其它的假单胞菌，链霉菌，及葡萄球菌属中的种类。在一个原核宿主细胞中，例如在大肠杆菌中，该多肽可以包含一个N-末端的甲硫氨酸残基以使得重组多肽在原核宿主细胞中的表达得以容易进行。N-末端的甲硫氨酸可以从表达的重组多肽中切割开来。
用于原核宿主细胞的有用的表达载体的例子包括那些商业上可获得的质粒例如克隆载体pET质粒(Novagen，Madison，WI，USA)或pBR322(ATCC37017)。pBR322含有氨比西林及四环素抗性基因因而对于鉴别转化细胞提供了一个简单的方法。为了使用pBR322构建一个表达载体，将一个合适的启动子及编码一个或多
个本发明多肽的DNA序列插入到pBR322载体中去。其它的商业上可获得的载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)以及pGEM-1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。其它的商业上可获得的载体包括那些特定为某些蛋白的表达而设计的载体；其包括pMAL-p2及pMAL-c2载体，其用于融合到麦芽糖结合蛋白的蛋白的表达(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。
通常应用于重组原核宿主细胞表达载体的启动子序列包括噬菌体T7启动子(Studier F.W.和Moffatt B.A.，J.Mol.Biol.189：113，1986)，β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖启动子系统(Chang等，Nature 275：615，1978；and Goeddel等，Nature 281：544，1979)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，Nucl.Acids Res.8：4057，1980；和EP-A-36776)，以及tac启动子(Maniatis，MoLecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982)。特定的有用的原核宿主细胞表达系统应用了一个噬菌体λPL启动子及一个c1857ts不耐热的阻抑制蛋白序列。质粒载体可以获自美国典型培养物收集中心(American Type Culture Collection)(″ATCC″)，其掺入了包括质粒pHUB2(存在于大肠杆菌菌株中JMB9(ATCC37092))以及pPLc28(存在于大肠杆菌菌株中RR1(ATCC53082))的PL启动子的衍生体。
本发明的多肽同样可以在酵母宿主细胞中表达，尤其是在酵母属(如酿酒酵母)。其它的酵母属，例如Pichia或克鲁维酵母(例如乳酸克鲁维酵母)，也可以被用到。酵母载体通常含有一个获自2μ酵母质粒的复制序列起始位点，一个自主复制序列(ARS)，一个启动子区，用于多聚腺苷酸化的序列，用于转录终止的序列，及一个可选择标记基因。用于酵母载体的合适的启动子序列包括，
在其它当中的，金属巯基组氨酸三甲基内盐启动子，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255：2073，1980)，或其它的糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7：149，1968；和Holland等，Biochem.17：4900，1978)，例如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶以及葡萄糖激酶。其它的应用于酵母表达的合适的载体及启动子进一步描述于Hitzeman，EPA-73，657或Fleer等，Gene，107：285-195(1991)；以及van den Berg等，Bio/Technology，8：135-139(1990)。其它可选择的是葡萄糖可抑制性ADH2启动子描述于Russell等(J.Biol.Chem.258：2674，1982)及Beier等(Nature 300：724，1982)。可以在酵母及大肠杆菌中进行复制的穿梭载体通过插入一个获自pBR3 22的用于在大肠杆菌中进行选择及复制的DNA序列(Ampr基因及复制起始位点)进入上述的酵母载体中而构建。
本发明的一个实施方式是经修饰含有本发明核酸的非人有机体。该非人有机体和/或宿主细胞可以通过任一本领域已知的基因转移方法进行修饰，例如，诸如脂质及病毒载体，裸露DNA，电穿孔技术，化学方法以及粒子介导的基因转移等传递方法的使用。在一个实施方式中，非人有机体是植物，昆虫或微生物。
例如，在一个实施方式中，本发明提供了一种制备至少一种倍半萜合酶的方法，其包括在有助于生产至少一种倍半萜合酶的条件下培养经修饰含有至少一种核酸的宿主细胞，其中所述至少一种核酸选自(a)包含实质如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的核酸；(b)编码实质如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID
NO：4或SEQ ID NO：5所示的多肽的核酸；以及(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)所述核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶的活性。
在进一步的实施方式中，宿主指的是植物例如烟草或绿叶刺蕊草，动物或微生物也包括但并不限于细菌细胞，酵母细胞，植物细胞及动物细胞。正如这里所使用的，植物细胞及动物细胞包括那些作为宿主的植物及动物。例如，在本发明的一些实施方式中，在经遗传修饰的非人有机体中进行表达。
例如，哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统也可被用于表达本发明的重组多肽。这种宿主细胞培养系统，如同将DNA导入哺乳动物或昆虫细胞的方法一样为本领域技术人员所公知。
相似地，用于哺乳动物宿主细胞表达载体的转录及翻译控制序列也已被广泛报道，例如，其可以切割自病毒基因组。
本领域已知有若干方法可以制造转基因植物。其包括但并不限于：植物原生质体的电穿孔技术，脂质体介导的转化，土壤杆菌介导的转化，聚乙二醇介导的转化。植物细胞的显微注射，以及使用病毒的转化。在一个实施方式中，使用粒子轰击而直接进行基因转移。在另一个实施方式中，使用土壤杆菌介导的转化。
