BR112014003041B1

BR112014003041B1 - Método para produzir vanilina e/ou vanilina beta-d-glicosídeo, polipeptídeo de catecol-ometil transferase (comt) mutante, e, microorganismo hospedeiro recombinante

Info

Publication number: BR112014003041B1
Application number: BR112014003041-3A
Authority: BR
Inventors: Joergen Hansen; Esben Halkjær Hansen; Honey Polur Sompalli; Joseph M. Sheridan; Jonathan R. Heal; William D. O. Hamilton
Original assignee: International Flavors & Fragrances Inc.; Evolva Sa
Priority date: 2011-08-08
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2021-10-13
Also published as: MX2014001571A; CN108570464A; CN105063104A; EP3514226A1; BR112014003041A2; ES2719304T3; CN108570464B; US10208293B2; CN105063104B; EP3118304A1; WO2013022881A1; EP2742126A4; CN103987840A; WO2013022881A8; EP2742126A1; ES2730102T3; EP3118304B1; US20190136270A1; MX355785B; US11008592B2

Abstract

método para produzir vanilina e/ou vanilina beta-d-glicosídeo, extrato, artigo consumível, polipeptídeo, ácido nucleico isolado, e, hospedeiro recombinante. micro-organismos recombinantes, plantas, e células de planta são divulgados que foram engendrados para expressar para expressar um polipeptídeo arom mutante e/ou polipeptídeo da catecol-o-metiltransferase mutante sozinhos ou em combinação com uma ou mais enzimas biossintéticas de vanilina ou udp-glicosiltransferases (ugts). tais micro-organismos, plantas, ou células de planta podem produzir vanilina beta-d-glicosídeo.

Description

Introdução

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos Provisórios U.S. N°s 61/521.090, depositado em 8 de agosto de 2011 e 61/522.096, depositado em 10 de agosto de 2011, o conteúdo dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Fundamentos da Invenção

[0002] A vanilina é um dos compostos de sabor mais importante do mundo com um mercado global de 180 milhões de dólares. A vanilina natural é derivada das vagens de semente curadas da orquídea da baunilha (Vanilla planifolia), a maior parte da vanilina do mundo é sintetizada a partir de produtos petroquímicos ou ligninas da polpa da madeira. A produção de vanilina natural da vagem da baunilha é um processo trabalhoso e lento, que requer polinização manual das flores e um processo de cura de 1 a 6 meses das vagens de baunilha verdes colhidas (Ramachandra & Ravishankar (2000) J. Sci. Food Agric. 80: 289-304). A produção de 1 quilograma (kg) de vanilina requer aproximadamente 500 kg de vagens de baunilha, que correspondem à polinização de aproximadamente 40.000 flores. Atualmente apenas cerca de 0,25% (40 toneladas das 16.000) de vanilina vendidas anualmente origina-se das vagens de baunilha, enquanto que a maior parte restante é quimicamente sintetizada a partir da lignina ou hidrocarbonetos fósseis, em particular guaiacol. A vanilina sinteticamente produzida é vendida por aproximadamente $15 por kg, comparado com os preços de $1200 a 4000 por kg para a vanilina natural (Walton, et al. (2003) Phytochemistry 63: 505515).

Sumário da Invenção

[0003] Esta invenção fornece um método para produzir vanilina e/ou vanilina beta-D-glicosídeo. O método da invenção envolve as etapas de (a) fornecer um hospedeiro recombinante capaz de produzir vanilina, em que o dito hospedeiro recombinante abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de Enzima Multifuncional Arom (AROM) mutante e/ou um polipeptídeo de Catecol-O-Metil Transferase (COMT) mutante; (b) cultivar o dito hospedeiro recombinante por um tempo suficiente para o dito hospedeiro recombinante para produzir vanilina e/ou glicosídeo de vanilina; e (c) isolar a vanilina e/ou glicosídeo de vanilina do dito hospedeiro recombinante ou do sobrenadante de cultivo, produzindo deste modo a vanilina e/ou vanilina beta-D-glicosídeo.

[0004] Em uma forma de realização, um polipeptídeo AROM mutante é fornecido, em que o dito mutante tem atividade da xiquimato desidrogenase diminuída em relação a um polipeptídeo AROM correspondente que carece da mutação. De acordo com esta forma de realização, o polipeptídeo AROM mutante pode ter uma ou mais mutações no domínio 5, uma deleção de pelo menos parte do domínio 5, ou falta do domínio 5.

[0005] Em uma outra forma de realização, o polipeptídeo AROM mutante é um polipeptídeo de fusão que inclui (i) um polipeptídeo AROM aqui descrito, por exemplo, um polipeptídeo AROM que compreende uma deleção de pelo menos uma parte do domínio 5 ou um polipeptídeo AROM que careça do domínio 5; e (ii) um polipeptídeo tendo atividade da 3- desidroxiquimato desidratase (3DSD).

[0006] Em uma outra forma de realização, um polipeptídeo da COMT mutante é fornecido, em que o dito mutante tem uma ou mais propriedades melhoradas. Em particular, a invenção fornece polipeptídeos da COMT mutantes que preferencialmente catalisam a metilação na posição meta do ácido protocatecuico, e/ou aldeído protocatecuico, e/ou álcool protocatecuico ao invés de na posição para.

[0007] Qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos pode incluir ainda um rótulo de purificação, um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptídeo de sinal, ou um rótulo de secreção no terminal N ou C do polipeptídeo.

[0008] Em algumas formas de realização, o hospedeiro pode ser um micro-organismo, por exemplo, uma levedura tal como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe ou Escherichia coli. Alternativamente, o hospedeiro pode ser uma planta ou célula de planta (por exemplo, uma Physcomitrella ou planta ou célula de planta do tabaco).

[0009] Qualquer um dos hospedeiros aqui descritos podem incluir ainda um gene que codifica uma ácido carboxílico aromático redutase (ACAR); uma 3-desidroxiquimato desidratase (3DSD); uma uridina 5’- difosfoglicosil transferase (UGT); uma fosfopanteteína transferase (PPTase); um AROM do tipo selvagem; e/ou uma O-metiltransferase (OMT) do tipo selvagem.

[00010] Um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo da COMT mutante ou polipeptídeo AROM mutante também é fornecido.

Descrição Resumida dos Desenhos

[00011] A Figura 1 é um esquemático da biossíntese de novo da vanilina (4) e esboçado dos catabólitos de vanilina diferentes e produtos colaterais metabólicos, isto é, ácido desidroshiquímico (1), ácido protocatecuico (2), aldeído protocatecuico (3), ácido vanílico (5), álcool protocatecuico (6), vanilil álcool (7), e vanilina β-D-glicosideo (8), encontrados em um organismo que expressa 3DSD, ACAR, OMT, e UGT e uma fosfopanteteína transferase (PPTase). As setas abertas mostram reações metabólicas primárias em levedura; as setas pretas mostram reações enzimáticas introduzidas pelo engenheiramento metabólico; as setas diagonalmente listradas mostram as reações metabólicas de levedura inerentes indesejadas.

[00012] A Figura 2 é uma representação esquemática da biossíntese celular dos aminoácidos aromáticos tirosina, triptofano e fenilalanina usando um polipeptídeo AROM do tipo selvagem (esquerda) e um polipeptídeo AROM mutante que careça do domínio 5 (direita).

[00013] A Figura 3A mostra a produção de vanilina (VG) e iso-vanilina (IsoVg) em cepa de levedura que expressa vários polipeptídeos da COMT mutantes.

[00014] A Figura 3B e Figura 3C mostram a produção de vanilina (VG) e iso-vanilina (IsoVg) pelos polipeptídeos da COMT isolados de várias fontes quando comparados ao OMT humano (Hs-OMT) e ao mutante L198Y OMT humano (HS-OMT L198Y). Phytophthera infestans (PI), Catharanthus roseus (CR), Yarrowia lipolitica (IL), Ciona intestinalis Acesso N° GENBANK N°s XP_002121420 e XP_002131313 (CI-1 e CI-2), Capsasproa owczarzaki (CO), Chaetomium therophilum (CT), Clavispora lusitaniae (CL), Paracoccidioides sp. ‘lutzii’ Pb01 (PL), Vanilla planifolia (VP), Coffea Arabica (CA), Rattus norvegicus (RN), Mus musculus (MM), Crenarchaeote (CREN), Mycobacterium vanbaleeni (MV), ou Schizosaccharomyces pombe (SP).

[00015] A Figura 4 mostra os níveis de glicosídeo de vanilina, vanilina, glicosídeo de vanilil álcool e vanilil álcool em cepas de levedura que expressam Penicillium simplicissium (PS) ou Rhodococcus jostii (RJ) vanilil álcool oxidase (VAO), que foram suplementados com 3 mM de vanilil álcool.

[00016] A Figura 5 mostra os níveis de ácido vanílico, vanilina, e glicosídeo de vanilina em cepas de levedura que expressam ACAR de N. iowensis ou ACAR de N. crassa e da fosfopanteteinil transferase (PPTase) de E. coli ou PPTase de S. pombe, quando cultivados em meio suplementado com ácido vanílico 3 mM.

Descrição Detalhada da invenção

[00017] Esta invenção está fundamentada na descoberta de que os polipeptídeos AROM mutantes podem ser usados para aumentar o acúmulo da 3-desidroxiquimato (3-DHS) em hospedeiros recombinantes. A 3-DHS é um precursor para a biossíntese da vanilina, e se mais 3-DHS intracelular estiver disponível, mais ácido protocatecuico pode ser fabricado na primeira etapa comprometida do caminho da biossíntese da vanilina. Ver a Figura 1. AROM é um complexo de enzima penta-funcional codificada na levedura pelo gene ARO1. O gene tem 4764 pares de base de comprimento e codifica um polipeptídeo correspondente de 1588 aminoácidos no comprimento. AROM realiza cinco conversões enzimáticas consecutivas, isto é, conversão de DAHP (7-fosfato de ácido 3-desóxi-D-arabino-heptulossônico) em 3-DHQ (3-desidroquinato), que é convertido para 3-DHS (ácido 3-desidroshiquímico), que é convertido para xiquimato, que é convertido para xiquimato-3-P (3-fosfato de xiquimato), que é convertido em EPSP (3-fosfato de 5-enolpiruvilxiquimato), todos no caminho para a biossíntese celular dos aminoácidos aromáticos tirosina, triptofano e fenilalanina (ver a Figura 2).

[00018] As cinco funções catalíticas de AROM residem nos cinco domínios distintos do polipeptídeo codificado por ARO1. Os domínios funcionais do polipeptídeo AROM estão em uma ordem diferente do que a ordem com a qual eles são necessários na conversão de cinco etapas de DAHP para EPSP (ver a Figura 2). Assim, enquanto o domínio 1 corresponde com a atividade catalítica 1, o domínio 2 corresponde com a atividade catalítica 5, o domínio 3 corresponde com a atividade catalítica 4, o domínio 4 corresponde com a atividade catalítica 2, e finalmente o domínio 5 corresponde com a atividade catalítica 3 (ver a Figura 1).

[00019] Os hospedeiros recombinantes que contêm as variantes do domínio 5 do polipeptídeo AROM (por exemplo, um polipeptídeo AROM tendo uma ou mais mutações dentro do domínio 5 ou um polipeptídeo AROM em que uma porção do domínio 5 é deletada) pode ter níveis aumentados de 3-DHS em comparação com um hospedeiro correspondente que expressa um polipeptídeo AROM do tipo selvagem. Tais hospedeiros também podem ter produção de ácido protocatecuico.

[00020] Alternativamente, ou além, os polipeptídeos da COMT mutantes podem ser usados para melhorar a biossíntese de vanilina beta-D- glicosídeo. Por exemplo, os polipeptídeos da COMT mutantes aqui descritos podem ter uma ou mais das propriedades que seguem: metabolização aumentada; metilação preferencial na posição meta (3’), ao invés de na posição para (4’) tal que a produção de vanilina seja favorecida em relação à isovanilina; ou melhor especificidade para os substratos no caminho da vanilina, ácido protocatecuico e aldeído protocatecuico.

[00021] Consequentemente, a invenção fornece AROM mutante e polipeptídeos da COMT mutantes e ácidos nucleicos que codificam tais polipeptídeos e o uso do mesmo na biossíntese de vanilina e/ou glicosídeo de vanilina. O método inclui as etapas de fornecer um hospedeiro recombinante capaz de produzir vanilina na presença de uma fonte de carbono, em que o dito hospedeiro recombinante abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo da COMT mutante e/ou polipeptídeo AROM mutante; cultivar o dito hospedeiro recombinante na presença da fonte de carbono; e purificar vanilina e/ou glicosídeo de vanilina do dito hospedeiro recombinante ou do sobrenadante de cultivo.

[00022] Os hospedeiros recombinantes aqui descritos podem ser usados em métodos para produzir vanilina ou glicosídeo de vanilina. Por exemplo, se o hospedeiro recombinante for um micro-organismo, o método pode incluir cultivar o micro-organismo recombinante em um meio de cultura sob condições nas quais os genes da biossíntese da vanilina e/ou glicosídeo de vanilina são expressos. O micro-organismo recombinante pode ser cultivado em um processo de batelada, lote alimentado ou contínuo ou combinações dos mesmos. Tipicamente, o micro-organismo recombinante é cultivado em um fermentador em uma temperatura(s) definida(s) na presença de uma fonte nutriente adequada, por exemplo, uma fonte de carbono, durante um período desejado de tempo para produzir uma quantidade desejada de vanilina e/ou glicosídeo de vanilina.

[00023] As fontes de carbono de uso no presente método incluem qualquer molécula que possa ser metabolizada pela célula hospedeira recombinante para facilitar o cultivo e/ou produção da vanilina e/ou glicosídeo de vanilina. Os exemplos de fontes de carbono adequados incluem, mas não são limitados a, sacarose (por exemplo, como encontrado nos melaços), frutose, xilose, etanol, glicerol, glicose, celulose, amido, celobiose ou outro polímero que contenha glicose. Em formas de realização que utilizam levedura como um hospedeiro, por exemplo, fontes de carbono tais como sacarose, frutose, xilose, etanol, glicerol, e glicose são adequadas. A fonte de carbono pode ser fornecida ao organismo hospedeiro por todo o período de cultivo ou alternativamente, o organismo pode ser cultivado por um período de tempo na presença de uma outra fonte de energia, por exemplo, proteína, e depois fornecida com uma fonte de carbono apenas durante a fase de lote alimentado.

[00024] Em uma forma de realização, o micro-organismo deste método abriga um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo AROM mutante e opcionalmente um polipeptídeo da COMT do tipo selvagem. Em uma outra forma de realização, o micro-organismo deste método abriga um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo da COMT mutante e opcionalmente um polipeptídeo AROM do tipo selvagem. Já em uma outra forma de realização, o micro-organismo deste método abriga um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo AROM mutante e opcionalmente um polipeptídeo da COMT mutante. Dependendo do micro-organismo particular usado no método, outros genes recombinantes que codificam um 3DSD, ACAR, UGT, ou PPTase também podem estar presentes e expressados. Assim, o hospedeiro recombinante, em uma forma de realização, pode ser um micro-organismo que abriga um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam 3DSD, ACAR, UGT ou PPTase ou um homólogo funcional de qualquer um dos anteriormente mencionados que compartilham pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, por exemplo pelo menos 95% de identidade de sequência com o mesmo. Os níveis de produtos, substratos e intermediários, por exemplo, ácido desidroshiquímico, ácido protocatecuico, aldeído protocatecuico, vanilina, e vanilina beta-D-glicosídeo podem ser determinados pela extração de amostras do meio de cultura para análise de acordo com os métodos publicados.

[00025] Depois que o micro-organismo recombinante foi cultivado em cultura durante o período desejado de tempo, vanilina e/ou vanilina beta-D- glicosídeo podem ser depois recuperados da cultura usando várias técnicas conhecidos no ramo, por exemplo, isolação e purificação pela extração, destilação a vácuo e recristalização de estágio múltiplo de soluções aquosas e ultrafiltração (Boddeker, et al. (1997) J. Membrane Sci. 137: 155-158; Borges da Silva, et al. (2009) Chem. Eng. Des. 87: 1276-1292). Os processos de extração de fase dupla, que utilizam compostos de sulfidrila, tais como ditiotreitol, ditioeritritol, glutationa, ou L-cisteína (Patente US N°. 5.128.253), ou soluções de KOH alcalinas (WO 94/13614), foram usados na recuperação de vanilina assim como para a sua separação de outras substâncias aromáticas. A adsorção e pervaporação da vanilina a partir de meio bioconvertido usando membranas de copolímero de poliéter-poliamida também foi descrito (Boddeker, et al. (1997) supra; Zucchi, et al. (1998) J. Microbiol. Biotechnol. 8: 719-722). As resinas de adsorção macroporosas com matriz de poliestireno reticulado também foi usado para recuperar vanilina dissolvida a partir de soluções aquosas (Zhang, et al. (2008) Eur. Food Res. Technol. 226: 377383). As técnicas de ultrafiltração e contactador de membrana (MC) também foram avaliadas para recuperar vanilina (Zabkova, et al. (2007) J. Membr. Sci. 301: 221-237; Scuibba, et al. (2009) Desalination 241: 357-364). Alternativamente, as técnicas convencionais tais como percolação ou extração com dióxido de carbono supercrítico e osmose reversa para concentração podem ser usadas. Se o hospedeiro recombinante é uma planta ou células de planta, vanilina ou glicosídeo de vanilina podem ser extraídos do tecido de planta usando várias técnicas conhecidas na técnica.

