BR112015018872B1 - Método para produção de uma composição de glicosídeo de esteviol, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de rebaudiosídeo m, cultura de células, lisado de cultura de células e mistura reacional - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO APERFEIÇOADA DE REBAUDIOSÍDEO D E REBAUDIOSÍDEO M. Métodos para a produção recombinante de glicosídeo de esteviol e composições contendo glicosídeos de esteviol são fornecidos por esta invenção.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[001]A invenção divulgada aqui refere-se, geralmente, ao campo de produção recombinante de glicosídeos de esteviol. Particularmente, a invenção fornece métodos para a produção recombinante de glicosídeo de esteviol e composições contendo glicosídeos de esteviol.

Descrição da Técnica Relacionada

[002]Os adoçantes são bem conhecidos como ingredientes usados o mais comumente nas indústrias de alimento, bebida ou confeito. O adoçante pode ser incorporado em um produto alimentar final durante a produção ou para utilização autônoma, quando apropriadamente diluído ou como um adoçante de mesa. Os adoçantes incluem adoçantes naturais, tais como sacarose, xarope de milho de alta frutose, melaço, xarope de bordo e mel, e adoçantes artificiais tais como aspartame, sacarina e sucralose. Extrato de stévia é um adoçante natural que pode ser isolado e extraído a partir de um arbusto perene, Stevia rebaudiana. Stévia é comumente cultivada em América do Sul e Ásia para a produção comercial de extrato de stévia. Extrato de stévia, purificado a vários graus, é usado comercialmente como um adoçante de alta intensidade em alimentos e em misturas ou sozinho como um adoçante de mesa.

[003]Os extratos da planta Stévia contêm Rebaudiosídeos e outros glicosí- deos de esteviol que contribuem ao sabor doce, embora a quantidade de cada glico- sídeo frequentemente varia entre lotes de produção diferentes. Os produtos comerciais existentes são predominantemente Rebaudiosídeo A com quantidades menores de outros glicosídeos tais como Rebaudiosídeo C, D e F. Extratos de stévia também podem conter contaminantes tais como compostos derivado de planta que contribuem para off-flavors ou têm outros efeitos indesejáveis. Estes contaminantes podem ser mais ou menos problemáticos dependendo do sistema de alimentação ou aplicação de escolha. Contaminantes potenciais incluem pigmentos, lipídeos, proteínas, fenóli- cos, sacarídeos, espatulenol e outros sesquiterpenos, diterpenos labdanos, monoter- penos, ácido cáprico, ácido 8,11,14-eicosatrienóico, 2-metiloctadecano, pentacosano, octacosano, tetracosano, octadecanol, estigmasterol, beta-sitosterol, alfa- e beta-ami- rina, lupeol, acetato de beta-amirina, triterpenos pentacíclicos, centauredina, querci- tina, epi-alfa-cadinol, carofilenos e derivados, beta-pineno, beta-sitosterol, e gibere- lina.

[004]Como a recuperação e purificação de glicosídeos de esteviol a partir de planta Stévia provaram ser um trabalho intensivo e ineficiente, permanece uma necessidade de um sistema de produção recombinante que pode produzir altos rendimentos de glicosídeos desejados de esteviol tais como Rebaudiosídeo D e Rebaudi- osídeo M com menos contaminantes à base de planta, incluindo mas não limitados a esteviosídeo. As cepas Saccharomyces cerevisiae que produzem glicosídeo de este- viol, assim como bio-conversão e biossíntese in vitro são descritas em Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, que estão aqui incorporados como referência em sua totalidade.

[005]Na natureza, a uridina difosfato de Stévia dependente de glicosiltransfe- rase 76G1 (UGT76G1) catalisa várias reações de glicosilação na estrutura de esteviol, que leva à produção de glicosídeos de esteviol. Recentemente, mostrou-se que UGT76G1 pode converter 1,2-esteviosídeo a Rebaudiosídeo A e 1,2-biosídeo a Re- baudiosídeo B (veja, Richman et al., 2005, The Plant Journal 41: 56 - 67). Assim, há uma necessidade na técnica de identificar as reações dirigidas à produção de Rebau- diosídeos glicosilados por UGT76G1 ou outras enzimas UGT. Particularmente, há uma necessidade de explorar ou identificar outras reações catalisadas por UGT76G1 assim como uma necessidade de aumentar a capacidade catalítica de UGT76G1 de modo a produzir rendimentos mais elevados de glicosídeos de esteviol, tais como Re- baudiosídeo D e Rebaudiosídeo M.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006]Trata-se contra os fundamentos acima que a presente invenção fornece certas vantagens e avanços sobre a técnica anterior.

[007]Em particular, a invenção é dirigida à biossíntese de preparações de Re- baudiosídeo D e Rebaudiosídeo M e Rebaudiosídeo D e Rebaudiosídeo M de células geneticamente modificadas.

[008]Em formas de realização particulares, a invenção é dirigida às preparações de Rebaudiosídeo D e Rebaudiosídeo M de células geneticamente modificadas tendo taxas e redimentos de biossíntese significantemente melhorados.

[009]Esta divulgação refere-se à produção de glicosídeos de esteviol. Em particular, esta divulgação refere-se à produção de glicosídeos de esteviol incluindo Re- baudiosídeo M: (2S,3R,4S,5R,6R)-5-hidróxi-6-(hidroximetil)-3,4-bis({[(2S,3R,4S,5S,6R)- 3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroximetil)oxan-2-il]óxi})oxan-2-il (1R,5R,9S,13R)-13- {[(2S,3R,4S,5R,6R)-5-hidróxi-6-(hidroximetil)-3,4-bis({[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hi- dróxi-6-(hidroximetil)oxan-2-il]óxi})oxan-2-il]óxi}-5,9-dimetil-14-metilidenotetraci- clo[11,2,1,01,10,04,9]hexadecano-5-carboxilato e Rebaudiosídeo D: 4,5-di-hidróxi-6-(hidroximetil)-3-{[3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroximetil)oxan-2- il]óxi}oxan-2-il 13-{[5-hidróxi-6-(hidroximetil)-3,4-bis({[3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroximetil) oxan-2-il]óxi})oxan-2-il]óxi}-5,9-dimetil-14-metilidenotetraciclo[11,2,1,01,10,04,9] hexa- decano-5-carboxilato por meios não limitados àqueles hospedeiros recombinantes tais como microorganismos recombinantes, através da bioconversão, e in vitro.

[010]Assim, em um aspecto, a divulgação fornece um hospedeiro recombi- nante, por exemplo, um micro-organismo, compreendendo um ou mais genes biossin- téticos, em que a expressão de um ou mais genes biossintéticos resulta na produção de glicosídeos de esteviol incluindo Rebaudiosídeo M e Rebaudiosídeo D.

[011]Em particular, a expressão de uma ou mais uridina 5’-difosfo (UDP) gli- cosil transferases descritas aqui, tais como EUGT11, UGT74G1, UGT76G1, UGT85C2 e UGT91D2, facilitam a produção e acúmulo de Rebaudiosídeo M ou Re- baudiosídeo D em hospedeiros recombinantes ou certos sistemas in vitro.

[012]Embora esta invenção aqui divulgada não está limitada a funcionalidade ou vantagens específicas, a invenção fornece uma composição compreendendo de cerca de 1 % a cerca de 99 % p/p de Rebaudiosídeo M, em que a composição tem um nível reduzido de contaminantes derivados de stévia em relação a um extrato de stévia, em que, pelo menos, um dos ditos contaminantes é um composto derivado de planta. Em certos casos, o dito composto contaminante derivado de planta pode, inter alia, contribuir para off-flavors.

[013]Em alguns aspectos, a composição compreendendo de cerca de 1 % a cerca de 99 % p/p de Rebaudiosídeo M tem menos do que 0,1 % de contaminantes derivados de stévia em relação a um extrato de stévia, em que, pelo menos, um dos ditos contaminantes é um composto derivado de planta. Em certos casos, o dito composto contaminante derivado de planta pode, inter alia, contribuir para off-flavors.

[014]A invenção fornece ainda um produto alimentar compreendendo a composição como descrito acima.

[015]Em alguns aspectos, o produto alimentar é uma bebida ou um concentrado de bebida.

[016]A invenção fornece ainda uma célula hospedeira recombinante que expressa: (a) um gene recombinante que codifica um GGPPS; (b) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo ent-copalil difosfato sintase (CDPS); (c) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno oxidase (KO); (d) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno sintase (KS); (e) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo esteviol sintase (KAH); (f) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo citocromo P450 redu- tase (CPR); (g) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT85C2; (h) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT74G1; (i) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1; (j) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT91d2; e (k) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo EUGT11; em que, pelo menos, um dos ditos genes é um gene recombinante e, em que a célula produz Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q e/ou Rebau- diosídeo I. (l) 7]A invenção fornece ainda uma célula hospedeira recombinante compreendendo ácidos nucleicos exógenos compreendendo: (a) um gene recombinante que codifica um GGPPS; (b) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo ent-copalil difosfato sintase (CDPS); (c) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno oxidase (KO); (d) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno sintase (KS); (e) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo esteviol sintase (KAH); (f) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo citocromo P450 redu- tase (CPR); (g) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT85C2; (h) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT74G1; (i) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1; (j) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT91d2; e (k) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo EUGT11; em que a célula produz Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q e/ou Rebaudiosídeo I.

[017] A invenção fornece ainda uma célula hospedeira recombinante compreendendo ácidos nucleicos exógenos compreendendo: (a) um gene recombinante que codifica um GGPPS; (b) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo ent-copalil difosfato sintase (CDPS); (c) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno oxidase (KO); (d) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno sintase (KS); (e) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo esteviol sintase (KAH); (f) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo citocromo P450 redutase (CPR); (g) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT85C2; (h) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT74G1; (i) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1; (j) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT91d2; e (k) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo EUGT11; em que a célula produz Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q e/ou Rebaudiosídeo I.

[018]A invenção fornece ainda uma célula hospedeira recombinante que expressa um GGPPS, um polipeptídeo ent-copalil difosfato sintase (CDPS), um polipep- tídeo caureno oxidase (KO), um polipeptídeo caureno sintase (KS); um polipeptídeo esteviol sintase (KAH), um polipeptídeo citocromo P450 redutase (CPR), um polipep- tídeo UGT74G1, um polipeptídeo UGT76G1, um polipeptídeo UGT91d2, e um poli- peptídeo EUGT11, em que, pelo menos, um dos ditos polipeptídeos é codificado por um gene exógeno ou heterólogo tendo sido introduzido na dita célula; em que a célula produz um glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hi- dróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) ou um gli- cosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β- D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]).

[019]Em algumas formas de realização, a produção alvo de Rebaudiosídeos individuais pode ser realizada controlando os níveis relativos de atividades de UDP- glicosil transferase (veja, Figura 1).

[020]Em alguns aspectos, a produção alvo de Rebaudiosídeos individuais pode ser realizada por números de cópias diferenciais dos genes que codificam UGT (veja, Figura 1) na célula recombinante, forças promotoras diferenciais e/ou utilizando mutantes com especificidade/atividade aumentada para o produto de interesse. Por exemplo, baixos níveis de Rebaudiosídeo D, E, e M serão formados se EUGT11 é expressado em baixos níveis em comparação com outros UGTs, o que favoreceria a formação de Rebaudiosídeo A. Altos níveis de expressão de EUGT11 resultam na produção de mais 19-O 1,2 diglucosídeo que pode servir como substrato para UGT76G1 para formar Rebaudiosídeo M. Em certas formas de realização vantajosas, cópias adicionais ou versões mutantes de UGT76G1 em células recombinantes da invenção podem melhorar a taxa de formação de Rebaudiosídeo M a partir de Rebau- diosídeo D.

[021]Em algumas formas de realização, UGT76G1 catalisa a glicosilação de esteviol e glicosídeos de esteviol na posição 19-O. Assim, em algumas formas de realização, um ou mais de RebM, RebQ, RebI, glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopirano- sil]), ou glicosídeo de esteviol tri-glicosilado ((ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) são produzidos em um hospedeiro recombinante que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1, através da bioconversão, ou através da catálise por UGT76G1 in vitro. Em algumas formas de realização, UGT76G1 catalisa a glicosilação de esteviol e glicosídeos de esteviol na posição 13-O e, preferencialmente, glicosila substratos de glicosídeo de esteviol que são 1,2-di-glicosilado na posição 13-O ou mono-glicosilado na posição 13-O. Em algumas formas de realização, UGT76G1 não mostra uma preferência para o estado de glicosilação da posição 19-O.

[022]Em alguns aspectos, GGPPS compreende GGPPS de Synechococcus sp. apresentado na SEQ ID NO: 24.

[023]Em alguns aspectos, o polipeptídeo CDP compreende um polipeptídeo CDPS de Z. mays apresentado na SEQ ID NO: 13, em que o polipeptídeo está sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto.

[024]Em alguns aspectos, o polipeptídeo KO compreende um polipeptídeo KO tendo identidade de 70 % ou maior para a sequência de aminoácidos do polipeptídeo KO de S. rebaudiana apresentada na SEQ ID NO: 25.

[025]Em alguns aspectos, o polipeptídeo KS compreende um polipeptídeo KS tendo identidade de 40 % ou maior para a sequência de aminoácidos do polipeptídeo KS de A. thaliana apresentada na SEQ ID NO: 21.

[026]Em alguns aspectos, o polipeptídeo KAH compreende um polipeptídeo KAH tendo identidade de 60 % ou maior para a sequência de aminoácidos de KAH de S. rebaudiana apresentada na SEQ ID NO: 11.

[027]Em alguns aspectos, o polipeptídeo CPR compreende um polipeptídeo CPR tendo identidade de 65 % ou maior para uma sequência de aminoácidos de CPR S. rebaudiana apresentada na SEQ ID NO: 4, um polipeptídeo CPR de A. thaliana da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 ou uma combinação destes.

[028]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT85C2 compreende um polipep- tídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26.

[029]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT74G1 compreende um polipep- tídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19.

[030]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT76G1 compreende um polipep- tídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[031]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT91d2 compreende um polipep- tídeo UGT91d2 tendo identidade de 90 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 ou um homólogo funcional deste, um polipeptídeo UGT91d2e tendo uma substituição em resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15 ou uma combinação destes.

[032]Em alguns aspectos, o polipeptídeo EUGT11 compreende um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de amino- ácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16.

[033]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT76G1 compreende uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: T55K, T55E, S56A, Y128S, Y128E, H155L, H155R, Q198R, S285R, S285T, S253W, S253G, T284R, T284G, S285G, K337E, K337P e L379V da SEQ ID NO: 2.

[034]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT76G1 compreende uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: Q23G, Q23H, I26F, I26W, T146A, T146G, T146P, H155R, L257P, L257W, L257T, L257G, L257A, L257R, L257E, S283G e S283N da SEQ ID NO: 2.

[035]Em alguns aspectos, a célula hospedeira recombinante é uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana.

[036]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans.

[037]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma de Saccharomycete.

[038]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae.

[039]A invenção fornece ainda a célula, como aqui divulgada, que produz Re- baudiosídeo D.

[040]A invenção fornece ainda a célula, como aqui divulgada, que produz Re- baudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q ou Rebaudiosídeo I.

[041]A invenção fornece ainda a célula, como aqui divulgada, que produz o glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O- β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) ou o glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil- β-D-glucopiranosil]).

[042]Em alguns aspectos, o Rebaudiosídeo D é produzido na célula, como aqui divulgado, em uma concentração entre cerca de 1.000 mg/L e cerca de 2.900 mg/L.

[043]Em alguns aspectos, o Rebaudiosídeo D e o Rebaudiosídeo M são produzidos na célula, como aqui divulgado, em uma razão entre cerca de 1:1 a cerca de 1,7:1.

[044]Em alguns aspectos, o Rebaudiosídeo M é produzido na célula, como aqui divulgado, em uma concentração entre cerca de 600 mg/L e cerca de 2.800 mg/L.

[045]Em alguns aspectos, o Rebaudiosídeo M e o Rebaudiosídeo D são produzidos na célula, como aqui divulgado, em uma razão entre cerca de 0,6:1 a cerca de 1,1:1.

[046]A invenção fornece ainda um método de produzir Rebaudiosídeo D, Re- baudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q, Rebaudiosídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosi- lado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopi- ranosil]) ou glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]), compreendendo: (a) cultivar uma célula recombinante em um meio de cultura, sob condições em que os genes que codificam um GGPPS; um ent-copalil difosfato sintase (CDPS) polipeptídeo; um polipeptídeo caureno oxidase (KO); um polipeptídeo caureno sintase (KS); um polipeptídeo esteviol sintase (KAH); um polipeptídeo citocromo P450 redu- tase (CPR); um polipeptídeo UGT85C2; um polipeptídeo UGT74G1; um polipeptídeo UGT76G1; um polipeptídeo UGT91d2; e um polipeptídeo EUGT11 são expressados, compreendendo induzir a expressão dos ditos genes ou constitutivamente expressar os ditos genes; e (b) sintetizar Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q, Rebau- diosídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) ou glicosídeo de esteviol tri-glicosi- lado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glu- copiranosil-β-D-glucopiranosil]) na célula; e opcionalmente (c) isolar Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q, Rebaudio- sídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) ou glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopi- ranosil-β-D-glucopiranosil]).

[047]Em alguns aspectos, Rebaudiosídeo D é produzido por uma célula, como aqui divulgado.

[048]Em alguns aspectos, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q ou Rebaudio- sídeo I é produzido por uma célula, como aqui divulgado.

[049]Em alguns aspectos, glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hi- dróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) ou o gli- cosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β- D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) é produzido por uma célula, como aqui divulgado.

[050]Em alguns aspectos, Rebaudiosídeo D é produzido em uma concentração entre cerca de 1.000 mg/L e cerca de 2.900 mg/L.

[051]Em alguns aspectos, Rebaudiosídeo D e Rebaudiosídeo M são produzidos em uma razão entre cerca de 1:1 a cerca de 1,7:1.

[052]Em alguns aspectos, Rebaudiosídeo M é produzido em uma concentração entre cerca de 600 mg/L e cerca de 2.800 mg/L.

[053]Em alguns aspectos, Rebaudiosídeo M e Rebaudiosídeo D são produzidos em uma razão entre cerca de 0,6:1 a cerca de 1,1:1.

[054]Em alguns aspectos, uma célula para praticar os métodos aqui divulgados é uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana.

[055]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans.

[056]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma de Saccharomycete.

[057]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae.

[058]A invenção fornece ainda métodos para produzir Rebaudiosídeo D, Re- baudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q, Rebaudiosídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosi- lado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopi- ranosil]) ou glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) através da bioconversão in vitro de esteviol derivado de planta ou sintético ou glicosídeos de es- teviol usando um ou mais polipeptídeos UGT.

[059]Em alguns aspectos, os ditos métodos para produzir Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M compreendem usar pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT91d2 compreendendo um polipeptídeo UGT91d2 tendo identidade de 90 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 ou um homólogo funcional deste, um polipeptídeo UGT91d2e tendo uma substituição em resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15 ou uma combinação destes; ou um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16.

[060]Em alguns aspectos, o glicosídeo de esteviol usado para a produção de Rebaudiosídeo D compreende esteviosídeo, RebA, RebB, RebE ou misturas destes.

[061]Em alguns aspectos, o glicosídeo de esteviol usado para a produção de Rebaudiosídeo M compreende esteviosídeo, RebA, RebB, RebE, RebD ou misturas destes.

[062]Em alguns aspectos, os métodos para produzir Rebaudiosídeo Q compreendem usar pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; ou um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[063]Em alguns aspectos, o glicosídeo de esteviol usado para produzir Re- baudiosídeo Q compreende rubusosídeo, RebG ou misturas destes.

[064]Em alguns aspectos, os métodos para produzir Rebaudiosídeo I compreendem usar pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT91d2 compreendendo um polipeptí- deo UGT91d2 tendo identidade de 90 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 ou um homólogo funcional deste, um polipeptídeo UGT91d2e tendo uma substituição em resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15; ou uma combinação destes.

[065]Em alguns aspectos, o glicosídeo de esteviol usado para produzir Re- baudiosídeo I compreende 1,2-esteviosídeo, RebA ou misturas destes.

[066]Em alguns aspectos, os métodos para produzir glicosídeo de esteviol di- glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D- glucopiranosil]) compreendem usar pelo menos um ou polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; ou um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16.

[067]Em alguns aspectos, o glicosídeo de esteviol usado para produzir glico- sídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D- glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) compreende esteviol-19-O-glicosídeo.

[068]Em alguns aspectos, os métodos para produzir glicosídeo de esteviol tri- glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β- D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) compreendem usar pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; ou um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16.

[069]Em alguns aspectos, o glicosídeo de esteviol usado para produzir glico- sídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D- glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) compreende glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopira- nosil-β-D-glucopiranosil]), esteviol-19-O-glicosídeo ou misturas destes.

[070]Em alguns aspectos, os métodos de bioconversão, como aqui divulgados, compreendem bioconversão enzimática ou bioconversão de célula inteira.

[071]Em alguns aspectos, uma célula para praticar os métodos aqui divulgados é uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana.

[072]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans.

[073]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma de Saccharomycete.

[074]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Saccharomyces cerevisiae.

[075]A invenção fornece ainda uma célula hospedeira recombinante compreendendo ácidos nucleicos exógenos compreendendo: (a) um gene recombinante que codifica um GGPPS; (b) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo ent-copalil difosfato sintase (CDPS); (c) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno oxidase (KO); (d) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo caureno sintase (KS); (e) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo esteviol sintase (KAH); (f) um gene recombinante que codifica um polipeptídeo citocromo P450 redu- tase (CPR); e/ou (g) um ou mais genes recombinantes que codificam um ou mais polipeptídeos UGT; em que a célula produz Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q ou Rebaudiosídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16- en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) ou glicosídeo de este- viol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil- 3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]).

[076]Em alguns aspectos das ditas células hospedeiras recombinantes, GGPPS compreende GGPPS de Synechococcus sp. apresentado na SEQ ID NO: 24; o polipeptídeo CDP compreende um polipeptídeo CDPS de Z. mays apresentado na SEQ ID NO: 13, em que o polipeptídeo está sem um peptídeo de trânsito de cloro- plasto; o polipeptídeo KO compreende um polipeptídeo KO tendo identidade de 70 % ou maior para a sequência de aminoácidos do polipeptídeo KO de S. rebaudiana apresentado na SEQ ID NO: 25; o polipeptídeo KS compreende um polipeptídeo KS tendo identidade de 40 % ou maior para a sequência de aminoácidos do polipeptídeo KS de A. thaliana apresentado na SEQ ID NO: 21; o polipeptídeo KAH compreende um poli- peptídeo KAH tendo identidade de 60 % ou maior para a sequência de aminoácidos de KAH de S. rebaudiana apresentada na SEQ ID NO: 11; o polipeptídeo CPR compreende um polipeptídeo CPR tendo identidade de 65 % ou maior para uma sequência de aminoácidos de CPR de S. rebaudiana apresentada na SEQ ID NO: 4, um polipep- tídeo CPR de A. thaliana da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 ou uma combinação destes.

[077]Em alguns aspectos, a célula produz Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosí- deo M, em que o polipeptídeo UGT é pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT91d2 compreendendo um polipeptídeo UGT91d2 tendo identidade de 90 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 ou um homólogo funcional deste, um polipeptídeo UGT91d2e tendo uma substituição em resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15 ou uma combinação destes; ou um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16.

[078]Em alguns aspectos, a célula produz Rebaudiosídeo Q, em que o poli- peptídeo UGT é pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; ou um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

[079]Em alguns aspectos, a célula produz Rebaudiosídeo I, em que o polipep- tídeo UGT é pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT91d2 compreendendo um polipeptí- deo UGT91d2 tendo identidade de 90 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 ou um homólogo funcional deste, um polipeptídeo UGT91d2e tendo uma substituição em resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15; ou uma combinação destes.

[080]Em alguns aspectos, a célula produz glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopirano- sil]), em que o polipeptídeo UGT é pelo menos um polipeptídeo UGT que é: um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; ou um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16.

[081]Em alguns aspectos, a célula produz glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopi- ranosil-β-D-glucopiranosil]), em que o polipeptídeo UGT é pelo menos um polipeptí- deo UGT que é: um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; ou um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16

[082]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT76G1 compreende uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: Q23G, Q23H, I26F, I26W, T146A, T146G, T146P, H155R, L257P, L257W, L257T, L257G, L257A, L257R, L257E, S283G e S283N da SEQ ID NO: 2.

[083]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT76G1 compreende uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: T55K, T55E, S56A, Y128S, Y128E, H155L, H155R, Q198R, S285R, S285T, S253W, S253G, T284R, T284G, S285G, K337E, K337P e L379V da SEQ ID NO: 2.

[084]Em alguns aspectos, a célula hospedeira recombinante é uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana.

[085]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans.

[086]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma de Saccharomycete.

[087]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae.

[088]A invenção fornece ainda métodos para produzir Rebaudiosídeo D através da fermentação usando uma célula recombinante, como aqui divulgados.

[089]A invenção fornece ainda métodos para produzir Rebaudiosídeo M através da fermentação usando uma célula recombinante, como aqui divulgados.

[090]A invenção fornece ainda métodos para produzir Rebaudiosídeo Q através da fermentação usando uma célula recombinante, como aqui divulgados.

[091]A invenção fornece ainda métodos para produzir Rebaudiosídeo I através da fermentação usando uma célula recombinante, como aqui divulgados.

[092]A invenção fornece ainda métodos para produzir glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D- glucopiranosil]) através da fermentação usando uma célula recombinante, como aqui divulgados.

[093]A invenção fornece ainda métodos para produzir glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O- β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) através da fermentação usando uma célula re- combinante, como aqui divulgados.

[094]Em alguns aspectos, uma célula para praticar os métodos aqui divulgados é uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana.

[095]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans.

[096]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma de Saccharomycete.

[097]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae.

[098]A invenção fornece ainda métodos in vitro para produzir Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M, compreendendo: (a) adicionar um ou mais de um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT91d2 compreendendo um polipeptídeo UGT91d2 tendo identidade de 90 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 ou um homólogo funcional deste, um polipeptídeo UGT91d2e tendo uma substituição em resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15 ou uma combinação destes; um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16, e esteviol de derivado de planta ou sintético ou glicosídeos de esteviol para a mistura de reação; e (b) sintetizar Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M na mistura de reação; e opcionalmente (c) isolar Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M na mistura de reação.

[099A invenção fornece ainda métodos in vitro para produzir Rebaudiosídeo Q, compreendendo: (a) adicionar um ou mais de um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, e esteviol de derivado de planta ou sintético ou glicosídeos de esteviol para a mistura de reação; e (b) sintetizar Rebaudiosídeo Q na mistura de reação; e opcionalmente (c) isolar Rebaudiosídeo Q na mistura de reação.