通过粒子轰击而直接进行基因转移给出了一个转化植物组织的例子。在这种技术中，一个粒子，或一个包覆有DNA的微弹可以射穿细胞的物理屏障。粒子轰击可被用于将DNA导入任一其可以被DNA包覆的颗粒穿透的目标组织中，但是对于稳定的转化来说，必须使用可再生的细胞。典型的为使用金或钨制备的颗粒。使用本领域已知的技术例如CaCl2或者乙醇沉淀法将DNA包覆在颗粒上。
DNA包覆颗粒可以通过粒子枪来射出。合适的粒子枪可以购
买自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA)。通过调整参数例如爆炸性爆发的强度，颗粒的大小，以及颗粒必经的到达目标组织的距离来控制粒子的穿透。
用于包覆颗粒的DNA可以包含有适于驱动相关基因表达的表达盒，其含有一个启动子可操作连接至相关基因上。
通过粒子轰击所进行的直接基因转移技术的方法揭示于美国专利号5,990,387(Tomes等)。
在一个实施方式中，本发明的cDNA可以以如此途径被表达，其产生一个正义或反义的RNA。反义RNA指的是具有与为基因所编码的mRNA(正义RNA)的反式互补的序列的RNA。驱动反义RNA表达的载体为那些其中cDNA按照启动子被“反向取代”以至于非编码链(而不是编码链)被转录。反义RNA的表达可被用于下调为与反义RNA互补的mRNA所编码的蛋白的表达。如上所述产生反义RNA的载体可被用于制造转基因植物。
在一个实施方式中，转染DNA被整合进入一个非人有机体的染色体上以至于产生一个稳定的重组体系统。本领域已知的任意的染色体整合方法可被用于本发明的颗粒，包括但并不限于重组酶介导的盒交换(RMCE)，病毒位点特异性染色体插入，腺病毒及原核注射。
本发明的另一个实施方式包括使用本发明的核苷酸及多肽制备萜类化合物及倍半萜化合物的方法。实施例包括制备至少一种萜类化合物的方法，其包括将由本发明核酸编码的至少一种多肽与至少一种无环焦磷酸酯萜前体接触，优选的，该核酸选自(a)包含实质如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO ：4，或SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的核酸；(b)编码实质如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ
ID NO：10所示的多肽的核酸；以及(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)所述核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶的活性；且分离所产生的至少一种萜类化合物。另一个实施例是制备至少一种萜类化合物的方法，其包括将至少一种无环焦磷酸酯萜前体与至少一种实质如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示多肽接触，并分离所产生的至少一种萜类化合物。
正如这里所使用的，一种无环焦磷酸酯萜前体可以是任一的无环焦磷酸酯化合物，其为产生至少一种的包括但并不限于牻牛儿醇焦磷酸(GPP)，焦磷酸法呢酯(FPP)及牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的萜的前体。
在一个实施方式中，至少一种萜类化合物选自倍半萜。在一个实施方式中，至少一种无环焦磷酸酯萜前体是焦磷酸法呢酯。在进一步的实施方式中，至少一种倍半萜选自绿叶醇，γ-姜黄烯及其它的大根香叶型倍半萜，显示于图1-12中。本发明的萜类化合物可以以本领域所惯用的任一方法包括但并不限于色谱，提取及蒸馏等进行分离。
在一个实施方式中，产物的分配及实际上形成的产物可以通过调整合酶接触无环焦磷酸酯萜前体例如焦磷酸法呢酯时的pH值而改变。在一个实施方式中，pH为7。在进一步的实施方式中该pH值小于7，例如6，5，4，及3。
同样在本发明实践范围内的是一个有机体(例如微生物或植物)其可被用于构建一个倍半萜合酶(例如FPP)的作用底物的高水平生产的平台以及将本发明的核酸导入一个有机物中去。例如，至少一种编码倍半萜合酶的本发明的核酸被整合进产生FPP的非人有机体中进而影响FPP向倍半萜的转换和倍半萜进一步的代谢
产物。在一个实施方式中，结果产生倍半萜高水平生产的平台。
在一个实施方式中，本发明的核酸被用于产生其它的编码倍半萜合酶的核酸。例如，本发明提供了一种鉴别倍半萜合酶的方法，其包括使用本发明的核酸构建一个DNA文库，在该文库中筛选可以编码至少一种倍半萜合酶的核酸。使用本发明的核酸的DNA文库可以通过本领域已知的步骤进行构建，其中使用本发明的核酸作为起始点包括但并不限于DNA重排的方法构建DNA序列。在这样的一个方法中，使用功能性测试手段在该文库中筛选以发现一个可以编码倍半萜合酶的目标核酸。倍半萜合酶的活性可以通过例如这里所述的方法进行分析。在一个实施方式中，高通量筛选可被用于分析所编码的多肽的活性。
正如这里所使用的，一个″核苷酸探针″被定义为一个寡聚核苷酸或多聚核苷酸，其能够与目标核酸的互补序列通过一种或多种的化学键、通过互补碱基对或通过氢键形成而进行结合。如上所述，寡聚核苷酸探针可以包括天然的(例如。A，G，C，或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷，次黄嘌呤核苷等)。此外，核苷酸探针中的碱基可以通过除了磷酸二酯键的其它方式进行连接，只要其并不妨碍杂交即可。这样，寡聚核苷酸探针可以具有并非磷酸二酯键连接的肽键的结合以形成碱基。
″目标核酸″这里指的是可以与核苷酸探针或分子特异性杂交的核酸。探针被设计以确定目标核酸的存在与否以及目标核酸的数量。目标核酸具有与相应的定向该目标的探针的核酸序列互补的序列。正如本领域普通技术人员所认识的那样，探针同样可以包含额外的核酸或其它的部分，例如标签，其可以不与目标特异性杂交。术语”目标核酸”也可以指一个较大的核酸的具体的核苷酸序列，其为探针所定向，或指整个序列(例如，基因或mRNA)。
本领域的普通技术人员可以认识到其在各种条件下完整的用途。
