JP2022502008A - ドリマニルアセテート化合物を生成する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
テルペン類は、ほとんどの生物(微生物、動物、植物)に見出される。これらの化合物は、イソプレン単位と呼ばれる5つの炭素単位で構成されており、それらの構造中に存在するイソプレン単位の数によって分類され、当該単位は環状構造要素を含む場合がある。したがって、モノテルペン類、セスキテルペン類およびジテルペン類は、それぞれ10個、15個および20個の炭素原子を含むテルペン類である。例えば、セスキテルペン類は、植物界に広く見出される。セスキテルペン分子の多くは、それらがフレーバーおよびフレグランス特性ならびに化粧品、薬用、抗菌効果を有することで知られている。数多くのセスキテルペン炭化水素およびセスキテルペノイド類が同定されている。化学合成アプローチが開発されてきたが、それでも複雑であり、必ずしも費用対効果が高いとは限らない。
上記の課題は、アセチルトランスフェラーゼ活性を示し、かつアルビカノールまたはドリメノールのようなそれぞれのドリマンアルコール前駆体から、アセチル化を介してアセチル基供与体としてアセチル−CoAを使用して、アルビカニルアセテートまたはドリメノールアセテートのようなドリマニルアセテートを産生する、新しいクラスの酵素を提供することによって解決され得る。物理化学的特性のために、特にそれらは周囲温度で液体であることから、ドリマニルアルコール類のアセチル化誘導体は、より適切な材料として役立ち得る。
bp 塩基対
kb キロベース
CoA コエンザイムA
DNA デオキシリボ核酸
cDNA 相補的DNA
DTT ジチオスレイトール
FPP ファルネシル二リン酸
GC ガスクロマトグラフ
MS 質量分析計/質量分析
MVA メバロン酸
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸
miRNA マイクロRNA
siRNA 低分子干渉RNA
rRNA リボソームRNA
tRNA 転写RNA
別段の記載がない限り、以下の技術用語の定義が適用されるものとする:
本発明の目的のための「アセチルトランスフェラーゼ」または「アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド」または「アセチル基を移動させることができるポリペプチド」は、より一般的にはアシルトランスフェラーゼEC2.3.1のクラスの酵素を指し、特にアセチル−CoA:アルコールO−アセチルトランスフェラーゼEC2.3.1.84を指す。それは、アセチル基供与体としてアセチル−CoAを用いて、アルビカノール、ドリメノールおよびビシクロファルネソールから選択される少なくとも1種のドリマニルアルコールをアセチル化する能力を示す。ドリマニルアセテートは、その立体異性体のいずれかの形態で、またはその混合物として生成され得る。アルビカニルアセテート、ドリメニルアセテートまたはビシクロファルネシルアセテートは、対応するアルコール前駆体が単一のアセチル基受容体として存在する場合には、唯一の生成物であり得、または2種以上のドリメニルアルコール類の混合物が提供され、アセチルトランスフェラーゼが基質特異的でない場合には、2種以上のドリメニルアセテートの混合物の一部であり得る。選択性が増加した場合、アセチルトランスフェラーゼは、優勢に単一のドリマニルアセテートを形成し得る。本明細書に記載されるようなアセチルトランスフェラーゼは、基質としての異なるドリマニルアルコール類に対して同一または異なる優先性または特異性を示し得る。例えば、第1のタイプのアセチルトランスフェラーゼが優勢にアルビカノールをアセチル化し得、第2のタイプのアセチルトランスフェラーゼが優勢にドリメノールをアセチル化し得、第3のタイプのアセチルトランスフェラーゼが優勢にビシクロファルネソールをアセチル化し得る。そのような場合、そのようなドリマニルアルコール類の混合物が基質として使用される場合には、それぞれの主生成物として、アルビカノールアセテート、ドリメノールアセテートまたはビシクロファルネシルアセテートが形成されるであろう。基質特異性の場合、アセチルトランスフェラーゼは、たとえそのようなドリマニルアルコール類の混合物が基質として使用される場合であっても、単一のドリマニルアセテートを選択的に形成し得る。特にアセチル化は、ドリマニルアルコール基質のそれぞれの立体化学的配置を保持した状態で実施される。
%ee=[XA−XB]/[XA+XB]*100
式中、XAおよびXBは、立体異性体AおよびBのモル比(モル分率)を表す。
− 反応の全過程またはその前記間隔中に観察された異性体のより高い最大収率;
− 基質の変換値の定義された%度での異性体のより高い相対量;および/または
− より高い変換値の%度での異性体の同一の相対量
であって、それぞれが参照方法と比較して観察されることが好ましく、前記参照方法は、既知の化学的または生化学的手段と他の点では同一の条件下で実施される。
a.本発明の特定の実施形態
1.少なくとも1種の、特に1種、2種または3種、特に1種または2種のドリマニルアセテート化合物を生体触媒的に生成する方法であって、
(1)アセチル基供与体の存在下で、立体異性的に純粋な形態または立体異性体の混合物の形態における少なくとも1種の、特に1種のドリマニルアルコールを、特に、前記アセチル基供与体からのアセチル基を少なくとも1種の、特に1種のドリマニルアルコールに移動させることができるアセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1種の、特に1つのポリペプチドと接触させて、主生成物として少なくとも1種のドリマニルアセテート、特に主生成物として1種のドリマニルアセテートを得るステップと、
(2)任意に、ステップ(1)の反応生成物から少なくとも1種の、特に1種のドリマニルアセテート化合物を単離するステップと