[0100]A invenção fornece ainda métodos in vitro para produzir Rebaudiosídeo I, compreendendo: (a) adicionar um ou mais de um polipeptídeo UGT85C2 compreendendo um polipeptídeo UGT85C2 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 26; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT91d2 compreendendo um polipeptídeo UGT91d2 tendo identidade de 90 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 26 ou um homólogo funcional deste, um polipeptídeo UGT91d2e tendo uma substituição em resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15 ou uma combinação destes, e esteviol de derivado de planta ou sintético ou glicosídeos de esteviol para a mistura de reação; e (b) sintetizar Rebaudiosídeo I na mistura de reação; e opcionalmente (c) isolar Rebaudiosídeo I na mistura de reação.

[0101]A invenção fornece ainda métodos in vitro para produzir um glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopi- ranosil-β-D-glucopiranosil]), compreendendo: (a) adicionar um ou mais de um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a Os03g0702000 sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, e esteviol de derivado de planta ou sintético ou glicosídeos de esteviol para a mistura de reação; e (b) sintetizar o glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16- en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) na mistura de reação; e opcionalmente (c) isolar glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18- oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) na mistura de reação.

[0102]A invenção fornece ainda métodos in vitro para produzir um glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-gluco- piranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]), compreendendo: (a) adicionar um ou mais de um polipeptídeo UGT76G1 compreendendo um polipeptídeo UGT76G1 tendo identidade de 50 % ou maior para a sequência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; um polipeptídeo UGT74G1 compreendendo um polipeptídeo UGT74G1 tendo identidade de 55 % ou maior para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; um polipeptídeo EUGT11 compreendendo um polipeptídeo EUGT11 tendo identidade de 65 % ou maior para a sequência de aminoácidos de Os03g0702000 apresentada na SEQ ID NO: 16, e esteviol de derivado de planta ou sintético ou glicosídeos de esteviol para a mistura de reação; e (b) sintetizar glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en- 18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) na mistura de reação; e opcionalmente (c) isolar glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18- oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) na mistura de reação.

[0103]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT76G1 para produzir Rebaudi- osídeo D compreende uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 selecionadas a partir do grupo que consiste de: Q23G, Q23H, I26F, I26W, T146A, T146G, T146P, H155R, L257P, L257W, L257T, L257G, L257A, L257R, L257E, S283G e S283N da SEQ ID NO: 2.

[0104]Em alguns aspectos, o polipeptídeo UGT76G1 para produzir Rebaudi- osídeo M, Rebaudiosídeo Q, Rebaudiosídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosilado e glicosídeo de esteviol tri-glicosilado compreende uma ou mais das variantes de poli- peptídeo UGT76G1 selecionadas a partir do grupo que consiste de: T55K, T55E, S56A, Y128S, Y128E, H155L, H155R, Q198R, S285R, S285T, S253W, S253G, T284R, T284G, S285G, K337E, K337P e L379V da SEQ ID NO: 2.

[0105]Em alguns aspectos, o método in vitro divulgado é método in vitro enzi- mático ou método in vitro de célula inteira.

[0106]Em alguns aspectos, uma célula para praticar os métodos aqui divulgados é uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana.

[0107]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans.

[0108]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma de Saccharomycete.

[0109]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae.

[0110]A invenção fornece ainda Rebaudiosídeo Q produzido pelos métodos aqui divulgados.

[0111]A invenção fornece ainda Rebaudiosídeo I produzido pelos métodos aqui divulgados.

[0112]A invenção fornece ainda um glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) produzido pelos métodos aqui divulgados.

[0113]A invenção fornece ainda um glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil- β-D-glucopiranosil]) produzido pelos métodos aqui divulgados.

[0114]A invenção fornece ainda um polipeptídeo UGT76G1 para produzir Re- baudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q, Rebaudiosídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosi- lado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopi- ranosil]) ou glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]), em que o polipeptídeo UGT76G1 compreende um polipeptídeo UGT76G1 da SEQ ID NO: 2 ou uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: T55K, T55E, S56A, Y128S, Y128E, H155L, H155R, Q198R, S285R, S285T, S253W, S253G, T284R, T284G, S285G, K337E, K337P e L379V da SEQ ID NO: 2.

[0115]A invenção fornece ainda um polipeptídeo UGT76G1 para produzir Re- baudiosídeo D, em que o polipeptídeo UGT76G1 compreende um polipeptídeo UGT76G1 da SEQ ID NO: 2 ou uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: Q23G, Q23H, I26F, I26W, T146A, T146G, T146P, H155R, L257P, L257W, L257T, L257G, L257A, L257R, L257E, S283G e S283N da SEQ ID NO: 2.

[0116]A invenção fornece ainda célula hospedeira recombinante compreendendo um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1, em que o po- lipeptídeo UGT76G1 compreende uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: T55K, T55E, S56A, Y128S, Y128E, H155L, H155R, Q198R, S285R, S285T, S253W, S253G, T284R, T284G, S285G, K337E, K337P e L379V da SEQ ID NO: 2.

[0117]Em alguns aspectos, a célula hospedeira recombinante, como aqui divulgada, produz Rebaudiosídeo D.

[0118]A invenção fornece ainda uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1, em que o polipeptídeo UGT76G1 compreende uma ou mais das variantes de polipeptídeo UGT76G1 compreendendo: Q23G, Q23H, I26F, I26W, T146A, T146G, T146P, H155R, L257P, L257W, L257T, L257G, L257A, L257R, L257E, S283G e S283N da SEQ ID NO: 2.

[0119]Em alguns aspectos, a célula hospedeira recombinante, como aqui divulgada, produz Rebaudiosídeo M, Rebaudiosídeo Q, Rebaudiosídeo I, glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopira- nosil-β-D-glucopiranosil]) ou glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-gluco- piranosil]).

[0120]Em alguns aspectos, a célula hospedeira recombinante é uma célula de levedura, uma célula vegetal, uma célula de mamífero, uma célula de inseto, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana.

[0121]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Sac- charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gossypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimorpha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans.

[0122]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma de Saccharomycete.

[0123]Em alguns aspectos, a célula de levedura é uma célula de espécie Saccharomyces cerevisiae.

[0124]A invenção fornece ainda uma composição compreendendo de cerca de 1 % a cerca de 99 % p/p de Rebaudiosídeo D, em que a composição tem um nível reduzido de contaminantes derivados de stévia em relação a um extrato de stévia. Em certos casos, pelo menos um dos ditos contaminantes é um composto derivado de planta que inter alia contribui para off-flavors no produto de glicosídeo de esteviol.

[0125]Em alguns aspectos, a composição tem menos do que 0,1 % de conta- minantes derivados de stévia em relação a um extrato de stévia. Em certos casos, pelo menos um dos ditos contaminantes é um composto derivado de planta que inter alia contribui para off-flavors no produto de glicosídeo de esteviol.

[0126]A invenção fornece ainda um produto alimentar compreendendo a composição, como aqui divulgado.

[0127]Em alguns aspectos, o produto alimentar é uma bebida ou um concentrado de bebida.

[0128]Qualquer um dos hospedeiros descritos aqui pode ser um micro-organismo (por exemplo, um Saccharomycete tal como Saccharomyces cerevisiae, ou Escherichia coli) ou uma célula de planta ou vegetal (por exemplo, um Stévia tal como um Stevia rebaudiana ou Physcomitrella).

[0129]Estas e outras características e vantagens da presente invenção serão mais completamente entendidas a partir da seguinte descrição detalhada da invenção tomadas em conjunto com as reivindicações anexas. Observou-se que o escopo das reivindicações é definido pelas recitações e não pelo debate específico de características e vantagens apresentadas na presente descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0130]A descrição detalhada seguinte das formas de realização da presente invenção pode ser melhor entendida quando lida em conjunto com os desenhos seguintes, onde estrutura semelhante é indicada com números de referência semelhantes e, em que:

[0131]A Figura 1 mostra as reações de glicosilação de glicosídeo de esteviol e as enzimas pelas quais elas são catalisadas.

[0132]A Figura 2 mostra a estrutura química de Rebaudiosídeo M (RebM).

[0133]A Figura 3 mostra a estrutura química de Rebaudiosídeo D (RebD).

[0134]A Figura 4 mostra a via bioquímica para a produção de esteviol.

[0135]A Figura 5 é um cromatograma representativo de análise de Espectro- metria de Massa por Cromatografia Líquida (LC-MS) que mostra a formação de um glicosídeo de esteviol hexa-glicosilado a 1,31 min de tempo de retenção. Os resíduos, a partir do topo ao fundo, correspondem à m/z indicada na Tabela 12.

[0136]A Figura 6 é um esquemático dos métodos para isolar glicosídeos de esteviol hexa-glicosilados.

[0137]A Figura 7 é um cromatograma representativo e espectros de massa de uma análise de tempo de trânsito quadrupolar por cromatografia líquida (LC-QTOF) do glicosídeo de esteviol hexa-glicosilado semi-purificado depois da cromatografia flash.

[0138]A Figura 8A é um cromatograma indicando os compostos produzidos através da fermentação de cepa de levedura EFSC 3044. A Figura 8B é a estrutura de RMN do glicosídeo de esteviol di-glicosilado indicado (ácido 13-hidróxi caur-16-en- 18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-O-β-D-glucopiranosil]), um análogo de esteviol- 1,2-biosídeo. O nome da IUPAC para o glicosídeo de esteviol di-glicosilado é (2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-di-hidróxi-6-(hidroximetil)-3-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hi- dróxi-6-(hidroximetil)oxan-2-il]óxi}oxan-2-il(1R,4S,5R,9S,10R,13S)-13-hidróxi-5,9-di- metil-14-metilidenotetraciclo[11,2,1,0A{1,10},0A{4,9}]hexadecano-5-carboxilato. A Figura 8C é a estrutura da estrutura de RMN do glicosídeo de esteviol tri-glicosilado indicado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D- glucopiranosil-O-β-D-glucopiranosil], um isômero de RebB. O nome da IUPAC para glicosídeo de esteviol tri-glicosilado é (2S,3R,4S,5R,6R)-5-hidróxi-6-(hidroximetil)-3,4- bis({[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroximetil)oxan-2-il]óxi})oxan-2-il (1R,4S,5R,9S,10R,13S)-13-hidróxi-5,9-dimetil-14-metilidenotetraci- clo[11,2,1,0A{1, 10},0A{4,9}]hexadecano-5-carboxilato.

[0139]A Figura 9 mostra produção de RebD pela cepa de levedura EFSC 3261. Quatro fermentações da cepa de levedura EFSC 3261 em meio mínimo (MM) são mostradas.

[0140]A Figura 10 mostra a produção de RebD e RebM pela cepa de levedura EFSC 3297.

[0141]A Figura 11 mostra a produção de RebD, RebM e RebA pela cepa de levedura EFSC 3841.

[0142]A Figura 12 compara RebD/RebM produzidos com uma ou duas cópias de UGT76G1.

[0143]A Figura 13A mostra as taxas relativas de consumo de RebD e produção de RebM por UGT76G1. A Figura 13B mostra as taxas relativas de consumo de RebE e produção de RebD e RebM por UGT76G1.

[0144]A Figura 14 mostra a variação dos três modelos de homologia de UGT76G1.

[0145]A Figura 15A é um gráfico de disperção de produção de RebD e RebM em placas de 96 e 4 x 24 poços profundos; A Figura 15B é um gráfico de caixa de produção de RebD e RebM em placas de 96 e 4 x 24 poços profundos, e a Figura 15C é um gráfico de caixa de produção de RebD/RebM em placas de 96 e 4 x 24 poços profundos.

[0146]A Figura 16 mostra todos os pontos de dados da triagem de saturação de sítio de UGT76G1 inicial com produção de tipo selvagem mostrada como triângulos pretos.

[0147]A Figura 17 mostra as colônias produtoras de RebD e RebM superiores selecionadas para outro estudo.

[0148]A Figura 18 mostra uma retriagem de produtores de UGT76G1 de RebD e RebM superiores (como mostrado na Figura 17) conduzida em triplicata mostrando as mesmas tendências como a triagem inicial.

[0149]A Figura 19A mostra as taxas relativas de consumo de Rubusosídeo e produção de 1,3-esteviosídeo (RebG) e Rebaudiosídeo Q (“RebQ”) por UGT76G1. A Figura 19B mostra as taxas relativas de consumo de 1,2-esteviosídeo e produção de RebA por UGT76G1. A Figura 19C mostra as taxas relativas de consumo de 1,2-bio- sídeo e produção de RebB por UGT76G1.

[0150]A Figura 20 mostra chromatogramas de 1,2-esteviosídeo e RebA com ou sem picos de UGT76G1 indicando a produção de RebI.

[0151]Os técnicos habilitados avaliarão que os elementos nas Figuras são ilustrados para a simplicidade e clareza e não necessariamente tenham sido desenhados em escala. Por exemplo, as dimensões de alguns dos elementos nas Figuras podem ser exageradas em relação a outros elementos para ajudar a melhorar a com- preenção das formas de realização da presente invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

[0152]Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são por este meio expressamente incorporados como referência para todos os propósitos.

[0153]Os métodos bem conhecidos àqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir as construções de expressão genética e células recombinantes de acordo com esta invenção. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, técnicas de recombinação in vivo, e técnicas de reação de cadeia polimerase (PCR). Veja, por exemplo, técnicas como descritas em Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, Nova Iorque, e PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA).

[0154]Antes de descrever a presente invenção em detalhes, vários termos serão definidos. Como usado aqui, as formas singulares “um/uma” e “o/a” incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Por exemplo, a referência a um “ácido nucleico” significa um ou mais ácidos nucleicos.

[0155]Observou-se que os termos semelhantes “preferivelmente”, “comu- mente”, e “tipicamente” não são utilizados aqui para limitar o escopo da invenção reivindicada ou implicar que certas características são criticas, essenciais, ou mesmo importantes à estrutura ou função da invenção reivindicada. Preferivelmente, estes termos são meramente intencionados a realçar características alternativas ou adicionais que podem ou não ser utilizadas em uma forma de realização particular da presente invenção.

[0156]Para os propósitos de descrever e definir a presente invenção, observou-se que o termo “substancialmente” é utilizado aqui para representar o grau inerente de incerteza que pode ser atribuído a qualquer comparação quantitativa, valor, medição ou outra representação. O termo “substancialmente” também é utilizado aqui para representar o grau pelo qual uma representação quantitativa pode variar de uma referência estabelecida sem resultar em uma mudança na função básica da matéria objeto em questão.

[0157]Como usado aqui, os termos “polinucleotídeo”, “nucleotídeo”, “oligonu- cleotídeo”, e “ácido nucleico” podem ser usados permutavelmente para referir-se a ácido nucleico compreendendo DNA, RNA, seus derivados, ou suas combinações.

[0158]Como usado aqui, o termo “e/ou” é utilizado para descrever componentes múltiplos em combinação ou exclusivos um ao outro. Por exemplo, “x, y e/ou z” pode referir-se a “x” sozinho, “y” sozinho, “z” sozinho, “x, y, e z,” “(x e y) ou z,” ou “x ou y ou z.” Em algumas formas de realização, “e/ou” é usado para referir-se aos ácidos nucleicos exógenos que uma célula recombinante compreende, em que uma célula recombinante compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos selecionados a partir de um grupo. Em algumas formas de realização, “e/ou” é usado para referir-se à produção de glicosídeos de esteviol, em que um ou mais glicosídeos de esteviol selecionados a partir de um grupo são produzidos. Em algumas formas de realização, “e/ou” é usado para referir-se à produção de glicosídeos de esteviol, em que um ou mais glicosídeos de esteviol são produzidos através de uma ou mais das etapas seguintes: cultivar uma célula recombinante, sintetizar um ou mais glicosídeos de este- viol em uma célula, e isolar um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0159]Glicosídeos de esteviol altamente glicosilados podem estar presentes em quantidades vestigiais na planta Stévia, mas em níveis tão baixos que a extração a partir da planta é impraticável para o uso de tais glicosídeos em sistemas de alimentos e bebidas. Veja, Hellfritsch et al., J. Agric. Food Chem. 60: 6782 - 6793 (2012); DuBois GE, Stephenson RA., J Med Chem. Jan; 28: 93 - 98 (1985); e Publicação de Patente US 2011-0160311.

[0160]Tipicamente, esteviosídeo e Rebaudiosídeo A são os compostos primários em extratos de stévia comercialmente produzidos. Esteviosídeo é relatado ter um sabor mais amargo e menos doce do que Rebaudiosídeo A. A composição de extrato de stévia pode variar de lote para lote dependendo do solo e clima em que as plantas são cultivadas. Dependendo da planta originária, as condições de clima, e o processo de extração, a quantidade de Rebaudiosídeo A em preparações comerciais é relatada variar de 20 a 97 % do teor de glicosídeo de esteviol total.

[0161]Outros glicosídeos de esteviol estão presentes em quantidades variáveis em extratos de stévia. Por exemplo, Rebaudiosídeo B é tipicamente presente a menos do que 1 a 2 %, enquanto que Rebaudiosídeo C pode estar presente em níveis tão alto quanto 7 a 15 %. Rebaudiosídeo D está tipicamente presente em níveis de 2 % ou menos, e Rebaudiosídeo F está tipicamente presente em composições a 3,5 % ou menos dos glicosídeos de esteviol totais. A quantidade dos glicosídeos de esteviol menores, incluindo mas não limitados a Rebaudiosídeo M, pode afetar o perfil de sabor de um extrato de Stévia.

[0162]Além disso, Rebaudiosídeo D e outros glicosídeos de esteviol glicosila- dos superiores são pensados ser adoçantes de qualidade superior do que Rebaudio- sídeo A. Como tais, os hospedeiros recombinantes e métodos descritos aqui são particularmente úteis para produzir composições de glicosídeo de esteviol tendo uma quantidade aumentada de Rebaudiosídeo D para o uso, por exemplo, como um adoçante não-calórico com propriedades funcionais e sensoriais superiores àquelas de muitos adoçantes de alta potência.

[0163]Rebaudiosídeo M, um glicosídeo de esteviol hexa-glicosilado foi relatado estar presente na planta Stévia e tem um nome de IUPAC de (2S,3R,4S,5R,6R)- 5-hidróxi-6-(hidroximetil)-3,4-bis({[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroxime- til)oxan-2-il]óxi})oxan-2-il(1R,5R,9S,13R)-13-{[(2S,3R,4S,5R,6R)-5-hidróxi-6-(hidroxi- metil)-3,4-bis({[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroximetil) oxan-2-il]óxi})oxan- 2-il]óxi}-5,9-dimetil-14-metilidenotetraciclo [11,2,1,01,10,04,9] hexadecano-5-carboxi- lato. Veja, Ohta et al., registro de MassBank: FU000341, FU000342, FU000343 (2010) e Ohta et al (J. Applied Glycosides, 57(3): 199 - 209, 2010). Rebaudiosídeo M foi fornecido um número CAS de 1220616-44-3. Veja a Figura 2 para a estrutura de Rebau- diosídeo M.

[0164]Rebaudiosídeo D, um glicosídeo de esteviol penta-glicosilado, também tem sido relatado estar presente na planta Stévia e tem um nome de IUPAC de 13- {[5-hidróxi-6-(hidroximetil)-3,4-bis({[3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroximetil)oxan-2- il]óxi})oxan-2-il]óxi}-5,9-dimetil-14-metilidenotetraciclo[11,2,1,01,10,04,9]hexadecano-5- carboxilato de 4,5-di-hidróxi-6-(hidroximetil)-3-{[3,4,5-tri-hidróxi-6-(hidroximetil)oxan- 2-il]óxi}oxan-2-ila. Rebaudiosídeo D foi fornecido um número CAS de 64849-39-4. Veja a Figura 3 para a estrutura de Rebaudiosídeo D.

[0165]São aqui fornecidos hospedeiros recombinantes, tais como micro- organismos que expressam polipeptídeos úteis para biossíntese de novo de Rebaudiosí- deo M ou Rebaurdioside D. Os hospedeiros descritos aqui expressam uma ou mais uri- dina 5’-difosfo (UDP) glicosil transferases adequadas para produzir glicosídeos de este- viol. A expressão destes polipeptídeos biossintéticos em vários sistemas microbianos permite os glicosídeos de esteviol ser produzidos em uma maneira reproduzível, compatível, de fontes de energia e carbono, tais como açúcares, glicerol, CO2, H2, e luz solar. A proporção de cada glicosídeo de esteviol produzido por um hospedeiro recombinante pode ser adaptada incorporando enzimas biossintéticas pré selecionadas nos hospedeiros e expressando em níveis apropriados, para produzir uma composição de adoçante com um perfil de sabor compatível. Além disso, as concentrações de glicosídeos de esteviol produzidos por hospedeiros recombinantes são esperadas ser mais altas do que os níveis de glicosídeos de esteviol produzidos na planta Stévia, que melhoram a eficiência da purificação a jusante. Tais composições adoçantes vantajosamente contêm poucos ou nenhum contaminantes à base de planta, em relação à quantidade de contaminantes presentes em extratos de Stévia.

[0166]A prática dos métodos e células hospedeiras recombinantes como divulgado são fornecidos em que, pelo menos, um dos genes que codifica um polipep- tídeo UGT85C2; um polipeptídeo UGT74G1; um polipeptídeo UGT76G1; ou um poli- peptídeo UGT91d2 é um gene recombinante, os genes recombinantes particulares dependendo da espécie ou cepa selecionada para o uso. Genes ou módulos biossin- téticos adicionais podem ser incluídos de modo a aumentar o rendimento de glicosí- deo de esteviol, melhorar a eficiência com que as fontes de energia e carbono são convertidas a esteviol e seus glicosídeos e/ou realçar a produtividade da cultura celular. Como usado aqui, os “módulos biossintéticos” referem-se a uma coleção de genes que são parte de uma via biossintética comum e, assim, são frequentemente co-ex- pressados em um organismo recombinante. Como usado aqui, tais módulos biossin- téticos adicionais incluem genes envolvidos na síntese dos precursores terpenóides, difosfato de isopentenila e difosfato de dimetilalila. Os módulos biossintéticos adicionais incluem genes terpeno sintase e terpeno ciclase, tais como genes que codificam geranilgeranil difosfato sintase e copalil difosfato sintase; estes genes podem ser genes endógenos ou genes recombinantes. I. Polipeptídeos de Biossíntese de Esteviol e Glicosídeo de Esteviol A. Polipeptídeos de Biossíntese de Esteviol

[0167]A via bioquímica para produzir esteviol envolve a formação do precursor, geranilgeranil difosfato (catalisado por GGDPS), ciclização a (-) copalil difosfato (catalisado por CDPS), seguido por formação de (-)-caureno (catalisado por KS), seguido por oxidação (catalisado por KO), e hidroxilação (catalisado por KAH) para formar esteviol. Veja, Figura 4. Assim, a conversão de geranilgeranil difosfato para este- viol em um micro-organismo recombinante envolve a expressão de um gene que codifica uma caureno sintase (KS), um gene que codifica um caureno oxidase (KO), e um gene que codifica uma esteviol sintetase (KAH). Esteviol sintetase também é conhecida como ácido caurenóico 13-hidroxilase.

[0168]Os polipeptídeos KS adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas KS adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Zea mays, Populus trichocarpa, e Arabidopsis thaliana. Veja, Tabela 2 e Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, que estão aqui incorporados como referência em sua totalidade. A sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo KS de A. thaliana é apresentada na SEQ ID NO: 6, e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo KS de A. thaliana é apresentada na SEQ ID NO: 21. Tabela 2. Clones de caureno sintase (KS).

[0169]Os polipeptídeos KO adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas KO adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Arabidopsis tha- liana, Gibberella fujikoroi e Trametes versicolor. Veja, por exemplo, Tabela 3 e Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, que estão aqui incorporados como referência em sua totalidade. Tabela 3. Clones de caureno oxidase (KO).

[0170]Os polipeptídeos KAH adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas KAH adequadas incluem aquelas feitas por Stevia rebaudiana, Arabidopsis tha- liana, Vitis vinifera e Medicago trunculata. Veja, por exemplo, Tabela 4, Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, Publicação de Patente U.S. Nos 2008/0271205 e 2008/0064063, e Acesso Genbank No gi 189098312 (SEQ ID NO: 37) e Acesso Genbank ABD60225; GI:89242710 (SEQ ID NO: 38), que estão aqui incorporados como referência em sua totalidade. A esteviol sintetase de A. thaliana é classificada como CYP714A2. Tabe a 4. Clones de esteviol sintetase (KAH).

* = Sequência é identificada com identificador de sequência número 2 como mostrado na Publicação de Patente U.S. No 2008-0064063.

[0171]Além disso, um polipeptídeo KAH de Stevia rebaudiana que foi identificado como descrito no Pedido PCT No PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade, é particularmente útil em um hospedeiro re- combinante. A sequência de nucleotídeo que codifica o KAH de S. rebaudiana (SrKAHe1) é apresentada na SEQ ID NO: 91. Uma sequência de nucleotídeo que codifica o KAH de S. rebaudiana que foi otimizado por códon para a expressão em levedura é apresentada na SEQ ID NO: 8, e a sequência de aminoácidos do polipep- tídeo KAH de S. rebaudiana é apresentada na SEQ ID NO: 11. Quando expressado em S. cerevisiae, o KAH de S. rebaudiana (SEQ ID NO: 11) mostra significantemente atividade de esteviol sintase superior em comparação com a ácido ent-caurenóico hi- droxilase de A. thaliana descrita por Yamaguchi et al. (Publicação de Patente U.S. No 2008/0271205 A1) e outras enzimas KAH de S. rebaudiana descritas na Publicação de Patente U.S. No 2008/0064063, assim como a sequência de proteína depositada em GenBank como ACD93722. O polipeptídeo KAH de S. rebaudiana (SEQ ID NO: 11) tem menos do que 20 % de identidade para o KAH da Publicação de Patente U.S. No 2008/0271205 e menos do que 35 % de identidade para o KAH da Publicação de Patente U.S. No 2008/0064063.

[0172]Por exemplo, a esteviol sintase codificada por SrKAHe1 é ativada pelo CPR de S. cerevisiae codificado por gene NCP1 (YHR042W). Níveis de ativação maiores da esteviol sintase codificada por SrKAHe1 são observados quando o CPR de A. thaliana codificado pelo gene ATR2 (SEQ ID NO: 10) e o CPR de S. rebaudiana codificado pelo gene CPR8 (SEQ ID NO: 5) são co-expressados. A sequência de amino- ácidos de ATR2 de A. thaliana é apresentada na SEQ ID NO: 9, e a sequência de aminoácidos para polipeptídeos CPR8 de S. rebaudiana é apresentada na SEQ ID NO: 4.