除了操作实施例以外或以其它的方式所表示的那样，说明书及权利要求书中所使用到的各种成分的表达数量，反应条件等等应该被理解为可以通过各种方式通过术语“大约”进行修饰。因此，除非有相反的证据，说明书及权利要求书中所列举的数字参数均是近似值，其根据本发明要求获得的期望特性而进行变化。最起码且并不作为一种对本权利要求范围中的同等的原理的应用的一种限制，每一数字参数应当以惯用的约数方式及有效数字的数目进行解释。
尽管本发明保护范围内所列举的数值范围及参数为近似值。具体实施例中所列的数值也报道得尽可能准确。但是，任意数值中都必然含有因各自测量存在的标准偏差所不可避免地带来的一定误差。下述实施例用于对本发明进行解释但并不限制其范围，所给出的百分比以重量为基础。
除非另外定义，这里所使用的所有科技用语都与本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的具有相同的意思。尽管任何的类似或等同于这里所述的方法或材料也同样可被应用于实施本发明，实施例中的方法和材料也是用于作例证的目的。本申请所提到的所有的出版物都被整合进本发明作为参考以揭示和描述所引用的出版物中相关的方法和/或材料。
此外，提供这里所讨论的出版物仅仅是为那些在本申请申请日之前它们的公开内容。并不是解释说本发明因为这些出版物先发明的原因而不被授权。更进一步，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，其需要被分别予以确认。
应该明确这里及随后的权利要求所使用到的单数形式的″一种″，″和″，及″所述″包括复数的指代，除非上下文明确指出相反
的情况。这样，例如所提到的”一种萜”包括了很多这种萜以及“一种载体”包括一个或多个的载体及其为本领域技术人员所熟知的等同物。
本发明实践中所使用到的方法，技术和/或设计(统称为“方法”)并不局限于整个说明书所引用的这些操作的具体的实施例但却包括了本领域已知的任何用于相同目的的操作。例如，就在宿主细胞中表达DNA序列的方法而言，本发明并不局限于所引用的操作，但包括对于本领域熟练技术人员来说有效的任何以在宿主细胞中表达DNA序列的方法。
下述实施例用于说明本发明但并不限制本发明。
实施例
材料
本发明实施例中所用到的植物广藿香(绿叶刺蕊草)获自一个本地制造商，Le Jardin des Senteurs 
瑞士)，且在Centred′Horticulture de Lullier(Jussy，瑞士)的温室中进行生长及繁殖。其它来源的植物绿叶刺蕊草可被应用于下述实施例中。GC-MS分析植物的叶子显示在所有大小的叶子中都有着较高的绿叶醇的含量。从收集于植物绿叶刺蕊草的各种大小的新鲜的叶子的混合物中提取总RNA及mRNA。
实施例l：分离总RNA及mRNA
从植物绿叶刺蕊草中收集叶子，立即在液氮中冷冻且使用研钵及研棒进行研磨。按照产品制造商的说明使用购买自Invitrogen的ConcertTM Plant RNA Reagent提取总RNA。典型的，平均200μg的总RNA获自1g的研磨组织。RNA的浓度在260nm的OD值下估计。RNA的完整性通过凝胶电泳验证核糖体RNA的带的完整性
来证明。mRNA通过按照制造商的说明使用 
2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen)所进行的寡聚胸苷酸纤维素亲和色谱法而纯化自总RNA。
实施例2：逆转录(RT)-PCR
使用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒以及EppendorfMastercycler梯度热循环仪来进行RT-PCR。典型的反应混合物包括10μl的5X Qiagen OneStep RT-PCR缓冲液，400μM每一dNTP，400nM每一引物，2μl Qiagen OneStep RT-PCR酶混合物，1μl 
核糖核酸酶抑制剂(Promega Co.)以及1μg总RNA，最终的体积50μl。热循环仪条件为：在50℃下30分钟(逆转录作用)；在95℃下15分钟(DNA聚合酶激活)；在94℃下45秒钟、42℃下10秒钟以及72℃下4 5秒钟共40个循环，最后在72℃下10分钟。
PCR产品的大小通过1％的琼脂糖凝胶进行评价。相应于预期尺寸的带从凝胶中切离，并使用 凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化且在 
2.1-TOPO载体中使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆。所插入的DNA片段然后进行DNA测序并与GenBank non-redundant protein database(NCBI)使用BLASTX算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，和Lipman，D.J.(1990)Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215，403-410)进行序列对比。
实施例3：3′-及5′-RACE
对于3′及5′cDNA末端的快速扩增(RACE)来说，连接双链cDNA的接头按照制造商的使用说明通过使用MarathonTM cDNA扩增试剂盒(Clontech)从获自绿叶刺蕊草的叶子的mRNA来制备。具体的cDNA的3′-或5′-末端通过使用基因及接头特异性的寡核苷酸的组合及使用 2聚合酶混合物而进行扩增。典型的
RACE反应混合液包括，最终体积为50μl，5μl10X PCR反应缓冲液(Clontech)，200nM每一dNTP，lμl 
2聚合酶混合物，200μM接头特异性引物(Clontech)，200μM基因特异性引物及5μl的50到250倍稀释的cDNA。扩增在一个Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪中进行。该热循环仪的条件如下：在94℃下1分钟，在94℃下30秒及在72℃下2-4分钟进行5个循环，在94℃下30秒及在70℃下2-4分钟进行5个循环，在94℃下20秒及在68℃下2-4分钟进行20个循环。常规的，使用一个嵌套接头特异性引物(Clontech)及一个嵌套基因特异性引物进行扩增的第二个循环。按照上述描述的方法对扩增产品进行评估，亚克隆及序列分析。
PCR产品的大小通过1％的琼脂糖凝胶进行评价。相应于预期尺寸的带从凝胶中切离，并使用 凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化且在 
