ES2730102T3 - Composiciones y métodos para la biosíntesis de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina - Google Patents

Composiciones y métodos para la biosíntesis de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina Download PDF

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Abstract

Un método para producir vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina que comprende (A) proporcionar un hospedante recombinante capaz de producir vainillina, en donde dicho hospedante recombinante es un microorganismo, planta o célula de planta y alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de catecol-O-metil transferasa (COMT) mutante; en donde el polipéptido de COMT mutante tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27 determinada a lo largo de la longitud entera de la SEQ ID NO: 27; y que comprende Asn, Asp, Cys, Glu, Phe o Tyr en la posición 198 de la SEQ ID NO: 27. (B) cultivar dicho hospedante recombinante durante un tiempo suficiente para que dicho hospedante recombinante produzca vainillina y/o glucósido de vainillina; y (C) aislar la vainillina y/o glucósido de vainillina de dicho hospedante recombinante o del líquido sobrenadante del cultivo, produciendo así vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la biosíntesis de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina
Introducción
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. n° 61/521.090, presentada el 8 de agosto de 2011 y 61/522.096, presentada el 10 de agosto de 2011.
Antecedente de la invención
La vainillina es uno de los compuestos de sabor más importantes en el mundo con un mercado global de 180 millones de dólares. La vainillina natural se obtiene de las vainas de semillas curadas de la orquídea vainilla (Vanilla planifolia), pero la mayor parte de la vainilla mundial se sintetiza a partir de productos petroquímicos o ligninas de pasta de madera. La producción de vainilla natural a partir de la vaina de vainilla es un procedimiento lento y laborioso, que requiere la polinización manual de las flores y un procedimiento de curado de 1-6 meses de las vainas de vainilla verdes recogidas (Ramachandra & Ravishankar (2000) J. Sci. Food Agrie. 80:289-304). La producción de 1 kilogramo (kg) de vainillina requiere aproximadamente 500 kg de vainilla, que corresponde a la polinización de aproximadamente 40.000 flores. Actualmente solo aproximadamente 0,25% (40 toneladas de 16.000) de vainillina vendidas anualmente procede de vainas de vainilla, mientras que la mayor parte del resto se sintetiza químicamente a partir de lignina o hidrocarburos fósiles, en particular guayacol. La vainilla producida de forma sintética se vende a aproximadamente 15 dólares por kg, en comparación con los precios de 1200-4000 dólares por kg de la vainilla natural (Walton, et al. (2003) Phytochemistry 63:505-515).
Resumen de la invención
Esta invención proporciona un método para producir vainillina o beta-D-glucósido de vainillina. El método de la invención implica las etapas de (a) proporcionar un hospedante recombinante capaz de producir vainillina, en donde dicho hospedante recombinante alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de enzima catecol-O-metil transferasa (COMT) mutante; (b) cultivar dicho hospedante recombinante durante un tiempo suficiente para que dicho hospedante recombinante produzca vainillina y/o glucósido de vainillina; y (c) aislar la vainillina y/o glucósido de vainillina de dicho hospedante recombinante o del líquido sobrenadante del cultivo, de modo que se produce vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina.
En una realización adicional, se proporciona un polipéptido de COMT mutante, en donde dicho mutante tiene una o más propiedades mejoradas. En particular, la invención proporciona polipéptidos de COMT mutantes que catalizan preferentemente la metilación en la posición meta del ácido protocatéquico y/o aldehído protocatéquico y/o alcohol protocatéquico en lugar de en la posición para.
Cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente memoria puede incluir además un marcador de purificación, un péptido de tránsito al cloroplasto, un péptido de tránsito mitocondrial, un péptido de amiloplasto, péptido señal, o un marcador de secreción en el extremo N o C del polipéptido.
El hospedante es un microorganismo, p. ej., una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe o Escherichia coli, una planta o célula de planta (p. ej., Physcomitrella o planta o célula de planta de tabaco).
Cualquiera de los mutantes descritos en la presente memoria puede incluir además un gen que codifica una ácido carboxílico aromático reductasa (ACAR); una 3-deshidroshikimato deshidratasa (3DSD); una uridina 5'-difosfoglucosil transferasa (UGT); una fosfopanteteína transferasa (PPTasa) y/o una enzima multifuncuional arom de tipo natural (AROM).
También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido de COMT mutante.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un esquema de la biosíntesis nueva de la vainillina (4) y describe los diferentes catabolitos de vainillina y productos secundarios metabólicos, es decir, ácido deshidroshikímico (1), ácido protocatéquico (2), aldehído protocatéquico (3), ácido vainíllico (5), alcohol protocatéquico (6), alcohol de vainillilo (7), y p-D-glucósido de vainillina (8), encontrados en un organismo que expresa 3DSD, ACAR, OMT y UGT y una fosfopanteteína transferasa (PPTasa). Las flechas blancas muestran reacciones metabólicas primarias en levaduras; las flechas negras muestran reacciones enzimáticas introducidas por modificación genética metabólica; las flechas ralladas diagonalmente muestran reacciones metabólicas de levaduras inherentes indeseadas.
La figura 2 es una representación esquemática de la biosíntesis celular de los aminoácidos aromáticos tirosina, triptófano y fenilalanina usando un polipéptido de AROM de tipo natural (izquierda) y un polipéptido de AROM mutante que carece del dominio 5 (derecha).
La figura 3A muestra la producción de vainillina (VG) e isovainillina (IsoVG) en cepa de levadura que expresa diferentes polipéptidos de COMT mutantes.
La figura 3B y figura 3C muestra la producción de vainillina (VG) e isovainillina (IsoVG) por polipéptidos de COMT aislados de diferentes fuentes en comparación con OMT humana (Hs-OMT) y la OMT mutante l 198y humana (HS-OMT L198Y). Phytophthera infestans (PI), Catharanthus roseus (CR), Yarrowia lipolytica (YL), Ciona intestinalis números de acceso en GENBANK XP_002121420 y XP_002131313 (CI-1 y CI-2), Capsasproa owczarzaki (CO), Chaetomium therophilum (CT), Clavispora lusitaniae (CL), Paracoccidioides sp. 'lutzii' Pb01 (PL), Vanilla planifolia (VP), Coffea Arabica (CA), Rattus norvegicus (RN), Mus musculus (MM), Crenarchaeote (CRe N), Mycobacterium vanbaleeni (MV), o Schizosaccharomyces pombe (SP).
La figura 4 muestra niveles de glucósido de vainillina, vainillina, glucósido de alcohol de vainillilo y alcohol de vainillilo en cepas de levaduras que expresan alcohol de vainillilo oxidasa (VAO) Penicillium simplicissium (PS) o Rhodococcus jostii (RJ), que se complementaban con alcohol de vainillilo 3 mM.
La figura 5 muestra los niveles de ácido vainíllico, vainillina y glucósido de vainillina en cepas de levaduras N. iowensis ACAR o N. crassa ACAR y de E. coli que expresan fosfopanteteinilo transferasa (PPTasa) o PPTasa de S. pombe, cuando se cultivan en medio complementado con ácido vainíllico 3 mM.
Descripción detallada de la invención
AROM es un complejo enzimático pentafuncional codificado en levaduras por el gen ARO1. El gen tiene 4764 pb de longitud y codifica un polipéptido correspondiente de 1588 aminoácidos de longitud. AROM lleva a cabo cinco conversiones enzimáticas consecutivas, es decir, conversión de DAHP (ácido 3-desoxi-D-arabino-heptulosónico 7-fosfato) en 3-DHQ (3-deshidroquinato), que se convierte en 3-DHS (ácido 3-deshidroshikímico), que se convierte en shikimato, que se convierte en shikimato-3-P (shikimato 3-fosfato), que se convierte en EPSP (5-enolpiruvilskimato 3-fosfato), todas encaminadas a la biosíntesis celular de los aminoácidos aromáticos tirosina, triptófano y fenilalanina (véase la figura 2).
Las cinco funciones catalíticas de AROM residen en cinco dominios distintos del polipéptido que codifica ARO1. Los dominios funcionales de los polipéptidos AROM están en un orden diferente del orden en el que son necesarios en la conversión de cinco etapas de DAHP en EPSP (véase la figura 2). Por lo tanto, mientras el dominio 1 corresponde a la actividad catalítica 1, el dominio 2 corresponde a la actividad catalítica 5, el dominio 3 corresponde a la actividad catalítica 4, el dominio 4 corresponde a la actividad catalítica 2 y finalmente el dominio 5 corresponde a la actividad catalítica 3 (véase la figura 1). Los polipéptidos de COMT mutante se pueden usar para la biosíntesis mejorada de beta-D-glucósido de vainillina. Por ejemplo, los polipéptidos de COMT mutante descritos en la presente memoria pueden tener una o más de las siguientes propiedades: mayor recambio; metilación preferencial en la posición meta (3'), en lugar de en la posición para (4') de modo que está favorecida la producción de vainillina frente a la de isovainillina; o mejor especificidad para los sustratos de la ruta de la vainillina, ácido protocatéquico y aldehído protocatéquico.
Por consiguiente, la invención proporciona polipéptidos de COMT mutantes y ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos y el uso de los mismos en la biosíntesis de vainillina y/o glucósido de vainillina. El método incluye las etapas de proporcionar un hospedante recombinante capaz de producir vainillina en presencia de una fuente de carbono, en donde dicho hospedante recombinante alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de AROM mutante; cultivar dicho hospedante recombinante en presencia de la fuente de carbono; y purificar la vainillina y/o glucósido de vainillina de dicho hospedante recombinante o del líquido sobrenadante de cultivo.
Los hospedantes recombinantes descritos en la presente memoria se pueden usar en métodos para producir vainillina o glucósido de vainillina. Por ejemplo, si el hospedante recombinante es un microorganismo, el método puede incluir el crecimiento del microorganismo recombinante en un medio de cultivo en condiciones en las que se expresan los genes de la biosíntesis de la vainillina y/o glucósido de vainillina. El microorganismo recombinante se puede cultivar en un procedimiento discontinuo, semicontinuo o continuo o combinaciones de los mismos. Típicamente, el microorganismo recombinante se cultiva en un fermentador a una temperatura(s) definida en presencia de una fuente de nutrientes adecuada, p. ej., una fuente de carbono, durante un periodo de tiempo deseado para producir una cantidad deseada de vainillina y/o glucósido de vainillina.
Las fuentes de carbono de uso en el presente método incluyen cualquier molécula que pueda ser metabolizada por la célula hospedante recombinante para facilitar el cultivo y/o producción de la vainillina y/o glucósido de vainillina. Los ejemplos de fuentes de carbono adecuadas incluyen sacarosa (p. ej., como se encuentra en melazas), fructosa, xilosa, etanol, glicerol, glucosa, celulosa, almidón, celobiosa u otros polímeros que contienen glucosa. En realizaciones que usan levaduras como un hospedante, por ejemplo, son adecuadas fuentes de carbono tales como sacarosa, fructosa, xilosa, etanol, glicerol y glucosa. La fuente de carbono se puede proporcionar al organismo hospedante a lo largo del periodo de cultivo o, alternativamente, el organismo se puede cultivar durante un periodo de tiempo en presencia de otra fuente de energía, p. ej., proteína, y después proporcionar una fuente de carbono, solo durante la fase semicontinua.
En una realización, el microorganismo de este método alberga un ácido nucleico que codifica el polipéptido de COMT mutante y opcionalmente un polipéptido de AROM de tipo natural. Dependiendo del microorganismo particular usado en el método, también pueden estar presentes y expresarse otros genes recombinantes que codifican una 3DSD, ACAR, UGT o PPTasa. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede, en una realización, ser un microorganismo que alberga uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican 3DSD, ACAR, UGT o PPTasa o un homólogo funcional de cualquiera de los mencionados que comparte al menos 80%, tal como al menos 90%, por ejemplo al menos 95% de la identidad de secuencia con los mismos. Los niveles de productos, sustratos y productos intermedios, p. ej., ácido deshidroshikímico, ácido protocatéquico, aldehído protocatéquico, vainillina, beta-D-glucósido de vainillina, se pueden determinar extrayendo muestras del medio de cultivo para el análisis de acuerdo con los métodos publicados.
Después de cultivar el microorganismo recombinante en cultivo durante el periodo de tiempo deseado, se puede entonces recuperar la vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina del cultivo usando diferentes técnicas conocidas en la técnica, p. ej., aislamiento y purificación por extracción, destilación a vacío y recristalización en múltiples etapas de soluciones acuosas y ultrafiltración (Boddeker, et al. (1997) J. Membrane Sci. 137:155-158; Borges da Silva, et al. (2009) Chem. Eng. Des. 87:1276-1292). Los procedimientos de extracción de dos fases, que usan compuestos de sulfhidrilo, tales como ditiotreitol, ditioeritritol, glutatión o L-cisteína (patente de EE.UU. n° 5.128.253), o soluciones alcalinas de KOH (documento WO 94/13614), se han usado en la recuperación de vainillina así como en su separación de otras sustancias aromáticas. La adsorción y pervaporación de vainillina de medios bioconvertidos usando membranas de copolímero de poliéter-poliamida también se ha descrito (Boddeker, et al. (1997) véase antes; Zucchi, et al. (1998) J. Microbio!. Biotechnol. 8:719-722). También se han usado resinas de adsorción macroporosas con armazones de poliestireno reticulado para recuperar la vainillina disuelta de soluciones acuosas (Zhang, et al. (2008) Eur. Food Res. Technol. 226:377-383). También se han evaluado las técnicas de ultrafiltración y contactores de membrana (MC) para recuperar vainillina (Zabkova, et al. (2007) J. Membr. Sci. 301:221-237; Scuibba, et al. (2009) Desalination 241:357-364). Alternativamente, se podrían usar técnicas convencionales tales como percolación o extracción con dióxido de carbono supercrítico y ósmosis inversa para la concentración. Si el hospedante recombinante es una planta o células de planta, la vainillina o glucósido de vainillina se pueden extraer del tejido vegetal usando diferentes técnicas conocidas en la técnica.