[0173]Em algumas formas de realização, um micro-organismo recombinante contém um gene recombinante que codifica um KO, KS, e um polipeptídeo KAH. Tais micro-organismos também tipicamente contêm um gene recombinante que codifica um polipeptídeo citocromo P450 redutase (CPR), visto que certas combinações de KO e/ou polipeptídeos KAH necessitam de expressão de um polipeptídeo CPR exógeno. Em particular, a atividade de um KO e/ou um polipeptídeo KAH de origem vegetal pode ser significantemente aumentada pela inclusão de um gene recombinante que codifica um polipeptídeo CPR exógeno. Os polipeptídeos CPR adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas CPR adequadas incluem aquelas feitas por S. rebau- diana e A. thaliana. Veja, por exemplo, Tabela 5 e Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, que estão aqui incorporados como re-ferência em sua totalidade. Tabela 5. Clones de citocromo P450 redutase (CPR).

[0174]O gene DPP1 de levedura e/ou o gene LPP1 de levedura pode reduzir o rendimento de esteviol convertendo os precursores de GGPP e FPP por estas enzimas. Estes genes podem ser interrompidos ou suprimidos tais que a degradação de farnesil pirofosfato (FPP) para farnesol é reduzida e a degradação de geranilgeranil- pirofosfato (GGPP) para geranilgeraniol (GGOH) é reduzida. Alternativamente, os elementos promotores ou realçadores de um gene endógeno que codifica um fosfatase podem ser alterado tais que a expressão de suas proteínas codificadas é alterada. Recombinação homóloga pode ser usada para interromper um gene endógeno. Por exemplo, um vetor de “substituição de gene” pode ser construído em um tal modo a incluir um gene marcador selecionável. O gene marcador selecionável pode ser ligado de maneira operável, em ambas as extremidades 5’ e 3’, às porções do gene de com-primento suficiente para mediar a recombinação homóloga usando métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica.

[0175]Um marcador selecionável pode ser um de qualquer número de genes que complementam a auxotrofia de célula hospedeira, fornecem resistência a antibiótico, ou resultam em uma mudança de cor. Fragmentos de DNA linearizados do vetor de substituição de gene, em seguida, são introduzidos nas células usando métodos bem conhecidos na técnica (veja abaixo). Integração dos fragmentos lineares no ge- noma e na disrupção do gene pode ser determinada com base no marcador de seleção e pode ser verificada por, por exemplo, análise de Southern blot. Subsequente para seu uso em seleção, um marcador selecionável pode ser removido a partir do genoma da célula hospedeira por, por exemplo, sistemas Cre-loxP (veja, por exemplo, Gossen et al., 2002, Ann. Rev. Genetics 36: 153 - 173 e Publicação de Pedido U.S. No 20060014264). Alternativamente, um vetor de substituição de gene pode ser cons-truído em um tal modo como a incluir uma porção do gene a ser interrompida, onde a porção é desprovida de qualquer sequência promotora de gene endógeno e codifica nenhum ou um fragmento inativo da sequência codificadora do gene.

[0176]Um “fragmento inativo” é um fragmento do gene que codifica uma proteína tendo, por exemplo, menos do que cerca de 10 % (por exemplo, menos do que cerca de 9 %, menos do que cerca de 8 %, menos do que cerca de 7 %, menos do que cerca de 6 %, menos do que cerca de 5 %, menos do que cerca de 4 %, menos do que cerca de 3 %, menos do que cerca de 2 %, menos do que cerca de 1 %, ou 0 %) da atividade da proteína produzida a partir de sequência codificadora do gene de comprimento total. Uma tal porção de um gene é inserida em um vetor em um tal modo que nenhuma sequência promotora conhecida é ligada de maneira operável à sequência do gene, mas que um códon de terminação e uma sequência de terminação de transcrição são ligados de maneira operável à porção da sequência do gene. Este vetor pode ser subsequentemente linearizado na porção da sequência do gene e transformado em uma célula. Por via de recombinação homóloga única, este vetor linearizado é, em seguida, integrado na contraparte endógena do gene com sua inativação.

[0177]Expressão em um micro-organismo recombinante destes genes pode resultar na conversão de geranilgeranil difosfato para esteviol.

B. Polipeptídeos de Biossíntese de Glicosídeo de Esteviol

[0178]Células hospedeiras recombinantes são descritas aqui que podem converter esteviol para um glicosídeo de esteviol. Tais hospedeiros (por exemplo, microorganismos) contém genes que codificam uma ou mais Glicosil Transferases UDP, também conhecidas como UGTs. UGTs transferem uma unidade de monossacarídeo a partir de um açúcar de nucleotídeo ativado a uma porção aceitante, neste caso, uma porção de -OH ou -COOH em esteviol ou derivado de esteviol ou uma porção de -OH em uma glicose já ligada à estrutura de esteviol. UGTs foram classificadas em famílias e subfamílias com base na homologia da sequência. Veja, Li et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 4338 - 4343.

Polipeptídeos de Biossíntese de Rubusosídeo

[0179]Biossíntese de rubusosídeo envolve glicosilação do 13-OH e do 19- COOH de esteviol. Veja, Figura 1. Conversão de esteviol para rubusosídeo em um hospedeiro recombinante, tal como um micro-organismo pode ser realizada por expressão de genes que codificam UGTs 85C2 e 74G1, que transferem uma unidade de glicose a 13-OH ou a 19-COOH, respectivamente, de esteviol.

[0180]Um UGT85C2 adequado funciona como uma uridina 5’-difosfogluco- sil:esteviol 13-OH transferase, e uma uridina 5’-difosfoglucosil:esteviol-19-O-glicosí- deo 13-OH transferase. Reações exemplares para UGT85C2 incluem conversão de esteviol e UDP-glicose para Esteviol-13-O-glicosídeo ou conversão de Esteviol-19-O- glicosídeo e UDP-glicose para Rubusosídeo. Veja, Figura 1. Polipeptídeos UGT85C2 funcionais também podem catalisar as reações de glucosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol exceto esteviol e esteviol-19-O-glicosídeo.

[0181]Um polipeptídeo UGT74G1 adequado funciona como uma uridina 5’- difosfo glucosil:esteviol 19-COOH transferase e uma uridina 5’-difosfo glucosil:este- viol-13-O-glicosídeo 19-COOH transferase. Reações exemplares de 74G1 incluem conversão de esteviol para esteviol-19-O-glicosídeo e conversão de esteviol-13-O-gli- cosídeo para Rubusosídeo. Veja, Figura 19 para estes e outros exemplos não limitan- tes de reações de UGT74G1. Polipeptídeos UGT74G1 funcionais também podem ca-talisar as reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de es- teviol exceto esteviol e esteviol-13-O-glicosídeo, ou que transferem porções de açúcar a partir de doadores exceto uridina difosfato glicose.

[0182]Um micro-organismo recombinante que expressa um UGT74G1 funcional e um UGT85C2 funcional pode fazer rubusosídeo e ambos monosídeos de este- viol (isto é, 13-O-monoglucosídeo de esteviol e 19-O-monoglucosídeo de esteviol) quando esteviol é usado como uma matéria-prima no meio. Tipicamente, entretanto, os genes que codificam UGT74G1 e UGT85C2 são genes recombinantes que foram transformados em um hospedeiro (por exemplo, micro-organismo) que naturalmente não o possui.

[0183]Como usado aqui, o termo “hospedeiro recombinante” é intencionado a referir-se a (incluindo mas não limitado a) uma célula hospedeira, o genoma de que tem sido aumentado por pelo menos uma sequência de DNA incorporada; exemplos extracromossomais, como plasmídeos em bactérias e epissomas compreendendo o círculo de 2 mícrons em levedura. Tais sequências de DNA incluem, mas não são limitadas a, genes que não estão naturalmente presentes, sequências de DNA que não são normalmente transcritas em RNA ou traduzidas em uma proteína (“expressada”), e outros genes ou sequências de DNA que se desejam introduzir no hospedeiro não recombinante. Será avaliado que, tipicamente, o genoma de um hospedeiro recombinante descrito aqui é aumentado através da introdução estável de um ou mais genes recombinantes. Geralmente, o DNA introduzido não é originalmente residente no hospedeiro que é o recipiente do DNA, mas está dentro do escopo da invenção para isolar um segmento de DNA a partir de um determinado hospedeiro, e para introduzir subsequentemente uma ou mais cópias adicionais daquele DNA no mesmo hospedeiro, por exemplo, para realçar a produção do produto de um gene ou alterar a expressão padrão de um gene. Em alguns casos, o DNA introduzido modificará ou substituir ainda um gene endógeno ou sequência de DNA por, por exemplo, recombi- nação homóloga ou mutagênese dirigida ao sítio. Hospedeiros recombinantes adequados incluem micro-organismos, células de mamífero, células de inseto, células fúngicas, células de planta, e plantas.

[0184]O termo “gene recombinante” refere-se a um gene ou sequência de DNA que é introduzido em um recipiente hospedeiro, independentemente do fato de o mesmo ou um gene ou sequência de DNA similar poder já estar presente em um tal hospedeiro. “Introduzido” ou “aumentado” neste contexto, é conhecido na técnica para significar introduzido ou aumentado pelo mão do homem. Assim, um gene recombi- nante pode ser uma sequência de DNA a partir de uma outra espécie, ou pode ser uma sequência de DNA que originou de ou está presente na mesma espécie, mas foi incorporada em um hospedeiro por métodos recombinantes para formar um hospedeiro recombinante. Será avaliado que um gene recombinante que é introduzido em um hospedeiro pode ser idêntico a uma sequência de DNA que está normalmente presente no hospedeiro sendo transformado, e é introduzido para fornecer uma ou mais cópias adicionais do DNA para desse modo permitir superexpressão ou expressão modificada (incluindo mas não limitada a regulada ou induzível) do produto de gene daquele DNA.

[0185]Polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 adequados incluem aqueles feitos por S. rebaudiana. Genes que codificam UGT74G1 funcional e polipeptídeos UGT85C2 de Stévia são relatados em Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56 - 67. Sequências de aminoácidos de polipeptídeos UGT74G1 (SEQ ID NO: 19) e UGT85C2 (SEQ ID NO: 26) de S. rebaudiana são apresentados nas SEQ ID NOs: 1 e 3, respectivamente, do Pedido PCT No PCT/US2012/050021, como são sequências de nucleotídeos que codificam UGT74G1 e UGT85C2 que foram otimizadas para a expressão em levedura e sequência otimizada por códon 2,0 de DNA para UGTs 85C2, 91D2e, 74G1 e 76G1. A sequência de nucleotídeo otimizada por códon de Técnica de Gene que codifica um UGT85C2 de S. rebaudiana é apresentada na SEQ ID NO: 3. Veja também, as variantes de UGT85C2 e UGT74G1 descritas abaixo na seção “Homólogo Funcional”. Por exemplo, um polipeptídeo UGT85C2 pode conter substituições em qualquer uma das posições 65, 71, 270, 289, e 389 (por exemplo, A65S, E71Q, T270M, Q289H, e A389V) ou uma combinação destes.

[0186]Em algumas formas de realização, o hospedeiro recombinante é um micro-organismo. Micro-organismo recombinante pode ser cultivado em meios contendo esteviol de modo a produzir rubusosídeo. Em outras formas de realização, entretanto, o micro-organismo recombinante expressa genes envolvidos em biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO, e um gene KAH. Polipeptídeos CDPS adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas CDPS adequadas incluem aquelas feitas por S. rebaudiana, Streptomyces clavuligerus, Bradyrhizobium japonicum, Zea mays, e Arabidopsis sp. Veja, por exemplo, Tabela 6 e Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, que estão aqui incorporados como referência em sua totalidade.

[0187]Em algumas formas de realização, polipeptídeos CDPS que carecem de um peptídeo de trânsito de cloroplasto no amino terminal do polipeptídeo não modificado podem ser usados. Por exemplo, os primeiros 150 nucleotídeos a partir da extremidade 5’ da sequência codificadora de CDPS de Zea mays (SEQ ID NO: 12) podem ser removidos, a sequência de nucleotídeo truncada é mostrada na SEQ ID NO: 133. Fazendo isso, remove os 50 resíduos amino terminais da sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 13, que codifica um peptídeo de trânsito de cloro- plasto; a sequência de aminoácidos truncada é mostrada na SEQ ID NO: 134. O gene CDPS truncado pode ser equipado com um novo sítio de início de tradução de ATG e ligado de maneira operável a um promotor, tipicamente, um promotor constitutivo ou que expressa fortemente. Quando uma pluralidade de cópias, incluindo mas não limitadas a, uma cópia, duas cópias ou três cópias da sequência codificadora truncada é introduzida em um micro-organismo, a expressão do polipeptídeo CDPS a partir do promotor resulta em um fluxo de carbono aumentado para a biossíntese de ent-cau- reno. Tabela 6. Clones de CDPS.

[0188]As proteínas bifuncionais CDPS-KS também podem ser usadas. Sequências de nucleotídeos que codificam as enzimas bifuncionais CDPS-KS mostradas na Tabela 7 foram modificadas para a expressão em levedura (veja Pedido PCT No PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade). Uma enzima bifuncional de Gibberella fujikuroi também pode ser usada. Tabela 7. C ones de CDPS-KS.

[0189]Assim, um micro-organismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH além de um gene UGT74G1 e UGT85C2 é capaz de produzir monosídeos e rubusosídeo de esteviol sem a necessidade de usar esteviol como uma matéria-prima.

[0190]Em algumas formas de realização, o micro-organismo recombinante ainda expressa um gene recombinante que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase (GGPPS). Polipeptídeos GGPPS adequados são conhecidos. Por exemplo, as enzimas GGPPS adequadas incluem aquelas feitas por S. rebaudiana, Gibberella fujikuroi, Mus musculus, Thalassiosira pseudonana, Streptomyces clavuligerus, Sulfu- lobus acidocaldarius, Synechococcus sp. e A. thaliana. Veja, Tabela 8 e Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, que estão aqui incorporados como referência em sua totalidade. Tabela 8. Clones de GGPPS.

[0191]Em alguns aspectos, o gene KAH que codifica o polipeptídeo KAH apre-sentado na SEQ ID NO: 11, compreendendo uma célula recombinante da invenção é sobre expressada. Em alguns aspectos, o gene KAH pode estar presente em (incluindo mas não limitado a) uma, duas ou três cópias. Em alguns aspectos, o gene KS que codifica o polipeptídeo KS, apresentado na SEQ ID NO: 21, compreendendo uma célula recombinante da invenção é sobre expressada. Em alguns aspectos, o gene KS pode estar presente em (incluindo mas não limitado a) uma, duas ou três cópias.

[0192]Em algumas formas de realização, o micro-organismo recombinante ainda pode expressar genes recombinantes envolvidas em biossíntese de diterpeno ou produção de precursores terpenóides, por exemplo, genes na via de metileritritol 4-fosfato (MEP) ou genes na via de mevalonato (MEV) debatidos abaixo, têm atividade fosfatase reduzida e/ou expressam uma sacarose sintase (SUS) como debatidos aqui. Polipeptídeos de Biossíntese de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D e Re- baudiosídeo E

[0193]Biossíntese de Rebaudiosídeo A envolve glucosilação do esteviol de aglicona. Especificamente, Rebaudiosídeo A pode ser formado por glucosilação do 13-OH de esteviol que forma o 13-O-esteviolmonosídeo, glucosilação de C-2’ da 13- O-glicose de esteviolmonosídeo que forma esteviol-1,2-biosídeo, glucosilação de C19 carboxil de esteviol-1,2-biosídeo que forma esteviosídeo, e glucosilação de C-3’ da C-13-O-glicose de esteviosídeo para produzir Reb A. A ordem em que cada reação de glucosilação ocorre pode variar. Veja, Figura 1.

[0194]Biossíntese de Rebaudiosídeo E e/ou Rebaudiosídeo D envolve gluco- silação do esteviol de aglicona. Especificamente, Rebaudiosídeo E pode ser formado por glucosilação do 13-OH de esteviol que forma esteviol-13-O-glicosídeo, glucosila- ção de C-2’ da 13-O-glicose de esteviol-13-O-glicosídeo que forma o esteviol-1,2-bio- sídeo, glucosilação de C-19 carboxil do 1,2-biosídeo para formar 1,2-esteviosídeo, e glucosilação de C-2’ da 19-O-glicose do 1,2-esteviosídeo para formar Rebaudiosídeo E. Rebaudiosídeo D pode ser formado por glucosilação de C-3’ da C-13-O-glicose de Rebaudiosídeo E. A ordem em que cada reação de glicosilação ocorre pode variar. Por exemplo, a glucosilação de C-2’ da 19-O-glicose pode ser a última etapa na via, em que Rebaudiosídeo A é um intermediário na via. Veja, Figura 1.

Polipeptídeos de Rebaudiosídeo M

[0195]Como fornecido aqui, a conversão de esteviol para Rebaudiosídeo M em um hospedeiro recombinante pode ser realizada expressando as combinações de UGTs:91D2, EUGT11, 74G1, 85C2 e 76G1 funcional. Veja, Figura 1. É particularmente útil expressar EUGT11 em altos níveis usando um plasmídeo de alto número de cópias, ou usando um promotor forte, ou múltiplo cópias integradas do gene, ou epissoma sob seleção para alto número de cópias do gene. Assim, um micro- organismo recombinante expressando combinações destes UGTs pode fazer Rebau- diosídeo A (85C2; 76G1; 74G1; 91D2e), Rebaudiosídeo D (85C2; 76G1; 74G1; 91D2e; EUGT11), Rebaudiosídeo E (85C2; 74G1; 91D2e; EUGT11), ou Rebaudiosí- deo M (85C2; 76G1; 74G1; 91D2e; EUGT11). Veja, Figura 1. Tipicamente, um ou mais destes genes são genes recombinantes que foram transformados em um micro-organismo que naturalmente não o possui. Também tem sido descoberto que UGTs designados aqui como SM12UGT podem ser substituídos no lugar de UGT91D2.

[0196]Produção alvejada de Rebaudiosídeos individuais pode ser realizada por números de cópias diferenciais dos genes que codificam UGT (veja, Figura 1) na célula recombinante, forças promotoras diferenciais e/ou utilizando mutantes com es- pecificidade/atividade aumentada para o produto de interesse. Por exemplo, baixos níveis de Rebaudiosídeo D, E, e M serão formados se EUGT11 é expressado em baixos níveis em comparação com outros UGTs, o que favoreceriam a formação de Rebaudiosídeo A. Altos níveis de expressão de EUGT11 resultam na produção de mais 19-O 1,2 diglucosídeo que podem servir como substrato para UGT76G1 para formar Rebaudiosídeo M. Em certas formas de realização vantajosas, cópias adicionais ou versões mutantes de UGT76G1 em células recombinantes da invenção podem melhorar a taxa de formação de Rebaudiosídeo M de Rebaudiosídeo D.

[0197]Em algumas formas de realização, UGT76G1 catalisa a glicosilação de esteviol e glicosídeos de esteviol na posição 19-O. Assim, em algumas formas de realização, um ou mais de RebM, RebQ, RebI, glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, éster [2-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopirano- sil]), ou glicosídeo de esteviol tri-glicosilado ((ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; éster [2-O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil]) são produzidos em um hospedeiro recombinante que expressa um gene recombinante que codifica um polipeptídeo UGT76G1, através da bioconversão, ou através da catálise por UGT76G1 in vitro. Em algumas formas de realização, UGT76G1 catalisa a glicosilação de esteviol e glicosídeos de esteviol na posição 13-O e, preferencialmente, glicosila substratos de glicosídeo de esteviol que são 1,2-di-glicosilados na posição 13-O ou mono-glicosilados na posição 13-O. Em algumas formas de realização, UGT76G1 não mostra uma preferência para o estado de glicosilação da posição 19-O.

[0198]Em alguns aspectos, uma célula hospedeira recombinante da invenção compreende o gene que codifica o polipeptídeo UGT76G1 apresentado na SEQ ID NO: 2. Em alguns aspectos, o gene que codifica o polipeptídeo UGT76G1 apresentado na SEQ ID NO: 2, compreendendo uma célula recombinante da invenção é sobre expressada. Em alguns aspectos, o gene pode estar presente em (incluindo mas não limitado a) duas ou três cópias.

[0199]Em algumas formas de realização, o gene que codifica o polipeptídeo UGT76G1 apresentado na SEQ ID NO: 2 está presente em uma cópia. Como mostrado na Figura 12 (Exemplo 9), um menor número de cópias (uma cópia) do gene que codifica o polipeptídeo UGT76G1 resulta em menor expressão de UGT76G1 e aumenta a razão de Rebaudiosídeo D/Rebaudiosídeo M.

[0200]Em algumas formas de realização, menos do que cinco (por exemplo, um, dois, três ou quatro) UGTs são expressados em um hospedeiro. Por exemplo, um micro-organismo recombinante expressando um EUGT11 funcional pode fazer Re- baudiosídeo D quando Rebaudiosídeo A é usado como uma matéria-prima. Um microorganismo recombinante expressando um UGT76G1 funcional pode fazer Rebaudio- sídeo M quando Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo E é usado como uma matéria- prima. Rebaudiosídeo M pode ser formado a partir de Rebaudiosídeo D ou Rebaudi- osídeo E por glucosilação de C-3’ da 19-O-glicose de Rebaudiosídeo D ou Rebuadio- sídeo E; no caso de Rebaudiosídeo E, uma segunda glucosilação é necessária, da 13-O-glicose para produzir Rebaudiosídeo M.

[0201]Um micro-organismo recombinante expressando EUGT11, 74G1 ou 76G1, e 91D2 pode fazer Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M quando rubusosídeo ou 1,2-esteviosídeo é usado como uma matéria-prima. Como uma outra alternativa, um micro-organismo recombinante expressando EUGT11, 74G1, 76G1, e 91D2 pode fazer Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M quando o monosídeo, esteviol-13-O-gli- cosídeo são adicionados ao meio. Similarmente, a conversão de esteviol-19-O-glico- sídeo para Rebaudiosídeo D em um micro-organismo recombinante pode ser realizada expressando nos genes da célula que codificam UGTs EUGT11, 85C2, 76G1 e 91D2e, quando alimentados esteviol-19-O-glicosídeo.

[0202]Polipeptídeos UGT74G1 e UGT85C2 adequados incluem aqueles debatidos acima. Um UGT76G1 adequado adiciona uma porção de glicose a C-3’ da C- 13-O-glicose da molécula aceitante, um 1,2 glicosídeo de esteviol. UGT76G1 funciona, por exemplo, como uma uridina 5’-difosfo glucosil:esteviol 13-O-1,2 glicosídeo C3’ glucosil transferase e uma uridina 5’-difosfo glucosil:esteviol-19-O-glicose, 13-O-1,2 biosídeo C-3’ glucosil transferase. Polipeptídeos UGT76G1 funcionais também podem catalisar as reações de glucosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que contêm açúcares exceto glicose, por exemplo, ramnosídeos de esteviol e xilosídeos de esteviol. Veja, Figura 1. Polipeptídeos UGT76G1 adequados incluem aqueles feitos por S. rebaudiana e relatados em Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56 - 67. Uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo UGT76G1 de S. re- baudiana otimizado para expressão em levedura é apresentada na SEQ ID NO: 14. Veja, também as variantes de UGT76G1 apresentadas na seção “Homólogo Funcio-nal”.

[0203]Um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91d2 adequado funciona como uma uridina 5’-difosfo glucosil:esteviol-13-O-glicosídeo transferase (também referido como um esteviol-13-monoglucosídeo 1,2-glucosilase), transferindo uma porção de glicose a C-2’ da 13-O-glicose da molécula aceitante, esteviol-13-O-glicosídeo.

[0204]Um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91d2 adequado também funciona como uma uridina 5’-difosfo glucosil:rubusosídeo transferase transferindo uma porção de glicose a C-2’ da 13-O-glicose da molécula aceitante, rubusosídeo, para produzir esteviosídeo. Polipeptídeos EUGT11 também podem transferir uma porção de glicose a C-2’ da 19-O-glicose da molécula aceitante, rubusosídeo, para produzir um 19-O- 1,2-rubusosídeo diglicosilado (veja, Figura 1).

[0205]O polipeptídeo EUGT11 ou UGT91d2 funcional também pode catalisar as reações que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol exceto esteviol-13-O-gli- cosídeo e rubusosídeo. Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 funcional pode utilizar esteviosídeo como um substrato, transferindo uma porção de glicose a C-2’ do resíduo de 19-O-glicose para produzir Rebaudiosídeo E (veja, Figura 1). Polipeptídeos EUGT11 e UGT91d2 funcionais também podem utilizar Rebaudiosídeo A como um substrato, transferindo uma porção de glicose a C-2’ do resíduo de 19-O-glicose de Rebaudiosídeo A para produzir Rebaudiosídeo D. EUGT11 pode converter Rebaudi- osídeo A para Rebaudiosídeo D em uma taxa que é menos 20 vezes mais rápida (por exemplo, como menos 25 vezes ou pelo menos 30 vezes mais rápida) do que a taxa correspondente de UGT91D2e do tipo selvagem (SEQ ID NO: 15) quando as reações são realizadas sob condições similares, isto é, tempo similar, temperatura, pureza, e concentração de substrato. Como tal, EUGT11 produz maiores quantidades de RebD do que UGT91D2e sob condições similares em células ou in vitro, sob condições onde o EUGT11 sensível a temperatura é estável.

[0206]Além disso, um EUGT11 funcional exibe atividade de C-2’ 19-O-diglico- silação significante com rubusosídeo ou esteviosídeo como substratos, enquanto que UGT91D2e não tem atividade de diglicosilação detectável com estes substratos sob algumas condições. Assim, um EUGT11 funcional pode ser distinguido de UGT91D2e pelas diferenças em especificidade de substrato de glicosídeo de esteviol.

[0207]Um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91d2 funcional não transfere uma porção de glicose para compostos de esteviol tendo um 1,3-glicose ligada na posição C-13, isto é, a transferência de uma porção de glicose para esteviol-1,3-biosídeo e 1,3-esteviosídeo (RebG) não ocorre.

[0208]Os polipeptídeos EUGT11 e UGT91d2 funcionais podem transferir porções de açúcar a partir de doadores exceto uridina difosfato glicose. Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91d2 funcional pode agir como uma uridina 5’-difosfo D- xilosil:esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção de xilose a C-2’ da 13-O-glicose da molécula aceitante, esteviol-13-O-glicosídeo. Como um outro exemplo, um polipeptídeo EUGT11 ou UGT91d2 funcional pode agir como uma uri- dina 5’-difosfo L-rhamnosil:esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção de ramnose a C-2’ da 13-O-glicose da molécula aceitante, esteviol-13-O-glicosí- deo.

[0209]Os polipeptídeos EUGT11 adequados são descritos aqui e podem incluir o polipeptídeo EUGT11 de Oryza sativa (Acesso Genbank No AC133334; SEQ ID NO: 16). Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 pode ter uma sequência de ami- noácidos com pelo menos 70 % de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99 % de identidade de sequência) à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16. A sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de EUGT11 também é apresentada na SEQ ID NO: 17, como é uma sequência de nucleotídeo otimizada por códon para a expressão em levedura (SEQ ID NO: 18).