2.1-TOPO载体中使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆。所插入的DNA片段然后进行DNA测序并与GenBank non-redundant protein database(NCBI)使用BLASTX算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，和Lipman，D.J.(1990)Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215，403-410)进行序列对比然后与原始的DNA序列进行比对以确保获得有效的DNA序列的重叠区。
实施例4：构建表达质粒
对于倍半萜合酶的功能性表达来说，cDNA在pET11a(Novagen)，pET101(Invitrogen)或pET102(Invitrogen)表达质粒中亚克隆。在这些质粒中，cDNA被放置在在大肠杆菌细胞中控制重组蛋白表达的T7启动子的下游。转化大肠杆菌细胞后，可以通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白的表达。
在pET11a中连接插入子需要使用NdeI及BamHI限制性核酸内切酶。使用设计以在紧挨着起始密码子之前及终止密码子之后引入合适的限制性酶识别位点(NdeI及BamHI)的寡聚核苷酸引物以对插入子进行PCR扩增。纯化扩增后的cDNA，使用合适的限制性酶进行消化并以连接至用相同的酶消化的pET11a质粒上。构建体使用消化及DNA测序以证实。
为了将PatTpsA连接至pET11a上，使用引物PatTpsA Nde及PatTpsA Bam(表1)对cDNA进行PCR扩增以在紧挨着起始密码子之前引入NdeI限制性酶切位点及在紧挨着终止密码子之后引入一个BamHI限制性酶切位点。
pET101及pET102质粒与pET Directional ExpressionKit(Invitrogen)一起使用以允许对PCR产品进行定向克隆而并不需要引入限制性酶切位点(当cDNA在编码区含有亚克隆所必需的限制性酶切位点时是有用的)。为了将cDNA连接至这两个质粒中，使用引物通过PCR扩增插入子，设计以扩增包括起始密码子及终止密码子的cDNA的寡聚核苷酸。按照制造商手册进行连接。通过DNA测序证实构建体。
对于在pET102中连接PatTpsA，该cDNA通过使用引物PatTpsA topo及PatTpsA Stop(表1)进行扩增。对于将PatTpsBF2连接至pET101及pET102中，使用引物PatTpsBF2.1 topo及PatTpsBF2.1 stop(表1)对该cDNA进行PCR扩增。对于扩增在pET101中用于连接的PatTpsCF2，引物PatTpsCF2 topo及PatTpsCF2 stop被用到(表1)。对于扩增在pET101中用于连接的PaTpsB15及PatTps177，引物对PatTpsB15 topo-PatTpsB15 stop及PatTps 177 topo-PatTps 177 stop被分别使用到。
用于表达的cDNA的所有扩增均使用Pfu DNA聚合酶
(Promega)进行，其最终体积为50μl，含有5μl的Pfu DNA聚合酶10X缓冲液，200μM的每一dNTP，0.4μM的每一正向及反向引物，2.9单位的Pfu DNA聚合酶及5μl的100倍稀释的cDNA(使用MarathonTM cDNA扩增试剂盒(Clontech)如本申请所述制备)。热循环条件如下：95℃下2分钟；95℃下30秒、52℃下30秒及在72℃下4分钟共25个循环；及在72℃下10分钟。PCR产品在琼脂糖凝胶中进行纯化并且使用 
凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行提取。
实施例5：倍半萜合酶表达
在一个标准的蛋白表达实验中，含有倍半萜合酶cDNA的表达质粒与空质粒(用作阴性对照)一起转化进入BL21(DE3)或BL21StarTM(DE3)的大肠杆菌细胞(Novagen)中去。使用转化的大肠杆菌单菌落接种5ml LB培养基，在37℃下孵育5-6小时后，培养物被转到一个20℃的培养箱中并放置1小时用于平衡。然后通过加入0.5mM IPTG诱导蛋白表达然后培养物在20℃下过夜培养。第二天，通过离心收集细胞，并在0.5ml提取缓冲液(50mM MOPSO pH7，5mM DTT，10％甘油)中悬浮并超声处理三次30秒钟。细胞碎片通过在18,000g下离心30分钟进行沉淀并回收含有溶解蛋白的上清。倍半萜合酶的表达通过在SDS-PAGE上的蛋白提取物的分离被评价，使用考马斯蓝染色并用获自空质粒转化细胞的蛋白提取物进行对比。
实施例6：酶法分析
酶法分析在聚四氟乙烯密封的玻璃管中进行，其使用50-100μL的蛋白提取物溶于最终体积为1mL的补充有15mMMgCl2及100至250μM FPP(Sigma)的提取缓冲液中。培养基使用1ml的戊烷进行覆盖然后在30℃下过夜培养。回收含有倍半萜的
戊烷相并使用另一体积的戊烷提取培养物。合并的戊烷的部分在氮中浓缩并使用气相色谱法在一个Hewlett-Packard 6890系列的GC系统中使用一个0.25mm内径的30m SPB-1(Supelco)毛细管柱进行分析。载气是氦气其恒流速为1.6ml/min。以不分流方式进样，进样器温度设置在200℃，以7.5℃/min的速率从100℃(0min保持)升温至200℃(0min保持)接着以20℃/min的速率升温至280℃(2min保持)进行程序升温。使用一个火焰离子检测器进行检测。化合物的鉴别基于与权威的标准物质(当可获得时)的保留时间相同。对于所鉴别产品的证实，使用装备有一个0.25mm内径的30mSPB-1(Supelco)毛细管柱的Hewlett-Packard 6890 GC-四级质量选择性检测系统的毛细管气相色谱质谱联用分析样品。在氦气恒定流速为1.5ml/min的条件下，以7℃从80℃(0min保持)升温至280℃进行程序升温。在电子倍增器电压为2200V下在70eV记录光谱。酶产物的保留时间与权威的标准物质的保留时间进行比较或者计算Kovats保留指数并与所公开的数据对比(Joulain，D.，和 
W.A.The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons，EBVerlag，Hamburg，1998).