[00026] Em algumas formas de realização, vanilina ou vanilina beta-D- glicosídeo podem ser produzidos usando células integrais que são matérias primas alimentadas que contêm moléculas precursoras. As matérias primas podem ser alimentadas durante o cultivo da célula ou depois do cultivo da célula. As células integrais podem estar em suspensão ou imobilizadas. As células integrais podem estar em caldo de fermentação ou em um tampão de reação. Em algumas formas de realização um agente permeabilizante pode ser requerido para a transferência eficiente de substrato dentro das células.

[00027] Em algumas formas de realização, a vanilina ou vanilina beta- D-glicosídeo são isolados e purificados até a homogeneidade (por exemplo, pelo menos 90%, 92%, 94%, 96%, ou 98% puros). Em outras formas de realização, a vanilina ou vanilina beta-D-glicosídeo são isolados como um extrato a partir de um hospedeiro recombinante. Neste aspecto, a vanilina ou vanilina beta-D-glicosídeo podem ser isolados, mas não necessariamente purificados até a homogeneidade. Desejavelmente, a quantidade de vanilina ou vanilina beta-D-glicosídeo produzidos pode ser de cerca de 1 mg/l a cerca de 20.000 mg/L ou mais alto. Por exemplo de cerca de 1 a cerca de 100 mg/L, de cerca de 30 a cerca de 100 mg/L, de cerca de 50 a cerca de 200 mg/L, de cerca de 100 a cerca de 500 mg/L, de cerca de 100 a cerca de 1.000 mg/L, de cerca de 250 a cerca de 5.000 mg/L, de cerca de 1.000 a cerca de 15.000 mg/L, ou de cerca de 2.000 a cerca de 10.000 mg/L de vanilina ou vanilina beta-D-glicosídeo podem ser produzidos. No geral, tempos de cultura mais longos levarão a quantidades maiores de produto. Assim, o micro-organismo recombinante pode ser cultivado de 1 dia a 7 dias, de 1 dia a 5 dias, de 3 dias a 5 dias, em torno de 3 dias, em torno de 4 dias, ou em torno de 5 dias.

[00028] Será avaliado que os vários genes e módulos aqui divulgados podem estar presentes em dois ou mais micro-organismos recombinantes ao invés de um único micro-organismo. Quando uma pluralidade de microorganismos recombinantes é usada, eles podem ser cultivados em uma cultura mista para produzir vanilina e/ou glicosídeo de vanilina.

[00029] Os extratos de vanilina ou vanilina beta-D-glicosídeo isolados, e opcionalmente purificados, encontram uso em consumíveis aromatizados tais como produtos alimentícios, suplementos dietéticos, nutracêuticos, composições farmacêuticas, composições higiênicas dentárias, e produtos cosméticos.

[00030] A frase “produto alimentício,” como aqui usada, inclui, mas não é limitada a, frutas, vegetais, sucos, produtos cárneos tais como presunto, toucinho e salsicha; produtos do ovo, concentrados de fruta, gelatinas e produtos iguais à gelatina tais como geleias, conservas, e os semelhantes; produtos lácteos tais como sorvete, coalhada e gelado de fruta; glacês, xaropes que incluem melaços; produtos do milho, trigo, centeio, soja, aveia, arroz e cevada, nozes e produtos de nozes, bolos, biscoitos, confeitos tais como balas, gomas, pastilhas aromatizadas de fruta, e chocolates, gomas de mascar, mentas, cremes, glacê, sorvete, tortas e pães, bebidas tais como café, chá, refrigerantes carbonatados, tais como COCA e PEPSI, refrigerantes não carbonatados, sucos e outras bebidas de fruta, bebidas de esportistas tais como GATORADE, café, chás, chás gelados, cola, bebidas alcoólicas, tais como cervejas, vinhos e licores, e KOOL-AID.

[00031] Os produtos alimentícios também incluem condimentos tais como ervas, temperos e condimentos, realçadores de sabor. Um produto alimentício também inclui produtos empacotados preparados, tais como adoçantes dietéticos, adoçantes líquidos, misturas aromáticas granuladas que na reconstituição com água fornecem bebidas não carbonatadas, misturas instantâneas para pudim, café e chá instantâneo, branqueadores de café, mistura lácteas maltadas, alimentos para animais de estimação, ração para criação, tabaco, e materiais para aplicações de panificação, tal como misturas em pó para panificação para a preparação de pães, biscoitos, bolos, panquecas, donuts e os semelhantes. Os produtos alimentícios também incluem alimentos e bebidas dietéticos e de baixa caloria que contêm pouca ou nenhuma sacarose. Outros exemplos de produtos alimentícios previstos de acordo com a presente invenção são descritos abaixo e por todo o relatório descritivo.

[00032] Em uma outra forma de realização, os produtos alimentícios são frutas, vegetais, sucos, produtos cárneos tais como presunto, toucinho e salsicha; produtos do ovo, concentrados de fruta, gelatinas e produtos iguais à gelatina tais como geleias, conservas, e os semelhantes; produtos lácteos tais como sorvete, coalhada e gelado de fruta; glacês, xaropes incluindo melaços; produtos do milho, trigo, centeio, soja, aveia, arroz e cevada, nozes e produtos de nozes, bolos, biscoitos, confeitos tais como balas, gomas, pastilhas aromatizadas com fruta, e chocolates, cremes, glacê, sorvete, tortas e pães.

[00033] Em uma outra forma de realização, o consumível é uma composição farmacêutica. As composições preferidas são composições farmacêuticas que contêm vanilina e/ou vanilina beta-D-glicosídeo e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Estas composições farmacêuticas podem ser usadas para formular medicamentos farmacêuticos que contêm um ou mais agentes ativos que exercem um efeito biológico. Como tal, a composição farmacêutica preferivelmente inclui ainda um ou mais agentes ativos que exercem um efeito biológico. Tais agentes ativos incluem agentes farmacêuticos e biológicos que têm uma atividade. Tais agentes ativos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, The Physician’s Desk Reference. Tais composições podem ser preparadas de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA. Em uma forma de realização, um tal agente ativo inclui broncodilatadores, anorexiantes, anti-histaminas, suplementos nutricionais, laxativos, analgésicos, anestésicos, antiácidos, antagonistas do receptor de H2, anticolinérgicos, antidiarréicos, emolientes, antitussivos, antinauseantes, antimicrobianos, antibacterianos, antifúngicos, antivirais, expectorantes, agentes anti-inflamatórios, antipiréticos, e misturas dos mesmos. Em uma forma de realização, o agente ativo é um antipirético ou analgésico, por exemplo, ibuprofeno, acetaminofeno, ou aspirina; laxantes, por exemplo, fenolftaleína dioctil sulfossuccinato de sódio; inibidores do apetite, por exemplo, anfetaminas, fenilpropanolamina, cloridrato de fenil-propanolamina, ou cafeína; antiácidos, por exemplo, carbonato de cálcio; antiasmáticos, por exemplo, teofilina; antidiuréticos, por exemplo, cloridrato de difenoxilato; agentes ativos contra flatulência, por exemplo, simetecon; agentes contra enxaqueca, por exemplo, tartarato de ergotamina; agentes psicofarmacológicos, por exemplo, haloperidol; espasmolíticos ou sedativos, por exemplo, fenobarbitol; anti-hipercinéticos, por exemplo, metildopa ou metilfenidato; tranquilizantes, por exemplo, benzodiazepinas, hidroxinmeprobramatos ou fenotiazinas; anti-histamínicos, por exemplo, astemizol, maleato de clorofeniramina, maleato de piridamina, succinato de doxlamina, maleato de bromofeniramina, citrato de feniltoloxamina, cloridrato de clorociclizina, maleato de feniramina, e tartarato de fenindamina; descongestionantes, por exemplo, cloridrato de fenilpropanolamina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato de pseudoefedrina, sulfato de pseudoefedrina, bitartarato de fenilpropanolamina, e efedrina; bloqueadores do receptor beta, por exemplo, propanolol; agentes para a retirada de álcool, por exemplo, dissulfiram; antitussivos, por exemplo, benzocaína, dextrometorfano, bromidreto de dextrometorfano, noscapina, citrato de carbetapentano, e cloridrato de clofedianol; suplementos de flúor, por exemplo, fluoreto de sódio; antibióticos locais, por exemplo, tetraciclina ou cleocina; suplementos de corticosteróide, por exemplo, prednisona ou prednisolona; agentes contra a formação de bócio, por exemplo, colcicina ou alopurinol; antiepilépticos, por exemplo, fenitoína sódica; agentes contra a desidratação, por exemplo, suplementos eletrolíticos; antissépticos, por exemplo, cloreto de cetilpiridínio; NSAIDs, por exemplo, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno, ou sais do mesmo; agentes ativos gastrointestinais, por exemplo, loperamida e famotidina; vários alcalóides, por exemplo, fosfato de codeína, sulfato de codeína, ou morfina; suplementos para elementos traço, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de zinco, carbonato de cálcio, óxido de magnésio, e outros sais de metal alcalino e sais de metal alcalino terroso; vitaminas; resinas de troca de íon, por exemplo, colestiramina; depressor do colesterol e substâncias que diminuem lipídeo; antiarrítmicos, por exemplo, N-acetilprocainamida; e expectorantes, por exemplo, guaifenesina.

[00034] As substâncias ativas que têm um gosto particularmente desagradável incluem agentes antibacterianos tais como ciprofloxacina, ofloxacina, e pefloxacina; antiepiléticos tais como zonisamida; antibióticos macrolídeos tais como eritromicina; antibióticos de beta-lactama tais como penicilinas e cefalosporinas; substâncias ativas psicotrópicas tais como clorpromazina; substâncias ativas tais como sulpirina; e agentes ativos contra úlceras, tais como cimetidina.

[00035] As composições farmacêuticas desta invenção são administradas a um indivíduo em qualquer forma adequada para obter seus propósitos pretendidos. Preferivelmente, entretanto, a composição é uma que possa ser administrada bucal ou oralmente. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser uma pulverização oral ou nasal. O indivíduo é qualquer animal, tal como um ser humano, embora a invenção não seja intencionada a ser assim limitada. Outros animais adequados incluem caninos, felinos, cães, gatos, animais de criação, cavalos, gado, ovelha, e os semelhantes. Uma composição veterinária, como aqui usada, refere-se a uma composição farmacêutica que seja adequada para animais não humanos Tais composições veterinárias são conhecidas na técnica.

[00036] Em uma outra forma de realização, a composição farmacêutica é uma forma de dosagem líquida para a administração oral, incluindo emulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos compostos ativos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes habitualmente usados na técnica tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificadores tais como etil álcool, isopropil álcool, carbonato de etila, acetato de etila, benzil álcool, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetil formamida, óleos (em particular, os óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, mamona, e gergelim), glicerol, tetraidrofurfuril álcool, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e misturas do mesmo. As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes de suspensão como, por exemplo, álcoois isostearílico etoxilado, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar, e tragacanto, e misturas dos mesmos.

[00037] A composição farmacêutica da presente invenção pode estar na forma de um tablete mastigável. Os tabletes mastigáveis são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N°s 4.684.534 e 6.060.078, cada uma das quais é incorporada por referência em sua totalidade. Qualquer tipo de medicamento pode estar contido no tablete mastigável, preferivelmente um medicamento de sabor amargo, extratos de planta naturais ou outros compostos orgânicos. Mais preferivelmente, vitaminas tais como vitamina A, vitamina B, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina C, vitamina E vitamina K; extratos de planta natural tais como extratos de Sohgunjung-tang, extratos de Sipchundaebo-tang e extratos de Eleutherococcus senticosus; compostos orgânicos tais como dimenhidrinato, meclazina, acetaminofeno, aspirina, fenilpropanolamina, e cloreto de cetilpiridínio; ou agentes gastrointestinais tais como gel de hidróxido de alumínio seco, domperidona, azuleno solúvel, L-glutamina e hidrotalcita podem estar contidos no núcleo.

[00038] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição de desintegração oral. Os tabletes de desintegração oral são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N°s 6.368.625 e 6.316.029, cada uma das quais é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade.

[00039] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma forma de dosagem sólida, que inclui vanilina ou vanilina beta-D- glicosídeo e um grânulo efervescente ativado por água e/ou saliva, tal como um tendo uma taxa controlável de efervescência. A composição efervescente pode compreender ainda um composto farmaceuticamente ativo. As composições farmacêuticas efervescentes são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N°. 6.649.186, que é incorporada por referência em sua totalidade. A composição efervescente pode ser usada em aplicações farmacêuticas, veterinárias, horticulturais, domésticas, alimentícias, culinárias, pesticidas, agrícolas, cosméticas, herbicidas, industriais, de limpeza, confeitaria e aromatizantes. As formulações que incorporam a composição efervescente que contêm vanilina ou vanilina beta-D-glicosídeo pode incluir ainda um ou mais adjuvantes adicionais e/ou ingredientes ativos que podem ser escolhidos daqueles conhecidos na técnica, que incluem aromatizantes, diluentes, cores, aglutinantes, enchedores, tensoativos, desintegrantes, estabilizantes, veículos de compactação, e desintegrantes não efervescentes.

[00040] A composição farmacêutica pode ser uma composição farmacêutica na forma de película ou na forma de bolacha. Uma tal composição farmacêutica na forma de película ou na forma de bolacha pode ser configurada, por exemplo, como formas de administração que se desintegram rapidamente, por exemplo, formas de administração que se desintegram dentro de um período de 1 segundo até 3 minutos, ou como formas de administração que se desintegram lentamente, por exemplo, formas de administração que se desintegram dentro de um período de 3 a 15 minutos. Os tempos de desintegração indicados podem ser ajustados às faixas mencionadas acima pelo uso, por exemplo, de polímeros que formam matriz que têm características de desintegração, ou solubilidade diferentes. Assim, pela mistura dos componentes poliméricos correspondentes, o tempo de desintegração pode ser ajustado. Além disso, os desintegrantes são conhecidos que “puxam” água para dentro da matriz e fazem com que a matriz se rompa a partir de dentro. Como uma consequência, certas formas de realização da invenção incluem tais desintegrantes para o propósito de ajustar o tempo de desintegração.

[00041] Os adequados são polímeros para o uso na composição farmacêutica na forma de película ou na forma de bolacha incluem derivados de celulose, álcool polivinílico (por exemplo, MOWIOL), poliacrilatos, polivinil pirrolidona, éteres de celulose, tais como etil celulose, assim como álcool polivinílico, poliuretano, polimetacrilatos, metacrilatos de polimetila e derivados e copolimerizados dos polímeros anteriormente mencionados.

[00042] Em certas formas de realização, a espessura total da composição farmacêutica na forma de película ou na forma de bolacha de acordo com a invenção é preferivelmente de 5 μm até 10 mm, preferivelmente de 30 μm a 2 mm, e com preferência particular de 0,1 mm a 1 mm. As preparações farmacêuticas podem ser redondas, ovais, elípticas, triangulares, quadrangulares ou de forma poligonal, mas elas também podem ter qualquer forma arredondada.

[00043] A composição farmacêutica da presente invenção pode estar na forma de um aerossol. A composição de aerossol pode incluir ainda um agente farmaceuticamente ativo. As composições de aerossol são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N°. 5.011.678, que é por meio deste incorporada por referência em sua totalidade. Como um exemplo não limitante, uma composição de aerossol de acordo com a presente invenção pode incluir uma quantidade medicamente eficaz de uma substância farmaceuticamente ativa, vanilina ou vanilina beta-D-glicosídeo e um propelente biocompatível, tal como um propelente de (hidro/fluoro)carbono.

[00044] Em uma forma de realização da presente invenção, a composição farmacêutica é uma composição nutricional. Os exemplos de composições nutricionais tendo um gosto indesejável incluem, mas não são necessariamente limitados a, produtos de nutrição enteral para o tratamento de déficit nutricional, trauma, cirurgia, doença de Crohn, doença renal, hipertensão, obesidade e os semelhantes, para promover desempenho atlético, intensificação muscular ou bem estar geral ou erros congênitos do metabolismo tais como fenilcetonúria. Em particular, tais formulações nutricionais podem conter um ou mais aminoácidos que tenham um gosto ou sabor restante amargos ou metálicos. Tais aminoácidos incluem, mas não são limitados a, um dos aminoácidos essencial tais como um isômero L de leucina, isoleucina, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, tirosina ou valina.