を含む、方法。
複数のドリマニルアセテートが形成される場合、混合物をさらに分離し、個々のアセテートを精製してもよい。
a)配列番号9、11、13、15、17、19、21、23、25、118、121、124、127、130、133、136、143および144から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
b)アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ配列番号9、11、13、15、17、19、21、23、25、118、121、124、127、130、133、136、143および144の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも1つと少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、先行する実施形態のいずれか1つの方法。
a)前記ドリマニルアルコールを形成するドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド(1段階生合成);または
b)少なくとも1種のドリマニルリン酸中間体を形成するドリマニルリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドと、前記少なくとも1種のドリマニルリン酸(一リン酸および/または二リン酸)中間体を少なくとも1種のドリマニルアルコールに変換するホスファターゼ活性を有するポリペプチドとの組み合わせ(2段階生合成)
によって触媒される、FPPの酵素的変換によって生成される、実施形態10の方法。
a)前記ドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、アルビカノールシンターゼ活性、ドリメノールシンターゼ活性、ビシクロファルネソールシンターゼ活性またはそのような活性の任意の組み合わせから選択され、特に、前記活性のうちの1つを優先的に示し、より具体的には、前記活性のうちの1つを特異的に示し、かつ
b)前記ポリペプチドの組み合わせが、ドリマニル二リン酸シンターゼ活性、特にアルビカニル二リン酸シンターゼ活性およびホスファターゼ酵素、例えば細菌性アルカリホスファターゼを含む、
実施形態11の方法。
a)前記ドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、国際出願PCT/EP2018/064344号明細書(2018年5月31日付出願)に記載されるようなドリマンシンターゼならびに国際公開第2015/169871号および国際公開第2015/176959号に記載されるようなドリメノールシンターゼから選択され、
b)前記ドリマニルリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、モノリン酸のようなアルビカニルリン酸誘導体、より具体的には基質としてのファルネシル二リン酸(FPP)からアルビカニル二リン酸誘導体を産生する能力を含む、2018年5月29日に出願された国際出願PCT/CN2018/088902号明細書に記載されるようなアルビカニル二リン酸シンターゼである。
実施形態12の方法。
Dryopteris fragransのDfHAD、DfHAD−9(V274A)、DfHAD−His_GST、およびDfHAD−8(K532R)
ならびにそれらと少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する、それらに由来するポリペプチド
である。
である。
である。
Valeriana amurensisのVaTPS3
およびそれと少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する、それに由来するポリペプチド
である。
a)国際出願PCT/EP2018/064344号明細書に記載されるような、(二官能性)アルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはアルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号5と少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド;
b)国際出願PCT/EP2018/064344号明細書に記載されるような、(二官能性)ドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号7と少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド
から選択される、実施形態13の方法。
a)実施形態5に定義されている少なくとも1種のアセチルトランスフェラーゼ;任意に
b)非環状セスキテルペン前駆体FPPを、実施形態9から14のうちのいずれか1つに定義されている少なくとも1種のドリマニルアルコールに変換する能力を有する少なくとも1つのポリペプチド;および任意に
c)上記で定義されているメバロン酸経路に関与する酵素から選択される少なくとも1種の酵素
を機能的に発現することができる、組換え非ヒト宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物中で実施される、実施形態15の方法。
a)アセチル基供与体からのアセチル基をドリマニルアルコールに移動させることができるアセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの核酸、発現構築物またはベクターであって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
