JP2021519579A - バニリンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
バニリンは、食品、飲料、及び医薬品において使用するための世界的に重要な化合物である。世界の生産のごく一部のみが、バニラの鞘からの抽出によって天然に自然に得られるが、しかしながら、これらの天然植物源の利用可能性は低く、生産方法は面倒で時間がかかる。ラン科のV.プラニフォリア(V. planifolia)又はV.タヒテンシス(V. tahitensis)の鞘から得られる複雑な抽出物は、独特で複雑な混合物及び嗅覚特性を高コストで提供する一方で、バニリンの大部分(>99%、すなわち年間16000トン)は、石油化学原料から生産され、未だ少量の画分が、製紙産業のリグニン廃棄物から得られている。しかしながら、主に北米及び欧州に供給している天然の「豆由来ではないバニリン(vanillin not from the bean)」(NFB)についての市場は小さくても成長している。天然の状態を主張するための規制要件は、これら2つの市場で異なる。
本発明は、バニリンの生化学的製造のためにこれまで適用されてきた公知のシステムに関連する上記の欠点に対処する。
bp 塩基対
kb キロベース
DNA デオキシリボ核酸
cDNA 相補的DNA
DTT ジチオトレイトール
GC ガスクロマトグラフ
IPTG イソプロピル−D−チオガラクト−ピラノシド
IEM イソオイゲノールモノオキシゲナーゼ
LB 溶原性培地
MS 質量分析計/質量分析法
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
RBS リボソーム結合部位
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸
miRNA マイクロRNA
siRNA 低分子干渉RNA
rRNA リボソームRNA
tRNA トランスファーRNA
P. シュードモナス(Pseudomonas)。
「イソオイゲノール」という用語は、それぞれ、2−メトキシ−4−(プロペ−1−エン−1−イル)フェノール(CAS登録番号:97−54−1)、及びトランスイソオイゲノールとシスイソオイゲノールとの任意の異性体混合物、又は(E)−イソオイゲノール及び(Z)−イソオイゲノールをいう。
%ee=[XA−XB]/[XA+XB]*100
に従って算出した純度%eeパラメータによって定量化されてよく、ここで式中、XA及びXBは、立体異性体AとBのモル比(Molenbruch)を表す。
− 反応の全過程又はそれらの間隔中に観察される異性体のより高い最大収量;
− 基質の変換率の定義された%度での異性体のより高い相対量;及び/又は
− 変換値のより高い%度での異性体の同一の相対量;
で表されてよく、それらのそれぞれは、好ましくは参照方法と比較して観察され、前記参照方法は、他の点では公知の化学的又は生化学的手段と同一の条件下で実施される。
a. 本発明の特定の実施形態
本発明は、特に次の実施形態に関する。
a. イソオイゲノール酸化活性を有し、特に酸素、特に分子状酸素の存在下で触媒作用を及ぼし、イソオイゲノールからバニリン及びアセトアルデヒドを形成するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(A)、並びに
b. 前記ヌクレオチド配列(A)によりコードされる少なくとも1つ、例えば1つ、2つ、又は3つ、好ましくは2つのヘルパーポリペプチドであって、単独で、又は好ましくは協力して、ポリペプチドの機能的発現、特に前記で発現したポリペプチドの正しいフォールディングを助けるヘルパーポリペプチドをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列(B)
を含み、前記ヌクレオチド配列(A)及び(B)の同時発現を提供する、前記発現系。
a. 前記核酸配列(A)及び前記少なくとも1つの核酸(B)をそれぞれ保有する少なくとも2つの、好ましくは互いに独立して作用又は機能する核酸構築物の組み合わせ、及び
b. 前記核酸配列(A)及び前記少なくとも1つの核酸(B)を保有する単一の核酸構築物であって、最終的には、(A)酵素イソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチドのコード配列及び(B)ヘルパーポリペプチドのコード配列を含む単一のmRNA分子に転写される、例えば複数のクローニング部位を保有する核酸構築物もしくはベクターであってもよく、又はより好ましくはポリシストロン性核酸構築物であってもよい単一の核酸構築物
から選択される発現系。前記核酸配列(A)及び前記少なくとも1つの核酸(B)を保有する前記単一の核酸構築物は、ポリシストロン性核酸構築物にも由来しうる。それは、例えば、実験の段落においてさらに例示されるように、前記核酸分子に含まれる(A)及び(B)の少なくとも1つのコード配列の転写及び/又は翻訳に影響を与えるか又は調節するために、適切な位置、例えばプロモーター、RBS及び/又はターミネーターに1つ以上の同一又は異なる制御配列を導入することにより、それらから誘導されうる。
a. イソオイゲノール酸化活性を有し、かつ配列番号2(すなわち、本来のシュードモナス・ニトロレデュセンスJin1から単離されたIEM1)に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