实施例7：使用RT-PCR分离倍半萜合酶cDNA
排列所推导的植物倍半萜合酶的氨基酸序列以鉴别保守区域并设计植物倍半萜合酶特异性寡聚核苷酸。为了获得更好的序列同源性，这些序列被分为两组(图2)。第一组含有的序列来自蕃茄(Lycopersicon esculentum)cv.VFNT cherry(colby，S.M.等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)，2216-2221.)的大根香叶烯C合酶，来自欧薄荷(Mentha x piperita)(Crock，J.等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(24)，12833-12838)的(E)-β-法呢烯合酶，来自北美冷杉(Steele，C.L.等，(1998)J.Biol.Chem.273(4)，2078-
2089)的δ-蛇床烯合酶，来自香橙(Citrus junos)(GenBank accessionno.AF288465)的倍半萜合酶，来自烟草(Nicotiana tabacum)(Facchini，P.J.和Chappell，J.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，11088-11092)及辣椒(Capsicum annuum)(Back，K.等，(1998)Plant Cell Physiol.39(9)，899-904)的5-表-马兜铃烯合酶，来自马铃薯(Solanum tuberosum)及Hyoscyamus muticus(Back，K.和Chappell，J.(1995)J.Biol.Chem.270(13)，7375-7381)的vetispiradiene合酶。第二组含有的序列来自亚洲棉(Chen，X.Y.等，(1995)Arch.Biochem.Biophys.324(2)，255-266)的(+)-δ-小豆蔻烯合酶，来自黄花蒿(Artemisia annua)的紫穗槐-4，11-二烯合酶(Mercke，P.等，(2000)Arch.Biochem.Biophys.381(2)，173-180)以及表-雪松醇合酶(Mercke，P.等，(1999)Arch.Biochem.Biophys.369(2)，213-222)以及来自北美冷杉(Steele，C.L.等，(1998)J.Biol.Chem.273(4)，2078-2089)的γ-葎草烯合酶。最高的序列同源性发现于该序列的中部。含有充分保守的三个氨基酸区域被选择且设计特异于这些区域的简并寡聚核苷酸(也就是说，四个正向(TpsVF1，TpsVF2，TpsCF1，TpCF2)及两个反向引物(TpsVR3，TpsCR3)被推导出)(图2)。
使用这些寡聚核苷酸的几种组合对来自于绿叶刺蕊草叶子的总RNA进行RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)。使用引物组合TpsCF1及TpsCR3的扩增给出了一个具有期望大小(180bp)的扩增子(命名为Pat5)。该片段被纯化及使用相同的引物再扩增。180bp的扩增子(Pat5-10)被纯化，在 
2.1-TOPO质粒(Invitrogen)中亚克隆，并对5个克隆进行测序。其中，一个克隆，Pat5-10-4，具有倍半萜合酶序列相似性且被命名为PatTpsA。
以相似的方式，Pat5片段使用引物TpsCF2及TpsCR3进行再
扩增。其提供了三个克隆(120bp插入子)，Pat8-1-1，Pat8-1-6及Pat8-1-7具有与倍半萜合酶相似的序列。Pat8-1-6及Pat8-1-7具有相同的DNA序列，如同以前获得的克隆Pat5-10-4(PatTpsA)一样。Pat8-1-1具有不同的DNA序列并被命名为PatTpsC。
在另一个实验中，使用引物TpsVF2及TpsCR3，获得具有120bp(Pat8-10-2)的DNA片段，其显示了与倍半萜合酶相似的序列及与前述两种克隆明显的差别。该克隆被命名为PatTpsB。
实施例8：使用5′/3′-RACE分离倍半萜合酶cDNA
为了分离倍半萜合酶的全长序列，一个5′/3′-RACE(cDNA末端的快速扩增)途径被第一次用到。设计特异于三个鉴别的倍半萜合酶序列的正向引物(表1)以及进行3′RACE。具有期望大小的片段获自这三种克隆。序列分析鉴别了来自三种不同克隆的3′半cDNA其被命名为PatA-14，PatB-15及PatC-16(图3)。
为了获得该克隆的另一半(5′末端)，基于这三种序列设计反向引物(每一克隆两个引物；表1)。进行5′RACE且获得三种不同倍半萜合酶的5′末端半长：PatAF2，PatBF2以及PatCF2(图4)。3′RACE产物与5′RACE产物的序列对比显示在PatA-14与PatAF2之间具有100％同一性的序列重叠区(54bp)，因此证实了可以获得PatTpsA的全长序列(图5)。然而，因为其它的四个RACE产物没有重叠区，意味着这两个3′RACE产物及两个5′RACE产物来自于不同的克隆。
