JP6576247B2 - 組み換え宿主におけるステビオールグリコシドの効率的生産 - Google Patents
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Description
本出願は2013年2月11日出願の米国仮出願第61/763,290号および2013年2月11日出願の米国仮出願第61/763,308号の利益を主張する。それらの各開示は参照によって組み込まれる。
本開示はステビオールグリコシドの組み換え生産とその単離方法とに関する。特に、本開示は、組み換え微生物などの組み換え宿主によるステビオールグリコシド(レバウジオシドA(RebA)、レバウジオシドB(RebB)、レバウジオシドD(RebD)、レバウジオシドE(RebE)およびレバウジオシドM(RebM)など)の生産に関する。本開示は、かかるステビオールグリコシドの生産、排出または両方を増大させるための組み換え宿主の輸送系の改変にも関する。
甘味料は、食品、飲料または製菓産業によって最も一般的に用いられる成分として周知である。甘味料は生産中の最終的な食品中に組み込まれ得、または、適当に希釈されて卓上甘味料もしくはパン焼きの砂糖の家庭代用品として単独使用向けであり得る。甘味料は、天然甘味料(ショ糖、高果糖コーンシロップ、糖蜜、メープルシロップおよび蜂蜜など)および人工甘味料(アスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースなど)を含む。ステビア抽出物は天然甘味料であり、多年生低木のStevia rebaudianaから単離および抽出され得る。ステビアは、一般に、南アメリカおよびアジアで、ステビア抽出物の商業生産用に栽培されている。ステビア抽出物は様々な程度に精製され、食品の強力な甘味料として、さらにブレンドまたは単独で卓上用甘味料として商業利用されている。
本出願は、ステビオールグリコシドの排出に関わる組み換え宿主の輸送系の改変によって、ステビオールグリコシド組成物を効率的に生産するために用いられ得る材料および方法を記載する。いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え宿主は、少なくとも1つのステビオールグリコシドを生産し、抗生物質を能動的に排出する輸送体などの異種輸送体を発現できる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え宿主は少なくとも1つのステビオールグリコシドを生産し、内在性の輸送体遺伝子の発現が宿主内において改変されており、および/または、転写因子遺伝子の発現が改変されており、転写因子は少なくとも1つの内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する。抗生物質を能動的に分泌する内在性の輸送体の発現を改変することは、特に有用である。いくつかの態様において、内在性の輸送体遺伝子、転写因子遺伝子または両方の複数の発現が改変される。かかる組み換え宿主は、その発現がレバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドD、レバウジオシドEまたはレバウジオシドMなどのステビオールグリコシドの生産をもたらす1つまたは2つ以上の生合成遺伝子を含み得る。かかる生合成遺伝子は、13−モノグルコシドβ−1,2−グリコシルトランスフェラーゼおよび/または19−モノグルコシドβ−1,2−グルコシルトランスフェラーゼ(例えば91D2eおよびEUGT11)および他のUDPグリコシルトランスフェラーゼ(例えばUGT74G1、UGT76G1および/またはUGT85C2)を含んでおり、組み換え宿主によるステビオールグリコシドの生産を可能にする。
(a) スクロース輸送体およびスクロースシンターゼをコードする1つまたは2つ以上の組み換え遺伝子;
(b) GGPPSポリペプチドをコードする核酸;
(c) ent−コパリル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸;
(d) カウレンシンターゼ(KS)ポリペプチドをコードする核酸;
(e) カウレンオキシダーゼ(KO)ポリペプチドをコードする核酸;
(f) ステビオールシンターゼ(KAH)ポリペプチドをコードする核酸;
(g) シトクロムP450レダクターゼ(CPR)ポリペプチドをコードする核酸;および、さらに適切な組み合わせで、
(h) UGT85C2ポリペプチドをコードする核酸;
(i) UGT76G1ポリペプチドをコードする核酸;
(j) UGT74G1ポリペプチドをコードする核酸;
(k) UGT91D2ポリペプチドをコードする核酸;または
(l) EUGT11ポリペプチドをコードする核酸。
別段の定めがない限り、本明細書に用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は本発明を実施するために用いられ得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書で挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれる。矛盾がある場合には、本明細書が、定義も含めて優先される。さらに、材料、方法および例は例示的に過ぎず、限定することは意図されていない。本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなる。出願人は、特許法の標準慣行に従って移行句「を含む」、「から本質的になる」、または「からなる」を用い、任意の開示される発明を択一的にクレームする権利を有する。
A.ステビオール生合成ポリペプチド
異種輸送体および/もしくは転写因子の遺伝子を発現すること、または、上記の内在性の輸送体遺伝子の発現を改変することに加えて、本明細書に記載の宿主は、イソプレノイド前駆体からステビオールへの変換に関与する遺伝子産物を含有および発現する。
上記の輸送変異に加えて、本明細書に記載の宿主細胞はステビオールをステビオールグリコシドに変換できる。かかる宿主(例えば微生物)は、1つまたは2つ以上のUDPグリコシルトランスフェラーゼ(UGTとしても知られる)をコードする遺伝子を含有する。UGTは、活性化した糖ヌクレオチドの単糖ユニットをアクセプター部分(この場合、ステビオールの−OHまたは−COOH部分、ステビオールグリコシドのグルコース部分またはステビオール誘導体)に転移させる。UGTは配列相同性に基づいて種々のファミリーおよびサブファミリーに分類されている。Li et al. J. Biol. Chem. 276:4338-4343 (2001)。
ルブソシドの生合成はステビオールの13−OHおよび19−COOHのグリコシル化を必要とする。図1参照。微生物などの組み換え宿主によるステビオールからルブソシドへの変換は、UGTの85C2および74G1をコードする遺伝子(単数または複数)の発現によって達成され得、それらはそれぞれグルコースユニットをステビオールの13−OHまたは19−COOHに転移させる。
レバウジオシドAの生合成はアグリコンのステビオールのグルコシル化を必要とする。具体的には、レバウジオシドAは、13−O−ステビオールモノシドを生成するステビオールの13−OHのグルコシル化、ステビオール−1,2−ビオシドを生成するステビオールモノシドの13−O−グルコースのC−2’のグルコシル化、ステビオシドを生成するステビオール−1,2−ビオシドのC−19カルボキシルのグルコシル化、および、ステビオシドのC−13−O−グルコースのC−3’のグルコシル化によって生成し得る。各グルコシル化反応が起こる順序は様々であり得る。図1参照。
