ES2950245T3 - Composiciones y métodos para la biosíntesis de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina - Google Patents

Composiciones y métodos para la biosíntesis de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina Download PDF

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Abstract

Se describen microorganismos, plantas y células vegetales recombinantes que han sido diseñados para tener niveles o actividad reducidos de una o más alcohol deshidrogenasas o aldehído reductasa, aumentando así la producción de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para la biosíntesis de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina
Antecedentes
La vainillina es uno de los compuestos aromatizantes más importantes del mundo con un mercado global de 180 millones de dólares. La vainillina natural se deriva del tegumento seminal curado de la orquídea vainilla (Vanilla planifolia), pero la mayoría de la vainillina del mundo se sintetiza a partir de productos petroquímicos o ligninas de la pulpa de la madera. La producción de vainillina natural a partir de la vaina de vainilla es un proceso laborioso y lento, que requiere la polinización manual de las flores y un proceso de curado de 1 -6 meses de las vainas de vainilla verdes cosechadas (Ramachandra y Ravishankar (2000) J. Sci. Food Agric. 80:289-304). La producción de 1 kilogramo (kg) de vainillina requiere aproximadamente 500 kg de vainas de vainilla, lo que corresponde a la polinización de aproximadamente 40.000 flores. Hoy en día solo aproximadamente el 0,25% (40 toneladas de 16.000) de la vainillina vendida anualmente procede de vainas de vainilla, mientras que la mayor parte del resto se sintetiza químicamente a partir de lignina o hidrocarburos fósiles, en particular guayacol. La vainillina producida sintéticamente se vende a aproximadamente 15$ por kg, en comparación con los precios de 1200-4000$ por kg para la vainillina natural (Walton, et al. (2003) Phytochemistry 63:505-515). Hansen et al., “De novo biosynthesis of vanillin in fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) and baker’s yeast (Saccharomyces cerevisiae)”, APPL ENVIRON MICROBIOL., 75, páginas 2765 - 2774 (2009) notifican una ruta de biosíntesis de novo para la producción de vainillina a partir de glucosa en levadura de fisión y levadura de panadería.
Sumario de la invención
Esta invención proporciona una célula huésped recombinante que tiene las siguientes características:
(a) el huésped recombinante produce vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina;
(b) el huésped recombinante tiene, en comparación con un organismo de tipo silvestre, una producción o actividad reducida de:
(i) alcohol deshidrogenasa 6 (ADH6), aldehído reductasa intermedia 1 (ARI1) y aldehído reductasa YGL039W;
(ii) ADH6, alcohol deshidrogenasa 7 (ADH7) y genes de respuesta al estrés 2 (GRE2);
(iii) ADH6, ADH7, GRE2 e YGL039W;
(iv) ADH6, ADH7, GRE2, ARI1 e YGL039W; o
(v) ADH6, GRE2, ARI1 e YGL039W;
siendo la producción o actividad reducida un resultado de la deleción de los genes que codifican las deshidrogenasas y reductasas anteriores; y
(c) el huésped recombinante es una célula de levadura recombinante y comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de O-metiltransferasa (OMT), un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 3-deshidroshikimato deshidratasa (3DSD) y un ácido nucleico que codifica un polipéptido de uridina-5’-difosfoglucosil transferasa (UGT).
También se proporciona un método para producir vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina según las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un esquema de la biosíntesis de novo de vainillina (4) y un resumen de los diferentes catabolitos y productos secundarios metabólicos de vainillina, es decir, ácido deshidroshikímico (1), ácido protocatéquico (2), aldehído protocatéquico (3), ácido vanílico (5), alcohol protocatéquico (6), alcohol vainillílico (7) y p-D-glucósido de vainillina (8), encontrados en un organismo que expresa 3DSD, ACAR, OMT y UGT, y una fosfopanteteína transferasa (PPTasa). Las flechas huecas muestran reacciones metabólicas primarias en la levadura; las flechas negras muestras reacciones enzimáticas introducidas mediante ingeniería metabólica; las flechas con rayas diagonales muestran reacciones metabólicas de levadura inherentes no deseadas.
La Figura 2 muestra la producción de glucósido de alcohol vainillílico, alcohol vainillílico, p-D-glucósido de vainillina y vainillina en una cepa que carece de una o más alcohol deshidrogenasas funcionales.
La Figura 3 muestra la producción de glucósido de alcohol vainillílico, alcohol vainillílico, p-D-glucósido de vainillina y vainillina en una cepa que carece de gre2 (EFSC2055 gre2) o gre2 y aril (EFSC2055 gre2 aril) en comparación con la cepa parental EFSC2055. *, p<0,01.
Descripción detallada de la invención
Esta invención se basa en el descubrimiento de que la desactivación de ciertas alcohol deshidrogenasas y/o aldehído reductasas, o enzimas similares, disminuye la cantidad de alcohol vainillílico que se forma como subproducto. Véanse las Figuras 1 y 2. Esto es de importancia comercial porque la presencia de alcohol crea ineficiencias en ciertas etapas de la purificación posterior de vainillina o glucósido de vainillina si se permite que se acumule el alcohol.
Por tanto, la presente invención es un huésped recombinante según las reivindicaciones adjuntas que es capaz de producir vainillina o glucósido de vainillina, pero no produce, o tiene una producción reducida de, una o más alcohol deshidrogenasas y/o una o más aldehído reductasas. Un huésped recombinante que produce o es capaz de producir vainillina o glucósido de vainillina es una célula huésped que expresa las enzimas de biosíntesis necesarias para producir vainillina o glucósido de vainillina a partir de un sustrato primario, por ejemplo, glucosa, o a partir de una molécula intermedia, por ejemplo, ácido deshidroshikímico, ácido protocatéquico, aldehído protocatéquico o ácido vanílico. Véase la Figura 1.
Un huésped recombinante que no produce una enzima, tiene una producción reducida de una enzima o carece de una enzima funcional, incluye un organismo que se ha modificado de manera recombinante de modo que el gen que codifica la enzima esté desactivado, un organismo con una o más mutaciones puntuales en la enzima que reducen o disminuyen la actividad de la enzima, o un organismo en el que el promotor del gen que codifica la enzima se ha modificado o eliminado de modo que la enzima no se exprese o se exprese a un nivel reducido en comparación con un organismo de tipo silvestre.
Un experto en la técnica conoce muchos métodos para la modificación genética de genes diana y pueden usarse para crear el huésped recombinante de esta invención. Las modificaciones que pueden usarse para reducir o eliminar la expresión de una enzima diana son alteraciones que incluyen, pero no se limitan a, deleción de todo el gen o una porción del gen que codifica una enzima; insertar un fragmento de ADN en un gen que codifica la enzima (o bien en el promotor o bien en la región codificante) de modo que la enzima no se exprese o se exprese a menores niveles; introducir una mutación en la región codificante para la enzima, lo que añade un codón de terminación o desplazamiento de marco de modo que no se exprese una enzima funcional; e introducir una o más mutaciones en la región codificante de una enzima para alterar aminoácidos de modo que se exprese una enzima no funcional o una enzima enzimáticamente menos activa. Además, la expresión de una enzima puede bloquearse mediante la expresión de un ARN antisentido o un ARN interferente, y pueden introducirse constructos que dan como resultado supresión conjunta. Además, la síntesis o estabilidad del transcrito puede disminuirse mediante mutación. De manera similar, la eficiencia mediante la que se traduce una enzima a partir de ARNm puede modularse mediante mutación. Todos estos métodos pueden ponerse en práctica fácilmente por un experto en la técnica haciendo uso de las secuencias conocidas que codifican las alcohol deshidrogenasas y/o aldehído reductasas de esta invención.
Las secuencias de alcohol deshidrogenasa y aldehído reductasa de una variedad de organismos se conocen ampliamente en la técnica y la selección del gen/de los genes diana dependerá del huésped seleccionado. Secuencias de alcohol deshidrogenasa (ADH) y aldehído reductasa representativas, que pueden seleccionarse como diana según la presente divulgación se listan en la tabla 1. Un experto en la técnica puede elegir estrategias de modificación específicas para eliminar o disminuir la expresión de una alcohol deshidrogenasa y/o aldehído reductasa según se desee para facilitar la producción de vainillina y/o glucósido de vainillina.