[00045] Em uma forma de realização, o consumível da presente invenção é uma composição higiênica dentária que contenha vanilina e/ou vanilina beta-D-glicosídeo. As composições higiênicas dentárias são conhecidas na técnica e incluem, mas não são necessariamente limitadas a, pasta de dente, enxágue bucal, enxague de placa, fio dental, aliviadores de dor dentária (tais como ANBESOL), e os semelhantes.

[00046] Em uma outra forma de realização, o consumível da presente invenção é um produto cosmético que contêm vanilina e/ou vanilina beta-D- glicosídeo. Por exemplo, mas não por via de limitação, o produto cosmético pode ser um creme facial, batom, brilho labial, e os semelhantes. Outras composições adequadas da invenção incluem bálsamo labial, tal como bálsamo labial CHAPSTICK ou BURT’S BEESWAX, que contêm ainda vanilina e/ou vanilina beta-D-glicosídeo.

[00047] Polipeptídeos de Enzima Multifuncional Arom (AROM)

[00048] Os Exemplos não limitantes de polipeptídeos AROM incluem o polipeptídeo de Saccharomyces cerevisiae tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4 (N° de Acesso do GENBANK X06077); um polipeptídeo de Schizosaccharomyces pombe (N° de Acesso do GENBANK NP_594681,1); um polipeptídeo Schizosaccharomyces japonic (N° de Acesso do GENBANK XP_002171624); um polipeptídeo de Neurospora crassa (N° de Acesso do GENBANK XP_956000); e um polipeptídeo de Yarrowia lipolitica (N° de Acesso do GENBANK XP_505337).

[00049] O termo “polipeptídeo AROM” como aqui usado refere-se a qualquer sequência de aminoácido que seja pelo menos 80 por cento (por exemplo, pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 por cento) idêntica à sequência apresentada na SEQ ID N°: 4, e possui pelo menos quatro das cinco atividades enzimáticas do polipeptídeo AROM de S. cerevisiae, isto é, a atividade da 3-desidroquinato desidratase, atividade da 3-desidroquinato sintase, atividade da 3-fosfoxiquimato 1-carbóxi viniltransferase, atividade da xiquimato 3-desidrogenase (NADP+), e atividade da xiquimato cinase.

[00050] De acordo com uma forma de realização desta invenção, o polipeptídeo AROM é um polipeptídeo AROM mutante com atividade da xiquimato desidrogenase diminuída. Quando expressado em um hospedeiro recombinante, o polipeptídeo AROM mutante redireciona o fluxo metabólico da produção de aminoácido aromático para a produção do precursor de vanilina (Figura 2). A atividade da xiquimato desidrogenase diminuída pode ser deduzida do acúmulo do ácido desidroshiquímico em um hospedeiro recombinante que expressa um polipeptídeo AROM mutante, usando LC-MS.

[00051] O polipeptídeo AROM mutante aqui descrito pode ter uma ou mais modificações N° domínio 5 (por exemplo, uma substituição de um ou mais aminoácidos, uma deleção de um ou mais aminoácidos, inserções de um ou mais aminoácidos, ou combinações de substituições, deleções, e inserções). Por exemplo, um polipeptídeo AROM mutante pode ter uma deleção em pelo menos uma porção do domínio 5 (por exemplo, uma deleção do domínio 5 inteiro, isto é, dos aminoácidos de 1305 a 1588 da sequência de aminoácido na SEQ ID N°: 4, ou pode ter uma ou mais substituições de aminoácido N° domínio 5, tal que o polipeptídeo AROM mutante tenha atividade da xiquimato desidrogenase diminuída. Um polipeptídeo AROM mutante exemplar que careça do domínio 5 é fornecido na SEQ ID N°: 2. Os polipeptídeos AROM mutantes exemplares com pelo menos uma substituição de aminoácido no domínio 5 incluem os polipeptídeos AROM A1533P, P1500K, R1458W, V1349G, T1366G, I1387H, W1571V, T1392K, K1370L e A1441P como apresentados na SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 24, respectivamente.

[00052] As substituições de aminoácido que são particularmente úteis podem ser encontradas, por exemplo, em uma ou mais posições que se alinham com a posição 1349, 1366, 1370, 1387, 1392, 1441, 1458, 1500, 1533, ou 1571 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4. Por exemplo, um polipeptídeo AROM modificado pode ter uma substituição em uma posição que alinha com a posição 1370 ou na posição 1392 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4.

[00053] Por exemplo, um polipeptídeo AROM modificado pode ter uma ou mais dos que seguem: um aminoácido diferente de valina (por exemplo, uma glicina) em uma posição que se alinha com a posição 1349 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de treonina (por exemplo, uma glicina) em uma posição que se linha com a posição 1366 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de lisina (por exemplo, leucina) em uma posição que se alinha com a posição 1370 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de isoleucina (por exemplo, histidina) em uma posição que se alinha com a posição 1387 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de treonina (por exemplo, lisina) em uma posição que se alinha com a posição 1392 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de alanina (por exemplo, prolina) em uma posição que se alinha com a posição 1441 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de arginina (por exemplo, triptofano) em uma posição que se alinha com a posição 1458 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de prolina (por exemplo, lisina) em uma posição que se alinha com a posição 1500 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; um aminoácido diferente de alanina (por exemplo, prolina) em uma posição que se alinha com a posição 1533 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4; ou um aminoácido diferente de triptofano (por exemplo, valina) em uma posição que se alinha com a posição 1571 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 4.

[00054] Em algumas formas de realização, um polipeptídeo AROM modificado é fundido a um polipeptídeo que catalisa a primeira etapa comprometida da biossíntese da vanilina, a 3-desidroxiquimato desidratase (3DSD). Um polipeptídeo tendo atividade de 3DSD e que seja adequado para o uso em um polipeptídeo de fusão inclui o polipeptídeo de 3DSD de Podospora pauciseta, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp., Aspergillus niger ou Neurospora crassa. Ver, Acesso do GENBANK N°s CAD60599), XP_001905369,1, XP_761560,1, ABG93191,1, AAC37159,1, e XM_001392464.

[00055] Por exemplo, um polipeptídeo AROM modificado que careça do domínio 5 pode ser fundido a um polipeptídeo tendo atividade de 3DSD (por exemplo, um 3DSD de Podospora pauciseta). SEQ ID N°: 26 apresenta a sequência de aminoácido de uma tal proteína e a SEQ ID N°: 27 apresenta a sequência de ácido nucleico que codifica a proteína.

Polipeptídeos da Catechol-O-Metil Transferase (COMT)

[00056] O polipeptídeo da COMT de acordo com a invenção, em certas formas de realização pode ser uma cafeoil-O-metiltransferase. Em outras formas de realização, o polipeptídeo da COMT é preferivelmente uma catecol-O-metiltransferase. Mais preferivelmente, um polipeptídeo da COMT da invenção é um polipeptídeo mutante (COMT) tendo meta hidroxil metilação melhorada do aldeído protocatecuico, ácido protocatecuico e/ou álcool protocatecuico em relação àquela da COMT de Homo sapiens tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27.

[00057] Os exemplos não limitantes dos polipeptídeos da COMT que podem ser mutados de acordo com esta invenção incluem os polipeptídeos da COMT na família classificada sob o número EC 2.1.1.6, tal como o polipeptídeo de Homo sapiens (Hs) tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27 (ver, também, o N° de Acesso do GENBANK NM_000754); um polipeptídeo de Arabidopsis thaliana tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 53 (N° de Acesso do GENBANK AY062837); ou um polipeptídeo de Fragaria x ananassa (morango) tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 54 (N° de Acesso do GENBANK AF220491). O polipeptídeo da COMT humana existe como diversas variantes e o polipeptídeo da COMT pode ser qualquer uma destas variantes, entretanto em uma forma de realização preferida o polipeptídeo da COMT humana é a SEQ ID N°: 27 ou SEQ ID N°: 55. Outros polipeptídeos da COMT de mamífero adequados de uso nesta invenção incluem, mas não são limitados a, aqueles isolados de Pan troglodytes (N° de Acesso do GENBANK XP_514984), Macaca mulatta (N de Acesso do GENBANK AFJ70145), Equus caballus (N° de Acesso do GENBANK NP_001075303), Canis lupus familiaris (N° de Acesso do GENBANK AAR20324), Cricetulus griseus (No de Acesso do GENBANK EGV97595), Sus scrofa (N° de Acesso do GENBANK NP_001182259), e Bos taurus (N° de Acesso do GENBANK NP_001095787). Outros polipeptídeos da COMT exemplares de planta e micro-organismo incluem, mas não são limitados a, aqueles isolados da Rosa chinensis (N° de Acesso do GENBANK CAD29457), Prunus dulcis (N° de Acesso do GENBANK CAA58218), Gossypium hirsutum (N° de Acesso do GENBANK ACT32028), Jatropha curcas (N° de Acesso do GENBANK ACT87981), Eucalyptus camaldulensis (ADB82906), Candida orthopsilosis (N° de Acesso do GENBANK CCG25047), Pichia stipitis (N° de Acesso do GENBANK ABN67921), e Spathaspora passalidarum (N° de Acesso do GENBANK EGW29958). Em certas formas de realização, o polipeptídeo da COMT da invenção é obtido de Phytophthera infestans (N° de Acesso do GENBANK XP_002899214), Catharanthus roseus (N° de Acesso do GENBANK EGS21863), Yarrowia lipolitica (N° de Acesso do GENBANK XP_500451), Ciona intestinalis (N° de Acesso do GENBANK XP_002121420 ou XP_002131313), Capsasproa owczarzaki (N° de Acesso do GENBANK EFW46044), Chaetomium therophilum (N° de Acesso do GENBANK EGS21863), Clavispora lusitaniae (N° de Acesso do GENBANK XP_002899214), Paracoccidioides sp. ‘lutzii’ Pb01 (N° de Acesso do GENBANK XP_002793380), Baunilha planifolia (SEQ ID N°: 56), Coffea Arabica (N° de Acesso do GENBANK AAN03726), Rattus norvegicus (N° de Acesso do GENBANK NP_036663), Mus musculus (N° de Acesso do GENBANK NP_031770), Crenarchaeote (N° de Acesso do GENBANK ABZ07345), Mycobacterium vanbaleeni (N° de Acesso do GENBANK ABM14078), ou Schizosaccharomyces pombe (N° de Acesso do GENBANK NP_001018770, que foram mostrados exibir a atividade da COMT desejada (Figuras 3B e 3C).

[00058] O termo “polipeptídeo da COMT” como aqui usado refere-se a qualquer sequência de aminoácido que seja pelo menos 80 por cento (por exemplo, pelo menos 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 por cento) idêntica à sequência da COMT de Hs apresentada na SEQ ID N°: 27 e possua as atividades enzimáticas da catechol-O-metiltransferase do polipeptídeo da COMT de Hs do tipo selvagem.

[00059] Em uma forma de realização, o termo “polipeptídeo da COMT mutante,” como aqui usada, refere-se a qualquer polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que seja pelo menos 80 por cento, tal como pelo menos 85 por cento, por exemplo pelo menos 90 por cento, tal como pelo menos 95 por cento, por exemplo pelo menos 96 por cento, tal como pelo menos 97 por cento, por exemplo pelo menos 98 por cento, tal como pelo menos 99 por cento idêntica à sequência da COMT de Hs apresentada na SEQ ID N°: 27 e seja capaz de catalisar a metilação do grupo -OH na posição meta do ácido protocatecuico e/ou aldeído protocatecuico, em que a sequência de aminoácido do dito polipeptídeo da COMT mutante difere da SEQ ID N°: 27 em pelo menos um aminoácido. Além disso, a sequência de aminoácido do polipeptídeo da COMT mutante deve diferir da SEQ ID N°: 53, SEQ ID N°: 54 e SEQ ID N°: 55 em pelo menos um aminoácido. É preferido que o polipeptídeo da COMT mutante difira em pelo menos um aminoácido de qualquer sequência de qualquer polipeptídeo da COMT do tipo selvagem.

[00060] Em uma outra forma de realização da invenção, o termo “polipeptídeo da COMT mutante” refere-se a um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido, que seja pelo menos 80 por cento, tal como pelo menos 85 por cento, por exemplo pelo menos 90 por cento, tal como pelo menos 95 por cento, por exemplo pelo menos 96 por cento, tal como pelo menos 97 por cento, por exemplo pelo menos 98 por cento, tal como pelo menos 99 por cento idêntica à SEQ ID N°: 53 ou SEQ ID N°: 54 e seja capaz de catalisar a metilação do grupo -OH na posição meta do ácido protocatecuico e/ou aldeído protocatecuico, em que a sequência de aminoácido do dito polipeptídeo da COMT mutante difere de cada uma das SEQ ID N°: 53 e SEQ ID N°: 54 em pelo menos um aminoácido.

[00061] Os polipeptídeos da COMT mutantes aqui descritos podem ter uma ou mais mutações (por exemplo, uma substituição de um ou mais aminoácidos, uma deleção de um ou mais aminoácidos, inserções de um ou mais aminoácidos, ou combinações de substituições, deleções, e inserções), por exemplo, no sítio de ligação do substrato. Por exemplo, um polipeptídeo da COMT mutante pode ter uma ou mais substituições de aminoácido no sítio de ligação do substrato da COMT humana.

[00062] Em certas formas de realização, um “polipeptídeo da COMT mutante” da invenção difere da SEQ ID N°: 27, SEQ ID N°: 53, SEQ ID N°: 54 ou SEQ ID N°: 55 em apenas um ou dois resíduos de aminoácido, em que as diferenças entre as ditas proteínas mutantes e do tipo selvagem estão no sítio de ligação do substrato.

[00063] Como aqui descrito, os polipeptídeos da COMT mutantes podem ser usados para melhorar a biossíntese de glicosídeo de vanilina. Por exemplo, os polipeptídeos da COMT mutantes podem ter uma ou mais das propriedades que seguem: metabolização aumentada; metilação preferencial na posição meta (3’), ao invés de na posição para (4’) tal que a produção de vanilina seja favorecida em relação à isovanilina; ou melhor especificidade para os substratos do caminho da vanilina, ácido protocatecuico e aldeído protocatecuico. Os polipeptídeos da COMT mutantes podem ser caracterizados in vitro usando ensaios de metilação ou caracterizados in vivo em um hospedeiro recombinante com base na produção de ácido vanílico, vanilina, ou glicosídeo de vanilina.

[00064] As estruturas de iso-vanilina, vanilina, ácido iso-vanílico e ácido vanílico são como segue.

[00065] A COMT do Hs do tipo selvagem carece da O-metilação regiosseletiva de aldeído protocatecuico e ácido protocatecuico, indicando que o sítio de ligação de COMT do Hs não se liga a estes substratos em uma orientação que permite a metilação regiosseletiva desejada. Sem estar ligado a um mecanismo particular, o sítio ativo de COMT Hs é composto da co- enzima S-adenosil metionina (SAM), que serve como o doador de metila, e o substrato de catecol, que contém a hidroxila a ser metilada coordenada para Mg2+ e próxima ao Lys144. A O-metilação se processa por intermédio de um mecanismo SN2, onde Lys144 serve como uma base catalítica que desprotona a hidroxila proximal para formar o óxi-ânion que ataca um grupo metila do sulfônio de SAM. Ver, por exemplo, Zheng & Bruice (1997) J. Am. Chem. Soc. 119(35): 8137-8145; Kuhn & Kollman (2000) J. Am. Chem. Soc. 122(11): 2586-2596; Roca, et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125(25): 7726-37.

[00066] Em uma forma de realização da invenção a invenção fornece um polipeptídeo da COMT mutante, que é capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH do ácido protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos 4 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico, preferivelmente pelo menos 5 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico, tal como pelo menos 10 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico, por exemplo pelo menos 15 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico, tal como pelo menos 20 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico, por exemplo pelo menos 25 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico, tal como pelo menos 30 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico; e que tem uma sequência de amino que difere da SEQ ID N°: 27 em pelo menos um aminoácido.

[00067] Além das propriedades acima mencionadas, é além disso preferido que um polipeptídeo da COMT mutante seja capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH de aldeído protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos 4, 5, 10, 15, 20, 25, ou 30 vezes mais vanilina comparada à iso-vanilina; e/ou é capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH de álcool protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos 4, 5, 10, 15, 20, 25, ou 30 vezes mais vanilil álcool comparado com o iso-vanilil álcool.

