CN1129953A - 糖组分的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种合成糖组分的方法。在这种方法中，受体部分在至少一种细胞表面结合糖基转移酶存在下与至少一种供体糖接触，该细胞表面结合糖基转移酶可特异地催化受体部分与供体糖的偶联。所用的受体部分是碳水化合物，蛋白质，糖蛋白，脂类，或糖脂。
Description
技术领域：
本发明涉及糖组分，如：寡糖、多糖、糖脂和糖蛋白的制备方法。
背景技术
“碳水化合物”一词包括通式为(CH2O)n的一大批化学物质，如单糖、二糖、寡糖和多糖。寡糖是由糖单位组成的链，即通常所知的糖类。这些糖单位可以任何顺序排列，二个糖单位之间大约有10种连接方式。因此，各种可能的寡糖立体异构体链的数目是庞大的。
在所有生物聚合物家族中，对寡糖和多糖研究得最不充分，这部分原因是由于对其常常复合糖链的测序与合成均十分困难。尽管合成寡核苷酸和多肽的技术已发展得很完善，但迄今仍没有一种通用的合成寡糖的技术。
理论上已形成了大量的合成碳水化合物的传统技术，但这些技术均存在需要选择性保护与去保护的困难，迄今只获得了非常有限的结果。寡糖的有机合成因许多糖苷键的不稳定性，实现区域选择性糖偶联的困难，以及通常合成产率低而进一步受阻。加之分离、纯化碳水化合物以及分析它们的结构等的困难，使寡糖的有机合成成为一个极为苛刻的化学领域。
对于碳水化合物以及包含碳水化合物片段的分子如糖脂和糖蛋白已进行了深入的研究。研究兴趣集中在这些组成成分主要是由于认识到蛋白质与碳水化合物互作是一系列生物识别过程，包括受精、分子标记、细胞间识别以及病毒、细菌、真菌的致病原因。目前普遍认识到糖蛋白和糖脂的寡糖部分介导细胞与细胞、细胞与配体、细胞与细胞外基质、及细胞与病原体之间的识别。
这些识别现象可能会受到寡糖的抑制，这些寡糖同参与细胞识别的糖蛋白或糖脂的活性部位具有相同的糖顺序和立体化学结构。它们可能与糖蛋白及糖脂竞争受体蛋白上的结合位点。例如，二糖半乳糖苷β1-4N-乙酰葡糖胺是糖蛋白的组成成分之一。这种糖蛋白与肝细胞的原生质体膜中的受体互作。由于寡糖和其它的糖组分同那些对细胞结合位点有潜在危害的组成成分竞争，所以它们在诊断医学、药理学以及治疗方面具有开辟新的领域的潜力。
如上所述，由于尚未找到合成寡糖的方法，在测试作为人类或动物疾病治疗剂的寡糖方面的努力一直相对较少。少数小片段寡糖类型可用有机化学方法委托合成，但这类化合物的成本极高。此外，寡糖的立体有择合成很困难，有些糖如唾液酸和岩藻糖等由于其化学键极为不稳定而尚未完成其加成。因此，需要改良的，普遍适用的寡糖合成方法以便生产大量的不同类型的具有治疗用途的寡糖。
对于某些应用场合，酶法已经作为众多传统技术中一种可供选择的方法用于有机合成。例如，酶在有机合成中作为催化剂，此处酶促合成反应在加快反应速度和立体选择性方面的作用已得到证实。另外，目前已获得了低成本生产一些酶和改变其特性的技术。
糖基转移酶以分步方式催化活化糖(供体NDP-糖)加到蛋白、糖蛋白、脂类、糖脂或延伸的寡糖的非还原性末端上的加成反应。氮连接的糖蛋白经由转移酶和脂连接的寡糖供体[Dol-PP-NAG2Glc3Man9]全体转移进而修饰核心来合成。在这种情况下，核心糖的属性同随后的连接部分稍有不同。碳水化合物合成中需要大量的糖基转移酶。每种供体NDP-糖残基需要一类截然不同的糖基转移酶，到目前为止所鉴定的每100种以上的糖基转移酶催化一个特定的糖苷键的形成。迄今，关于糖基转移酶特异性的细节尚不清楚，如还不知道大多数糖基转移酶识别碳水化合物的什么序列。
糖基转移酶在许多脊椎动物体液中以可溶性形式存在，但它们在细胞中通常以膜结合形式存在。迄今为止许多关于膜结合酶的研究认为其为内在蛋白；即，它们不能经声处理从膜中释放出来，而需要用去污剂溶解。1971年以前，由于在大鼠的肝脏中发现了糖基转移酶活性，所以一般认为它们位于细胞内高尔基体和内质网上。从那时起，人们认为表面糖基转移酶位于脊椎动物和无脊椎动物细胞的表面，还认识到这些表面转移酶在生理条件下保持催化活性。但细胞表面糖基转移酶的识别功能是细胞间识别。(Roth，Molecular Ap-proaches to Supracellular Phenomena，1990)。