TABLA 1
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En algunas realizaciones, la célula huésped recombinante tiene una producción o actividad reducida de una primera alcohol deshidrogenasa y una producción reducida de una o más segundas alcohol deshidrogenasas, una o más aldehído reductasas, o una combinación de las mismas. En realizaciones particulares, la primera alcohol deshidrogenasa es ADH6. En otra realización, la una o más segundas alcohol deshidrogenasas se seleccionan del grupo de ADH7, GRE2 (genes de respuesta al estrés 2); y la aldehído reductasa se selecciona del grupo de ARI1 (aldehído reductasa intermedia 1) o aldehído reductasa YGL039W.
Las secuencias de ADN que rodean a una o más de las secuencias a las que se hizo referencia anteriormente también son útiles en algunos procedimientos de modificación y están disponibles para levaduras tal como para Saccharomyces cerevisiae en la secuencia de genoma completa coordinada por el NCBI (National Center for Biotechnology Information) con los n.os BioProject de identificación PRJNA128, PRJNA13838, PRJNA43747, PRJNA48559, PRJNA52955, PRJNA48569, PRJNA39317. Los ejemplos adicionales de secuencias genómicas de levadura incluyen la de Schizosaccharomyces pombe, que está incluida en los n.os BioProject PRJNA127, PRJNA13836 y PRJNA20755.
En particular, las secuencias de ADN que rodean a una secuencia que codifica alcohol deshidrogenasa o aldehído reductasa son útiles para métodos de modificación que usan recombinación homóloga. Por ejemplo, secuencias que flanquean el gen de interés se sitúan a cada lado de un gen marcador seleccionable para mediar en la recombinación homóloga con lo que el gen marcador reemplaza el gen de interés. Además, pueden usarse secuencias génicas parciales y secuencias flanqueantes que limitan con un gen marcador seleccionable para mediar en la recombinación homóloga con lo que el gen marcador reemplaza una porción del gen diana. Además, el marcador seleccionable puede limitarse mediante sitios de recombinación específicos de sitio, de modo que tras la expresión de la recombinasa específica de sitio correspondiente, el gen de resistencia se escinde del gen de interés sin reactivar este último. La recombinación específica de sitio deja atrás un sitio de recombinación que altera la expresión de la alcohol deshidrogenasa o aldehído reductasa. El vector de recombinación homóloga puede construirse para dejar también una deleción en el gen de interés tras la escisión del marcador seleccionable, tal como conoce ampliamente un experto en la técnica.
Las deleciones pueden hacerse usando recombinación mitótica tal como se describe en Wach, et al. ((1994) Yeast 10:1793-1808). Este método implica preparar un fragmento de ADN que contiene un marcador seleccionable entre regiones genómicas que pueden ser de tan solo 20 pb, y que limitan una secuencia de ADN diana. Este fragmento de ADN puede prepararse mediante amplificación por PCR del gen marcador seleccionable usando como cebadores oligonucleótidos que se hibridan a los extremos del gen marcador y que incluyen las regiones genómicas que pueden recombinarse con el genoma de levadura. El fragmento de ADN lineal puede transformarse eficientemente en levadura y recombinarse en el genoma dando como resultado el reemplazo génico incluyendo con deleción de la secuencia de ADN diana.
Además, pueden usarse métodos de reemplazo de promotor para intercambiar los elementos de control transcripcional endógenos permitiendo que otros medios modulen la expresión, tal como se describe en Mnaimneh, et al. ((2004) Cell 118(1):31-44).
Las células huésped de uso en esta divulgación incluyen cualquier organismo capaz de producir vainillina y/o glucósido de vainillina ya sea de manera natural o sintéticamente, por ejemplo, mediante la expresión recombinante de uno o más genes de la ruta de biosíntesis de vainillina y/o glucósido de vainillina (Figura 1). La levadura es un eucariota adecuado para su uso en la construcción de los microorganismos recombinantes descritos en el presente documento. Una especie y una cepa seleccionadas para su uso como cepa de producción de vainillina y/o glucósido de vainillina se analiza en primer lugar para determinar qué genes de producción son endógenos para la cepa y qué genes no están presentes. Los genes para los que un equivalente endógeno no está presente en la cepa se ensamblan en uno o más constructos recombinantes, que se transforman entonces en la cepa con el fin de suministrar la(s) función/funciones que faltan.
Especies a modo de ejemplo se describen en más detalle más adelante. Sin embargo, se apreciará que otras especies pueden ser adecuadas. Por ejemplo, puede haber especies adecuadas en un género Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces y Schizosaccharomyces. Las especies a modo de ejemplo incluyen Pichia pastoris, Candida utilis y Yarrowia lipolytica. En algunas realizaciones, un microorganismo puede ser un ascomiceto tal como Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe o Saccharomyces cerevisiae. Se apreciará que pueden usarse ciertos microorganismos para examinar y someter a prueba genes de interés de una manera de alto rendimiento, mientras que pueden usarse otros microorganismos con características de productividad o de crecimiento deseadas para la producción a gran escala de beta-D-glucósido de vainillina.
Ejemplos no limitativos específicos de huéspedes recombinantes útiles se describen en el documento WO 01/40491, así como en Hansen et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75:2765-2774 y Brochado, et al. (2010) Microbial Cell Factories 9:84, conteniendo el huésped recombinante según esta invención un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido de COMT mutante y/o polipéptido de AROM mutante en lugar de los genes OMT descritos en el documento WO 01/40491.
Un huésped recombinante preferido para su uso con la presente invención es S. cerevisiae, que puede modificarse mediante ingeniería de manera recombinante tal como se describe en el presente documento. S. cerevisiae es un organismo chasis usado ampliamente en biología de síntesis, y puede usarse como plataforma de microorganismo recombinante. Hay bibliotecas de mutantes, plásmidos, modelos informáticos detallados de metabolismo y otra información disponible para S. cerevisiae, permitiendo el diseño racional de diversos módulos para potenciar el rendimiento de producto. Se conocen métodos para hacer microorganismos recombinantes. La cepa VG4 de S. cerevisiae (Brochado, et al. (2010) Microb. Cell Fact. 9:84) es particularmente útil. VG4 tiene el genotipo de pdclAgdh 1Ú]G DH2.
Dependiendo del organismo particular usado en esta invención, la célula huésped recombinante puede expresar de manera natural o recombinante genes que codifican una AROM (enzima multifuncional Arom), OMT (O-metiltransferasa), COMT (catecol-O-metil transferasa), 3DSD (3-deshidroshikimato deshidratasa), ACAR (ácido carboxílico aromático reductasa), UGT (uridina-5’-difosfoglucosil transferasa) o PPTasa (fosfopanteteína transferasa) (Figura 1).
Expresión recombinante significa que el genoma de una célula huésped se ha aumentado a través de la introducción de uno o más genes recombinantes, que incluyen secuencias reguladoras que facilitan la transcripción y traducción de una proteína de interés. Aunque las realizaciones incluyen la introducción estable de genes recombinantes en el genoma huésped, también pueden usarse plásmidos o vectores autónomos o replicativos dentro del alcance de esta invención. Además, la presente invención puede ponerse en práctica usando un plásmido o vector de bajo número de copias, por ejemplo, una única copia, o uno de alto número de copias (tal como se ejemplifica en el presente documento).
Generalmente, el gen recombinante introducido no es residente originariamente en el huésped que es el receptor del gen recombinante, pero forma parte de la divulgación para aislar un segmento de ADN de un huésped dado, y para introducir posteriormente una o más copias adicionales de ese ADN en el mismo huésped, por ejemplo, para potenciar la producción del producto de un gen o alterar el patrón de expresión de un gen. En algunos casos, el ADN introducido modificará o incluso reemplazará un gen endógeno o una secuencia de ADN mediante, por ejemplo, recombinación homóloga o mutagénesis dirigida al sitio. Los huéspedes recombinantes adecuados dados a conocer mediante el presente documento incluyen microorganismos, células vegetales y plantas.
El término “gen recombinante” se refiere a un gen o secuencia de ADN que se introduce en un huésped receptor, independientemente de si el mismo gen o secuencia de ADN o uno/una similar puede ya estar presente en un huésped de este tipo. En la técnica se conoce que “introducido” o “aumentado” en este contexto significa introducido o aumentado por la mano del hombre. Por tanto, un gen recombinante puede ser una secuencia de ADN de otra especie, o puede ser una secuencia de ADN que se originó de o está presente en la misma especie, pero se ha incorporado a un huésped mediante métodos recombinantes para formar un huésped recombinante. Se apreciará que un gen recombinante que se introduce en un huésped puede ser idéntico a una secuencia de ADN que está presente normalmente en el huésped que están transformándose, y se introduce para proporcionar una o más copias adicionales del ADN para permitir de ese modo la sobreexpresión o expresión modificada del producto génico de ese ADN.