[00068] Para determinar se um dado polipeptídeo da COMT mutante é capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH do ácido protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos X vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico, um ensaio in vitro pode ser conduzido. Em um tal ensaio, o ácido protocatecuico é incubado com um polipeptídeo da COMT mutante na presença de um doador de metila e subsequentemente o nível de ácido iso-vanílico e ácido vanílico gerados é determinado. O dito doador de metila por exemplo pode ser S- adenosilmetionina. Mais preferivelmente, isto pode ser determinado pela geração de um hospedeiro recombinante que abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo da COMT mutante a ser testado, em que o dito hospedeiro recombinante além disso é capaz de produzir ácido protocatecuico. Depois do cultivo do hospedeiro recombinante, o nível de ácido iso-vanílico e ácido vanílico gerados pode ser determinado. Em relação a este método é preferido que o dito ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo da COMT mutante a ser testado esteja operavelmente ligado a uma região reguladora que permita a expressão no dito hospedeiro recombinante. Além disso, é preferido que o hospedeiro recombinante expresse pelo menos um 3DSD e pelo menos um ACAR, que preferivelmente pode ser um dos 3DSD’s e ACAR’s aqui descritos. Em formas de realização onde o hospedeiro recombinante expressa um ACAR capaz de catalisar a conversão de ácido vanílico para vanilina, depois o método também pode incluir determinar o nível de vanilina e iso-vanilina gerado. O hospedeiro recombinante também pode expressar pelo menos um UGT capaz de catalisar a glicosilação da vanilina e isovanilina, caso este em que os níveis de vanilina-glicosídeo e iso-vanilina-glicosídeo podem ser determinados ao invés dos níveis de vanilina e iso-vanilina, respectivamente. Alternativamente, isto pode ser determinado pela geração de um hospedeiro recombinante que abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo da COMT mutante a ser testado, e alimentar o ácido protocatecuico ao dito hospedeiro recombinante, seguido pela determinação do nível de ácido iso-vanílico e ácido vanílico gerados.

[00069] Similarmente, um ensaio in vitro ou uma célula hospedeira recombinante pode ser usado para determinar se um polipeptídeo da COMT mutante é capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH de aldeído protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos X vezes mais vanilina comparada com a iso-vanilina. Entretanto, neste ensaio, o aldeído protecatecuico é usado como material de partida e o nível de vanilina e iso-vanilina é determinado.

[00070] Do mesmo modo, um ensaio in vitro ou uma célula hospedeira recombinante pode ser usada para determinar se um dado polipeptídeo da COMT mutante é capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH do álcool protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos X vezes mais vanilil álcool comparado com o iso-vanilil álcool. Entretanto, neste ensaio, o álcool protecatecuico é usado como material de partida e o nível de vanilil álcool e iso-vanilil álcool é determinado.

[00071] O nível de isovanilina e vanilina pode ser determinado por qualquer método adequado útil para detectar estes compostos, em que o dito método pode distinguir entre isovanilina e vanilina. Tais métodos incluem por exemplo HPLC. Similarmente, o nível de ácido iso-vanílico, ácido vanílico, iso-vanilil álcool e vanilil álcool pode ser determinado usando qualquer método adequado útil para detectar estes compostos, em que o dito método pode distinguir entre isovanilina e vanilina. Tais métodos incluem por exemplo HPLC.

[00072] Para os substratos das dimensões de aldeído protocatecuico e ácido protocatecuico, o limite do sítio de ligação do substrato de COMT do Hs foi descoberto ser formado pelos resíduos hidrofóbicos que seguem: Trp38, Met40, Cys173, Pro174, Trp143, e Leu198. Um resíduo hidrofílico adicional que pode influencia a ligação é Arg201. A hidroxila do catecol que não é metilada liga-se pelo hidrogênio com Glu199.

[00073] De acordo com este mecanismo, para que a metilação na posição meta de aldeído protocatecuico e ácido protocatecuico ocorra, estes substratos devem ser ligados em uma orientação que coloque a hidroxila em meta de modo que a mesma seja coordenada para Mg2+ e próxima ao Lys144, ao passo que a hidroxila em para está próxima ao Glu199. A falta observada desta regiosseletividade desejada em COMT do Hs do tipo selvagem sugere que esta orientação de ligação preferencialmente não ocorre. Um ou mais aminoácidos podem ser substituídos no lugar dos resíduos do sítio de ligação de COMT do Hs para permitir uma orientação de ligação dos substratos que promove a O-metilação em meta desejada do aldeído protocatecuico e ácido protocatecuico.

[00074] Portanto, esta invenção também inclui um método para identificar polipeptídeos da COMT com especificidade de substrato melhorada. Em particular, um tal método fornece metodologia computacional para identificar mutações de resíduo que conferem O-metilação em meta melhorada por um polipeptídeo da COMT. O método inclui várias etapas distintas. Em particular, um método de identificar mutações ideais inclui as etapas de (a) selecionar uma estrutura de proteína de um polipeptídeo da COMT; (b) ancorar os substratos de ácido protocatecuico e aldeído protocatecuico à estrutura de proteína do polipeptídeo da COMT determinada em (a) para deduzir as conformações diferentes que promovem a O-metilação em meta ou para regiosseletiva; (c) identificar mutações do sítio de ligação próxima aos substratos do ácido protocatecuico e aldeído protocatecuico; (d) realizar a análise mutacional in silico em cada resíduo identificado em (c); (e) classificar as mutações de resíduo candidatas para cada posição de (d) com base nas conformações prognosticadas de substrato de O-metilação em meta ou para; e (f) selecionar as melhores mutações obtidas para cada resíduo candidato identificado em (c).

[00075] Como debatido acima, o polipeptídeo da COMT pode estar na família COMT classificada sob o número EC 2.1.1.6, catecol O-metil transferase. Como tal, uma pessoa habilitada na técnica avaliaria que, além do COMT do Hs, o método pode ser aplicado a qualquer espécie de COMT dentro desta classificação, em que tais proteínas teriam resíduos de sítio de ligação similares. Em algumas formas de realização, o método é aplicado à COMT de Arabidopsis ou morango (SEQ ID N°: 54 e SEQ ID N°: 54, respectivamente). Embora cada uma das etapas do método seja descrita em mais detalhes com respeito à COMT do Hs, será avaliado que etapas de método similares podem ser realizadas com outros polipeptídeos da COMT.

[00076] Na etapa (a), uma estrutura de proteína da COMT é selecionada. As estruturas de proteína de COMT do Hs são publicamente disponíveis do Banco de Dados de Proteína e podem ser avaliadas quanto à utilidade com base na resolução, inclusão de mutações, e outras variações de sequência que podem ser introduzidas para produzir a cristalização. Outros fatores que podem ser considerados na escolha de uma estrutura incluem se a estrutura inclui ou não um substrato ligado à proteína, ou a natureza do substrato ligado à proteína. A estrutura cristalina código 3BWM (RCSB Banco de Dados de Proteína) é uma estrutura particularmente útil para a COMT do Hs, e foi usada nos métodos aqui descritos. Uma pessoa habilitada na técnica avaliaria que outras estruturas cristalinas da COMT do Hs podem ser usadas como entradas para procedimentos de modelagem.

[00077] Na etapa (b), os substratos de interesse, por exemplo, ácido protocatecuico e aldeído protocatecuico, são ancorados à estrutura de proteína. A ancoragem é um termo que simboliza um método computacional implementado em uma variedade de algoritmos de prognosticar uma conformação provável de uma molécula pequena selecionada em um sítio de ligação de proteína. A técnica tipicamente calcula uma contagem de ligação para fornecer a base para avaliar a bondade de ajuste e energia de ligação prognosticada de interação. O programa de ancoragem usado para derivar as conformações de substrato usadas no procedimento corrente é ProtoScreen (Haydon, et al. (2008) Science 321: 1673-1675). O método cria contagens de ligação de acordo com o algoritmo ProtoScore (Bhurruth-Alcor, et al. (2011) Org. Biomol. Chem. 9: 1169-1188). Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que outros programas de ancoragem podem ser usados nesta etapa de método para identificar conformações de ligação adequadas de substratos do ácido protocatecuico e aldeído protocatecuico em COMT do Hs (ou outro membro da família COMT).

[00078] Na etapa (c), a análise mutacional é realizada. Isto pode incluir várias subetapas tais como (i) identificar um primeiro resíduo a ser mutado; (ii) identificar um resíduo para mutar da lista de aminoácidos adequados; (iii) para cada resíduo em (ii), pesquisar uma biblioteca de rotâmero para candidatos conformacionais; (iv) mutar o resíduo de (i) com cada uma das novas seleções de rotâmero de cadeia lateral de resíduo de (iii); (v) minimizar a conformação de complexo de proteína; (vi) contar cada candidato a rotâmero em (iv) com vários cálculos de energias de mutante-substrato, mutante-proteína, mutante-solvente e substrato-solvente com conformações diferentes do ácido protocatecuico ou aldeído que permite comparações de energia entre eles onde o substrato está sendo modificado nas posições meta ou para; e (vii) classificar as seleções de rotâmero seleções de (iii) e depois os mutantes de aminoácido de contagem mais alta de (ii).

[00079] Na subetapa (i), cada um dos resíduos a serem mutados são analisados por sua vez.

[00080] Na subetapa (ii), um resíduo para mutar é escolhido de uma lista determinística de aminoácidos disponíveis. Por default esta lista é dos 20 aminoácidos padrão encontrados na natureza, mas pode incluir outros aminoácidos não naturais.

[00081] Na subetapa (iii), todos os rotâmeros são identificados em uma biblioteca de rotâmero que compara a identidade do aminoácido mutante. Uma biblioteca de rotâmero é um conjunto pré-computadorizado de conformações preferidas de cadeias laterais de aminoácido padrão em um formato 3D utilizável. Tais bibliotecas são habitualmente usadas no trabalho de análise estrutural de proteína, e são incluídos na maioria dos pacotes de modelagem molecular comercialmente disponíveis. O conjunto de rotâmeros que comparam a identidade do resíduo mutante são selecionados para a subetapa (iv).

[00082] Na subetapa (iv), o resíduo de proteína selecionado é trocado para cada um dos rotâmeros identificados em (iii). Isto envolve manipular a representação computacional dos átomos do resíduo de proteína tal que os átomos da cadeia lateral do resíduo de partida que são deletados antes do rotâmero selecionado adventício de (iii) são conectados na posição do carbono alfa usando as matemáticas de vetor. Este método é repetido para cada rotâmero candidato para chegar em uma lista de representações 3D da proteína cada uma variando apenas pelas conformações de rotâmero que diferem em uma única posição de resíduo.

[00083] Na subetapa (v), os complexos de proteína-substrato derivados em (iv) são submetidos às minimizações de campo de força. Em uma forma de realização particularmente útil, este campo de força é AMBER99 com cargas de AM1-BCC aplicadas ao substrato. Em um outro aspecto do método, um termo solvatação de Born é usado. A cadeia principal da proteína pode ser amarrada usando restrições de parede, enquanto que as cadeias laterais permanecem não restrita. Isto tem o efeito de reduzir o movimento da proteína global, mas permite o efeito da mutação de resíduo individual nos resíduos vizinhos a serem explorados. Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que vários pacotes de modelagem molecular comercialmente disponíveis são capazes de realizar estas tarefas.

[00084] Na subetapa (vi), as conformações de proteína-complexo resultantes são submetidas aos cálculos energéticos para determinar a viabilidade das conformações mutantes individuais. Isto inclui calcular individualmente a energia de interação de resíduo do tipo selvagem com o substrato, ambiente de proteína e solvente e depois realizar os mesmos cálculos com a conformação de resíduo mutado. Os cálculos são determinados para ambas das conformações (reação em meta e para) do substrato. Esta etapa do método identifica assim as mutações que têm energias de ligação favoráveis para o substrato na posição de reação meta comparado com a posição de ativação em para. As energias são calculadas usando campo de força com termos base. Em uma forma de realização, o campo de força é AMBER99 e a energia de interação entre um aminoácido e o ambiente de proteína-substrato é descrito pela equação 1. eletrostático (Equação 1)

[00085] onde

[00086] Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que outras equações similares podem ser implementadas para derivar as energias de interação adequadas para esta análise energética diferencial de posições de substrato- aminoácido mutado diferentes.

[00087] Na subetapa (vii), aminoácidos mutantes são selecionados com base nas energias de ligação favoráveis de substrato ligado na posição prognosticada que reage em meta comparada com a posição prognosticada que reage em para. Estes cálculos assim determinam que as mutações de aminoácido são prováveis de promover a O-metilação regiosseletiva em meta.

[00088] Na etapa (iv), a etapa (iii) é repetida até que uma lista de valores de energia é produzida para cada um dos resíduos do sítio de ligação a serem mutados.

[00089] Na etapa (v), a lista de valores de energia derivada da etapa (iv) é classificada pelo diferencial em energia entre cada mutação onde o substrato está na posição de reação meta comparado com a posição de reação em para. As entradas no topo desta lista representam onde mutações favorecem a O-metilação meta em relação à O-metilação para.

[00090] Na etapa (vi), um número limitado de tais candidatos da etapa (v) são selecionados com base nos valores de energia. As mutações não são selecionadas onde (1) as mutações são energeticamente desfavoráveis ou (2) onde as mutações não são prognosticadas alterar a regiosseletividade.

[00091] Como aqui descrito, a aplicação do método descrito acima à COMT do Hs resultou na identificação de um conjunto de mutações que são planejadas para melhorar a regiosseletividade da enzima de O-metilação. As mutações podem ser usadas independentemente ou em combinação.

[00092] Na isoforma ligada à membrana de COMT do Hs, os números de resíduo equivalentes são aqueles de COMT do Hs solúvel mais cinquenta. Portanto os resíduos descritos ou substituídos na COMT do Hs solúvel também são deduzidos estar descritos ou substituídos no número de resíduo mais cinquenta no COMT do Hs ligado à membrana.

[00093] Em uma forma de realização, a invenção fornece um polipeptídeo da COMT mutante, que (1) tenha uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos por cento, tal como pelo menos 85 por cento, por exemplo pelo menos 90 por cento, tal como pelo menos 95 por cento, por exemplo pelo menos 96 por cento, tal como pelo menos 97 por cento, por exemplo pelo menos 98 por cento, tal como pelo menos 99 por cento de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 27 determinado N° comprimento inteiro da SEQ ID N°: 27; e (2) tenha pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição que se alinha com as posições 198 a 199 da SEQ ID N°: 27, que pode ser qualquer uma das substituições de aminoácido aqui descritas abaixo; e (3) seja capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH do ácido protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos 4, 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 vezes mais ácido vanílico comparado com o ácido iso-vanílico. Além destas características, o dito polipeptídeo da COMT mutante também pode ser capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH de aldeído protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos 4, 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 vezes mais vanilina comparado com a iso- vanilina; e/ou ser capaz de catalisar a metilação de um grupo -OH de álcool protocatecuico, em que a dita metilação resulta na geração de pelo menos 4, 5, 10, 15, 20, 25, ou 30 vezes mais vanilil álcool comparado com o iso-vanilil álcool.

[00094] Assim, o polipeptídeo da COMT mutante em uma forma de realização preferida pode ter uma substituição de aminoácido no alinhamento da posição com a posição 198 da SEQ ID N°: 27. Consequentemente, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da COMT mutante com as características esboçadas acima, em que a dita substituição é uma substituição da leucina na posição que se alinha com a posição 198 da SEQ ID N°: 27 com um outro aminoácido tendo um índice de hidropatia mais baixo. Por exemplo, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da COMT mutante com características como esboçadas acima, em que a dita substituição é uma substituição da leucina na posição que se alinha com a posição 198 da SEQ ID N°: 27 com um outro aminoácido tendo um índice de hidropatia mais baixo do que 2. assim, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da COMT mutante com características como esboçadas acima, em que a dita substituição é uma substituição da leucina na posição que se alinha com a posição 198 da SEQ ID N°: 27 com um Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr, por exemplo Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr. Entretanto, preferivelmente a dita substituição é uma substituição da leucina na posição que se alinha com a posição 198 da SEQ ID N°: 27 com tirosina. A substituição da leucina que se alinha com posição 198 da SEQ ID N°: 27 com metionina aumentou a regiosseletividade da O-metilação de meta>para para o aldeído protocatecuico.

[00095] Em uma outra forma de realização preferida, o polipeptídeo da COMT mutante pode ter uma substituição de aminoácido na posição que se alinha com a posição 199 da SEQ ID N°: 27. Consequentemente, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da COMT mutante com características como esboçadas acima, em que a dita substituição é uma substituição do ácido glutâmico na posição que se alinha com a posição 199 da SEQ ID N°: 27 com um outro aminoácido, que tem uma carga de cadeia lateral neutra ou positiva N° pH 7,4. Assim, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da COMT mutante com características como esboçadas acima, em que a dita substituição é uma substituição do ácido glutâmico na posição que se alinha com a posição 199 da SEQ ID N°: 27 com Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val. Entretanto, preferivelmente a dita substituição é uma substituição do ácido glutâmico na posição que se alinha com a posição 199 da SEQ ID N°: 27 com uma alanina ou glutamina. A substituição do ácido glutâmico que se alinha com a posição 199 da SEQ ID N°: 27 com alanina ou glutamina aumentou a regiosseletividade da O-metilação de meta>para para o aldeído protocatecuico.