表达细胞表面糖基转移酶活性的细胞已得到鉴定。Cerven曾报道，作为唾液酸转移酶活性源，进入瑞士小白鼠的完整艾氏腹水癌细胞的表面具有这种活性。Bernacki也曾测定了完整白血病L-1210细胞的内源唾液酸转移酶活性。关于细胞表面糖基转移酶活性的进展，详见Pierce等人的文章International Review of Cytology，65：1-44，1980)。
在其它情况下已经认识到有些糖基转移酶，特别是那些与膜结合者，需要有附加蛋白的存在才能表达转移酶活性(Kelleher，D.J.等人，细胞，69：55-65，1992)。
此外，已经建立了改变细胞表达的糖基转移酶的方法。Larson等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：8227-8231(1989))报道了一种分离克隆的cDNA序列的遗传方法，这种cDNA序列能决定细胞表面寡糖结构及其相关糖基转移酶的表达。从已知表达UDP-半乳糖：β-D-半乳糖苷-1，4-N-乙酰-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖转移酶的小鼠细胞系中分离mRNA生成cDNA文库，将后者转染到CDS-1细胞中。然后培养转染的细胞并测定其1-3半乳糖基转移酶活性。
Paulson等人(美国专利5,032,519)公开了一种生产分泌性糖基转移酶的方法。按照这一方法，真核细胞除表达内源高尔基体结合体形式的酶以外，还表达经遗传改变的可溶形式的糖基转移酶。但这一方法仅限于真核细胞系统。
Francisco等人在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：2713-2717(1992)著文中公开了β-内酰胺酶固着于大肠杆菌外表面的方法。产生一种由(i)外膜蛋白信号序列，(ii)外膜蛋白的跨膜区和(iii)完整成熟的β-内酰胺酶序列组成的三元融合体，由此得到活性表面结合的β-内酰胺酶分子。但Francisco的方法仅限于原核细胞系统，并且作者认识到只有当融合体的三个组成成分完整时才具有适宜的功能。这种细菌三元融合体由于细胞产生长融合蛋白的极其沉重负担而降低了细胞效率并减缓了细胞生长，因而不适于工业化生产。融合蛋白构建的生产是反方向生产的。
尽管在修饰结合与非结合糖基转移酶方面取得了一些进展，但如此修饰的微生物的应用一直是极为有限的。事实上，这些转化细胞仅用于糖基化蛋白的转基因生产，在此之前仅得到非糖基化蛋白。
由于细胞外糖基转移酶出现在细胞表面上，因此将这些糖基转移酶活性用于人工合成方法是可行的。
本发明的公开
如上所述，本发明的目的之一是提供一种新的利用细胞表面结合的糖基转移酶合成糖组分，包括寡糖的方法。
本发明的另一目的是提供一种适合于合成本发明所说的糖组分的生物反应器，该反应器包括至少一种细胞培养物(如果多于一种，则各自表达不同的糖基转移酶)和分离糖组分的装置。
本发明的第三个目的是提供一种适合于合成本发明所说的糖组分的生物反应器，该反应器包括至少一种细胞培养物，同结合的供体糖类一起表达糖基转移酶。
发明者现已发现本发明的上述目的及可从下文对本发明的描述中明显看出的其它目的均由糖基转移酶催化制备糖组分的方法得以实现，该方法是使预选的糖单位连续地结合到受体部分上，其中受体部分在至少一种细胞表面结合糖基转移酶存在的条件下同至少一种供体糖接触，细胞表面结合糖基转移酶可特异地催化受体部分与供体糖的偶联。受体部分是碳水化合物、糖蛋白或糖脂。当受体部分是蛋白质或脂时，最终产物是氧连接的糖蛋白或氧连接的糖脂。这一糖组分产物随后可被分离并被选择性地进一步纯化。
实施本发明的最佳方式
本文所用的“糖组分”一词包括任何其结构中含有糖单位的化学成份。糖、碳水化合物、糖类、单糖、寡糖、多糖、糖蛋白和糖脂均为糖组分的实例。上述成份的混合物及溶液亦均为糖组分。
按照本发明，可提供一个能同预选的糖单位共价结合的受体部分。典型的受体部分包括蛋白质，糖蛋白、脂类、糖脂及碳水化合物如单糖、二糖、寡糖和/或多糖。应该认识到优选的受体部分作为相关糖组分的结构成份存在。当蛋白质和脂类为受体时，将产生氧连接的糖蛋白或氧连接的糖脂。为了形成氮连接的糖蛋白，必须首先连接核心糖单位。例如在制备象N-乙酰神经氨酸α2-3半乳糖苷β1-4N-乙酰葡萄糖胺的糖组分时，受体部分是N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖苷β1-4N-乙酰葡萄糖胺。同样可以看到，受体部分被糖单位封端时，随后的糖单位一般共价结合于末端糖的非还原性末端上。