En algunas realizaciones, la vainillina o beta-D-glucósido de vainillina se puede producir usando células enteras que se alimentan con materias primas que contienen moléculas precursoras. Las materias primas se pueden alimentar durante el cultivo celular o después del cultivo celular. Las células enteras pueden estar en suspensión o inmovilizadas. Las células enteras pueden estar en caldo de fermentación o en un tampón de reacción. En algunas realizaciones puede ser necesario un agente de permeabilización para la transferencia eficaz de sustrato a las células.
En algunas realizaciones, la vainillina o beta-D-glucósido de vainillina se aísla y purifica hasta homogeneidad (p. ej., al menos 90%, 92%, 94%, 96% o 98% puro). En otras realizaciones, la vainillina o beta-D-glucósido de vainillina se aísla como un extracto de un hospedante recombinante. En relación con esto, la vainillina o beta-D-glucósido de vainillina se puede aislar, pero no necesariamente purificar hasta homogeneidad. De forma conveniente, la cantidad de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina producida puede ser de aproximadamente 1 mg/l a aproximadamente 20.000 mg/l o mayor. Por ejemplo, se puede producir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/l, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 mg/l, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg/l, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/l, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1,000 mg/l, de aproximadamente 250 a aproximadamente 5.000 mg/l, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000 mg/l, o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 10.000 mg/l de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina. En general, tiempos de cultivo más largos conducirán a mayores cantidades de producto. Por lo tanto, el microorganismo recombinante se puede cultivar durante de 1 día a 7 días, de 1 día a 5 días, de 3 días a 5 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días o aproximadamente 5 días.
Se apreciará que los diferentes genes y módulos descritos en la presente memoria pueden estar presentes en dos o más microorganismos recombinantes más que en un solo microorganismo. Cuando se usa una pluralidad de microorganismos recombinantes, se pueden cultivar en un cultivo mixto para producir vainillina y/o glucósido de vainillina.
Los extractos de la vainillina o beta-D-glucósido de vainillina aislados y opcionalmente purificados son útiles en productos de consumo saborizantes tales como productos alimenticios, complementos dietéticos, productos nutracéuticos, composiciones farmacéuticas, composiciones higiénicas dentales y productos cosméticos.
La frase "producto alimenticio", como se usa en la presente memoria, incluye frutas, verduras, zumos, productos cárnicos tales como jamón, tocino y salchichas; productos de huevo, concentrados de frutas, gelatinas y productos similares a la gelatina tales como mermeladas, jaleas, conservas; productos lácteos tales como helado, crema agria y el sorbete; glaseados, jarabes incluyendo melazas; productos de maíz, trigo, centeno, soja, avena, arroz y cebada, corazones de nueces y productos de nueces, pasteles, galletas, confitería tales como caramelos, gomas, gotas con sabor a frutas y chocolates, chicles, mentas, cremas, glaseado, helados, tartas y panes, bebidas tales como café, té, refrescos gaseosos, tales como COKE y PEPSI, refrescos sin gas, zumos y otras bebidas de frutas, bebidas para el deporte tales como GATORADE, café, té, té helado, cola, bebidas alcohólicas, tales como cervezas, vinos y licores, y KOOL-AID.
Los productos alimenticios también incluyen condimentos tales como hierbas, especias y aderezos, potenciadores del sabor. Un producto alimenticio también incluye productos preparados, tales como edulcorantes dietéticos, edulcorantes líquidos, mezclas de sabores granulados que tras reconstitución con agua proporcionan bebidas no carbonatadas, mezclas de pudín instantáneo, café y té instantáneos, blanqueadores de café, mezclas de leche malteada, alimentos para mascotas, piensos para ganado, tabaco y materiales para aplicaciones de horneado, tales como mezclas para hornear en polvo para la preparación de panes, galletas, pasteles, tortitas, rosquillas. Los productos alimenticios también incluyen alimentos y bebidas de dieta o bajas en calorías que contiene poca o no contiene sacarosa. Otros ejemplos de productos alimenticios previstos de acuerdo con la presente invención se describen más adelante y a lo largo de la memoria descriptiva.
En otra realización, los productos alimenticios son frutas, verduras, zumos, productos cárnicos tales como jamón, tocino y salchichas; productos de huevo, concentrados de frutas, gelatinas y productos similares a la gelatina tales como mermeladas, jaleas, conservas; productos lácteos tales como helado, crema agria y el sorbete; glaseados, jarabes incluyendo melazas; productos de maíz, trigo, centeno, soja, avena, arroz y cebada, corazones de nueces y productos de nueces, pasteles, galletas, confitería tales como caramelos, gomas, gotas con sabor a frutas y chocolates, cremas, glaseado, helados , tartas y panes.
En otra realización, el producto consumible es una composición farmacéutica. Las composiciones preferidas son composiciones farmacéuticas que contienen vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar para formar fármacos farmacéuticos que contienen uno o más agentes activos que ejercen un efecto biológico. Como tal, la composición farmacéutica preferiblemente incluye además uno o más agentes activos que ejercen un efecto biológico. Dichos agentes activos incluyen agentes farmacéuticos y biológicos que tienen una actividad. Dichos agentes activos son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., The Physician's Desk Reference. Dichas composiciones se pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, EE.UU. En una realización, dicho agente activo incluye broncodilatadores, anorexígenos, antihistamínicos, suplementos nutricionales, laxantes, analgésicos, anestésicos, antiácidos, antagonistas del receptor H2, anticolinérgicos, antidiarreicos, emolientes, antitusivos, antieméticos, antimicrobianos, antibacterianos, antifúngicos, antivirales, expectorantes, antiinflamatorios y mezclas de los mismos. En una realización, el agente activo es un antipirético o analgésico, p. ej., ibuprofeno, acetaminofeno o aspirina; laxantes, p. ej., fenolftaleína-dioctilsulfosuccinato de sodio; calmantes del apetito, p. ej., anfetaminas, fenilpropanolamina, hidrocloruro de fenilpropanolamina, o cafeína; antiácidos, p. ej., carbonato de calcio; antiasmáticos, p. ej., teofilina; antidiuréticao, p. ej., hidrocloruro de difenoxilato; agentes activos contra la flatulencia, p. ej., simeticona; agentes para migraña, p. ej., tartrato de ergotamina; agentes psicofarmacológicos, p. ej., haloperidol; espasmolíticos o sedantes, p. ej., fenobarbitol; antihipercinéticos, p. ej., metildopa o metilfenidato; tranquilizantes, p. ej., benzodiazepinas, hidroxinmeprobramatos o fenotiazinas; antihistamínicos, p. ej., astemizol, maleato de clorofeniramina, maleato de piridamina, succinato de doxlamina, maleato de bromofeniramina, citrato de feniltoloxamina, hidrocloruro de clorociclizina, maleato de feniramina, y tartrato de fenindamina; descongestionantes, p. ej., hidrocloruro de fenilpropanolamina, hidrocloruro de fenilefrina, hidrocloruro de pseudoefedrina, sulfato de pseudoefedrina, bitartrato de fenilpropanolamina y efedrina; bloqueantes de receptores beta, p. ej., propanolol; agentes para síndrome de abstinencia del alcohol, p. ej., disulfiram; antitusivos, p. ej., benzocaína, dextrometorfano, hidrobromuro de dextrometorfano, noscapina, citrato de carbetapentano, e hidrocloruro de clofedianol; suplementos de flúor, p. ej., fluoruro sódico; antibióticos locales, p. ej., tetraciclina o cleocina; suplementos de corticosteroides, p. ej., prednisona o prednisolona; agentes contra la formación de bocio, p. ej., colchicina o alopurinol; antiepilépticos, p. ej., fenitoína de sodio; agentes contra la deshidratación, p. ej., suplementos de electrolitos; antisépticos, p. ej., cloruro de cetilpiridinio; AINE, p. ej., acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno, o sus sales; agentes activos gastrointestinales, p. ej., loperamida y famotidina; diferentes alcaloides, p. ej., fosfato de codeína, sulfato de codeína o morfina; suplementos para oligoelementos, p. ej., cloruro de sodio, cloruro de zinc, carbonato de calcio, óxido de magnesio y otras sales de metales alcalinos y sales de metales alcalinotérreos; vitaminas; resinas de intercambio iónico, p. ej., colestiramina; sustancias reductoras del colesterol y que disminuyen los lípidos; antiarrítmicos, p. ej., N-acetilprocainamida; y expectorantes, p. ej., guaifenesina.
Sustancias activas que tienen un sabor particularmente desagradable incluyen agentes antibacterianos tales como ciprofloxacina, ofloxacina y pefloxacina; antiepilépticos tales como zonisamida; antibióticos macrólidos tales como eritromicina; antibióticos beta-lactámicos tales como penicilinas y cefalosporinas; sustancias activas psicotrópicas tales como clorpromazina; sustancias activas tales como sulpirina; y agentes activos contra las úlceras, tales como cimetidina.
Las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto en cualquier forma adecuada para lograr su propósito previsto. Sin embargo, preferiblemente la composición es una que se puede administrar por vía bucal u oral. Alternativamente, la composición farmacéutica puede ser un pulverizador oral o nasal. El sujeto es cualquier animal, tal como un ser humano. Otros animales adecuados incluyen caninos, felinos, perros, gatos, ganado, caballos, vacas, ovejas. Como se usa en la presente memoria, una composición veterinaria se refiere a una composición farmacéutica que es adecuada para animales no humanos. Dichas composiciones veterinarias son conocidas en la técnica.
En otra realización, la composición es una forma farmacéutica líquida para administración oral, que incluye emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes usados normalmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurilo, polietilenglicoles y ésteres de ácido graso y sorbitán, y sus mezclas. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, por ejemplo, alcoholes de isoestearilo etoxilado, ésteres de sorbitol y sorbitán polioxietilénico, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar, y tragacanto y sus mezclas.
La composición farmacéutica puede estar en forma de un comprimido masticable. Los comprimidos masticables son conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. n° 4.684.534 y 6.060.078. Un comprimido masticable puede contener cualquier tipo de medicamento, preferiblemente un medicamente de sabor amargo, extractos de plantas naturales y otros compuestos orgánicos. Más preferiblemente, pueden estar contenidos en el núcleo vitaminas tales como vitamina A, vitamina B, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina C, vitamina E y vitamina K; extractos de plantas naturales tales como extractos de sohgunjung-tang, extractos de Sipchundaebotang y extractos de Eleutherococcus senticosus; compuestos orgánicos tales como dimenhidrinato, meclazina, acetaminofeno, aspirina, fenilpropanolamina y cloruro de cetilpiridinio; o agentes gastrointestinales como el gel de hidróxido de aluminio seco, domperidona, azuleno soluble, L-glutamina e hidrotalcita.
La composición farmacéutica se puede disgregar por vía oral. Los comprimidos de disgregación oral son conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE.uU. n° 6.368.625 y 6.316.029.
La composición farmacéutica puede ser una forma farmacéutica sólida, que incluye vainillina o beta-D-glucósido de vainillina y un gránulo efervescente activado por agua y/o saliva, tal como uno que tiene una velocidad de efervescencia controlable. La composición efervescente puede comprender además un compuesto farmacéuticamente activo. Las composiciones farmacéuticas efervescentes son conocidas en la técnica. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. n° 6.649.186. La composición efervescente se puede usar en aplicaciones farmacéuticas, veterinarias, hortícolas, domésticas, de alimentos, culinarias, plaguicidas, agrícolas, cosméticas, herbicidas, industriales, de limpieza, confitería y saborizantes. Las formulaciones que incorporan la composición efervescente que contiene vainillina o beta-D-glucósido de vainillina puede incluir además uno o más adyuvantes y/o ingredientes activos adicionales que se pueden elegir de los conocidos en la técnica, que incluyen sabores, diluyentes, colorantes, aglutinantes, carga, tensioactivo, disgregante, estabilizante, vehículos de compactación y disgregantes no efervescentes.
La composición farmacéutica puede ser una composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea. Dicha composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea se puede configurar, por ejemplo, como formas de administración de disgregación rápida, p. ej., formas de administración que se disgregan en un periodo de 1 segundo hasta 3 minutos, o como formas de administración que se disgregan lentamente, p. ej., formas de administración que se disgregan en un periodo de 3 a 15 minutos. Los tiempos de disgregación indicados se pueden ajustar a los intervalos mencionados antes usando, por ejemplo, polímeros formadores de matrices que tienen diferentes características de disgregación o solubilidad. Por lo tanto, mezclando los componentes poliméricos correspondientes, se puede ajustar el tiempo de disgregación. Además, se conocen disgregantes que "arrastran" agua dentro de la matriz y hacen que la matriz de rompa y abra desde dentro. Como consecuencia, algunas realizaciones de la invención incluyen dichos disgregantes con el fin de ajustar el tiempo de disgregación.
Los polímeros que son adecuados para usar en la composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea incluyen derivados de celulosa, poli(alcohol vinílico) (p. ej., MOWIOL), poliacrilatos, polvinilpirrolidona, éteres de celulosa, tales como etilcelulosa, así como poli(alcohol vinílico), poliuretano, polimetacrilatos, poli(metacrilatos de metilo) y derivados y copolimerizados de los polímeros mencionados antes.
En algunas realizaciones, el espesor total de la composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea es preferiblemente de 5 pm hasta 10 mm, preferiblemente de 30 um a 2 mm, y con preferencia particular de 0,1 mm a 1 mm. Las preparaciones farmacéuticas pueden ser de forma redonda, ovalada, elíptica, triangular, cuadrangular o poligonal, pero también pueden tener cualquier forma redondeada.