Un gen recombinante que codifica un polipéptido descrito en el presente documento incluye la secuencia codificante para ese polipéptido, ligado operativamente, en orientación sentido, a una o más regiones reguladoras adecuadas para expresar el polipéptido. Dado que muchos microorganismos son capaces de expresar múltiples productos génicos a partir de un ARNm policistrónico, pueden expresarse múltiples polipéptidos bajo el control de una única región reguladora para aquellos microorganismos, si se desea. Se considera que una secuencia codificante y una región reguladora están ligadas operativamente cuando la región reguladora y la secuencia codificante están posicionadas de modo que la región reguladora es efectiva para regular la transcripción o traducción de la secuencia. Normalmente, el sitio de iniciación de la traducción del marco de lectura traduccional de la secuencia codificante está posicionado entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en el sentido de 3’ de la región reguladora para un gen monocistrónico.
En muchos casos, la secuencia codificante para un polipéptido descrito en el presente documento se identifica en una especie distinta de la del huésped recombinante, es decir, es un ácido nucleico heterólogo. El término “ácido nucleico heterólogo” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico introducido en un huésped recombinante, no estando dicho ácido nucleico presente de manera natural en dicho huésped. Por tanto, si el huésped recombinante es un microorganismo, la secuencia codificante puede ser de otros microorganismos procariotas o eucariotas, de plantas o de animales. Sin embargo, en algún caso, la secuencia codificante es una secuencia que es nativa para el huésped y que están volviendo a introducirse en ese organismo. Una secuencia nativa puede distinguirse a menudo de la secuencia que se produce de manera natural mediante la presencia de secuencias no naturales ligadas al ácido nucleico exógeno, por ejemplo, secuencias reguladoras no nativas que flanquean una secuencia nativa en un constructo de ácido nucleico recombinante. Además, los ácidos nucleicos exógenos transformados de manera estable se integran normalmente en posiciones distintas de la posición en la que se encuentra la secuencia nativa.
“Región reguladora” se refiere a un ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos que influyen en el inicio y la tasa de transcripción o traducción, y en la estabilidad y/o movilidad de un producto de transcripción o traducción. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitación, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteínas, elementos inducibles, secuencias de unión a proteínas, regiones no traducidas (UTR) en 5’ y 3’, sitios de inicio transcripcional, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, intrones y combinaciones de los mismos. Una región reguladora incluye normalmente al menos un promotor de núcleo (basal). Una región reguladora puede incluir también al menos un elemento de control, tal como una secuencia potenciadora, un elemento en el sentido de 5’ o una región de activación en el sentido de 5’ (UAR). Una región reguladora está ligada operativamente a una secuencia codificante mediante el posicionamiento de la región reguladora y la secuencia codificante de modo que la región reguladora sea efectiva para regular la transcripción o traducción de la secuencia. Por ejemplo, para ligar operativamente una secuencia codificante y una secuencia promotora, el sitio de iniciación de la traducción del marco de lectura traduccional de la secuencia codificante se posiciona normalmente entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos en el sentido de 3’ del promotor. Sin embargo, una región reguladora puede posicionarse tanto como aproximadamente 5.000 nucleótidos en el sentido de 5’ del sitio de iniciación de la traducción, o aproximadamente 2.000 nucleótidos en el sentido de 5’ del sitio de inicio de la transcripción.
La elección de regiones reguladoras que deben incluirse depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, eficiencia, seleccionabilidad, inducibilidad, nivel de expresión deseado y expresión preferencial durante ciertas fases de cultivo. Es una cuestión rutinaria para un experto en la técnica modular la expresión de una secuencia codificante seleccionando y posicionando apropiadamente regiones reguladoras en relación con la secuencia codificante. Se entenderá que puede estar presente más de una región reguladora, por ejemplo, intrones, potenciadores, regiones de activación en el sentido de 5’, terminadores de transcripción y elementos inducibles.
Uno o más genes, por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos heterólogos, pueden combinarse en un constructo de ácido nucleico recombinante en “módulos” útiles para un aspecto discreto de la producción de vainillina y/o glucósido de vainillina. La combinación de una pluralidad de genes o ácidos nucleicos heterólogos en un módulo facilita el uso del módulo en una variedad de especies. Por ejemplo, una agrupación de genes de vainillina puede combinarse de modo que cada secuencia codificante esté ligada operativamente a una región reguladora independiente, para formar un módulo de vainillina para la producción en organismos eucariotas. Además de genes útiles para la producción de vainillina o glucósido de vainillina, un constructo recombinante contiene también normalmente un origen de replicación, y uno o más marcadores seleccionables para el mantenimiento del constructo en especies apropiadas.
Se apreciará que, debido a la degeneración del código genético, varios ácidos nucleicos pueden codificar un polipéptido particular; es decir, para muchos aminoácidos hay más de un triplete de nucleótidos que sirve como codón para el aminoácido. Por tanto, los codones en la secuencia codificante para un polipéptido dado pueden modificarse de modo que se obtenga una expresión óptima en un huésped particular, usando tablas de sesgos de codón apropiadas para ese huésped (por ejemplo, microorganismo). Como ácidos nucleicos aislados, estas secuencias modificadas pueden existir como moléculas purificadas y pueden incorporarse a un vector o un virus para su uso en la construcción de módulos para constructos de ácido nucleico recombinantes.
Como se indica, los huéspedes recombinantes pueden expresar una o más enzimas implicadas en la biosíntesis de la vainillina o del glucósido de vainillina, así como genes o módulos de biosíntesis adicionales que mejoran la eficiencia con la que la energía y las fuentes de carbono se convierten en vainillina y su glucósido, y/o para potenciar la productividad a partir del cultivo celular o de la planta. Se da a conocer que el huésped recombinante expresa de manera endógena o recombinante genes que codifican AROM, COMT, 3DSD, ACAR, UGT y/o PPTasa.
AROM es un complejo enzimático pentafuncional codificado en levadura por el gen ARO1. El gen tiene 4764 pb de longitud y codifica un polipéptido correspondiente de 1588 aminoácidos de longitud. AROM realiza cinco conversiones enzimáticas consecutivas, es decir, convirtiendo DAHP (ácido 3-desoxi-D-arabino-heptulosónico-7-fosfato) en 3-DHQ (3-deshidroquinato), que se convierte en 3-DHS (ácido 3-deshidroshikímico), que se convierte en shikimato, que se convierte en shikimato-3-P (shikimato-3-fosfato), que se convierte en EPSP (5-enolpiruvilskimato-3-fosfato), todo en la ruta para la biosíntesis celular de los aminoácidos aromáticos tirosina, triptófano y fenilalanina. Según algunas realizaciones de esta invención, la enzima AROM presenta al menos cuatro de las cinco actividades enzimáticas del polipéptido de AROM de S. cerevisiae, es decir, actividad 3-deshidroquinato deshidratasa, actividad 3-deshidroquinato sintasa, actividad 3-fosfoshikimato 1-carboxiviniltransferasa, actividad shikimato 3-deshidrogenasa (NADP+) y actividad shikimato quinasa.
Los ejemplos no limitativos de polipéptidos de AROM incluyen el polipéptido de Saccharomyces cerevisiae disponible bajo el n ° de registro GENBANK X06077; el polipéptido de Schizosaccharomyces pombe disponible bajo el n ° de registro GENBANK NP_594681.1; el polipéptido de Schizosaccharomyces japonicas disponible bajo el n ° de registro GENBANK XP_002171624; el polipéptido de Neurospora crassa disponible bajo el n ° de registro GENBANK XP_956000; y el polipéptido de Yarrowia lipolytica disponible bajo el n ° de registro GENBANK XP_505337.
Según una realización de esta invención, el polipéptido de AROM es un polipéptido de AROM mutante con actividad shikimato deshidrogenasa disminuida. Cuando se expresa en un huésped recombinante, el polipéptido de AROM mutante redirige el flujo metabólico de la producción de aminoácido aromático a la producción de precursor de vainillina, es decir, 3-DHS. Véase el documento WO 2013/022881. En determinadas realizaciones, el polipéptido de AROM mutante descrito en el presente documento puede tener una o más modificaciones en el dominio 5 (por ejemplo, una sustitución de uno o más aminoácidos, una deleción de uno o más aminoácidos, inserciones de uno o más aminoácidos, o combinaciones de sustituciones, deleciones e inserciones).