供体糖以核苷单磷酸或二磷酸糖的形式出现。在哺乳动物系统中，下述8种单糖以这种形式被活化，产生大多数寡糖的结构单元：UDP-Glc，UDP-GlcUA，UDP-GlcNAc，UDP-Gal，UDP-GalNAc，GDP-Man，GDP-Fuc和CMP-NeuAc。
以其最简单的形式，本发明的方法用于在至少一种细胞培养物存在的条件下使受体和至少一种供体糖连在一起。当使用一种以上的细胞培养物时，每种细胞培养物可优选带有不同的细胞表面结合糖基转移酶，后者能够催化受体和一种供体糖的偶联以及受体-供体糖复合体与第二种供体糖的偶联。可以使用单一的供体糖，此时三糖是受体与两个相同的供体糖单位结合的结果。可使细胞培养物生长并不断产生带有膜结合的糖基转移酶的细胞。在有受体和两种供体糖存在的情况下，可提供一种生产三糖的生物反应器。
根据本方法所使用的细胞是在细胞表面表达能催化受体与供体部分反应的相关糖基转移酶的细胞培养物。尽管细胞表面糖基转移酶天然存在，但用基因转染细胞以表达相关的糖基转移酶也是可能的。
转染细胞可用本领域的普通技术人员已知的方法获得。例如，为了获得转染细胞，将含有天然的或修饰的编码糖基转移酶催化和跨膜区的序列的DNA，包括cDNA转入自然条件下没有相关糖基转移酶表达的细胞中。那些已有相关糖基转移酶细胞表面表达的细胞也能用所需cDNA进行转染，从而获得表面具有更高特异性的转移酶活性的细胞。
在许多情况下已对编码糖基转移酶基因的DNA(包括cDNA)进行了分离与测序。已有关于牛酶和人类酶中的编码乳糖合成酶的基因的报道(Narimatsu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：4720-24(1986)；Shaper et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：1573-77(1986)和Appert et al，Biochem.Biophys.Res.Comm.，139：163-68(1986))。已报道的其它糖基转移酶基因是两种唾液酸转移酶(Weinstein et al，J.Biol.Chem.，262：17735-43(1987)；Wenet al.，J.Biol.Chem.，267：21011-19(1992))，大鼠肝脏葡糖醛酸基转移酶(Jackzon and Burcheli，Nuc.Acids Res.，14：779-95(1986)；Mackonzie，J.Biol.Chem.，261：14112-17(1986)，小鼠葡糖醛酸基转移酶(Kimura and Owens，Eur.J.Biochem.，168：515-21(1987))，人类葡糖醛酸基转移酶(Jackzon，Biochem.J.，242：581-88(1987))，人类N-乙酰氨基半乳糖醛酸转移酶(Nagataet al.，J.Biol.Chem.，267：12082-89(1992))，小鼠半乳糖基转移酶(Iarson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：8227-31(1989)，兔子N-乙酰氨基糖基转移酶I(Sarkar et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：234-38(1991))，大鼠N-乙酰氨基糖基转移酶III(Nishikawa et al.，J.Biol.Chem.，267：18199-204(1992))；一些人类岩藻糖基转移酶(Larsen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：6674-78(1990)：Kukowska-Latallo et al.，Genesand Development 4：1288-303(1990)；Weston et al.，J.Biol.Chem.，267：4152-60(1992))，人类N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(Berhuizen and Fukuda，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：9326-30(1992))和牛N-乙酰氨基糖基转移酶(Homa et al.，J.Biol.Chem.，268：12609-16(1993))。