La composición farmacéutica puede estar en forma de un aerosol. La composición en aerosol puede incluir además un agente farmacéuticamente activo. Las composiciones en aerosol son conocidas en la técnica. Véase, p. ej., la patente de EE.UU. n° 5.011.678. Como un ejemplo no limitante, una composición en aerosol puede incluir una cantidad médicamente eficaz de una sustancia farmacéuticamente activa, vainillina o beta-D-glucósido de vainillina y un propulsor biocompatible, tal como un propulsor de (hidro/fluoro)carbono.
En una realización, la composición farmacéutica es una composición nutricional. Los ejemplos de composiciones nutricionales que tienen un sabor indeseable incluyen productos de nutrición enteral para el tratamiento de la deficiencia nutricional, traumatismo, cirugía, enfermedad de Crohn, enfermedad renal, hipertensión, obesidad, para promover el rendimiento atlético, potenciación muscular o bienestar general o errores congénitos del metabolismo tales como fenilcetonuria. En particular, dichas formulaciones nutricionales pueden contener uno o más aminoácidos que tienen un sabor o regusto amargo o metálico. Dichos aminoácidos incluyen aminoácidos esenciales tales como un isómero L de la leucina, isoleucina, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, tirosina o valina. En una realización, el producto consumible es una composición para la higiene dental que contiene vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina. Las composiciones para la higiene dental son conocidas en la técnica e incluyen pasta de dientes, enjuagues bucales, enjuague de placa, hilo dental, analgésicos dentales (tales como ANBESOL). En otra realización, el producto consumible es un producto cosmético que contiene vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina. Por ejemplo, el producto cosmético puede ser una crema facial, barra de labios, brillo de labios y similares. Otras composiciones adecuadas incluyen bálsamo de labios, tales como bálsamo de labios CHAPSTICK o BURT'S BEESWAX, que contienen además vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina.
Polipéptidos de enzima multifuncional arom (AROM)
Los ejemplos no limitantes de polipéptidos de AROM incluyen el polipéptido de Saccharomyces cerevisiae que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 (n° de acceso en GENBANK X06077); un polipéptido de Schizosaccharomyces pombe (n° de acceso en GENBANK NP_594681.1); un polipéptido de Schizosaccharomyces japónicas (n° de acceso en GENBANK XP_002171624); un polipéptido de Neurospora crassa (n° de acceso en GENBANK XP_956000); y un polipéptido de Yarrowia lipolytica (n° de acceso en GENBANK XP_505337).
La expresión "polipéptido de AROM" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que es al menos 80 por ciento (p. ej., al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por cien) idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4, y tiene actividad de 3-deshidroquinato deshidratasa, actividad de 3-deshidroquinato sintasa, actividad de 3-fosfoshikimato 1-carboxiviniltransferasa, actividad de shikimato 3-deshidrogenasa (NADP+) y actividad de shikimato quinasa.
Polipéptidos de catecol-O-metil-transferasa (COMT)
El polipéptido de COMT de acuerdo con la invención es una catecol-O-metiltransferasa mutante que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 por ciento de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 27 determinada a lo largo de la longitud entera de la SEQ ID NO: 27; y que comprende Asn, Asp, Cys, Glu, Phe o Tyr en la posición 198 de la SEQ ID NO: 27.
Los polipéptidos de COMT que se pueden mutar de acuerdo con esta invención incluyen polipéptidos de COMT en la familia clasificada con el número EC 2.1.1.6, tal como el polipéptido de Homo sapiens (Hs) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 (véase, también, n° de acceso en GENBANK NM_000754); un polipéptido de Arabidopsis thaliana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 53 (n° de acceso en GENBANK AY062837); o un polipéptido de Fragaria x ananassa (fresa) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54 (n° de acceso en GENBANK AF220491). El polipéptido de COMT humano existe en forma de varias variantes y el polipéptido de COMT puede ser cualquiera de esas variantes, sin embargo, en una realización preferida el polipéptido de COMT humano es de SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 55. Otros polipéptidos de COMT de mamífero adecuados útiles en esta invención incluyen los aislados de Pan troglodytes (n° de acceso en GENBANK XP_514984), Macaca mulatta (n° de acceso en GENBANK AFJ70145), Equus caballus (n° de acceso en GENBANK NP_001075303), Canis lupus familiaris (n° de acceso en GENBANK AAR20324), Cricetulus griseus (n° de acceso en GENBANK EGV97595), Sus scrofa (n° de acceso en GENBANK NP_001182259), y Bos taurus (n° de acceso en GENBANK NP_001095787). Otros polipéptidos de COMT de fuentes vegetales y microorganismos incluyen los aislados de Rosa chinensis (n° de acceso en GENBANK CAD29457), Prunus dulcis (n° de acceso en GENBANK CAA58218), Gossypium hirsutum (n° de acceso en GENBANK ACT32028), Jatropha curcas (n° de acceso en GENBa Nk ACT87981), Eucalyptus camaldulensis (ADB82906), Candida orthopsilosis (n° de acceso en GENBANK CCG25047), Pichia stipitis (n° de acceso en GENBANK ABN67921), y Spathaspora passalidarum (n° de acceso en GENBANK EGW29958). En ciertas realizaciones, el polipéptido de COMT de la invención se obtiene de Phytophthera infestans (n° de acceso en GENBANK XP_002899214), Catharanthus roseus (n° de acceso en GENbAn K EGS21863), Yarrowia lipolytica (n° de acceso en GENBANK XP_500451), Ciona intestinalis (n° de acceso en GENbAn K XP_002121420 o XP_002131313), Capsasproa owczarzaki (n° de acceso en GENBANK EFW46044), Chaetomium therophilum (n° de acceso en g EnbAn K EGS21863), Clavispora lusitaniae (n° de acceso en GENBANK XP_002899214), Paracoccidioides sp. 'lutzii' Pb01 (n° de acceso en GENBANK Xp_002793380), Vanilla planifolia (SEQ ID NO:56), Coffea Arabica (n° de acceso en GENBANK AAN03726), Rattus norvegicus (n° de acceso en GENBANK NP_036663), Mus musculus (n° de acceso en GENBANK NP_031770), Crenarchaeote (n° de acceso en GENBANK ABZ07345), Mycobacterium vanbaleeni (n° de acceso en GENBANK ABM14078), o Schizosaccharomyces pombe (n° de acceso en GENBANK NP_001018770, que se ha mostrado que presenta la actividad de COMT deseada (figuras 3B y 3C).
La expresión "polipéptido de COMT" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que es al menos 80 por ciento (p. ej., al menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por cien) idéntica a la secuencia de Hs COMT expuesta en la SEQ ID NO: 27 y tiene actividades enzimáticas de catecol-O-metiltransferasa del polipéptido de Hs COMT de tipo natural.
La expresión "polipéptido de COMT mutante", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 por ciento, tal como al menos 85 por ciento, por ejemplo al menos 90 por ciento, tal como al menos 95 por ciento, por ejemplo al menos 96 por ciento, tal como al menos 97 por ciento, por ejemplo al menos 98 por ciento, tal como al menos 99 por ciento, idéntica a la secuencia de Hs COMT expuesta en la SEQ ID NO: 27, y es capaz de catalizar la metilación del grupo -OH en la posición meta del ácido protocatéquico y/o aldehído protocatéquico, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido de COMT mutante comprende Asn, Asp, Cys, Glu, Phe o Tyr en la posición 198 de la SEQ ID NO: 27.
Como se describe en la presente memoria, los polipéptidos de COMT mutante se pueden usar para mejorar la biosíntesis del glucósido de vainillina. Por ejemplo, los polipéptidos de COMT pueden tener una o más de las siguientes propiedades: mayor recambio; metilación preferencial en la posición meta (3'), más que en la posición para (4') de modo que está favorecida la producción de vainillina frente a la isovainillina; o mejor especificidad por los sustratos de la ruta de la vainillina, el ácido protocatéquico y aldehído protocatéquico. Los polipéptidos de COMT mutantes se pueden caracterizar por ensayos de metilación in vitro o se pueden caracterizar in vivo en un hospedante recombinante basándose en la producción de ácido vainíllico, vainillina o glucósido de vainillina.
Las estructuras de isovainillina, vainillina, ácido isovainíllico y ácido vainíllico son las siguientes.
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La Hs COMT de tipo natural carece de O-metilación regioselectiva del aldehído protocatéquico y el ácido protocatéquico, indicando que el sitio de unión de la Hs COMT no se une a estos sustratos en una orientación que permita la metilación regioselectiva deseada. Sin querer estar limitados por un mecanismo particular, el sitio activo de la Hs COMT está compuesto de la coenzima S-adenosil-metionina (sAm ), que sirve como el donador de metilo, y el sustrato catecol, que contiene el hidroxilo que se va a metilar coordinado al Mg2+ y próximo a la Lys144. La O-metilación procede por un mecanismo de SN2, donde la Lys144 sirve como una base catalítica que desprotona el hidroxilo proximal para formar un oxianión que ataca un grupo metilo del sulfonio de la SAM. Véase, por ejemplo, Zheng & Bruice (1997) J. Am. Chem. Soc. 119(35):8137-8145; Kuhn & Kollman (2000) J. Am. Chem. Soc.
122(11):2586-2596; Roca, et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125(25):7726-37.
Para determinar si un polipéptido de COMT mutante dado es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH del ácido protocatéquico, en donde dicha metilación da como resultado la generación de al menos X veces más ácido vainíllico en comparación con el ácido isovainíllico, se puede llevar a cabo un ensayo in vitro. En dicho ensayo, el ácido protocatéquico se incuba con un polipéptido de COMT mutante en presencia de un donador de metilo y posteriormente se determina el nivel de ácido isovainíllico y ácido vainíllico generado. Dicho donador de metilo puede ser, por ejemplo, S-adenosilmetionina. Más preferiblemente, esto se puede determinar generando un hospedante recombinante que alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de COMT mutante, en donde dicho hospedante recombinante además es capaz de producir ácido protocatéquico. Después de cultivar el hospedante recombinante, se puede determinar el nivel de ácido isovainíllico y ácido vainíllico generado. En relación con este método, se prefiere que dicho ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de COMT mutante que se va a ensayar esté operativamente unido a una región reguladora que permite la expresión en dicho hospedante recombinante. Además, se prefiere que el hospedante recombinante exprese al menos una 3DSD y al menos una ACAR, que pueden ser preferiblemente una de las 3DSD y ACAR descritas en la presente memoria. En realizaciones donde el hospedante recombinante expresa una ACAR capaz de catalizar la conversión de ácido vainíllico en vainillina, entonces el método puede incluir también determinar el nivel de vainillina e isovainillina generado. El hospedante recombinante también puede expresar al menos una UGT capaz de catalizar la glucosilación de la vainillina e isovainillina, en cuyo caso se pueden determinar en su lugar los niveles de glucósido de vainillina y glucósido de isovainillina, respectivamente. Alternativamente, esto se puede determinar generando un hospedante recombinante que alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de COMT mutante que se va a ensayar, y alimentando ácido protocatéquico a dicho hospedante recombinante, seguido de la determinación del nivel generado de ácido vainíllico y ácido isovainíllico.
De forma similar, se puede usar un ensayo in vitro o una célula de hospedante recombinante para determinar si un polipéptido de COMT mutante es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH del aldehído protocatéquico, en donde dicha metilación da como resultado la generación de al menos X veces más vainillina en comparación con la isovainillina. Sin embargo, en este ensayo, se usa aldehído protocatéquico como material de partida y se determina el nivel de vainillina e isovainillina.
Igualmente, se puede usar un ensayo in vitro de una célula de hospedante recombinante para determinar si un polipéptido de COMT mutante es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH del alcohol protocatéquico, en donde dicha metilación da como resultado la generación de al menos X veces más alcohol de vainillilo en comparación con el alcohol de vainillilo. Sin embargo, en este ensayo, se usa aldehído protocatéquico como material de partida y se determina el nivel de vainillina e isovainillina.
El nivel de isovainillina y vainillina se pueden determinar por cualquier método adecuado útil para detectar estos compuestos, en donde dicho método puede distinguir entre la isovainillina y la vainillina. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, HPLC. De forma similar, el nivel de ácido isovainíllico, ácido vainíllico, alcohol de isovainillilo y alcohol de vainillilo, se puede determinar usando cualquier método adecuado útil para detectar estos compuestos, en donde dicho método puede distinguir entre isovainillina y la vainillina. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, HPLC.
Para sustratos de las dimensiones del aldehído protocatéquico y ácido protocatéquico, se encontró que el límite del sitio de unión del sustrato de la Hs COMT estaba formado por los siguientes restos hidrófobos: Trp38, Met40, Cys173, Pro174, Trp143 y Leu198. Un resto hidrófilo adicional que puede influir en la unión es Arg201. El hidroxilo del catecol que no es metilado, forma enlace de hidrógeno con la Glu199.
De acuerdo con este mecanismo, para que se produzca la metilación en la posición meta del aldehído protocatéquico y el ácido protocatéquico, estos sustratos deben unirse en una orientación que coloque el hidroxilo en meta de modo que esté coordinado con el Mg2+ y próximo a la Lys144, mientras que el hidroxilo en para está próximo a la Glu199. La falta de esta regioselectividad deseada observada en la Hs COMT de tipo natural sugiere que esta orientación de unión no ocurre de forma preferente. Uno o más aminoácidos pueden sustituir los restos del sitio de unión de la Hs COMT para permitir una orientación de unión de los sustratos que promueva la O-metilación en meta deseada del aldehído protocatéquico y el ácido protocatéquico.
