CN116574718B - SoSTPS2在作为倍半萜合酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了SoSTPS2在作为倍半萜合酶中的应用。本发明公开的SoSTPS2来源于紫丁香，为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；A2)将序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有倍半萜合酶活性的蛋白质；A3)来源于紫丁香且与A1)所述蛋白质具有98％以上同一性且具有倍半萜合酶活性的蛋白质。实验证明，本发明的SoSTPS2具有倍半萜合酶活性，可以将法尼基焦磷酸或其盐催化生成佛术烯，本发明的SoSTPS2及其编码基因具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，SoSTPS2在作为倍半萜合酶中的应用。
背景技术
目前已报道的萜类化合物有8万多种，其中倍半萜类化合物是结构多样性最为复杂的一类，目前已发现300多种基本骨架，广泛分布在植物、海洋生物、微生物及昆虫等的组织中，多以酯、醇、酮或苷的形式存在。倍半萜类(Sesquiterpenoids)化合物是由3个异戊二烯单元组成，并具有15个碳原子的一类化合物及其衍生物，大多倍半萜类化合物具有较强的生物活性和重要的生物功能。倍半萜是高沸点芳香精油的主要组成成分，也是导致芳香油香味差异形成的重要化合物。倍半萜在生物体内多种酶参与的一些列次生代谢过程产生复杂的衍生物。倍半萜类物质的研究一直是天然产物化学非常重要的研究领域。
倍半萜类活性成分是植物挥发油的重要组成部分，由3个异戊二烯单元组成，如青蒿素、土木香内酯等。倍半萜类物质的生物合成主要是通过甲羟戊酸途径(Mevalonatepathway，MVA)途径，在法尼基二磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase，FPPS)作用下催化2分子异戊二烯基二焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)与1分子二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)首尾相连生成法尼基焦磷酸(Farnesyldiphosphate，FPP)，在倍半萜合酶(Sesquiterpene synthase)作用下形成倍半萜类基本骨架，并通过CYP450修饰酶的作用下形成复杂多样的倍半萜类活性成分。该过程中涉及3个乙酰CoA，3个乙酰CoA在乙酰乙酰CoA硫解酶(Acetoacetyl-CoA thiolase，ATOT)的作用下生成乙酰乙酰CoA(Acetoacetyl-CoA)，另一个乙酰CoA在羟甲基戊二酰CoA合酶(Hydroxymethyl-glutaryl-CoA synthase，HMGS)和乙酰CoA酰基转移酶的作用下生成3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(3-hydroxy-3-ethylglutaryl CoA，HMG-CoA)，再与羟甲基戊二酰CoA还原酶(Hydroxymethyl-utaryl-CoA reductase，HMGR)的催化下转化为MVA。MVA在甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase，MK)的作用下磷酸化生成甲羟戊酸-5-磷酸(Mevalonate-5-pyosphate，MVAP)，进一步在MVA焦磷酸脱羧酶(Mevalonate pyrophosphatedecarboxylase，MPD)的作用下进行脱羧生成IPP，IPP被异构化酶转化为DMAPP。HMGR是MVA途径的第一个且关键性限速酶。
倍半萜合酶(sesquiterpene synthase)催化法尼基焦磷酸(Farnesylpyrophosphate，FPP)形成倍半萜中间体。倍半萜合酶是萜类合酶的一种，主要存在于被子植物和裸子植物的地上组织中。1992年，从烟草中成功克隆两个倍半萜合酶以来，已在40多种植物中克隆到了倍半萜合酶基因，包括农作物、药用植物、微生物以及拟南芥等模式植物中均有倍半萜合酶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备倍半萜合酶。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于紫丁香(Syringa oblataLindl.)的蛋白质，其名称为SoSTPS2，SoSTPS2为如下A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有倍半萜合酶活性的蛋白质；
A3)来源于紫丁香且与A1)所述蛋白质具有98％以上同一性且具有倍半萜合酶活性的蛋白质；