b)非環状セスキテルペン前駆体からドリマニルアルコールを生成することができるドリマニルアルコールシンターゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの核酸、発現構築物またはベクターであって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
c)前記非環状セスキテルペン前駆体を生成するための生合成経路に関与する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの核酸、発現構築物またはベクターであって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと
で形質転換することを含む、先行する実施形態のいずれか1つの方法。
a)実施形態5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、または
b)配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、116、117、119、120、122、123、125、126、128、129、131、132、134および135から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上100%未満の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または
c)a)もしくはb)の配列のうちの1つに相補的な配列を含むヌクレオチド配列を含むか、または
d)a)、b)もしくはc)のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、
単離された核酸分子。
a)実施形態26の少なくとも1つの単離された核酸分子であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているもの、または
b)実施形態27の少なくとも1つの発現構築物であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているもの、または
c)実施形態28から31のうちのいずれか1つの少なくとも1つのベクター
を含む、組換え宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物。
a)実施形態32から34のうちのいずれか1つの非ヒト宿主生物または宿主細胞を培養して、実施形態25記載の少なくとも1つのポリペプチドを発現または過剰発現させるステップと、
b)任意に、ステップa)で培養された非ヒト宿主細胞または生物からポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
a)配列番号9、11、13、15、17、19、21、23、25、118、121、124、127、130、133、133、136、143および144から選択されるポリペプチドをコードする核酸分子を選択するステップと、
b)選択された核酸分子を改変して、少なくとも1つの変異体核酸分子を得るステップと、
c)宿主細胞または単細胞宿主生物を変異体核酸配列で形質転換して、変異体核酸配列によってコードされたポリペプチドを発現させるステップと、
d)発現産物を、アセチルトランスフェラーゼ活性を含む少なくとも1つの変異体についてスクリーニングするステップと、
e)任意に、ポリペプチドが所望の変異体活性を有しない場合、所望の変異体活性を有するポリペプチドが得られるまで、プロセスステップa)〜d)を繰り返すステップと、
f)任意に、ステップd)で所望の変異体活性を有するポリペプチドが同定された場合、ステップc)で得られた対応する変異体核酸を単離するステップと
を含む、方法。
この文脈では、以下の定義が適用される:
「ポリペプチド」または「ペプチド」という一般用語は、互換的に使用することができ、約10〜約1,000を超える残基までを含む、ペプチドで連結された連続アミノ酸残基の天然もしくは合成の直鎖または配列を指す。30残基までを有する短鎖ポリペプチドは、「オリゴペプチド」とも称される。
この文脈では、以下の定義が適用される:
「核酸配列」、「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、ヌクレオチドの配列を意味する。核酸配列は、任意の長さの一本鎖もしくは二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり得、遺伝子のコーディング配列および非コーディング配列、エクソン、イントロン、センスおよびアンチセンス相補配列、ゲノムDNA、cDNA、miRNA、siRNA、mRNA、rRNA、tRNA、組換え核酸配列、単離および精製された天然に存在するDNAおよび/またはRNA配列、合成DNAおよびRNA配列、断片、プライマーおよび核酸プローブを含む。当業者は、RNAの核酸配列がDNA配列と同一であり、チミン(T)の代わりにウラシル(U)が用いられているという違いを有する。「核酸配列」という用語はまた、ポリヌクレオチド分子もしくはオリゴヌクレオチド分子を別個の断片の形態で含むものとして、またはより大きな核酸の構成要素として理解されるべきである。
多重アラインメントパラメーター
ギャップオープニングペナルティ 10
ギャップ伸長ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アラインメント遅延に対する%同一性 40
残基特異性ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション重み付け(Transition weighing) 0
ペアワイズアラインメントパラメーター:
FASTアルゴリズム オン
Kタプルサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウィンドウサイズ 5