[0210]Os polipeptídeos UGT91d2 funcionais adequados incluem, por exemplo, os polipeptídeos designados UGT91D2e e UGT91D2m e homólogos funcionais como descrito aqui. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo UGT91d2e exemplar de S. rebaudiana é apresentada na SEQ ID NO: 15, como é a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo UGT91d2e que foi otimizada por códon para a expressão em levedura (SEQ ID NO: 89). As sequências de aminoácidos de poli- peptídeos UGT91D2m exemplares (SEQ ID NO: 86) de S. rebaudiana são apresentados como SEQ ID NO: 10 no Pedido PCT No PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade. Além disso, as variantes de UGT91D2 contendo uma substituição em resíduos de aminoácido 206, 207, e 343 podem ser usadas. Por exemplo, a sequência de aminoácidos tendo mutações G206R, Y207C e W343R com respeito a UGT91D2e do tipo selvagem pode ser usada. Além disso, uma variante de UGT91D2 contendo substituições nos resíduos de aminoácido 211 e 286 pode ser usada. Por exemplo, uma variante de UGT91D2 pode incluir uma substituição de uma metionina para leucina na posição 211 e uma substituição de uma alanina para valina na posição 286 (referida como UGT91D2e-b). Estas variantes, L211M e V286A, são variantes da SEQ ID NO: 5 de PCT/US2012/050021, que é aqui divulgado como SEQ ID NO: 66. Variantes adicionais podem incluir variantes (exceto variantes de T144S, M152L, L213F, S364P e G384C) descritas na Tabela 12 e Exemplo 11 do PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade.

[0211]Como indicado acima, UGTs designados aqui como SM12UGT podem ser substituídos no lugar de UGT91D2. Polipeptídeos SM12UGT funcionais adequados incluem aqueles feitos por Ipomoea purpurea (Glória da manhã japonesa) e descrita em Morita et al., 2005, Plant J. 42, 353 - 363. A sequência de aminoácidos que codifica o IP3GGT de I. purpurea (SEQ ID NO: 67) (que está apresentada no Pedido PCT No PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade) como uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 68) que codifica o poli- peptídeo e que foi otimizada por códon para a expressão em levedura. Um outro poli- peptídeo SM12UGT adequado é um polipeptídeo UGT94B1 tendo uma mutação de R25S (polipeptídeo Bp94B1). Veja, Osmani et al., 2008, Plant Phys. 148: 1295 - 1308 e Sawada et al., 2005, J. Biol. Chem. 280: 899 - 906. A sequência de aminoácidos do UGT94B1 de Bellis perennis (margarida vermelha) (SEQ ID NO: 69) e a sequência de nucleotídeo que foi otimizada por códon para a expressão em levedura (SEQ ID NO: 70) são apresentadas no Pedido PCT No PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade.

[0212]Em algumas formas de realização, o micro-organismo recombinante é cultivado em meios contendo esteviol-13-O-glicosídeo ou esteviol-19-O-glicosídeo de modo a produzir Rebaudiosídeo M. Em tais formas de realização, o micro-organismo contém e expressa genes que codificam um EUGT11 funcional, um UGT74G1 funcional, um UGT85C2 funcional, um UGT76G1 funcional, e um funcional UGT91D2, e é capaz de acumular Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo M ou uma combinação destes, dependendo dos níveis relativos de atividades de UDP-glicosil transferase, quando esteviol, um ou ambos dos esteviolmonosídeos, ou rubusosídeo é usado como matéria-prima.

[0213]Em outras formas de realização, o micro-organismo recombinante é cultivado em meios contendo rubusosídeo de modo a produzir Rebaudiosídeo A, D, ou M. Em tais formas de realização, o micro-organismo contém e expressa genes que codificam um EUGT11 funcional, um UGT76G1 funcional, e um funcional UGT91D2, e é capaz de produzir Rebaudiosídeo A, D, M ou uma combinação destes, dependendo dos níveis relativos de atividades de UDP-glicosil transferase, quando rubuso- sídeo é usado como matéria-prima.

[0214]Em outras formas de realização o micro-organismo recombinante expressa genes envolvidos em biossíntese de esteviol, por exemplo, um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e/ou um gene KAH. Assim, por exemplo, um micro-organismo contendo um gene CDPS, um gene KS, um gene KO e um gene KAH, além de um EUGT11, um UGT74G1, um UGT85C2, um UGT76G1, e um UGT91D2 funcional (por exemplo, UGT91D2e), é capaz de produzir Rebaudiosídeo A, D, E e/ou M sem a necessidade de incluir esteviol nos meios de cultura.

[0215]Em algumas formas de realização, o hospedeiro recombinante ainda contém e expressa um gene GGPPS recombinante de modo a fornecer níveis aumentados do geranilgeranil difosfato de diterpeno precursor, para fluxo aumentado através da via biossintética de esteviol.

[0216]Em algumas formas de realização, o hospedeiro recombinante ainda contém uma construção para paralisar a expressão de vias de não-esteviol consumindo geranilgeranil difosfato, ácido ent-caurenóico ou farnesil pirofosfato, desse modo fornecendo fluxo aumentado através das vias biossintéticas de esteviol e glico- sídeos de esteviol. Como debatido abaixo, o fluxo para as vias de produção de esterol, tais como ergosterol pode ser reduzido por regulação para baixo do gene ERG9. Em células que produzem giberelinas, a síntese de giberelina pode ser regulada para baixo para aumentar o fluxo de ácido ent-caurenóico para esteviol. Em organismos produtores de carotenóide, o fluxo para esteviol pode ser aumentado por regulação para baixo de um ou mais genes biossintéticos de carotenóide. Em algumas formas de realização, o micro-organismo recombinante ainda pode expressar os genes re- combinantes envolvidos em biossíntese de diterpeno ou produção de precursores ter- penóides, por exemplo, genes nas vias MEP ou MEV debatidos abaixo, têm atividade fosfatase reduzida e/ou expressam um SUS como debatido aqui.

[0217]Uma pessoa com habilidade na técnica reconhecerá que modulando níveis de expressão relativos de diferentes genes de UGT, um hospedeiro recombi- nante pode ser adaptado para produzir especificamente os produtos de glicosídeo de esteviol em uma proporção desejada. Regulação transcricional de genes de biossín- tese de esteviol e genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol pode ser obtida por uma combinação de ativação e repressão transcricional usando técnicas conhecidas àqueles na técnica. Para reações in vitro, uma pessoa com habilidade na técnica reconhecerá que a adição de diferentes níveis de enzimas UGT em combinação ou sob condições que impactam as atividades relativas de diferentes UGTS em combinação dirigirá a síntese para uma proporção desejada de cada glicosídeo de esteviol. Uma pessoa com habilidade na técnica reconhecerá que uma proporção mais elevada de Rebaudiosídeo D ou M, ou conversão mais eficiente para Rebaudiosídeo D ou M pode ser obtida com uma enzima de diglicosilação que tem uma maior atividade para a reação de 19-O-glicosídeo em comparação com a reação de 13-O-glicosídeo (substratos Rebaudiosídeo A e esteviosídeo).

[0218]Em algumas formas de realização, um hospedeiro recombinante tal como um micro-organismo produz composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas com Rebaudiosídeo M que têm maior do que pelo menos 3 % de Rebaudiosídeo M em peso total de glicosídeos de esteviol, por exemplo, pelo menos 4 % de Rebau- diosídeo M, pelo menos 5 % de Rebaudiosídeo M, pelo menos 10 a 20 % de Rebau- diosídeo M, pelo menos 20 a 30 % de Rebaudiosídeo M, pelo menos 30 a 40 % de Rebaudiosídeo M, pelo menos 40 a 50 % de Rebaudiosídeo M, pelo menos 50 a 60 % de Rebaudiosídeo M, pelo menos 60 a 70 % de Rebaudiosídeo M, ou pelo menos 70 a 80 % de Rebaudiosídeo M. Outros glicosídeos de esteviol presentes podem incluir aqueles descritos na Figura 1, tais como monosídeos de esteviol, glucobiosídeos de esteviol, Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, e esteviosídeo. Em algumas formas de realização, a composição enriquecida com Rebaudiosídeo M produzida pelo hospedeiro (por exemplo, micro-organismo) pode ser ainda purificada e o Rebaudiosídeo M assim purificado pode, em seguida, ser misturado com outros glicosídeos de esteviol, sabores, ou adoçantes para se obter um sistema de sabor desejado ou composição edulcorante. Por exemplo, uma composição enriquecida com Rebaudiosídeo M produzida por um hospedeiro recombinante pode ser combinada com uma composição enriquecida com Rebaudiosídeo A, C, D ou E produzida por um diferente hospedeiro recombinante, com Rebaudiosídeo A, C, D, ou E purificado a partir de um extrato de Stévia, ou com Rebaudiosídeo A, C, D, ou E produzido in vitro.

[0219]Em algumas formas de realização, o Rebaudiosídeo M pode ser produzido usando métodos in vitro enquanto fornecendo o açúcar de UDP apropriado e/ou um sistema livre de célula para a regeneração de açúcares de UDP. Em algumas formas de realização, sacarose e uma sacarose sintase podem ser fornecidas no vaso de reação de modo a regenerar UDP-glicose a partir de UDP generado durante as reações de glicosilação. A sacarose sintase pode ser de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência codificadora de sacarose sintase a partir de A. thaliana, S. rebaudiana ou Coffea arabica pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob controle de um promotor adequado, e expressada em um hospedeiro, tal como um micro-organismo ou uma planta.

[0220]Múltiplas reações que necessitam de conversões podem ser realizadas juntas, ou gradualmente. Por exemplo, Rebaudiosídeo M pode ser produzido a partir de Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo E que é comercialmente disponível como um extrato enriquecido ou produzido via biossíntese, com a adição de quantidades este- quiométricas ou em excesso de UDP-glicose e UGT76G1. Como uma alternativa, Re- baudiosídeo D e Rebaudiosídeo M podem ser produzidos a partir de extratos de gli- cosídeo de esteviol que são enriquecidos para esteviosídeo e Rebaudiosídeo A, usando EUGT11 e uma enzima UGT76G1 adequada. Em algumas formas de realização, as fosfatases são usadas para remover produtos secundários e melhorar os rendimentos de reação. UGTs e outras enzimas para reações in vitro podem ser fornecidos nas formas solúveis ou nas formas imobilizadas.

[0221]Em algumas formas de realização, Rebaudiosídeo M pode ser produzido usando células inteiras que são matérias-primas alimentadas que contêm moléculas precursoras tais como esteviol e/ou glicosídeos de esteviol, incluindo misturas de glicosídeos de esteviol derivadas de extratos de planta. As matérias-primas podem ser alimentadas durante o crescimento celular ou depois do crescimento celular. As células inteiras podem estar em suspensão ou imobilizadas. As células inteiras podem ser capturadas em gotas, por exemplo, gotas de alginato de cálcio ou sódio. As células inteiras podem ser ligadas a um sistema de reator de tubo de fibra oco. As células inteiras podem ser concentradas e capturadas dentro de um sistema de reator de membrana. As células inteiras podem ser em caldo de fermentação ou em um tampão de reação. Metodologia similar pode ser aplicada à fermentação de células recombi- nantes.

[0222]Em algumas formas de realização, um agente permeabilizante é utilizado para a transferência eficiente de substrato nas células. Em algumas formas de realização, as células são permeabilizadas com um solvente tal como tolueno, ou com um detergente tal como Triton-X ou Tween. Em algumas formas de realização, as células são permeabilizadas com um tensoativo, por exemplo, um tensoativo catiônico tal como brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). Em algumas formas de realização, as células são permeabilizadas com choque mecânico periódico tal como eletropora- ção ou um choque osmótico ligeiro. As células podem conter um UGT recombinante ou múltiplos UGTs recombinantes. Por exemplo, as células podem conter UGT76G1, 91D2e, 85C2, 74G1 e EUGT11 tais que as misturas de esteviol e/ou glicosídeos de esteviol são eficientemente convertidas para Rebaudiosídeo M. Em algumas formas de realização, as células inteiras são as células hospedeiras descritas abaixo. Em algumas formas de realização, as células inteiras são uma bactéria Gram-negativa, tal como E. coli. Em algumas formas de realização, a célula inteira é uma bactéria Gram-positiva, tal como Bacillus. Em algumas formas de realização, a célula inteira é uma espécie fúngica, tal como Aspergillus, ou levedura tal como Saccharomyces. Em algumas formas de realização, o termo “biocatálise de célula inteira” é usado para referir-se ao processo em que as células inteiras são cultivadas como descrito acima (por exemplo, em um meio e opcionalmente permeabilizadas) e um substrato, tal como Rebaudiosídeo D, Rebaudiosídeo E, ou esteviosídeo é fornecido e convertido ao produto final usando as enzimas a partir das células. As células podem ou não ser viáveis, e podem ou não estar crescendo durante as reações de bioconversão. Ao contrário, na fermentação, as células são cultivadas em um meio de crescimento e alimentadas com uma fonte de carbono e energia, tal como glicose e o produto final é produzido com células viáveis.

C. Outros Polipeptídeos

[0223]Os genes para os polipeptídeos adicionais, cuja expressão facilita a produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol mais eficiente ou grande escala também podem ser introduzidos em um hospedeiro recombinante. Por exemplo, um microorganismo recombinante, planta, ou célula vegetal também podem conter um ou mais genes que codificam uma geranilgeranil difosfato sintase (GGPPS, também referida como GGDPS). Como um outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma ramnose sintetase ou um ou mais genes que codificam uma UDP-glicose desidrogenase e/ou uma UDP-ácido glucurônico decarboxi- lase. Como um outro exemplo, um hospedeiro recombinante também pode conter um ou mais genes que codificam uma citocromo P450 redutase (CPR). Expressão de um CPR recombinante facilita o ciclismo de NADP+ para regenerar NADPH, que é utilizado como um cofactor para a biossíntese de terpenóide. Outros métodos podem ser usados para regenerar bem os níveis de NADHP. Em circumstâncias onde NADPH torna-se limitante, por exemplo, as cepas podem ser ainda modificadas para incluir genes exógenos transhidrogenase . Veja, por exemplo, Sauer et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 6613 - 6619. Outros métodos são conhecidos àqueles com habilidade na técnica para reduzir ou de outro modo modificar a razão de NADH/NADPH, tal que o nível de cofactor desejado é aumentado.

[0224]Como um outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma sacarose sintase, e adicionalmente pode conter genes de captação de sacarose se desejado. A reação de sacarose sintase pode ser usada para aumentar a UDP-glicose em um hospedeiro de fermentação, ou em um processo de bioconversão de célula inteira. Isto regenera a UDP-glicose a partir de UDP produzido durante a glicosilação e sacarose, considerando glicosilação eficiente. Em alguns organismos, a disrupção da endógeno invertase é vantajosa para prevenir a degradação de sacarose. Por exemplo, a SUC2 invertase de S. cerevisiae pode ser interrompida. A sacarose sintase (SUS) pode ser de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência codificadora de sacarose sintase de, sem limitação, A. thaliana, S. rebaudiana, ou C. arabica pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob controle de um promotor adequado, e expressada em um hospedeiro (por exemplo, um micro-organismo ou uma planta). A sacarose sintase pode ser expressada em uma tal cepa em combinação com um transportador de sacarose (por exemplo, o transportador de SUC1 de A. thaliana ou um homólogo funcional deste) e um ou mais UGTs (por exemplo, UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, e UGT91D2e, EUGT11 ou homólogos funcionais destes). Cultivar o hospedeiro em um meio que contém sacarose pode promover a produção de UDP-glicose, assim como um ou mais glucosídeos (por exemplo, glicosídeos de esteviol).

[0225]A expressão do gene ERG9, que codifica esqualeno sintase (SQS), também pode ser reduzida em hospedeiros recombinantes tal que existe uma acumulação de precursores para esqualeno sintase no hospedeiro recombinante. SQS é classificado sob EC 2.5.1.21 e é a primeira enzima comprometida da via de biossín- tese que leva à produção de esteróis. Catalisa a síntese de esqualeno a partir da farnesil pirofosfato através do pirofosfato de pré-esqualeno intermediário, em que duas unidades de farnesil pirofosfato são convertidas em esqualeno. Esta enzima é uma enzima de ponto de ramificação na biossíntese de terpenóides/isoprenóides e é considerada regular o fluxo de intermediários de isopreno através da via de esterol. A enzima é algumas vezes referida como farnesil-difosfato farnesiltransferase (FDFT1). Além disso, um hospedeiro recombinante pode ter atividade fosfatase reduzida como debatido aqui.

Polipeptídeos de Biossíntese de MEP

[0226]Como um outro exemplo, o hospedeiro recombinante pode conter um ou mais genes que codificam uma ou mais enzimas na via de MEP ou na via de me- valonato. Tais genes são úteis porque eles podem aumantar o fluxo de carbono na via de biossíntese de diterpeno, produzindo geranilgeranil difosfato a partir de difosfato de isopentenila e difosfato de dimetilalila generados pela via. O geranilgeranil difosfato assim produzido pode ser dirigido para esteviol e glicosídeo de biossíntese de esteviol devido à expressão de polipeptídeos de biossíntese de esteviol e polipeptídeos de biossíntese de glicosídeo de esteviol. Veja, por exemplo, Brandle et al., 2007, Phytochemistry 68: 1855 - 1863.

[0227]Em algumas formas de realização, um hospedeiro recombinante contém um ou mais genes que codificam enzimas envolvidas na via de metileritritol 4- fosfato (MEP) para a biossíntese de isoprenóide. Enzimas na via de MEP incluem desoxixilulose 5-fosfato sintase (DXS), D-1-desoxixilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol sintase (CMS), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D- eritritol cinase (CMK), 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintase (MCS), 1-hidróxi-2-metil-2(E)-butenil 4-difosfato sintase (HDS) e 1-hidróxi-2-metil- 2(E)-butenil 4-difosfato redutase (HDR). Um ou mais genes de DXS, genes de DXR, genes de CMS, genes de CMK, genes de MCS, genes de HDS e/ou genes de HDR podem ser incorporados em um micro-organismo recombinante. Veja, Rodríguez- Concepción e Boronat, Plant Phys. 130: 1079 - 1089 (2002).

[0228]Genes adequados que codificam polipeptídeos DXS, DXR, CMS, CMK, MCS, HDS e/ou HDR incluem aqueles feitos por E. coli, A. thaliana e Synechococcus leopoliensis. Sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos DXR (por exemplo, SEQ ID NO: 71) são descritas, por exemplo, na Patente U.S. No 7.335.815.

Polipeptídeos de Biossíntese de Mevalonato

[0229]S. cerevisiae contém genes endógenos que codificam as enzimas de uma via de mevalonato funcional para a síntese de isoprenóide. Em algumas formas de realização, um hospedeiro recombinante também contém um ou mais genes hete- rólogos que codificam enzimas envolvidas na via de mevalonato. Genes adequados para a transformação em um hospedeiro codificam enzimas na via de mevalonato tal como um 3-hidróxi-3-metil-glutaril (HMG)-CoA redutase truncada (tHMG) e/ou um gene que codifica uma mevalonato cinase (MK) e/ou um gene que codifica uma fos- fomevalonate cinase (PMK) e/ou um gene que codifica uma mevalonato pirofosfato decarboxilase (MPPD). Assim, um ou mais genes de HMG-CoA redutase, genes de MK, genes de PMK e/ou genes de MPPD podem ser incorporados em um hospedeiro recombinante, tal como um micro-organismo.

[0230]Genes adequados que codificam os polipeptídeos da via de mevalonato são conhecidos. Por exemplo, polipeptídeos adequados incluem aqueles feitos por E. coli, Paracoccus denitrificans, S. cerevisiae, A. thaliana, Kitasatospora griseola, Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Gallus gallus, Streptomyces sp. KO-3988, Nicoti- ana attenuata, Kitasatospora griseola, Hevea brasiliensis, Enterococcus faecium e Ha- ematococcus pluvialis. Veja, por exemplo, Tabela 9, Patente U.S. Nos 7.183.089, 5.460.949, e 5.306.862, e Pedido PCT Nos PCT/US2012/050021 e PCT/US2011/038967, que estão aqui incorporados como referência em sua totalidade. Tabela 9. Fontes de HMG CoA Redutases e outros Genes de Mevalonato

Polipeptídeos de Sacarose Sintase

[0231]Sacarose sintase (SUS) pode ser usada como uma ferramenta para gerar açúcar de UDP, em particular UDP-glicose. SUS (EC 2.4.1.13) catalisa a formação de UDP-glicose e frutose a partir de sacarose e UDP. UDP gerado pela reação de UGTs, assim pode ser convertido pot SUS em UDP-glicose na presença de sacarose. Veja, por exemplo, Chen et al., 2001, J. Am. Chem. Soc. 123: 8866 - 8867; Shao et al., 2003, Appl. Env. Microbiol. 69: 5238 - 5242; Masada et al., 2007, FEBS Lett. 581: 2562 - 2566; e Son et al., 2009, J. Microbiol. Biotechnol. 19: 709 - 712.

[0232]Sacarose sintases pode ser usada para gerar UDP-glicose e remover UDP, facilitatando a glicosilação eficiente de compostos em vários sistemas. Por exemplo, levedura deficiente na capacidade de utilizar sacarose pode ser feita crescer em sacarose introduzindo um transportador de sacarose e um SUS. Por exemplo, S. cerevisiae não têm um sistema de captação de sacarose eficiente, e confia em SUC2 extracelular utilizar sacarose. A combinação de disruptar a SUC2 invertase de S. ce- revisiae endógena e expressar SUS recombinante resultou em uma cepa de levedura que foi capaz de metabolizar a sacarose intracelular, mas não extracelular (Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11: 4705 - 4713). A cepa foi usada para isolar transportadores de sacarose por transformação com uma biblioteca e seleção de expressão de cDNA de transformantes que tinham ganho a capacidade de absorver a sacarose.

[0233]A expressão combinada de sacarose sintase recombinante e um transportador de sacarose in vivo pode levar à disponibilidade de UDP-glicose aumentada e remoção de UDP não desejado. Por exemplo, a expressão funcional de uma sacarose sintase recombinante, um transportador de sacarose, e uma glicosiltransferase, em combinação com nocaute do sistema de degradação de sacarose natural (SUC2 no caso de S. cerevisiae) pode ser usada para gerar uma célula que é capaz de produzir quantidades aumentadas de compostos glicosilados, tais como glicosídeos de esteviol. Esta capacidade de glicosilação mais elevada é devido a pelo menos (a) uma maior capacidade de produzir UDP-glicose em uma maneira mais eficiente de energia, e (b) remoção de UDP a partir do meio de crescimento, como UDP pode inibir as reações de glicosilação.

[0234]A sacarose sintase pode ser de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência codificadora de sacarose sintase de, sem limitação, A. thaliana (por exemplo, SEQ ID NO: 79 ou 80), ou C. arabica (por exemplo, SEQ ID NO: 81) (veja, por exemplo, SEQ ID NOs: 178, 179, e 180 de PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade) inclui a sequência de aminoácidos do transportador de sacarose SUC1 de A. thaliana (SEQ ID NO: 80), e a sequência de aminoácidos da sacarose sintase de café (SEQ ID NO: 81).

[0235]A sacarose sintase pode ser de qualquer organismo adequado. Por exemplo, uma sequência codificadora de sacarose sintase de, sem limitação, A. tha- liana, S. rebaudiana, ou C. arabica (veja, por exemplo, SEQ ID NOs: 79 - 81) pode ser clonada em um plasmídeo de expressão sob controle de um promotor adequado, e expressada em um hospedeiro (por exemplo, um micro-organismo ou uma planta). Uma sequência codificadora de SUS pode ser expressada em uma cepa de S. cere- visiae deficiente de SUC2 (enzima hidrlítica de sacarose), assim como evitar a degradação de sacarose extracelular pela levedura.

[0236]A sacarose sintase pode ser expressada em uma tal cepa em combinação com um transportador de sacarose (por exemplo, o transportador de SUC1 de A. thaliana ou um homólogo funcional deste) e um ou mais UGTs (por exemplo, UGT85C2, UGT74G1, UGT76G1, EUGT11, e UGT91D2e, ou homólogos funcionais destes). Cultivar o hospedeiro em um meio que contém sacarose pode promover a produção de UDP-glicose, assim como, um ou mais glucosídeos (por exemplo, glico- sídeo de esteviol). Deve ser observado que em alguns casos, uma sacarose sintase e um transportador de sacarose podem ser expressados junto com um UGT em uma célula hospedeira que também é recombinante para a produção de um composto particular (por exemplo, esteviol).

Modulação da Expressão do Gene ERG9

[0237]Expressão do gene ERG9 endógeno pode ser alterada em um hospedeiro recombinante descrito aqui usando uma construção de ácido nucleico. A construção pode incluir duas regiões que são homológas para partes da sequência de genoma dentro do promotor de ERG9 ou extremidade 5’ do quadro aberto de leitura de ERG9 (ORF), respectivamente. A construção pode ainda incluir um promotor, tal como o ScKex2 do tipo selvagem ou ScCyc1 do tipo selvagem, e o promotor ainda pode incluir uma inserção heteróloga, tal como um grampo em sua extremidade 3’. O polipeptídeo codificado pelo ORF vantajosamente tem pelo menos 70 % de identidade para uma esqualeno sintase (EC 2.5.1.21) ou um fragmento biologicamente ativo deste, o dito fragmento tendo pelo menos 70 % de identidade de sequência ao dito esqualeno sintase em uma faixa de sobreposição de pelo menos 100 aminoácidos. Veja, por exemplo, PCT/US2012/050021 (incorporado aqui para todos os propósitos em sua totalidade).

[0238]A inserção heteróloga pode adaptar o elemento de estrutura secundária de um grampo com um loop de grampo. A sequência de inserção heteróloga tem a fórmula geral (I): -X1-X2-X3-X4-X5, em que X2 compreende pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos sendo complementar a, e formando um elemento de estrutura secundária do grampo com pelo menos 4 nucleotídeos consecutivos de X4, e X3 é opcional e se presente compreende nucleotídeos envolvidos formando um loop de grampo entre X2 e X4, e X1 e X5 individualmente e opcionalmente compreendem um ou mais nucleo- tídeos, e X2 e X4 pode individualmente consistir de qualquer número adequado de nu- cleotídeos, contanto que uma sequência consecutiva de pelo menos 4 nucleotídeos de X2 é complementar para uma sequência consecutiva de pelo menos 4 nucleotídeos de X4. Em algumas formas de realização, X2 e X4 consiste do mesmo número de nucleotídeos.