对于那些不易得到其基因(DNA or cDNA)的糖基转移酶，如下方法可用于获得编码所需糖基转移酶的基因。通常，在按照本发明合成糖组分的过程中，预选的糖单位首先要在酶促条件下连接到初始受体部分，即蛋白质、糖蛋白、脂类、糖脂或碳水化合物起始物上。然后，预选的糖单位在酶促条件下连续不断地连接到所得产物上，由此形成糖组分。
连接每个预选糖单位时会得到中间产物。正如本发明者待审申请07/683,810中所详细描述的，合成起始物(即，蛋白质、糖蛋白、脂类、糖脂或碳水化合物)和合成中形成的每个中间产物。对于每个相应的合成步骤，可被有利地用于获得对催化在合成目的糖组分中连接下一个中间产物特异的糖基转移酶。
因此，任何给定步骤所需的糖基转移酶同中间产物(受体部分)分离且用于连接到受体部分，即构建目的碳水化合物分子所需的下一个糖单位上。这个过程可重复进行，随着每次分离使下一个糖单位连接到伸长的分子上所需的特定的糖基转移酶，直至得到目的碳水化合物分子为止。按照这种方式，可分离对特定的受体部分特异且能将预选糖单位转移到受体部分的糖基转移酶并且据此可得到用于给定的合成反应的所有酶。
另外，肽序列也能从糖基转移酶获得，这种糖基转移酶已用本领域普通技术人员已知的传统方法纯化。从肽序列获得的合成的简并寡核苷酸可用于筛选λ噬菌体，柯斯质粒或YAC库，从而分离各种糖基转移酶的cDNA或基因组克隆。使用上述合成的寡核苷酸探针，用聚合酶链式反应(PCR)方法同样可克隆糖基转移酶。最后，已成功地用于分离大量糖基转移酶的表达克隆(Larsen et al.，Pror.Natl Acad.Sci.U.S.A.，87：6674-78(1990)；Nagata et al.，J.Biol.Chem.，267：12082-89(1992))也可被用于获得编码其它糖基转移酶的cDNA。
每个对合成一个目的寡糖所必需的酶均能在受体部分同对受体部分特异的糖基转移酶有效结合的条件下，通过使受体部分与可能含有众多的糖基转移酶的混合物接触可以鉴定和获得合成目的寡糖所必需的每种必不可少的酶，包括所需的糖基转移酶。可能含有所需糖基转移酶的混合物可用下述方法鉴定。对于最普通的糖苷键，很多文献报道了糖基转移酶活性。象牛奶寡糖这样的化合物，或典型的(即，普通的)糖蛋白、糖脂的碳水化合物部分大多如此。对于描述不太充分的连接键，可以首先注意食料微生物上的组织和器官，其中可发现连接键。通常，如果该连接键是在某个特殊来源中发现的，则产生该连接键的酶也存在于该来源中。
如果一个连接键仅存在于某个糖结构上而不是存在于某一来源中，则可以使用目前最为敏感的筛选方法对可能包含这一糖结构的微生物进行测试(借助于相关结构的文献报道)。例如，如果目的化合物含有艾杜糖醛酸，N-乙酰氨基半乳糖或N-乙酰氨基葡糖，则可测试脊椎动物的结缔组织。如果目的化合物含有阿比可糖，则可以测试细菌和植物是否存在适当的糖基转移酶。
大量可按照本发明测试糖基转移酶的方法已经发表。以下可作例证。Furukawa等人(Biochem.J.，227：573-582(1985))描述了一种由本发明者发展的硼酸浸渍纸电泳方法和荧光测定方法。Roth等人(Exp′l Cell Research 143：217-225(1983)描述了硼酸测试葡糖醛酸基转移酶的应用，此前是用显色法测定的。Benau等人(J.Histochem.Cytochem.，38：(1)：23-20(1990)介绍了一种依赖由NADH还原重氮盐的组织化学测试法。
一个有关的糖基转移酶的来源一但被发现，需将该来源均质化。通过将受体部分作为亲和配体的亲和色谱，可将这种酶从均化物中纯化出来。也就是说，在能使糖基转移酶结合到受体部分上的条件下，使均化物通过一个其上已固定有受体部分的固体基质。
对受体结合酶的监测可如下进行。使细胞均化物通过固定的受体部分。例如，使细胞均化物通过一个有固定的受体部分的柱可使上述过程得以实现。此后，洗脱该柱并监测通过有固定受体柱的蛋白质的量。当检测不到蛋白质时，使一种盐水溶液或适宜糖供体洗脱物的溶液通过柱子洗脱这种酶。然后测定所得的洗脱物中是否存在糖基转移酶。可使用的检测方法如上所述，即Furukawa等人，Roth等人和Benau等人所述的方法。