En algunas realizaciones, un polipéptido de AROM modificado se fusiona con un polipéptido que cataliza la primera etapa realizada de biosíntesis de vainillina, 3DSD. Un polipéptido que tiene actividad 3DSD y que es adecuado para su uso en un polipéptido de fusión incluye el polipéptido de 3DSD de Podospora pauciseta, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp., Aspergillus nigero Neurospora crassa. Véanse, los n.os de registro GENBANK CAD60599), XP_001905369.1, XP_761560.1, ABG93191.1, AAC37159.1 y XM_001392464.
Además, el huésped recombinante puede expresar un polipéptido de COMT. Los ejemplos no limitativos de polipéptidos de COMT de uso en esta divulgación incluyen polipéptidos de COMT en la familia clasificada bajo el número EC 2.1.1,6, tal como el polipéptido de Homo sapiens (Hs) disponible bajo el n ° de registro GENBANK NM_000754; un polipéptido de Arabidopsis thaliana disponible bajo el n ° de registro GENBANK AY062837; o un polipéptido de Fragaria x ananassa (fresa) disponible bajo el n ° de registro GENBANK AF220491. El polipéptido de COMT humano existe como varias variantes y el polipéptido de COMT puede ser cualquiera de estas variantes. Otros polipéptidos de COMT de mamífero adecuados de uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos aislados de Pan troglodytes (n° de registro GENBANK XP_514984), Macaca mulatta (n° de registro GENBANK AFJ70145), Equus caballus (n° de registro GENBANK NP_001075303), Canis lupus familiaris (n° de registro GENBANK AAR20324), Cricetulus griseus (n° de registro GENBANK EGV97595), Sus scrofa (n° de registro GENBANK NP_001182259) y Bos taurus (n° de registro GENBANK NP_001095787). Otros polipéptidos de COMT a modo de ejemplo de fuentes vegetales y de microorganismos incluyen, pero no se limitan a, aquellos aislados de Rosa chinensis (n° de registro GENBANK CAD29457), Prunus dulcis (n° de registro GENBANK CAA58218), Gossypium hirsutum (n° de registro GENBANK ACT32028), Jatropha curcas (n° de registro GENBANK ACT87981), Eucalyptus camaldulensis (ADB82906), Candida orthopsilosis (n° de registro GENBANK CCG25047), Pichia stipitis (n° de registro GENBANK ABN67921) y Spathaspora passalidarum (n° de registro GENBANK EGW29958). En determinadas realizaciones, el polipéptido de COMT de la invención se obtiene de Phytophthera infestans (n° de registro GENBANK XP_002899214), Catharanthus roseus (n° de registro GENBANK EGS21863), Yarrowia lipolytica (n.° de registro GENBANK XP_500451), Ciona intestinalis (n° de registro GENBANK XP_002121420 o XP_002131313), Capsasproa owczarzaki (n° de registro GENBANK EFW46044), Chaetomium therophilum (n° de registro GENBANK EGS21863), Clavispora lusitaniae (n° de registro GENBANK Xp_002899214), Paracoccidioides sp. ‘lutzii’ Pb01 (n° de registro GENBANK XP_002793380), Vanilla planifolia (véase la SEQ ID nO:56 del documento PCT/US2012/049842), Coffea arabica (n° de registro GENBANK AAN03726), Rattus norvegicus (n° de registro GENBANK NP_036663), Mus musculus (mo de registro GENBANK NP_031770), Crenarchaeote (n° de registro GENBANK ABZ07345), Mycobacterium vanbaleeni (n° de registro GENBANK ABM14078) o Schizosaccharomyces pombe (mo de registro GENBANK NP_001018770.
También se da a conocer un polipéptido de COMT mutante usado para mejorar la biosíntesis de beta-D-glucósido de vainillina. Por ejemplo, los polipéptidos de COMT mutantes pueden tener una o más de las siguientes propiedades: renovación aumentada; metilación preferencial en la posición meta (3’), en vez de en la posición para (4’) de modo que se favorece la producción de vainillina con respecto a isovainillina; o mejor especificidad para los sustratos de la ruta de la vainillina, ácido protocatéquico y aldehido protocatéquico. Véase el documento WO 2013/022881. Un COMT polipéptido mutante puede tener una o más mutaciones (por ejemplo, una sustitución de uno o más aminoácidos, una deleción de uno o más aminoácidos, inserciones de uno o más aminoácidos, o combinaciones de sustituciones, deleciones e inserciones) en, por ejemplo, el sitio de unión a sustrato. Por ejemplo, un polipéptido de COMT mutante puede tener una o más sustituciones de aminoácido en el sitio de unión a sustrato de COMT humano.
En la divulgación se proporciona un polipéptido de COMT mutante, que es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH de ácido protocatéquico, dando como resultado dicha metilación la generación de al menos 4 veces más ácido vanílico en comparación con ácido isovanílico. En la divulgación, el polipéptido de COMT mutante es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH de aldehido protocatéquico, dando como resultado dicha metilación la generación de al menos 4 veces más vainillina en comparación con isovainillina.
En la divulgación, el huésped alberga un ácido nucleico que codifica polipéptido de AROM mutante y opcionalmente un polipéptido de COMT de tipo silvestre. En la divulgación, el huésped de esta invención alberga un ácido nucleico que codifica polipéptido de COMT mutante y opcionalmente un polipéptido de AROM de tipo silvestre. También se da a conocer un huésped que alberga un ácido nucleico que codifica polipéptido de AROM muíante y opcionalmente un polipéptido de COMT muíante.
Se conocen polipéptidos de 3DSD adecuados. Un polipéptido de 3DSD según la presente divulgación puede ser cualquier enzima con actividad 3-deshidroshikimato deshidratasa. Preferiblemente, el polipéptido de 3DSD es una enzima capaz de catalizar la conversión de 3-deshidro-shikimato a protocatecuato y H2O. Un polipéptido de 3DSD según la presente divulgación es preferiblemente una enzima clasificada bajo EC 4.2.1.118. Por ejemplo, un polipéptido adecuado que tiene actividad 3DSD incluye el polipéptido de 3DSD elaborado por Podospora pauciseta, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp, Aspergillus niger o Neurospora crassa. Véanse los n.os de registro GENBANK CAD60599, XP_001905369.1, XP_761560.1, ABG93191.1, AAC37159.1 y XM_001392464. Por tanto, el huésped recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de 3DSD de Podospora anserina, Ustilago maydis, Rhodoicoccus jostii, Acinetobacter sp., Aspergillus niger o Neurospora crassa o un homólogo funcional de cualquiera de los mencionados anteriormente que comparta al menos un 80%, tal como al menos un 85%, por ejemplo, al menos un 90%, tal como al menos un 95%, por ejemplo, al menos un 98% de identidad de secuencia con el mismo.
También se conocen en la técnica polipéptidos de ACAR adecuados. Un polipéptido de ACAR según la presente divulgación puede ser cualquier enzima que tenga actividad ácido carboxílico aromático reductasa. Preferiblemente, el polipéptido de ACAR es una enzima capaz de catalizar la conversión de ácido protocatéquico a aldehido protocatéquico y/o la conversión de ácido vanílico a vainillina. Un polipéptido de ACAR según la presente divulgación es preferiblemente una enzima clasificada bajo EC 1.2.1.30. Por ejemplo, un polipéptido de ACAR adecuado se elabora por Nocardia sp. Véase, por ejemplo, el n.° de registro GENBANK AY495697. Por tanto, el huésped recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de ACAR de Nocardia sp. o un homólogo funcional del mismo que comparta al menos un 80%, tal como al menos un 85%, por ejemplo, al menos un 90%, tal como al menos un 95%, por ejemplo, al menos un 98% de identidad de secuencia con el mismo.
Se conocen polipéptidos de PPTasa adecuados. UN polipéptido de PPTasa según la presente divulgación puede ser cualquier enzima capaz de catalizar la fosfopanteteinilación. Preferiblemente, el polipéptido de PPTasa es una enzima capaz de catalizar la fosfopanteteinilación de ACAR. Por ejemplo, un polipéptido de PPTasa adecuados se elabora por E. coli, Corynebacterium glutamicum o Nocardia farcinica. Véanse los n.os de registro GENBANK NP_601186, BAA35224 e YP_120266. Por tanto, el huésped recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de PPTasa de E. coli, C. glutamicum o N. farcinica o un homólogo funcional de cualquiera de los mencionados anteriormente que comparta al menos un 80%, tal como al menos un 85%, por ejemplo, al menos un 90%, tal como al menos un 95%, por ejemplo, al menos un 98% de identidad de secuencia con el mismo.