[0239]A inserção heteróloga é o tempo suficiente para permitir um grampo ser concluído, mas curto o suficiente para permitir a tradução limitada de um ORF que está presente enquadrado e imediatamente 3’ à inserção heteróloga. Tipicamente, a inserção heteróloga é de 10 a 50 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, 10 a 30 nucleotídeos, 15 a 25 nucleotídeos, 17 a 22 nucleotídeos, 18 a 21 nucleotídeos, 18 a 20 nucleotídeos, ou 19 nucleotídeos em comprimento. Como fornecido aqui: X2 pode, por exemplo, consistir de na faixa de 4 a 25 nucleotídeos, tal como na faixa de 4 a 20, 4 a 15, 6 a 12, 8 a 12, ou 9 a 11 nucleotídeos. X4 pode, por exemplo, consistir de na faixa de 4 a 25 nucleotídeos, tal como na faixa de 4 a 20, 4 a 15, 6 a 12, 8 a 12, ou 9 a 11 nucleotídeos.

[0240]Em algumas formas de realização, X2 consiste de uma sequência de nucleotídeo que é complementar à sequência de nucleotídeo de X4, todos os nucleo- tídeos de X2 são complementares à sequência de nucleotídeo de X4.

[0241]X3 pode estar ausente, isto é, X3 pode consistir de zero nucleotídeos. Também é possível que X3 consistir na faixa de 1 a 5 nucleotídeos, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.

[0242]X1 pode estar ausente, isto é, X1 pode consistir de zero nucleotídeos. Também é possível que X1 consistir na faixa de 1 a 25 nucleotídeos, tal como na faixa de 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, ou 1 a 3 nucleotídeos.

[0243]X5 pode estar ausente, isto é, X5 pode consistir de zero nucleotídeos. Também é possível que X5 pode consistir na faixa 1 a 5 nucleotídeos, tal como na faixa de 1 a 3 nucleotídeos.

[0244]A inserção heteróloga pode ser qualquer sequência adequada que cumpre os requisitos definidos aqui. Por exemplo, a inserção heteróloga pode compreender tgaattcgttaacgaattc (SEQ ID NO: 82), tgaattcgttaacgaactc (SEQ ID NO: 83), tgaa- ttcgttaacgaagtc (SEQ ID NO: 84), ou tgaattcgttaacgaaatt (SEQ ID NO: 85).

[0245]Sem estar ligado a um mecanismo particular, a expressão de ERG9 pode ser diminuída por pelo menos parcialmente, impedindo estericamente a ligação do ribossomo ao RNA assim reduzindo a tradução de esqualeno sintase. Assim, a taxa de tradução de uma esqualeno sintase funcional (EC 2.5.1.21) pode ser reduzida, por exemplo. Usando uma tal construção também pode diminuir a rotatividade de far- nesil-pirofosfato para esqualeno e/ou realçar o acúmulo de um composto selecionado a partir do grupo que consiste de farnesil-pirofosfato, isopentenil-pirofosfato, dimetilal- lil-pirofosfato, geranil-pirofosfato e geranilgeranil-pirofosfato.

[0246]Em alguns casos, pode ser vantajoso incluir um inibidor de esqualeno sintase quando cultivando hospedeiros recombinantes descritos aqui. Inibição química de esqualeno sintase, por exemplo, por lapaquistat, é conhecida na técnica. Outros inibidores de esqualeno sintase incluem ácido zaragózico e RPR 107393. Assim, em uma forma de realização, a etapa de cultivo dos métodos definidos aqui são realizadas na presença de um inibidor de esqualeno sintase.

[0247]Em algumas formas de realização, os hospedeiros recombinantes descritos aqui contêm uma mutação no quadro aberto de leitura de ERG9.

[0248]Em algumas formas de realização, os hospedeiros recombinantes descritos aqui contêm um ERG9[Delta]::HIS3 deleção/inserção alelo.

D. Homólogos Funcionais

[0249]Homólogos funcionais dos polipeptídeos descritos acima também são adequados para o uso em produzir esteviol ou glicosídeos de esteviol em um hospedeiro recombinante. Um homólogo funcional é um polipeptídeo que tem similaridade de sequência para uma polipeptídeo de referência, e que realiza uma ou mais das funções bioquímicas ou fisiológicas do polipeptídeo de referência. Um homólogo funcional e o polipeptídeo de referência podem ser polipeptídeos que ocorrem naturalmente, e a similaridade de sequência pode ser devido a eventos evolutivos convergentes ou divergentes. Como tais, os homólogos funcionais são algumas vezes designados na literatura como homólogos, ou ortólogos, ou parálogos. Variantes de um homólogo funcional que ocorre naturalmente, tais como polipeptídeos codificados por mutantes de uma sequência codificadora do tipo selvagem, podem por si só ser homólogos funcionais. Homólogos funcionais também podem ser criados através de mu- tagênese dirigida ao sítio da sequência codificadora para um polipeptídeo, ou por domínios de combinação a partir das sequências codificadoras para diferentes polipep- tídeos que ocorrem naturalmente (“troca de domínio”). Técnicas para modificar genes que codificam polipeptídeos UGT funcionais descritos aqui são conhecidas e incluem, inter alia, técnicas de evolução dirigida, técnicas de mutagênese dirigida ao sítio e técnicas de mutagênese aleatória, e podem ser úteis para aumentar a atividade específica de um polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, alterar os níveis de expressão, alterar a localização subcelular, ou modificar as interações de polipeptí- deo:polipeptídeo em uma maneira desejada. Tais polipeptídeos modificados são con-siderados homólogos funcionais. O termo “homólogo funcional” é algumas vezes aplicado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo funcionalmente homológo.

[0250]Homólogos funcionais podem ser identificados por análise de alinhamentos de sequência de nucleotídeo e polipeptídeo. Por exemplo, que realizam uma dúvida em uma base de dados de sequências de nucleotídeo ou polipeptídeo podem identificar homólogos de polipeptídeos de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de es- teviol. Análise de sequência pode envolver análise de BLAST, BLAST recíproco ou PSI-BLAST de bases de dados não redundantes usando uma sequência de aminoá- cidos de GGPPS, CDPS, KS, KO ou KAH como a sequência de referência. Sequência de aminoácidos é, em alguns casos, deduzida a partir da sequência de nucleotídeo. Aqueles polipeptídeos na base de dados que têm maior do que 40 % de identidade de sequência são candidatos para outra evaliação para adequação como um polipep- tídeo de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol. Similaridade de sequência de aminoácidos permite para substituições de aminoácido conservativas, tais como substituição de um resíduo hidrofóbico para um outro ou substituição de um resíduo polar para um outro. Se desejado, a inspeção manual de tais candidatos pode ser realizada de modo a limitar o número de candidatos a ser ainda avaliado. A inspeção manual pode ser realizada selecionando aqueles candidatos que parecem ter domínios presentes nos polipeptídeos de biossíntese de esteviol, por exemplo, domínios funcionais conservados.

[0251]Regiões conservadas podem ser identificadas localizando uma região dentro da sequência de aminoácidos primária de um polipeptídeo de biossíntese de esteviol ou glicosídeo de esteviol que é uma sequência repetida, formam alguma estrutura secundária (por exemplo, hélices e folhas beta), estabelecem domínios positivamente ou negativamente carregados, ou representam uma motivo ou domínio de proteína. Veja, por exemplo, o web site de Pfam que descreve sequências consensos para uma variedade de motivos e domínios de proteína na World Wide Web em san- ger.ac.uk/Software/Pfam/e pfam.janelia.org/. A informação incluída na base de dados de Pfam é descrita em Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26: 320 - 322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28: 405 - 420 (1997); e Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27: 260 - 262 (1999). Regiões conservadas também podem ser determinadas alinhando as sequências dos mesmos ou polipeptídeos relacionados a partir das espécies estreitamente relacionadas. Espécies estreitamente relacionadas, preferivelmente, são a partir da mesma família. Em algumas formas de realização, o alinhamento de sequências a partir de duas espécies diferentes é adequado.

[0252]Tipicamente, os polipeptídeos que exibem pelo menos cerca de 40 % de identidade de sequência de aminoácidos são úteis para identificar as regiões conservadas. As regiões conservadas de polipeptídeos relacionados exibem pelo menos 45 % de identidade de sequência de aminoácidos (por exemplo, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, ou pelo menos 90 % de identidade de sequência de aminoácidos). Em algumas formas de realização, uma região conservada exibe pelo menos 92 %, 94 %, 96 %, 98 %, ou 99 % de identidade de sequência de aminoácidos.

[0253]Por exemplo, os polipeptídeos adequados para produzir glicosídeos de esteviol em um hospedeiro recombinante incluem homólogos funcionais de EUGT11 (SEQ ID NO: 16), UGT91D2e (SEQ ID NO: 15), UGT91D2m (SEQ ID NO: 86), UGT85C (SEQ ID NO: 26), e UGT76G (SEQ ID NO: 2). Tais homólogos têm maior do que 90 % (por exemplo, pelo menos 95 % ou 99 %) de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos de EUGT11, UGT91D2e, UGT91D2m, UGT85C, ou UGT76G aqui divulgada ou no Pedido PCT No PCT/US2012/050021, que está aqui incorporado como referência em sua totalidade. Variantes de polipeptídeos EUGT11, UGT91D2, UGT85C e UGT76G, tipicamente, têm 10 ou menos substituições de ami- noácido dentro da sequência de aminoácidos primária, por exemplo, 7 ou menos substituições de aminoácido, 5 ou substituições de aminoácido conservativas, ou entre 1 e 5 substituições. Entretanto, em algumas formas de realização, as variantes de poli- peptídeos EUGT11, UGT91D2, UGT85C e UGT76G podem ter 10 ou mais substituições de aminoácido (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 10 a 20, 10 a 35, 20 a 30, ou 25 a 35 substituições de aminoácido). As substituições podem ser conservativas, ou em algumas formas de realização, não conservativas. Exemplos não limitantes de alterações não conservativas em polipeptídeos UGT91d2e incluem glicina para argi- nina e triptofano para arginina. Exemplos não limitantes de substituições não conser- vativas em polipeptídeos UGT76G incluem valina para ácido glutâmico, glicina para ácido glutâmico, glutamina para alanina, e serina para prolina. Exemplos não limitan- tes de alterações de polipeptídeos UGT85C incluem histidina para ácido aspártico, prolina para serina, lisina para treonina, e treonina para arginina.

[0254]Em algumas formas de realização, um homólogo de UGT91D2 útil pode ter substituições de aminoácido (por exemplo, substituições de aminoácido conserva- tivas) em regiões do polipeptídeo que estão do lado de fora dos loops prognosticados, por exemplo, resíduos 20 a 26, 39 a 43, 88 a 95, 121 a 124, 142 a 158, 185 a 198, e 203 a 214 são loops prognosticados no domínio N-terminal e resíduos 381 a 386 são loops prognosticados no domínio C-terminal de 91D2e (veja, SEQ ID NO: 15). Por exemplo, um homólogo de UGT91D2 útil pode incluir pelo menos uma substituição de aminoácido nos resíduos 1 a 19, 27 a 38, 44 a 87, 96 a 120, 125 a 141, 159 a 184, 199 a 202, 215 a 380, ou 387 a 473. Em algumas formas de realização, um homólogo de UGT91D2 pode ter uma substituição de aminoácido em um ou mais resíduos selecionados a partir do grupo que consiste de resíduos 30, 93, 99, 122, 140, 142, 148, 153, 156, 195, 196, 199, 206, 207, 211, 221, 286, 343, 427, e 438. Por exemplo, um homólogo de UGT91D2 funcional pode ter uma substituição de aminoácido em um ou mais dos resíduos 206, 207, e 343, tais como uma arginina no resíduo 206, uma cis- teína no resíduo 207, e uma arginina no resíduo 343. Outros homólogos funcionais de UGT91D2 podem ter um ou mais dos seguintes: uma tirosina ou fenilalanina no resíduo 30, uma prolina ou glutamina no resíduo 93, uma serina ou valina no resíduo 99, uma tirosina ou uma fenilalanina no resíduo 122, uma histidina ou tirosina no resíduo 140, uma serina ou cisteína no resíduo 142, uma alanina ou treonina no resíduo 148, uma metionina no resíduo 152, uma alanina no resíduo 153, uma alanina ou serina no resíduo 156, uma glicina no resíduo 162, uma leucina ou metionina no resíduo 195, um ácido glutâmico no resíduo 196, uma lisina ou ácido glutâmico no resíduo 199, uma leucina ou metionina no resíduo 211, uma leucina no resíduo 213, uma serina ou fenilalanina no resíduo 221, uma valina ou isoleucina no resíduo 253, uma valina ou alanina no resíduo 286, uma lisina ou asparagina no resíduo 427, uma alanina no resíduo 438, e uma alanina ou treonina no resíduo 462. Em uma outra forma de reali-zação, um homólogo de UGT91D2 funcional contém uma metionina no resíduo 211 e uma alanina no resíduo 286.

[0255]Em algumas formas de realização, um homólogo de UGT85C útil pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 9, 10, 13, 15, 21, 27, 60, 65, 71, 87, 91, 220, 243, 270, 289, 298, 334, 336, 350, 368, 389, 394, 397, 418, 420, 440, 441, 444, e 471. Exemplos não limitantes de homólogos de UGT85C úteis incluem polipeptídeos tendo substituições (com respeito a SEQ ID NO: 26) no resíduo 65 (por exemplo, uma serina no resíduo 65), no resíduo 65 em combinação com resíduo 15 (uma leucina no resíduo 15), 270 (por exemplo, uma metionina, arginina, ou alanina no resíduo 270), 418 (por exemplo, uma valina no resíduo 418), 440 (por exemplo, um ácido aspártico no resíduo 440), ou 441 (por exemplo, uma asparagina no resíduo 441); resíduos 13 (por exemplo, uma fenilalanina no resíduo 13), 15, 60 (por exemplo, um ácido aspártico no resíduo 60), 270, 289 (por exemplo, uma histidina no resíduo 289), e 418; substituições nos resíduos 13, 60, e 270; substituições nos resíduos 60 e 87 (por exemplo, uma fenilalanina no resíduo 87); substituições nos resíduos 65, 71 (por exemplo, uma glutamina no resíduo 71), 220 (por exemplo, uma treonina no resíduo 220), 243 (por exemplo, um triptofano no resíduo 243), e 270; substituições nos resíduos 65, 71, 220, 243, 270, e 441; substituições nos resíduos 65, 71, 220, 389 (por exemplo, uma valina no resíduo 389), e 394 (por exemplo, uma valina no resíduo 394); substituições nos resíduos 65, 71, 270, e 289; substituições nos resíduos 220, 243, 270, e 334 (por exemplo, uma serina no resíduo 334); ou substituições nos resíduos 270 e 289. As seguintes mutações de aminoácido não resultam em uma perda de atividade em polipeptídeos 85C2: V13F, F15L, H60D, A65S, E71Q, I87F, K220T, R243W, T270M, T270R, Q289H, L334S, A389V, I394V, P397S, E418V, G440D, e H441N. Mutações adicionais que foram observadas em clones ativos in-cluem K9E, K10R, Q21H, M27V, L91P, Y298C, K350T, H368R, G420R, L431P, R444G, e M471T. Em algumas formas de realização, um UGT85C2 contém substituições nas posições 65 (por exemplo, uma serina), 71 (uma glutamina), 270 (uma me- tionina), 289 (uma histidina), e 389 (uma valina).

[0256]Em algumas formas de realização, um homólogo de UGT76G1 útil (SEQ ID NO: 2) pode ter uma ou mais substituições de aminoácido nos resíduos 29, 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346 (veja, TABELA 10). Exemplos não limitantes de homólogos de UGT76G1 úteis incluem polipeptídeos tendo substituições nos resíduos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, e 291; resíduos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, e 291; ou resíduos 74, 87, 91, 116, 123, 125, 126, 130, 145, 192, 193, 194, 196, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 266, 273, 274, 284, 285, 291, 330, 331, e 346. Veja, Tabela 10. Tabela 10.

[0257]Métodos para modificar a especificidade do substrato de, por exemplo, EUGT11 ou UGT91D2e, são conhecidos àqueles habilitados na técnica, e incluem sem limitação abosrdagens de mutagênese dirigida ao sítio/racional, abosrdagens de evolução dirigida aleatória e combinações em que técnicas de mutagênese/saturação aleatória são realizadas perto do sítio ativo da enzima. Por exemplo Veja, Sarah A. Osmani, et al., Phytochemistry 70 (2009) 325 - 347.

[0258]Uma sequência candidata, tipicamente, tem um comprimento que é de 80 por cento a 200 por cento do comprimento da sequência de referência, por exem-plo, 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 por cento do comprimento da sequência de referência. Um polipeptídeo homólogo funcional, tipicamente, tem um comprimento que é de 95 por cento a 105 por cento do comprimento da sequência de referência, por exemplo, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115, ou 120 por cento do comprimento da sequência de referência, ou qualquer intervalo entre eles. Uma percentagem de identidade para qualquer ácido nucleico ou polipeptídeo candidato em relação a um ácido nucleico ou polipeptídeo de referência pode ser determinada como segue. Uma sequência de re-ferência (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de ami- noácidos descrita aqui) é alinhada a uma ou mais sequências candidatas usando o programa de computador ClustalW (version 1.83, parâmetros de valor), que permite os alinhamentos de sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo ser realizados em todo o seu comprimento (alinhamento global). Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13): 3497 - 500 (2003).

[0259]ClustalW calcula a melhor correspondência entre uma referência e uma ou mais sequências candidatas, e as alinham de modo que as identidades, similaridades e diferenças possam ser determinadas. As lacunas de um ou mais resíduos podem ser inseridas em uma sequência de referência, uma sequência candidata, ou ambas, para maximizar os alinhamentos da sequência. Para rápido alinhamento por pares de sequências de ácido nucleico, os parâmetros de valor seguintes são usados: tamanho de palavra: 2; tamanho de janela: 4; método de pontuação: percentagem; número de diagonais de topo: 4; e desvantagem de intervalo: 5. Para o alinhamento múltiplo de sequências de ácido nucleico, os parâmetros seguintes são usados: des-vantagem de lacuna de intervalo: 10,0; desvantagem de extensão de intervalo: 5,0; e transições de peso: sim. Para o alinhamento rápido por pares de sequências de proteína, os parâmetros seguintes são usados: tamanho de palavra: 1; tamanho de janela: 5; método de pontuação: percentagem; número de diagonais de topo: 5; desvantagem de intervalo: 3. Para o alinhamento múltiplo de sequências de proteína, os parâmetros seguintes são usados: matriz de peso: blosum; desvantagem de lacuna de intervalo: 10,0; desvantagem de extensão de intervalo: 0,05; lacunas hidrofílicas: on; resíduos hidrofílicos: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, e Lys; desvantagens de lacuna específicas ao resíduo: on. A saída de ClustalW é um alinhamento de sequência que reflete o relacionamento entre as sequências. ClustalW pode ser conduzido, por exemplo, no site de Baylor College of Medicine Search Launcher em World Wide Web (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) e no site de European Bioinformatics Institute em World Wide Web (ebi.ac.uk/clustalw).

[0260]Para determinar a percentagem de identidade de uma sequência de ácido nucleico ou aminoácidos candidata para uma sequência de referência, as sequências são alinhadas usando ClustalW, o número de correspondências idênticas no alinhamento é dividida pelo comprimento da sequência de referência, e o resultado é multiplicado por 100. Observou-se que a valor de percentagem de identidade pode ser arredondado ao décimo mais próximo. Por exemplo, 78,11, 78,12, 78,13, e 78,14 são arredondados até 78,1, enquanto que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18, e 78,19 são arredondados até 78,2.

[0261]Será avaliado que UGTs funcionais podem incluir aminoácidos adicionais que não são envolvidos em glucosilação ou outras atividades enzimáticas realizadas pela enzima e, assim, um tal polipeptídeo pode ser mais longo do que seria o caso. Por exemplo, um polipeptídeo EUGT11 pode incluir um marcador de purificação (por exemplo, marcador de HIS ou marcador de GST), um peptídeo de trânsito de cloroplasto, um peptídeo de trânsito mitocondrial, um peptídeo de amiloplasto, peptí- deo de sinal ou um marcador de secreção adicionado ao terminal amino ou carbóxi. Em algumas formas de realização, um polipeptídeo EUGT11 inclui uma sequência de aminoácidos que funciona como um reporter, por exemplo, um proteína fluorescente verde ou proteína fluorescente amarela.

II. Ácidos Nucleicos de Biossíntese de Esteviol e Glicosídeo de Esteviol

[0262]Um gene recombinante que codifica um polipeptídeo descrito aqui compreende a sequência codificadora para o polipeptídeo, ligado de maneira operável na orientação sentido para uma ou mais regiões reguladoras adequadas expressar o po- lipeptídeo. Uma vez que muitos micro-organismos são capazes de expressar múltiplos produtos de gene a partir de um mRNA policistrônico, múltiplos polipeptídeos podem ser expressados sob o controle de uma única região reguladora para aqueles microorganismos, se desejados. Uma sequência codificadora e uma região reguladora são consideradas estar ligadas de maneira operável quando a região reguladora e sequência codificadora são posicionadas de modo que a região reguladora é eficaz para regular a transcrição ou tradução da sequência. Tipicamente, o sítio de iniciação de tradução do quadro de leitura translacional da sequência codificadora é posicionado entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante da região reguladora para um gene monocistrônico.

[0263]Em muitos casos, a sequência codificadora para um polipeptídeo descrito aqui é identificada em uma espécie exceto o hospedeiro recombinante, isto é, é um ácido nucleico heterólogo. Assim, se o hospedeiro recombinante é um micro-organismo, a sequência codificadora pode ser de outros micro-organismos procarióticos ou eucarióticos, de plantas ou de animais. Em alguns casos, entretanto, a sequência codificadora é uma sequência que é nativa ao hospedeiro e está sendo reintroduzida naquele organismo. Uma sequência nativa pode ser frequentemente distinguida a partir de sequência que ocorre naturalmente pela presença de sequências não naturais ligadas ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não nativas flanqueando uma sequência nativa em uma construção de ácido nucleico recombi- nante. Além disso, ácidos nucleicos exógenos estavelmente transformados, tipicamente, são integrados nas posições exceto na posição onde a sequência nativa é encontrada.

[0264]“Região reguladora” refere-se a um ácido nucleico tendo sequências de nucleotídeos que influenciam a iniciação e taxa de transcrição ou tradução, e estabilidade e/ou mobilidade de um produto de transcrição ou tradução. As regiões reguladoras incluem, sem limitação, sequências promotoras, sequências realçadoras, elementos de resposta, sítos de reconhecimento de proteína, elementos induzíveis, sequências ligadoras de proteína, regiões não traduzidas 5' e 3' (UTRs), sítios de início transcricional, sequências de terminação, sequências de poliadenilação, íntrons, e suas combinações. Uma região reguladora, tipicamente, compreende pelo menos um promotor de núcleo (basal). Uma região reguladora também pode incluir pelo menos um elemento de controle, tal como uma sequência realçadora, um elemento a montante ou uma região de ativação a montante (UAR). Uma região reguladora é ligada de maneira operável a uma sequência codificadora posicionando a região reguladora e a sequência codificadora de modo que a região reguladora é eficaz para regular a transcrição ou tradução da sequência. Por exemplo, ligar de maneira operável uma sequência codificadora e uma sequência promotora, o sítio de iniciação de tradução do quadro de leitura translacional da sequência codificadora é, tipicamente, posicionada entre um e cerca de cinquenta nucleotídeos a jusante do promotor. Uma região reguladora, entretanto, pode ser posicionada tanto quanto cerca de 5.000 nucleotí- deos a montante do sítio de iniciação de tradução, ou cerca de 2.000 nucleotídeos a montante do sítio de início de transcrição.

[0265]A escolha de regiões reguladoras a ser incluídas depende de vários fatores, incluindo, mas não limitado a, eficiência, selecionabilidade, inducibilidade, nível de expressão desejado, e expressão preferencial durante certos estágios de cultura. É uma matéria de rotina para uma pessoa de habilidade na técnica modular a expressão de uma sequência codificadora por apropriadamente selecionar e posicionar as regiões reguladoras em relação à sequência codificadora. Será entendido que mais do que uma região reguladora pode estar presente, por exemplo, íntrons, real- çadores, regiões de ativação a montante, terminadores de transcrição, e elementos induzíveis.

[0266]Um ou mais genes podem ser combinados em uma construção de ácido nucleico recombinante em “módulos” úteis para um aspecto discreto de produção de esteviol e/ou glicosídeo de esteviol. Combinação de uma pluralidade de genes em um módulo, particularmente, um módulo policistrônico, facilita o uso do módulo em uma variedade de espécies. Por exemplo, um cluster do gene de biossíntese de esteviol ou um cluster do gene UGT, pode ser combinado em um módulo policistrônico tal que, depois da inserção de uma região reguladora adequada, o módulo pode ser introduzido em uma ampla variedade de espécies. Como um outro exemplo, um cluster do gene UGT pode ser combinado tal que cada sequência codificadora de UGT é ligada de maneira operável a uma região reguladora separada, para formar um módulo de UGT. Um tal módulo pode ser usado naquela espécie para que a expressão monoci- strônica seja necessária ou desejável. Além de genes úteis para a produção de este- viol ou glicosídeo de esteviol, uma construção recombinante, tipicamente, também contém uma origem de replicação, e um ou mais marcadores selecionáveis para a manutenção da construção em espécie apropriada.

[0267]Será avaliado que por causa da degeneração do código genético, vários ácidos nucleicos podem codificar um polipeptídeo particular; isto é, para muitos ami- noácidos, existe mais do que um tripleto de nucleotídeo que serve como o códon para o aminoácido. Assim, os códons na sequência codificadora para um determinado po- lipeptídeo podem ser modificados tal que a expressão ideal em um hospedeiro particular é obtida, usando tabelas de desvio de códon apropriado para aquele hospedeiro (por exemplo, micro-organismo). Como ácidos nucleicos isolados, estas sequências modificadas podem existir como moléculas purificadas e podem ser incorporadas em um vetor ou um virus para o uso em módulos de construção para a construção de ácidos nucleicos recombinantes.

[0268]Em alguns casos, é desejável inibir uma ou mais funções de um poli- peptídeo endógeno de modo a desviar os intermediários metabólicos para a biossín- tese de esteviol ou glicosídeo esteviol. Por exemplo, pode ser desejável regular para baixo a síntese de esteróis em uma cepa de levedura de modo a aumentar ainda a produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, por exemplo, regulando para baixo a esqualeno epoxidase. Como um outro exemplo, pode ser desejável inibir funções de- gradativas de certos produtos de gene endógeno, por exemplo, glico-hidrolases que removem porções de glicose a partir de metabólitos secundários ou fosfatases como debatido aqui. Como um outro exemplo, a expressão de transportadores de membrana envolvidos no transporte de glicosídeos de esteviol pode ser inibida, tal que a secreção de esteviosideos glicosilados é inibida. Tal regulação pode ser benéfica em que a secreção de glicosídeos de esteviol pode ser inibida para um período de tempo desejado durante a cultura do micro-organismo, desse modo aumentando o rendimento de produtos de glicosídeo na colheita. Em tais casos, um ácido nucleico que inibe a expressão do polipeptídeo ou produto de gene pode ser incluído em uma construção recombinante que é transformada na cepa. Alternativamente, a mutagênese pode ser usada para gerar mutantes em genes para que seja desejada inibir a função.