如果没有发生酶与受体部分的结合(即洗脱物检测没有发现糖基转移酶存在)，那么可以得出结论，混合物中不含对特定受体特异的酶。其它混合物，如动物和/或植物细胞匀浆保持与受体部分接触，直至观察到酶结合。
当受体部分被酶结合后，将这部分分离出来。例如可以洗脱结合有糖基转移酶的固体支持基质。进而经一个洗脱步骤使糖基转移酶从固体支持基质上释放出来，并收集之。已知吸附的糖基转移酶可洗脱下来，例如使盐水溶液(如NaCl)通过固体支持基质。
在一个优选的实施方案中，受体与待选的酶再次接触，此时有供体部分存在，该供体部分包含欲转移至受体部分上所需的糖单位。如果这种接触导致糖单位转移到受体上，则该酶是可用于实施本发明的糖基转移酶。
应该认识到一旦糖基转移酶被识别并分离出来，可对其测序，用本领域技术人员熟知的技术获得和/或复制编码该酶的DNA序列。例如，可借助于包括分离为糖基转移酶编码的遗传物质和制备能扩增大量编码该糖基转移酶的DNA的不灭细胞系的技术，获得编码这个酶的DNA序列。使用DNA或RNA探针，最好是简并探针，测定糖基转移酶的氨基酸顺序(使用已知技术)，从而能分离得到编码这个酶的DNA序列。
按照本发明，编码糖基转移酶基因的DNA(包括cDNA)可使用下述已知技术以天然或人工形式引入真核或原核的宿主细胞内。
在原核细胞情况下，糖基转移酶的信号序列和跨膜序列被能实现融合蛋白在外膜上的定位的细菌信号序列取代。适宜的信号序列包括但并不仅限于大肠杆菌主要的脂蛋白Lpp和LamB。此外，om-pA，ompC，ompF或phoE形成的跨模区可以三元融合蛋白形式用于引导融合蛋白适当插入外膜。任何原核细胞，包括但不限于大肠杆菌，芽孢杆菌菌种和假单胞菌菌种等典型实例均可按照本发明使用。
在另一实施方案中，糖基转移酶的天然跨膜区被细菌外膜蛋白的跨膜区取代。在这一实施方案中，糖基转移酶信号序列和细菌跨膜区共同作用使糖基转移酶固着于细菌的细胞外膜上。任何外膜结合蛋白均适用于此。包括但不限于ompA、ompC和ompF、Lpp，及LamB，只要跨膜结构是已知的，即人们能确定其在线性序列中的位置，该蛋白质中存在细胞外环。糖基转移酶的催化部分应与细菌跨膜区中的细胞外环融合以便保证融合蛋白结合在外膜表面上而非细胞原生质或周质中的适当取向。关于融合蛋白插入这种环区而没有适当的跨膜折叠的描述以前曾报道过(Charbit et al.，J.Bacteriology.173：262-275(1991)；Francisco，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：2713-2717(1992))。
本发明也适用于能导致在已知的可培养的真核细胞中糖基转移酶的细胞表面表达的真核细胞，包括但并不限于酵母细胞、昆虫细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L细胞、小鼠A9细胞、幼仓鼠肾细胞、C127细胞、和PC8细胞。
Paulson等人(美国专利5,032,519，在此引用作为参考)描述了一种使糖基转移酶分泌可溶形式的酶的方法。本专利权人描述了导致以可溶形式分泌蛋白质的糖基转移酶疏水跨膜固着区域的去除。在本发明中糖基转移酶的天然跨膜区被修饰使重组蛋白能定位于细胞原生质膜的细胞外表面上。
在本发明优选的实施方案中，糖基转移酶跨膜区被质膜蛋白的跨膜区取代。任何固定的质膜蛋白的跨膜区均适于此目的。M6P/IGF-II受体，LDL受体或转铁蛋白受体的跨膜部分均为典型例子。进而，除了跨膜部分以外的短的细胞质肽将使在质膜上的固着得到改善。如果前述三种受体蛋白任一种的细胞质尾部的内在化信号经过位点特异性诱变而失活，则这种细胞质尾部就够了(Johozon eta1.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：10010-10014(1990)；Canfield et al.，J.Biol.Chem.，266：5682-5688(1991))。内在化信号的失活可以由修饰4个氨基酸的序列tyr-X-X-Y来达到，此处X是任何氨基酸，Y是亮氨酸，异亮氨酸或缬氨酸。内在化信号失活是由于酪氨酸变成丙氨酸和Y变成丙氨酸。