La glucosilación de vainillina es particularmente útil. El p-D-glucósido de vainillina es la forma de almacenamiento de vainillina encontrada en la vaina de vainilla. Es no tóxica para la mayoría de los organismos, incluyendo la levadura, y tiene una mayor solubilidad en agua, en comparación con la vainillina. Además, lo más probable es que la formación de p-D-glucósido de vainillina dirija la biosíntesis hacia la producción de vainillina. UGT72E2 (Hansen, et al. (2009) Appl. Environ. Microbiol. 75:2765-27740) presentó una alta especificidad de sustrato hacia la vainillina. En concordancia con esta observación, su expresión en la cepa de S. cerevisiae que produce vainillina dio como resultado que casi toda la vainillina se convirtiese en p-D-glucósido de vainillina. La capacidad de convertir vainillina en p-D-glucósido de vainillina in vivo es importante, porque la producción microbiana de vainillina no glucosilada más allá de la escala de 0,5-1 g/litro estaría obstaculizada por la toxicidad de la vainillina libre. La glucosilación sirve para eludir el efecto inhibidor.
Por consiguiente, el huésped recombinante expresa un polipéptido de UGT. Un polipéptido de UGT puede ser cualquier UDP-glucosa:aglicon-glucosiltransferasa. Preferiblemente, los polipéptidos de UGT pueden catalizar la glucosilación de vainillina (es decir, para producir beta-D-glucósido de vainillina). Por tanto, el polipéptido de UGT puede ser una familia 1 glicosiltransferasa. Los polipéptidos de UGT preferidos según la invención se clasifican bajo EC 2.4.1. Los polipéptidos de UGT adecuados incluyen los polipéptidos de UGT71C2, UGT72B1, UGT72E2, UGT84A2, UGT89B1, UGT85B1 y de arbutina sintasa. Véanse, por ejemplo, los n.os de registro GENBANK AC0005496, NM_116337 y NM_126067. El UGT72E2 de A. thaliana es particularmente útil (véase, por ejemplo, Hansen, et al. (2009) citado anteriormente). Por tanto, el huésped recombinante puede incluir un ácido nucleico heterólogo que codifica los UGT71C2, UGT72B1, UGT72E2, UGT84A2, UGT89B1, UGT85B1 o arbutina sintasa o un homólogo funcional de cualquiera de los mencionados anteriormente que comparta al menos un 80%, tal como al menos un 85%, por ejemplo, al menos un 90%, tal como al menos un 95%, por ejemplo, al menos un 98% identidad de secuencia con el mismo. Otros UGT útiles se describen en el documento WO 01/40491.
Como realización adicional de esta invención, una enzima VAO (EC 1.1.3.38) también puede expresarse mediante células huésped para oxidar cualquier alcohol vainillílico residual para dar vainillina. Las enzimas VAO se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, enzimas de hongos filamentosos tales como Fusarium monilifomis (n° de registro GENBANK AfJ11909) y Penicillium simplicissium (mo de registro GENBANK P56216; Benen, et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:7865-72) y bacterias tales como Modestobacter marinus (n° de registro GENBANK YP_006366868), Rhodococcus jostii (mo de registro GENBANK YP_703243.1) y R. opacus (mo de registro GENBANK EH139392).
En algunos casos, es deseable inhibir una o más funciones de un polipéptido endógeno con el fin de desviar productos intermedios metabólicos hacia la biosíntesis de vainillina o glucósido de vainillina. Por ejemplo, puede reducirse la actividad piruvato descarboxilasa (PDC1) y/o glutamato deshidrogenasa. En tales casos, un ácido nucleico que inhibe la expresión del polipéptido o producto génico puede incluirse en un constructo recombinante que se transforma en la cepa. Alternativamente, puede usarse mutagénesis para generar mutantes en genes para los que se desee inhibir la función.
Para demostrar la expresión y actividad de una o más de las enzimas a las que se hizo referencia anteriormente expresadas por el huésped recombinante, pueden determinarse niveles de productos, sustratos y productos intermedios, por ejemplo, ácido deshidroshikímico, ácido protocatéquico, aldehído protocatéquico, vainillina y beta-D-glucósido de vainillina producidos por el huésped recombinante extrayendo muestras de medios de cultivo para su análisis según métodos publicados.
Los huéspedes recombinantes descritos en el presente documento pueden usarse en métodos para producir vainillina o glucósido de vainillina. Por ejemplo, si el huésped recombinante es un microorganismo, el método puede incluir hacer crecer el microorganismo recombinante en un medio de cultivo en condiciones en las que se expresan genes de biosíntesis de vainillina y/o glucósido de vainillina. El microorganismo recombinante puede hacerse crecer en un proceso discontinuo, semicontinuo o continuo, o combinaciones de los mismos. Normalmente, el microorganismo recombinante se hace crecer en un fermentador a una(s) temperatura(s) definida(s) en presencia de una fuente de nutrientes adecuada, por ejemplo, una fuente de carbono, durante un periodo de tiempo deseado para producir una cantidad deseada de vainillina y/o glucósido de vainillina.
Por tanto, esta invención proporciona también un método para producir vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina proporcionando un huésped recombinante según las reivindicaciones adjuntas que produce vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina; cultivando dicho huésped recombinante, por ejemplo, en presencia de una fuente de carbono adecuada, durante un tiempo suficiente para que dicho huésped recombinante produzca vainillina y/o glucósido de vainillina; y aislando vainillina y/o glucósido de vainillina a partir de dicho huésped recombinante o a partir del sobrenadante de cultivo. En una realización, el huésped recombinante produce una cantidad reducida de alcohol vainillílico en comparación con un huésped que expresa la una o más alcohol deshidrogenasas funcionales o una o más aldehído reductasas.
En determinadas realizaciones, se prefiere que el huésped recombinante exprese al menos una 3DSD y al menos una ACAR, que pueden ser preferiblemente una de las 3DSD y ACAR descritas en el presente documento. En realizaciones en las que el huésped recombinante expresa una ACAR capaz de catalizar la conversión de ácido vanílico a vainillina, entonces el método también puede incluir determinar el nivel de vainillina e isovainillina generadas. El huésped recombinante expresa al menos una UGT capaz de catalizar la glucosilación de vainillina y isovainillina, en cuyo caso pueden determinarse los niveles de glucósido de vainillina y glucósido de isovainillina en lugar de los niveles de vainillina e isovainillina, respectivamente. Alternativamente, esto puede determinarse generando un huésped recombinante que alberga un ácido nucleico heterólogo que codifica el polipéptido de COMT mutante que debe someterse a prueba, y alimentando ácido protocatéquico a dicho huésped recombinante, seguido de determinar el nivel de generado de ácido isovanílico y ácido vanílico.
De manera similar, puede usarse un ensayo in vitro o una célula huésped recombinante para determinar si un polipéptido de COMT mutante es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH de aldehído protocatéquico, dando como resultado dicha metilación la generación de al menos X veces más vainillina en comparación con isovainillina. Sin embargo, en este ensayo, se usa aldehído protecatéquico como material de partida y se determina el nivel de vainillina e isovainillina.
Igualmente, puede usarse un ensayo in vitro o una célula huésped recombinante para determinar si un polipéptido de COMT mutante dado es capaz de catalizar la metilación de un grupo -OH de alcohol protocatéquico, dando como resultado dicha metilación la generación de al menos X veces más alcohol vainillílico en comparación con alcohol isovainillílico. Sin embargo, en este ensayo, se usa alcohol protecatéquico como material de partida y se determina el nivel de alcohol vainillílico y alcohol isovainillílico.
El nivel de isovainillina y vainillina puede determinare mediante cualquier método adecuado útil para detectar estos compuestos, pudiendo dicho método distinguir entre isovainillina y vainillina. Tales métodos incluyen, por ejemplo, HPLC. De manera similar, el nivel de ácido isovanílico, ácido vanílico, alcohol isovainillílico y alcohol vainillílico puede determinarse usando cualquier método adecuado útil para detectar estos compuestos, pudiendo dicho método distinguir entre isovainillina y vainillina. Tales métodos incluyen, por ejemplo, HPLC.