III. Hospedeiros Micro-organismos

[0269]Hospedeiros recombinantes podem ser usados para expressar polipep- tídeos para a produção de glicosídeos de esteviol, incluindo células de mamífero, inseto e planta. Vários procariontes e eucariontes também são adequados para o uso na construção de micro-organismos recombinantes descritos aqui, por exemplo, bactérias gram-negativas, levedura e fungos. Uma espécie e cepa selecionadas para o uso como uma cepa de produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol é primeiro analisada para determinar que os genes de produção são endógenos para a cepa e que os genes não estão presentes. Genes para que uma contraparte endógena não está presente na cepa são montados em uma ou mais construções recombinantes que são, em seguida, transformados na cepa de modo a fornecer as funções perdidas.

[0270]Espécies procarióticas e eucarióticas exemplares são descritas em mais detalhe abaixo. Entretanto, será avaliado que outra espécie pode ser adequada. Por exemplo, espécie adequada pode ser em um gênero selecionado a partir do grupo que consiste de Agaricus, Aspergillus, Bacillus, Candida, Corynebacterium, Eremothe- cium, Escherichia, Fusarium/Gibberella, Kluyveromyces, Laetiporus, Lentinus, Phaf- fia, Phanerochaete, Pichia, Physcomitrella, Rhodoturula, Saccharomyces, Schizosac- charomyces, Sphaceloma, Xanthophyllomyces e Yarrowia. Espécie exemplar a partir de tais gêneros incluem Lentinus tigrinus, Laetiporus sulphureus, Phanerochaete chrysosporium, Pichia pastoris, Cyberlindnera jadinii, Physcomitrella patens, Rhodo- turula glutinis 32, Rhodoturula mucilaginosa, Phaffia rhodozyma UBV-AX, Xantho- phyllomyces dendrorhous, Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi, Candida utilis, Candida glabrata, Candida albicans, e Yarrowia lipolitica. Em algumas formas de realização, um micro-organismo pode ser um Ascomicete tal como Gibberella fujikuroi, Kluy- veromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, Yarrowia lipolitica, Ashbya gossypii, ou Saccharomyces cerevisiae. Em algumas formas de realização, um micro-organismo pode ser um procariota tal como Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides, ou Rhodobacter capsulatus. Será avaliado que certos micro-organismos podem ser usados para peneirar e genes de teste de interesse em uma maneira de alto rendimento, enquanto que outros micro-organismos com produtividade desejada ou características de crescimento podem ser usados para produção de grande escala de glicosídeos de esteviol.

Saccharomyces cerevisiae

[0271]Saccharomyces cerevisiae é um organismo chassi amplamente usado em biologia sintética, e pode ser usado como a plataforma de micro-organismo recombinante. Existem bibliotecas de mutantes, plasmídeos, modelos de computador detalhados de metabolismo e outra informação disponível para S. cerevisiae, considerando projeto racional de vários módulos para realçar o rendimento do produto. Métodos são conhecidos para fabricar micro-organismos recombinantes.

[0272]Um cluster do gene de biossíntese de esteviol pode ser expressado em levedura usando qualquer um de vários promotores conhecidos. Cepas que produzem demasiadamente terpenos são conhecidas e podem ser usadas para aumantar a quantidade de geranilgeranil difosfato disponível para a produção de esteviol e glico- sídeo de esteviol.

Aspergillus spp.

[0273]Espécies Aspergillus tais como A. oryzae, A. niger e A. sojae são micro-organismos amplamente usados em produção de alimentos e, também podem ser usadas como a plataforma de micro-organismo recombinante. Sequências de nucleo- tídeos são disponíveis para os genomas de A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae, A. clavatus, A. flavus, A. niger, e A. terreus, permitindo projeto racional e modificação de vias de endógeno para realçar o fluxo e aumantar o rendimento do produto. Modelos metabólicos foram desenvolvidos para Aspergillus, assim como estudos transcriptô- micos e estudos proteômicos. A. niger é cultivada para a produção industrial de vários ingredientes alimentares tais como ácido cítrico e ácido glicônico e, assim as espécies tais como A. niger são geralmente adequadas para a produção de ingredientes alimentares tais como esteviol e glicosídeos de esteviol.

Escherichia coli

[0274]Escherichia coli, um outro organismo de plataforma amplamente usado em biologia sintética, também pode ser usado como a plataforma de micro-organismo recombinante. Similares a Saccharomyces, existem bibliotecas de mutantes, plasmí- deos, modelos de computador detalhados de metabolismo e outra informação disponível para E. coli, considerando projeto racional de vários módulos para realçar o rendimento do produto. Métodos similares àqueles descritos acima para Saccha- romyces podem ser usados para fazer micro-organismos de E. coli recombinantes.

Agaricus, Gibberella, e Phanerochaete spp.

[0275]Agaricus, Gibberella, e Phanerochaete spp. podem ser úteis porque eles são conhecidos produzir grandes quantidades de giberelina em cultura. Assim, os precursores de terpeno para produzir grandes quantidades de esteviol e glicosí- deos de esteviol são já produzidos por genes endógenos. Assim, os módulos contendo genes recombinantes para polipeptídeos de biossíntese de esteviol ou glicosí- deo de esteviol podem ser introduzidos em espécie a partir de tais gêneros sem a necessidade de introduzir genes de vias de mevalonato ou MEP.

Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans)

[0276]Arxula adeninivorans é uma levedura dimórfica (cresce como um levedura de germinação como a levedura de padeiro até uma temperatura de 42 °C, acima deste princípio cresce em uma forma filamentosa) com características bioquímicas não usuais. Pode crescer em uma ampla faixa de substratos e pode assimilar nitrato. Tem sido aplicada com êxito à geração de cepas que podem produzir plásticos naturais ou o desenvolvimento de um biossensor para estrogênios em amostras ambientais.

Yarrowia lipolitica

[0277]Yarrowia lipolitica é uma levedura dimórfica (veja, Arxula adeninivorans) que pode crescer em uma ampla faixa de substratos. Tem um potencial alto para aplicações industriais, mas não existem ainda produtos recombinantes comercialmente disponíveis.

Rhodobacter spp.

[0278]Rhodobacter pode ser usado como a plataforma de micro-organismo recombinante. Similares a E. coli, existem bibliotecas de mutantes disponíveis assim como vetores de plasmídeo adequados, considerando projeto racional de vários módulos para realçar o rendimento do produto. As vias de isoprenóide foram engendradas em espécie bacteriana membranosa de Rhodobacter para a produção aumentada de carotenóide e CoQ10. Veja, Publicação de Patente U.S. Nos 20050003474 e 20040078846. Métodos similares àqueles descritos acima para E. coli podem ser usados para fazer micro-organismos de Rhodobacter recombinantes.

Candida boidinii

[0279]Candida boidinii é uma levedura metilotrófica (pode crescer em metanol). Como outra espécie metilotrófica tal como Hansenula polimorpha e Pichia pastoris, fornece uma plataforma excelente para a produção de proteínas heterólogas. Rendimentos em uma faixa multigrama de uma proteína anterior secretada foram relatados. Um método computacional, IPRO, mutações recentemente prognosticadas que experimentalmente comutaram a especificidade de cofactor de Candida boidinii xilose redutase de NADPH a NADH.

Hansenula polimorpha (Pichia angusta)

[0280]Hansenula polimorpha é uma outra levedura metilotrófica (veja, Candida boidinii). Pode além disso crescer em uma ampla faixa de outros substratos; é termotolerante e pode assimilar nitrato (veja também Kluyveromyces lactis). Foi aplicada à produção de vacinas de hepatite B, insulina e interferon alfa-2a para o tratamento de hepatite C, além disso a uma faixa de enzimas técnicas.

Kluyveromyces lactis

[0281]Kluyveromyces lactis é levedura regularmente aplicada à produção de kefir. Pode crescer em vários açúcares, mais importante em lactose que está presente no leite e soro de leite coalhado. Tem sido aplicada com êxito entre outros à produção de quimosina (uma enzima que está usualmente presente no estômago de bezerros) para a produção de queijo. Produção ocorre em fermentadores em uma escala de 40.000 L.

Pichia pastoris

[0282]Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica (veja Candida boidinii e Hansenula polimorpha). Fornece uma plataforma eficiente para a produção de proteínas estranhas. Elementos de plataforma são disponíveis como um kit e é no mundo inteiro usado em academia para a produção de proteínas. Cepas que foram engendradas podem produzir N-glicano humano complexo (glicanos de levedura são similares mas não idênticos àqueles encontrados em seres humanos).

Physcomitrella spp.

[0283]Physcomitrella mosses, quando cultivado em cultura de suspensão, têm características similares à levedura ou outras culturas fúngicas. Estes gêneros estão tornando-se um importante tipo de célula para a produção de metabólitos secundários de planta, que podem ser difíceis de produzir em outros tipos de células.

IV. Métodos de Produzir os Glicosídeos de Esteviol

[0284]Hospedeiros recombinantes descritos aqui podem ser usados em métodos para produzir glicosídeos de esteviol tais como Rebaudiosídeo M. Por exemplo, se o hospedeiro recombinante é um micro-organismo, o método pode incluir crescer o micro-organismo recombinante em um meio de cultura sob condições, em que genes de biossíntese de esteviol e/ou glicosídeo de esteviol são expressados. O microorganismo recombinante pode ser cultivado em um processo de batelada alimentada ou contínuo. Tipicamente, o micro-organismo recombinante é cultivado em um fer- mentor em uma temperatura definida por um período de tempo desejado. Em certas formas de realização, os micro-organismos incluem, mas não são limitados a S. cere- visiae, A. niger, A. oryzae, E. coli, L. lactis e B. subtilis. O construído e, geneticamente, micro-organismos engendrados fornecidos pela invenção pode ser cultivada usando processos de fermentação convencional, incluindo, inter alia, quimiostato, lote, cultivos de batelada alimentada, fermentação de perfusão contínua, e cultura celular de perfusão contínua.

[0285]Dependendo do micro-organismo particular usado no método, outros genes recombinantes tais como genes de biossíntese de isopentenil e genes terpeno sintase e ciclase também podem estar presentes e expressados. Níveis de substratos e intermediários, por exemplo, difosfato de isopentenila, difosfato de dimetilalila, gera- nilgeranil difosfato, caureno e ácido caurenóico, podem ser determinados extraindo amostras de meios de cultura para a análise de acordo com os métodos publicados.

[0286]Depois que o micro-organismo recombinante foi cultivado em cultura durante o período de tempo desejado, esteviol e/ou um ou mais glicosídeos de esteviol podem ser, em seguida, recuperados a partir da cultura usando várias técnicas conhecidas no ramo. Em algumas formas de realização, um agente permeabilizante pode ser adicionado para ajudar a matéria-prima entrar no hospedeiro e o produto sair. Se o hospedeiro recombinante é uma planta ou células de planta, esteviol ou glicosídeos de esteviol pode ser extraído a partir do tecido de planta usando várias técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo, um lisado bruto do micro-organismo cultivado ou tecido de planta pode ser centrifugado para se obter um sobrenadante. O sobrenadante resultante pode ser, em seguida, aplicado a uma coluna de cromato- grafia, por exemplo, uma coluna C18 tal como coluna C18 Aqua® de Phenomenex ou uma coluna Hidro RP 80A Synergi™, e lavado com água para remover os compostos hidrofílicos, seguido por eluição dos compostos de interesse com um solvente tal como acetonitrila ou metanol. Os compostos podem ser, em seguida, purificado ainda por HPLC preparativa. Veja também WO 2009/140394.

[0287]A quantidade de glicosídeo de esteviol (por exemplo, Rebaudiosídeo M) produzido pode ser de cerca de 1 mg/L a cerca de 2800 mg/L, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 mg/L, cerca de 3 a cerca de 10 mg/L, cerca de 5 a cerca de 20 mg/L, cerca de 10 a cerca de 50 mg/L, cerca de 10 a cerca de 100 mg/L, cerca de 25 a cerca de 500 mg/L, cerca de 100 a cerca de 1,500 mg/L, ou cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/L. Em geral, tempos de cultura mais longos levarão a maiores quantidades de produto. Assim, o micro-organismo recombinante pode ser cultivado por 1 dia a 7 dias, 1 dia a 5 dias, 3 dias a 5 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, ou cerca de 5 dias.

[0288]Será avaliado que os vários genes e módulos debatidos aqui podem estar presentes em dois ou mais micro-organismos recombinantes ao invés de um único micro-organismo. Quando uma pluralidade de micro-organismos recombinantes é usada, eles podem ser cultivados em uma cultura mista para produzir esteviol e/ou glicosídeos de esteviol. Por exemplo, um primeiro micro-organismo pode compreender um ou mais genes de biossíntese para produzir esteviol enquanto que um segundo micro-organismo compreende genes de biossíntese de glicosídeo de esteviol. Alternativamente, dois ou mais micro-organismos podem ser cultivados em um meio de cultura separado e o produto do primeiro meio de cultura, por exemplo, esteviol, pode ser introduzido no segundo meio de cultura a ser convertido em um intermediário subsequente, ou em um produto final tal como Rebaudiosídeo A. O produto produzido pelo segundo, ou micro-organismo final é, em seguida, recuperado. Também será avaliado que em algumas formas de realização, um micro-organismo recombinante é cultivado usando fontes de nutriente exceto um meio de cultura e utilizando um sistema exceto um fermentor.

[0289]Glicosídeos de esteviol não necessariamente têm desempenho equivalente em diferentes sistemas de alimentação. É, portanto, desejável ter a capacidade de direcionar a síntese às composições de glicosídeo de esteviol de escolha. Hospedeiros recombinantes descritos aqui podem produzir composições que são seletivamente enriquecidas para glicosídeos de esteviol específicos (por exemplo, Rebaudio- sídeo M) e têm um perfil de sabor compatível. Assim, os micro-organismos recombi- nantes, plantas, e células de planta descritos aqui podem facilitar a produção de composições que são adaptadas para atender o perfil adoçante desejado para um determinado produto alimentar e que têm uma proporção de cada glicosídeo de esteviol que é compatível de lote a lote. Micro-organismos descritos aqui não produzem os subprodutos de planta indesejáveis encontrados em extratos de Stévia. Assim, as composições de glicosídeo de esteviol produzidas pelos micro-organismos recombi- nantes descritos aqui são distinguíveis a partir das composições derivadas das plantas Stévia.

V. Produtos Alimentardes

[0290]Os glicosídeos de esteviol obtidos pelos métodos aqui divulgados podem ser usados para fazer produtos alimentares e de bebidas, suplementos dietéticos e composições adoçantes. Por exemplo, glicosídeo de esteviol substancialmente puro, tal como Rebaudiosídeo M pode ser incluído em produtos alimentares, tais como sorvete, bebidas carbonatadas, sucos de frutas, iogurtes, pães, gomas de mascar, balas duras e moles, e molhos. Glicosídeo de esteviol substancialmente puro também pode ser incluído em produtos não alimentares, tais como produtos farmacêuticos, produtos medicinais, suplementos dietéticos e suplementos nutritionais. Glicosídeos de esteviol substancialmente puros também podem ser incluídos em produtos alimentares de animal tanto para a indústria de agricultura quanto para a indústria de animal de companhia. Alternativamente, uma mistura de glicosídeos de esteviol pode ser feita cultivando micro-organismos recombinantes separadamente ou crescendo diferentes plantas/células de planta, cada um produzindo um esteviol ou glicosídeo de esteviol específico, recuperando o esteviol ou glicosídeo de esteviol na forma substancialmente pura de cada micro-organismo ou planta/células de planta e, em seguida, combinando os compostos para se obter uma mistura contendo cada composto na proporção desejada (por exemplo, Rebaudiosídeo M com um ou mais outros glicosídeos de esteviol). Os micro-organismos recombinantes, plantas, e células de planta descritos aqui permitam misturas mais precisas e compatíveis a ser obtidas em comparação com produtos de Stévia correntes. Em uma outra alternativa, um glicosídeo de esteviol substancialmente puro pode ser incorporado em um produto alimentar junto com outros adoçantes, por exemplo, sacarina, dextrose, sacarose, frutose, eritritol, aspartame, sucralose, monatina, ou acessulfame de potássio. A razão em peso de glicosídeo de esteviol em relação a outros adoçantes pode ser variada como desejado para se obter um sabor satisfatório no produto alimentar final. Veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No 2007/0128311. Em algumas formas de realização, o gli- cosídeo de esteviol pode ser fornecido com um sabor (por exemplo, citrus) como um modulador de sabor.

[0291]Composições produzidas por um micro-organismo recombinante, planta, ou célula vegetal descritos aqui podem ser incorporadas em produtos alimentares. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto alimentar em uma quantidade variando de cerca de 20 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto alimentar a cerca de 1800 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto alimentar em uma base de peso seco, dependendo do tipo de glicosídeo de esteviol e produto alimentar. Por exemplo, uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um sobremesa, confeito frio (por exemplo, sorvete), produto lácteo (por exemplo, iogurte), ou bebida (por exemplo, uma bebida carbonatada) tal que o produto alimentar tem um máximo de 500 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um assado (por exemplo, um biscoito) tal que o produto alimentar tem um máximo de 300 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombi- nante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um molho (por exemplo, calda de chocolate) ou produto vegetal (por exemplo, picles) tal que o produto alimentar tem um máximo de 1000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um microorganismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em pão tal que o produto alimentar tem um máximo de 160 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzida por um micro-organismo recombinante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em uma bala dura ou mole tal que o produto alimentar tem um máximo de 1600 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco. Uma composição de glicosídeo de esteviol produzido por um micro-organismo recombi- nante, planta, ou célula vegetal pode ser incorporada em um produto de fruta processada (por exemplo, sucos de frutas, recheio de fruta, compotas, e geléias) tal que o produto alimentar tem um máximo de 1000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de alimento em uma base de peso seco.

[0292]Em algumas formas de realização, um esteviol ou glicosídeo de esteviol substancialmente puro é incorporado em um adoçante de mesa ou produto “cup-for- cup”. Tais produtos, tipicamente, são diluídos a nível de doçura apropriado com um ou mais agentes espessantes, por exemplo, maltodextrinas, conhecidos àqueles habilitados na técnica. As composições de glicosídeo de esteviol enriquecidas para Re- baudiosídeo M podem ser empacotadas em um sachê, por exemplo, em 10.000 a 30.000 mg de glicosídeo de esteviol/kg de produto em uma base de peso seco, para o uso em mesas.

[0293]A invenção será ainda descrita nos exemplos seguintes, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.

EXEMPLOS

[0294]Os Exemplos que se seguem são ilustrativos das formas de realização específicas da invenção e vários usos destas. Eles são apresentados apenas para fins explicativos e não devem ser tomados como limitantes da invenção.

Exemplo 1: Engenharia de cepa e fermentação de EFSC 3044.

[0295]Cepa de levedura EFSC 3044 foi derivada de uma cepa de Saccha- romyces cerevisiae do tipo selvagem contendo três modificações auxotróficas, isto é, as deleções de URA3, LEU2 e HIS3. A cepa pode ser manipulada usando métodos genéticos padrão e pode ser usada como uma cepa de levedura diplóide ou haplóide regular. A cepa foi convertida para levedura produtoras de glicosídeos de esteviol por integração genômica de cinco cosntruções de DNA. Cada construção continha genes múltiplos e foi introduzida no genoma de levedura por recombinação homóloga. Além disso, a primeira, segunda, e quinta construção foram montadas por recombinação homóloga em levedura.

[0296]A primeira construção continha oito genes e foi inserida no loco DPP1 e DPP1 (fosfatase) interrompida e parcialmente suprimida. O DNA inserido continha: o promotor TEF1 de Ashbya gossypii expressando o gene natMX (marcador selecio- nável) seguido pelo terminador TEF1 de A. gossypii; UGT85C2 de Stevia rebaudiana otimizado por códon de Técnica de Gene (GenBank AAR06916.1; SEQ ID NO: 3) expressado a partir do promotor GPD1 de levedura nativa e seguido pelo terminador CYC1 de levedura nativa; CPR-8 de S. rebaudiana (SEQ ID NO: 5) expressado usando o promotor TPI1 de levedura nativa seguido pelo terminador TDH1 de levedura nativa; caureno sintase de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 6, similar a GenBank AEE36246.1) expressado a partir do promotor PDC1 de levedura nativa e seguido pelo terminador FBA1 de levedura nativa; GGPPS de Synechococcus sp. sintético (SEQ ID NO: 22, GenBank ABC98596.1) expressado usando o promotor TEF2 de levedura nativa e seguido pelo terminador PGI1 de levedura nativa; KAHe1 de S. re- baudiana otimizado por códon DNA2.0 (SEQ ID NO: 8) expressado a partir do promotor TEF1 de levedura nativa e seguido pela terminador ENO2 de levedura nativa; KO- 1 de S. rebaudiana sintético (SEQ ID NO: 23, GenBank ABA42921.1) expressado usando o promotor FBA1 de levedura nativa e seguido pelo terminador TDH2 de levedura nativa; e CDPS truncado de Zea mays (SEQ ID NO: 133) expressado usando o promotor PGK1 de levedura nativa e seguido pelo terminador ADH2 de levedura nativa.

[0297]A segunda construção foi inserida no loco YPRCΔ15 e continha: o promotor TEF1 de A. gossypii em frente do gene kanMX (marcador selecionável) seguido pelo terminador TEF1 de A. gossypii; o ATR2 de A. thaliana otimizado por códon de Técnica de Gene (SEQ ID NO: 10) expressado a partir do promotor PGK1 de levedura nativa seguido pelo terminador ADH2 de levedura nativa; UGT74G1 de S. rebaudiana (SEQ ID NO: 135, GenBank AAR06920.1) expressado a partir do promotor TPI1 de levedura nativa seguido pelo terminador TDH1 de levedura nativa; UGT76G1 de S. rebaudiana otimizado por códon de Técnica de Gene (SEQ ID NO: 14, codifica GenBank AAR06912) expressado a partir do promotor TEF1 de levedura nativa seguido pelo terminador ENO2 de levedura nativa; e sequência otimizada por códon GeneArt que codifica um UGT91D2e-b de S. rebaudiana com as modificações de aminoácido L211M e V286A (SEQ ID NO: 15 para a sequência de aminoácidos UGT91D2e para a sequência do tipo selvagem; sequência de nucleotídeo otimizada por códon é apresentada na SEQ ID NO: 90) e expressado a partir do promotor GPD1 de levedura nativa e seguido pelo terminador CYC1 de levedura nativa. UGT91D2e-b é aqui divulgado como SEQ ID NO: 66 com mutações no resíduo de metionina no resíduo 211 e uma resíduo de alanina no resíduo 286.

[0298]A primeira e a segunda construção foram combinadas no mesmo clone de esporo por meio de cruzamento e dissecção. Esta cepa de levedura foi subsequentemente transformada com três e quatro construções em dois eventos sucessivos.

[0299]Construção três foi integrada entre genes PRP5 e YBR238C e continha o promotor leu2 de Kluyveromyces lactis expressando o gene leu2 de K. lactis seguido pelo terminador leu2 de K. lactis, o promotor GPD1 de levedura nativa expressando o KAHe1 de S. rebaudiana otimizada DNA2.0 (SEQ ID NO: 8) seguido pelo terminador CYC1 de levedura nativa, e o promotor TPI1 de levedura nativa expressando o CDPS truncado de Zea mays (SEQ ID NO: 133) seguido pelo terminador TPI1 de levedura nativa.

[0300]Construção quatro foi integrada no genoma entre genes ECM3 e YOR093C com um cassete de expressão contendo o promotor TEF1 de A. gossypii expressando o gene hphMX de K. pneumoniae seguido pelo terminador TEF1 de A. gossypii, GGPPS de Synechococcus sp. (SEQ ID NO: 22) expressado a partir do promotor GPD1 de levedura nativa seguido pelo terminador CYC1 de levedura nativa, e o promotor TPI1 de levedura nativa expressando o KS de A. thaliana (SEQ ID NO: 6) seguido pelo terminador TPI1 de levedura nativa.

[0301]Os quatro introduziram marcadores selecionáveis natMX, kanMX, K. lactis LEU2 e hphMX de K. pneumoniae e os promotores precedentes e terminadores sucessores do genes marcadores selecionáveis foram, em seguida, removidos por recombinação.

[0302]Nesta cepa de levedura, a quinta construção foi inserida e montada por transformação de levedura e recombinação de homólogo. A quinta construção continha sete genes e foi inserida no loco YORWΔ22. O DNA inserido continha: o promotor TEF1 de A. gossypii expressando o gene HIS5 de Schizosaccharomyces Pombe (marcador selecionável) seguido pelo terminador TEF1 de A. gossypii; KO-1 de S. rebau- diana (SEQ ID NO: 23, GenBank ABA42921.1) expressado a partir do promotor GPD1 de levedura nativa e seguido pelo terminador CYC1 de levedura nativa; CPR-8 de S. rebaudiana (SEQ ID NO: 5) expressado usando o promotor TPI1 de levedura nativa seguido pelo terminador TDH1 de levedura nativa; caureno sintase de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 6, similar a GenBank AEE36246.1) expressado a partir do promotor PDC1 de levedura nativa e seguido pelo terminador FBA1 de levedura nativa; uma versão otimizada por códon do Os03g0702000 de gene de arroz (SEQ ID NO: 18, que codifica EUGT11) expressado usando o promotor TEF2 de levedura nativa e seguido pelo terminador PGI1 de levedura nativa; KAHe1 de S. rebaudiana otimizado por códon DNA2.0 (SEQ ID NO: 8) expressado a partir de promotor TEF1 de levedura nativa e seguido pelo terminador ENO2 de levedura nativa; e CDPS truncado de Zea mays (SEQ ID NO: 133) expressado usando o promotor PGK1 de levedura nativa e seguido pelo terminador ADH2 de levedura nativa.

[0303]A cepa de levedura descrita foi feita prototrófica através da introdução dos dois plasmídeos, EPSC2182 e EPSC2308. EPSC2182 foi derivado de um plas- mídeo de transporte de CEN/ARS à base de p415TEF com um marcador LEU2 e contém uma outra cópia de KAHe1 de S. rebaudiana expressado a partir de promotor TEF1 de levedura nativa e sucedido pelo terminador CYC1 de levedura nativa. EPSC2308 foi um plasmídeo de transporte de CEN/ARS à base de p416TEF com o marcador URA3 em que o gene EUGT11 foi clonado e expressado a partir de promotor TEF1 de levedura nativa e sucedido pelo terminador CYC1 de levedura nativa. Esta cepa de levedura depois foi designada EFSC 3044. Tabela 11. Lista de Genes Recombinantes em Cepa EFSC 3044.