b. イソオイゲノール酸化活性を有し、かつ配列番号4(すなわち、本来のシュードモナス・プチダIE27から単離されたIEM2)に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号4に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有するアミノ酸配列は、T52、Q74、D440から選択されたアミノ酸配列位置で少なくとも1つの変異を含み、かつ任意にN120、T121、F281、M298、及びL470から選択される、特にN120I、T121P、F281Q、M298K、及びL470Sから選択されるアミノ酸配列位置で、少なくとも1つ、例えば1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つのさらなる変異を含む、前記ポリペプチド
をコードする、前記発現系。
a. 単一変異体(T52X1)、(Q74X2)及び(D440X3)
b. 二重変異体(T52X1、Q74X2)、(T52X1、D440X3)及び(Q74X2、D440X3)、並びに
c. 三重変異体(T52X1、Q74X2、D440X3)
から選択され、
式中、
X1は、P、KもしくはM、又は他の天然もしくは非天然の、特に天然の、機能的にバニリンを生成する酵素変異体をもたらすアミノ酸置換であり、好ましくはX1は、P又はMであり、最も好ましくはPであり、
X2は、HもしくはA、又は他の天然もしくは非天然の、特に天然の、機能的にバニリンを生成する酵素変異体をもたらすアミノ酸置換であり、最も好ましくは、X2はHであり、
X3は、N、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、WもしくはY、又は他の天然もしくは非天然の、特に天然の、機能的にバニリンを生成する酵素変異体をもたらすアミノ酸置換であり、好ましくはX3は、N、A、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V又はYであり、かつ最も好ましくはNである、
前記発現系。
(T52X1、Q74X2):
式中、X1はPであり、かつX2はHもしくはAであるか;又は
X1はKであり、かつX2はHもしくはAであるか;又は
X1はMであり、かつX2はHもしくはAである。
(T52X1、D440X3)
式中、X1はPであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、WもしくはYであるか;又は
X1はKであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、WもしくはYであるか;又は
X1はMであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、WもしくはYである。
(Q74X2、D440X3)
式中、X2はHであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、WもしくはYであるか;又は
X2はAであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、WもしくはYである。
(T52P、Q74H);
(T52P、D440X3)、式中、X3は、N、A、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V、又はYである
(Q74H、D440X3)、式中、X3は、N、A、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V、又はYである。
(T52X1、Q74X2、D440X3)
式中、X1はPであり、X2はHであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYである;
X1はKであり、X2はHであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYである;
X1はMであり、X2はHであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYである;
X1はPであり、X2はAであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYである;
X1はKであり、X2はAであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYである;
X1はMであり、X2はAであり、X3はN、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W、又はYである。
(T52P、Q74H、D440X3)、式中、X3は、N、A、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V、又はYである。
a. (B1)は、配列番号8(GroEL)に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシャペロニン活性を有するポリペプチドをコードし、かつ
b. (B2)は、配列番号10(GroES)に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシャペロニン活性を有するポリペプチドをコードする、
前記発現系。