最良の対角線数 5
DNAギャップオープンペナルティ 15.0
DNAギャップ伸長ペナルティ 6.66
DNAマトリックス Identity
タンパク質ギャップオープンペナルティ 10.0
タンパク質伸長ペナルティ 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP −1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
さらに、当業者であれば、機能的変異体を生成する方法、すなわち、本明細書に開示されているようなアミノ酸関連配列番号のいずれか1つと少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有するポリペプチド、および/または本明細書に開示されているようなヌクレオチド関連配列番号のいずれか1つと少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成する方法に精通している。
− 遺伝子の個々のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドが指示された方法で置換される部位特異的突然変異誘発(Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、
− 遺伝子の任意の点で任意のアミノ酸のコドンを交換または追加することができる、飽和突然変異誘発(Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1)、
− ヌクレオチド配列が変異性DNAポリメラーゼによって変異させられる、変異性ポリメラーゼ連鎖反応(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739)、
− 好ましい交換がポリメラーゼによって妨げられる、SeSaM法(配列飽和法)Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279、
− 例えばヌクレオチド配列の変異率の増加がDNA修復機構の欠陥のために起きる、突然変異誘発株における遺伝子の継代(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、または
− 密接に関連する遺伝子のプールが形成され、消化され、その断片がポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして使用され、鎖の分離および再アニーリングの繰り返しによって全長のモザイク遺伝子が最終的に生成される、DNAシャッフリング(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
この文脈では、以下の定義が適用される:
「遺伝子の発現」は、「異種発現」および「過剰発現」を包含し、遺伝子の転写およびmRNAのタンパク質への翻訳を含む。過剰発現とは、遺伝子導入細胞または生物におけるmRNA、ポリペプチドおよび/または酵素活性のレベルによって測定される遺伝子産物の産生が、非形質転換細胞または類似の遺伝的背景を持つ生物における産生レベルを上回ることを意味する。
文脈に応じて、「宿主」という用語は、野生型宿主もしくは遺伝子的に改変された、組換え宿主、またはその両方を意味し得る。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドまたはその機能的、生物学的に活性な断片を組換え産生するための方法であって、ポリペプチド産生微生物を培養し、任意に、遺伝子発現を有する少なくとも1種の誘導物質を適用することによってポリペプチドの発現を誘導し、発現されたポリペプチドを培養物から単離する方法に関する。ポリペプチドはまた、所望される場合、工業的規模でこのようにして生成することもできる。
本発明による酵素またはポリペプチドは、本明細書に記載される方法において、遊離または固定化された形態で使用することができる。固定化された酵素は、不活性担体に固定化された酵素である。適切な担体材料およびその上に固定化された酵素は、欧州特許出願公開第1149849号明細書、欧州特許出願公開第1069183号明細書および独国特許出願DE−OS100193773号明細書およびそこに引用された参考文献から知られている。これに関して、これらの文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。適切な担体材料としては、例えば、粘土、粘土鉱物、例えばカオリナイト、珪藻土、パーライト、シリカ、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、アニオン交換体材料、合成ポリマー、例えばポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリオレフィン類、例えばポリウレタン、ポリエチレンおよびポリプロピレンが挙げられる。担持された酵素を作製するために、担体材料は、通常、微細に分割された粒状形態で用いられ、多孔質状形態が好ましい。担体材料の粒径は、通常5mm以下、特に2mm以下(粒度分布曲線)である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼを使用する場合には、遊離形態または固定化形態を選択することができる。担体材料は、例えば、アルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。細胞と同様に酵素もまた、グルタルアルデヒドと直接架橋され得る(CLEAへの架橋)。対応する他の固定化技術が、例えば、J. Lalonde and A. Margolin 「Immobilization of Enzymes」、K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimに記載されている。本発明による方法を行うためのバイオ形質転換およびバイオリアクターに関する更なる情報も、例えば、Rehm et al. (Ed.) Biotechnology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17, VCH, Weinheimに与えられる。