組み換え宿主によるステビオールからレバウジオシドMへの変換は、次の機能的なUGTの組み合わせを発現することによって達成され得る:91D2、EUGT11、74G1、85C2および76G1。図1参照。多コピー数プラスミドを用いること、または、強力なプロモーターもしくは遺伝子の複数のインテグレーションコピーもしくは遺伝子の高コピー数の選択を受けるエピソームを用いることによって、高レベルでEUGT11を発現することは特に有用である。したがって、これらのUGTの組み合わせを発現する組み換え微生物は、レバウジオシドA(85C2、76G1、74G1、91D2e)、レバウジオシドD(85C2、76G1、74G1、91D2e、EUGT11)、レバウジオシドE(85C2、74G1、91D2e、EUGT11)またはレバウジオシドM(85C2、76G1、74G1、91D2e、EUGT11)を生産し得る。図1参照。通常は、それらの遺伝子の1つまたは2つ以上は、それらを天然には有さない微生物に形質転換された組み換え遺伝子である。本明細書でSM12UGTと呼ぶUGTがUGT91D2の代用となり得るということも発見された。
その発現がステビオールまたはステビオールグリコシドのより効率的またはより大規模な生産を容易にするさらなるポリペプチドの遺伝子も、組み換え宿主内に導入され得る。例えば、組み換え微生物は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ(GGPPS。GGDPSとも呼ばれる)をコードする1つまたは2つ以上の遺伝子も含有し得る。別の例としては、組み換え宿主は、ラムノースシンテターゼをコードする1つまたは2つ以上の遺伝子またはUDP−グルコースデヒドロゲナーゼおよび/もしくはUDP−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする1つまたは2つ以上の遺伝子を有し得る。別の例として、組み換え宿主は、シトクロムP450レダクターゼ(CPR)をコードする1つまたは2つ以上の遺伝子をも有し得る。組み換えCPRの発現は、NADP+の回転を容易にして、NADPH(これはテルペノイド生合成のコファクターとして利用される)を再生する。NADHPレベルを再生するためには他の方法も用いられ得る。NADPHが制限要因となる状況では、株は外来性のトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含むようにさらに改変され得る。例えばSauer et al. J. Biol. Chem. 279: 6613-6619 (2004) 参照。所望のコファクターレベルが増大するようにNADH/NADPHの比を減少させるまたは改変するための他の方法は、当業者にとって公知である。
いくつかの態様において、組み換え宿主は、イソプレノイド生合成のためにメチルエリトリトール−4−リン酸(MEP)経路に含まれる酵素をコードする1つまたは2つ以上の遺伝子を含有する。MEP経路の酵素は、デオキシキシルロース−5−リン酸シンターゼ(DXS)、D−1−デオキシキシルロース−5−リン酸レダクトイソメラーゼ(DXR)、4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリトリトールシンターゼ(CMS)、4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリトリトールキナーゼ(CMK)、4−ジホスホシチジル−2−C−メチル−D−エリトリトール2,4−シクロ二リン酸シンターゼ(MCS)、1−ヒドロキシ−2−メチル−2(E)−ブテニル−4−二リン酸シンターゼ(HDS)および1−ヒドロキシ−2−メチル−2(E)−ブテニル−4−二リン酸レダクターゼ(HDR)を含む。1つまたは2つ以上のDXS遺伝子、DXR遺伝子、CMS遺伝子、CMK遺伝子、MCS遺伝子、HDS遺伝子および/またはHDR遺伝子が組み換え微生物内に組み込まれ得る。Rodriguez-Concepcion and Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002) 参照。
いくつかの態様において、組み換え宿主は、イソプレノイド生合成のためにメバロン酸経路に含まれる酵素をコードする1つまたは2つ以上の遺伝子を含有する。宿主の形質転換に適した遺伝子は、メバロン酸経路の酵素、例えば末端欠失3−ヒドロキシ−3−メチル-グルタリル(HMG)−CoAレダクターゼ(tHMG)、および/またはメバロン酸キナーゼ(MK)をコードする遺伝子、および/またはホスホメバロン酸キナーゼ(PMK)をコードする遺伝子、および/またはメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ(MPPD)をコードする遺伝子をコードする。したがって、1つまたは2つ以上のHMG−CoAレダクターゼ遺伝子、MK遺伝子、PMK遺伝子、および/またはMPPD遺伝子が微生物などの組み換え宿主内に取り込まれ得る。
スクロースシンターゼ(SUS)は、UDP−糖を生成するためのツールとして用いられ得る。SUS(EC2.4.1.13)は、UDP−グルコースおよび果糖のスクロースおよびUDPからの生成を触媒する。そのようにしてUGTの反応によって生成したUDPは、スクロース存在下においてUDP−グルコースに変換され得る。例えば、Chen et al. (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:8866-8867、Shao et al. (2003) Appl. Env. Microbiol. 69:5238-5242、Masada et al. (2007) FEBS Lett. 581: 2562-2566およびSon et al. (2009) J. Microbiol. Biotechnol. 19:709-712参照。
内在性のスクアレンシンターゼ遺伝子の発現は、本明細書に記載の組み換え宿主内にあって改変され得、例えば、スクアレンシンターゼをコードする遺伝子のプロモーターまたはスクアレンシンターゼをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)の5’末端のゲノム配列の一部に対してそれぞれ相同な、2つの領域を含有する核酸構築物を用いる。酵母では、例えば、かかる構築物は、ERG9プロモーターまたはERG9オープンリーディングフレームの5’末端のゲノム配列の一部に対してそれぞれ相同な2つの領域を含有し得る。構築物は、酵母の野生型ScKex2または野生型ScCyc1などのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、その3’末端にヘアピンなどの異種挿入物をさらに含み得る。ORFによってコードされるポリペプチドは、少なくとも70%の同一性をスクアレンシンターゼ(EC2.5.1.21)またはその生物活性断片に対して有し、この断片は少なくとも100アミノ酸の重ね合わせの範囲において少なくとも70%の配列同一性をスクアレンシンターゼに対して有する。例えばPCT/US2012/050021参照。
−X1−X2−X3−X4−X5
を有する。
X2は少なくとも4個の連続したヌクレオチドを含み、これはX4の少なくとも4個の連続したヌクレオチドに対して相補的であり、X4と一緒になってヘアピン2次構造エレメントを形成する。X3は任意であるが、存在する場合には、X2とX4との間にヘアピンループを形成することに関与するヌクレオチドを含む。