在这一阶段，我们具有一个全长的cDNA(PatTpsA)，两个3′末端半长cDNA及两个5′末端半长cDNA。为了获得最后这些克隆的cDNA的全长序列我们设计了特异的引物。首先，设计了特异于PatBF2及PatCF2的正向引物(表1)及进行3′RACE。分析所获得的3′RACE产物的序列显示其有倍半萜合酶的相似性。通过与
PatBF2及PatCF2比较揭示了有足够的序列重叠因而得出结论：已经获得了命名为PatTpsBF2及PatTpsCF2的两个倍半萜合酶的cDNA的全长序列(图5)。以相同的方式，设计特异于PatB-15及PatC-16的新的反向引物(表1)。选择这些与先前所获得的克隆具有最大差别的序列的区域是为了更好扩增PatB-15及PatC-16的cDNA。对PatB-15进行5′RACE并因此获得PatTpsB-15的全长cDNA序列(图5)。而对于PatC-16，5′RACE并未产生预期的DNA片段且这些克隆并未完成。
为了分离新的编码倍半萜合酶的cDNA，基于已经分离自绿叶刺蕊草的叶子的四种倍半萜合酶的编码cDNA的DNA序列设计寡核苷酸。排列来自PatTpsA，PatTpsBF2，PatTpsCF2及PatTpsB15的DNA序列并搜索其保守序列。选择四个区域(图6)及设计两个正向及两个反向简并寡聚核苷酸(表1)。这四个″绿叶刺蕊草倍半萜合酶特异性″引物用于PCR并用作一个制备自绿叶刺蕊草叶子mRNA(Marathon Kit，Clontech)的模板cDNA。分析通过这种途径获得的不同克隆的DNA序列显示，正如同所预期的那样，大多数为已经分离的cDNA片段。但是两个克隆，FID177及FID178其是同一的)，来自于一个新的倍半萜合酶。使用特异性引物Pat177-5R1及Pat177-5R2(表1)所进行的3′RACE及使用特异性引物Pat177-3 R1及Pat177-3R2(表1)所进行的5′RACE给出了该cDNA的全长序列，其被命名为PatTps177。
推导自5个全长的及1个部分的倍半萜合酶的cDNA的氨基酸序列的排列显示于图5中。这些cDNA的核苷酸序列的排列显示于图6，获自这些实验的倍半萜合酶的DNA序列及氨基酸序列显示于图13至18中。
表1：本发明所用到的寡聚核苷酸的名称、序列及描述。SEQ
ID NO S 37-76分别以表1中所示顺序显示。
(V＝A+C+G，D＝A+T+G，B＝T+C+G，H＝A+T+C，W＝A+T，S＝C+G，K＝T+G，M＝A+C，Y＝C+T，R＝A+G)。
表1
| 名称 | 序列(5’至3’) | 描述 |
| PatTpsAF 1 | CCTACCATATATAAGAGACAGCGTGGC GG | 特异于PatTpsA的正向引物 |
| PatTpsAF2 | TGCCTATCTTTGGGCTGTAGCATTATAT TTCG | 特异于PatTpsA的嵌套的正 向引物 |
| PatTpsBF 1 | CATGGGGTTTTATTTTGAACCACAATAT GC | 特异于PatTpsB的正向引物 |
| PatTpsBF2 | GAAATATCTTAGTCAAAGTACAATGTTT GGTGTC | 特异于PatTpsB的嵌套的正 向引物 |
| PatTpsCF 1 | GAGTGTTCCATGAACCCAAGTACTCTC G | 特异于PatTpsC的正向引物 |
| PatTpsCF2 | CTCGTGCCCGTATTATGTTTACTAAAAC C | 特异于PatTpsC的嵌套的正 向引物 |
| PatTpsAR1 | GTAAGAAGTTGAGCTTCTCGAATGGTC GC | 特异于PatTpsA-14的反向引 物 |
| PatTpsAR2 | GGTCGCATAATTATCGTATGTATCATCTA CTCGAG | 特异于PatTpsA-14的嵌套的 反向引物 |
| PatTpsBR1 | TCTAAGCATGAGATACTCCATCTATCAA TGGC | 特异于PatTpsB-15的反向引 物 |
| PatTpsBR2 | CCTTAAAGCACCATATGCATCAAAAGT GTCATC | 特异于PatTpsB-15的嵌套的 反向引物 |
| PatTpsCR1 | CTGGGAGTCCATTAATTTCCTTAATATC CCACC | 特异于PatTpsC-16的反向引 物 |
| PatTpsCR2 | GCCTTGGTGAGAAGATCAAGTTCTTGA AGTG | 特异于PatTpsC-16的嵌套的 反向引物 |
| PatBF23′R1 | AATGTTACCATTTGCTAGACAACGATT GGTG | 特异于PatBF2的正向引物 |
| PatBF23′R2 | GGAGACATACTTCTGGGACGCTGGAGT AG | 特异于PatBF2的嵌套的正向 引物 |
| PatCF23′R1 | GAGTCTTACTTTTGGGCAGTGGGAGTG TACTATC | 特异于PatCF2的正向引物 |