A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述A2)中的蛋白质，为与SEQ ID No.3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.4所示的DNA分子编码SEQID No.3所示的蛋白质。
本发明还提供了与SoSTPS2相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：
B1)编码SoSTPS2的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，所述核酸分子可为如下1)或2)或3)或4)：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA分子；
2)序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SoSTPS2的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码SoSTPS2的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SoSTPS2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SoSTPS2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SoSTPS2蛋白质且具有SoSTPS2蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％ SDS和1×SSC,0.1％ SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码SoSTPS2蛋白质的核酸分子的表达盒(SoSTPS2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SoSTPS2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动SoSTPS2基因转录的启动子，还可包括终止SoSTPS2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述SoSTPS2基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pMAL-c2X载体。
B3)所述重组载体具体可为pMAL-c2X-SoSTPS2，pMAL-c2X-SoSTPS2为利用BamHI在pMAL-c2X载体中插入SEQ ID No.4所示的SoSTPS2基因得到的重组载体。pMAL-c2X-SoSTPS2能表达序列表中SEQ ID No.3所示的SoSTPS2与MBP形成的融合蛋白质。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌，如大肠杆菌Rosetta(DE3)。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系不包括繁殖材料。
SoSTPS2在作为倍半萜合酶中的应用，也属于本发明的保护范围。
SoSTPS2或所述生物材料在制备倍半萜合酶中的应用，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了具有倍半萜合酶活性的蛋白质的制备方法，所述方法包括将SoSTPS2的编码基因在生物细胞中进行表达得到具有倍半萜合酶活性的蛋白质的步骤；
所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
上述方法中，所述将SoSTPS2的编码基因在生物细胞中进行表达可包括将SoSTPS2的编码基因导入所述生物细胞的步骤。
上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。
SoSTPS2的编码基因可通过含有SoSTPS2的编码基因的重组载体导入所述生物细胞。
上述方法中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
进一步，所述细菌可为大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为大肠杆菌Rosetta(DE3)，所述重组载体可为pMAL-c2X-SoSTPS2。
所述将SoSTPS2的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述重组载体pMAL-c2X-SoSTPS2导入所述大肠杆菌Rosetta(DE3)得到重组大肠杆菌，使SoSTPS2的编码基因在所述重组大肠杆菌中表达得到具有倍半萜合酶活性的蛋白质。