Por lo tanto, un método para identificar los polipéptidos de COMT con especificidad por el sustrato mejorada proporciona metodología computacional para identificar mutaciones de restos que confieran O-metilación en meta mejorada por un polipéptido de COMT. El método incluye varias etapas diferentes. En particular, un método de identificación de mutaciones óptimas incluye las etapas de (a) seleccionar una estructura de proteína de un polipéptido de COMT; (b) acoplamiento de los sustratos ácido protocatéquico y aldehído protocatéquico a la estructura de proteína del polipéptido de COMT determinada en (a) para reducir las diferentes conformaciones que promueven la O-metilación en meta o para regioselectiva; (c) identificar mutaciones del sitio de unión próximas a los sustratos ácido protocatéquico y aldehído protocatéquico; (d) llevar a cabo análisis mutacional in silico en cada resto identificado en (c); (e) clasificar las mutaciones de restos candidatos para cada posición de (d) basado en conformaciones previstas del sustrato de la O-metilación en meta o para; y (f) seleccionar las mutaciones con mejor puntuación para cada resto candidato identificado en (c).
Como se ha descrito antes, el polipéptido de COMT puede estar en la familia de COMT clasificado con el número EC 2.1.1.6, catecol O-metil transferasa. Así pues, un experto en la técnica apreciará que, además de la Hs COMT, el método se puede aplicar a cualquier especie de COMt dentro de esta clasificación, en donde dichas proteínas tendrán restos del sitio de unión similares. Aunque se describe cada una de las etapas del método con más detalle con respecto a la Hs COMT, se apreciará que se pueden llevar a cabo etapas de métodos similares con otros polipéptidos de COMT.
En la etapa (a), se selecciona una estructura de proteína de COMT. Las estructuras de proteínas de Hs COMT están públicamente disponibles en el Banco de Datos de Proteínas y se puede evaluar la utilidad basándose en la resolución, inclusión de mutaciones y otras variaciones de secuencias que se pueden introducir para dar la cristalización. Otros factores que se pueden considerar cuando se selecciona una estructura incluyen si la estructura incluye o no un sustrato unido a la proteína, o la naturaleza del sustrato unido a la proteína. El código de estructura cristalina 3BWM (Banco de Datos de Proteínas RCSB) es una estructura particularmente útil para la Hs COMT, y se usó en los métodos descritos en la presente memoria. Un experto en la técnica apreciará que se puede usar otra estructura cristalina de Hs COMT como entradas para los procedimientos de modelización.
En la etapa (b), los sustratos de interés, p. ej., el ácido protocatéquico y aldehido protocatéquico, se acoplan a la estructura de proteína. Acoplamiento es un término para indicar un procedimiento computacional implementado en una variedad de algoritmos de predicción de una conformación probable de una molécula pequeña seleccionada en un sitio de unión de proteína. La técnica típicamente calcula una puntuación de la unión para proporcionar la base para evaluar la bondad de ajuste y la energía de unión prevista de la interacción. El programa de acoplamiento usado para obtener las conformaciones del sustrato usadas en el procedimiento actual es ProtoScreen (Haydon, et al. (2008) Science 321:1673-1675). El método crea puntuaciones de unión de acuerdo con el algoritmo de ProtoScore (Bhurruth-Alcor, et al. (2011) Org. Biomol. Chem. 9:1169-1188). Un experto en la técnica apreciará que se pueden usar otros programas de acoplamiento en esta etapa del método para identificar conformaciones de unión adecuadas de los sustratos ácido protocatéquico y aldehído protocatéquico en la Hs COMT (u otro miembro de la familia de COMT).
En la etapa (c) se lleva a cabo el análisis mutacional. Este puede incluir varias subetapas tales como (i) identificar un primer resto que se va a mutar; (ii) identificar un resto con el que se va a mutar de la lista de aminoácidos adecuados; (iii) para cada resto en (ii), buscar una biblioteca de rotámeros para los candidatos conformacionales; (iv) mutar el resto de (i) con cada una de las nuevas selecciones de rotámeros de la cadena lateral de restos de (iii); (v) minimizar la conformación del complejo de proteína; (vi) puntuar cada candidato a rotámero en (iv) con diferentes cálculos de energías de mutante-sustrato, mutante-proteína, mutante-disolvente y sustrato-disolvente con diferentes conformaciones del ácido o aldehído protocatéquico que permitan comparaciones de energía donde el sustrato se esté modificando en la posición meta o en la para; y (vii) clasificar las selecciones de rotámeros de (iii) y después dar la puntuación más alta a los mutantes de aminoácidos de (ii).
En la subetapa (i), se analiza a su vez cada uno de los restos que se va a mutar.
En la subetapa (ii), se selecciona un resto que se va a mutar de una lista determinística de aminoácidos disponibles. Por defecto esta lista son los 20 aminoácidos estándar que se encuentran en la naturaleza, pero podría incluir otros aminoácidos no naturales.
En la subetapa (iii), todos los rotámeros se identifican en una biblioteca de rotámeros que se corresponden con la identidad del aminoácido mutante. Una biblioteca de rotámeros es un conjunto precalculado de conformaciones preferidas de cadenas laterales de aminoácidos estándar en un formato 3D que se puede usar. Dichas bibliotecas se usan habitualmente en el trabajo de análisis estructural de proteínas, y están incluidas en la mayoría de los paquetes de modelización molecular disponibles en el mercado. Los conjuntos de rotámeros que se corresponden con la identidad del resto que muta se seleccionan para la subetapa (iv).
En la subetapa (iv), el resto de proteína seleccionado se intercambia por cada uno de los rotámeros identificados en (iii). Esto implica manipular la representación computacional de los átomos del resto de proteína de modo que se eliminen los átomos de la cadena lateral del resto de inicio antes de que el rotámero seleccionado entrante de (iii) se conecte a la posición del carbono alfa usando matemáticas vectoriales. Este método se repite para cada rotámero candidato para llegar a una lista de representaciones 3D de la proteína que varía cada una solo en las diferentes conformaciones del rotámero en la posición de un solo resto.
En la subetapa (v), los complejos de proteína-sustrato obtenidos en (iv) se someten a minimizaciones de campos de fuerza. En una realización particularmente útil, este campo de fuerza es AMBER99 con cargas AM1-BCC aplicadas al sustrato. En otro aspecto del método, se usa un término de solvatación de Born. La cadena principal de proteína se puede conectar usando restricciones de pared, mientras que las cadenas laterales permanecen sin restringir. Esto tiene el efecto de reducir el movimiento de proteína general, pero permitiendo explorar el efecto de la mutación de restos individuales en restos vecinos. Un experto en la técnica apreciará que varios paquetes de modelización molecular disponibles en el mercado son capaces de realizar estas tareas.
En la subetapa (vi), las conformaciones de proteína-complejo resultantes se someten a cálculos energéticos para determinar la viabilidad de las conformaciones mutantes individuales. Esto incluye el cálculo individual de la energía de interacción del resto de tipo natural con el sustrato, entorno de la proteína y disolvente y después llevar a cabo los mismos cálculos con la conformación de restos mutados. Los cálculos se determinan para ambas conformaciones (reacción en meta y para) del sustrato. Esta etapa del método identifica por lo tanto mutaciones que tienen energías de unión favorables para el sustrato en la colocación de reacción en meta, en comparación con la posición de activación para. Las energías se calculan usando términos basados en el campo de fuerzas. En una realización, el campo de fuerzas es AMBER99 y la energía de interacción entre el aminoácido y el entorno de proteína-sustrato se describe por la ecuación 1.
Figure imgf000010_0001
donde
Figure imgf000011_0001
E electrostático W h
= par
no 2ejas
unidas
Un experto en la técnica apreciará que se pueden implementar otras ecuaciones similares para derivar energías de interacción adecuadas para estos análisis energéticos diferenciales de diferentes colocaciones de sustratoaminoácido mutado.
En la subetapa (vii), los aminoácidos mutantes se seleccionan basándose en energías de unión favorables del sustrato unido en la colocación prevista de reacción en meta en comparación con la colocación prevista de reacción en para. Por lo tanto, estos cálculos determinan qué mutaciones de aminoácidos es probable que promuevan la O-metilación regioselectiva en meta.
En la etapa (iv), se repite la etapa (iii) hasta que resulta una lista de valores de energía para cada uno de los restos del sitio de unión que se van a mutar.
En la etapa (v), la lista de valores de energía derivada de la etapa (iv) se clasifica por la diferencia de energía entre cada mutación donde el sustrato está en la posición de reacción en meta en comparación con la posición de reacción en para. Las entradas en la parte superior de la lista representan cuando las mutaciones favorecen la O-metilación en meta frente a la O-metilación en para.
En la etapa (vi), se selecciona un número limitado de dichos candidatos de la etapa (v) basándose en los valores de energía. Las mutaciones no se seleccionan cuando (1) las mutaciones no son energéticamente favorables o (2) cuando no está previsto que las mutaciones alteren la regioselectividad.
Como se describe en la presente memoria, la aplicación del método descrito antes a la Hs COMT producía la identificación de un conjunto de mutaciones que se diseñan para mejorar la regioselectividad enzimática de la O-metilación. Las mutaciones se pueden usar independientemente o en combinación.
En la isoforma unida a membrana de Hs COMT, el número de restos equivalentes son los de Hs COMT solubles más cincuenta. Por lo tanto, los restos descritos o sustituidos en la Hs COMT también se deduce que se describen o sustituyen en el número de resto más cincuenta en la Hs COMT unida a membrana.
La invención proporciona un polipéptido de COMT mutante, el cual (1) tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos un porcentaje, tal como al menos 85 por ciento, por ejemplo al menos 90 por ciento, tal como al menos 95 por ciento, por ejemplo al menos 96 por ciento, tal como al menos 97 por ciento, por ejemplo al menos 98 por ciento, tal como al menos 99 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27, determinado a lo largo de la longitud entera de la SEQ ID NO:27; y (2) tiene al menos una sustitución de aminoácido en una posición que se alinea con la posición 198 de la SEQ ID NO: 27 descrita en la presente memoria; y (3) es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH del ácido protocatéquico, en donde dicha metilación da como resultado la generación de al menos 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 veces más ácido vainíllico en comparación con el ácido isovainíllico. Además de estas características, dicho polipéptido de COMT mutante también puede ser capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH del ácido protocatéquico, en donde dicha metilación da como resultado la generación de al menos 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 veces más vainillina en comparación con la isovainillina; y/o ser capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH del alcohol protocatéquico, en donde dicha metilación da como resultado la generación de al menos 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 veces más alcohol de vainillilo en comparación con el alcohol de isovainillilo.
Por lo tanto, el polipéptido de COMT mutante es un polipéptido de COMT mutante con características como se han indicado antes, en donde dicha sustitución es una sustitución de la leucina en la posición que se alinea con la posición 198 de la SEQ ID NO: 27 Asn, Asp, Cys, Glu, Phe o Tyr. Sin embargo, preferiblemente dicha sustitución es una sustitución de la leucina en la posición que se alinea con la posición 198 de la SEQ ID NO: 27 por tirosina. El polipéptido de COMT mutante puede tener una sustitución del ácido glutámico en la posición que se alinea con la posición 199 de la SEQ ID NO: 27 por Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val. Sin embargo, preferiblemente dicha sustitución es una sustitución del ácido glutámico en la posición que se alinea con la posición 199 de la SEQ ID NO: 27 por alanina o glutamina. La sustitución del ácido glutámico que se alinea con la posición 199 de la SEQ ID NO: 27 por alanina o glutamina aumentaba la regioselectividad de la O-metilación meta>para en el aldehído protocatéquico.
El polipéptido de COMT mutante puede tener una o más de las siguientes mutaciones: una sustitución de la metionina por arginina, lisina o alanina en una posición que se alinea con la posición 40 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27, una sustitución del triptófano por una tirosina, lisina, histidina o arginina en una posición que se alinea con la posición 143 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27 una sustitución de la prolina por una isoleucina, arginina o tirosina en una posición que se alinea con la posición 174 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27; una sustitución del triptófano por una arginina o lisina en una posición que se alinea con la posición 38 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27; una sustitución de la cisteína por una fenilalanina, tirosina, ácido glutámico, triptófano o metionina en una posición que se alinea con la posición 173 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27; y/o una sustitución de arginina por una serina, ácido glutámico o ácido aspártico en una posición que se alinea con la posición 201 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27.
Porcentaje de identidad
Las identidades de secuencias dadas en la presente memoria son identidad de secuencia a lo largo de la longitud entera de la secuencia de referencia. Por consiguiente, la identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos proporcionada como la SEQ ID NO: 27 en la presente memoria, es la identidad de secuencia a lo largo de la longitud entera de la SEQ ID NO: 27, respectivamente.
El porcentaje de identidad se puede determinar como sigue. Una secuencia de referencia (p. ej., una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27) se alinea con una o más secuencias candidatas usando el programa de ordenador ClustalW (versión 1.83, parámetros por defecto), que permite llevar a cabo alineamientos de secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos a lo largo de su longitud entera (alineamiento global). Chenna et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31(13):3497-500.
ClustalW calcula el mejor emparejamiento entre una secuencia de referencia y una o más secuencias candidatas, y las alinea de modo que se pueden determinar las identidades, similitudes y diferencias. Se pueden insertar huecos de uno o más restos en una secuencia de referencia, una secuencia candidata, o ambas, para maximizar los alineamientos de las secuencias. Para el alineamiento por pares rápido de secuencias de ácidos nucleicos, se usan los siguientes parámetros por defecto: tamaño de palabra: 2; tamaño de ventana: 4; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 4; y penalización por hueco; 5. Para alineamientos múltiples de secuencias de ácidos nucleicos, se usan los siguientes parámetros: penalización por apertura de hueco: 10,0; penalización por extensión de hueco: 5,0; y transiciones de peso: si. Para el alineamiento por pares rápido de secuencias de proteínas, se usan los siguientes parámetros: tamaño de palabra: 1; tamaño de ventana: 5; método de puntuación: porcentaje; número de diagonales superiores: 5; penalización por hueco; 3. Para alineamiento múltiple de secuencias de proteínas, se usan los siguientes parámetros: peso de matriz: blosum; penalización por apertura de hueco: 10,0; penalización por extensión de hueco: 0,05; huecos hidrófilos: seleccionado: restos hidrófilos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg y Lys; penalizaciones por hueco específico de resto: activado. El resultado de ClustalW es un alineamiento de secuencias que refleja la relación entre secuencias.