本発明の反応は、インビボまたはインビトロ条件下で実施することができる。
本発明の方法は、任意に立体異性体的または鏡像異性体的に実質的に純粋な形態で、最終生成物または中間生成物を回収するステップをさらに含み得る。「回収する」という用語には、培養物または反応媒体から化合物を抽出、採取、単離または精製することが含まれる。化合物の回収は、従来の樹脂(例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂など)による処理、従来の吸着剤(例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど)による処理、pHの変化、溶媒抽出(例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒による)、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶、pH調整、凍結乾燥などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の従来の単離法または精製法に従って実施することができる。
本発明はまた、ドリマニルアセテートを発酵産生するための方法に関する。
材料:
別段の記載がない限り、本明細書で用いられるすべての化学的および生化学的な材料ならびに微生物または細胞は市販品である。
DB−5MS UIカラム(膜厚10m×0.25mm×0.25μm)(Agilent Technologies Inc(カリフォルニア州サンタ・クララ)製)のカスタムカラムを備えたAgilent Intuvo 9000シリーズGCシステム。GCは、1:1検出器スプリッターチップ(G4588−60502,Agilent Technologies Inc(カリフォルニア州サンタ・クララ))によって2つの検出器に結合した。1つ目の検出器はAgilent 5977Bシリーズ質量分析計で、2つ目の検出器は標準的なIntuvo 9000水素炎イオン化検出器(FID)である。キャリアガスとして、ヘリウムを2.5ml/分の一定流量で使用した。インジェクションは、インジェクター温度を240℃に設定したスプリット(1:100)モードで行った。オーブン温度は、150℃(0.1分保持)から240℃に40℃/分で、次いで325℃に180℃/分でプログラムし、0.5分保持した。
ドリマンセスキテルペンをドリマニルアセチル化セスキテルペンに変換するためのアセチルトランスフェラーゼ候補の選択
アセチルトランスフェラーゼは、8,000を超える既知の代表例を有する遺伝的に多様な酵素のクラスを構成している(PFAMデータベース:PF02458トランスフェラーゼファミリー)。アセチルトランスフェラーゼが基質として受容する分子のレパートリーは膨大であるが、セスキテルペンアルコールを基質として受容することは報告されていない。ドリマン型セスキテルペンアルコールをアセチル化できるアセチルトランスフェラーゼを同定するために、植物、真菌、細菌由来の既知のアセチルトランスフェラーゼ数千種のうち54種(第1表)を、以下の根拠に基づいて選択した。
アルビカノールシンターゼおよび異なるアセチルトランスフェラーゼ候補を共発現するSaccharomyces cerevisiaeにおけるアルビカニルアセテートのインビボ生成
酵素候補をそれぞれ、アルビカノールからアルビカニルアセテートへのインビボ生物変換についてスクリーニングした。スクリーニングのために、アセチルトランスフェラーゼ候補をそれぞれ、内因性ファルネシル二リン酸(FPP)のレベルが増加した、操作されたSaccharomyces cerevisiae株におけるディコミタス・スクアレン(Dichomitus squalens)由来のアルビカノールシンターゼXP_007369631.1(NCBIアクセッション番号XP_007369631.1)をコードする遺伝子と共発現させた。
a)BsmBIを用いた酵素的制限により線形化されたプラスミドpF167(配列番号1)。pF167は、以前は酵母でのインビボアセンブリによって構築されており、pF167は、それ自身のプロモーターおよびターミネーターを有する酵母マーカーLEU2、大腸菌マーカーAmpR、2μ酵母複製起点、大腸菌pUC複製起点ならびに相同組換えのための5’−GCACTTGCTACACTGTCAGGATAGCTTCCGTCACATGGTGGCGATCACCGTACATCTGAG−3’(配列番号2)および5’−AGGTGCAGTTCGCGTGCAATTATAACGTCGTGGCAACTGTTATCAGTCGTACCGCGCCAT−3’(配列番号3)を含む;
b)5’−GCACTTGCTACACTGTCAGGATAGCTTCCGTCACATGGTGGCGATCACCGTACATCTGAG−3’(配列番号2)、酵母遺伝子PGK1のターミネーター領域およびS. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたセスキテルペンシンターゼXP_007369631.1 DNA配列コドン(配列番号4)によって構成された断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)によって得られた。酵母由来の双方向性GAL1/GAL10プロモーター領域をPCRオーバーラップエクステンションによって、この断片に付加した。(Yolov and Shabarova., Nucleic Acids Res. 1990, 18(13):3983-6);