[00096] Por exemplo, um polipeptídeo da COMT mutante pode ter uma ou mais das mutações que seguem: uma substituição de um triptofano, tirosina, fenilalanina, ácido glutâmico, ou arginina No lugar da leucina em uma posição que se alinha com a posição 198 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27; uma substituição de uma arginina, lisina, ou alanina No lugar da metionina em uma posição que se alinha com a posição 40 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27; uma substituição de uma tirosina, lisina, histidina, ou arginina No lugar do triptofano em uma posição que se alinha com a posição 143 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27; uma substituição de uma isoleucina, arginina, ou tirosina no lugar da prolina em uma posição que se alinha com a posição 174 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27; uma substituição de uma arginina ou lisina no lugar do triptofano em uma posição que se alinha com a posição 38 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27; uma substituição de uma fenilalanina, tirosina, ácido glutâmico, triptofano, ou metionina no lugar da cisteína em uma posição que se alinha com a posição 173 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27; e/ou uma substituição de uma serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico no lugar da arginina em uma posição que se alinha com a posição 201 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27.

[00097] Em uma forma de realização, um polipeptídeo da COMT mutante contém a substituição de triptofano no lugar da leucina em uma posição que se alinha com a posição 198. Esta mutação pode aumentar a regiosseletividade da O-metilação de meta>para para o ácido protocatecuico. A modelagem do sítio de ligação da proteína de um polipeptídeo da COMT que contêm uma mutação L198W, indica que um conflito estérico pode ocorrer entre o resíduo mutado e o substrato. Este conflito estérico não ocorre na conformação de reação meta visto que o ácido carboxílico do substrato está distal em relação a este resíduo.

[00098] Em uma outra forma de realização da invenção, o polipeptídeo da COMT mutante é um polipeptídeo da SEQ ID N°: 27, em que o aminoácido na posição 198 foi substituído com um aminoácido tendo um índice de hidropatia menor do que o da leucina. Por exemplo, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da SEQ ID N°: 27, em que a leucina na posição 198 foi substituída com um aminoácido tendo um índice de hidropatia mais baixo do que 2. Assim, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da SEQ ID N°: 1, em que a leucina na posição 198 foi substituído com um Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr, preferivelmente Met ou Tyr.

[00099] Em uma outra forma de realização preferida, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da SEQ ID N°: 27, em que o aminoácido na posição 199 foi substituído com um outro aminoácido, que tem uma carga de cadeia lateral neutra ou positiva N° pH 7,4. Assim, o polipeptídeo da COMT mutante pode ser um polipeptídeo da SEQ ID N°: 27 onde o ácido glutâmico na posição 199 foi substituído com Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val, preferivelmente Ala ou Gln.

[000100] Em algumas formas de realização, um polipeptídeo da COMT mutante tem duas ou mais mutações. Por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dos resíduos no sítio de ligação do substrato podem ser mutados. Por exemplo, em uma forma de realização, um polipeptídeo da COMT mutante pode ter uma substituição de uma arginina ou lisina no lugar da metionina em uma posição que se alinha com a posição 40 da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 27; uma substituição de uma tirosina ou histidina no lugar do triptofano em uma posição que se alinha com a posição 143 da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 27; uma substituição de uma isoleucina no lugar da prolina em uma posição que se alinha com a posição 174 da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 27, e uma substituição de uma arginina ou lisina no lugar do triptofano na posição 38. Um polipeptídeo da COMT mutante também pode ter uma substituição de lisina ou arginina no lugar do triptofano em uma posição que se alinha com a posição 143 da sequência de aminoácido da SEQ ID N°: 27 e uma substituição de uma arginina ou tirosina no lugar da prolina na posição 174 da SEQ ID N°: 27. Um polipeptídeo da COMT mutante também pode ter uma substituição de uma fenilalanina, tirosina, ácido glutâmico, triptofano, ou metionina no lugar da cisteína em uma posição que se alinha com a posição 173 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27, uma substituição de uma alanina no lugar da metionina em uma posição que se alinha com a posição 40 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27, e uma substituição de uma serina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico no lugar da arginina em uma posição que se alinha com a posição 201 da sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID N°: 27. Também é possível que o polipeptídeo da COMT mutante tenha uma substituição da leucina em uma posição que se alinha com a posição 198 da SEQ ID N°: 27 assim como uma substituição do ácido glutâmico em uma posição que se alinha com a posição 199 da SEQ ID N°: 27. As ditas substituições podem ser qualquer uma das substituições descritas nesta seção acima, Também é possível que o polipeptídeo da COMT mutante tenha uma substituição da leucina em uma posição que se alinha com a posição 198 da SEQ ID N°: 27 assim como uma substituição da arginina em uma posição que se alinha com a posição 201 da SEQ ID N°: 27. As ditas substituições podem ser qualquer uma das substituições descritas nesta seção acima.

Identidade percentual

[000101] As identidades de sequência dadas aqui são preferivelmente identidade de sequência N° comprimento inteiro da sequência de referência. Consequentemente, a identidade de sequência com a sequência de aminoácido fornecida como a SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 27 aqui é a identidade de sequência N° comprimento inteiro da SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 27, respectivamente.

[000102] A identidade percentual pode ser determinada como segue. Uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácido apresentadas na SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 27) é alinhada com uma ou mais sequências candidatas usando o programa de computador ClustalW (versão 1.83, parâmetros de default), que permite que os alinhamentos de sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo sejam realizados através do seu comprimento total (alinhamento global). Chenna et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31(13): 3497-500.

[000103] ClustalW calcula o melhor emparelhamento entre uma sequência de referência e uma ou mais sequências candidatas, e as alinham de modo que as identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. Os intervalos de um ou mais resíduos podem ser inseridos em uma sequência de referência, uma sequência candidata, ou ambas, para maximizar os alinhamentos de sequência. Para o alinhamento aos pares rápido de sequências de ácido nucleico, os parâmetros de default que seguem são usados: tamanho da palavra: 2; tamanho da janela: 4; método de contagem: porcentagem; número de diagonais de topo: 4; e penalidade de intervalo: 5. Para o alinhamento múltiplo das sequências de ácido nucleico, os parâmetros que seguem são usados: penalidade de abertura de intervalo: 10,0; penalidade de extensão de intervalo: 5,0; e transições de peso: sim. Para o alinhamento aos pares rápido das sequências de proteína, os parâmetros que seguem são usados: tamanho da palavra: 1; tamanho da janela: 5; método de contagem: porcentagem; número de diagonais de topo: 5; penalidade de intervalo: 3. Para o alinhamento múltiplo das sequências de proteína, os parâmetros que seguem são usados: matriz de peso: blosum; penalidade de abertura de intervalo: 10,0; penalidade de extensão de intervalo: 0,05; intervalos hidrofílicos: ligado; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, e Lys; penalidades de intervalo específicos de resíduo: ligado. O resultado do ClustalW é um alinhamento de sequência que reflete as relações entre as sequências.

[000104] Para determinar a identidade percentual de uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácido candidata em relação a uma sequência de referência, as sequências são alinhadas usando ClustalW, o número de emparelhamentos idênticos no alinhamento é dividido pelo comprimento da sequência de referência, e o resultado é multiplicado por 100. É mencionado que o valor da identidade percentual pode ser arredondado até o décimo mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, e 78,14 são arredondados para baixo para 78,1, enquanto que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, e 78,19 são arredondados até 78,2.

Substituições de Aminoácido

[000105] As substituições de aminoácido podem ser conservativas ou não conservativas. As substituições de aminoácido conservativas substituem um aminoácido com um aminoácido da mesma classe, ao passo que as substituições de aminoácido não conservativas substituem um aminoácido com um aminoácido de uma classe diferente. Os exemplos de substituições conservativas incluem substituições de aminoácido dentro dos grupos que seguem: (1) glicina e alanina; (2) valina, isoleucina, e leucina; (3) ácido aspártico e ácido glutâmico; (4) asparagina, glutamina, serina, e treonina; (5) lisina, histidina, e arginina; e (6) fenilalanina e tirosina.

[000106] As substituições não conservativas de aminoácido podem substituir um aminoácido de uma classe com um aminoácido de uma classe diferente. As substituições não conservativas podem fazer uma mudança substancial na carga ou hidrofobicidade do produto de gene. As substituições não conservativas de aminoácido também podem fazer uma mudança substancial no volume da cadeia lateral do resíduo, por exemplo, substituindo um resíduo de alanina no lugar de um resíduo de isoleucina. Os exemplos de substituições não conservativas incluem a substituição de um aminoácido básico no lugar de um aminoácido não polar ou um aminoácido polar no lugar de um aminoácido ácido. Uma pessoa de habilidade comum na técnica avaliará que aminoácidos similares podem ser substituídos no lugar dos mutantes aqui descritos.

Ácido Nucleicos

[000107] Este documento também fornece ácidos nucleicos isolados que codificam os polipeptídeos de AROM e COMT mutantes. Um “ácido nucleico isolado” refere-se a um ácido nucleico que é separado de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes em um genoma, que inclui ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam um ou ambos os lados do ácido nucleico em um genoma. O termo “isolados” como aqui usado com respeito aos ácidos nucleicos também inclui qualquer sequência de ácido nucleico que não ocorre naturalmente, visto que tais sequencias que não ocorrem naturalmente não são encontradas na natureza e não têm sequências imediatamente contíguas em um genoma que ocorre naturalmente.

[000108] Um ácido nucleico isolado pode ser, por exemplo, uma molécula de DNA, contanto que uma das sequências de ácido nucleico normalmente encontradas imediatamente flanqueando esta molécula de DNA em um genoma que ocorre naturalmente é removido ou ausente. Assim, um ácido nucleico isolado inclui, sem limitação, uma molécula de DNA que existe como uma molécula separada (por exemplo, um ácido nucleico quimicamente sintetizado, ou um cDNA ou fragmento de DNA genômico produzido pela PCR ou tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras sequências assim como DNA que é incorporado dentro de um vetor, um plasmídeo que replica autonomamente, um vírus (por exemplo, qualquer paramixovírus, retrovírus, lentivírus, adenovírus, ou vírus do herpes), ou dentro do DNA genômico de um procariota ou eucariota. Além disso, um ácido nucleico isolado pode incluir um ácido nucleico engendrado tal como uma molécula de DNA que é parte de um ácido nucleico híbrido ou de fusão. Um ácido nucleico que existe entre centenas a milhões de outros ácidos nucleicos dentro, por exemplo, das bibliotecas de cDNA ou bibliotecas genômicas, ou fatias de gel que contêm uma digestão de restrição de DNA genômico, não é considerado um ácido nucleico isolado.

[000109] Ácido nucleicos que codificam os polipeptídeos de AROM ou COMT podem ser modificados usando técnicas de clonagem molecular comuns (por exemplo, mutagênese direcionada por local) para gerar mutações nas posições particulares do polipeptídeo codificado (por exemplo, posições que se alinham com as posições 1349, 1366, 1370, 1387, 1392, 1441, 1458, 1500, 1533, ou 1571 da sequência de aminoácido de AROM apresentada na SEQ ID N°: 4; ou posições que se alinham com as posições 38, 40, 143, 173, 174, 198, ou 201 da forma solúvel da sequência de aminoácido da COMT humana apresentada na SEQ ID N°: 27). As moléculas de ácido nucleico podem incluir uma mutação de nucleotídeo único ou mais do que uma mutação, ou mais do que um tipo de mutação. A reação da cadeia da polimerase (PCR) e as técnicas de hibridização de ácido nucleico podem ser usadas para identificar ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos AROM tendo sequências de aminoácido alteradas.

[000110] Em algumas formas de realização, uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo mutante desta invenção pode incluir uma sequência de rótulo que codifica um “rótulo” designado para facilitar a manipulação subsequente (por exemplo, para facilitar a purificação ou detecção), secreção, ou localização do polipeptídeo codificado. As sequências de rótulo podem ser inseridas na sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de AROM ou COMT tal que o rótulo codificado está localizado no terminal carboxila ou amino do polipeptídeo de AROM ou COMT. Os exemplos não limitantes de rótulos codificados incluem proteína fluorescente verde (GFP), glutationa S transferase (GST), rótulo HIS, e rótulo FLAG (Kodak, New Haven, CT). Outros exemplos de rótulos incluem um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptídeo de sinal, ou um rótulo de secreção.

[000111] Os polipeptídeos (mutantes ou do tipo selvagem) desta invenção podem ser produzidos usando qualquer método. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos pela síntese química. Alternativamente, os polipeptídeos aqui descritos podem ser produzidos pela tecnologia recombinante padrão usando vetores de expressão heterólogos que codificam os polipeptídeos. Os vetores de expressão podem ser introduzidos dentro das células hospedeiras (por exemplo, pela transformação ou transfecção) para a expressão do polipeptídeo codificado, que depois pode ser purificado. Os sistemas de expressão que podem ser usados para a produção e escala pequena ou grande de polipeptídeos incluem, sem limitação, microorganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformados com vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA plasmídico, ou DNA cosmídico que contêm as moléculas de ácido nucleico aqui descritas, e levedura (por exemplo, S. cerevisiae ou S. pombe) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinantes que contêm as moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Os sistemas de expressão úteis também incluem sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) que contêm as moléculas de ácido nucleico aqui descritas, e sistemas de célula de planta infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus mosaico do tabaco) ou transformado com vetores de expressão de plasmídeo recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) que contêm as moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Os polipeptídeos desta invenção também podem ser produzidos usando sistema de expressão de mamífero que abriga promotores que contêm construções de expressão recombinantes derivados a partir do genoma das células de mamífero (por exemplo, o promotor da metalotioneína) ou a partir de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus e o promotor de citomegalovírus), junto com os ácidos nucleicos aqui descritos. Os polipeptídeos desta invenção podem ter um rótulo de terminal N ou terminal C como debatido acima.

Hospedeiros recombinantes

[000112] Esta invenção também descreve hospedeiros recombinantes. Como aqui usado, o termo hospedeiro recombinante é intencionado a se referir a um hospedeiro, o genoma do qual foi aumentado em pelo menos uma sequência de DNA incorporada. Tais sequências de DNA incluem mas não são limitadas aos genes que não estão naturalmente presentes, sequências de DNA que não são normalmente transcritas em RNA ou traduzidas em uma proteína (“expressadas”), e outros genes ou sequências de DNA que se deseja introduzir dentro do hospedeiro não recombinante. Será avaliado que tipicamente o genoma de um hospedeiro recombinante aqui descrito é aumentado através da introdução estável de um ou mais genes recombinantes. Entretanto, os plasmídeos ou vetores autônomos ou replicativos também podem ser usados dentro do escopo desta invenção. Além disso, a presente invenção pode ser praticada usando um número de cópia baixo, por exemplo, um plasmídeo ou vetor de cópia única, ou número de cópia alto (como aqui exemplificado).

[000113] No geral, o DNA introduzido não é originalmente residente no hospedeiro que é o receptor do DNA, mas está dentro do escopo da invenção isolar um segmento de DNA de um dado hospedeiro, e para subsequentemente introduzir uma ou mais cópias adicionais deste DNA dentro do mesmo hospedeiro, por exemplo, para realçar a produção do produto de um gene ou alterar o padrão de expressão de um gene. Em alguns casos, o DNA introduzido modificará ou mesmo substituirá um gene endógeno ou sequência de DNA, por exemplo, pela recombinação homóloga ou mutagênese direcionada por local. Os hospedeiros recombinantes adequados incluem micro-organismos, células de planta, e plantas.

[000114] O termo “gene recombinante” refere-se a um gene ou sequência de DNA que é introduzida dentro de um hospedeiro receptor, independente de se o mesmo ou um gene ou sequência de DNA similares possam já estar presente em um tal hospedeiro. “Introduzido,” ou “aumentado” neste contexto, é conhecido na técnica significar introduzido ou aumentado pela mão do homem. Assim, um gene recombinante pode ser uma sequência de DNA de uma outra espécie, ou pode ser uma sequência de DNA que se origina de ou está presente na mesma espécie, mas foi incorporada dentro de um hospedeiro pelos métodos recombinantes para formar um hospedeiro recombinante. Será avaliado que um gene recombinante que é introduzido dentro de um hospedeiro pode ser idêntico a uma sequência de DNA que está normalmente presente no hospedeiro que é transformado, e é introduzido para fornecer uma ou mais cópias adicionais do DNA para permitir deste modo a super expressão ou expressão modificada do produto de gene deste DNA.