Para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos candidata con una secuencia de referencia, las secuencias se alinean usando ClustalW, el número de emparejamientos idénticos en el alineamiento se divide entre la longitud de la secuencia de referencia, y el resultado se multiplica por 100. Hay que indicar que el valor del porcentaje de identidad se puede redondear a la décima más cercana. Por ejemplo, 78,11, 78,12, 78,13 y 78,14 se pueden redondear a 78,1, mientras que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 y 78,19 se redondean a 78,2.
Sustituciones de aminoácidos
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras sustituyen un aminoácido por un aminoácido de la misma clase, mientras que las sustituciones de aminoácidos no conservadoras sustituyen un aminoácido por un aminoácido de una clase diferente. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen sustituciones de aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (1) glicina y alanina; (2) valina, isoleucina y leucina; (3) ácido aspártico y ácido glutámico; (4) asparagina, glutamina, serina y treonina; (5) lisina, histidina y arginina; y (6) fenilalanina y tirosina.
Las sustituciones de aminoácidos no conservadoras pueden sustituir un aminoácido de una clase por un aminoácido de una clase diferente. Las sustituciones no conservadoras pueden hacer un cambio sustancial en la carga o hidrofobicidad del producto génico. Las sustituciones de aminoácidos no conservadoras también pueden hacer un cambio sustancial en el volumen de la cadena lateral del resto, p. ej., sustitución de un resto de isoleucina por una alanina. Los ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un aminoácido básico por un aminoácido no polar o un aminoácido ácido por un aminoácido polar. Un experto en la técnica apreciará que se pueden sustituir aminoácidos similares por los mutantes descritos en la presente memoria.
Ácidos nucleicos
Este documento también proporciona ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de COMT mutante. Un "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presente en un genoma, incluyendo ácidos nucleicos que normalmente flanquean uno o ambos lados del ácido nucleico en un genoma. El término "aislado" como se usa en la presente memoria con respecto a ácidos nucleicos incluye cualquier secuencia de ácido nucleico que no es natural, puesto que dichas secuencias que no son naturales no se encuentran en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma que es natural.
Un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN, con la condición de que se elimine o esté ausente una de las secuencias de ácido nucleico que se encuentra flanqueando inmediatamente esa molécula de ADN en un genoma que es natural. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, una molécula de ADN que existe como una molécula separada (p. ej., un ácido nucleico químicamente sintetizado, o un ADNc o fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias, así como ADN que se incorpora en un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (p. ej., cualquier paramixovirus, retrovirus, lentivirus, adenovirus o herpesvirus), o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico genéticamente modificado tal como una molécula de ADN que es parte de un ácido nucleico híbrido o de fusión. Un ácido nucleico que existe entre cientos de millones de otros ácidos nucleicos, por ejemplo, en bibliotecas de ADNc, genotecas o corte de gel que contienen una digestión por restricción de ADN genómico, no se considera un ácido nucleico aislado.
Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de COMT se pueden modificar usando técnicas de clonación molecular comunes (p. ej., mutagénesis dirigida al sitio) para generar mutaciones en posiciones particulares del polipéptido codificado (p. ej., posiciones que se alinean con la posición 38, 40, 143, 173, 174, 198 o 201 de la forma soluble de la secuencia de aminoácidos de COMT humana expuesta en la SEQ ID NO: 27). Las moléculas de ácido nucleico pueden incluir una mutación de nucleótido única o más de una mutación, o más de un tipo de mutación.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante de esta invención puede incluir una secuencia de marcador que codifica un "marcador" destinado a facilitar la posterior manipulación (p. ej., a facilitar la purificación o detección), secreción o localización del polipéptido codificado. Las secuencias de marcadores se pueden insertar en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de COMT de modo que el marcador codificado se localiza en el extremo carboxilo o amino del polipéptido de COMT. Ejemplos no limitantes de marcadores codificados incluyen la proteína verde fluorescente (g Fp ), glutatión S transferasa (GST), marcador HIS y marcador FLAG (Kodak, New Haven, CT). Otros ejemplos de marcadores incluyen un péptido de transito de cloroplasto, un péptido de tránsito mitocondrial, un péptido de amiloplasto, péptido señal o un marcador de secreción.
Los polipéptidos (mutantes o de tipo natural) de esta invención se pueden producir usando cualquier método. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden producir por síntesis química. Alternativamente, los polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden producir por tecnología recombinante convencional usando vectores de expresión heterólogos que codifican polipéptidos. Los vectores de expresión se pueden introducir en células hospedantes (p. ej., por transformación o transfección) para la expresión del polipéptido codificado, el cual después se puede purificar. Los sistemas de expresión que se pueden usar para la producción a pequeña o gran escala de polipéptidos incluyen, sin limitación, microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli y B. subtilis) transformados con ADN bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vectores de expresión de ADN cósmido que contienen moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, y levaduras (p. ej., S. cerevisiae o S. pombe) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria. Los sistemas de expresión útiles también incluyen sistemas de células de insectos infectadas con los vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, y sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico del tabaco) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contienen moléculas de ácido nucleico descritas en la presente memoria. Los polipéptidos de esta invención también se pueden producir usando sistemas de expresión de mamíferos que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (p. ej., el promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío de adenovirus y el promotor de citomegalovirus), junto con los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria. Los polipéptidos de esta invención pueden tener un marcador N-terminal o C-terminal como se ha descrito antes.
Hospedantes recombinantes
Esta invención también caracteriza hospedantes recombinantes. Como se usa en la presente memoria, la expresión hospedante recombinante se pretende que se refiera a un hospedante, cuyo genoma se ha aumentado en al menos una secuencia de ADN incorporada. Dichas secuencias de ADN incluyen genes que no están presentes de forma natural, secuencias de ADN que normalmente no son transcritas en ARN o traducidas en una proteína ("expresadas"), y otros genes y secuencias de ADN que se desean introducir en el hospedante no recombinante. Se apreciará que típicamente el genoma de un hospedante recombinante descrito en la presente memoria se aumenta por la introducción estable de uno o más genes recombinantes. Sin embargo, también se pueden usar plásmidos o vectores autónomos o replicativos dentro del alcance de esta invención. Además, la presente invención se puede poner en práctica usando un plásmido o vector de número de copias bajo, p. ej., una sola copia, o número de copias alto (como se ilustra en la presente memoria).
En general, el ADN introducido no reside originalmente en el hospedante que es el receptor del ADN, pero está dentro del alcance de la invención aislar un segmento de ADN de un hospedante dado, y posteriormente introducir una o más copias adicionales de ese ADN en el mismo hospedante, p. ej., para potenciar la producción del producto de un gen o alterar el patrón de expresión de un gen. En algunos casos, el ADN introducido modificará o incluso sustituirá un gen endógeno o secuencia de ADN por, p. ej., recombinación homóloga o mutagénesis dirigida al sitio. Los hospedantes recombinantes adecuados incluyen microorganismos, células de plantas y plantas.
La expresión "gen recombinante" se refiere a un gen o secuencia de ADN que se introduce en un hospedante receptor, independientemente de si puede estar ya presente en dicho hospedante el mismo o similar gen o secuencia de ADN. "Introducido" o "aumentado" en este contexto, se sabe en la técnica que significa introducido o aumentado por la mano del hombre. Por lo tanto, un gen recombinante puede ser una secuencia de ADN de otra especie, o puede ser una secuencia de ADN que procede o está presente en la misma especie, pero se ha incorporado en un hospedante por métodos recombinantes para formar un hospedante recombinante. Se apreciará que un gen recombinante que se introduce en un hospedante puede ser idéntico a una secuencia de ADN que está normalmente presente en el hospedante que se va a transformar, y se introduce para proporcionar una o más copias adicionales del ADN para así permitir la sobreexpresión o expresión modificada del producto génico de ese ADN.
Un gen recombinante que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria incluye la secuencia codificante para ese polipéptido, operativamente unida, en la orientación paralela, a una o más regiones reguladoras adecuadas para la expresión del polipéptido. Debido a que muchos microorganismos son capaces de expresar múltiples productos génicos a partir de un ARNm policistrónico, se pueden expresar múltiples polipéptidos bajo el control de una sola región reguladora para esos microorganismos, si se desea. Una secuencia codificante y una región reguladora se considera que están operativamente unidas cuando la región reguladora y la secuencia codificante están situadas de modo que la región reguladora es eficaz para regular la transcripción o traducción de la secuencia. Típicamente, el sitio de inicio de la traducción del marco de lectura traduccional de la secuencia codificante está situado entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en la dirección 3' de la región reguladora para un gen monocistrónico.
En muchos casos, la secuencia codificante de un polipéptido descrito en la presente memoria se identifica en una especie distinta del hospedante recombinante, es decir, es un ácido nucleico heterólogo. La expresión "ácido nucleico heterólogo" como se usa en la presente memoria, se refiere a un ácido nucleico introducido en un hospedante recombinante, en donde dicho ácido nucleico no está naturalmente presente en dicho hospedante. Por lo tanto, si el hospedante recombinante es un microorganismo, la secuencia codificante pude ser de microorganismos procariotas o eucariotas, de plantas o de animales. Sin embargo, en algún caso, la secuencia codificante es una secuencia que es originaria del hospedante y se está reintroduciendo en ese organismo. Una secuencia originaria se puede distinguir a menudo de la secuencia que se encuentra de forma natural por la presencia de secuencias no naturales unidas al ácido nucleico exógeno, p. ej., secuencias reguladoras no originarias que flanquean una secuencia originaria en una construcción de ácido nucleico recombinante. Además, los ácidos nucleicos exógenos transformados de forma estable típicamente se integran en posiciones distintas de la posición donde se encuentra la secuencia originaria.
"Región reguladora" se refiere a un ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos que influyen en el inicio y velocidad de transcripción o traducción, y la estabilidad y/o movilidad de un producto de transcripción o traducción. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitación, secuencias de promotores, secuencias de potenciadores, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteínas, elementos inducibles, secuencias de unión de proteínas, regiones no traducidas (UTRs) 5' y 3', sitios de inicio de la transcripción, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, intrones y combinaciones de las mismas. Una región reguladora típicamente incluye al menos un promotor nuclear (basal). Una región reguladora también puede incluir al menos un elemento de control, tal como una secuencia de potenciador, un elemento en la dirección 5' o región de activación en la dirección 5' (UAR). Una región reguladora se une operativamente a una secuencia codificante colocando la región reguladora y la secuencia codificante de modo que la región reguladora sea eficaz para regular la transcripción o traducción de la secuencia. Por ejemplo, para unir operativamente una secuencia codificante a una secuencia de promotor, el sitio de inicio de la traducción del marco de lectura traduccional de la secuencia codificante está colocada típicamente entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en la dirección 3' del promotor. Sin embargo, una región reguladora puede estar colocada como mucho aproximadamente 5.000 nucleótidos en la dirección 5' del sitio de inicio de la traducción, o aproximadamente 2.000 nucleótidos en la dirección 5' del sitio de inicio de la traducción.
La elección de las regiones reguladoras que se van a incluir depende de varios factores, que incluyen eficacia, seleccionabilidad, inducibilidad, nivel de expresión deseado y expresión preferencial durante ciertas etapas del cultivo. Para un experto en la técnica es una cuestión rutinaria modular la expresión de una secuencia codificante seleccionando adecuadamente y colocando regiones reguladoras con respecto a la secuencia codificante. Se entenderá que puede estar presente más de una región reguladora, p. ej., intrones, potenciadores, regiones de activación en dirección 5', terminadores de la transcripción y elementos inducibles.
Se pueden combinar uno o más genes, por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos heterólogos en una construcción de ácido nucleico en "módulos" útiles para un aspecto discreto de la producción de vainillina y/o glucósido de vainillina. La combinación de una pluralidad de genes o ácidos nucleicos heterólogos en un módulo facilita el uso del módulo en una variedad de especies. Por ejemplo, un grupo de genes de vainillina se puede combinar de modo que cada secuencia codificante esté operativamente unida a una región reguladora separada, para formar un módulo de vainillina para la producción en organismos eucariotas. Alternativamente, el módulo puede expresar un mensaje policistrónico para la producción de vainillina y/o glucósido de vainillina en hospedantes procariotas tales como especies de Rodobacter, E. coli, Bacillus o Lactobacillus. Además de los genes útiles para la producción de vainillina o glucósido de vainillina, una construcción recombinante típicamente también contiene un origen de la replicación, y uno o más marcadores seleccionables para el mantenimiento de la construcción en especies adecuadas.
Se apreciará que, debido a la degeneración del código genético, una serie de ácidos nucleicos pueden codificar un polipéptido particular; es decir, para muchos aminoácidos, hay más de un triplete de nucleótidos que sirve como codón para el aminoácido. Por lo tanto, los codones en la secuencia codificante para un polipéptido dado se pueden modificar de modo que se obtenga la expresión óptima en un hospedante particular, usando tablas de sesgo de codones para ese hospedante (p. ej., microorganismo). Como ácidos nucleicos aislados, estas secuencias modificadas pueden existir como moléculas purificadas y se pueden incorporar en un vector o un virus para usar en módulos de construcción para construcciones de ácidos nucleicos recombinantes.
Los hospedantes recombinantes descritos en la presente memoria expresan polipéptidos de COMT mutantes. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un hospedante recombinante que alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de COMT mutante, que puede ser cualquiera de los polipéptidos mutantes descritos en la presente memoria. En particular, la invención se refiere a un hospedante recombinante que alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica dicho polipéptido de AROM mutante, en donde dicho ácido nucleico está operativamente unido a una región reguladora que permite la expresión en dicho hospedante recombinante.