在另一优选的实施方案中，糖基转移酶的高尔基保留位点被位点特异性诱变所破坏。这种方法诱变少数使糖基转移酶集中到高尔基区的氨基酸。生成的糖基转移酶转运到质膜上，在此经由其修饰的跨膜序列得以固着。β-1，4-半乳糖基转移酶跨膜区的异亮氨酸残基取代天然氨基酸表明酶优先定域在质膜上而不是高尔基体上(Mazibay et al.，J.Biol.Chem.，268：9908-9916(1993))。尽管不希望受任何特定的理论束缚，但认为异亮氨酸残基的取代作用增加了跨膜序列的疏水性，从而导致酶优先定域在质膜上。
对于本领域的普通技术人员来说，任何将外源DNA序列导入宿主细胞的已知方法都可用于本发明。将外源DNA转运到细胞中的适宜载体包括但并不限于质粒载体、病毒载体和将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、半合成DNA和任何的其它外源遗传物质导入宿主细胞的任何其它的已知方法。
适宜的原核载体包括但不限于pBR322，pMB9、pUC、λ噬菌体、M13噬菌体和Blue script。
适宜的真核载体包括但不限于pMSG，pAV009/A+、PMT010/A+，pMAM neo-5，棒状病毒、pDSVE，YIP5，YRP17，YEP。
依所使用的宿主细胞的细胞类型应使用哪种载体或启动子系统对于本领域的普通技术人员来说是清楚的。
优选地，细胞培养物只表达所需的细胞表面的糖基转移酶。
通过与适当的受体和放射性标记的供体糖部分一起温育认为能表达所需的细胞表面糖基转移酶的细胞，可鉴定适宜的细胞。温育期结束后，从未消耗的放射性底物中分离糖基化产物。适宜的受体—供体缩合物的合成是细胞表面上所需糖基转移酶活性存在的证据。
以这种方式，可鉴定一个完整的细胞培养物库，在其细胞表面上表达特异的糖基转移酶。例如，可以鉴定和贮存在细胞表面上表达N-乙酰氨基糖基转移酶的细胞培养物。同样也可鉴定和贮存表达半乳糖基转移酶的细胞培养物。
一但鉴定出一个适宜的糖基转移酶库，就可以选择合成目的寡糖所需的特异性糖基转移酶。
例如：为了合成乳-N-新四糖，一种发现于人乳中的结构为β-D-Gal 1-4β-D-Glc NAc 1-3β-D-Gal 1-4 D-Glc的寡糖，必须有两个细胞培养物，其产生两种形成β-Gal 1-4 GlcNAC键和β-GlcNAc 1-3Gal键所需的糖基转移酶。在这两个细胞培养物及UPD-GlcNAc和UDP-Gal存在下，β-D-Gal 1-4 D-Glc(即乳糖)转变为乳-N-新四糖。
通过装配该细胞培养物，受体和供体糖源，有可能设计一个合成包含天然存在的糖苷键的任何寡糖组分的生物反应器。这个生物反应器酷似传统生物反应器的结果，其中培养细胞将产生所需的生物学产物，但在本方法中，目的产物可由人决定。依据制备目的寡糖所需的糖基转移酶的数量，生物反应器可包含任意数量不同的细胞培养物。特别是生物反应器可包含1、2、3或4个不同的细胞培养物，每个细胞培养物在细胞表面上表达不同的糖基转移酶。单独的细胞培养物将提供与单个细胞相同的功能，但由于可对细胞培养物和供体糖进行选择，可预先确定最终产物。
表达糖基转移酶活性的适宜细胞可以是转染的原核或真核细胞。优选的是使用表达所需糖基转移酶的转染的酵母细胞。
本发明也可按上述同样方法用表达不同糖基转移酶的多样性细胞来实施，即，使细胞表面糖基转移酶和结合的供体糖与适宜的受体接触以形成寡糖。
以这种方式，任何所需的寡糖均可简单地通过使表达所需细胞表面糖基转移酶的适宜细胞和必需的受体及供体糖连在一起而形成。因此，可以通过选择细胞培养物和供体糖单位生成一个“设计的”生物反应器。
在优选的实施方案中，包含表达给定的结合的糖核苷酸供体的细胞培养物的生物反应器，由于编码对糖供体的合成反应是必需的酶的cDNAs的转染，可以同另一个包含适宜细胞培养物的生物反应器互作，该细胞培养物具有对于结合的糖核苷酸适宜的糖基转移酶的表面表达。在培养基中包含适当的放射性标记的受体部分可以鉴定适宜的细胞。在温育期结束时，使糖基化产物与未消耗的放射性受体分离。形成放射标记产物表明表达结合的糖供体的细胞培养物和在其表面上表达糖基转移酶的培养细胞同时存在。也有可能是具有适宜糖基转移酶表面表达的细胞培养物和表达给定的结合的糖核苷酸供体的细胞培养物在一个单一生物反应器中互作。