c)評価されるアセチルトランスフェラーゼDNAコーディング配列(S. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたコドン)の1つである酵母GAL10プロモーター領域の最初のヌクレオチドに対応する60bpと、酵母CYC1ターミネーター領域の60bpとから構成される断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)によって得られた;ならびに
d)酵母遺伝子CYC1のターミネーター領域と、配列5’−AGGTGCAGTTCGCGTGCAATTATAACGTCGTGGCAACTGTTATCAGTCGTACCGCGCCAT−3’(配列番号3)とから構成された断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)により得られた。
ドリメノールシンターゼと選択されたアセチルトランスフェラーゼ候補とを共発現するSaccharomyces cerevisiaeにおけるドリメニルアセテートのインビボ産生
Saccharomyces cerevisiaeにおけるドリメニルアセテートの生成のために、例2に示すように、アルビカノールをアルビカニルアセテートに変換することができる9種類の選択されたアセチルトランスフェラーゼ(CrDAT、FgaAT、OAH94415.1、TcTAT、CrMAT、LiAAT−4、GAO81666.1、CfACT1−6、CfACT1−8)を使用して、ドリメノールからドリメニルアセテートへの変換を評価した。
a)BsmBIを用いた酵素的制限により線形化されたプラスミドpF167(配列番号1)。pF167は、以前は酵母でのインビボアセンブリによって構築されており、pF167は、それ自身のプロモーターおよびターミネーターを有する酵母マーカーLEU2、大腸菌マーカーAmpR、2μ酵母複製起点、大腸菌pUC複製起点ならびに相同組換えのための5’−GCACTTGCTACACTGTCAGGATAGCTTCCGTCACATGGTGGCGATCACCGTACATCTGAG−3’(配列番号2)および5’−AGGTGCAGTTCGCGTGCAATTATAACGTCGTGGCAACTGTTATCAGTCGTACCGCGCCAT−3’(配列番号3)を含む;
b)5’−GCACTTGCTACACTGTCAGGATAGCTTCCGTCACATGGTGGCGATCACCGTACATCTGAG−3’(配列番号2)、酵母遺伝子PGK1のターミネーター領域およびS. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたセスキテルペンシンターゼXP_006461126 DNA配列コドン(配列番号6)によって構成された断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)によって得られた。酵母由来の双方向性GAL1/GAL10プロモーター領域をPCRオーバーラップエクステンションによって、この断片に付加した。(Yolov and Shabarova., Nucleic Acids Res. 1990, 18(13):3983-6);
c)評価されるアセチルトランスフェラーゼDNAコーディング配列(S. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたコドン)の1つである酵母GAL10プロモーター領域の最初のヌクレオチドに対応する60bpと、酵母CYC1ターミネーター領域の60bpとから構成される断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)によって得られた;ならびに
d)酵母遺伝子CYC1のターミネーター領域と、配列5’−AGGTGCAGTTCGCGTGCAATTATAACGTCGTGGCAACTGTTATCAGTCGTACCGCGCCAT−3’(配列番号3)とから構成された断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)により得られた。
ドリメノールおよびアルビカノール対して活性を有するアセチルトランスフェラーゼに基づきドリマンセスキテルペンをアセチル化ドリマニルセスキテルペンに変換するためのアセチルトランスフェラーゼ候補の選択
a)実験1
ドリマン型セスキテルペンアルコールをアセチル化することができるアセチルトランスフェラーゼをさらに同定するために、アルビカノールおよびドリメノールに対して活性を有するアセチルトランスフェラーゼCrDATおよびFgaAT(例2および3に示す)のアミノ酸配列を用いて、NCBI Protein Blast検索を行い、類似したタンパク質配列のホモログを見つけ出した。Protein Blast検索は、デフォルトのパラメーターを使用して実行した(Tatiana et al, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250, 1999)。
さらに、追加のアセチルトランスフェラーゼ候補を、苔類エゾムチゴケ(Bazzania trilobata)およびシダ植物ニオイシダ(Dryopteris fragrans)のトランスクリプトームから検索した。苔類Bazzaniaは、ドリマンセスキテルペンを含むテルペノイド類を豊富に含んでおり、さらに、Bazzania属の苔類からの天然物としてアルビカニルアセテートおよびアルビカニルカフェートが報告されている(Asakawa et al, Phytochemistry, Volume 30, Issue 9, 1991, Pages 3037-3040)。同様に、Dryopteris属では、アルビカニルアセテートを含むいくつかの異なる天然物が報告されている(Hideyuki Ito et al. Chem. Pharm. Bull. 48(8) 1190-1195 (2000); Froissard D et al. Nat Prod Commun. 2014 Jan;9(1):137-40.)。