Las fuentes de carbono de uso en el método de esta divulgación incluyen cualquier molécula que pueda metabolizarse mediante la célula huésped recombinante para facilitar el crecimiento y/o la producción de la vainillina y/o del glucósido de vainillina. Los ejemplos de fuentes de carbono adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sacarosa (por ejemplo, tal como se encuentra en melaza), fructosa, xilosa, etanol, glicerol, glucosa, celulosa, almidón, celobiosa u otro polímero que contenga glucosa. En realizaciones que emplean levadura como huésped, por ejemplo, son adecuadas fuentes de carbono tales como sacarosa, fructosa, xilosa, etanol, glicerol y glucosa. La fuente de carbono puede proporcionarse al organismo huésped durante todo el periodo de cultivo o, alternativamente, el organismo puede hacerse crecer durante un periodo de tiempo en presencia de otra fuente de energía, por ejemplo, proteína, y entonces proporcionarse con una fuente de carbono solo durante la fase semidiscontinua.
Tras haber hecho crecer el huésped recombinante en cultivo durante el periodo de tiempo deseado, la vainillina y/o el beta-D-glucósido de vainillina pueden recuperarse entonces del cultivo usando diversas técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, aislamiento y purificación mediante extracción, destilación a vacío y recristalización en múltiples fases a partir de disoluciones acuosas y ultrafiltración (Boddeker, etal. (1997) J. Membrane Sci. 137:155-158; Borges da Silva, et al. (2009) Chem. Eng. Des. 87:1276-1292). Se han usado procesos de extracción en dos fases, que emplean o bien compuestos de sulfhidrilo, tales como ditiotreitol, ditioeritritol, glutatión o L-cisteína (patente estadounidense n ° 5.128.253), o bien disoluciones de KOH alcalinas (documento WO 94/13614) en la recuperación de vainillina así como para su separación de otras sustancias aromáticas. También se ha descrito la adsorción y pervaporación de vainillina a partir de medios bioconvertidos usando membranas de copolímero de poliéter-poliamida (Boddeker, et al. (1997) citado anteriormente; Zucchi, et al. (1998) J. Microbiol. Biotechnol. 8:719-722). También se han usado resinas de adsorción macroporosas con entramados de poliestireno reticulado para recuperar vainillina disuelta a partir de disoluciones acuosas (Zhang, et al. (2008) Eur. Food Res. Technol. 226:377-383). También se han evaluado técnicas de ultrafiltración y contactor de membrana (MC) para recuperar vainillina (Zabkova, et al. (2007) J. Membr. Sci. 301:221-237; Scuibba, et al. (2009) Desalination 241:357-364). Alternativamente, podrían usarse técnicas convencionales tales como percolación o extracción de dióxido de carbono supercrítica y ósmosis inversa para concentración. Si el huésped recombinante es una planta o células vegetales, puede extraerse vainillina o glucósido de vainillina a partir del tejido vegetal usando diversas técnicas conocidas en la técnica.
En la divulgación, puede producirse vainillina o beta-D-glucósido de vainillina usando células enteras a las que se les alimentan materias primas que contienen moléculas precursoras. Las materias primas pueden alimentarse durante el crecimiento celular o tras el crecimiento celular. Las células completas pueden estar en suspensión o inmovilizadas. Las células completas pueden estar en caldo de fermentación o en un tampón de reacción. En algunos aspectos puede requerirse un agente de permeabilización para una transferencia eficiente de sustrato a las células.
En algunos aspectos, la vainillina o el beta-D-glucósido de vainillina se aísla y se purifica hasta homogeneidad (por ejemplo, al menos el 90%, el 92%, el 94%, el 96% o el 98% de pureza). En otros aspectos, la vainillina o el beta-D-giucósido de vainillina se aísla como extracto a partir de un huésped recombinante. A este respecto, la vainillina o el beta-D-glucósido de vainillina puede aislarse, pero no necesariamente purificarse hasta homogeneidad. De manera deseable, la cantidad de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina producida puede ser de desde aproximadamente 1 mg/l hasta aproximadamente 20.000 mg/l o superior. Por ejemplo, puede producirse de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/l, de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 mg/l, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 mg/l, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 mg/l, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 mg/l, de aproximadamente 250 a aproximadamente 5.000 mg/l, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000 mg/l o de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 10.000 mg/l de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina. En general, tiempos de cultivo más largos conducirán a mayores cantidades de producto. Por tanto, el microorganismo recombinante puede cultivarse durante desde 1 día hasta 7 días, desde 1 día hasta 5 días, desde 3 días hasta 5 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días o aproximadamente 5 días.
Se apreciará que los diversos genes y módulos discutidos en el presente documento pueden estar presentes en dos o más microorganismos recombinantes en vez de un único microorganismo. Cuando se usa una pluralidad de microorganismos recombinantes, pueden hacerse crecer en un cultivo mixto para producir vainillina y/o glucósido de vainillina.
Extractos de vainillina o beta-D-glucósido de vainillina aislada/o, y opcionalmente purificada/o, se usan en productos de consumo aromatizantes tales como productos alimenticios, suplementos dietéticos, productos nutracéuticos, composiciones farmacéuticas, composiciones higiénicas dentales y productos cosméticos.
La frase “producto alimenticio”, tal como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, frutas, verduras, zumos, productos cárnicos tales como jamón, beicon y salchicha; productos de huevo, concentrados de fruta, gelatinas y productos de tipo gelatina tales como mermeladas, jaleas, conservas y similares; productos lácteos tales como helado, crema agria y sorbete; glaseados, siropes incluyendo melaza; productos de maíz, trigo, centeno, soja, avena, arroz y cebada, corazones de frutos secos y productos de frutos secos, tartas, galletas, golosinas tales como caramelos, chicles, gotas con aroma de fruta y chocolates, gomas de mascar, caramelos de menta, cremas, glaseado, helado, pasteles y panes, bebidas tales como café, té, refrescos carbonatados, tales como COKE y PEPSI, refrescos no carbonatados, zumos y otras bebidas de frutas, bebidas deportivas tales como GATORADE, café, tés, tés helados, cola, bebidas alcohólicas, tales como cervezas, vinos y licores, y KOOL-AID.
Los productos alimenticios también incluyen condimentos tales como hierbas, especias y aderezos, potenciadores del aroma. Un producto alimenticio incluye también productos envasados preparados, tales como edulcorantes dietéticos, edulcorantes líquidos, mezclas aromatizantes granuladas que tras la reconstitución con agua proporcionan bebidas no carbonatadas, mezclas de flan instantáneo, café y té instantáneo, blanqueadores de café, mezclas de leche malteada, piensos para mascotas, pienso para ganado, tabaco, y materiales para aplicaciones de horneado, tales como mezclas de horneado en polvo para la preparación de panes, galletas, tartas, tortitas, donuts y similares. Los productos alimenticios también incluyen alimentos y bebidas dietéticos o can bajo contenido en calorías que contiene poco o nada de sacarosa. Otros ejemplos de productos alimenticios concebidos según la presente invención se describen más adelante y por toda la memoria descriptiva.
En otro aspecto, los productos alimenticios son frutas, verduras, zumos, productos cárnicos tales como jamón, beicon y salchicha; productos de huevo, concentrados de fruta, gelatinas y productos de tipo gelatina tales como mermeladas, jaleas, conservas y similares; productos lácteos tales como helado, crema agria y sorbete; glaseados, siropes incluyendo melaza; productos de maíz, trigo, centeno, soja, avena, arroz y cebada, corazones de frutos secos y productos de frutos secos, tartas, galletas, golosinas tales como caramelos, chicles, gotas con aroma de fruta y chocolates, cremas, glaseado, helado, pasteles y panes.