X4は、例えば4〜25ヌクレオチドの範囲、例えば4〜20、4〜15、6〜12、8〜12または9〜11ヌクレオチドの範囲からなり得る。
X3は不在であり得る。すなわちX3は0個のヌクレオチドからなり得る。X3が1〜5ヌクレオチドの範囲、例えば1〜3ヌクレオチドの範囲からなることも可能である。
X5は不在であり得る。すなわち、X5は0個のヌクレオチドからなり得る。X5が1〜5ヌクレオチドの範囲、例えば1〜3ヌクレオチドの範囲からなることも可能である。
いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え酵母宿主はERG9[Δ]::HIS3欠失/挿入アレルを含有する。
本明細書に記載のポリペプチドの機能的なホモログも、組み換え宿主によってステビオールまたはステビオールグリコシドを生産する際の使用に好適である。機能的なホモログは、参照ポリペプチドに対する配列類似性を有し、且つ参照ポリペプチドの生化学的または生理的機能(単数または複数)の1つまたは2つ以上を果たすポリペプチドである。機能的なホモログおよび参照ポリペプチドは天然に存在するポリペプチドであり得、配列類似性は収斂または分岐進化イベントに起因し得る。したがって、機能的なホモログは、文献中、ホモログもしくはオルソログまたはパラログと呼ばれることもある。天然に存在する機能的なホモログのバリアント(例えば、野生型のコード配列の変異体によってコードされるポリペプチド)は、それら自体が機能的なホモログとなり得る。機能的なホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異導入によって、または異なる天然に存在するポリペプチド同士のコード配列に由来するドメインを組み合わせることによって、作製され得る(「ドメインスワッピング」)。本明細書に記載の機能的なUGTポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は公知であり、特に指向性進化技術、部位特異的変異導入技術およびランダム変異導入技術を含み、望ましくポリペプチドの特異的活性を増大させる、基質特異性を改変する、発現レベルを改変する、細胞内局在部位を改変する、または、ポリペプチド間相互作用を改変する、ために有用であり得る。かかる改変ポリペプチドは機能的なホモログと考えられる。用語「機能的なホモログ」は場合によっては機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、そのポリペプチドを発現するのに好適な1つまたは2つ以上の制御領域とセンスの向きに作動可能に連結されたそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物はポリシストロニックmRNAから複数の遺伝子産物を発現できるので、複数のポリペプチドが必要に応じてそれらの微生物では1つの制御領域の制御下で発現され得る。コード配列および制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように制御領域およびコード配列が位置する場合に、作動可能に連結されていると見なされる。通常は、コード配列の翻訳の読み枠の翻訳開始部位はモノシストロニック遺伝子の制御領域の1〜約50ヌクレオチド下流に位置する。
本願は、内在性の輸送体遺伝子の発現が改変されたまたは異種輸送体遺伝子が発現された組み換え宿主細胞に関する。いくつかの態様において、内在性のプロモーターを異なるプロモーターによって置換することによって内在性の輸送体の発現が改変されて、輸送体蛋白質の増大した発現をもたらし得る(例えば発現の少なくとも5%の増大、例えば発現の少なくとも10%、15%、20%または25%の増大)。例えば、内在性のプロモーターが構成的または誘導性プロモーターによって置換されて、これが輸送体の増大した発現をもたらし得る。輸送体の増大した発現をもたらす別のプロモーターによって内在性の遺伝子のプロモーターを置換するために、相同組み換えが用いられ得る。別の態様において、誘導性または構成的プロモーターと内在性の輸送体または転写因子遺伝子とが、相同組み換えを用いてゲノムの異なる遺伝子座にインテグレーションされ得る。別の態様において、微生物による輸送体の過剰発現をもたらすプロモーターを有する外来性のプラスミドを用いて、微生物内に輸送体遺伝子が導入され得る。さらに別の態様において、外来性のプラスミドは輸送体遺伝子の複数コピーを含有し得る。さらなる態様において、内在性の輸送体は、組み換え微生物の天然の機構を用いて過剰発現されるように誘導され得る(例えば熱ショック、ストレス、重金属または抗生物質の曝露)。例えば、オリゴマイシンおよび/またはカドミウムが培養培地に添加されて(YOR1の発現がこれらの分子によって誘導され得る)、YOR1の発現を増大させ、それによってステビオールグリコシドの排出を増大させ得る。例えば、Hallstrom & Moye-Rowley (1998) JBC 273(4): 2098-104、Nagy et al, (2006) Biochimie. 88(11): 1665-71およびKatzmann et al., (1995) Mol Cell Biol. 15(12):6875-83を参照。
転写因子の発現の改変も、輸送体の発現を増大させるために用いられ得る。例えば、酵母の転写因子PDRlおよび/またはPDR3は、ABC輸送体PDR5、SNQ2、およびYOR1をコードする遺伝子の発現を制御する。したがって、いくつかの態様において、内在性のPDR1およびPDR3遺伝子座のプロモーターが異なるプロモーターによって置換されて、転写因子の増大した発現をもたらし得る。これは、内在性の輸送体の増大した生産をもたらし得る。別の態様において、微生物による転写因子の過剰発現をもたらすプロモーターを有する外来性のプラスミドを用いて、転写因子が微生物内に導入され得る。さらに別の態様において、外来性のプラスミドは転写因子の複数コピーも有し得る。さらなる態様において、内在性の転写因子は、組み換え微生物の天然の機構を用いて活性化または過剰発現誘導され得る(例えば熱ショック、ストレス、重金属または抗生物質の曝露)。
ステビオール経路中間体の排出を変化させる遺伝子を同定するための方法が本明細書に開示される。かかる方法は、少なくとも1つの内在性の輸送体遺伝子を不活性化すること、または少なくとも1つの輸送体遺伝子の発現を改変することを含み得る。通常は変異体微生物のライブラリーが調製され、ライブラリーの各変異体は別々の内在性の輸送体遺伝子を不活性化されている。いくつかの態様において、別の内在性の輸送体遺伝子の発現がライブラリーの各微生物について改変される。改変が加えられる元の微生物はステビオールグリコシド経路遺伝子を欠いており得るが、必要ならばかかる遺伝子の1つまたは2つ以上を含み得る。通常は、ステビオールグリコシド経路遺伝子の非存在下において改変を加え、所望の種々の標的グリコシド産物の生産を容易にする経路遺伝子を次に導入することがより便利である。1つまたは2つ以上のステビオールグリコシド経路遺伝子を含有する変異体微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドが合成される条件の培地によって培養され、微生物によって生産された細胞外および/または細胞内のステビオールグリコシド経路の中間体の量は本明細書に記載のように(例えばLC-MSを用いて)測定される。