アルビカノール、ドリメノールまたはビシクロファルネソールのいずれかを産生するための酵素を、選択されたアセチルトランスフェラーゼ候補と共に共発現させることよる、Saccharomyces cerevisiaeにおけるドリマニルアセテートのインビボ産生
アルビカノール、ドリメノールおよびビシクロファルネソールをそれらの対応するアセテート誘導体に変換するためのアセチルトランスフェラーゼの拡張スクリーニングを実施した。例1の表1および例4に記載される計89のアセチルトランスフェラーゼを、操作されたSaccharomyces cerevisiae細胞においてインビボでスクリーニングした。例2および例3に記載されるような予備的な数のアセチルトランスフェラーゼについて産生されたスクリーニングデータは繰り返さなかった。したがって、例2および例3で試験されなかったアルビカノール、ドリメノールまたはビシクロファルネソールのいずれかを産生するSaccharomyces cerevisiae細胞とのアセチルトランスフェラーゼの新しい組み合わせのみをスクリーニングした。
a)BsmBIを用いた酵素的制限により線形化されたプラスミドpF167(配列番号1);
b)5’−GCACTTGCTACACTGTCAGGATAGCTTCCGTCACATGGTGGCGATCACCGTACATCTGAG−3’(配列番号2)、酵母遺伝子PGK1のターミネーター領域およびS. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたAstK DNA配列コドン(配列番号141)によって構成された断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)によって得られた。酵母由来の双方向性GAL1/GAL10プロモーター領域をPCRオーバーラップエクステンションによって、この断片に付加した。(Yolov and Shabarova., Nucleic Acids Res. 1990, 18(13):3983-6);
c)評価されるアセチルトランスフェラーゼDNAコーディング配列(S. cerevisiaeにおけるその発現のために最適化されたコドン)の1つである酵母GAL10プロモーター領域の最初のヌクレオチドに対応する60bpと、酵母CYC1ターミネーター領域の60bpとから構成される断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)によって得られた;ならびに
d)酵母遺伝子CYC1のターミネーター領域と、配列5’−AGGTGCAGTTCGCGTGCAATTATAACGTCGTGGCAACTGTTATCAGTCGTACCGCGCCAT−3’(配列番号3)とから構成された断片であって、この断片は、DNA合成(ATUM、カリフォルニア州メンローパーク94025)により得られた。
アルビカノールに対して活性を有する前述の9つの酵素(CrDAT、FgaAT、OAH94415.1、TcTAT、CrMAT、LiAAT−4、GAO81666.1、CfACT1−6、CfACT1−8)(例2参照)に加えて、これらの条件下で、Bazzania trilobata(配列番号124または144)由来のアセチルトランスフェラーゼERR364415−1_contig_8546、およびDryopteris fragrans(配列番号118)由来のDfATC13を使用した場合、アルビカニルアセテートが検出された。しかしながら、それらの活性はCrDATおよびFgaATに比べて低かった。アルビカニルアセテートの相対量を図5に示す。
Claims (17)
- ドリマニルアセテート化合物を生体触媒的に生成する方法であって、
(1)アセチル基供与体の存在下で、ドリマニルアルコールを、前記アセチル基供与体からのアセチル基を前記ドリマニルアルコールに移動させることができる酵素クラスEC2.3.1のアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドと接触させて、ドリマニルアセテートを得るステップと、
(2)任意に、ステップ(1)の反応生成物からドリマニルアセテート化合物を単離するステップと
を含む、方法。 - 前記ドリマニルアセテート化合物が、アルビカニルアセテート、ドリメニルアセテート、およびビシクロファルネシルアセテートからなる群から選択され、それぞれが立体異性体的に純粋な形態で、またはその少なくとも2つの立体異性体の混合物、または前記群のうちの少なくとも2つのメンバーを含むそれらの組み合わせとして存在する、請求項1記載の方法。
- 前記ドリマニルアルコールが、アルビカノール、ドリメノール、およびビシクロファルネソールからなる群から選択され、それぞれが立体異性的に純粋な形態で、またはその少なくとも2つの立体異性体の混合物、または前記群のうちの少なくとも2つのメンバーを含むそれらの組み合わせとして存在する、請求項1または2記載の方法。
- 前記アセチル基供与体がアセチル−コエンザイムA(アセチル−CoA)である、請求項1から3までのいずれか1項記載の方法。
- 前記アセチルトランスフェラーゼが、
a)配列番号9、17、118、124、144、23、21、11、19、13、15、25、121、143、127、130、133または136から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