| PatCF23′R2 | CCCAAGTACTCTCGTGCCCGTATTATGC | 特异于PatCF2的嵌套的正向 引物 |
| PatTpsB155R1 | CCATTGGAAGGCTTGTGGGGTGGC | 特异于PatTpsB-15的反向引 物 |
实施例9：酶活性的异源表达及鉴定
为了鉴定全长cDNA已被分离的倍半萜合酶的生化特征，将其cDNA连接至一个合适的表达质粒上。该质粒用于转化大肠杆菌细胞且在表达重组蛋白质后，提取大肠杆菌蛋白然后用于评估FPP向倍半萜化合物的生物化学转换(参见实施例5及6)。
PatTpsA.：PatTpsA cDNA被连接至pET11a表达质粒(实施例5及6)中。在商业上可获得的大肠杆菌株BL21(DE3)中进行异源表达其仅生产少量的功能性的可溶重组蛋白及大量的不溶性蛋白(倍半萜合酶为可溶蛋白且不溶蛋白反映了作为包涵体沉淀的无活性蛋白)。曾进行若干尝试通过慢化蛋白合成以促使蛋白正确折叠以提高可溶性倍半萜合酶蛋白的分数(低温培养，低浓度诱导剂)。没有发现明显的改进。
PatTpsA也被连至pET102质粒，其允许倍半萜合酶作为具有硫氧还蛋白的融合蛋白而表达。硫氧还蛋白促进在蛋白折叠中二硫键的形成。这种形式的融合如显示那样促进表达蛋白的正确的折叠及溶解。使用该体系表达PatTpsA并不促进功能性蛋白的表达。
结果是，对于PatTpsA发现于重组大肠杆菌蛋白提取物的酶活性很低，但是检测到了少量的倍半萜类的生物合成。GC-MS分析及计算保留指数(KI)鉴别γ-姜黄烯作为主要的所产生的倍半萜(图7)。并不排除若干次要的倍半萜类的产生，因为低活性其可能并未被检测出来。
这组成了克隆编码γ-姜黄烯合酶的cDNA的第一份报告。在绿叶油中并未检测到γ-姜黄烯。可能是该化合物存在于较低的浓度或其被转化为其它的化合物。
PatTpsBF2：PatTpsBF2 cDNA被连接至pET101质粒上(实施
例4)。经过转化BL21 StarTM(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen)及诱导表达，仅少量的可溶重组蛋白被检测到。至于PatTpsA，使用pET102质粒进行的表达(与硫氧还蛋白融合表达)并未提高功能性蛋白的表达。倍半萜合酶的活性使用来自表达PatTpsBF2蛋白的大肠杆菌细胞的粗蛋白提取物而检测(图8)。仅一个倍半萜产物，(-)-大根香叶烯D，可被鉴别(使用质谱及保留指数证实)。在绿叶油中从未检测到大根香叶烯D及其可能在植物中存在为一种痕量组份或被转换为一种其它的化合物。大根香叶烯D合酶cDNA以前被分离自番茄(van der Hoeven，R.S.，Monforte，A.J.，BreedenD.，Tanksley，S.D.，and Steffens J.C.(2000)The Plan cell 12，2283-2294)但是，当包括其它的所有的次要产品时，所有的产物的数据图形看上去是不同的。
PatTpsCF2：PatTpsCF2 cDNA被连接在pET101质粒以及使用该构建体转化BL21StarTM(DE3)大肠杆菌细胞。获得相对大量的重组蛋白及很容易检测到倍半萜合酶的活性。使用焦磷酸法呢酯孵育后，几种倍半萜也可使用GC-MS被分离(图9)。主要的峰可被鉴别为(-)-β-榄香烯。该化合物通过(+)-大根香叶烯A在GC的热进样器中的热重排(脂肪烃端烯烃σ迁移)形成。因此PatTpsCF2是一种倍半萜合酶，其产生主要化合物(+)-大根香叶烯A。其它的次要的倍半萜同样被检测到，且其中一些例如4，5-二-表-马兜铃烯，(-)-雅槛蓝烯及α-蛇床烯，被暂时鉴别(图9)。(-)-β-榄香烯被检测为绿叶油分析中的次要产品，意味着(+)-大根香叶烯A存在于油中。大根香叶烯A是一种相对普遍存在于植物种类中的倍半萜。编码大根香叶烯合酶的cDNA分离自若干植物种类包括莴苣，菊苣以及一枝黄(Bennett，M.H.等，(2002)Phytochem.60，255-261；Bouwmeester，H.J.等，(2002)Plant Physiol.129(1)，134-144；
Prosser I等，(2002)Phytochem.60，691-702)。
PatTpsB15：PatTpsB15 cDNA被连接进pET101质粒且转化BL21 StarTM(DE3)大肠杆菌细胞。使用诱导重组倍半萜合酶表达后的大肠杆菌粗蛋白提取物进行酶法分析，显示出FFP较好的新陈代谢。使用GC-MS检测几种倍半萜(图10)。该主要产物被鉴别(通过质谱及保留指数)为(-)-大根香叶烯D。δ-榄香烯，(-)-β-榄香烯(大根香叶烯C及(+)-大根香叶烯A各自的热重排产物)，β-衣兰烯，(E，E)-β-法呢烯及(E，E)-α-法呢烯也可以在通过重组体PatTpsB15形成的次要产品中被鉴别。产生至少八种其它的倍半萜但其结构并不能被清楚确定。PatTpsB15倍半萜合酶具有与PatTpsBF2相似的活性，形成的主要产品为(-)-大根香叶烯D。但当包括所有形成的产物时，这两种酶的催化活性却表现出相当大的差异。