a. 単一変異体(T52X1)、(Q74X2)及び(D440X3)
b. 二重変異体(T52X1、Q74X2)、(T52X1、D440X3)及び(Q74X2、D440X3)、並びに
c. 三重変異体(T52X1、Q74X2、D440X3)
から選択され、
式中、
X1は、P、KもしくはM、又は他の天然もしくは非天然の、特に天然の、機能的にバニリンを生成する酵素変異体をもたらすアミノ酸置換であり、好ましくはX1は、P又はMであり、最も好ましくはPであり、
X2は、HもしくはA、又は他の天然もしくは非天然の、特に天然の、機能的にバニリンを生成する酵素変異体をもたらすアミノ酸置換であり、最も好ましくは、X2はHであり、
X3は、N、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、WもしくはY、又は他の天然もしくは非天然の、特に天然の、機能的にバニリンを生成する酵素変異体をもたらすアミノ酸置換であり、好ましくはX3は、N、A、C、E、F、G、H、K、L、M、Q、R、S、T、V又はYであり、かつ最も好ましくはNである、
ポリペプチド。
a. 実施形態1から6までのいずれか1つに記載の組換え発現系、又は前記部分核酸構築物の1つ、又はそれらの逆相補体、又は
b. 実施形態11又は12において定義した核酸、又は
c. 実施形態13に記載の構築物
を含む発現ベクター。
a. 実施形態1から6のいずれか1つに記載の組換え発現系又は前記部分核酸構築物の1つ、又は
b. 実施形態11又は12において定義した核酸又はその逆相補体、又は
c. 実施形態13に記載の構築物、又は
d. 実施形態14又は15に記載のベクター
を含む、非ヒト宿主生物又は宿主細胞。
a. イソオイゲノールと、実施形態7から10までのいずれか1つにおいて定義したイソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチド又は実施形態20から22までのいずれか1つに記載の方法によって製造したイソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチドとを、酸素、特に分子状酸素の存在下で接触させて、バニリン及びアセトアルデヒドを製造するステップ、及び
b. 任意に、ステップaにおいて製造したバニリンを単離するステップ
を含む、バニリンの製造方法。
a. 実施形態11又は12に従って核酸を選択するステップ、
b. 選択した核酸を改変して、少なくとも1つの変異体核酸を得るステップ、
c. 宿主細胞又は単細胞生物に変異体核酸配列を提供して、変異体核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現させるステップ、
d. イソオイゲノールの酸化において活性を有する少なくとも1つの変異体ポリペプチドをスクリーニングするステップ、
e. 任意に、変異させたポリペプチドが所望の活性を有さない場合に、所望の活性を有するポリペプチドが得られるまでプロセスステップa.〜d.を繰り返すステップ、及び
f. 任意に、所望の活性を有する変異体ポリペプチドをステップd.又はe.において同定した場合に、対応する変異体核酸を単離するステップ
を含む、前記方法。
本記載内容において、次の定義が適用される。
本記載内容において、次の定義が適用される。
さらに、当業者は、本明細書において開示した配列番号に関連するアミノ酸のいずれかに対して、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であるか、及び/又は本明細書において開示した配列番号に関連するアミノ酸のいずれかに対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、又はそれらの逆相補体を含む核酸分子によりコードされる、機能的変異体を生じるための方法を熟知している。
− 遺伝子の個々のヌクレオチド又はいくつかのヌクレオチドが指定された方法で置換される部位特異的変異誘発(Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、
− 任意のアミノ酸のコドンを遺伝子の任意の箇所で交換又は不可できる飽和変異誘発(Kegler−Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1)
− エラープローンポリメラーゼ連鎖反応によりヌクレオチド配列を変異させるエラープローンDNAポリメラーゼ(Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);
− 好ましい変換をポリメラーゼにより妨げるSeSaM法(配列飽和法)、Schenkら(Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277−279)、
− 例えばDNA修復機構の欠陥によりヌクレオチド配列の変異率が増加する、変異誘発株における遺伝子の継代(Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、又は
− 密接に関連する遺伝子のプールを形成して消化し、そしてその断片を、反復鎖分離及び再結合により全長モザイク遺伝子を最終的に生成するポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として使用する、DNAシャッフリング(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