b)アセチルトランスフェラーゼ活性を有し、かつ配列番号9、17、118、124、144、23、21、11、19、13、15、25、121、143、127、130、133または136の前記アミノ酸配列のうちの少なくとも1つと少なくとも40%の配列同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、請求項1から4までのいずれか1項記載の方法。 - ステップ1)に先立って、前記ドリマニルアルコール化合物の生体触媒的形成、特に、非環状セスキテルペン前駆体、例えばファルネシルピロリン酸(FPP)からの酵素的合成をさらに含む、請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。
- 前記ドリマニルアルコールの前記酵素的合成が、前記非環状セスキテルペン前駆体を1つ以上の酵素的ステップで少なくとも1種のドリマニルアルコールに変換する能力を有する1つ以上のポリペプチドによって触媒される、請求項6記載の方法。
- 前記少なくとも1種のドリマニルアルコールを、FPPから単一のステップまたは2つ以上の酵素的ステップで生成する、請求項7記載の方法。
- 前記少なくとも1種のドリマニルアルコールが、
a)前記ドリマニルアルコールを形成するドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチド;または
b)少なくとも1種のドリマニルリン酸中間体を形成するドリマニルリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドと、前記少なくとも1種のドリマニルリン酸中間体を少なくとも1種のドリマニルアルコールに変換するホスファターゼ活性を有するポリペプチドとの組み合わせ
によって触媒される、FPPの酵素的変換によって生成される、請求項8記載の方法。 - a)前記ドリマンセスキテルペンシンターゼ活性を有するポリペプチドが、アルビカノールシンターゼ活性、ドリメノールシンターゼ活性、ビシクロファルネソールシンターゼ活性またはそのような活性の任意の組み合わせから選択され、かつ
b)前記ポリペプチドの組み合わせが、ドリマニル二リン酸シンターゼ活性、特にアルビカニル二リン酸シンターゼ活性およびホスファターゼを含む、
請求項9記載の方法。 - 前記ドリマリンセスキテルペンシンターゼが、
a)アルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはアルビカノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号5と少なくとも40%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド;
b)ドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはドリメノールシンターゼ活性を有し、かつ配列番号7と少なくとも40%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異体もしくは多様体ポリペプチド
から選択される、請求項10記載の方法。 - インビボでは宿主細胞培養中で、またはインビトロでは液体反応媒体中で実施され、それぞれ少なくとも1種のドリマニルアセテートの生成を助長する条件下にある、請求項1から11までのいずれか1項記載の方法。
- a)請求項5に定義されている少なくとも1種のアセチルトランスフェラーゼと、任意に
b)非環状セスキテルペン前駆体FPPを、請求項7から11までのいずれか1項において定義されている少なくとも1種のドリマニルアルコールに変換する能力を有する少なくとも1つのポリペプチドと、任意に
c)メバロン酸経路に関与する酵素から選択される少なくとも1種の酵素と
を機能的に発現することができる、組換え宿主細胞または組換え非ヒト宿主生物中で実施される、請求項12記載の方法。 - 前記非ヒト宿主細胞または宿主生物が、原核生物もしくは真核生物の微生物、またはそれらに由来する細胞から選択され、特に、ここで、前記非ヒト宿主細胞または宿主生物は、細菌、真菌および植物の細胞または植物から選択される、請求項13記載の方法。
- ステップ(3)として、ステップ(1)またはステップ(2)の前記ドリマニルアセテートを処理して、化学合成または生体触媒合成またはその両方の組み合わせを使用して誘導体を得ることをさらに含む、請求項1から14までのいずれか1項記載の方法。
- 前記方法が、特に、非ヒト宿主生物または宿主細胞を、
a)アセチル基供与体からのアセチル基をドリマニルアルコールに移動させることができるアセチルトランスフェラーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの核酸であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
b)非環状セスキテルペン前駆体からドリマニルアルコールを生成することができるドリマニルアルコールシンターゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの核酸であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと、任意に
c)前記非環状セスキテルペン前駆体を生成するための生合成経路に関与する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの核酸であって、任意に安定的にゲノムに組み込まれているものと
で形質転換することを含む、請求項1から15までのいずれか1項記載の方法。 - 匂い物質、フレーバーもしくはフレグランス成分または昆虫/害虫防除成分を調製するための、請求項1から15までのいずれか1項において定義されるアセチルトランスフェラーゼの使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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