本願は、1つまたは2つ以上の不活性化された内在性の輸送体遺伝子を含む組み換え宿主に関し得る。内在性の輸送体遺伝子は、通常は、遺伝子の発現を破壊すること、または、変異を有する宿主の輸送体活性を減少させるかもしくはさらには完全に排除する変異を導入すること(例えば1つまたは2つ以上の内在性の輸送体遺伝子の破壊)によって不活性化される。その結果として、宿主は破壊された遺伝子によってコードされる輸送体について輸送体の減少した発現または活性を有する。
転写因子の発現の改変も、輸送体の発現を減少させるまたは排除するために用いられ得る。例えば、酵母の転写因子PDR1および/またはPDR3は、ABC輸送体PDR5、SNQ2およびYOR1をコードする遺伝子の発現を制御する。PDR1および/またはPDR3の遺伝子座を破壊することまたは発現を減少させることは、ステビオールグリコシド中間体の排出の検出可能な減少をもたらし得る。したがって、いくつかの態様において、酵母宿主が、不活性化された内在性のPDR1およびPDR3遺伝子座を複数の不活性化された輸送体遺伝子と一緒に含有しており、いずれか1つの輸送体または転写因子の不活性化によって提供されるものよりも中間体の排出の大きな減少を提供する。別の態様において、転写因子を破壊することまたはその発現を減少させることによってステビオールグリコシドの排出を減少させるものと同定された転写因子が、ステビオールグリコシドの排出を増大させるために組み換え微生物によって過剰発現され得る。
ステビオール経路中間体の排出を変化させる遺伝子を同定するための方法が本明細書に開示される。かかる方法は、少なくとも1つの内在性の輸送体遺伝子を不活性化すること、破壊すること、または、その発現を減少させることを含む。通常は変異体微生物のライブラリーが調製され、ライブラリーの各変異体は、不活性化された、破壊された、または、減少した発現を有する別々の内在性の輸送体遺伝子を有する。変異が引き起こされる元の微生物はステビオールグリコシド経路遺伝子を欠いており得るが、かかる遺伝子の1つまたは2つ以上を有し得る。通常は、ステビオールグリコシド経路遺伝子の非存在下において変異を発生させ、所望の種々の標的グリコシド産物の生産を容易にする経路遺伝子を次に導入することが便利である。1つまたは2つ以上のステビオールグリコシド経路遺伝子を含有する変異体微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドが合成される条件の培地によって培養され得、微生物によって生産された細胞外および/または細胞内のステビオールグリコシド経路の中間体の量が測定され得る。
いくつもの原核生物および真核生物が、本明細書に記載の組み換え微生物を構築する際の使用に好適である(例えば、グラム陰性細菌、酵母および真菌)。ステビオールまたはステビオールグリコシドの生産株としての使用に選ばれた種および株が、どの生産遺伝子が株にとって内在性であるのか、どの遺伝子が存在しないのかを確認するために先ず分析された。内在性の相当物が株内に存在しない遺伝子は組み立てられて1つまたは2つ以上の組み換え構築物にされ、欠けている機能(単数または複数)を補うために次にその株に形質転換された。
Saccharomyces cerevisiaeは合成生物学の汎用されるシャシー(chassis)生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして用いられ得る。変異体、プラスミド、代謝の詳しいコンピューターモデルおよび他の情報のライブラリーがS.cerevisiaeに関して利用可能であり、産物収量を向上させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。組み換え微生物を作るための方法は公知である。ステビオール生合成遺伝子クラスターが、酵母(特にSaccharomycetes)によって、いくつもの公知のプロモーターのいずれのものも用いて発現され得る。テルペンを過剰生産する株が公知であり、ステビオールおよびステビオールグリコシドの生産に利用可能なゲラニルゲラニル二リン酸の量を増大させるために用いられ得る。Saccharomyces cerevisiaeは例示的なSaccharomyces種である。
A.oryzae、A.nigerおよびA.sojaeなどのAspergillus種は食品生産に広く用いられる微生物であり、組み換え微生物プラットフォームとしても用いられ得る。A.nidulans、A.fumigatus、A.oryzae、A.clavatus、A.flavus、A.nigerおよびA.terreusのゲノムについてはヌクレオチド配列が入手可能であり、フラックスを増強して産物収量を増大させるための内在性の経路の合理的設計および改変を可能にする。Aspergillusでは代謝モデルならびにトランスクリプトーム解析およびプロテオミクス研究が進展している。A.nigerはクエン酸およびグルコン酸などのいくつもの食品成分の商業生産用に培養されている。したがって、A.nigerなどの種はステビオールおよびステビオールグリコシドなどの食品成分の生産に通常は好適である。
Escherichia coliは合成生物学のもう1つの汎用されるプラットフォーム生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして同じく用いられ得る。Saccharomycesと同様に、変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報のライブラリーがE.coliに関して利用可能であり、産物収量を向上させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。Saccharomycesに関する上記のものと同様の方法が、組み換えE.coli微生物を作るために用いられ得る。
Agaricus、GibberellaおよびPhanerochaete spp.は培養によって大量のジベレリンを生産することが公知であるので、有用であり得る。すなわち、大量のステビオールおよびステビオールグリコシドを生産するためのテルペン前駆体が内在性の遺伝子によって予め生産されている。したがって、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの組み換え遺伝子を含有するモジュールは、メバロン酸またはMEP経路遺伝子を導入する必要なしに、かかる属の種に導入され得る。
Arxula adeninivoransは二形性酵母であり(42℃の温度以下ではパン酵母のように出芽酵母として増殖し、この閾値を超えると糸状形態で増殖する)、際立った生化学的特質を有する。様々な基質を利用して増殖でき、硝酸塩を資化できる。天然プラスチックを生産できる株の作製または環境試料中のエストロゲンのバイオセンサーの開発に、首尾よく応用されて来た。
Yarrowia lipolyticaは二形性酵母であり(Arxula adeninivorans参照)、様々な基質を利用して増殖できる。産業応用の高い可能性を有するが、組み換え産物は未だ市販されていない。
Rhodobacterは組み換え微生物プラットフォームとしての使用であり得る。E.coliと同様に、利用可能な変異体のライブラリーおよび適当なプラスミドベクターが存在しており、産物収量を向上させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。カロテノイドおよびCoQ10の増大した生産のために、Rhodobacterの多膜性の細菌種においてイソプレノイド経路が操作されている。米国特許公開公報第20050003474号および20040078846号参照。E.coliに関する上記のものと同様の方法が、組み換えRhodobacter微生物を作るために用いられ得る。