Dichos hospedantes pueden incluir además genes adicionales o módulos biosintéticos para producir vainillina o glucósido de vainillina, mejorar la eficacia con la que la energía y fuentes de carbono se convierten en vainillina y su glucósido, y/o para potenciar la productividad del cultivo celular o planta. Dichos módulos biosintéticos adicionales pueden incluir uno o más de un gen que codifica un polipéptido de 3DSD, un gen que codifica una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) y un gen que codifica un polipéptido de UGT. Véase la figura 1. Estos genes pueden ser genes endógenos o genes recombinantes. Además, cuando la célula hospedante alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de COMT mutante, la célula hospedante puede incluir además un gen de AROM de tipo natural. Además, el hospedante puede expresar además una enzima alcohol de vainillilo oxidasa (VAO).
Se conocen polipéptidos de 3DSD adecuados. Un polipéptido de 3DSD de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier enzima con actividad de 3-deshidro-shikimato deshidratasa. Preferiblemente, el polipéptido de 3DSD es una enzima capaz de catalizar la conversión del 3-deshidro-shikimato en protocatecuato y H2O. Un polipéptido de 3DSD de acuerdo con la presente invención preferiblemente es una enzima clasificada como EC 4.2.1.118. Por ejemplo, un polipéptido adecuado que tiene actividad de 3DSD incluye el polipéptido de 3DSD hecho por Podospora pauciseta, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp., Aspergillus niger o Neurospora crassa. Véanse los números de acceso en GENBANK CAD60599, XP_001905369.1, XP_761560.1, ABG93191.1, AAC37159.1 y XM_001392464. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de 3DSD de Podospora anserina, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp., Aspergillus niger o Neurospora crassa o un homólogo funcional de cualquiera de los anteriores que comparte al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95%, por ejemplo al menos 98% de identidad de secuencia con el mismo.
Igualmente, los polipéptidos de AROM de tipo natural son conocidos. Por ejemplo, los polipéptidos de AROM de tipo natural adecuados incluyen AROM hecha por S. cerevisiae, S. pombe, S. japonicas, N. crassa, y Y. Lipolytica, véanse los n° de acceso en GENBANK X06077, NP_594681.1, XP_002171624 y XP_956000.
Los polipéptidos de ACAR son conocidos. Los polipéptidos de ACAR pueden ser cualquier enzima que tenga actividad de ácido carboxílico aromático reductasa. Preferiblemente, el polipéptido de ACAR es una enzima capaz de catalizar la conversión de ácido protocatéquico en aldehido protocatéquico y/o la conversión de ácido vainíllico en vainillina. Un polipéptido de ACAR preferiblemente es una enzima clasificada como EC 1.2.1.30. Por ejemplo, un polipéptido de ACAR adecuado lo produce el género Nocardia. Véase, p. ej., n° de acceso en GENBANK AY495697. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de ACAR del género Nocardia o un homólogo funcional del mismo que comparte al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95%, por ejemplo al menos 98% de identidad de secuencia con el mismo.
Los polipéptidos de PPTasa son conocidos. Un polipéptido de PPTasa puede ser cualquier enzima capaz de catalizar la fosfopanteteinilación. Por ejemplo, un polipéptido de PPTasa adecuado es una enzima capaz de catalizar la fosfopanteteinilación de ACAR. Por ejemplo, un polipéptido de PPTasa adecuado es producido por E. coli, Corynebacterium glutamicum o Nocardia farcinica. Véanse los n° de acceso en GENBANK NP_601186, BAA35224 y YP_120266. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de PPTasa de E. coli, C. glutamicum o N. farcinica o un homólogo funcional de cualquiera de los mencionados antes que comparte al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95%, por ejemplo al menos 98% de identidad de secuencia con el mismo.
La glucosilación de la vainillina es particularmente útil. El p-D-glucósido de vainillina es la forma de almacenamiento de la vainillina que se encuentra en la vaina de vainilla. No es tóxico para la mayoría de los organismos, incluyendo levaduras, y tiene una mayor solubilidad en agua, en comparación con la vainillina. Además, la formación del p-D-glucósido de vainillina dirige lo más probablemente la biosíntesis hacia la producción de vainillina. UGT72E2 (Hansen, et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75:2765-27740) presentaba una alta especificidad de sustrato hacia la vainillina. En concordancia con esta observación, su expresión en la cepa de S. cerevisiae que produce vainillina daba como resultado que prácticamente toda la vainillina se convertía en p-D-glucósido de vainillina. La capacidad de convertir la vainillina en p-D-glucósido de vainillina in vivo es importante, porque la producción microbiana de vainillina no glucosilada más allá de la escala de 0,5-1 g/litro estaría dificultada por la toxicidad de la vainillina libre. La glucosilación sirve para evitar el efecto inhibidor.
Por consiguiente, el hospedante recombinante de esta invención también expresa un polipéptido de UGT. Un polipéptido de UGT puede ser cualquier UDP-Glucosa:Aglicón-Glucosiltransferasa. Preferiblemente, los polipéptidos de UGT pueden catalizar la glucosilación de la vainillina (es decir, para producir beta-D-glucósido de vainillina). Por lo tanto, el polipéptido de UGT puede ser una familia de 1 glicosilatransferasa. Los polipéptidos de UGT preferidos se clasifican como EC 2.4.1. Los polipéptidos de UGT adecuados incluyen UGT71C2, UGT72B1, UGT72E2, UGT84A2, UGT89B1, UGT85B1, y polipéptidos de arbutina sintasa. Véanse, p. ej., los n° de acceso en GENBANK AC0005496, NM_116337 y NM_126067. UGT72E2 de A. thaliana es particularmente útil (véase, p. ej., Hansen, et al. (2009) véase antes). Por lo tanto, el hospedante recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica UGT71C2, UGT72B1, UGT72E2, UGT84A2, UGT89B1, UGT85B1, o la arbutina sintasa o un homólogo funcional de cualquiera de los mencionados antes que comparte al menos 80%, tal como al menos 85%, por ejemplo al menos 90%, tal como al menos 95%, por ejemplo al menos 98% de identidad de secuencia con el mismo. Se describen otros UGT útiles en el documento WO 01/40491.
Como una realización adicional, una enzima VAO (EC 1.1.3.38) también puede ser expresada por células hospedantes para oxidar cualquier alcohol de vainillilo formado a vainillina. Las enzimas VAO son conocidas en la técnica e incluyen enzimas de hongos filamentosos tales como Fusarium monilifomis (n° de acceso en GENBANK AFJ11909) y Penicillium simplicissium (n° de acceso en GENBANK P56216; Benen, et al. (1998) J. Biol. Chem.
273:7865-72) y bacterias tales como Modestobacter marinus (n° de acceso en GENBANK YP_006366868), Rhodococcus jostii (n° de acceso en GENBANK YP_703243.1) y R. opacus (n° de acceso en GENBANK EHI39392).
En algunos casos, es deseable inhibir una o más funciones de un polipéptido endógeno con el fin de desviar productos intermedios metabólicos hacia la biosíntesis de vainillina o glucósido de vainillina. Por ejemplo, se puede reducir la actividad de piruvato descarboxilasa (PDC1) y/o de glutamato deshidrogenasa. En dichos casos, se puede incluir un ácido nucleico que inhibe la expresión del polipéptido o producto génico en una construcción recombinante que es transformada en la cepa. Alternativamente, se puede usar mutagénesis para generar mutantes en genes para los que se desea inhibir la función.
Son adecuados una serie de procariotas y eucariotas para usar en la construcción de microorganismos recombinantes descritos en la presente memoria, p. ej., bacterias gram negativas, bacterias gram positivas, levaduras y otros hongos. Se analiza primero una especie o cepa seleccionada para usar como una cepa de producción de vainillina o glucósido de vainillina para determinar que genes de producción son endógenos de la cepa y que genes no están presentes. Los genes para los que no está presente un equivalente endógeno en la cepa, se ensamblan en una o más construcciones recombinantes, que después se transforman en la cepa con el fin de suministrar la o las funciones que faltan.
Las especies procariotas y eucariotas de ejemplo se describen con más detalle más adelante. Sin embargo, se apreciará que pueden ser adecuadas otras especies. Por ejemplo, las especies adecuadas pueden ser de un género Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, Corynebacterium, Escherichia, Fusarium/Gibberella, Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaffia, Phanerochaete, Pichia, Physcomitrella, Rhodoturula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sphaceloma, Xanthophyllomyces Yarrowia y Lactobacillus. Las especies de ejemplo de dichos géneros incluyen Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphureus, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Physcomitrella patens, Rhodoturula glutinis 32, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma UBV-AX, Xanthophyllomyces dendrorhous, Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi, Candida utilis y Yarrowia lipolytica. En algunas realizaciones, un microorganismo puede ser un ascomiceto tal como Gibberella fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger o Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, un microorganismo puede ser un procariota tal como Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides o Rhodobacter capsulatus. Se apreciará que algunos microorganismos se pueden usar para cribar y ensayar genes de interés de una forma de alta capacidad, mientras que otros microorganismos con productividad o características de crecimiento deseadas se pueden usar para la producción a gran escala de beta-D-glucósido de vainillina.
Se describen ejemplos específicos de hospedantes recombinantes útiles en el documento WO 01/40491, así como en Hansen et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75:2765-2774 y Brochado, et al. (2010) Microbial Cell Factories 9:84, en donde el hospedante recombinante de acuerdo con esta invención contiene un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de COMT mutante en lugar de los genes de OMT descritos en el documento WO 01/40491.
Un hospedante recombinante preferido para usar con la presente invención es S. cerevisiae, que se puede modificar genéticamente de forma recombinante como se describe en la presente memoria. S. cerevisiae es un organismo de bastidor ampliamente usado en biología sintética, y se puede usar como la plataforma de microorganismo recombinante. Hay bibliotecas de mutantes, plásmidos, modelos de ordenador detallados de metabolismo y otra información para S. cerevisiae, que permiten un diseño racional de diferentes módulos para potenciar el rendimiento del producto. Los métodos para hacer microorganismos recombinantes son conocidos. La cepa VG4 de S. cerevisiae (Brochado, et al. (2010) Microb. Cell Fact. 9:84) es particularmente útil. VG4 tiene el genotipo de pdc1úgdh1ú\GDH2.
Las especies de Aspergillus tales como A. oryzae, A. niger y A. sojae son microorganismos ampliamente usados en la producción de alimento, y también se pueden usar como la plataforma de microorganismo recombinante. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede ser Aspergillus spp. Están disponibles secuencias de nucleótidos para genomas de A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae, A. clavatus, A. flavus, A. niger y A. terreus, que permiten el diseño racional y la modificación de rutas endógenas para potenciar el flujo y aumentar el rendimiento del producto. Se han desarrollado modelos metabólicos para Aspergillus, así como estudios transcriptómicos y estudios proteómicos. A. niger se cultiva para la producción industrial de una serie de ingredientes de alimentos tales como ácido cítrico y ácido glucónico, y por lo tanto, especies como A. niger en general son adecuadas para la producción de ingredientes de alimentos tales como la vainillina y glucósido de vainillina.
E. coli, otro organismo plataforma ampliamente usado en biología sintética, también se puede usar como la plataforma de microorganismo recombinante. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede ser E. coli. De forma similar a Saccharomyces, hay bibliotecas de mutantes, plásmidos, modelos de ordenador detallados de metabolismo y otra información para E. coli, que permiten un diseño racional de diferentes módulos para potenciar el rendimiento del producto. Se pueden usar métodos similares a los descritos antes para Saccharomyces para hacer microorganismos recombinantes de E. coli.
Se puede usar Rhodobacter como la plataforma de microorganismo recombinante. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede ser Rhodobacter spp. De forma similar a E. coli, hay bibliotecas de mutantes así como vectores de plásmidos adecuados, que permiten el diseño racional de diferentes módulos para potenciar el rendimiento del producto. Se pueden usar métodos similares a los descritos antes para E. coli para hacer microorganismos recombinantes de Rhodobacter.
Los musgos Physcomitrella, cuando crecen en cultivo en suspensión, tienen características similares a cultivos de levaduras y otros cultivos fúngicos. Este género se está convirtiendo en un tipo importante de célula para la producción de metabolitos secundarios de plantas, que pueden ser difíciles de producir en otros tipos de células. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede ser una Physcomitrella spp.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en la presente memoria se introducen en plantas o células de plantas para aumentar la producción general de vainillina o glucósido de vainillina. Por lo tanto, un hospedante recombinante puede ser una planta o una célula de planta que incluye al menos un ácido nucleico heterólogo descrito en la presente memoria. Una planta o célula de planta se puede transformar al tener un ácido nucleico heterólogo integrado en su genoma, es decir, se puede transformar establemente. Las células transformadas establemente típicamente retienen el ácido nucleico introducido con cada división celular. Una planta o célula de planta también se puede transformar de manera transitoria de modo que el ácido nucleico heterólogo no se integre en su genoma. Las células transformadas de forma transitoria típicamente pierden todo o una parte del ácido nucleico introducido con cada división celular de modo que el ácido nucleico introducido no se puede detectar en células hija después de un número suficiente de divisiones celulares. Las plantas y células de plantas transgénicas tanto transformadas de forma transitoria como transformadas establemente pueden ser útiles en los métodos descritos en la presente memoria.
Las células de plantas transgénicas usadas en los métodos descritos en la presente memoria pueden constituir parte o todo de una planta entera. Dichas plantas se pueden desarrollar de una forma adecuada para la especie en consideración, sea en una cámara de cultivo, un invernadero o en un campo. Las plantas transgénicas se pueden cruzar como se desee para un propósito particular, p. ej., para introducir un ácido nucleico heterólogo, por ejemplo una construcción de ácido nucleico recombinante en otras líneas, para transferir un ácido nucleico heterólogo a otras especies, o para la selección adicional de otras características deseables. Alternativamente, las plantas transgénicas se pueden propagar de forma vegetativa para las especies sensibles a dichas técnicas. Como se usa en la presente memoria, una planta transgénica también se refiere a la progenie de una planta transgénica inicial con la condición de que la progenie herede el transgén. Las semillas producidas por una planta transgénica se pueden cultivar y después autofecundar (o cruzar y autofecundar) para obtener semillas homocigotas para la construcción de ácido nucleico.