[000115] Um gene recombinante que codifica um polipeptídeo aqui descrito inclui a sequência codificadora para este polipeptídeo, operavelmente ligada, na orientação de sentido, a uma ou mais regiões reguladoras adequadas para a expressão do polipeptídeo. Porque muitos micro-organismos são capazes de expressar produtos de gene múltiplo a partir de um mRNA policistrônico, polipeptídeos múltiplos podem ser expressados sob o controle de uma única região reguladora para estes micro-organismos, se desejado. Uma sequência codificadora e uma região reguladora são consideradas serem operavelmente ligadas quando a região reguladora e sequência codificadora são posicionadas de modo que a região reguladora seja eficaz para regular a transcrição ou tradução da sequência. Tipicamente, o sítio de início de tradução da matriz de leitura traducional da sequência codificadora é posicionada entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da região reguladora para um gene monocistrônico.

[000116] Em muitos casos, a sequência codificadora para um polipeptídeo aqui descrito é identificada em uma espécie outra que não o hospedeiro recombinante, isto é, é um ácido nucleico heterólogo. O termo “ácido nucleico heterólogo” como aqui usado, refere-se a um ácido nucleico introduzido dentro de um hospedeiro recombinante, em que o dito ácido nucleico não está naturalmente presente no dito hospedeiro. Assim, se o hospedeiro recombinante é um micro-organismo, a sequência codificadora pode ser de outros micro-organismos procarióticos ou eucarióticos, de plantas ou de animais. Em alguns casos, entretanto, a sequência codificadora é uma sequência que é nativa ao hospedeiro e está sendo reintroduzida neste organismo. Uma sequência nativa pode ser frequentemente distinguida da sequência que ocorre naturalmente pela presença de sequências não naturais ligadas ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não nativas que flanqueiam uma sequência nativa em uma construção de ácido nucleico recombinante. Além disso, os ácidos nucleicos exógenos estavelmente transformados são integrados nas posições outras que não a posição onde a sequência nativa é encontrada.

[000117] A “região reguladora” refere-se a um ácido nucleico tendo sequências de nucleotídeo que influenciam o início e a taxa de transcrição ou tradução, e a estabilidade e/ou mobilidade de um produto da transcrição ou tradução. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências realçadoras, elementos de resposta, sítios de reconhecimento de proteína, elementos indutíveis, sequências de ligação de proteína, regiões não traduzidas 5’ e 3’ (UTRs), sítios de início transcricional, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, íntrons, e combinações dos mesmos. Uma região reguladora tipicamente inclui pelo menos um promotor de núcleo. Uma região reguladora também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência realçadora, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). Uma região reguladora é operavelmente ligada a uma sequência codificadora pelo posicionamento da região reguladora e da sequência codificadora de modo que a região reguladora é eficaz para regular a transcrição ou tradução da sequência. Por exemplo, para ligar operavelmente uma sequência codificadora e uma sequência promotora, o sítio de início de tradução da matriz de leitura traducional da sequência codificadora é tipicamente posicionada entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante do promotor. Uma região reguladora, entretanto, pode ser posicionada tanto quanto cerca de 5.000 nucleotídeos a montante do sítio de início de tradução, ou de cerca de 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início de transcrição.

[000118] A escolha das regiões reguladoras a serem incluídas depende de vários fatores, que incluem, mas não limitados a, eficiência, selecionabilidade, indutibilidade, nível de expressão desejado, e expressão preferencial durante certos estágios da cultura. É uma questão de rotina para uma pessoa de habilidade na técnica para modular a expressão de uma sequência codificadora pela seleção e posicionamento de modo apropriado das regiões reguladoras em relação à sequência codificadora. Será entendido que mais do que uma região reguladora pode estar presente, por exemplo, íntrons, realçadores, regiões de ativação a montante, terminadores de transcrição, e elementos indutíveis.

[000119] Um ou mais genes, por exemplo um ou mais ácidos nucleicos heterólogos, podem ser combinados em uma construção de ácido nucleico recombinante em “módulos” úteis para um aspecto separado da produção de vanilina e/ou glicosídeo de vanilina. Combinar uma pluralidade de genes ou ácidos nucleicos heterólogos em um módulo, facilita o uso do módulo em uma variedade de espécies. Por exemplo, um grupo de gene da vanilina pode ser combinado tal que cada sequência codificadora é operavelmente ligada a uma região reguladora separada, para formar um módulo de vanilina para a produção em organismos eucarióticos. Alternativamente, o módulo pode expressar uma mensagem policistrônica para a produção de vanilina e/ou glicosídeo de vanilina em hospedeiros procarióticos tais como espécies de Rodobacter, E. coli, Bacillus ou Lactobacillus. Além dos genes úteis para a produção de vanilina ou glicosídeo de vanilina, uma construção recombinante tipicamente também contém uma origem de replicação, e um ou mais marcadores selecionáveis para a manutenção da construção em espécies apropriadas.

[000120] Será avaliado que por causa da degenerescência do código genético, vários ácidos nucleicos podem codificar um polipeptídeo particular; isto é, para muitos aminoácidos, existem mais do que um tripleto de nucleotídeo que serve como o códon para o aminoácido. Assim, os códons na sequência codificadora para um dado polipeptídeo podem ser modificados tal que a expressão ideal em um hospedeiro particular é obtido, usando as tabelas tendências de códon apropriadas para este hospedeiro (por exemplo, microorganismo). Como ácidos nucleicos isolados, estas sequências modificadas podem existir como moléculas purificadas e podem ser incorporadas dentro de um vetor ou um vírus para o uso em módulos de construção para as construções de ácido nucleico recombinantes.

[000121] Os hospedeiros recombinantes aqui descritos expressam polipeptídeos AROM mutantes e/ou polipeptídeos da COMT mutantes. Assim, em um aspecto, a presente invenção diz respeito a um hospedeiro recombinante que abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo AROM mutante e/ou um polipeptídeo da COMT mutante, que pode ser qualquer um dos polipeptídeos mutantes aqui descritos. Em particular, A invenção diz respeito a um hospedeiro recombinante que abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica o dito polipeptídeo AROM mutante e/ou polipeptídeo da COMT mutante, em que o dito ácido nucleico é operavelmente ligado a uma região reguladora que permite a expressão no dito hospedeiro recombinante.

[000122] Tais hospedeiros podem incluir ainda genes adicionais ou módulos biossintéticos para produzir vanilina ou glicosídeo de vanilina, melhorar a eficiência com que a energia e as fontes de carbono são convertidas para vanilina e o seu glicosídeo, e/ou realçar a produtividade da cultura de célula ou planta. Tais módulos biossintéticos adicionais podem incluem um ou mais de um gene que codifica um polipeptídeo de 3DSD, um gene que codifica uma fosfopanteteinil transferase (PPTase), e um gene que codifica um polipeptídeo de UGT. Ver a Figura 1. Estes genes podem ser endógenos ou genes recombinantes. Além disso, quando a célula hospedeira abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo AROM mutante, a célula hospedeira pode incluir ainda um gene OMT do tipo selvagem. Do mesmo modo, quando a célula hospedeira abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo da COMT mutante, a célula hospedeiro pode incluir ainda um gene AROM do tipo selvagem. Alternativamente, a célula hospedeira pode abrigar ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo da COMT mutante e um polipeptídeo AROM mutante, como aqui descritos. Além disso, o hospedeiro pode expressar ainda uma enzima da vanilil álcool oxidase (VAO).

[000123] Os polipeptídeos 3DSD adequados são conhecidos. Um polipeptídeo de 3DSD de acordo com a presente invenção pode ser qualquer enzima com a atividade da 3-desidroxiquimato desidratase. Preferivelmente, o polipeptídeo de 3DSD é uma enzima capaz de catalisar a conversão da 3- desidro-xiquimato para protocatechuato e H2O. Um polipeptídeo de 3DSD de acordo com a presente invenção é preferivelmente uma enzima classificada sob EC 4.2.1.118. Por exemplo, um polipeptídeo adequado tendo atividade de 3DSD inclui o polipeptídeo de 3DSD fabricado pela Podospora pauciseta, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp., Aspergillus niger ou Neurospora crassa. Ver, Acessos do GENBANK N°s CAD60599, XP_001905369,1, XP_761560,1, ABG93191,1, AAC37159,1, e XM_001392464. Assim, o hospedeiro recombinante pode incluir um ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo de 3DSD de Podospora anserina, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp., Aspergillus niger ou Neurospora crassa ou um homólogo funcional de qualquer um dos anteriormente mencionados que compartilham pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, por exemplo pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, por exemplo pelo menos 98% de identidade de sequência com o mesmo.

[000124] Como aqui divulgado, os polipeptídeo de OMT do tipo selvagem adequados são conhecidos. Por exemplo, um polipeptídeo de OMT do tipo selvagem adequado inclui o OMT fabricado por H. sapiens, A. thaliana, ou Fragaria x ananassa (ver, Acesso do GENBANK N°s NM_000754, AY062837; e AF220491), assim como polipeptídeos de OMT isolados de uma variedade de outros mamíferos, plantas ou microorganismos.

[000125] Do mesmo modo, os polipeptídeos AROM do tipo selvagem adequados são conhecidos. Por exemplo, os polipeptídeos AROM do tipo selvagem adequados incluem AROM fabricada pela S. cerevisiae, S. pombe, S. japonicas, N. crassa, e Y lipolitica. Ver os Acessos do GENBANK N°s X06077, NP_594681,1, XP_002171624 e XP_956000.

[000126] Os polipeptídeos de ACAR adequados são conhecidos. Um polipeptídeo de ACAR de acordo com a presente invenção pode ser qualquer enzima tendo atividade da ácido carboxílico aromático redutase. Preferivelmente, o polipeptídeo de ACAR é uma enzima capaz de catalisar a conversão do ácido protocatecuico para aldeído protocatecuico e/ou a conversão do ácido vanílico para vanilina. Um polipeptídeo de ACAR de acordo com a presente invenção é preferivelmente uma enzima classificada sob EC 1.2.1.30. Por exemplo um polipeptídeo de ACAR adequado é fabricado pela Nocardia sp. Ver, por exemplo, o N° de Acesso do GENBANK AY495697. Assim, o hospedeiro recombinante pode incluir um ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo de ACAR de Nocardia sp. ou um homólogo funcional do mesmo que compartilha pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, por exemplo pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, por exemplo pelo menos 98% de identidade de sequência com o mesmo.

[000127] Os polipeptídeos de PPTase adequados são conhecidos. Um polipeptídeo de PPTase de acordo com a presente invenção pode ser qualquer enzima capaz de catalisar a fosfopanteteinilação. Preferivelmente, o polipeptídeo de PPTase é uma enzima capaz de catalisar a fosfopanteteinilação de ACAR. Por exemplo, um polipeptídeo de PPTase adequado é fabricado pela E. coli, Corynebacterium glutamicum, ou Nocardia farcinica. Ver o Acesso do GENBANK N°s NP_601186, BAA35224, e YP_120266. Assim, o hospedeiro recombinante pode incluir um ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo de PPTase da E. coli, C. glutamicum, ou N. farcinica ou um homólogo funcional de qualquer um dos anteriormente mencionados que compartilham pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, por exemplo pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, por exemplo pelo menos 98% de identidade de sequência com o mesmo.

[000128] A glicosilação da vanilina é particularmente útil. A vanilina-β- D-glicosídeo é a forma de armazenagem da vanilina encontrada na vagem da baunilha. Ela não é tóxica para a maioria dos organismos, que incluem levedura, e tem uma solubilidade mais alta em água, quando comparado com a vanilina. Além disso, a formação de vanilina-β-D-glicosideo mais provavelmente direciona a biossíntese para a produção de vanilina. UGT72E2 (Hansen, et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75: 2765-27740) exibiu alta especificidade de substrato para a vanilina. De acordo com esta observação, a sua expressão na cepa de S. cerevisiae que produz vanilina resultou em quase toda a vanilina sendo convertida em vanilina-β-D-glicosideo. A capacidade para transformar vanilina em vanilina-β-D-glicosideo in vivo é importante, porque a produção microbiana de vanilina não glicosilada além da escala de 0,5 a 1 g/litro seria impedida pela toxicidade da vanilina livre. A glicosilação serve para contornar o efeito inibidor.

[000129] Consequentemente, o hospedeiro recombinante desta invenção também expressa um polipeptídeo UGT. Um polipeptídeo UGT pode ser qualquer UDP-Glicose: Aglicon-Glicosiltransferase. Preferivelmente os polipeptídeos de UGT podem catalisar a glicosilação da vanilina (isto é, produzir a vanilina beta-D-glicosídeo). Assim, o polipeptídeo de UGT pode ser uma glicosiltransferase da Família 1. Os polipeptídeos de UGT preferidos de acordo com a invenção são classificados sob EC 2.4.1. os polipeptídeos de UGT adequados incluem o UGT71C2, UGT72B1, UGT72E2, UGT84A2, UGT89B1, UGT85B1, e os polipeptídeos da arbutin sintase. Ver, por exemplo, os Acessos do GENBANK N°s AC0005496, NM_116337, e NM_126067. O UGT72E2 da A. thaliana é particularmente útil (ver, por exemplo, Hansen, et al. (2009) supra). Assim, o hospedeiro recombinante pode incluir um ácido nucleico heterólogo que codifica o UGT71C2, UGT72B1, UGT72E2, UGT84A2, UGT89B1, UGT85B1, ou arbutin sintase ou um homólogo funcional de qualquer um dos anteriormente mencionados que compartilha pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, por exemplo pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, por exemplo pelo menos 98% de identidade de sequência com o mesmo. Outras UGTs úteis são descritas na WO 01/40491.

[000130] Como uma outra forma de realização desta invenção, uma enzima VAO (EC 1.1.3.38) também pode ser expressada pelas células hospedeiras para oxidar qualquer vanilil álcool formada em vanilina. As enzimas VAO são conhecidas na técnica e incluem, mas não são limitadas às enzimas de fungos filamentosos tais como Fusarium monilifomis (N° de Acesso do GENBANK AFJ11909) e Penicillium simplicissium (N° de Acesso do GENBANK P56216; Benen, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 7865-72) e bactérias tais como Modestobacter marinus (N° de Acesso do GENBANK YP_006366868), Rhodococcus jostii (N° de Acesso do GENBANK YP_703243,1) e R. opacus (N° de Acesso do GENBANK EHI39392).

[000131] Em alguns casos, é desejável inibir uma ou mais funções de um polipeptídeo endógeno de modo a desviar de intermediários metabólicos para a biossíntese da vanilina ou glicosídeo de vanilina. Por exemplo, as atividades de piruvato descarboxilase (PDC1) e/ou glutamato desidrogenase podem ser reduzidas. Em tais casos, um ácido nucleico que inibe a expressão do polipeptídeo ou produto de gene pode ser incluído em uma construção recombinante que é transformada dentro da cepa. Alternativamente, a mutagênese pode ser usada para gerar mutantes nos genes para os quais é desejado inibir função.

[000132] Vários procariotas e eucariotas são adequados para o uso na construção dos micro-organismos recombinantes aqui descritos, por exemplo, bactérias gram negativas, bactérias gram positivas, levedura ou outros fungos. Uma espécie e cepa selecionados para o uso como uma cepa de produção de vanilina ou glicosídeo de vanilina são primeiro analisadas para determinar quais genes de produção são endógenos para a cepa e quais genes não estão presentes. Os genes para os quais uma contraparte endógena não está presente na cepa são montadas em uma ou mais construções recombinantes, que são depois transformadas na cepa de modo a fornecer a(s) função(ões) perdida(s).

[000133] As espécies procarióticas e eucarióticas exemplares são descritas em mais detalhes abaixo. Entretanto, será avaliado que outras espécies podem ser adequadas. Por exemplo, as espécies adequadas podem estar em um gênero Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, Corynebacterium, Escherichia, Fusarium/Gibberella, Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaffia, Phanerochaete, Pichia, Physcomitrella, Rhodoturula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sphaceloma, Xanthophillomyces Yarrowia e Lactobacillus. As espécies exemplares de tais gêneros incluem Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphureus, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Physcomitrella patens, Rhodoturula glutinis 32, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma UBV-AX, Xanthophillomyces dendrorhous, Fusarium fujikuroi/ Gibberella fujikuroi, Candida utilis e Yarrowia lipolitica. Em algumas formas de realização, um micro-organismo pode ser um Ascomicete tal como Gibberella fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, ou Saccharomyces cerevisiae. Em algumas formas de realização, um micro-organismo pode ser um procariota tal como Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides, ou Rhodobacter capsulatus. Será avaliado que certos micro-organismos podem ser usados para triar e testar genes de interesse em uma maneira de alto rendimento, embora outros micro-organismos com produtividade desejada ou as características de cultivo possam ser usados para a produção em larga escala de vanilina beta-D-glicosídeo.

[000134] Os exemplos não limitantes específicos de hospedeiros recombinantes úteis são descritos na WO 01/40491, assim como em Hansen et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75: 2765-2774 e Brochado, et al. (2010) Microbial Cell Factories 9: 84, em que o hospedeiro recombinante de acordo com esta invenção contém um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo da COMT mutante e/ou polipeptídeo AROM mutante ao invés dos genes OMT descritos na WO 01/40491.