在另一优选的实施方案中，同样的细胞培养物既有糖基转移酶的表面表达又表达结合的供体糖。通过温育认为能表达细胞表面糖基转移酶和结合部分的细胞鉴定适宜的细胞。在温育期结束时，使葡糖基化产物与未消耗的放射性受体分离。放射性受体反应表明在相同的细胞培养物中存在表面糖基转移酶和结合的供体糖。然后通过表征受体—供体糖组分鉴定糖基转移酶活性。
通过鉴定同时表达糖基转移酶和结合的供体糖的细胞培养物，包含这种细胞培养物的任何生物反应器的效率由于排除了单独提供供体糖的需要而大大提高。
按照本发明的生物反应器可以是任何常用的细胞培养反应器。适宜的反应器应设置有维持稳定的适宜温度的装置，提供必要的细胞营养素的装置和混合反应器内容物的装置。
按照本方法，可用标准技术连续或分批培养细胞。
可通过不断调整营养环境，以改良的批量法培养细胞(U.S.3，419，703)。
按照本发明可以制备出的糖组分在诊断、治疗和药理学应用方面具有广泛用途。一但所需的目的糖组分的糖序列由传统方法确定，便可进行反向合成分析以确定可行的糖组分的合成方案。这种合成方案很适宜鉴定获得糖组分所需的特定的供体部分、受体部分和糖基转移酶。
在如下叙述的典型实施方案中可见本发明的这些和其它特征，这些实施方案是用于说明本发明的，但本发明并不限于此。
实施例1
乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraoee)的合成
在包含适宜的反应培养基的细胞培养器中加入两个细胞培养物，两者分别表达不同的糖基转移酶。一个细胞培养物表达产生Gal1-4GlcNAc键所需的糖基转移酶。第二个细胞培养物提供形成Glc-NAc1-3Gal键所需的糖基转移酶。反应介质中含有水及供细胞培养物生长所需的适当营养素。在这个细胞培养器中还含有1当量的UDP-GlcNAc和1当量的UDP-Gal。然后将1摩尔当量的乳糖加入反应介质中。将反应器置于35℃，反应28小时。此后，细胞培养物通过过滤而分离，上清液经层析纯化，得到乳-N-新四糖。
显然，依据以上教导对本发明的多种改进和改变都是可能的。因此可以理解在本发明所附权利要求的范围内，本发明可以不同于此处具体描述的方法来实践。
Claims (59)
1.通过将预选的糖单位连续结合到受体部分上，在糖基转移酶催化条件下制备糖组分的方法，包括：
(i)在至少一种特异地催化受体部分与所说的供体糖偶联的细胞表面结合糖基转移酶存在条件下，使受体部分同至少一种供体糖接触，其中所说的受体部分是碳水化合物、蛋白质、糖蛋白、脂类或糖脂；
(ii)分离所述糖组分。
2.权利要求1的方法，其中使用至少两种不同的细胞表面结合糖基转移酶和两种供体糖。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞是原核生物。
4.权利要求3的方法，其中所说的受体部分是碳水化合物。
5.权利要求4的方法，其中所说的碳水化合物是单糖。
6.权利要求4的方法，其中所说的碳水化合物是二糖。
7.权利要求4的方法，其中所说的碳水化合物是寡糖。
8.权利要求4的方法，其中所说的碳水化合物是多糖。
9.权利要求3的方法，其中所说的受体部分是蛋白质。
10.权利要求3的方法，其中所说的受体部分是糖蛋白。
11.权利要求3的方法，其中所说的受体部位是脂类。
12.权利要求3的方法，其中所说的受体部分是糖脂。
13.权利要求1的方法，其中所说的细胞是真核生物。
14.权利要求13的方法，其中所说的受体部分是碳水化合物。
15.权利要求14的方法，其中所说的碳水化合物是单糖。
16.权利要求14的方法，其中所说的碳水化合物是二糖。
17.权利要求14的方法，其中所说的碳水化合物是寡糖。
18.权利要求14的方法，其中所说的碳水化合物是多糖。
19.权利要求13的方法，其中所说的受体部分是蛋白质。
20.权利要求13的方法，其中所说的受体部分是糖蛋白。
21.权利要求13的方法，其中所说的受体部分是脂类。
22.权利要求13的方法，其中所说的受体部分是糖脂。
23.权利要求1的方法，其中所说的细胞是一种表达β1-4糖基转移酶的转染细胞。
24.权利要求1的方法，其中所说的细胞一种表达β1-3糖基转移酶的转染细胞。
25.权利要求1的方法，其中所说的细胞是酵母细胞。
26.权利要求3的方法，其中所说的细胞被包含编码糖基转移酶的cDNA的DNA载体所转染。
27.权利要求26的方法，其中cDNA天然信号序列已被细菌信号序列所取代。
