CN104845990A

CN104845990A - 拟南芥糖基转移酶基因ugt73c7在提高植物抗病性中的应用

Info

Publication number: CN104845990A
Application number: CN201510319793.8A
Authority: CN
Inventors: 侯丙凯; 王勇; 李燕洁
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-08-19

Abstract

本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7在提高植物抗病性中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT73C7的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其是通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆的。本发明利用基因UGT73C7构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的抗病性得到显著提高，预示本发明实施后将会创造新型抗病植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

Description

拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7在提高植物抗病性中的应用

技术领域

本发明涉及一个糖基转移酶基因的应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7在提高植物抗病性中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

自然界中的致病菌(活体型菌、半活体型菌、死体型菌)无处不在，它们通过各自不同的途径(如通过表皮细胞的气孔、水孔或受伤的部位)进入植物体内，寄宿在植物体内的不同部位(细胞间或穿过细胞质膜进入细胞内)(Jones at el.,2006)。寄宿在植物体内的植物病原菌大量增殖，引起植物严重的病害。

在农业上，植物病害一直是生产中难以防治的，据联合国粮农组织(FAO)估计，全世界粮食生产每年因病害的发生而导致的损失占总损失的10％，严重时，甚至导致绝收。瓜果蔬菜也常常遭受病原菌的危害，例如甘蓝枯萎病，甘蓝枯萎病最早发现于美国(Smith，1899)，它是由尖孢镰刀菌粘团专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Conglutinans，FOC699)引起的土传病害，近年来，在我国北方甘蓝产区出现了由尖孢镰刀菌引起的枯萎病，导致部分地区甘蓝严重减产。甘蓝枯萎病是一种典型的土传病害，难以通过药剂等措施来防治，其发病区域呈逐年扩大的趋势(李明远等，2003)。再例如白菜病毒病、霜霉病和软腐病在我国白菜种植过程中经常发生，一般导致白菜品质下降、产量降低甚至绝收，而这些病害用传统的方法不易防治，并且会引起农药残留，影响蔬菜品质。利用基因工程技术，获得具有植物病原菌抗性的白菜、甘蓝等十字花科蔬菜可以有效缓解作物的病害。

糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，拟南芥糖基转移酶家族1中共有119个可能的糖基转移酶。虽然这些糖基转移酶基因的序列已公开于核酸序列数据库中，但是这些糖基转移酶基因的特殊功能还远远没有被揭示，如拟南芥糖基转移酶家族1中的UGT73C7基因能够增强转基因植物抗病性的功能和应用目前未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7在提高植物抗病性中的应用。

本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7在提高植物抗病性中的应用。

其中：所述糖基转移酶基因UGT73C7的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述抗病是指对病原菌PstDC3000或FOC699的抗性。所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、油菜、白菜、甘蓝或芥菜。

本发明利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆糖基转移酶基因UGT73C7，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的抗病性(如对病原菌PstDC3000或FOC699的抗性)得到显著提高(见图1、图2、图3、图4和图5)。

本发明实施后可能带来的有益效果

实验证实，应用本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7进行植物转基因操作，可以显著提高转基因植物的抗病性。预示本发明实施后将会创造新型抗病植物，可用于后续的作物品种改良，植物新品种开发生产，对我国农业生产具有重大意义。

附图说明

图1. UGT73C7转基因植物成苗期对病原菌PstDC3000的抗性明显增强(证据之一)。

其中WT为拟南芥对照植物，UGT73C7OE-1和UGT73C7OE-2为UGT73C7两个转基因过表达株系。A为PstDC3000侵染三天后，整株植物图片；B为PstDC3000侵染后，莲座叶图片。成苗接种病原菌三天后，野生型叶片坏死斑明显大于UGT73C7过表达体。

图2. UGT73C7转基因植物幼苗期对病原菌PstDC3000的抗性明显增强(证据之二)。

其中WT为拟南芥对照植物，UGT73C7OE-1和UGT73C7OE-2为UGT73C7两个转基因过表达株系。UGT73C7过表达体幼苗中PstDC3000的增长量明显少于野生型。

图3. UGT73C7转基因植物对病原菌FOC699的抗性明显增强(证据之三)。

其中WT为拟南芥对照植物，UGT73C7OE-1和UGT73C7OE-2为UGT73C7两个转基因过表达株系。A为植株在浸染FOC69912h、24h后下胚轴荧光强度；B为浸染FOC69912h后，利用RealtimePCR统计的各株系中FOC699的生物量结果。UGT73C7过表达体中FOC699的增长量明显少于野生型。