本发明还提供了倍半萜合酶的制备方法，所述方法包括从所述具有倍半萜合酶活性的蛋白质的制备方法得到的具有倍半萜合酶活性的蛋白质中纯化得到倍半萜合酶。
本发明还提供了以法尼基焦磷酸为底物进行催化反应的方法，所述方法包括：以法尼基焦磷酸或其盐为底物用SoSTPS2进行催化反应，实现目的催化反应。
本发明还提供了制备佛术烯的方法，所述方法包括：以法尼基焦磷酸或其盐为底物用SoSTPS2进行催化反应得到含有佛术烯的反应物。
所述催化反应的反应体系可为：将SoSTPS2，法尼基焦磷酸铵盐(FPP，底物)，氯化镁，甘油，DTT(dithiothreitol)与20μL 0.5M HEPES(PH 7.5)缓冲液混合，利用水定容至20μL，其中，FPP、氯化镁、甘油、DTT在反应体系中的浓度分别为50μM、10mM、5％(体积百分比)、1M。
所述催化反应可在30℃下进行，所述反应的时间可为12小时(过夜)。
SoSTPS2或所述生物材料在制备佛术烯中的应用，也属于本发明的保护范围。
SoSTPS2在催化法尼基焦磷酸或其盐生成佛术烯中的应用，也属于本发明的保护范围。
SoSTPS2在以法尼基焦磷酸或其盐为底物进行催化反应中的应用，也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明的SoSTPS2具有倍半萜合酶活性，可以将FPP催化生成佛术烯，本发明的SoSTPS2及其编码基因具有很好的应用前景。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为纯化后蛋白质的检测结果。左图各泳道从左到右依次为：蛋白质分子量标准，MBP(即对照重组菌Rosetta-pMAL-c2X经蛋白表达纯化得到的蛋白质)，MBP-SoSTPS3，MBP，MBP-SoSTPS2，MBP，MBP-SoSTPS1；右图各泳道从左到右依次为蛋白质分子量标准，MBP，MBP-SoSTPS4，MBP，MBP-SoSTPS5。各箭头表示各目标融合蛋白质。图2为MBP-SoSTPS1产物GC-MS图。图3为MBP-SoSTPS1产物质谱图。图4为MBP-SoSTPS2产物GC-MS图。图5为MBP-SoSTPS2产物质谱图。图6为MBP-SoSTPS3产物GC-MS图；Copu2表示Copu2的催化产物，SoSTPS3的产物不同于Copu2。图7为MBP-SoSTPS3产物质谱图。图8为MBP-SoSTPS4产物GC-MS图。图9为MBP-SoSTPS4产物质谱图。图10为MBP-SoSTPS5产物GC-MS图。图11为MBP-SoSTPS5产物保留时间19.26min处质谱图。图12为MBP-SoSTPS5产物保留时间20.96min处质谱图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
法尼基焦磷酸铵盐(Farnesylpyrophosphate ammonium salt，FPP)：Sigma-Aldrich产品。
实施例1、SoSTPS1-5均具有倍半萜合酶活性
本实施例提供了来源于紫丁香(Syringa oblata Lindl.)的5个具有倍半萜合酶活性的蛋白质，记为SoSTPS1-5。SoSTPS1-5的蛋白质序列分别为序列表中SEQ ID No.1、3、5、7、9，其编码基因分别如序列表中SEQ ID No.2、4、6、8、10所示。
一、重组载体的构建
提取紫丁香的心材的总RNA，并反转录为cDNA；以所得cDNA为模板，分别利用表1中的各基因的引物进行基因全长的扩增，得到PCR产物。
表1、全长PCR引物序列
将所得PCR产物分别与克隆载体(即pEASY-Blunt Zero Cloning Kit中载体)(该试剂盒为北京全式金生物科技有限公司产品，目录号CB501)进行连接，分别得到克隆载体1-5。分别以克隆载体1-5为模板，利用带载体序列及酶切位点的无缝克隆引物进行PCR扩增，得到五种PCR产物。使用限制性内切酶BamHI对pMAL-c2X载体进行单酶切，得到线性化载体；将所得线性化载体分别与五种PCR产物进行连接，将得到的序列正确的重组载体分别记为pMAL-c2X-SoSTPS1、pMAL-c2X-SoSTPS2、pMAL-c2X-SoSTPS3、pMAL-c2X-SoSTPS4、pMAL-c2X-SoSTPS5。
pMAL-c2X-SoSTPS1、pMAL-c2X-SoSTPS2、pMAL-c2X-SoSTPS3、pMAL-c2X-SoSTPS4、pMAL-c2X-SoSTPS5的载体特征描述如下：pMAL-c2X-SoSTPS1、pMAL-c2X-SoSTPS2、pMAL-c2X-SoSTPS3、pMAL-c2X-SoSTPS4、pMAL-c2X-SoSTPS5为利用BamHI分别在pMAL-c2X载体中插入SEQ ID No.2、4、6、8、10所示的SoSTPS1-5基因得到的重组载体，分别能表达序列表中SEQ ID No.1、3、5、7、9所示的SoSTPS1-5与MBP形成的融合蛋白质(分别记为MBP-SoSTPS1、MBP-SoSTPS2、MBP-SoSTPS3、MBP-SoSTPS4、MBP-SoSTPS5)，蛋白质的表达由35s驱动。