PatTps177：PatTps177 cDNA被连接进pET101质粒中，BL21StarTM(DE3)大肠杆菌细胞被转化且诱导重组倍半萜合酶的表达。使用粗蛋白提取物及FPP作为底物进行的酶法分析显示PatTps177为绿叶醇合酶。该酶所产生的主要产物为(-)-绿叶醇及至少其它的18种倍半萜(图11及12)。由该酶所产生的大多数的倍半萜可以通过GC-MS进行鉴定及GC(火焰离子检测)评估其数量：(-)-绿叶醇(39.1％)，β-绿叶烯(2.1％)，(+)-大根香叶烯A(检测为热重排产品β-榄香烯)(1.6％)，反-β-石竹烯(4.5％)，α-愈创木烯(14％)，塞瑟尔烯(seychellene)(4％)，反-β-法呢烯(3％)，α-葎草烯(1.1％)，α-绿叶烯(8.9％)，(Z，E)-α-法呢烯(1.35％)，γ-绿叶烯(2.5％)，(反)-α-法呢烯(3％)以及α-布藜烯(8.6％)。所有通过重组绿叶醇合酶所产生的倍半萜以近似相同的比例(除了法呢烷倍半萜类以外)发现于绿叶油分析中。重组的绿叶醇合酶的产品图形显示一个单一的倍半萜合酶负责发现于植物绿叶刺蕊草中的主要的及大多数特征的
倍半萜类的生产。
实施例10：绿叶醇的体内生物合成
细菌使用DXP途径以生产本质上起到tRNA异戊二烯化的功能的类异戊二烯，以及生物合成醌及多萜醇。这样，在大肠杆菌细胞中，FPP作为一种中间介质及至少一部分集合体(pool)因这些细胞中表达的倍半萜合酶而可用。
实验在大肠杆菌中进行以测试绿叶醇合酶在体内从内源FPP集合体合成倍半萜类的能力。典型的用于评估体内合成倍半萜的实验如下所述。含有倍半萜合酶cDNA的表达质粒转化进入BL21(DE3)大肠杆菌细胞中。使用转化细胞的单菌落接种补充有合适的抗生素的5ml LB培养基。在37℃下孵育5-6小时后，使用培养物接种补充有合适抗生素的100mlTB培养基，且培养物在一个250ml的摇瓶中在20℃下孵育2小时。经过2小时孵育后，通过加入1mM的IPTG以诱导蛋白表达。培养物放置24小时后直接使用一体积的戊烷提取两次。在进行GC-MS分析之前将这两种溶剂部分进行回收，混合及浓缩至0.5ml。在体内倍半萜生产分析中，表达绿叶醇合酶的大肠杆菌细胞(如实施例9所描述的)产生绿叶醇。通过GC分析提取的培养物应该很清楚地检测到绿叶醇，而使用空质粒转化的细胞没有检测到绿叶醇。产品的鉴定可以通过GC-MS进行证实。但所产生的倍半萜的数量却相对很低，因而估计数值是不大可能实现的。
本实验已经证明绿叶醇合酶能够使用内源的FPP且在体内产生绿叶醇。编码绿叶醇合酶的cDNA可被用于设计体内生产绿叶醇的有机体。
Claims (14)
1.一种编码绿叶醇合酶的分离的核酸，选自：
(a)由SEQ ID NO：5所示核苷酸序列构成的核酸；和
(b)编码SEQ ID NO：10所示多肽的核酸。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于所述核酸分离自绿叶刺蕊草的叶子。
3.一种多肽，由权利要求1或2所述的核酸编码。
4.一种分离的多肽，由SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列构成。
5.包含权利要求1或2所述核酸的载体。
6.如权利要求5所述的载体，其中所述载体是从病毒载体、噬菌体和质粒中选出的。
7.如权利要求5或6所述的载体，其中SEQ ID NO：5所示的核酸可操作地连接至适当的转录或翻译调控核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的载体，其中所述转录或翻译调控核苷酸序列是从转录启动子、操纵子或增强子，mRNA核糖体结合位点，调控转录的起始和终止或调控翻译的起始和终止的适当序列，以及与权利要求3或4的多肽并不自然地关联的适当信号肽中选出的。
9.包含权利要求1或2所述核酸的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞、原核细胞或酵母细胞。
10.经修饰以含有权利要求1或2所述核酸的微生物。
11.一种制备重组宿主细胞的方法，包括将权利要求5～8中任一项所述的载体导入宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞、原核细胞或酵母细胞。
12.一种制备至少一种绿叶醇合酶的方法，包括在有助于生产所述至少一种绿叶醇合酶的条件下培养经修饰以含有至少一种核酸序列的宿主，其特征在于所述至少一种核酸是权利要求1或2所述的核酸，并且所述宿主是微生物、植物或植物细胞。
13.一种在活体内制备绿叶醇的方法，包括将产生焦磷酸法呢酯的微生物、植物或植物细胞转化以含有权利要求1或2所述的核酸，由此引起焦磷酸法呢酯至绿叶醇的转变。
14.如权利要求13所述的方法，进一步包括分离所产生的绿叶醇的步骤。
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