Candida boidiniiはメチロトローフ酵母である(メタノールによって増殖できる)。他のメチロトローフ種(例えばHansenula polymorphaおよびPichia pastoris)と同様に、異種蛋白質の生産用の優れたプラットフォームを提供する。排出される外来蛋白質の複数グラム範囲の収量が報告されている。計算手法のIPROは、Candida boidiniiキシロースレダクターゼのコファクター特異性をNADPHからNADHに実験的に切り換えた変異を最近になって予測した。
Hansenula polymorphaはもう1つのメチロトローフ酵母である(Candida boidinii参照)。さらに、様々な他の基質を利用して増殖でき、耐熱性であり、硝酸塩を資化できる(Kluyveromyces lactisも参照)。これは、B型肝炎ワクチン、C型肝炎の治療用のインスリンおよびインターフェロンα−2a、さらには様々な工業用酵素の生産に利用されて来た。
Kluyveromyces lactisはケフィアの生産に通常用いられる酵母である。いくつかの糖、最も重要には乳糖(これは牛乳およびホエイ中に存在する)を用いて増殖できる。特にチーズ生産用のキモシン(子牛の胃に通常存在する酵素)の生産に首尾よく応用されて来た。生産は40,000L規模の発酵槽内で行われる。
Pichia pastorisはメチロトローフ酵母である(Candida boidiniiおよびHansenula polymorpha参照)。外来蛋白質の生産用の効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォームの種々の要素はキットとして入手可能であり、蛋白質の生産用に学会では世界的に用いられている。複雑なヒトN−グリカンを生産できる株が設計されている(酵母のグリカンはヒトで見出されるものと類似であるが、同一ではない)。
Physcomitrella苔は、懸濁培養によって増殖させた場合には、酵母または他の真菌培養物と類似の性質を有する。この属は、他の種類の細胞では生産することが困難であり得る植物の2次代謝産物の生産用に、重要な種類の細胞となりつつある。
本明細書に記載の組み換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドを生産するための方法に用いられ得る。例えば、方法は、ステビオールおよび/またはステビオールグリコシド生合成遺伝子が発現される条件の培養培地中で組み換え微生物を増殖させることを含み得る。組み換え微生物は流加式または連続式プロセスによって増殖させられ得る。通常は、組み換え微生物は発酵槽内において所定の温度で所望の時間(単数または複数)増殖させられる。方法に用いられる具体的な微生物に応じて、他の組み換え遺伝子、例えばイソペンテニル生合成遺伝子およびテルペンシンターゼおよびシクラーゼ遺伝子も存在して発現され得る。基質および中間体、例えばイソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、カウレンおよびカウレン酸のレベルは、培養培地から試料を抽出して公開された方法による分析に供することによって測定され得る。
本明細書に開示の方法によって得られるステビオールグリコシドおよび組成物は、食品、ダイエタリー・サプリメントおよび甘味料組成物を作るために用いられ得る。例えば、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシド、例えばレバウジオシドAまたはレバウジオシドDは、アイスクリーム、炭酸飲料、フルーツジュース、ヨーグルト、焼き物、チューインガム、ハードおよびソフトキャンディならびにソースなどの食品中に含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、医薬品、薬用製品、ダイエタリー・サプリメントおよび栄養補助剤などの非食品の製品中にも含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、農産業およびペット産業向けの動物用飼料中にも含まれ得る。または、ステビオールおよび/またはステビオールグリコシドの混合物が作られ得、それぞれが特定のステビオールまたはステビオールグリコシドを生産する組み換え微生物を個別に培養することと、ステビオールまたはステビオールグリコシドを実質的に純粋な状態で各微生物から回収することと、次にそれらの化合物を組み合わせて所望の割合で各化合物を含有する混合物を得ることとによって作られ得る。本明細書に記載の組み換え微生物は、現行のステビア産物と比較してより精密で一貫した混合物が得られることを可能にする。もう1つの代替では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドが、食品中に他の甘味料(例えばサッカリン、ブドウ糖、スクロース、果糖、エリトリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチンまたはアセスルファムカリウム)と一緒に組み込まれ得る。ステビオールまたはステビオールグリコシドの他の甘味料に対する重量比は、最終的な食品の十分な風味を達成するように適宜変更され得る。例えば米国特許公開公報第2007/0128311号参照。いくつかの態様において、ステビオールまたはステビオールグリコシドは、香味調節剤としての香味(例えば柑橘系)を加えられ得る。
例1.LC−MS分析の手順
LC−MS分析は、Ultimate 3000 UPLCシステム(Dionex)を用いて行った。Waters Acquity UPLC(登録商標)BEHシールドRP18カラム(2.1×50mm、1.7μm粒子、130Å細孔径)が取り付けられており、これは加熱エレクトロスプレーイオン(HESI)源を備えたTSQ Quantum Access(ThermoFisher Scientific)トリプル四重極型(triple quadropole)質量分析計に接続されている(別段の定めがある場合を除く)。溶出は、溶出剤B(0.1%ギ酸を含むMeCN)および溶出剤A(0.1%ギ酸を含む水)の移動相を用いて、勾配を25%から47%Bまで増大させ(min.0.0〜4.0)、47%から100%Bまで増大させ(min.4.0〜5.0)、100%Bをmin.5.0から6.5の再平衡化まで維持することによって実施した。流速は0.4ml/min、カラム温度は35℃であった。ステビオールグリコシドはSIM(選択イオンモニタリング)を用いて次のm/z曲線で検出した。
A. 酵母株EFSC2772を、3つの栄養要求性改変、すなわちURA3、LEU2およびHIS3の欠失を有する野生型Saccharomyces cerevisiae株から構築した。野生型株は、標準的な遺伝学的方法を用いて操作し得、通常の2倍体または1倍体酵母株として用い得る。EFSC2772は、4つのDNA構築物のゲノムインテグレーションによってステビオールグリコシド生産酵母に改造した。各構築物は複数の遺伝子を含有し、それらを相同組み換えによって酵母ゲノム中に導入した。さらに、構築物1および2を相同組み換えによって組み立てた。
レバウジオシドを生産する酵母株は、上記例2ならびに国際出願第PCT/US2011/038967(WO/2011/153378)号およびPCT/US2012/050021(WO/2013/022989)号(両方ともその全体が本明細書においては参照によって組み込まれる)に記載されている。同様の株の振とうフラスコ研究による観察は、上清中のRebAの割合が経時的に増大するということを示唆した。この効果は細胞の溶解の結果ではないと確認された。Saccharomyces cerevisiaeのステビオールグリコシド排出に及ぼす種々の輸送体の影響を確認するために、輸送体遺伝子の内在性のプロモーターをTEF1構成的プロモーターに置換することによって、Saccharomyces cerevisiae株のライブラリーを構築した。