[0304]Fermentação de batelada alimentada foi realizada aerobicamente em fermentadores de 2L (volume de trabalho) que incluiu uma fase de crescimento de ~16 horas no meio de base (Meios Completos Sintéticos) seguido por ~100 horas de alimentação com glicose utilizada como a fonte de carbono e energia combinada com suplementação de metais de traço, vitaminas, sais, e Base de Nitrogênio de Levedura (YNB) e/ou aminoácido. O pH foi mantido perto de pH 5, e o ponto de ajuste de temperatura foi de 30 °C. A razão de alimentação foi controlada para evitar a depleção de oxigênio e minimizar a formação de etanol (condições limitadas de glicose). Todas as amostras de cultura (sem remoção de célula) foram tomadas e fervidas em um volume igual de DMSO para níveis de glicosídeos totais.

[0305]A metodologia seguinte foi usada para analisar os intermediários da via de glicosídeos de esteviol e esteviol, a menos que de outro modo indicado. Análises de LC-MS foram realizadas usando um sistema UPLC 3000 UltiMate® (Dionex, Sunnyvale, CA) equipado com um coluna C18 BEH Acquity UPLC® (100 x 2,1 mm, 1,7 μm de partículas; Waters, Milford, MA) conectado a um espectrômetro de massa de quadropolo triplo TSQ Quantum Access (ThermoFisher Scientific) com uma fonte de íon por electrospray aquecida (HESI). Eluição foi realizada usando uma fase móvel de eluente B (MeCN com Ácido fórmico a 0,1 %) e eluente A (água com Ácido fórmico a 0,1 %) aumentando o gradiente de 29 -> 48 % de B de min 0,0 a 4,0, aumentando de 48 -> 100 % de B em min 4,0 a 4,2, segurando 100 % de B de min 4,2 a 6,2, e reequilibrando com 29 % de eluente B. A taxa de fluxo foi 0,4 ml/min e a temperatura de coluna foi mantida a 55 °C. Glicosídeos de esteviol foram detectados usando SIM (Monitoramento de Íon Único) em modo positivo com os seguintes traços de m/z na Tabela 12. Tabela 12: Sumário de Compostos Analíticos Detectados por LC/MS.

[0306]O nível de glicosídeos de esteviol foi quantificado em comparação com curvas de calibração obtidas com padrões autênticos de Padrões de LGC. Por exemplo, soluções padrão de 0,5 a 100 μM de Rebaudiosídeo A (RebA) foram tipicamente utilizadas para construir uma curva de calibração. Figura 5 contém espectros de massa representativos de fermentações que resultaram na formação de um glico- sídeo de esteviol hexaglicosilado (tempo de retenção 1,31, traços de massa correspondendo a um glicosídeo de esteviol e esteviosídeo de hexa-glicose).

[0307]Uma metodologia de LC-MS modificada (usando uma coluna de HPLC C18 BEH RPshield (50 x 2,1 mm, 1,7 μm de partículas; Waters, Milford, MA) foi usada para analisar os compostos descritos no Exemplo 5 e experimento in vitro para determinar as taxas relativas para UGT76G1. A eluição foi realizada usando uma fase móvel de eluente B (MeCN com Ácido fórmico a 0,1 %) e eluente A (água com Ácido fórmico a 0,1 %) aumentando o gradiente de 25 -> 47 % de B de min 0,0 a 4,0, aumentando de 47 -> 100 % de B em min 4,0 a 5,0, segurando 100 % de B de min 5,0 a 6,5, e finalmente re-equilibrando com 25 % de B. A taxa de fluxo foi 0,4 ml/min e a temperatura de coluna foi mantida a 35 °C. Uma metodologia de LC-MS modificada resultou em tempo de retenção muito curto para os compostos mostrados na Tabela 12. Tempos de retenção típicos usando a metodologia de LC-MS modificada (tR em min) foram: 3,34 para 19-SMG; 3,54 para 13-SMG; 2,55 para Rubusosídeo; 2,95 para Esteviol-1,2-biosídeo; 3,31 para Esteviol-1,3-biosídeo; 2,04 para 1,2-Esteviosídeo; 2,42 para 1,3-Esteviosídeo; 2,91 para Rebaudiosídeo B; 2,03 para Rebaudiosídeo A; 1,1 para Rebaudiosídeo D; e 1,32 para Rebaudiosídeo M.

Exemplo 2: Caracterização in vitro de reações que produzem um glicosídeo de esteviol hexa-glicosilado.

[0308]Como descrito no Exemplo 1, um glicosídeo de esteviol hexa-glucosil foi observado quando EUGT11 foi expressado em altos níveis em produtoras de es- teviol-glicosídeo. Para caracterizar as reações que ocorreram para produzir esta molécula, outro trabalho in vitro foi feito com UGTs individuais.

[0309]UGT76G1 (SEQ ID NO: 1) foi clonado no plasmídeo pET30a (EMD Millipore). O vetor resultante foi transformado em uma cepa de E. coli DE3 apropriada e transformantes foram cultivados e induzidos de acordo com os protocolos do fabricante. A proteína de fusão correspondente (6X HIS-etiquetada) foi purificada por cro- matografia de afinidade de metal imobilizado usando métodos padrão.

[0310]Aproximadamente 0,08 μg de UGT76G1 purificado por μL de reação foi incubado com RebD 100 μM, UDP-glicose 300 μM, e Alcalino Fosfatase 10 U/mL (Fer- mentas/Thermo Fisher, Waltham, MA). As reações foram realizadas a 30 °C em Hepes-NaOH 20 mM, pH 7,6, por 24 horas. Antes da análise de LC-MS, um volume de DMSO a 100 % foi adicionado a cada reação e submetida a vórtice, e as amostras foram centrifugadas a 16.000X g por 1 minuto.

[0311]Um novo pico apareceu durante a reação em uma massa correspondendo a esteviol + 6 porções de glicose, eluindo a 1,31 min e correspondando a um traço de um dos glicosídeos de esteviol hexaglucosil encontrado na superexpressão de EUGT11 in vivo. Este resultado sugeriu que UGT76G1 pode ainda glicosilar RebD, resultando em um hexaglicosídeo. A hipótese de que UGT76G1, além de fazer uma ligação de 1,3-glicose com a glicose primária a C13 da estrutura de esteviol, tem uma atividade secundária de adicionar uma 1,3-glicose ligada à glicose primária a C19. É provável que somente o sítio de glicosilação disponível em RebD disponível para UGT76G1 seja a glicose a C19, que resultaria na produção de um hexaglicosídeo designado RebM. O hexaglicosídeo detectado foi isolado e determinado ser Rebaudi- osídeo M, como mostrado nos Exemplos 3 e 4.

Exemplo 3: Isolamento da molécula hexa-glicosilada.

[0312]O produto de glicosídeo de esteviol de hexa-glucosil foi isolado a partir de uma fermentação similar àquela descrita no Exemplo 1 para análise estrutural seguindo o esquema esboçado na Figura 6.

[0313]Depois da fermentação, o caldo de cultura foi centrifugado por 30 min a 7000 rpm a 4 °C e o sobrenadante foi purificado como segue: Uma coluna de vidro foi enchida com 150 mL de resina HP20 Diaion® (Supelco), e uma alíquota de 300 mL de sobrenadante foi carregada à coluna e lavada com 2 x 250 mL de água MilliQ. O produto de glicosídeo foi eluído por aumentos gradualmente incrementais na concentração de metanol em água MilliQ (em 250 mL de porções - iniciando com 0 % ^ 10 % ^ 40 % ^ 60 % ^ 80 % ^ 100 % de MeOH). Os níveis de glicosídeos de esteviol em cada fração foram analisados por LC-MS. As frações mais promissoras (60 a 80 % de MeOH) foram combinadas e reduzidas ao total de 10 mL usando um evaporador a vácuo. Uma coluna de vidro enchida com 600 mL de gel de sílica flash C18 esférica (45 a 70 um, 70 A/Supelco) foi equilibrada com acetonitrila aquosa a 5 % (Acetronitrila: grau de HPLC - Água: MilliQ). O resíduo concentrado a patir da purificação de HP20 foi carregado na coluna e eluído por aumentos graduais na contribuição de acetoni- trila. O eluente de partida foi acetonitrila a 5 % em água. O nível de acetonitrila foi elevado por 5 % por etapa (cada 400 mL). Depois de atingiro 50 % de acetonitrila, 10 % de etapas foram feitas. Todas as frações foram analisadas por LC-MS, agrupadas de acordo com sua composição de glicosídeo de esteviol, e secas sob vácuo. Tabela 13 contém um sumário dos glicosídeos encontrados em cada uma das frações. Figura 7 contém um cromatograma e espectros de massa de análise LC-QTOF do composto hexa-glicosilado semi-purificado depois da cromatografia flash. Tabela 13. Sumário de Fracionamento de Glicosídeos de Esteviol.

Exemplo 4: Confirmação de RMN da estrutura.

[0314]Para produzir uma amostra pura para RMN, aproximadamente 50 mg do resíduo enriquecido com hexa-glicosilado obtido no Exemplo 3 foram ainda purificados em um sistema de HPLC semi-preparativa. O sistema foi equipado com uma coluna C18 Aqua® (Phenomenex: Dimensão 250 x 21,2 mm, 5 mícrons). Eluição foi realizada usando uma fase móvel de eluente B (MeCN com ácido trifluoroacético a 0,1 %) e eluente A (água com ácido triflouroacídico a 0,1 %) aumentando o gradiente de 1 % ^ 50 % de B de min 0,0 a 21,50 -> 100 % min 21,0 a 27,0 e finalmente lavendo com 100 % de B e re-equilibração. A taxa de fluxo foi 14 mL/min na temperatura ambiente. As frações foram coletadas por tempo e analisadas por LC-QTOF-MS quanto a presença de glicosídeos de esteviol. O sistema usado foi um UPLC (Waters) acoplado a um Espectrômetro de massa MicrOTOFII (Bruker). A coluna usada foi Acquity UPLC® BEH C18, 100 x 2,1 mm, 1,7 μm (Waters). Fases móveis foram A: Ácido fór- mico a 0,1 % em água e B: Ácido fórmico a 0,1 % em Acetonitrila. O gradiente aplicado foi de 1 % de B a 50 % de B em 12 minutos e, em seguida, a 100 % de B em 3 minutos. A taxa de fluxo foi 0,4 ml/min.

[0315]Fração 93 foi utilizada para a análise de RMN. Todos os experimentos de RMN foram realizados em DMSO-d6 a 25C usando um espectrômetro de RMN Bruker Avance III 600MHz equipado com uma sonda TCI criogênica de 1,7 mm.

[0316]As estruturas foram resolvidas por meio de experimentos de RMN de multipulso homo e heteronuclear padrão, isto é, experimentos 1H,1H-COSY, 1H,13C- HSQC e 1H,13C-HMBC. Os dados de RMN obtido foram como segue: RMN de 1H (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,78 (br. s., 1 H) 0,83 (s, 3 H) 0,92 (d, J = 7,39 Hz, 2 H) 0,97 - 1,04 (m, 1 H) 1,17 (s, 3 H) 1,30 - 1,54 (m, 6 H) 1,67 (d, J = 10,40 Hz, 1 H) 1,72 - 1,86 (m, 4 H) 1,92 (d, J = 6,49 Hz, 1 H) 1,96 - 2,05 (m, 2 H) 2,08 (d, J = 10,82 Hz, 1 H) 2,32 (d, J = 12,71 Hz, 1 H) 2,91 (t, J = 8,82 Hz, 1 H) 2,95 - 3,01 (m, 1 H) 3,02 - 3,27 (m, 14 H) 3,31 - 3,55 (m, 10 H) 3,57 - 3,86 (m, 10 H) 4,47 (d, J = 7,86 Hz, 1 H) 4,51 (d, J = 8,00 Hz, 1 H) 4,53 (d, J = 7,62 Hz, 1 H) 4,66 (d, J = 7,81 Hz, 1 H) 4,73 (br. s., 1 H) 4,80 (d, J = 7,86 Hz, 1 H) 5,11 (br. s., 1 H) 5,53 (d, J = 8,19 Hz, 1 H) RMN de 13C (150,91 MHz, DMSO-d6) δ ppm 16,4, 19,4, 19,9, 21,8, 28,3, 36,7, 37,2, 39,3, 40,3, 41,5, 41,6, 43,2, 43,7, 47,0, 47,2, 53,2, 57,0, 60,7, 61,2, 61,4, 61,8, 62,0, 62,1, 68,5, 68,9, 70,4 (3C), 71,2, 71,6, 74,1 - 74,3 (4C), 74,8, 75,8, 76,9 - 77,1 (6C), 77,6, 79,6, 85,8, 86,8, 87,1, 92,1, 96,2, 102,1, 102,8, 103,2, 103,3, 104,5, 153,1, 175,1

[0317]A estrutura confirmada de RebM (nome sistemático: ácido 13-[β-D-glu- copiranosil-(1->3)-[β-D-glucopiranosil-(1->2)]-β-D-glucopiranosil-1-0xi]caur-16-en-18- oico, 18-[β-D-glucopiranosil-(1->3)-[β-D-glucopiranosil-(1->2))]-β-D-glucopiranosil-1- éster]) é mostrada na Figura 2.

Exemplo 5: Isolamento e determinação de produtos de fermentação adicionais de EFSC 3044.

[0318]Além de RebM, a fermentação de EFSC 3044 resultou na formação de um glicosídeo de esteviol di-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico, [2-O-β- D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil] éster) com um tempo de retenção de 2,31 (Figura 8B) e um glicosídeo de esteviol tri-glicosilado (ácido 13-hidróxi caur-16-en-18-oico; [2- O-β-D-glucopiranosil-3-O-β-D-glucopiranosil-β-D-glucopiranosil] éster) com um tempo de retenção de 2,15 (Figura 8C).

[0319]Estes compostos foram isolados de acordo com o método seguinte. Depois da fermentação, o caldo de cultura foi centrifugado por 10 min a 5000 rpm a 4 °C e o sobrenadante foi purificado como segue: Uma coluna de vidro foi enchida com 300 mL de resina HP20 Diaion® (Supelco), e uma alíquota de 1700 mL de sobrenadante foi carregada à coluna e lavada com 3,5 Litros de ddH2O. Os compostos foram eluídos usando 2 L de MeOH e frações de 500 mL cada, coletadas. Depois da análise de LC- MS, as frações contendo a maioria dos compostos alvos foram agrupadas e evaporadas em um sistema de evaporação rotativo (Rotavap, Büchi, Switzerland) produzindo 1,85 gramas de material cinza escuro. O extrato bruto foi re-dissolvido em 3,5 mL de DMSO e injetado em alíquotas de 0,7 mL em uma LC-MS semi-preparativa para outra purificação. A coluna usada foi uma C18 XBridge, 19 x 250 mm, 5 um (Waters Corporation). Fases móveis foram A: TFA a 0,1 % em água e B: TFA a 0,1 % em Acetonitrila. Eluição foi feita por um gradiente linear de 1 % de B a 60 % de B em 44 min. Frações de 2,1 mL foram continuamente coletadas durante a condução. Frações coletadas foram analisadas por LC-MS de modo a avaliar a presença e pureza de analitos alvos. Frações contendo compostos identificados como ‘Pico 8’ e ‘Pico 9’ foram neutralizadas adicionando 0,8 mL de NH3 (aq.), agrupadas e secas por sistema de evaporação centrífuga Genevac.

[0320]Estruturas destes compostos foram determinadas por RMN com o método de Exemplo 4.

[0321]Os dados RMN obtidos para o glicosídeo de esteviol di-glicosilado são como segue: RMN de 1H (600MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,72 - 0,79 (m, 1 H) 0,81 (s, 3 H) 0,93 (d, J = 8,07 Hz, 1 H) 0,98 - 1,05 (m, 1 H) 1,17 (s, 3 H) 1,20 (d, J = 11,37 Hz, 1 H) 1,36 (d, J = 4,03 Hz, 2 H) 1,40 - 1,52 (m, 1 H) 1,55 - 1,70 (m, 1 H) 1,77 (d, J = 9,54 Hz, 3 H) 1,84 - 1,90 (m, 1 H) 2,03 (d, J = 8,07 Hz, 1 H) 2,31 - 2,41 (m, 1 H) 2,79 - 2,87 (m, 1 H) 2,89 - 2,96 (m, 1 H) 3,08 (s, 2 H) 3,12 - 3,18 (m, 3 H) 3,19 - 3,24 (m, 1 H) 3,34 (d, J = 4,77 Hz, 2 H) 3,41 - 3,45 (m, 2 H) 3,46 - 3,55 (m, 1 H) 3,65 (d, J = 11,37 Hz, 1 H) 3,73 (dd, J = 15,41, 8,44 Hz, 4 H) 4,26 - 4,40 (m, 1 H) 4,48 (d, J = 7,70 Hz, 1 H) 4,52 - 4,62 (m, 1 H) 4,69 (br.s., 1H) 4,81 (d, J = 7,70 Hz, 1 H) 4,88 (br.s., 1 H) 4,91 - 5,03 (m, 1 H) 5,05 - 5,26 (m, 2 H) 5,51 (d, J = 7,70 Hz, 1 H) 5,55 (br.s., 1 H; a fórmula é C32H50O13; peso da fórmula é 642,7316).

[0322]Os dados de RMN obtidos para o glicosídeo de esteviol tri-glicosilado são como segue: RMN de 1H (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,73 - 0,79 (m, 1 H) 0,81 (s, 3 H) 0,89 - 0,97 (m, 2 H) 0,99 - 1,05 (m, 1 H) 1,17 (s, 3 H) 1,19 (d, J = 11,37 Hz, 1 H) 1,24 (s, 2 H) 1,31 - 1,40 (m, 4 H) 1,40 - 1,51 (m, 3 H) 1,55 - 1,63 (m, 1 H) 1,67 (dd, J = 14,12, 5,32 Hz, 1 H) 1,71 - 1,82 (m, 5 H) 1,88 (d, J = 11,00 Hz, 1 H) 1,98 - 2,08 (m, 2 H) 2,23 - 2,30 (m, 1 H) 2,94 (t, J = 8,44 Hz, 1 H) 3,01 - 3,11 (m, 3 H) 3,12 - 3,17 (m, 1 H) 3,19 - 3,28 (m, 3 H) 3,44 - 3,52 (m, 5 H) 3,54 - 3,60 (m, 1 H) 3,61 - 3,71 (m, 3 H) 4,36 (br. s., 1 H) 4,49 (br. s., 1 H) 4,55 (d, J = 7,70 Hz, 1 H) 4,69 (s, 1 H) 4,73 (br. s., 1 H) 4,88 (br. s., 1 H) 4,91 - 5,05 (m, 2 H) 5,17 (br.s., 1 H) 5,31 (br.s., 1 H) 5,44 (d, J = 8,07 Hz, 1 H) 5,55 (br. s., 1 H; a fórmula é C38H60O18; peso da fórmula é 804,8722).

[0323]O éster de glicosídeo de esteviol di-glicosilado foi determinado ser um análogo de esteviol-1,2-biosídeo (Figura 8B), e o glicosídeo de esteviol tri-glicosilado foi determinado ser um isômero de RebB, ambos os quais são glicosilados na posição 19-O (Figura 8C) em vez da posição 13-O de seus isômeros respectivos. Estes dados sugerem que estes compostos se formam quando a atividade de UGT85C é baixa em comparação com a atividade de EUGT11, UGT76G1, ou UGT74G1.

Exemplo 6: Engenharia e fermentação de EFSC 3261.

[0324]A cepa de Saccharomyces do tipo selvagem utilizada no Exemplo 1 foi modificada para conter os genes heterólogos na Tabela 14 envolvidos na produção de glicosídeo de esteviol. Os genes foram todos integrados no cromossomo da cepa do hospedeiro usando métodos similares descritos no Exemplo 1. Tabela 14. Lista de Genes Recombinantes e Promotores Usados na Cepa EFSC 3261.

[0325]Fermentação de batelada alimentada foi realizada aerobicamente em fermentadores de 2L (volume de trabalho) que incluiu uma fase de crescimento de ~16 horas no meio de base (meio mínimo contendo glicose, sulfato de amônio, metais de traço, vitaminas, sais, e tampão) seguido por ~100 horas de alimentação com um meio de alimentação definido contendo glicose. Glicose foi utilizada como a fonte de carbono e energia e combinada com metais de traço, vitaminas, e sais. O pH foi mantido perto de pH 5 e o ponto de ajuste de temperatura foi de 30 °C. A razão de alimentação foi controlada para evitar a depleção de oxigênio e minimizar formação de etanol (condições limitadas de glicose). Todas as amostras de cultura (sem remoção de célula) foram tomadas e fervidas em um volume igual de DMSO para níveis de glicosí- deos totais.

[0326]Figura 9 mostra produção de RebD por EFSC 3261 em quatro ensaios separados. Titulador médio de produção total (intracelular e extracelular combinada) foi entre 800 a 1200 mg/L. Para a fermentação conduzida 58, o titulador total final a 123 horas foi 1109 mg/L de RebD, 695 mg/L de RebM; a razão de D:M em uma base de massa foi de 1,6. 394 mg/L de RebA também foram produzidos.

Exemplo 7: Engenharia de cepa e fermentação de EFSC 3297 para a produção aumentada de RebD e RebM.

[0327]A mesma cepa de Saccharomyces do tipo selvagem utilizada no Exemplo 1 foi modificada para conter os genes heterólogos na Tabela 15 envolvidos na produção de glicosídeo de esteviol. Os genes foram todos integrados no cromossomo da cepa do hospedeiro usando métodos similares descritos no Exemplo 1. Embora os genes usados são idênticos àqueles no Exemplo 1, números de cópia aumentados de enzimas bottleneck na via de esteviol deixada para a produção aumentada de RebD e RebM. Fermentação de cepa 3297 foi realizada em um maneira similar àquela descrita acima para a cepa 3261. Tabela 15. Lista de Genes Recombinantes e Promotores Usados na Cepa EFSC 3297.

[0328]Produção de RebD e RebM por EFSC 3297 é mostrada na Figura 10. A razão de D:M em uma base de massa foi 1,1. 1517 mg/L de RebD foram produzidos no final da fermentação (total, intracelular mais extracelular) e 1375 mg/L de RebM foram produzidos.

Exemplo 8: Engenharia de cepa e fermentação de EFSC 3841 com duas cópias do gene UGT76G1.

[0329]A cepa de Saccharomyces do tipo selvagem utilizada no Exemplo 1 foi modificada para conter os genes heterólogos na Tabela 16 envolvidos na produção de glicosídeo de esteviol. Os genes foram todos integrados no cromossomo da cepa do hospedeiro usando métodos similares descritos no Exemplo 1. Condições de fermentação para 3841 foram similares àquelas descritas acima para a cepa 3261. Tabela 16. Lista de Genes Recombinantes e Promotores Usados na Cepa EFSC 3841.

[0330]Produção de RebD, RebM, e RebA por EFSC 3841 é mostrada na Figura 11. Aqui, a quantidade total de RebD produzida foi 2786 mg/L, e a quantidade total de RebM produzida foi 2673 mg/L para uma razão de 1,04 D:M (g por g). 703,7 mg/L de RebA também foram produzidos.

Exemplo 9: Combate de um gene UGT76G1 a partir de EFSC 3841 e produção diminuída de RebD e RebM.

[0331]Uma versão auxotrófica (leu2, ura3) de cepa EFSC 3841 descrita acima, designada EFSC 3643, foi ainda modificada para deletar genes 76G1 UGT do tipo selvagem. O desempenho de 3 colônias contendo uma cópia de UGT 76G1 foi testado versus 4 colônias da cepa não modificada que contém 2 cópias de UGT 76G1. PCR foi usada para verificar que a nova cepa apenas abrigou uma cópia de 76G1. Brevemente, a disrupção de uma cópia de UGT76G1 foi verificada por duas reações PCR amplificando uma região a montante do sítio de inserção com parte do cassete de integração e uma região a jusante do sítio de inserção com parte do cassete de integração usado para a disrupção. Primers de PCR designados para o 76G1 do tipo selvagem confirmaram que 76G1 do tipo selvagem estava ainda intacto e presente na cepa. As colônias foram cultivadas em placas de 96 poços profundos por 96 horas a 30 °C e 400 RPM. As quantidades totais de RebD e RebM foram determinadas por análise de LC/MS.

[0332]A partir da Figura 12, pode ser observado que o número de cópia de 76G1, significantemente, altera a razão de RebD/RebM. A razão de RebD para RebM foi plotada por 3 colônias contendo apenas uma cópia de 76G1 (barras do lado esquerdo do gráfico), versus 4 colônias da cepa precursora que continha 2 cópias de 76G1 UGT (barras do lado direito do gráfico).

Exemplo 10: Deteminação de taxas relativas de produção de RebD e RebM.

[0333]p416GPD contendo WT-76G1 foi expressado na cepa de levedura DSY6 deficiente de protease por 48 h em meios SC-ura. 100 μL de células foram, em seguida, reinoculadas em 3 mL de meios SC-ura por 16 h. As células foram lisadas com 200 μL de CelLytic™ Y de acordo com a descrição do fabricante. 6 μL do lisado foram adicionados a 24 μL da mistura de reação que consiste de 20 mM Tris-tampão (pH 8,0), UDPG 0,3 μM, e Reb D ou Reb E 0,1 μM. As reações foram incubadas a 30 °C e interrompidas a 0, 1, 2, e 18 h transferindo 25 μL da mistura de reação 30 μL a DMSO 25 μL. Quantidades de RebD, RebE, e RebM foram analisadas por LC-MS e avaliadas por integração de pico durante o processamento de dados como “área sob a curva.”

[0334]Figura 13 mostra que uma grande porção de RebD é consumida sem gerar uma quantidade correspondente de RebM. Também é mostrado que RebE é consumido dentro de 2 h e convertido para RebD. Esta descoberta confirma uma via de glicosilação alternativa de esteviol para RebM a RebE em ves de RebA ser possível, que é primeiro observado no ponto no tempo de 18 h.

Exemplo 11: Predição de aminoácidos envolvidos na ligação de RebM e RebD em UGT76G1.

[0335]Como um meio para identificar variantes de UGT76G1 com atividade aumentada e regiosseletividade para RebM ou RebD, estudos de modelação e acoplamento de homologia foram realizados. Três modelos de homologia foram gerados usando ajuste padrão no programa SybylX com uma combinação dos seguintes arquivos de PDB 2PQ6 (%ID = 31), 2C1X (%ID = 28), 3HBF (%ID = 28), 2VCE (%ID = 35) como modelos. Os ligantes presentes em PDB2VCE foram usados durante a geração de cadeias principais e laterais, mas removidos antes da minimização de energia. Para produzir as estruturas de qualidade superior, os modelos foram minimizados de energia usando um campo de força AMBER FF99 com os ajustes padrão ou uma terminação de gradiente com um pincípio de 0,1kJ, um raio de corte de 10 A, e uma iteração máxima de 5000 ciclos. Estatísticas para os modelos são mostradas na Tabela 17, e a variação entre os modelos pode ser encontrada na Figura 14. Tabela 17. Sumário de modelos de homologia de UGT76G1.