pMAL-c2X载体序列如下：
二、蛋白质的表达与纯化
将步骤一所得pMAL-c2X-SoSTPS1、pMAL-c2X-SoSTPS2、pMAL-c2X-SoSTPS3、pMAL-c2X-SoSTPS4、pMAL-c2X-SoSTPS5分别导入大肠杆菌Rosetta(DE3)(北京全式金生物科技有限公司)中，分别得到重组菌Rosetta-pMAL-c2X-SoSTPS1、Rosetta-pMAL-c2X-SoSTPS2、Rosetta-pMAL-c2X-SoSTPS3、Rosetta-pMAL-c2X-SoSTPS4、Rosetta-pMAL-c2X-SoSTPS5，将pMAL-c2X载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，得到对照重组菌Rosetta-pMAL-c2X。对各重组菌分别进行蛋白质的表达与纯化，具体步骤如下：
使用含有氨苄青霉素的LB培养基30mL，扩大培养重组菌至浑浊，然后将所得菌液按1：100比例在100mL含有氨苄青霉素的LB培养基中扩大培养至OD600值在0.6至0.8之间，而后加入IPTG至其在培养体系中的浓度为0.4mM，25℃，200rpm，继续培养8h。
培养结束后取出菌液置于50mL圆底离心管中，4℃，4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体；随后向菌体中加入5mL的PBS缓冲液洗沉淀，4℃，4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体；称重沉淀重量，按照5mL/每克菌体比例向菌体中加入Column Buffer(1M Hris-Hcl(PH7.4)20ml，NaCl 11.7g，0.5M EDTA(PH8.0)2ml，dd H2O补足至1L)，再加入DTT至其在菌悬液中的浓度为1mM，将所得菌悬液于冰上超声破碎，30Hz下超声5s，暂停5s，总共10min，至半透明状后在4℃，12000rpm离心15min，收集上清液即为粗蛋白溶液，备用。
取粗蛋白溶液于15mL离心管中，向其中加入Amylose Resin(BioLabs产品，货号为E8021S)与Column Buffer等体积混合液，4℃旋转混合2h，取出后于4℃，500rpm离心3min，弃上清液；向沉淀中加入1mL的Column Buffer，4℃，500rpm离心1min，弃上清液，利用Column Buffer重复洗杂蛋白4-5次，弃上清液；向沉淀中加入200μL的Elution Buffer(麦芽糖0.316g，Column Buffer补足至100mL)，4℃旋转混合1h，然后4℃，500rpm离心3min，所得上清液即为纯化后的蛋白质溶液，即分别得到纯化后的MBP-SoSTPS1、MBP-SoSTPS2、MBP-SoSTPS3、MBP-SoSTPS4、MBP-SoSTPS5、MBP(由对照重组菌Rosetta-pMAL-c2X得到)。标记好-80℃保存，备用。
将各纯化后的蛋白质进行SDS-PAGE，结果如图1所示。结果显示，均得到了比较纯的目的融合蛋白。
三、倍半萜合酶活性的检测
检测步骤二所得融合蛋白MBP-SoSTPS1、MBP-SoSTPS2、MBP-SoSTPS3、MBP-SoSTPS4、MBP-SoSTPS5的倍半萜合酶活性与，以步骤二所得MBP作为对照：
酶促反应体系共200μL，其中步骤二的纯化后的蛋白质溶液100μL，向其中加入法尼基焦磷酸铵盐(FPP，底物)，氯化镁，甘油，DTT(dithiothreitol)与0.5M HEPES(PH 7.5)缓冲液，其中，FPP、氯化镁、甘油、DTT在反应体系中的浓度分别为50μM、10mM、5％(体积百分比)、1M，0.5M HEPES(PH 7.5)缓冲液的添加量为20μL，余量为水。
将上述体系混匀后于上方加300μL正己烷覆盖，防止产物挥发遗失，于30℃水浴反应过夜(12小时)，完成酶促反应。
反应结束后，用600μL正己烷萃取酶促反应产物，吸取上层有机相重复提取三次，合并有机相。氮吹仪吹干，200μL正己烷溶解，使用0.22μm聚四氟乙烯有机滤膜过滤后，进行GC-MS成分测定。GC-MS检测条件：进样体积1μL，在无分流模式下，初始温度50℃，保持2min，以8℃/min的速度升至280℃，保持10min。喷射器温度和离子阱加热温度均为250℃，离子源为EI，电子能量70eV，扫描范围为20-650m/z。