[000135] Um hospedeiro recombinante preferido para o uso com a presente invenção é S. cerevisiae, que pode ser recombinantemente engendrado como aqui descrito. A S. cerevisiae é um organismo base amplamente usado na biologia sintética, e pode ser usado como a plataforma do micro-organismo recombinante. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados do metabolismo e outras informações disponíveis para a S. cerevisiae, permitindo o projeto racional de vários módulos para realçar o rendimento do produto. Os métodos são conhecidos para fabricar micro-organismos recombinantes. A cepa VG4 da S. cerevisiae (Brochado, et al. (2010) Microb. Cell Fact. 9: 84) é particularmente útil. VG4 tem o genótipo de pdc1Δgdh1Δ\GDH2.

[000136] As espécies de Aspergillus tais como A. oryzae, a. niger e A. sojae são amplamente usadas como micro-organismos na produção de alimento, e também podem ser usados como a plataforma do microorganismo recombinante. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser Aspergillus spp. As sequências de nucleotídeo são disponíveis para os genomas de A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae, A. clavatus, A. flavus, A. niger, e A. terreus, permitindo o planejamento racional e modificação de caminhos endógenos para realçar o fluxo e aumentar o rendimento de produto. Os modelos metabólicos foram desenvolvidos para Aspergillus, assim como estudos transcriptômicos e estudos proteômicos. A. niger é cultivado para a produção industrial de vários ingredientes alimentícios tais como ácido cítrico e ácido glicônico, e assim espécies tais como A. niger são no geral adequados para a produção de ingredientes alimentícios tais como vanilina e glicosídeo de vanilina.

[000137] A E. coli, um outro organismo plataforma amplamente usado na biologia sintética, também pode ser usada como a plataforma do micro-organismo recombinante. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser E. coli. Similar às Saccharomyces, existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados de metabolismo e outra informação disponível para a E. coli, permitindo quanto ao planejamento racional de vários módulos para realçar o rendimento de produto. Os métodos similares a estes descritos acima para Saccharomyces podem ser usados para fabricar micro-organismos da E. coli recombinantes.

[000138] A Rhodobacter pode ser usada como a plataforma do microorganismo recombinante. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser Rhodobacter spp. Similar à E. coli, existem bibliotecas de mutantes disponíveis assim como vetores plasmídicos adequados, permitindo o planejamento racional de vários módulos para realçar o rendimento de produto. Os métodos similares a aqueles descritos acima para E. coli podem ser usados para fabricar micro-organismos de Rhodobacter recombinantes.

[000139] Os musgos Physcomitrella, quando cultivados em cultura de suspensão, têm características similares à levedura ou outras culturas fúngicas. Estes gêneros estão se tornando um tipo importante de célula para a produção de metabólitos de planta secundários, que podem ser difíceis para produzir em outros tipos de células. Assim, o hospedeiro recombinante pode ser um Physcomitrella spp.

[000140] Em algumas formas de realização, os ácidos nucleicos e polipeptídeos aqui descritos são introduzidos dentro de plantas ou células de planta para aumentar a produção global de vanilina ou glicosídeo de vanilina. Assim, um hospedeiro recombinante pode ser uma planta ou uma célula de planta que incluam pelo menos um ácido nucleico heterólogo aqui descrito. Uma planta ou célula de planta podem ser transformadas para ter um ácido nucleico heterólogo integrado no seu genoma, isto é, pode ser estavelmente transformada. As células estavelmente transformadas tipicamente retêm o ácido nucleico introduzido com cada divisão de célula. Uma planta ou célula de planta também podem ser transitoriamente transformados tal que o ácido nucleico heterólogo não seja integrado dentro do seu genoma. As células transitoriamente transformadas tipicamente perdem toda ou alguma ou porção do ácido nucleico introduzido com cada divisão de célula tal que o ácido nucleico introduzido não pode ser detectado nas células filhas depois de um número suficiente de divisões de célula. As plantas e células de planta transgênicas tanto transitoriamente transformadas quanto estavelmente transformadas podem ser úteis nos métodos aqui descritos.

[000141] As células de planta transgênicas usadas nos métodos aqui descritos podem constituir parte ou todo de uma planta inteira. Tais plantas podem ser cultivadas em uma maneira adequada para as espécies sob consideração, em uma câmara de cultivo, uma estufa, ou em um campo. As plantas transgênicas podem ser cruzadas como desejado para um propósito particular, por exemplo, para introduzir um ácido nucleico heterólogo, por exemplo uma construção de ácido nucleico recombinante em outras linhagens, para transferir um ácido nucleico heterólogo para outras espécies, ou para outra seleção de outros traços desejáveis. Alternativamente, as plantas transgênicas podem ser propagadas vegetativamente para estas espécies sensíveis a tais técnicas. Como aqui usada, uma planta transgênica também se refere à progênie de uma planta transgênica inicial contanto que a progênie herde o transgene. As sementes produzidas por uma planta transgênica podem ser cultivadas e depois autopolinizadas (ou polinização cruzada e autopolinização) para obter sementes homozigotas para a construção de ácido nucleico.

[000142] As plantas transgênicas podem ser cultivadas em cultura em suspensão, ou cultura de tecido ou órgão. Para os propósitos desta invenção, as técnicas de cultura de tecido sólida e/ou líquida podem ser usadas. Quando do uso de meio sólido, as células de plantas transgênicas podem ser colocadas diretamente sobre o meio ou podem ser colocadas sobre um filtro que é depois colocado em contato com o meio. Quando do uso de meio líquido, as células de plantas transgênicas podem ser colocadas sobre um dispositivo de flotação, por exemplo, uma membrana porosa que contata o meio líquido.

[000143] Quando células de planta transitoriamente transformadas são usadas, uma sequência repórter que codifica um polipeptídeo repórter tendo uma atividade repórter pode ser incluída no procedimento de transformação e um ensaio para a atividade ou expressão do repórter pode ser realizado em um tempo adequado depois da transformação. Um tempo adequado para conduzir o ensaio tipicamente é cerca de 1 a 21 dias depois da transformação, por exemplo, de cerca de 1 a 14 dias, de cerca de 1 a 7 dias, ou de cerca de 1 a 3 dias. O uso de ensaios transitórios é particularmente conveniente para a análise rápida em espécies diferentes, ou para confirmar a expressão de um polipeptídeo heterólogo cuja expressão não foi anteriormente confirmada em células receptoras particulares.

[000144] As técnicas para introduzir ácidos nucleicos dentro de plantas monocotiledônea e dicotiledônea são conhecidos na técnica, e incluem, sem limitação, a transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vetor viral, eletroporação e transformação com pistola de partícula; ver as Patentes U.S. N°s 5.538.880, 5.204.253, 6.329.571, e 6.013.863. Se uma célula ou tecido cultivados são usados como o tecido receptor para a transformação, as plantas podem ser regeneradas a partir de culturas transformadas se desejado, pelas técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

[000145] Uma população de plantas transgênicas pode ser triada e/ou selecionada quanto a aqueles membros da população que têm um traço ou fenótipo conferido pela expressão do transgene. Por exemplo, uma população de progênie de um único evento de transformação pode ser triada quanto àquelas plantas que têm um nível desejado de expressão de um polipeptídeo ou ácido nucleico aqui descritos. Métodos físicos e bioquímicos podem ser usados para identificar os níveis de expressão. Estes incluem a análise de Southern ou amplificação pela PCR para a detecção de um polinucleotídeo; northern blots, proteção pela S1 RNase, iniciador-extensão, ou amplificação pela RT-PCR para detectar transcritos de RNA; ensaios enzimáticos para detectar a atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de proteína, western blots, imunoprecipitação, e imunoensaios ligados à enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas tais como hibridização in situ, tingimento de enzima, e imunotingimento também podem ser usados para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos. Os métodos para realizar todas as técnicas aludidas são conhecidos.

[000146] Como uma alternativa, uma população de plantas com eventos de transformação independentes pode ser triada quanto àquelas plantas que têm um traço desejado, tal como produção de glicosídeo de vanilina. A seleção e/ou triagem podem ser realizadas em uma ou mais gerações, e/ou em mais do que um local geográfico. Em alguns casos, as plantas transgênicas podem ser cultivadas e selecionadas sob condições que induzem um fenótipo desejado ou são de outro modo necessários para produzir um fenótipo desejado em uma planta transgênica. Além disso, a seleção e/ou triagem podem ser aplicadas durante um estágio de desenvolvimento particular em que o fenótipo é esperado ser exibido pela planta. A seleção e/ou triagem podem ser realizados para escolher aquelas plantas transgênicas que têm uma diferença estatisticamente significante no nível de vanilina ou vanilina beta- D-glicosídeo em relação a uma planta de controle que carece do transgene.

Homólogos Funcionais

[000147] Os homólogos funcionais dos polipeptídeos descritos acima também são adequados para o uso na produção de vanilina ou glicosídeo de vanilina em um hospedeiro recombinante. Assim, o hospedeiro recombinante pode incluir um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam homólogos funcionais dos polipeptídeos descritos acima e/ou um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de COMT ou AROM mutante como aqui descritos. Um homólogo funcional é um polipeptídeo que tem similaridade de sequência a um polipeptídeo de referência, e que carrega uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeos que ocorrem naturalmente, e a similaridade de sequência pode ser devido aos eventos evolucionários convergentes ou divergentes. Como tal, os homólogos funcionais são algumas vezes designados na literatura como homólogos, ou ortólogos, ou parálogos. As variantes de um homólogo funcional que ocorre naturalmente, tais como polipeptídeos codificados pelos mutantes de uma sequência codificadora do tipo selvagem, podem ser elas próprias homólogos funcionais. Os homólogos funcionais também podem ser criados por intermédio da mutagênese direcionada por local da sequência codificadora para um polipeptídeo, ou pela combinação de domínios das sequências codificadoras para polipeptídeos que ocorrem naturalmente diferentes (“troca de domínio”). As técnicas para a modificação de genes que codificam os polipeptídeos de AROM e/ou COMT funcionais aqui descritos são conhecidos e incluem, inter alia, técnicas de evolução direcionada, técnicas de mutagênese direcionada por local e técnicas de mutagênese aleatória, e podem ser úteis para aumentar a atividade específica de um polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato, alterar os níveis de expressão, alterar a localização subcelular, ou modificar as interações de polipeptídeo:polipeptídeo em uma maneira desejada. Tais polipeptídeos modificados são considerados homólogos funcionais. O termo “homólogo funcional” é algumas vezes aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente homólogo.

[000148] Os homólogos funcionais podem ser identificados pela análise de alinhamentos de sequência de nucleotídeo e polipeptídeo. Por exemplo, realizando uma pesquisa em uma base de dados de sequências nucleotídeo ou polipeptídeo podem identificar homólogos dos polipeptídeos de AROM ou COMT, os polipeptídeos 3DSD, ACAR, PPTase, ou UGT. A análise de sequência pode envolver as análises de BLAST, BLAST recíproco, ou PSI- BLAST de bases de dados não redundantes usando uma sequência de aminoácido de AROM ou COMT, 3DSD, ACAR, uma PPTase, ou UGT como a sequência de referência. As sequências de aminoácido são, em alguns casos, deduzidas da sequência de nucleotídeo. Aqueles polipeptídeos na base de dados que tenham mais do que 40% de identidade de sequência são candidatos para avaliação adicional quanto à adequabilidade como polipeptídeo da biossíntese de vanilina ou glicosídeo de vanilina. A similaridade de sequência de aminoácido permite substituições conservativas de aminoácido, tais como substituição de um resíduo hidrofóbico por um outro ou substituição de um resíduo polar por um outro. Se desejado, a inspeção manual de tais candidatos pode ser realizada de modo a reduzir o número de candidatos a serem avaliados ainda mais. A inspeção manual pode ser realizada pela seleção daqueles candidatos que parecem ter domínios presentes nos polipeptídeos de AROM ou COMT ou polipeptídeos da biossíntese da vanilina, por exemplo, domínios funcionais conservados.

[000149] As regiões conservadas podem ser identificadas pela localização de uma região dentro da sequência de aminoácido primária de um polipeptídeo que é uma sequência repetida, forma alguma estrutura secundária (por exemplo, hélices e folhas beta), estabelece domínios positiva ou negativamente carregados, ou representa um motivo ou domínio de proteína. Ver, por exemplo, a base de dados Pfam que descreve sequências de consenso para uma variedade de motivos e domínios de proteína. A informação incluída na base de dados Pfam é descrita em Sonnhammer, et al. (1998) Nucl. Acids Res. 26: 320-322; Sonnhammer et al. (1997) Proteins 28: 405-420; e Bateman et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27: 260-262. As regiões conservadas também podem ser determinadas pelo alinhamento de sequências do mesmo polipeptídeo ou de polipeptídeos relacionados a partir de espécies intimamente relacionadas. As espécies intimamente relacionadas preferivelmente são da mesma família. Em algumas formas de realização, o alinhamento das sequências de duas espécies diferentes é adequada.

[000150] Tipicamente, os polipeptídeos que exibem pelo menos cerca de 40% de identidade de sequência de aminoácido são úteis para identificar regiões conservadas. As regiões conservadas de polipeptídeos relacionados exibem pelo menos 45% de identidade de sequência de aminoácido (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácido). Em algumas formas de realização, uma região conservada exibe pelo menos 92%, 94%, 96%, 98%, ou 99% de identidade de sequência de aminoácido. A identidade de sequência pode ser determinada como apresentada acima.

[000151] A invenção será descrita ainda nos exemplos que seguem, que do não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

Exemplo 1: Cepa de Repórter de Levedura para Produzir Glicosídeo de Vanilina a partir de Glicose

[000152] Uma cepa de levedura geneticamente estável que produz glicosídeo de vanilina a partir de glicose foi criada como descrito em Brochado, et al. (2010) Microb. Cell Fact. 9: 84, isto é, a cepa VG4 com uma deleção de gene da PDC1 (Piruvato descarboxilase) e GDH1 (Glutamato desidrogenase), e que super expressa GDH2. Além disso, a cepa abrigou uma construção de expressão que contém uma PPTase integrada na região interlocal ECM3 do genoma da levedura. A expressão da sequência codificadora de PPTase da Corynebacterium glutamicum foi controlada pelo promotor TPI1 de levedura (Hansen, et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75(9): 2765-74. Epub 13 de março de 2009). A cepa resultante foi designada V12.

Exemplo 2: Construção de um AROM Que Carece do Domínio 5

[000153] Os 3912 pares de base mais próximos de 5’ do gene ARO1 de levedura, que inclui todos os domínios funcionais exceto o domínio 5 (tendo a atividade da xiquimato desidrogenase), foi isolado pela amplificação pela PCR do DNA genômico preparado a partir da cepa S288C da S. cerevisiae, usando a PCR polimerase à prova de leitura. O fragmento de DNA resultante foi subclonado dentro do vetor pTOPO e sequenciado para confirmar a sequência de DNA. A sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácido correspondente são apresentadas na SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 2, respectivamente. Este fragmento foi individualizado a uma digestão de restrição com SpeI e SalI e clonado dentro dos sítios de restrição correspondentes no vetor de expressão de levedura de número de cópia alto p426-GPD (um vetor com base em 2μ), a partir do qual o gene inserido pode ser expressado pelo promotor GPD1 de levedura constitutivo, forte. O plasmídeo resultante foi designado pVAN133.

Exemplo 3: Levedura AROM com Substituições de Aminoácido Únicas no Domínio 5

[000154] Todos os polipeptídeos AROM mutantes descritos neste exemplo são polipeptídeos da SEQ ID N°: 4, em que um aminoácido foi substituído no lugar de um outro aminoácido. Os polipeptídeos AROM mutantes são denominados como segue: XnnnY, onde nnn indica a posição na SEQ ID N°: 4 do aminoácido, que é substituído, X é o código de letra única para o aminoácido na posição nnn na SEQ ID N°: 4 e Y é o código de letra única para o aminoácido que substitui X. Por via de exemplo A1533P refere- se a um polipeptídeo AROM mutante da SEQ ID N°: 4, onde a alanina na posição 1533 é substituída com uma prolina.

[000155] O gene de ARO1 de levedura de 4764 pares de base completo foi isolado pela amplificação pela PCR a partir do DNA genômico preparado a partir da cepa S288C de S. cerevisiae, usando a PCR polimerase de proofreading (correção de erros de incorporação de nucleotídeos). O fragmento de DNA resultantes foi subclonado dentro do vetor pTOPO e sequenciado para confirmar a sequência de DNA. A sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácido correspondentes são apresentadas na SEQ ID N°: 3 e SEQ ID N°: 4, respectivamente. Este fragmento foi individualizado a uma digestão de restrição com SpeI e SalI e clonado dentro dos sítios de restrição correspondentes N° vetor de expressão de levedura de número de cópia baixo p416-TEF (um vetor com base em CEN-ARS), A partir do qual o gene pode ser expressado a partir do promotor de TEF forte. O plasmídeo resultante foi designado pVAN183.