6つの推定上のS.rebaudiana RebA輸送体をパイロシークエンスデータから同定した。SrDTX24(配列番号150)、SrMRP1O(配列番号151)、SrPDR12(配列番号152)、SrMRP2(配列番号153)、SrMRP4a(配列番号154)およびSrMRP4b(配列番号155)である。推定上の輸送体のうちの5つ、SrDTX24、SrMRP1O、SrPDR12、SrMRP4aおよびSrMRP4bがさらなる解析用に選択し、クローニングした。クローニングされた輸送体配列は、安定なRebA生産S.cerevisiaeによって発現した。ステビオールグリコシド排出のレベルを測定し、図7に示す。
4重輸送体変異体酵母株の構築
レバウジオシドを生産する酵母株は、上記の例2ならびに国際出願第PCT/US2011/038967(WO/2011/153378)号およびPCT/US2012/050021(WO/2013/022989)号(両方とも本明細書においてはその全体が参照によって組み込まれる)に記載されている。同様の株の振とうフラスコ研究による観察は、分子の分子量が増大するにつれて減少するように見える効率でS.cerevisiae細胞からステビオールグリコシドが排出されるということを示唆した。種々の輸送体がS.cerevisiaeによるステビオールグリコシドの排出に及ぼす影響を確認するために、それぞれ内在性の輸送体の破壊を有するS.cerevisiae変異体のライブラリーを構築した。
上記の4重輸送体変異体の結果に基づき、7×輸送体破壊変異体(pdr15−pdr10−snq2−pdr5−tpo1−pdr1−pdr3)を作製した。pdr1およびpdr3の2重変異体をBY4741バックグラウンドで作製した。二重変異体を作製するのに用いたマーカーを次に除去した。所産の二重変異体を選択マーカー−欠失カセットによって形質転換した。カセットは、形質転換による相同組み換えを可能にする尾部としてTPO1外側配列を有するプライマーを用いて、PCRによって調製した。3重変異体pdr1−pdr3−tpo1を上記の4×破壊変異体(BY4742に基づく)と掛け合わせた。所産の胞子から、全ての7つの位置が破壊された株が見出された。遺伝子の破壊をPCRによって確認した。標的遺伝子を置換するカセットの場合には、遺伝子の破壊を確認するために上記のPCR戦略を用いた。pdr1およびpdr3遺伝子座については、各遺伝子の上流および下流の配列にアニーリングするように設計されたフォワードおよびリバースプライマーを用いて、破壊を確認した。PCR産物は全てのクローンで存在し、短いPCR産物が標的遺伝子の喪失を示した。
より高分子量のレバウジオシドの排出に酵母遺伝子のノックアウトが及ぼす影響を、例2に記載の酵母株EFSC3248によって試験した。染色体上の個々の輸送体遺伝子(PDR5、SNQ2、YOR1、YHK8およびFLR1)の破壊は、以前に記載のように相同組み換えによって実施した。96時間のインキュベーション(30℃、200rpm)後に細胞を回収した。培養物の100μL分取分を遠心し、同体積の100%DMSOを上清に添加した。混合物の80マイクロリットルを「上清」試料としてLC−MSによって分析した。100μLの100%DMSO中の細胞懸濁液の100マイクロリットルを、80℃で10分間加熱し、次に遠心した。混合物をボルテックスし、80℃で10分間加熱し、残骸を除くために遠心した。所産の溶液の40マイクロリットルを40μLのDMSO(50%)と混合し、試料を「全量」試料としてLC−MSによって分析した。培養上清中に排出された種々のステビオールグリコシドの量(RebA、RebB、RebD、RebM、ルブソシド、13−SMG、1.2ステビオシド、1.2ビオシドおよび不明なステビオールグリコシド(4.13min.のLC−MSピーク)を含む)および全培養液中の全量を、例1に記載のようにLC−MSによって測定した。そのデータは、1つの内在性の酵母輸送体遺伝子の破壊が、培養培地の上清中の種々のステビオールグリコシドの排出されるパーセンテージ(図13D〜F)または量(図13A〜C)の減少をもたらすということを実証している。具体的には、SNQ2、YOR1およびFLR1の破壊は、上清もしくは酵母株中に排出されるRebA、RebBおよびRebDの減少または酵母株のRebA、RebBおよびRebDの濃度の減少を、対照と比較してもたらした(図13A〜F参照。図13の対照は「EFSC3248」である)。
Claims (22)
- 細胞培養物中でステビオールグリコシドを生産することができる組み換え微生物であって、
微生物が、配列番号107、108、111、113、115、または122のいずれか1つで示されるアミノ酸配列に少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの内在性の輸送体遺伝子、および、少なくとも1つの前記内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する、配列番号104または105で示されるアミノ酸配列に少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの内在性の転写因子遺伝子の改変された発現を有し、ここで、前記内在性の輸送体遺伝子は、ATP結合カセット(ABC)輸送体またはMajor Facilitatorスーパーファミリー(MFS)輸送体をコードする、
改変された発現が、相当する未改変の微生物について観察される発現のレベルと比較して、配列番号104、115、または122のいずれか1つで示されるアミノ酸配列に少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の過剰発現、または、各遺伝子座を破壊することまたは欠失させることによる、配列番号105、107、108、111または113のいずれか1つで示されるアミノ酸配列に少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の減少した発現を含み、
および、微生物が、
(a) スクロース輸送体(SUC1)ポリペプチドおよびスクロースシンターゼ(SUS1)ポリペプチドをコードする1つまたは2つ以上の遺伝子、ここで、SUS1ポリペプチドが、配列番号78または80で示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(b) ファルネシル二リン酸(FPP)およびイソペンテニル二リン酸(IPP)からゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号43〜50のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(c) GGPPからent−コパリル二リン酸を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号33〜39のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(d) ent−コパリルピロリン酸からent−カウレンを合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号1〜6のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(e) ent−カウレンからent−カウレン酸を合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号7〜10のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(f) ent−カウレン酸からステビオールを合成できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号11〜19のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;および