28.权利要求27的方法，其中所说的信号序列包含一个缺损的信号肽切割位点。
29.权利要求27的方法，其中所说的细菌信号序列是从包含OmpA，Lpp和LamB组中选择出的蛋白。
30.权利要求26的方法，其中所说的cDNA附加地包含一个编码疏水蛋白区域的DNA部分，其中所说的DNA片段被插入所说cDNA中的天然信号序列之后。
31.权利要求30的方法，其中所说的DNA或序列编码跨膜蛋白的疏水区域。
32.权利要求31的方法，其中所说的跨膜蛋白的疏水区域是从OmpA，Lpp和LamB组中选择出来的。
33.权利要求13的方法，其中所说的细胞被含有包括天然信号序列的DNA载体，和编码糖基转移酶的DNA区域的cDNA所转染其中编码疏水膜区域的DNA已被删除。
34.权利要求33的方法，其中所说的信号序列包含缺损的信号肽切割位点。
35.权利要求33的方法，其中所说的cDNA进而包括编码一段跨膜蛋白的DNA片段。
36.权利要求35的方法，其中所说的DNA片段编码从包含OmpA，Lpp和LamB的组中选择出来的跨膜蛋白。
37.权利要求1的方法，其中糖基转移酶羧基末端是结合到细胞表面上的C末端。
40.适合于通过将预选的糖单位连续结合到受体部分上，由糖基转移酶催化制备糖组分的生物反应器，包括：
一个包括至少一种表达细胞表面膜结合糖基转移酶的细胞培养物和一个对所说的膜结合糖基转移酶特异的供体糖部分源的反应装置，和分离所说的糖组分的装置。
41.适宜通过将预选的糖单位连续结合到受体部分上，由糖基转移酶催化制备糖组分的生物反应器，包括：
一个包括至少两种细胞培养物，每种表达不同的细胞表面膜结合的糖基转移酶和结合的供体糖的反应装置，和分离所说的糖组分的装置。
42.权利要求40的生物反应器，其中所说的细胞培养物是转染的细胞，经转染可表达糖基转移酶。
43.权利要求40的生物反应器，其中所说的细胞培养物之一是表达β1-4糖基转移酶的转染细胞的培养物。
44.权利要求40的生物反应器，其中所说的细胞培养物之一是表达β1-3糖基转移酶的转染细胞的培养物。
45.权利要求40的生物反应器，其中所说的细胞是酵母细胞。
46.权利要求40的生物反应器，其中所说的细胞是原核细胞。
47.权利要求46的生物反应器，其中所说的细胞被包含编码糖基转移酶的cDNA的DNA载体转染。
48.权利要求46的生物反应器，其中所说的cDNA的天然信号序列被细菌信号序列取代。
49.权利要求40的生物反应器，其中所说的信号序列包括缺损的信号肽切割位点。
50.权利要求48的生物反应器，其中所说的细菌信号序列是从包含OmpA，Lpp和LamB组中选择出的蛋白。
51.权利要求46的生物反应器，其中所说的cDNA附加地包括编码疏水蛋白区的DNA片段，其中所说的DNA片段被插入到所说cDNA的天然信号序列后面。
52.权利要求51的生物反应器，其中所说的DNA或序列编码跨膜蛋白的疏水区域。
53.权利要求51的生物反应器，其中所说的跨膜蛋白的疏水区是从包含OmpA，Lpp和LamB组中选择出来的。
54.权利要求40的生物反应器，其中所说的细胞是真核细胞。
55.权利要求54的生物反应器，其中所说的细胞被含有包括天然信号序列的DNA载体，和编码糖基转移酶的DNA区域的cDNA所转染，其中编码疏水膜区的DNA已被删除。
56.权利要求55的生物反应器，其中所说的信号序列包含一个缺损的信号肽切割位点。
57.权利要求55的生物反应器，其中所说的cDNA进而包含编码跨膜蛋白的DNA片段。
58.权利要求57的生物反应器，其中所说的编码跨膜蛋白的DNA片段是从OmpA，Lpp和LamB组中选择出来的。
59.权利要求40的生物反应器，其中糖基转移酶的羧基末端是结合到所述细胞表面上的C末端。
60.权利要求49的生物反应器，其中所说的信号肽切割位点已被编码所述信号序列的DNA的位点特异性突变所破坏。
61.权利要求56的生物反应器，其中所说的糖基转移酶的羧基末端是同所说细胞表面结合的C末端。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9137293A | 1993-07-15 | 1993-07-15 | |
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