En otro aspecto, el producto consumible es una composición farmacéutica. Composiciones preferidas son composiciones farmacéuticas que contienen vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones farmacéuticas pueden usarse para formular drogas farmacéuticas que contienen uno o más agentes activos que ejercen un efecto biológico. Como tal, la composición farmacéutica incluye preferiblemente además uno o más agentes activos que ejercen un efecto biológico. Tales agentes activos incluyen agentes farmacéuticos y biológicos que tienen una actividad. Tales agentes activos se conocen ampliamente en la técnica. Véase, por ejemplo, The Physician’s Desk Reference. Tales composiciones pueden prepararse según procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, EE. UU. En un aspecto, un agente activo de este tipo incluye broncodilatadores, supresores del apetito, antihistamínicos, suplementos nutricionales, laxantes, analgésicos, anestésicos, antiácidos, antagonistas de receptores H2, anticolinérgicos, antidiarreicos, emolientes, antitusivos, antieméticos, antimicrobianos, antibacterianos, antifúngicos, antivirales, expectorantes, agentes antiinflamatorios, antipiréticos y mezclas de los mismos. En un aspecto, el agente activo es un antipirético o analgésico, por ejemplo, ibuprofeno, acetaminofeno o aspirina; laxante, por ejemplo, fenolftaleína-dioctilsulfosuccinato de sodio; calmantes del apetito, por ejemplo, anfetaminas, fenilpropanolamina, hidrocloruro de fenilpropanolamina, o cafeína; antiácidos, por ejemplo, carbonato de calcio; antiasmáticos, por ejemplo, teofilina; antidiuréticos, por ejemplo, hidrocloruro de difenoxilato; agentes activos contra la flatulencia, por ejemplo, simeticona; agentes contra la migraña, por ejemplo, tartrato de ergotamina; agentes psicofarmacológicos, por ejemplo, haloperidol; espasmolíticos o sedantes, por ejemplo, fenobarbitol; antihipercinéticos, por ejemplo, metildopa o metilfenidato; tranquilizantes, por ejemplo, benzodiazepinas, hidroxinmeprobramatos o fenotiazinas; antihistamínicos, por ejemplo, astemizol, maleato de clorofeniramina, maleato de piridamina, succinato de doxlamina, maleato de bromofeniramina, citrato de feniltoloxamina, hidrocloruro de clorociclizina, maleato de feniramina y tartrato de fenindamina; decongestionantes, por ejemplo, hidrocloruro de fenilpropanolamina, hidrocloruro de fenilefrina, hidrocloruro de pseudoefedrina, sulfato de pseudoefedrina, bitartrato de fenilpropanolamina y efedrina; bloqueantes de receptores beta, por ejemplo, propanolol; agentes para la abstinencia al alcohol, por ejemplo, disulfiram; antitusivos, por ejemplo, benzocaína, dextrometorfano, hidrobromuro de dextrometorfano, noscapina, citrato de carbetapentano e hidrocloruro de clofedianol; suplementos de flúor, por ejemplo, fluoruro de sodio; antibióticos locales, por ejemplo, tetraciclina o cleocina; suplementos de corticosteroides, por ejemplo, prednisona o prednisolona; agentes contra la formación de bocio, por ejemplo, colchicina o alopurinol; antiepilépticos, por ejemplo, fenitoína de sodio; agentes contra la deshidratación, por ejemplo, suplementos de electrolitos; antisépticos, por ejemplo, cloruro de cetilpiridinio; AINE, por ejemplo, acetaminofeno, ibuprofeno, naproxeno o sales de los mismos; agentes activos gastrointestinales, por ejemplo, loperamida y famotidina; diversos alcaloides, por ejemplo, fosfato de codeína, sulfato de codeína o morfina; suplementos para elementos traza, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de cinc, carbonato de calcio, óxido de magnesio y otras sales de metales alcalinos y sales de metales alcalinotérreos; vitaminas; resinas de intercambio iónico, por ejemplo, colestiramina; sustancias depresoras del colesterol e hipolipemiantes; antiarrítmicos, por ejemplo, N-acetilprocainamida; y expectorantes, por ejemplo, guaifenesina.
Las sustancias activas que tienen un sabor particularmente desagradable incluyen agentes antibacterianos tales como ciprofloxacina, ofloxacina y pefloxacina; antiepilépticos tales como zonisamida; antibióticos macrólidos tales como eritromicina; antibióticos beta-lactámicos tales como penicilinas y cefalosporinas; sustancias activas psicotrópicas tales como clorpromazina; sustancias activas tales como sulpirina; y agentes activos contra las úlceras, tales como cimetidina.
Las composiciones farmacéuticas de esta divulgación se administran a un sujeto en cualquier forma adecuada para conseguir su propósito previsto. Sin embargo, la composición es preferiblemente una que puede administrarse bucal u oralmente. Alternativamente, la composición farmacéutica puede ser una pulverización oral o nasal. El sujeto es cualquier animal, tal como un humano, aunque no se pretende que la invención esté limitada de ese modo. Otros animales adecuados incluyen canes, felinos, perros, gatos, ganado, caballos, ganado vacuna, ovejas y similares. Una composición veterinaria, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición farmacéutica que es adecuada para animales no humanos. Tales composiciones veterinarias se conocen en la técnica.
En otro aspecto, la composición farmacéutica es una forma de dosificación líquida para administración oral, incluyendo emulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica tal como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tales como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, ésteres de polioxietileno-sorbitol y -sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
La composición farmacéutica de la presente divulgación puede estar en forma de un comprimido masticable. En la técnica se conocen comprimidos masticables. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.684.534 y 6.060.078. Cualquier clase de medicamento puede estar contenida en el comprimido masticable, preferiblemente un medicamento de sabor amargo, extractores vegetales naturales u otros compuestos orgánicos. Más preferiblemente, en el núcleo pueden estar contenidos vitaminas tales como vitamina A, vitamina B, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, vitamina C, vitamina E y vitamina K; extractos vegetales naturales tales como extractos de Sohgunjung-tang, extractos de Sipchundaebo-tang y extractos de Eleutherococcus senticosus; compuestos orgánicos tales como dimenhidrinato, meclazina, acetaminofeno, aspirina, fenilpropanolamina y cloruro de cetilpiridinio; o agentes gastrointestinales tales como gel de hidróxido de aluminio secado, domperidona, azuleno soluble, L-glutamina e hidrotalcita.
La composición farmacéutica de la presente divulgación puede ser una composición de disgregación oral. En la técnica se conocen comprimidos de disgregación oral. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.368.625 y 6.316.029.
La composición farmacéutica de la presente divulgación puede ser una forma de dosificación sólida, incluyendo vainillina o beta-D-glucósido de vainillina y un gránulo efervescente activado con agua y/o saliva, tal como uno que tiene una tasa controlable de efervescencia. La composición efervescente puede comprender además un compuesto farmacéuticamente activo. En la técnica se conocen composiciones farmacéuticas efervescentes. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 6.649.186. La composición efervescente puede usarse en aplicaciones farmacéuticas, veterinarias, hortícolas, domésticas, alimentarias, culinarias, pesticidas, agrícolas, cosméticas, herbicidas, industriales, de limpieza, de golosinas y aromatizantes. Las formulaciones que incorporan la composición efervescente que contienen vainillina o beta-D-glucósido de vainillina pueden incluir además uno o más adyuvantes y/o principios activos adicionales que pueden elegirse de aquellos conocidos en la técnica, incluyendo aromas, diluyentes, colores, aglutinantes, carga, tensioactivo, disgregante, estabilizante, vehículos de compactación y disgregantes no efervescentes.
La composición farmacéutica puede ser una composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea. Una composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea de este tipo puede estar configurada, por ejemplo, como formas de administración que se disgrega rápidamente, por ejemplo, formas de administración que se disgregan dentro de un periodo de 1 segundo a 3 minutos, o como formas de administración que se disgregan lentamente, por ejemplo, formas de administración que se disgregan dentro de un periodo de 3 a 15 minutos. Los tiempos de disgregación indicados pueden fijarse a los intervalos mencionados anteriormente usando, por ejemplo, polímeros formadores de matriz que tienen diferentes características de disgregación o solubilidad. Por tanto, mezclando los componentes de polímero correspondientes puede ajustarse el tiempo de disgregación. Además, se conocen disgregantes que “atraen” agua al interior de la matriz y provocan que la matriz se abra desde dentro. En consecuencia, determinadas realizaciones de la invención incluyen tales disgregantes para el propósito de ajustar el tiempo de disgregación.
Los polímeros adecuados para su uso en la composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea incluyen derivados de celulosa, poli(alcohol vinílico) (por ejemplo, MOWIOL), poliacrilatos, polivinilpirrolidona, éteres de celulosa, tales como etilcelulosa, así como poli(alcohol vinílico), poliuretano, polimetacrilatos, poli(metacrilatos de metilo) y derivados y copolimerizados de los polímeros mencionados anteriormente.
En ciertos aspectos, el grosor total de la composición farmacéutica en forma de película o en forma de oblea según la divulgación es preferiblemente de 5 gm a 10 mm, preferiblemente de 30 gm a 2 mm, y con preferencia particular de 0,1 mm a 1 mm. Las preparaciones farmacéuticas pueden ser de forma redonda, ovalada, elíptica, triangular, cuadrangular o poligonal, pero también pueden tener cualquier forma redondeada.
La composición farmacéutica de la presente divulgación puede estar en forma de un aerosol. La composición de aerosol incluye además un agente farmacéuticamente activo. En la técnica se conocen composiciones de aerosol. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 5.011.678. Como ejemplo no limitativo, una composición de aerosol según la presente divulgación puede incluir una cantidad médicamente efectiva de una sustancia farmacéuticamente activa, vainillina o beta-D-glucósido de vainillina y un propelente biocompatible, tal como un propelente de (hidro/fluoro)carbono.