(g) シトクロムP450複合体を還元できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号20、22、27または28のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
をさらに含み、および、
(h) ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13のヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号30または91で示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(i) ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコースまたは13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3−グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号85または89で示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(j) ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号29または88で示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;および
(k) ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコースまたは13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2−グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、遺伝子が、2つまたは3つ以上のコピー数を有し、およびここで、ポリペプチドが、配列番号51、54、55、86または90のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
をさらに含み、
少なくとも1つの前記遺伝子が組み換え遺伝子であり、および
ステビオールグリコシドが、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドD、レバウジオシドE、レバウジオシドMまたはそれらの組み合わせである、
前記組み換え微生物。 - 部分(a)〜(k)の少なくとも1つの遺伝子が、微生物における発現のためにコドン最適化されている、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 遺伝子が、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項2に記載の組み換え微生物。
- Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhousまたはCandida albicans種の酵母細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- Yarrowia lipolytica種の酵母細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 細胞培養物からステビオールグリコシドの排出を変化させる方法であって、遺伝子が発現される条件下で、請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物を増殖させることを含み、ここで、ステビオールグリコシドが微生物によって生産される、前記方法。
- 細胞培養物中でステビオールグリコシドを生産する方法であって、遺伝子が発現される条件下で、請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物を増殖させることを含み、ここで、増殖させることが、1つまたは2つ以上の遺伝子の発現を誘導すること、または、1つまたは2つ以上の遺伝子を構成的に発現することを含み、およびここで、ステビオールグリコシドが微生物によって生産される、前記方法。
- 請求項7に記載の方法であって、
(a) レバウジオシドAが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチド;ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され;
(b) レバウジオシドBが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され;
(c) レバウジオシドDが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチド;ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され;
(d) レバウジオシドEが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成され;および/または
(e) レバウジオシドMが、ステビオールの13−OHをグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチド;ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、
前記方法。 - レバウジオシドAが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチド;ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、請求項7に記載の方法。
- レバウジオシドDが、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13ヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチド;ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、請求項7に記載の方法。
- レバウジオシドMが、ステビオールの13−OHをグリコシル化できるポリペプチド;ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチド;ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチド;ならびに、ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを発現する微生物において合成される、請求項7に記載の方法。