Las plantas transgénicas se pueden cultivar en un cultivo en suspensión, o cultivo tisular o de órgano. Para los propósitos de esta invención, se pueden usar técnicas de cultivo de tejido sólido y/o líquido. Cuando se usa medio sólido, las células de plantas transgénicas se pueden poner directamente sobre el medio o se pueden poner sobre un filtro que después se pone en contacto con el medio. Cuando se usa medio líquido, las células de plantas transgénicas se pueden poner sobre un dispositivo de flotación, p. ej., una membrana porosa que se pone en contacto con el medio líquido.
Cuando se usan células de plantas transformadas de forma transitoria, se puede incluir una secuencia indicadora que codifica un polipéptido indicador que tiene actividad de indicador, en el procedimiento de transformación y se puede llevar a cabo un ensayo de actividad o expresión de indicador en un tiempo adecuado después de la transformación. Un tiempo adecuado para llevar a cabo el ensayo típicamente es de aproximadamente 1-21 días después de la transformación, p. ej., aproximadamente 1-14 días, aproximadamente 1-7 días, o aproximadamente 1­ 3 días. El uso de ensayos transitorios es particularmente conveniente para el análisis rápido en diferentes especies, o para confirmar la expresión de un polipéptido heterólogo cuya expresión no se ha confirmado previamente en células receptoras particulares.
Las técnicas para introducir ácidos nucleicos en plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas son conocidas en la técnica, e incluyen, sin limitación, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por vector vírico, electroporación y transformación con pistola de partículas; véanse las patentes de EE.UU. n° 5.538.880; 5.204.253; 6.329.571; y 6.013.863. Si una célula o tejido cultivado se usa como el tejido receptor para la transformación, las plantas se pueden regenerar a partir de cultivos transformados si se desea, por técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
En una población de plantas transgénicas se puede cribar y/o seleccionar los miembros de la población que tengan un rasgo o fenotipo conferido por la expresión del transgén. Por ejemplo, se pueden cribar en una población de progenie de un solo suceso de transformación las plantas que tienen un nivel deseado de expresión de un polipéptido o ácido nucleico descrito en la presente memoria. Se pueden usar métodos físicos y bioquímicos para identificar niveles de expresión. Estos incluyen el análisis Southern o la amplificación por PCR para la detección de un polinucleótido; transferencias Northern, protección de S1 RNasa, extensión de cebador o amplificación por RT-PCR para detectar transcritos de ARN; ensayos enzimáticos para detectar actividad de enzimas o ribozimas de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis en gel de proteínas, transferencias Western, inmunoprecipitación e inmunoensayos ligados a enzimas para detectar polipéptidos. También se pueden usar otras técnicas tales como hibridación in situ, tinción enzimática e inmunotinción, para detectar la presencia o expresión de polipéptidos y/o ácidos nucleicos. Se conocen métodos para llevar a cabo todas las técnicas mencionadas.
Como una alternativa, se puede cribar en una población de plantas con sucesos de transformación independientes las plantas que tienen un rasgo deseado, tal como producción de glucósido de vainillina. La selección y/o cribado se puede llevar a cabo en una o más generaciones y/o en más de una localización geográfica. En algunos casos, las plantas transgénicas se pueden cultivar y seleccionar en condiciones que inducen un fenotipo deseado o que es necesario de otra forma para producir un fenotipo deseado en una planta transgénica. Además, la selección y/o cribado se puede aplicar durante una etapa del desarrollo particular en el que se espera que la planta presente el fenotipo. La selección y/o cribado se puede llevar a cabo para seleccionar las plantas transgénicas que tienen una diferencia estadísticamente significativa en el nivel de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina con respecto a una planta de control que carece del transgén.
Homólogos funcionales
Los homólogos funcionales de los polipéptidos descritos antes también son adecuados para usar en la producción de vainillina o glucósido de vainillina en un hospedante recombinante. Por lo tanto, el hospedante recombinante puede incluir uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican homólogos funcionales del polipéptido descrito antes y un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de COMT mutante como se describe en la presente memoria. Un homólogo funcional es un polipéptido que tiene similitud de secuencia con un polipéptido de referencia, y que lleva una o más funciones bioquímicas o fisiológicas del polipéptido de referencia. Un homólogo funcional y el polipéptido de referencia pueden ser polipéptidos naturales, y la similitud de secuencia se puede deber a sucesos convergentes o divergentes. Como tales, los homólogos funcionales a veces se denominan en la bibliografía homólogos, ortólogos o parálogos. Las variantes de los homólogos funcionales naturales, tales como polipéptidos codificados por mutantes de una secuencia codificante de tipo natural, pueden ser ellas mismas homólogos funcionales. Los homólogos funcionales también se pueden crear por mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia codificante de un polipéptido, o por combinación de dominios de secuencias codificantes de diferentes polipéptidos naturales ("intercambio de dominios"). Las técnicas para modificar genes que codifican polipéptidos de a Ro M y/o COMT funcionales descritos en la presente memoria son conocidas e incluyen, entre otras, técnicas de evolución dirigida, técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de mutagénesis aleatoria, y pueden ser útiles para aumentar la actividad específica de un polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, alterar los niveles de expresión, alterar la localización subcelular o modificar las interacciones polipéptido:polipéptido de una forma deseada. Dichos polipéptidos modificados se consideran homólogos funcionales. La expresión "homólogo funcional" a veces se aplica al ácido nucleico que codifica un polipéptido funcionalmente homólogo.
Los homólogos funcionales se pueden identificar por análisis de alineamientos de nucleótidos y polipéptidos. Por ejemplo, realizar una búsqueda en una base de datos de secuencias de nucleótidos o polipéptidos puede identificar homólogos de polipéptidos de AROM o COMT, polipéptidos de 3DSD, ACAR, PPTasa o UGT. Los análisis de secuencia pueden implicar análisis por BLAST, Reciprocal BLAST o PSI-BLAST de bases de datos no redundantes que usan una secuencia de aminoácidos de AROM o COMT, 3DSD, ACAR, una PPTasa, o secuencia de aminoácidos de UGT como la secuencia de referencia. La secuencia de aminoácidos a veces se deduce de la secuencia de nucleótidos. Los polipéptidos en la base de datos que tienen más de 40% de identidad de secuencia son candidatos para la evaluación adicional de la idoneidad como polipéptido para la biosíntesis de vainillina o glucósido de vainillina. La similitud de secuencias de aminoácidos permite sustituciones de aminoácidos conservadoras, tales como sustitución de un resto hidrófobo por otro o sustitución de un resto polar por otro. Si se desea, se puede llevar a cabo la inspección manual de dichos candidatos con el fin de estrechar el número de candidatos que se van a evaluar más. La inspección manual se puede llevar a cabo seleccionando los candidatos que parece que tienen dominios presentes en polipéptidos de AROM o COMT o polipéptidos de biosíntesis de vainillina, p. ej., dominios funcionales conservados.
Las regiones conservadas se pueden identificar localizando una región dentro de la secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido que es una secuencia repetida, forma alguna estructura secundaria (p. ej., hélices y láminas beta), establece dominios cargados positivos o negativos, o representa un motivo o dominio de proteína. Véase, p. ej., la base de datos Pfam que describe secuencias consenso para una variedad de motivos y dominios de proteínas. La información incluida en la base de datos Pfam se describe en Sonnhammer, et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26:320-322; Sonnhammer et al. (1997) Proteins 28:405-420; y Bateman et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27:260-262. Las regiones conservadas también se pueden determinar alineando secuencias de los mismos polipéptidos o relacionados de especies estrechamente relacionadas. Especies estrechamente relacionadas preferiblemente son de la misma familia. En algunas realizaciones, es adecuado el alineamiento de secuencias de dos especies diferentes.
Típicamente, los polipéptidos que presentan al menos aproximadamente 40% de identidad de secuencia de aminoácidos son útiles para identificar regiones conservadas. Las regiones conservadas de polipéptidos relacionados presentan al menos 45% de identidad de secuencia de aminoácidos (p. ej., al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas realizaciones, una región conservada presenta al menos 92%, 94%, 96%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia se puede determinar como se ha expuesto antes.
La invención se describirá además en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: Cepa indicadora de levadura para la producción de glucósido de vainillina a partir de glucosa
Se creó una cepa de levadura genéticamente estable productora de glucósido de vainillina a partir de glucosa como se describe en Brochado, et al. (2010) Microb. Cell Fact. 9:84, es decir, cepa VG4 con una eliminación de gen de PDC1 (piruvato descarboxilasa) y GDH1 (glutamato deshidrogenasa), y que sobreexpresaba GDH2. Además, la cepa albergaba una construcción de expresión que contiene una PPTasa integrada en la región interlocus ECM3 del genoma de levadura. La expresión de la secuencia que codifica la PPTasa de Corynebacterium glutamicum se controló por el promotor TPI1 de levadura (Hansen, et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75(9):2765-74. Epub 2009 Mar 13). La cepa resultante se designó V12.
Ejemplo 2: Construcción de una AROM que carece de dominio 5
Se aislaron los 3912 pb más cercanos a 5' del gen ARO1 de levadura, que incluyen todos los dominios funcionales excepto el dominio 5 (que tiene la actividad de shikimato deshidrogenasa), por amplificación por PCR de ADN genómico preparado a partir de la cepa de S. cerevisiae S288C, usando polimerasa de PCR correctora de errores. El fragmento de ADN resultante se subclonó en el vector de pTOPO y se secuenció para confirmar la secuencia de ADN. La secuencia de ácido nucleico y la correspondiente secuencia de aminoácidos se presentan en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. Este fragmento se sometió a digestión de restricción con SpeI y SalI y se clonó en los correspondientes sitios de restricción en el vector de expresión de levadura de alto número de copias p426-GPD (un vector basado en 2p), a partir del cual se puede expresar el gen insertado por el promotor fuerte GPD1 de levadura constitutivo. El plásmido resultante se denominó pVAN133.
Ejemplo 3: AROM de levadura con sustituciones de un solo aminoácido en el dominio 5
Todos los polipéptidos de AROM mutantes descritos en este ejemplo son polipéptidos de SEQ ID NO: 4, en donde un aminoácido se ha sustituido por otro aminoácido. Los polipéptidos de AROM mutantes se nombran como sigue: XnnnY, donde nnn indica la posición en la SEQ ID NO:4 del aminoácido, el cual se sustituye, X es el código de una letra del aminoácido en la posición nnn en la SEQ ID NO: 4 e Y es el código de una letra del aminoácido que sustituye a X. A modo de ejemplo A1533P se refiere a un polipéptido de AROM mutante de SEQ ID NO: 4, donde la alanina en la posición 1533 se sustituye por una prolina.
Se aislaron los 4764 pb completos del gen ARO1 de levadura por amplificación por PCR de ADN genómico preparado a partir de la cepa de S. cerevisiae S288C, usando polimerasa de PCR correctora de errores. El fragmento de ADN resultante se subclonó en el vector de pTOPO y se secuenció para confirmar la secuencia de ADN. La secuencia de ácido nucleico y la correspondiente secuencia de aminoácidos se presentan en la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Este fragmento se sometió a digestión de restricción con SpeI y SalI y se clonó en los correspondientes sitios de restricción en el vector de expresión de levadura de bajo número de copias p416-TEF (un vector basado en CEN-ARS), a partir del cual se puede expresar el gen a partir del promotor fuerte TEF. El plásmido resultante se denominó pVAN183.
El plásmido pVAN183 se usó para hacer 10 mutantes de ARO1 con dominio 5 diferentes, usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QUICKCHANGE II (Agilent Technologies). Con referencia a la SEQ ID NO: 4, los mutantes contenían las siguientes sustituciones de aminoácidos: A1533P, P1500K, R1458W, V1349G, T1366G, I1387H, W1571V, T1392K, K1370L y A1441P.
Después de confirmar la secuencia de estos genes de AROM mutantes, los plásmidos de expresión que contenían las sustituciones A1533P, P1500K, R1458W, V1349G, T1366G, I1387H, W1571V, T1392K, K1370L y A1441P se designaron pVAN368-pVAN377, respetivamente. La secuencia de ácido nucleico y las correspondientes secuencias de aminoácidos de los mutantes de AROM se dan en la tabla 1.
Tabla 1
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Ejemplo 4: Proteína de fusión de AROM y deshidratasa 3DHS de levadura
Se aislaron los 3951 pb más cercanos a 5' del gen ARO1 de levadura, que incluyen todos los dominios funcionales excepto el dominio 5 con la actividad de shikimato deshidrogenasa, por amplificación por PCR de ADN genómico preparado a partir de la cepa de S. cerevisiae S288C, usando polimerasa de PCR correctora de errores. El fragmento de ADN resultante se subclonó en el vector de pTOPO y se secuenció para confirmar la secuencia de ADN. Con el fin de fusionar este fragmento con el gen de la 3-deshidroshikimato deshidratasa (3DSD) de la ruta de la vainillina, se insertó el gen de 3DSD de Podospora pauciseta (Hansen, et al. (2009) véase antes) en los sitios XmaI-EcoRI del vector de expresión p426-GPD, y después el fragmento de ARO1 clonado se liberó y se insertó en los sitios SpeI-XmaI de la construcción resultante. El gen de fusión final se expresa a partir del promotor fuerte GPD1 de levadura constitutivo. El plásmido resultante se denominó pVAN132. La secuencia de ácido nucleico y la correspondiente secuencia de aminoácidos de esta proteína de fusión se presentan en la SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, respectivamente.