En un aspecto de la presente divulgación, la composición farmacéutica es una composición nutricional. Los ejemplos de composiciones nutricionales que tienen un sabor indeseable incluyen, pero no se limitan necesariamente a, productos de nutrición enteral para el tratamiento de una deficiencia nutricional, traumatismo, cirugía, enfermedad de Crohn, enfermedad renal, hipertensión, obesidad y similares, para fomentar el rendimiento atlético, la potenciación muscular o el bienestar general o errores congénitos de metabolismo tal como fenilcetonuria. En particular, tales formulaciones nutricionales pueden contener uno o más aminoácidos que tienen un sabor o regusto amargo o metálico. Tales aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, unos aminoácidos esenciales tales como un L-isómero de leucina, isoleucina, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, tirosina o valina.
En un aspecto, el producto consumible de la presente divulgación es una composición higiénica dental que contiene vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina. En la técnica se conocen composiciones higiénicas dentales e incluyen, pero no se limitan necesariamente a, pasta de dientes, enjuague bucal, enjuague antiplaca, hilo dental, tratamientos contra el dolor dental (tal como ANBESOL) y similares.
En otro aspecto, el producto consumible de la presente divulgación es un producto cosmético que contiene vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, el producto cosmético puede ser una crema facial, pintalabios, brillo de labios y similar. Otras composiciones adecuadas de la invención incluyen bálsamo labial, tal como CHAPSTICK o BURT’S BEESWAX Lip Balm, que contienen además vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrito en las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Cepas de levadura con actividad alcohol deshidrogenasa/aldehído reductasa reducida
Se produjeron cepas de levadura que carecían de alcohol deshidrogenasa y/o aldehído reductasa en una cepa parental de levadura que era capaz de producir vainillina/beta-D-glucósido de vainillina. La cepa parental, EFSC2932, se creó integrando genes OMT, UGT y 3DSD exógenos en el genoma de la cepa EFSC2055 (genotipo: Mata his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0 adh6::LEU2 bgl1::KanMX4 PTPI1 ::3DSD[AurC]::(HsOMT::MET15[NatMX])::ACAR[HphMX]::UGT7 2E2ECM3::(CorPPTasa-ScHAP4). Los genes que codifican OMT, UGT y 3DSD se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores específicos de gen usando ADN polimerasa X7. Se construyeron vectores para la integración cromosómica de la expresión génica usando el método de clonación por reactivo de escisión específico de uracilo (USER) y un sistema de vector adaptado de Mikkelsen, et al. ((2012) Metab. Eng. 14:104-111). Los genes se fusionaron al promotor TEF1 de Ashbya gossypii y al promotor PGK1 de S. cerevisiae mediante clonación USER. Los constructos resultantes se integraron en las siguientes posiciones del cromosoma: XII-1 (pTEF1::HsOMT L198Y::pPGK::HsOMTDNA20), XII-2 (pTEF1 ::HsOMT L198Y pPGK::UGT72E2) y X-2 (pTEF1 ::HsOMT L198Y pPGK::Pa3DSD).
Los genes candidato que codifican alcohol deshidrogenasas o aldehído reductasas se seleccionaron y se desactivaron en diversas combinaciones. Se analizaron cultivos de cada inactivación usando HPLC-UV para cuantificar el glucósido de vainillina/glucósido de isovainillina y productos relacionados. El análisis de HPLC se llevó a cabo con un sistema AGILENT serie 1100 con bomba binaria y una columna Fenomenex Synergi Polar-RP 2,5 u 100 Á 100x2,00 mm, que separa los precursores y la isovainillina y la vainillina. Se ejecutó un gradiente plano con agua/acetonitrilo un 0,1% de ácido trifluoroacético. Se llevó a cabo un programa de 8,9 minutos ejecución posterior de 1,1 minutos tal como se presenta en la tabla 2.
TABLA 2
Figure imgf000013_0001
El glucósido de vainillina y el glucósido de isovainillina se cuantificaron integrando el área de los picos de HPLC y comparándolos con una curva estándar. Las combinaciones de genes alterados y el efecto resultante sobre la producción de alcohol vainillílico se proporcionan en la tabla 3.
TABLA 3
Figure imgf000014_0001
Este análisis indicó que, cuando se desactivaban, la combinación de adh6, adh7 y gre2 proporcionaba una disminución del 77% en la producción de alcohol vainillílico y de glucósido de alcohol vainillílico (véase la Figura 2).
Para analizar adicionalmente el efecto de aril, se delecionaron los genes arily gre2en la cepa EFSC2055 que contenía desactivaciones de los genes adh6 y adh7. La cepa EFSC2055 y las cepas de mutante individual (EFSC2055 gre2) y de mutante doble (EFSC 2055 gre2 aril) derivadas se cultivaron durante tres días en medios de melaza Delft (Delft 2% de glucosa 4% de melaza de caña) que contenían 3 mM de vainillina. Las cepas EFSC2055 y derivadas abarcan la UDP-glicosiltransferasa UGT72E2 que es capaz de glicosilar la vainillina y el alcohol vainillílico. La reducción de vainillina a alcohol vainillílico y glicósido de alcohol vainillílico se cuantificó mediante HPLC-UV. Como se muestra en la Figura 3, la deleción de gre2 sola redujo significativamente la formación de glicósido de alcohol vainillílico a partir de vainillina (prueba de la t, P<0,01). Sin embargo, la deleción doble tanto de gre2como de a ril en la cepa EFSC2055 eliminó completamente la formación de glicósido de alcohol vainillílico y redujo significativamente la formación de alcohol vainillílico (prueba de la t, P<0,01).
Dado el efecto observado de las deleciones de aril e YGL039W, se contempla que desactivar uno o ambos de estos genes en combinación con adh6, adh7 o gre2 (por ejemplo, adh6/adhHgre2/YGL039W; adh6/adhHgre2/ari1/YGL039W; adh6/gre2/aril; adh6/gre2/YGL039W; adh6/gre2/aril/YGL039W) también proporcionará una disminución en la producción de alcohol vainillílico y de glucósido de alcohol vainillílico.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1.- Un huésped recombinante que tiene las siguientes características:
(a) el huésped recombinante produce vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina;
(b) el huésped recombinante tiene, en comparación con un organismo de tipo silvestre, una producción o actividad reducida de:
(i) alcohol deshidrogenasa 6 (ADH6), aldehído reductasa intermedia 1 (ARI1) y aldehído reductasa YGL039W; (ii) ADH6, alcohol deshidrogenasa 7 (ADH7) y genes de respuesta al estrés 2 (GRE2);
(iii) ADH6, ADH7, GRE2 e YGL039W;
(iv) ADH6, ADH7, GRE2, ARI1 e YGL039W; o
(v) ADH6, GRE2, ARI1 e YGL039W;
siendo la producción o actividad reducida un resultado de la deleción de los genes que codifican las deshidrogenasas y reductasas anteriores; y
(c) el huésped recombinante es una célula de levadura recombinante y comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de O-metiltransferasa (OMT), un ácido nucleico que codifica un polipéptido de 3-deshidroshikimato deshidratasa (3DSD) y un ácido nucleico que codifica un polipéptido de uridina-5’-difosfoglucosil transferasa (UGT).
2. - El huésped recombinante según la reivindicación 1, en el que la célula huésped recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica un polipéptido de AROM, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de catecol-O-metiltransferasa (COMT), un ácido nucleico que codifica un polipéptido de ácido carboxílico aromático reductasa (ACAR), un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fosfopanteteína transferasa (PPTasa) y/o un ácido nucleico que codifica una alcohol vainillílico oxidasa (VAO).
3. - El huésped recombinante según la reivindicación 1 o 2, en el que la célula de levadura recombinante es un miembro del género Saccharomyces.
4. - El huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula de levadura recombinante es Saccharomyces cerevisiae.
5. - Un método para producir vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina que comprende:
(a) proporcionar el huésped recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
(b) cultivar dicho huésped recombinante durante un tiempo suficiente para que dicho huésped recombinante produzca vainillina y/o glucósido de vainillina; y
(c) aislar vainillina y/o glucósido de vainillina a partir de dicho huésped recombinante o a partir del sobrenadante de cultivo, produciendo de ese modo vainillina y/o beta-D-glucósido de vainillina.
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