本記載内容において、次の定義が適用される。
本記載内容に応じて、「微生物」という用語は、野生型微生物又は遺伝子改変した組換え微生物又はその双方を意味しうる。
本発明は、さらに、本発明によるポリペプチド又はそれらの機能的な生物学的に活性のある断片の組換え生成のための方法に関し、ここでポリペプチド生産微生物を培養し、任意にポリペプチドの発現を、少なくとも1つの誘導因子誘導遺伝子発現を適用することにより誘導させ、発現したポリペプチドを培養物から単離する。ポリペプチドを、所望の場合に、この方法で工業規模で生産してもよい。
本発明による酵素又はポリペプチドを、本明細書において記載される方法において、遊離して又は固定化して使用してよい。固定化した酵素は、不活性キャリヤー上に固定された酵素である。適したキャリヤー材料及びその上に固定化した酵素は、欧州特許出願公開第1149849号明細書(EP−A−1149849)、欧州特許出願公開第1 069 183号明細書(EP−A−1 069 183)及び独国特許第100193773号明細書(DE−OS 100193773)、並びにそれらに引用される参考文献から公知である。これに関して、参照をもって全体の開示を組み込んだものとする。適したキャリヤー材料は、例えば、粘土、粘土鉱物、例えばカオリナイト、珪藻土、パーライト、シリカ、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換材料、合成ポリマー、例えばポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、及びポリオレフィン、例えばポリエチレン及びポリプロピレンが含まれる。支持された酵素を作製するために、キャリヤー材料は、通常、微粉砕した粒子の形で使用され、多孔質の形が好ましい。キャリヤー材料の粒子サイズは、通常5mm以下、特に2mm以下である(粒子サイズ分布曲線)。同様に、デヒドロゲナーゼを全細胞触媒として使用する場合に、遊離又は固定化した形を選択できる。キャリヤー材料は、例えばアルギン酸カルシウム、カラギーナンである。酵素及び細胞を、グルタルアルデヒドで直接架橋(CLEAへの架橋)してもよい。対応する及び他の固定化技術は、例えば、J. Lalonde及びA. Margolin「Immobilization of Enzymes」、K. Drauz及びH. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991−1032, Wiley−VCH, Weinheimにおいて記載されている。本発明による方法を実施するための生体内変換及びバイオリアクターに関するさらなる情報は、Rehmら(Ed.) Biotechnology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17, VCH, Weinheimにおいても得られる。
本発明の方法中に又は本明細書において前記で定義した多段階法の個々のステップ中に存在する少なくとも1つのポリペプチド/酵素は、天然に又は組換えにより1つ又は複数の酵素を生産する生細胞に、収穫された細胞に、死細胞に、透過処理した細胞に、粗細胞抽出物に、精製抽出物に、又は本質的に純粋なもしくは完全に純粋な形で存在してよい。少なくとも1つの酵素は、溶液中に存在してよく、又はキャリヤー上に固定化された酵素として存在してよい。1つ又はいくつかの酵素は、可溶性の及び/又は固定化した形で同時に存在しうる。
本発明の方法論は、最終生成物又は中間生成物を、任意に立体異性的に又は鏡像異性的に実質的に純粋な形で回収するステップをさらに含んでよい。「回収する」という用語は、培養物又は反応培地から化合物を抽出すること、採取すること、単離すること又は精製することを含む。化合物の回収は、これらに限定されないが、従来の樹脂(例えば、陰イオン又は陽イオン交換樹脂、非イオン吸着樹脂等)での処理、従来の吸着剤(例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等)、pHの変更、溶媒抽出(例えば、従来の溶媒、例えばアルコール、酢酸エチル、ヘキサン等)、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶、pH調整、凍結乾燥等での処理を含む、当該技術分野において公知の任意の従来の単離又は精製方法に従って実施してよい。
本発明は、バニリンの発酵による生成のための方法にも関する。
材料:
特に明記しない限り、本明細書において使用される全ての化学的及び生化学的な材料及び微生物又は細胞は、市販の製品である。
典型的なイソオイゲノールモノオキシゲナーゼアッセイにおいて、ガスクロマトグラフィーによる分析の前に、次の例で説明するように、反応物を遠心分離し、そしてMTBEで抽出した。