Ejemplo 5: Expresión de enzimas AROM mutantes o de fusión en levaduras que ya biosintetizan glucósido de vainillina.
Cada uno de los plásmidos descritos en los ejemplos 2, 3 y 4 se introdujo en la cepa de levadura V12 por transformación, usando el protocolo de transformación de acetato de litio, que da como resultado las siguientes cepas de levaduras: V12-Aro1-1 (que contiene el plásmido pVAN133), V12-Aro1-2 (que contiene el plásmido pVAN132), V12-1-3 (que contiene el plásmido pVAN183), V12-Aro1-4 (que contiene el plásmido pVAN368), V12-Aro1-5 (que contiene el plásmido pVAN369), V12-Aro1-6 (que contiene el plásmido pVAN370), V12-Aro1-7 (que contiene el plásmido pVAN371), V12-Aro1-8 (que contiene el plásmido pVAN372), V12-Aro1-9 (que contiene el plásmido pVAN373), V12-Aro1-10 (que contiene el plásmido pVAN374), V12-Aro1-11 (que contiene el plásmido pVAN375), V12-Aro1-12 (que contiene el plásmido pVAN376) and V12-Aro1-13 (que contiene el plásmido pVAN377).
Las cepas de levadura V12-Aro1-1, V12-Aro1-2, V12-1-3, V12-Aro1-4, V12-Aro1-5, V12-Aro1-6, V12-Aro1-7, V12-Aro1-8, V12-Aro1-9, V12-Aro1-10, V12-Aro1-11, V12-Aro1-12, y V12-Aro1-13 se cultivaron como cultivos de 200 ml en matraces de agitación Erlenmeyer de 500 ml usando medio de crecimiento SC (completo sintético) sin aminoácidos aromáticos, a 30°C con revoluciones moderadas (150 rpm) durante 72 horas. Se tomaron muestras a las 48 horas, y se determinó el contenido de glucósido de vainillina. Se incluyó como controles la cepa de levadura V12 que contiene los vectores vacíos p416-TEF o p426-GPD. La producción de glucósido de vainillina (VG) en las cepas de control (que contienen los plásmidos vacíos p416- y p426-GPD) era típicamente aproximadamente 250 mg/l. Se espera que la expresión de ArOM con dominio 5 truncado aumente la producción de VG (cepa V12-Aro1-1) y se espera que la fusión física adicional de esta AROM truncada con la primera enzima comprometida en la ruta de la vainillina heteróloga (Podospora pauciseta 3DSD) de como resultado un aumento adicional en la producción del glucósido de vainillina (cepa V12-Aro1-2).
De las versiones mutantes de AROM, en las que se cambiaban aminoácidos individuales del dominio 5, los T1392K (cepa V12-Aro1-9) y K1370L (cepa V12-Aro1-10) pueden ser útiles para la mayor producción de VG. Por ejemplo, se puede observar un aumento de aproximadamente 30-35% en la producción de VG para T1392K (cepa V12-Aro1-9) y K1370L (cepa V12-Aro1-10).
Este ejemplo demuestra que mediante la sobreexpresión del polipéptido de AROM mutante con menor actividad de shikimato deshidrogenasa, se puede aumentar la concentración celular de 3-DHS suficientemente para tener una función en el rendimiento de la valoración final en la ruta heteróloga. Este ejemplo también demuestra que la fusión de la primera enzima de la ruta heteróloga, es decir, 3DHD, con una enzima a Ro M truncada da como resultado un aumento del flujo en la ruta heteróloga, obteniendo canalización del sustrato. Finalmente, los experimentos descritos en la presente memoria indicaban que cambiando aminoácidos discretos en el dominio de a Ro M que metaboliza naturalmente 3DHS, el compuesto necesario para la producción de vainillina, se puede aumentar la cantidad de 3DHS disponible para la biosíntesis de vainillina.
Ejemplo 6: Mutantes de COMT
Todos los polipéptidos de COMT mutantes descritos en este ejemplo son polipéptidos de SEQ ID NO: 27, en donde un aminoácido se ha sustituido por otro aminoácido. Los polipéptidos de COMT mutantes se nombran como sigue: XnnnY, donde nnn indica la posición en la SEQ ID NO: 27 del aminoácido, el cual se sustituye, X es el código de una letra del aminoácido en la posición nnn en la SEQ ID NO: 27 e Y es el código de una letra del aminoácido que sustituye a X. A modo de ejemplo L198Y se refiere a un polipéptido de COMT mutante de SEQ ID NO: 27, donde la leucina en la posición 198 se sustituye por un triptófano.
Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de COMT mutantes se construyeron por PCR usando cebadores que contienen los codones deseados. Las PCR se hicieron bien como una PCR individual o usando la PCR de extensión con solapamiento de secuencias (SOE) por procedimientos convencionales. Esta etapa la pueden hacer, por ejemplo, proveedores comerciales, tales como Life Technologies. Los cebadores usados se dan en la tabla 2.
TABLA 2
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
En las secuencias de cebadores proporcionadas antes: M puede ser A o C; R puede ser A o G; W puede ser A o T; S puede ser G o C; Y puede ser C o T; K puede ser G o T; V puede ser A, G o C; H puede ser A, C o T; D puede ser A, G o T; B puede ser G, C o T; y N puede ser A, G, C o T.
Se incluyeron sitios de restricción para EcoRI/XbaI en los cebadores para facilitar la clonación de los productos de la PCR en el vector de expresión de levadura centromérico p416-TEF (Mumberg, et al. (1995) Gene 156 (1):119-22).
Los plásmidos resultantes se transformaron en una cepa de levadura EFSC2055 (Genotipo: Mata his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0 adh6::LEU2 bgl1::KanMX4 PTPI1::3DSD[AurC]::(HsOMT::MET15[NatMX])::ACAR[HphMX]::UGT7 2E2[HIS3] ECM3::(CorPPTase-ScHAP4). Esta cepa de levadura se basa en la cepa VG4 (Brochado, et al. (2010) Microbial. Cell Factories 9:84), e incluye además una alteración de HsOMT con el marcador MET15, y tiene dos genes adicionales integrados, en concreto Corynebacterium glutamicum PPtase (n° de acceso en la base de datos NCBI NP_601186) y S. cerevisiae HAP4 (n° de acceso en la base de datos NCBI Z28109).
La HsOMT se alteró por amplificación por PCR de S. cerevisiae MET15 (marcador de selección auxotrófico metionina) usando cebadores con colas de 70 pb homólogos al extremo frontal y posterior de HsOMT, respectivamente. Después la cepa de levadura se transformó con el producto de la PCR, dando como resultado transformantes que no tenían actividad de HsOMT y capaces de crecer en placas no complementadas con metionina. La cepa resultante se designó EFSC2055,
Los plásmidos que expresan CorPPTasa y ScHAP4 se transformaron en la cepa predecesora EFSC2055 usando el protocolo convencional de transformación de levaduras con acetato de litio/PEG y los transformantes se seleccionaron en placas de SC-uracilo. Los transformantes se ensayaron por cultivo en cultivos de 3 ml durante 72 horas en medio Delft complementado con 8% de melazas de remolacha azucarera.
Se analizaron los cultivos usando HPLC-UV para cuantificar el glucósido de vainillina/glucósido de isovainillina y productos relacionados. El análisis por HPLC se llevó a cabo con un sistema AGILENT 1100 series con bomba binaria y una columna Phenomenex Synergi Polar-RP 2,5 u 100 Á 100x2,00 mm, que separa los precursores y la isovainillina y vainillina. Se ejecutó un gradiente plano con agua/acetonitrilo ácido trifluoroacético al 0,1%. Se llevó a cabo un programa de 8,9 minutos 1,1 minutos postejecución como se presenta en la tabla 3.
TABLA 3
Figure imgf000023_0001
El glucósido de vainillina y glucósido de isovainillina se cuantificaron integrando el área de los picos de HPLC y comparando los mismos con una curva patrón. Los resultados de este análisis se muestran en la figura 3A. Las células de levadura que expresaban Hs-OMT de SEQ ID NO: 27 (denominadas Hs-COMT wt) producían isovainillina y vainillina en una relación 1:3, mientras que el mutante L198Y producía isovainillina y vainillina en una relación de aproximadamente 1:125. La relación exacta era difícil de determinar ya que la producción de isovainillina estaba en el límite de detección.
Además de las mutaciones analizadas en la figura 3A, buena especificidad y baja producción de isovainillina en los mutantes L198C, L198N, L198D, L198F y L198E.
Ejemplo 7: Reducción de alcohol de vainillilo
A modo de ilustración, los genes de VAO de P. simplicissium (n° de acceso en GENBANK P56216) y R. jostii (n° de acceso en GENBANK YP_703243.1) se aislaron y se clonaron en un vector de expresión de levaduras. Los vectores de expresión se transformaron posteriormente en una cepa de levadura que expresa glucosiltransferasa. Se ensayó en las cepas transformadas la actividad de VAO por cultivo de la levadura durante 48 horas en medio complementado con alcohol de vainillilo 3 mM. Los resultados de este análisis se presentan en la figura 4. Las enzimas VAO tanto de P. simplicissium como R. jostii presentaban actividad en levaduras. Cuando las enzimas VAO se analizaron en una cepa capaz de producir glucósido de vainillina, hubo una reducción en la acumulación de alcohol de vainillilo durante la fermentación del glucósido de vainillina.
Ejemplo 8: Gen de ACAR de Neurospora crassa
Como alternativa a una proteína ACAR (EC 1.2.1.30) de Nocardia iowensis (Hansen, et al. ((2009) Appl. Environ. Microbio!. 75:2765-74), se investigó el uso de una enzima ACAR de Neurospora crassa (Gross & Zenk (1969) Eur. J. Biochem. 8:413-9; US 6.372.461) en levaduras, ya que Neurospora (moho común del pan) es un organismo GRAS. Se aisló un gen de N. crassa (GENBANK XP_955820) con homología con la ACAR de Nocardia iowensis y se clonó en un vector de expresión de levadura. El vector se transformó en una cepa de levadura que expresa una PPtasa, se seleccionaron cepas según la presencia del gen de ACAR, y la levadura seleccionada se cultivó durante 72 horas en medio complementado con ácido vainíllico 3 mM para demostrar la actividad de ACAR. Los resultados de este análisis se presentan en la figura 5. Se encontró que la enzima ACAR de N. crassa presenta una actividad mayor en levadura que la ACAR de N. iowensis. Por lo tanto, en algunas realizaciones del método descrito en la presente memoria, se usa una enzima ACAR de N. crassa en la producción de vainillina o glucósido de vainillina.
Además de las proteínas ACAR de N. iownsis o N. crassa ACAR, está contemplado que se pueden usar otras proteínas ACAR, incluyendo las aisladas de Nocardia brasiliensis (n° de acceso en GENBANK EHY26728), Nocardia farcinica (n° de acceso en GENBANK BAD56861), Podospora anserina (n° de acceso en GENBANK CAP62295), o Sordaria macropora (n° de acceso en GENBANK CCC14931), con identidad de secuencia significativa con la proteína ACAR de N. iownsis o N. crassa.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina que comprende
(A) proporcionar un hospedante recombinante capaz de producir vainillina, en donde dicho hospedante recombinante es un microorganismo, planta o célula de planta y alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de catecol-O-metil transferasa (COMT) mutante; en donde
el polipéptido de COMT mutante tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27 determinada a lo largo de la longitud entera de la SEQ ID NO: 27; y que comprende Asn, Asp, Cys, Glu, Phe o Tyr en la posición 198 de la SEQ ID NO: 27.
(B) cultivar dicho hospedante recombinante durante un tiempo suficiente para que dicho hospedante recombinante produzca vainillina y/o glucósido de vainillina; y
(C) aislar la vainillina y/o glucósido de vainillina de dicho hospedante recombinante o del líquido sobrenadante del cultivo, produciendo así vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de COMT mutante comprende Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val en la posición 199 de la SEQ ID NO: 27.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido de COMT mutante comprende además un marcador de purificación, un péptido de tránsito al cloroplasto, un péptido de tránsito mitocondrial, un péptido de amiloplasto, péptido señal, o un marcador de secreción en el extremo N o C de dicho polipéptido.
4. Un polipéptido de catecol-O-metil transferasa (COMT) mutante aislado, en donde dicho polipéptido de COMT mutante tiene una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27 determinada a lo largo de la longitud entera de la SEQ ID NO: 27; y que comprende Asn, Asp, Cys, Glu, Phe o Tyr en la posición 198 de la SEQ ID NO: 27.
5. El polipéptido de COMT mutante aislado de la reivindicación 4, en donde el polipéptido de COMT mutante comprende Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val en la posición 199 de la SEQ ID NO: 27.
6. El polipéptido mutante aislado de la reivindicación 4 o 5, en donde el polipéptido de COMT mutante comprende además un marcador de purificación, un péptido de tránsito al cloroplasto, un péptido de tránsito mitocondrial, un péptido de amiloplasto, péptido señal, o un marcador de secreción en el extremo N o C de dicho polipéptido.
7. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de COMT mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Un hospedante recombinante, en donde dicho hospedante recombinante es un microorganismo, planta o célula de planta y comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de COMT mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
9. El hospedante recombinante de la reivindicación 8; o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el hospedante recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 3-deshidroshikimato deshidratasa (3DSD), un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ácido carboxílico aromático reductasa (ACAR), un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fosfopanteteína transferasa (PPTasa), un ácido nucleico que codifica un polipéptido de uridina 5'-difosfoglucosil transferasa (UGT) y/o un ácido nucleico que codifica un alcohol de vainillilo oxidasa (VAO).
10. El hospedante recombinante de la reivindicación 8 o 9; o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho hospedante recombinante alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de COMT mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, y además comprende un gen que codifica un polipéptido de AROH de tipo natural.
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