通过GC-MS检测MBP，MBP-SoSTPS1，MBP-SoSTPS2，MBP-SoSTPS3，MBP-SoSTPS4，MBP-SoSTPS5催化FPP后的倍半萜产物。结果显示，对照MBP在17.87min处出现单峰，MBP-SoSTPS1的催化产物在保留时间18.15min处有新的单一产物峰，其与丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)SmSTPS3催化FPP的产物佛术烯的保留时间及质谱峰(X Fang et al.Front PlantSci(2017)，Identification of a Novel(-)-5-Epieremophilene Synthase from Salviamiltiorrhiza via Transcriptome Mining，DOI:10.3389/fpls.2017.00627)一致，由此确定MBP-SoSTPS1可以催化FPP生成佛术烯(-)-5-epieremophilene，图2和图3。
MBP-SoSTPS2的催化产物在保留时间18.15min处有新的单一产物峰，与SoSTPS1及SmSTPS3的催化产物佛术烯的保留时间及质谱峰一致。由此确定MBP-SoSTPS2可以催化FPP生成佛术烯(-)-5-epieremophilene，图4和图5。
MBP-SoSTPS3的催化产物在保留时间17.71min处有新的单一产物峰，对其进行检索，发现其应为Copaane型倍半萜β-Copaene，由此确定MBP-SoSTPS3可以催化FPP生成Copaane型倍半萜β-Copaene，图6和图7。
MBP-SoSTPS4的催化产物在保留时间18.04min和20.18min处有新的产物峰，对其进行检索，发现其为α-木犀烯(α-muurolene)和α-毕橙茄醇(α-cadinol)。SoSTPS4在保留时间18.04min处的产物保留时间及质谱峰与多头绒泡菌(Physarum polycephalum)PpolyTPS4催化FPP的产物α-木犀烯(α-muurolene)(X Chen et al.Beilstein J Org Chem(2019)，Emission and biosynthesis of volatile terpenoids from the plasmodialslime mold Physarum polycephalum，DOI:10.3762/bjoc.15.281)一致，由此确定MBP-SoSTPS4在保留时间18.04min处催化产物为α-木犀烯(α-muurolene)；SoSTPS4在保留时间20.18min处的产物与标准品α-cadinol(CAS:481-34-5)的保留时间及质谱峰一致，由此确定MBP-SoSTPS4在保留时间20.18min处的催化产物为α-毕橙茄醇(α-cadinol)，图8和图9。说明，MBP-SoSTPS4可以催化FPP生成α-木犀烯(α-muurolene)和α-毕橙茄醇(α-cadinol)。
MBP-SoSTPS5的催化产物在保留时间19.26min和20.96min处有新的产物峰，对其进行检索，发现其为(+)-germacreneD-4-ol和shyobunol。MBP-SoSTPS5在保留时间19.26min处的产物保留时间及质谱峰与白蚁伞属真菌(Termitomyces)STC15催化FPP的产物(+)-germacreneD-4-ol(I Burkhardt et al.Org Biomol Chem(2019)，MechanisticCharacterization of Three Sesquiterpene Synthases from the Termite-AssociatedFungus Termitomyces，DOI:10.1039/c8ob02744g)一致，由此确定MBP-SoSTPS5的在保留时间19.26min处产物为(+)-germacreneD-4-ol，图10和图11。MBP-SoSTPS5在保留时间20.38min处产物的质谱图如图12所示。说明，MBP-SoSTPS5可以催化FPP生成(+)-germacreneD-4-ol和shyobunol。
上文中，丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)SmSTPS3催化FPP反应、多头绒泡菌(Physarum polycephalum)PpolyTPS4催化FPP反应、白蚁伞属真菌(Termitomyces)STC15催化FPP反应的步骤如下：
1、重组载体的构建