バニリンを以下のように生成した:P.ニトロレデュセンスJin1のイソオイゲノールモノオキシゲナーゼを発現する大腸菌(実施例1を参照されたい)の細胞を、アンピシリン含有LB寒天プレートから、炭素源としてグルコース15g L-1を有するアンピシリン含有ミネラル塩培地50mLに移し、そして225rpm、37℃で20時間振盪させながら増殖させた。無機塩培地は、グルコース15g L-1、(NH4)2HPO4 5g L-1、K2HPO4 16g L-1、クエン酸2g L-1、MgSO4 1g L-1、CaCl2 30mg L-1、微量元素、ビタミン、及びアンピシリン100mg L-1から構成した。そして、この培養液0.4mLを取り、1Lのフラスコを使用して同一の組成の無機塩培地200mLに接種した。いくつかのフラスコを並行に動かした。培養物を37℃、180rpmで振盪させながらOD600が2.5に達するまで増殖させた。温度を20℃に下げた。培養物を、OD600 3で1mM IPTGで誘導させ、20℃、180rpmでさらに17時間振盪させながら増殖させた。培養終了時のOD600は24であった。培養物を4000gで4℃で50分間遠心分離した。細胞を100mMグリシン−NaOH緩衝液(pH9)に再懸濁させ、最終OD600を45にした。
菌株BL21(DE3):pIEM1_pGro7を、フェッドバッチ培養条件下で試験した。フェドバッチ培養を、溶存酸素に基づくグルコース供給を使用して、作業容量3.7Lの反応器(Bioengineering、Switzerland)で実施した。酵母エキス5g L-1を含み、カルベニシリン及びクロラムフェニコールをpH7で補ったミネラル塩培地は、炭素源としてグルコースの代わりにグリセロールを使用する成長培地として機能した。培養は37℃であった。OD600 48で、温度を25℃に下げ、培養をOD600 51でアラビノース1.5g L-1で誘導した。OD600 59で、培養を1mM IPTGで誘導した。供給溶液は70%の無菌水性グリセロールを含んだ。NH3水溶液でpHを調整した。発酵を43時間続け、最終OD600 163に達した。プラスミドの安定性を、選択に適切な抗生物質を含むか又は含まない寒天プレートを使用して測定した。細菌細胞を、前記したように遠心分離によって収集し、100mMグリシン−NaOH緩衝液(pH9)に再懸濁させ、活性を試験した。バニリン3.7g L-1までを、OD600 5に相当する触媒添加量で、実施例1に記載したように実施した反応において、ガスクロマトグラフィーにより観察した。
P.プチダIE27(IEM2)のイソオイゲノールモノオキシゲナーゼの人工変異体を、プラスミドpJ431(T7、kanR、低コピー;供給者Atum、Newark、CA)に挿入して、大腸菌BL21(DE3)T1で発現させた。あるいは、P.プチダIE27の変異体の1つを生成する大腸菌の細胞を、シャペロニンGroES及びGroELを同時生成するためにプラスミドpGro7で同時形質転換した。
プラスミドpIEM2_c154_t222_a1318(図8のプラスミドマップ及び注釈、並びに配列番号16を参照されたい)を保有する大腸菌BL21(DE3)T1のコロニー及びpGro7を寒天プレートから単離し、カナマイシン30mg/L及びクロラムフェニコール30mg/Lを含むLB培地2mLに添加した。培養物を、220rpmで16時間振盪しながら37℃で増殖させた。150μLを、同一の抗生物質を含む新しいLB培地50mLに移した。細胞を、OD600が0.45に達するまで37℃で220rpmで振盪させながら増殖させた。アラビノース1.5g/Lで培養を誘導し、OD600が0.6に達するまで振盪しながら温度を20℃に下げた。培養物を、0.5mM IPTGで誘導させ、さらに16時間220rpmで振盪しながら20℃で増殖させた。遠心分離により細胞を回収し、氷冷した0.1Mグリシン緩衝液(pH9.5)に再懸濁した。2〜45のOD600に対応する異なる細胞希釈液を準備した。開いた20mL反応バイアルに、イソオイゲノール80mg、異なる光学密度の細胞懸濁液2mLを添加した。室温で17時間、500rpmで磁気バーで撹拌して反応させた。反応物を3滴の15%HClで酸性化し、GCによる分析のための内部標準としてトリデカン1g/Lを含むMTBE10mLで抽出した。異なる細胞密度を含む反応で観察したバニリン濃度を図7に示す。
シャペロニンGroES及びGroELと一緒にイソオイゲノールモノオキシゲナーゼIE27の三重変異体を発現させるための異なるプラスミド構築物(図11の一般的なスキームに従って構築し、配列番号17〜24から選択されるヌクレオチド配列、及びIEMコード配列の転写ターミネーターが存在しない対応する構築物を有する)を保有する大腸菌細胞BL21(DE3)T1のコロニーを、カナマイシン含有寒天プレートから採取し、無機塩培地2mLに接種した。無機塩培地は、グリセロール30g/L、(NH4)2HPO4 5g L-1、K2HPO4 16g L-1、クエン酸 2g L-1、MgSO4 1g L-1、CaCl2 30mg L-1、酵母エキス 5g/L、微量元素及びカナマイシン50mg/Lを含んだ。
Claims (15)
- イソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチドの組換え発現のための発現系であって、以下、
a. 酵素イソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(A)、並びに
b. 前記ヌクレオチド配列(A)によってコードされる、ポリペプチドの機能的発現を単独で又は協力して助ける少なくとも1つのヘルパーポリペプチドをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列(B)
を保有する単一の核酸構築物を含み、前記ヌクレオチド配列(A)及び(B)の同時発現を提供する、前記発現系。 - 単一ポリシストロン性核酸構築物である、請求項1に記載の発現系。
- 前記ヌクレオチド配列(A)が、