[0336]Depois da geração do modelo, os substratos foram acoplados no sítio ativo da enzima usando o Surflex Dock suite em SybylX para prever a formação de aminoácidos na bolsa de ligação. A porção de UDPG do sulco de ligação de UGT76G1 foi localizada alinhando os modelos 76G1 com PDB2VCE e importando o ligante, UDPF2G, diretamente a partir do modelo. Para acoplar os substratos aceitantes, um protocolo foi gerado usando valores padrão cobrindo a parte remanescente do sítio de ligação. Os acoplamentos foram realizados usando os ajustes de GeomX em uma biblioteca de ligante contendo glicosídeos de esteviol deixados com flexibilidade de proteína (modelo 1) ou nenhuma flexibilidade (modelo 2). A resultados de acoplamento foram analisados usando uma combinação das funções de pontuação em SybylX usando resultados de aclopamento top 3 em modo de base e resultado de acoplamento top 1 com flexibilidade de proteína.

[0337]Todos os aminoácidos UGT76G1 são mostrados na Tabela 18 abaixo. Os sítios oara a biblioteca de saturação foram determinados selecionando todos os resíduos encontrados estar dentro de 5A de RebD e RebM na análise de acoplamento em dois ou mais modelos (mostrados como negrito “x”). Além disso, todos os resíduos encontrados estão dentro de 5A de 19-O-porção de glicose de RebM e RebD, que foram posicionados no sítio de ligação para a reação RebD^RebM, foram selecionados. Resíduos completamente conservados entre enzimas similares, que são mostrados em negrito e com um “!,” foram omitidos a partir da triagem. Tabela 18. Predição de aminoácidos envolvidos na ligação de RebM e RebD em UGT76G1.

Negrito indica conservação completa no aminoácido. Bold “!” indica resíduos de aminoácido que são completamente conservados entre enzimas similares e foram omitidos a partir da triagem.

Exemplo 12: Pré triagem da biblioteca de saturação de sítio de UGT76G1.

[0338]Antes de realizar a triagem da biblioteca de saturação de sítio de UGT76G1 como descrito aqui, crescimento de cultura e produção de RebM e RebD foram monitorados em placas de 96 e 4 x 24 poços profundos. Usando o protocolo de acetato de lítio padrão, a cepa EFSC 3385 foi transformada com p416GPD contendo WT-76G1, e os transformantes foram colocados em placas SC-URA. EFSC 3385 é uma cepa que é deficiente em UGT76G1 e, assim fará RebE até ser transformado com um plasmídeo contendo um UGT76G1 ativo. A cepa continha uma disrupção na reação codificadora de UGT76G1, que foi substituída com o marcador spHIS5, e também continha cópias integradas do mutante UGT91D2e-2X, UGT74G1, ATR2, UGT85C2, CPR8 de S. rebaudiana (2 cópias), KS5 de A. thaliana (2 cópias), GGPPS7 de Synechococcus, KAHe1 de S. rebaudiana otimizado por códon (2 cópias), KO de S. rebaudiana (duas cópias), CDPS5 de Zea mays truncado (2 cópias), e EUGT11.

[0339]Para a condição de placa de 96 poços profundos, 96 colônias foram transferidas a um placa contendo 1 mL de SC-URA, e a placa foi incubada a 30 °C e 400 RPM por 96 h. Para a condição de placa de 4 x 24 poços profundos, 96 colônias foram transferidas a uma placa contendo 3 mL de SC-URA. A placa foi incubada a 30 °C e 320 RPM por 96 h, e 200 μL foram, em seguida, transferidos a partir de cada poço a uma placa de 96 poços profundos.

[0340]50 μL das culturas de cada placa foram transferidos às placas de reação de cadeia polimerase (PCR) de 96 poços e diluídos 1:1 com dimetil sulfóxido a 100 % (DMSO). As placas foram seladas por calor, incubadas a 80 °C por 10 min, e subsequentemente esfriadas a 25 °C. As placas foram giradas a 4000 RPM por 10 min, e 50 μL das misturas de cultura foram transferidos a uma nova placa para a análise de LC-MS.

[0341]Os resultados da pré-triagem biblioteca de saturação do sítio UGT76G1 podem ser encontrados na Figura 15. Variação na produção de RebD e RebM pode ser explicada por evaporação, particularmente, nos poços localizados nas bordas da placa, durante o curso de 96 h do período de incubação. As concentrações mais altas de RebM e RebD produzidos por colônias cultivadas em placas de 96 poços profundos sugerem que estas placas são mais adequadas para a análise de LC-MS, em comparação com a placa de 4 x 24 poços profundos, e foram assim selecionadas para o uso no triagem de biblioteca de saturação de sítio de UGT76G1.

Exemplo 13: Triagem de biblioteca de saturação de sítio de UGT76G1.

[0342]Através da empresa, Baseclear, UGT76G1 foi subclonado a partir de EPSC2060 (p423GPD) para EPSB492 (p416GPD) usando os sítios de restrição SpeI e XhoI, e as bibliotecas de saturação de sítio foram criadas usando primers de NNS degenerados. Usando o protocolo de acetato de lítio padrão, a cepa EFSC3385 foi transformada com a biblioteca ou com plasmídeo de controle contendo WT-76G1, e os transformantes foram colocados em placas SC-URA.

[0343]1 mL de meios SC-URA foi adicionado a placas de 96 poços profundos, e as colônias a partir de cada um dos 38 resíduos de biblioteca de saturação de sítio identificados no Exemplo 9 foram escolhidas e incubadas nas placas de 96 poços profundos a 30 °C e 400 RPM por 96 h. 50 μL de cada amostra de cultura foram, em seguida, transferidos a placas de PCR de 96 poços contendo 50 μL de DMSO a 100 %. As placas foram, em seguida, seladas por calor, incubadas a 80 °C por 10 min, subsequentemente esfriadas a 12 °C, e giradas a 4000 RPM por 10 min. 70 μL de cada sobrenadante foram transferidos a uma nova placa para a análise de LC-MS.

[0344]A Figura 16 mostra todos os pontos de dados da triagem de biblioteca de saturação de sítio de UGT76G1, com a produção de tipo selvagem retratada com triângulos pretos. O sistema de numeração variante pode ser encontrado na Tabela 19. Tabela 19. Numeração para as variantes da biblioteca de saturação de sítio de UGT76G1.

[0345]A Tabela 20 e Figura 17 mostram as colônias de variantes de UGT76G1 com a seletividade mais alta para a produção de RebM ou RebD, que foram selecionadas para outro estudo. Na Figura 17, todos os pontos de dados com o prefixo “WT” indica produção de RebM e RebD da enzima de tipo selvagem. É mostrado que as variantes de enzima selecionada exibem um RebD inibido para a atividade de RebM ou uma produção aumentada de RebM, em comparação com os controles do tipo selvagem. Tabela 20. Co ônias produtoras de RebM e RebD superiores.

Exemplo 14: Retriagem de biblioteca de saturação de sítio de UGT76G1 e sequenciamento de variante.

[0346]Uma retriagem das 47 colônias de variante de UGT76G1 produzindo as quantidades mais altas de RebD ou RebM foi feita em triplicata e mostrou as mesmas tendências como a triagem inicial (Figura 19). As colônias a ser sequenciadas foram selecionadas compilando os resultados a partir da triagem e retriagem. Como os níveis de produção da triagem e retriagem não podem ser diretamente comparados, as colônias foram classificadas a partir de produtores mais altos para mais baixos de RebD e RebM, respectivamente, e os níveis a partir da triagem e retriagem foram submetidos a média. A partir das médias, as colônias produtoras de top 16 RebD-, top 16 RebM-, e top 16 RebD/M (um total de 48 colônias) foram identificadas. Como al- gums dos produtores de top RebD e top RebD/M foram encontrados ser as mesmas colônias, colônias em duplicata foram contadas apenas uma vez, e colônias adicionais foram escolhidas para atingir as 48 colônias totais a ser sequenciadas. Estas colônias foram, em seguida, sequenciadas em duplicata com os primers GPDseq_fwd e CYC1seq-rev, mostrados abaixo.

[0347]Primer GPDseq_fwd seq: CGG TAG GTA TTG ATT GTA ATT (SEQ ID NO: 88)

[0348]Primer CYC1seq_rev seq: CTT TTC GGT TAG AGC GGA TGT (SEQ ID NO: 89)

[0349]As Tabelas 21 a 23 mostram as quantidades e as classificações de RebD, RebM, e RebD/RebM produzidos pelas variantes indicadas, e a Tabela 24 resume as mutações que seletivamente aumentam a produção de RebD ou RebM. Quantidades de RebM, RebD, RebA, Rubusosídeo, e RebB produzidos por colônias de variante do tipo selvagem e UGT76G1 são mostradas na Tabela 25. Tabela 21. Identidades de variantes de UGT76G1 produtoras RebD superior.

Tabela 22. Identidades das variantes de UGT76G1 produtoras de RebM su- perior.

Tabela 23. Identidades das variantes de UGT76G1 produtoras de RebD/M su- perior.

Tabela 24. Sumário de variantes de UGT76G1 para a produção de RebD e produção de RebM.

Tabela 25. Produção de glicosídeos de esteviol por variantes de UGT76G1.

Exemplo 15: Determinação de taxas relativas de reações de glicosilação de UGT76G1.

[0350]UGT76G1 foi apenas conhecido na literatura para catalisar a 1,3-glico- silação de 1,2-esteviosídeo para convertê-lo em RebA e convertendo 1,2-biosídeo para RebB. Os inventores descobriram recentemente que as reações mostradas na Tabela 26 são catalisadas por UGT76G1. Tabela 26. Reações de UGT76G1 recentemente descobertas.

[0351]Similar ao Exemplo 9, p416GPD contendo WT-76G1 foi expressado na cepa de levedura DSY6 deficiente de protease por 48 h em meios SC-ura. 100 μL de células foram, em seguida, reinoculados em 3 mL de meios SC-ura por 16 h. As células foram lisadas com CelLytic™ Y 200 μL de acordo com a descrição do fabricante. 6 μL do lisado foram adicionados a 24 μL da mistura de reação que consiste de Tris-tampão 20 mM (pH 8,0), UDPG 0,3 μM, e rubusosídeo 0,1 μM, 1,2-biosídeo 0,2 μM, 1,2-esteviosídeo 0,2 μM, RebA 0,2 μM, ou RebE 0,1 μM. As reações foram incubadas a 30 °C e interrompidas a 0, 1, 2, e 18 h transferindo 25 μL da mistura de reação 30 μL para DMSO 25 μL. Quantidades de glicosídeos de esteviol foram analisadas por LC-MS e avaliadas por integração de pico durante o processamento de dados como “área sob a curva.”

[0352]Na Figura 19, é mostrado que uma diminuição de aproximadamente 50 % na “área sob a curva” para rubusosídeo resultou na produção considerável de 1,3- esteviosídeo (RebG) durante 18 h. RebQ, recentemente descoberto pelos inventores, foi primeiro detectado a 18 h. Adicionalmente, a Figura 19 mostra que 1,2-esteviosídeo não foi completamente consumido durante o período de 18 h para a produção de RebA como 1,2-biosídeo foi para a produção de RebB.

[0353]Além disso, usando 1,2-esteviosídeo ou RebA como um substrato, um pico eluindo a 1,96 min no cromatograma de esteviol + 5 glicose apareceu (Figura 20). Como RebD elui a 1,11 min e UGT76G1 apenas catalisa as reações de 1,3-glicosila- ção, o pico eluindo a 1,96 min apareceu ser RebI. Entretanto, não foi possível integrar o pico de RebI porque ele estava situado em um pico de artefato de substrato (Figura 20).

[0354]Estes resultados coletivamente indicaram que UGT76G1 preferencialmente catalisaram a glicosilação de substratos de glicosídeo de esteviol que são 1,2- di-glicosilados na 13-O-posição, seguido por substratos de glicosídeo de esteviol que são mono-glicosilados na 13-O-posição. Não pareceu ser pouca a preferência resultante a partir do estado de glicosilação da 19-O-posição. A Figura 1 resume as reações de glicosilação de glicosídeo de esteviol e as enzimas pelas quais elas são conhecidas ser catalisadas. Exemplo 16: Produção de glicosídeos de esteviol por variantes de UGT76G1.

[0355]Padrões quantitativos não são comercialmente disponíveis para cada glicosídeo de esteviol, que impedem algumas medições de concentração. Portanto, a produção de adicional de glicosídeos de esteviol pelas variantes de enzima, em comparação com a enzima do tipo selvagem, foi avaliada por integração de pico durante o processamento de dados. Os dados da “área sob a curva” para cada variante foram normalizados para UGT76G1 do tipo selvagem e são mostrados na Tabela 27. Estes dados estavam de acordo com os exemplos anteriores mas também mostram que algumas das variantes não produzem 1,3-esteviosídeo (RebG), rubusosídeo, “Reb Q,” e/ou um esteviol-tetraglicosídeo eluindo a 1,43 min, como os controles do tipo selvagem. Aumentos na produção de RebM e RebD podem ser explicados por esta observação. Tabela 27. Dados da “área sob a curva” como uma medida da produção de glicosídeos de esteviol por variantes de UGT76G1 em relação a produção de UGT76G1 do tipo selvagem.

[0356]A Tabela 28 resume as tendências na produção de glicosídeo de este- viol através de mutações de otimização de RebD e otimização de RebM, em comparação com produção de controles do tipo selvagem normalizada. As variantes com produção de RebD aumentada apareceu principalmente para ser o resultado de inibição da reação de RebD^RebM. A produção de RebD adicional pode ser o resultado da inibição da ramificação da glicosilação de esteviol de Rubu^RebG^RebQ assim como uma redução em RebB e de um tetraglucosídeo eluindo a 1,43 min. O aumento de quatro vezes em 1,2-Esteviosídeo e sete vezes increase em RebE foram inesperado, but the RebE increase pode ser um aumento de sete vezes em uma quantidade muito pequena de produto encontrado nos controles do tipo selvagem. Não obstante, esta descoberta indicou que a reação de Esteviosídeo^RebA também tem sido parcialmente inibida pelas mutações de otimização de RebD, que foi observado como uma redução no intermediário de RebA. Tabela 28. Produção de glicosídeo de esteviol pela mutações de UGT76G1 de tipo selvagem ou otimização de RebD e RebM.

[0357]A mutação resultante de níveis de RebD mais altos, L257G, produziu quase quatro vezes o RebD do tipo selvagem e foi encontrada em seis colônias se- quenciadas. Outras mutações de L257 demonstraram quase a mesma produtividade. Mutantes I26W e S283G mostraram a razão de RebD/esteviosídeo mais alta, indicando que estas mutações levaram a maior inibição da reação RebD^M sem atenuar a reação Stev^RebA. Estas duas mutações também aboliram completamente a via de Rubu^RebG^RebQ e reduziram a quantidade do tetraglucosídeo eluindo a 1,43 min enquanto afetando minimamente produção de RebB. As melhores razões de RebD/RebM foram encontradas com T146G e S283N mutantes, que mostraram um aumento de 40 a 50 vezes sobre o tipo selvagem. A mutação de S389F encontrada com L257R demonstrou produção de RebD mais alta do que L257R sozinho.

[0358]Geralmente, o aumento em RebM também resultou em aumento em RebD, enquanto diminuindo ou bloqueando completamente a via de o tetraglucosídeo eluindo a 1,43 min. Ainda, os glicosídeos de esteviol remanescentes estudados não apareceram afetados. Os produtores de RebM superior, T55K e K337P, cada um aumentou RebM por 1,3 vezes e diminuiu rubusosídeo por 0,6 vezes, em comparação com o tipo selvagem. Visto que, o rubusosídeo estava apenas presente a 0,7 μM no tipo selvagem, esta diminuição observada foi insuficiente para explicar o aumento de RebM. A via de Rubu^RebG^RebQ foi uase removida, sem nenhum 1,3-esteviosí- deo (RebG) produzido pelos mutantes. Também, a variante com a mutação de K337P produziu 0,6 vezes os níveis de RebQ com o tipo selvagem. As mutações de H155L e L379V, cada uma produziu mais RebM para RebD, com o UGT76G1 do tipo selvagem produziu aproximadamente 4,58 RebM por RebD, e H155L e L379 produzindo aproximadamente 6,66 e 5,88 RebM por RebD, respectivamente. Através dos dados divulgados por este estudo, as enzimas UGT76G1 podem ser triadas para identificar a espécie tendo cinéticas melhoradas para RebD e RebM e que minimizam os produtos secundários, desse modo, aumentando o fluxo para os glicosídeos desejados de esteviol.

[0359]Tendo descrito a invenção em detalhe e como referência às formas de realização específicas desta, será evidente que as modificações e variações são possíveis sem divergir do escopo da invenção definido nas reivindicações anexas. Mais especificamente, embora alguns aspectos da presente invenção são identificados aqui como particularmente vantajosos, é considerado que a presente invenção não está necessariamente limitada a estes aspectos particulares da invenção. Referências: 1. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 52: 11, 988 - 998, DOI:10.1080/10408398.2010.519447. 2. J Nat Prod. 2013 Jun 28; 76(6): 1201 - 28. doi: 10.1021/np400203b. Epub em 28 de Maio de 2013. 3. Plant Physiology and Biochemistry 63 (2013) 245e253. 4. Praveen Guleria and Sudesh Kumar Yadav, 2013. Insights into Steviol Glycoside Biosynthesis Pathway Enzymes Through Structural Homology Modelling. American Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 3: 1 - 19. 5. The Plant Journal (2005) 41, 56 - 67 doi: 10.1111/j.1365 - 313X.2004.02275. 6. Madhav et al., “Functional and structural variation of uridine diphosphate glycosyltransferase (UGT) gene of Stevia rebaudianaeUGTSr involved in the synthesis of rebaudioside A” Plant Physiology and Biochemistry 63 (2013) 245e253. 7. Jewett MC, et al., Molecular Systems Biology, Vol. 4, artigo 220 (2008). 8. Masada S et al., FEBS Letters, Vol. 581, 2562 - 2566 (2007).

Claims (13)

1. Método para produção de Rebaudiosídeo M CARACTERIZADO pelo fato de que compreende bioconversão de células inteiras de esteviol sintético ou derivado de plantas e/ou glicosídeos de esteviol em uma cultura de células de uma célula hospedeira recombinante usando: (a) um primeiro polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2’ da 13-O- glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de es- teviol; em que o primeiro polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 16; e um segundo polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2’ da 13-O-gli- cose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de este- viol; em que o segundo polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15 ou 86, um polipeptídeo que tem uma substituição nos resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15, ou uma combinação dos mesmos; (b) um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do C3’ da 13-O-glicose, 19- O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2 ou tem pelo menos uma substituição de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 que é Q23G, Q23H, T55K, T55E, S56A, I26F, I26W, Y128S, Y128E, T146A, T146G, T146P, H155L, H155R, Q198R, S285R, S285T, S253W, S253G, L257P, L257W, L257T, L257G, L257A, L257R, L257E, S283N, T284R, T284G, S285G, K337E, K337P ou L379V da SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo capaz de glicosilação de esteviol ou do glicosídeo de es- teviol no seu grupo hidroxila C-13, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 26; ou (d) um polipeptídeo capaz de glicosilação de esteviol ou do glicosídeo de es- teviol no seu grupo carboxila C-19, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 19; em que pelo menos um dos polipeptídeos é um polipeptídeo recombinante expresso na célula hospedeira recombinante; em que a bioconversão compreende bioconversão enzimática ou bioconver- são de células inteiras; e produzindo Rebaudiosídeo M desse modo; em que o glicosídeo de esteviol compreende esteviol-13-O-glucosídeo, este- viol-19-O-glucosídeo, rubusosídeo, esteviosídeo, 1,2 biosídeo, Rebaudiosídeo A, Re- baudiosídeo B, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo E; e em que Rebaudiosídeo M é produzido a uma concentração de pelo menos 600 mg/L da cultura de células; e compreende ainda o isolamento do Rebaudiosídeo M produzido da cultura de células.

2. Método in vitro para produção de Rebaudiosídeo M, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionar: (a) um primeiro polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2’ da 13-O- glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de es- teviol; em que o primeiro polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 16; e um segundo polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2’ da 13-O-gli- cose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de este- viol; em que o segundo polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15 ou 86, um polipeptídeo que tem uma substituição nos resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15, ou uma combinação das mesmas; e um ou mais de: (b) um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do C3’ da 13-O-glicose, 19- O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2 ou tem pelo menos uma substituição de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 que é Q23G, Q23H, T55K, T55E, S56A, I26F, I26W, Y128S, Y128E, T146A, T146G, T146P, H155L, H155R, Q198R, S285R, S285T, S253W, S253G, L257P, L257W, L257T, L257G, L257A, L257R, L257E, S283N, T284R, T284G, S285G, K337E, K337P ou L379V da SEQ ID NO: 2; (c) um polipeptídeo capaz de glicosilação de esteviol ou do glicosídeo de es- teviol no seu grupo hidroxila C-13, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 26; ou (d) um polipeptídeo capaz de glicosilação de esteviol ou do glicosídeo de es- teviol no seu grupo carboxila C-19, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 19; e um precursor de esteviol sintético ou derivado de planta, um esteviol, um precursor de glicosídeo de esteviol e/ou um glicosídeo de esteviol para uma mistura de reação; em que pelo menos um dos polipeptídeos é um polipeptídeo recombinante; e produzindo o Rebaudiosídeo M desse modo; e em que Rebaudiosídeo M é produzido a uma concentração de pelo menos 600 mg/L da mistura de reação; e compreendendo ainda isolar o Rebaudiosídeo M produzido da mistura de reação.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira produz Rebaudiosídeo M ou Rebaudiosídeo M é produzido em um método in vitro a uma concentração de pelo menos 1000 mg/L da cultura de células.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira produz ainda Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo D é ainda produzido em um método in vitro a uma concentração de pelo menos 1000 mg/L da cultura de células.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de glicosídeo de esteviol produzida ainda compreende Re- baudiosídeo D que é produzido pela célula hospedeira ou em um método in vitro a uma concentração de pelo menos 600 mg/L da cultura de células ou da mistura de reação.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira compreende Rebaudiosídeo M e Rebaudiosídeo D que são produzidos pela célula hospedeira ou em um método in vitro a uma proporção de pelo menos 1:0,1 na cultura de células ou na mistura de reação.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira compreende Rebaudiosídeo D e Rebaudiosídeo M que são produzidos pela célula hospedeira ou em um método in vitro a uma proporção de pelo menos 1:0,1 na cultura de células ou na mistura de reação.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura de células compreende: (a) a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira; (b) glicose, uridina difosfato (UDP)-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N- acetil-glucosamina; e (c) nutrientes suplementares compreendendo metais traço, vitaminas, sais, base de nitrogênio de levedura (YNB) e/ou aminoácidos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a cultura de células compreende: (a) a composição de glicosídeo de esteviol produzida pela célula hospedeira, em que a composição de glicosídeo de esteviol compreende ainda Rebaudi- osídeo D que é produzido pela célula hospedeira; em que Rebaudiosídeo M e Rebaudiosídeo D que são produzidos pela célula hospedeira estão presentes em uma proporção entre 1:0,1 e 0,1:1 na cultura de células; (b) glicose, uridina difosfato (UDP)-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N- acetil-glucosamina; e (c) nutrientes suplementares compreendendo metais traço, vitaminas, sais, base de nitrogênio de levedura (YNB) e/ou aminoácidos.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda isolar o Rebaudiosídeo M da cultura de células ou da mistura de reação; em que a etapa de isolar compreende separar uma fase líquida da cultura de células ou da mistura de reação de uma fase sólida da cultura de células ou da mistura de reação para obter um sobrenadante compreendendo o Rebaudiosídeo M produzido, e: (a) colocar em contato o sobrenadante com uma ou mais resinas adsorventes para obter pelo menos uma porção do Rebaudiosídeo M produzido; ou (b) colocar em contato o sobrenadante com uma ou mais colunas de croma- tografia de troca iônica ou de fase reversa, a fim de obter pelo menos uma porção do Rebaudiosídeo M produzido; ou (c) cristalizar ou extrair o Rebaudiosídeo M produzido; isolando assim o Rebaudiosídeo M produzido.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda recuperar o composto Rebaudiosídeo M sozinho ou em combinação a partir da cultura de células ou da mistura de reação; em que o Rebaudiosídeo M recuperado ou uma composição compreendendo Rebaudiosídeo M é enriquecida para Rebaudiosídeo M em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol da planta Stevia e tem um nível reduzido de componentes derivados de plantas Stevia em relação a uma composição de glicosídeo de esteviol obtida a partir de um extrato de Stevia derivado de plantas.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira recombinante é uma célula de levedura ou uma célula de bactéria; em que a célula de bactéria compreende células Escherichia, células Lactobacillus, células Lactococcus, células Cornebacterium, células Acetobacter, células Acinetobacter ou células Pseudomonas; em que a célula de levedura é uma célula da espécie Saccharomyces cerevi- siae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Candida glabrata, Ashbya gos- sypii, Cyberlindnera jadinii, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polimor- pha, Candida boidinii, Arxula adeninivorans, Xanthophyllomyces dendrorhous ou Candida albicans; em que a célula de levedura é um Saccharomycete; ou em que a célula de levedura é uma célula da espécie Saccharomyces cerevi- siae.

13. Mistura reacional CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) uma composição de glicosídeo de esteviol produzida na mistura reacional, em que a composição de glicosídeo de esteviol compreende Rebaudiosídeo M que é produzido em uma concentração de pelo menos 600 mg/ml da mistura reaci- onal; (b) um primeiro polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2’ da 13-O- glicose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de esteviol; em que o primeiro polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 16; e um segundo polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,2 do C2’ da 13-O-gli- cose, 19-O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose de um glicosídeo de este- viol; em que o segundo polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15 ou 86, um polipeptídeo que tem uma substituição nos resíduos 211 e 286 da SEQ ID NO: 15, ou uma combinação dos mesmos; e um ou mais de: (c) um polipeptídeo capaz de glicosilação beta 1,3 do C3’ da 13-O-glicose, 19- O-glicose, ou ambas 13-O-glicose e 19-O-glicose do glicosídeo de esteviol, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2; (d) um polipeptídeo capaz de glicosilar esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo hidroxila C-13, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 26; (e) um polipeptídeo capaz de glicosilar esteviol ou o glicosídeo de esteviol no seu grupo carboxila em C-19, em que o dito polipeptídeo tem a sequência de amino- ácidos definida na SEQ ID NO: 19; (f) uridina difosfato (UDP)-glicose, UDP-ramnose, UDP-xilose e/ou N-acetil- glucosamina; (g) tampão de reação e/ou sais; e um precursor de esteviol sintético ou derivado de planta, um esteviol, um precursor de glicosídeo de esteviol e/ou um glicosídeo de esteviol.

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