[000156] O plasmídeo pVAN183 foi usado para fabricar 10 mutantes do domínio 5 diferentes de ARO1, usando o Kit de Mutagênese Direcionada por local QUICKCHANGE II (Agilent Technologies). Com referência à SEQ ID N°: 4, os mutantes contiveram as substituições de aminoácido que seguem: A1533P, P1500K, R1458W, V1349G, T1366G, I1387H, W1571V, T1392K, K1370L e A1441P.

[000157] Depois da confirmação da sequência destes genes de AROM mutantes, os plasmídeos de expressão que contêm as substituições A1533P, P1500K, R1458W, V1349G, T1366G, I1387H, W1571V, T1392K, K1370L e A1441P foram designados pVAN368 a pVAN377, respectivamente. As sequências de ácido nucleico e as sequências de aminoácido correspondentes dos mutantes de AROM são listados na Tabela 1. TABELA 1

Exemplo 4: Proteína de Fusão da AROM e 3DHS Desidratase de Levedura

[000158] Os 3951 pares de base mais próximos de 5’ do gene ARO1 de levedura, que inclui todos os domínios funcionais exceto o domínio 5 com a atividade da xiquimato desidrogenase, foram isolados pela amplificação pela PCR a partir de DNA genômico preparado a partir da cepa S288C de S. cerevisiae, usando a PCR polimerase de proofreading (correção de erros de incorporação de nucleotídeos). O fragmento de DNA resultante foi subclonado dentro do vetor pTOPO e sequenciado para confirmar a sequência de DNA. De modo a fundir este fragmento ao gene da 3-desidroxiquimato desidratase (3DSD) a partir do caminho da vanilina, o gene da 3DSD de Podospora pauciseta (Hansen, et al. (2009) supra) foi inserido dentro dos sítios XmaI-EcoRI do vetor de expressão de levedura p426-GPD, e depois o fragmento de ARO1 clonado foi liberado e inserido dentro dos sítios SpeI- XmaI da construção resultante. O gene de fusão final é expressado a partir do promotor GPD1 de levedura forte, constitutivo. O plasmídeo resultante foi nomeado pVAN132. A sequência de ácido nucleico e a sequência de aminoácido correspondente desta proteína de fusão são apresentados na SEQ ID N°: 25 e SEQ ID N°: 26, respectivamente.

Exemplo 5: Expressão de Enzimas AROM Mutantes ou de Fusão em Levedura que Já Biossintetiza Glicosídeo de Vanilina

[000159] Cada um dos plasmídeos descritos nos Exemplos 2, 3 e 4 foram introduzidos dentro da cepa de levedura V12 pela transformação, usando o protocolo de transformação de acetato de lítio, resultando nas cepas de levedura que seguem: V12-Aro1-1 (que contêm o plasmídeo pVAN133), V12-Aro1-2 (que contêm plasmídeo pVAN132), V12-1-3 (que contêm plasmídeo pVAN183), V12-Aro1-4 (que contêm plasmídeo pVAN368), V12- Aro1-5 (que contêm plasmídeo pVAN369), V12-Aro1-6 (que contêm plasmídeo pVAN370), V12-Aro1-7 (que contêm plasmídeo pVAN371), V12- Aro1-8 (que contêm plasmídeo pVAN372), V12-Aro1-9 (que contêm plasmídeo pVAN373), V12-Aro1-10 (que contêm plasmídeo pVAN374), V12-Aro1-11 (que contêm plasmídeo pVAN375), V12-Aro1-12 (que contêm plasmídeo pVAN376) e V12-Aro1-13 (que contêm plasmídeo pVAN377).

[000160] As cepas de levedura V12-Aro1-1, V12-Aro1-2, V12-1-3, V12-Aro1-4, V12-Aro1-5, V12-Aro1-6, V12-Aro1-7, V12-Aro1-8, V12- Aro1-9, V12-Aro1-10, V12-Aro1-11, V12-Aro1-12, e V12-Aro1-13 foram cultivadas como culturas de 200 ml em frascos Erlenmeyer de 500 ml agitados usando o meio de cultivo SC (completo sintético) sem aminoácidos aromáticos, a 30 °C com revolução moderada (150 rpm) por 72 horas. As amostras foram coletadas em 48 horas, e o teor de glicosídeo de vanilina foi determinado. A cepa V12 de levedura que contém os vetores vazios p416- TEF ou p426-GPD foram incluídos como controles. A produção de glicosídeo de vanilina (VG) nas cepas de controle (que contêm os plasmídeos vazios p416- e p426-GPD) foi tipicamente em torno de 250 mg/L. Expressar AROM truncada no domínio 5 é esperado aumentar a produção de VG (cepa V12- Aro1-1) e outra fusão física desta AROM truncada para a primeira enzima comprometida no caminho da vanilina heterólogo (Podospora pauciseta 3DSD) é esperado resultar em um outro aumento na produção de glicosídeo de vanilina (cepa V12-Aro1-2).

[000161] Das versões mutantes de AROM, em que aminoácidos únicos do domínio 5 foram trocados, o T1392K (cepa V12-Aro1-9) e K1370L (cepa V12-Aro1-10) podem ser de uso para aumentar a produção de VG. Por exemplo, um aumento de aproximadamente 30 a 35% na produção de VG pode ser observado para T1392K (cepa V12-Aro1-9) e K1370L (cepa V12- Aro1-10).

[000162] Este exemplo demonstra que pela super expressão de um polipeptídeo AROM mutante com atividade da xiquimato desidrogenase diminuída, a concentração celular de 3-DHS pode ser aumentada suficientemente para desempenhar um papel no título final produzido no caminho heterólogo. Este exemplo também demonstra que fundir a primeira enzima do caminho heterólogo, isto é, 3DHD, a uma enzima de AROM truncada resulta em um aumento do fluxo para dentro do caminho heterólogo, obtendo o direcionamento do substrato. Finalmente, os experimentos aqui descritos indicaram que pela troca de aminoácidos separados no domínio de AROM que naturalmente metabolizam 3DHS, o composto necessário para a produção de vanilina, a quantidade do 3DHS disponível para a biossíntese de vanilina pode ser aumentada.

Exemplo 6: Mutantes de COMT

[000163] Todos os polipeptídeos da COMT mutantes descritos neste exemplo são polipeptídeos da SEQ ID N°: 27, em que um aminoácido foi substituído no lugar de um outro aminoácido. Os polipeptídeos da COMT mutantes são denominados como segue: XnnnY, onde nnn indica a posição na SEQ ID N°: 27 do aminoácido, que é substituído, X é o código de letra única para o aminoácido na posição nnn na SEQ ID N°: 27 e Y é o código de letra única para o aminoácido que substitui X. Por via de exemplo L198Y refere-se a um polipeptídeo da COMT mutante da SEQ ID N°: 27, onde a leucina na posição 198 é substituída com um triptofano.

[000164] Os ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos da COMT mutantes foram construídos pela PCR usando iniciadores que contêm os códons desejados. As PCRs foram feitas como uma PCR única ou usando a PCR de extensão de sobreposição de sequência (SOE) pelos procedimentos padrão. Esta etapa, por exemplo, pode ser feita por fornecedores comerciais, tais como a Life Technologies. Os iniciadores usados são listados na Tabela 2. TABELA 2

[000165] Nas sequências de iniciador fornecidas acima: M pode ser A ou C; R pode ser A ou G; W pode ser A ou T; S pode ser G ou C; Y pode ser C ou T; K pode ser G ou T; V pode ser A, G ou C; H pode ser A, C ou T; D pode ser A, G ou T; B pode ser G, C ou T; e N pode ser A, G, C ou T.

[000166] Os sítios de restrição para EcoRI/XbaI foram incluídos nos iniciadores para facilitar a clonagem dos produtos de PCR dentro do vetor de expressão de levedura centromérico p416-TEF (Mumberg, et al. (1995) Gene 156(1): 119-22). Os plasmídeos resultantes foram transformados em uma cepa de levedura EFSC2055 (Genotype: Mata his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0 adh6::LEU2 bgl1::KanMX4 PTPI1::3DSD[AurC]::(HsOMT::MET15[NatMX])::ACAR[HphMX]::UGT7 2E2[HIS3]ECM3::(CorPPTase-ScHAP4). Esta cepa de levedura está fundamentada na cepa VG4 (Brochado, et al. (2010) Microbial. Cell Factories 9: 84), e inclui ainda um rompimento de HsOMT com o marcador MET15, e tem dois genes adicionais integrados, a saber Corynebacterium glutamicum PPtase (acesso da base de dados NCBI N°. NP_601186) e S. cerevisiae HAP4 (acesso da base de dados NCBI N°. Z28109).

[000167] HsOMT foi rompido pela PCR amplificando MET15 de S. cerevisiae (marcador de seleção auxotrófico em metionina) usando caudas de iniciadores com 70 pares de base homólogos à extremidade da frente e traseira de HsOMT, respectivamente. A cepa de levedura foi depois transformada com o produto de PCR, resultando em transformantes não tendo nenhuma atividade de HsOMT e capaz de crescer nas placas não suplementadas com metionina. A cepa resultante foi designada EFSC2055.

[000168] Os plasmídeos que expressam CorPPTase e ScHAP4 foram transformados na cepa predecessora EFSC2055 usando o protocolo padrão de acetato de lítio/PEG de transformação de levedura e os transformantes foram selecionados nas placas de SC-uracila. Os transformantes foram testados pelo cultivo em culturas de 3 ml por 72 horas em meio de Delft suplementado com 8 % de melaços de beterraba açucareira.

[000169] As culturas foram analisadas usando HPLC-UV para quantificar glicosídeo de vanilina/Isoglicosídeo de vanilina e produtos relacionados. A análise de HPLC foi realizada com um sistema série 1100 da AGILENT com bomba binária e uma coluna Fenomenex Synergi Polar-RP 2,5 u 100Â 100 x 2,00 mm, que separa os precursores e a Isovanilina e vanilina. Um gradiente plano foi conduzido com água/acetonitrila + 0,1% de ácido trifluoroacético. Um programa de 8,9 minutos + 1,1 minuto após a condução foi realizado como apresentado na Tabela 3. TABELA 3

[000170] Glicosídeo de vanilina e isoglicosídeo de vanilina foram quantificados pela integração da área dos picos da HPLC e comparando os mesmos com uma curva padrão. Os resultados desta análise são mostrados na Figura 3A. As células de levedura que expressam a Hs-OMT do tipo selvagem da SEQ ID N°: 27 (aludida como Hs-COMT wt) produziu isovanilina e vanilina em uma razão de aproximadamente 1:3, ao passo que o mutante L198Y produziu isovanilina e vanilina em uma razão de aproximadamente 1:125. A razão exata foi difícil de determinar visto que a produção de isovanilina estava N° limite de detecção.

[000171] Além das mutações analisadas na Figura 3A, boa especificidade e baixa produção de isovanilina nos mutantes L198C, L198N, L198D, L198F, e L198E.

Exemplo 7: Redução de Vanilil álcool

[000172] Por via de ilustração, os genes VAO de P. simplicissium (N° de Acesso do GENBANK P56216) e R. jostii (N° de Acesso do GENBANK YP_703243.1) foram isolados e clonados em um vetor de expressão de levedura. Os vetores de expressão foram subsequentemente transformados em uma cepa de levedura que expressa a glicosiltransferase. As cepas transformadas foram testadas quanto a atividade de VAO pelo cultivo da levedura por 48 horas em meio suplementado com 3 mM de vanilil álcool. Os resultados desta análise são apresentados na Figura 4. As enzimas VAO tanto de P. simplicissium quanto de R. jostii exibiram atividade na levedura. Quando as enzimas VAO foram analisadas em uma cepa capaz de produzir glicosídeo de vanilina, houve uma redução N° acúmulo de vanilil álcool durante a fermentação do glicosídeo de vanilina.

Exemplo 8: Gene ACAR de NEUROSPORA CRASSA

[000173] Como uma alternativa a uma proteína ACAR (EC 1.2.1.30) de Nocardia iowensis (Hansen, et al. ((2009) Appl. Environ. Microbiol. 75: 2765-74), o uso de uma enzima ACAR de Neurospora crassa (Gross & Zenk (1969) Eur. J. Biochem. 8: 413-9; US 6.372.461) em levedura foi investigado, visto que Neurospora (mofo do pão) é um organismo GRAS. Um gene de N. crassa (GENBANK XP_955820) com homologia para a ACAR de Nocardia iowensis foi isolado e clonado em um vetor de expressão de levedura. O vetor foi transformado em uma cepa de levedura que expressa uma PPtase, as cepas foram selecionadas quanto à presença do gene ACAR, e a levedura selecionada foi cultivada por 72 horas em meio suplementado com ácido vanílico 3 mM para demonstrar a atividade de ACAR. Os resultados desta análise são apresentados na Figura 5. A enzima ACAR de N. crassa foi descoberta exibir uma atividade mais alta na levedura do que a ACAR de N. iowensis. Portanto, em algumas formas de realização do método aqui divulgado, uma enzima ACAR de N. crassa é usada na produção de vanilina ou glicosídeo de vanilina.

[000174] Além das proteínas ACAR de N. iownsis ou N. crassa, é considerado que outras proteínas de ACAR podem ser usadas, que incluem mas não limitadas àquelas isoladas de Nocardia brasiliensis (N° de Acesso do GENBANK EHY26728), Nocardia farcinica (N° de Acesso do GENBANK BAD56861), Podospora anserina (N° de Acesso do GENBANK CAP62295), ou Sordaria macropora (N° de Acesso do GENBANK CCC14931), que têm identidade de sequência significante com a proteína ACAR de N. iownsis ou N. crassa.

Claims

1. Método para produzir vanilina e/ou vanilina beta-D- glicosídeo, caracterizado pelo fato de que compreende (A) fornecer um hospedeiro recombinante capaz de produzir vanilina, em que o dito hospedeiro recombinante é uma levedura que expressa um polipeptídeo Catecol-O-Metil Transferase (COMT) mutante; em que o polipeptídeo COMT mutante compreende (i) Asn, Asp, Cys, Glu, Phe ou Tyr na posição 198; ou (ii) Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val na posição 199 da SEQ ID NO: 27; (B) cultivar o dito hospedeiro recombinante por um tempo suficiente para o dito hospedeiro recombinante produzir vanilina e/ou glicosídeo de vanilina; e (C) isolar a vanilina e/ou o glicosídeo de vanilina do dito hospedeiro recombinante ou do sobrenadante de cultivo, produzindo deste modo vanilina e/ou vanilina beta-D-glicosídeo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da COMT mutante compreende ainda um rótulo de purificação, um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptídeo de sinal, ou um rótulo de secreção nos terminais N ou C do dito polipeptídeo.

3. Polipeptídeo de Catecol-O-Metil Transferase (COMT) mutante, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo COMT mutante compreende (i) Asn, Asp, Cys, Glu, Phe ou Tyr na posição 198; ou (ii) Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val na posição 199 da SEQ ID NO: 27.

4. Polipeptídeo mutante isolado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da COMT mutante compreendem ainda um rótulo de purificação, um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptídeo de sinal, ou um rótulo de secreção no terminal N ou C do dito polipeptídeo.

5. Microorganismo hospedeiro recombinante, caracterizado pelo fato de que dito microorganismo hospedeiro recombinante compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo da COMT mutante, como definido na reivindicação 3 ou 4, em que o microorganismo hospedeiro é uma levedura que expressa um polipeptídeo Catecol-O-Metil Transferase (COMT) mutante; em que o polipeptídeo COMT mutante compreende (i) Asn, Asp, Cys, Glu, Phe ou Tyr na posição 198; ou (ii) Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val na posição 199 da SEQ ID NO: 27.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro recombinante compreende ainda um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da 3-desidroxiquimato desidratase (3DSD), um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da ácido carboxílico aromático redutase (ACAR), um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da fosfopanteteína transferase (PPTase), um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da uridina 5’-difosfoglicosil transferase (UGT) e/ou um ácido nucleico que codifica uma vanilil álcool oxidase (VAO), em que o microorganismo hospedeiro é uma levedura que expressa um polipeptídeo Catecol-O-Metil Transferase (COMT) mutante; em que o polipeptídeo COMT mutante compreende (i) Asn, Asp, Cys, Glu, Phe ou Tyr na posição 198; ou (ii) Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val na posição 199 da SEQ ID NO: 27.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito microorganismo hospedeiro recombinante abriga um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo da COMT mutante como definido na reivindicação 3 ou 4, e compreende ainda um gene que codifica um polipeptídeo AROM do tipo selvagem, em que o microorganismo hospedeiro é uma levedura que expressa um polipeptídeo Catecol-O-Metil Transferase (COMT) mutante; em que o polipeptídeo COMT mutante compreende (i) Asn, Asp, Cys, Glu, Phe ou Tyr na posição 198; ou (ii) Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val na posição 199 da SEQ ID NO: 27.