a. イソオイゲノール酸化活性を有し、かつ配列番号2に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、又は
b. 配列番号4に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列、並びにT52、Q74、D440から選択されるアミノ酸配列位置で少なくとも1つの変異、及びN120、T121、F281、M298、及びL470から選択されるアミノ酸配列位置で任意に少なくとも1つのさらなる変異を含むアミノ酸配列を含むイソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチド
をコードする、請求項1又は2に記載の発現系。 - イソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチドが、配列番号4のT52、Q74及びD440から選択されるアミノ酸配列位置で少なくとも1つの変異を含む変異体ポリペプチドである、請求項3に記載の発現系。
- 前記少なくとも1つのヌクレオチド配列(B)が、ヌクレオチド配列(B1)及び(B2)を含み、
a. (B1)は、配列番号8に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシャペロニン活性を有するポリペプチドをコードし、かつ
b. (B2)は、配列番号10に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシャペロニン活性を有するポリペプチドをコードする、
請求項1から4までのいずれか1項に記載の発現系。 - 配列番号4に対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列、並びにT52、Q74、D440から選択されるアミノ酸配列位置で少なくとも1つの変異、及びN120、T121、F281、M298及びL470から選択されるアミノ酸配列位置で任意に少なくとも1つのさらなる変異を含むアミノ酸配列を含むイソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチド。
- 配列番号4のT52、Q74及びD440から選択されるアミノ酸配列位置で少なくとも1つの変異を含む変異体ポリペプチドである、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記変異体が、
a. 単一変異体(T52X1)、(Q74X2)及び(D440X3)
b. 二重変異体(T52X1、Q74X2)、(T52X1、D440X3)及び(Q74X2、D440X3)、並びに
c. 三重変異体(T52X1、Q74X2、D440X3)
から選択され、
ここで、
X1は、P、M又はKであり、
X2は、H又はAであり、かつ
X3は、N、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、R、S、T、V、W又はYである、
請求項7に記載のポリペプチド。 - 請求項6から8までのいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号3もしくは5又はそれらの逆相補配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。
- 請求項9に記載の組換え核酸又はそれらの逆相補体を含む、組換え核酸構築物。
- 以下、
a. 請求項1から5までのいずれか1項に記載の組換え発現系によって含まれる単一核酸構築物又はそれらの逆相補体、又は
b. 請求項9に記載の組換え核酸又はそれらの逆相補体、又は
c. 請求項10に記載の組換え核酸構築物又はそれらの逆相補体
を含む、発現ベクター。 - 非ヒト宿主生物又は宿主細胞であって、任意にそのゲノム中で
a. 請求項1から5までのいずれか1項に記載の組換え発現系によって含まれる単一核酸構築物、又は
b. 請求項9に記載の組換え核酸、又は
c. 請求項10に記載の組換え核酸構築物、又は
d. 請求項11に記載の発現ベクター
を安定して組み込んだものを含む、非ヒト宿主生物又は宿主細胞。 - イソオイゲノール酸化活性を有する単離した触媒活性ポリペプチドを製造するための方法であって、イソオイゲノール酸化活性を有する前記ポリペプチドと、宿主細胞系において請求項1から5までのいずれか1項において定義した発現系によってそれぞれコードされる少なくとも1つのヘルパーポリペプチドとの同時発現、並びに任意にイソオイゲノール酸化活性を有する前記ポリペプチドの単離を含む、前記方法。
- 以下、
a. イソオイゲノールと、請求項6から8までのいずれか1項において定義したイソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチド又は請求項13に記載の方法によって製造したイソオイゲノール酸化活性を有するポリペプチドとを、酸素の存在下で接触させて、バニリンを製造するステップ、及び
b. 任意に、ステップaにおいて製造したバニリンを単離するステップ
を含む、バニリンの製造方法。 - オイゲノールをイソオイゲノールに化学的又は生化学的に異性化するステップ、及び任意に反応媒体からイソオイゲノールを単離するステップをさらに含む、請求項14に記載の方法。
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