提取丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)根的总RNA，并反转录为cDNA；以所得cDNA为模板，分别利用SmSTPS3的引物进行SmSTPS3基因全长的扩增，得到PCR产物。将所得PCR产物分别与克隆载体(该载体为pEASY-Blunt Zero Cloning Kit中载体)进行连接，得到克隆载体-SmSTPS3。以克隆载体-SmSTPS3为模板，利用带载体序列及酶切连接位点的无缝克隆引物进行PCR扩增，得到PCR产物。将所得PCR产物与pMAL-c2X载体利用BamHI酶切得到的线性化载体连接，将得到的序列正确的重组载体记为pMAL-c2X-SmSTPS3(该载体也可通过合成含有BamHI酶切位点的SmSTPS3基因，酶切后与pMAL-c2X载体连接测序得到)。pMAL-c2X-SmSTPS3含有SEQ ID No.12所示的SmSTPS3基因，能表达SEQ ID No.11所示的SmSTPS3与MBP形成的融合蛋白质(记为MBP-SmSTPS3)。
按照上述方法构建pMAL-c2X-PpolyTPS4，所用模板为多头绒泡菌(Physarumpolycephalum)的cDNA。pMAL-c2X-PpolyTPS4也可通过合成含有BamHI酶切位点的PpolyTPS4基因，酶切后与pMAL-c2X载体连接测序得到。pMAL-c2X-PpolyTPS4含有SEQ IDNo.14所示的PpolyTPS4基因，能表达SEQ ID No.13所示的PpolyTPS4与MBP形成的融合蛋白质(记为MBP-PpolyTPS4)。
按照上述方法构建pMAL-c2X-STC15，所用模板为白蚁伞属真菌的cDNA。pMAL-c2X-STC15也可通过合成含有BamHI酶切位点的STC15基因，酶切后与pMAL-c2X载体连接测序得到。pMAL-c2X-STC15含有SEQ ID No.16所示的STC15基因，能表达SEQ ID No.15所示的STC15与MBP形成的融合蛋白质(记为MBP-STC15)。
2、蛋白质的表达与纯化
将重组载体pMAL-c2X-SmSTPS3、pMAL-c2X-PpolyTPS4、pMAL-c2X-STC15分别导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，分别得到重组菌Rosetta-pMAL-c2X-SmSTPS3、Rosetta-pMAL-c2X-PpolyTPS4、Rosetta-pMAL-c2X-STC15。按照步骤二的方法，将重组菌分别替换为上述重组菌进行蛋白质的表达与纯化，分别得到纯化后的MBP-SmSTPS3、MBP-PpolyTPS4、MBP-STC15。
3、以FPP为底物进行催化反应
按照步骤三的方法，将融合蛋白分别替换为步骤2所得纯化后的MBP-SmSTPS3、MBP-PpolyTPS4、MBP-STC15，其他步骤均不变，进行以FPP为底物的催化反应，将所得反应产物进行GC-MS检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (13)
1.蛋白质，为如下A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B5)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B3)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.4的DNA分子；
2)序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质在作为倍半萜合酶中的应用。
5.权利要求2或3所述的生物材料在制备倍半萜合酶中的应用。
6.具有倍半萜合酶活性的蛋白质的制备方法，包括将权利要求1所述蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到具有倍半萜合酶活性的蛋白质的步骤；
所述生物细胞为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述将所述蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入所述生物细胞的步骤。
8.倍半萜合酶的制备方法，包括从权利要求6或7所述的方法得到的具有倍半萜合酶活性的蛋白质中纯化得到倍半萜合酶。
9.以法尼基焦磷酸为底物进行催化反应的方法，包括：以法尼基焦磷酸或其盐为底物用权利要求1所述蛋白质进行催化反应，实现目的催化反应。
10.制备佛术烯的方法，包括：以法尼基焦磷酸或其盐为底物用权利要求1所述蛋白质进行催化反应得到含有佛术烯(-)-5-epieremophilene的反应物。
11.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料在制备佛术烯(-)-5-epieremophilene中的应用。
12.权利要求1所述的蛋白质在催化法尼基焦磷酸或其盐生成佛术烯
(-)-5-epieremophilene中的应用。
13.权利要求1所述的蛋白质在以法尼基焦磷酸或其盐为底物进行催化反应中的应用。
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