- 微生物が、配列番号104、115、または122で示されるアミノ酸配列に少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を過剰発現する、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
- ステビオールグリコシドが、細胞培養物中に、少なくとも500mg/Lの濃度で生産される、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の組み換え微生物の細胞培養物中で、植物由来もしくは合成のステビオールまたはステビオールグリコシドの全細胞のバイオコンバージョンを含む、レバウジオシドMを生産する方法であって、
ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC2’をベータ1,2グリコシル化できるポリペプチドを使用し、ここで、ポリペプチドが、配列番号51、54、55、86または90のいずれか1つで示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含み、および、
(a) ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−13のヒドロキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号30または91で示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(b) ステビオールグリコシドの13−O−グルコース、19−O−グルコース、または、13−O−グルコースおよび19−O−グルコースの両方のC3’をベータ1,3グリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号85または89で示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
(c) ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC−19カルボキシル基でグリコシル化できるポリペプチドをコードする遺伝子、ここで、ポリペプチドが、配列番号29または88で示されるアミノ酸配列の1つに少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む;
の1つまたは2つ以上を使用し、
ここで、植物由来もしくは合成のステビオールまたはステビオールグリコシドが、ステビオール−13−O−グルコシド、ステビオール−19−O−グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、1,2−ビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドDもしくはレバウジオシドEまたはこれらの混合物を含む、
前記方法。 - 細胞培養物からレバウジオシドMを単独でまたは少なくとも1つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離することをさらに含む、請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項15に記載の方法であって、単離するステップが、細胞培養物の固相から細胞培養物の液相を分離して、レバウジオシドMを単独でまたは少なくとも1つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む上清を得ること、および
(a) 上清を、1つまたは2つ以上の吸着樹脂に接触させて、少なくとも一部のレバウジオシドMを単独でまたは少なくとも1つの他のステビオールグリコシドと一緒に得ること、または
(b) 上清を、1つまたは2つ以上のイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラムに接触させて、少なくとも一部のレバウジオシドMを単独でまたは少なくとも1つの他のステビオールグリコシドと一緒に得ること、または
(c) レバウジオシドMを単独でまたは少なくとも1つの他のステビオールグリコシドと一緒に結晶化または抽出すること、
それによって、レバウジオシドMを単独でまたは少なくとも1つの他のステビオールグリコシドと一緒に単離すること
を含む、前記方法。 - レバウジオシドMを単独でまたは少なくとも1つの他のステビオールグリコシドと一緒に含むステビオールグリコシド組成物を、細胞培養物から回収することをさらに含む、請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 回収されたステビオールグリコシド組成物が、ステビア草のステビオールグリコシド組成物と比較してレバウジオシドMについて濃縮され、および、植物由来ステビア抽出物から得られたステビオールグリコシド組成物と比較して、ステビア草由来成分の減少したレベルを有する、請求項17に記載の方法。
- 請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法であって、細胞培養物が、
(a) 組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド;
(b) グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸(UDP)−グルコース、UDP−ラムノース、UDP−キシロース、および/またはN−アセチル−グルコサミン;および/または
(c)微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原礎培地(YNB)、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素;
を含む、前記方法。 - 組み換え微生物が、発酵槽内においてある温度である期間増殖させられ、ここで温度および期間が、ステビオールグリコシド組成物の生産を容易にする、請求項6〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物を含む細胞培養物であって、
(a) 微生物によって生産されたステビオールグリコシド;
(b) グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸(UDP)−グルコース、UDP−ラムノース、UDP−キシロース、および/またはN−アセチル−グルコサミン;および
(c)微量金属、ビタミン、塩、YNB、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素;
をさらに含み、
ここで、ステビオールグリコシドが、細胞培養物の少なくとも1mg/リットルの濃度で存在する、
前記細胞培養物。 - 細胞培養物中で増殖させた請求項1〜5のいずれか一項に記載の組み換え微生物の細胞溶解物であって、
(a) 微生物によって生産されたステビオールグリコシド;
(b) グルコース、フルクトース、スクロース、キシロース、ラムノース、ウリジン二リン酸(UDP)−グルコース、UDP−ラムノース、UDP−キシロース、および/またはN−アセチル−グルコサミン;および
(c)微量金属、ビタミン、塩、YNB、および/またはアミノ酸を含む補助栄養素;
を含み、
ここで、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシドが、細胞培養物の少なくとも1mg/リットルの濃度で存在する、
前記細胞溶解物。
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