图4. UGT73C7转基因过表达体中免疫相关基因的表达分析(证据之四)。

其中WT为拟南芥对照植物，UGT73C7OE-1和UGT73C7OE-2为UGT73C7两个转基因过表达株系。A为两个抗病基因(SNC1、RPP4)的表达量验证结果；B为两个参与植物免疫的病程相关蛋白基因(PR1)和(PR2)的表达量检测；C为抗病信号通路上的两个基因PAD4和EDS1以及水杨酸运输相关蛋白基因(EDS5)的表达量检测。其中WT为拟南芥对照植物，UGT73C7OE-1和UGT73C7OE-2为UGT73C7两个转基因过表达株系。UGT73C7过表达体中免疫相关基因的表达相对野生型明显上调。

图5. UGT73C7转基因过表达体中水杨酸(SA)的含量明显增加(证据之五)。

其中WT为拟南芥对照植物，UGT73C7OE-1和UGT73C7OE-2为UGT73C7两个转基因过表达株系。A为总SA含量检测的高效液相色谱图；B为植物体内自由态SA的累积量；C为植物体内总SA的累积量。UGT73C7过表达体中SA的累积量明显高于野生型,说明抗病增强。

具体实施方式

实施例1 克隆拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7

1.拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7的克隆

通过公开网站http://www.cazy.org获得UGT73C7基因的cDNA序列。根据cDNA序列设计引物，正向引物为73C7-F:5’-GGATCCCTTCTACAATGTGTTCTCATGATCC-3’，反向引物为73C7-R:5’-GAGCTCGTTTTTCTCTGGTGCCAAATACC-3’。利用TRIzol试剂盒提取拟南芥RNA，RT-PCR方法扩增UGT73C7基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过BamHI和Sac Ⅰ酶切，之后连入相应酶切的pBluescript II SK(+)载体中，构建成测序中间载体，称为pK73C7。然后对载体进行目标基因的PCR扩增和BamHI和Sac Ⅰ酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆基因序列的正确性。

2.拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7的序列信息与特性分析

UGT73C7基因的编码区cDNA为1473bp，编码490个氨基酸的54.5kDa蛋白，C端具有44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。

实施例2 拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7的转基因应用

1.含有UGT73C7编码区cDNA表达载体的构建

pK73C7中间测序载体经过BamHI和SacⅠ双酶切后，获得带有酶切粘性末端的全长cDNA序列。将此基因片段与用相应酶酶切后的pBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为pBI73C7。

2.农杆菌介导植物转化

农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGT73C7植物表达载体(pBI73C7)转入农杆菌，然后进行PCR验证和酶切验证。利用浸花法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集T1代种子并在筛选培养基(MS培养基附加30mg/L卡那霉素)上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉素筛选，挑选出绿苗：白苗为3：1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子(T3代)。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合转基因株系。

3.转基因植株分子鉴定

对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。UGT73C7在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。利用两个UGT73C7表达量高的株系，即UGT73C7OE-1和UGT73C7OE-2，来进行后续的工作。

4. UGT73C7基因的抗病性功能验证

(1)UGT73C7转基因植物抗病性增强的证据之一。

UGT73C7转基因过表达体成苗期对病原菌PstDC3000的抗性实验。

将受试植物在培养皿中培养到第4周，在超净工作台中，用无菌棉棒在植物叶表面均匀涂抹浓度为1×10⁷个/ml病原菌PstDC3000，三天后观察植株叶片变化。发现野生型的拟南芥叶片出现较大的坏死斑点，而UGT73C7OE转基因叶片未出现或出现很小的坏死斑点(图1)，说明UGT73C7OE转基因植株成苗对植物病原菌PstDC3000的抗性明显增强。

(2)UGT73C7转基因植物抗病性增强的证据之二。

UGT73C7转基因过表达体幼苗对病原菌PstDC3000的抗性检测实验。

在22℃条件下，将受试植物培养到2周，分别取WT，UGT73C7OE-1，UGT73C7OE-2幼苗浸没到浓度为1×10⁷个/ml PstDC3000中1h，浸没1h后取出。取出的材料分为两部分，一部分用于统计菌体的初始数量，即每个株系分别取三棵幼苗立刻放入离心管中，称量每个离心管中三棵幼苗的重量，充分研磨，稀释到一定倍数，涂布到含有利福平和卡那霉素的KB固体培养基上，每组3个平行，培养3d后，统计每个平板上菌落数量，然后统计出的菌落数目除以对应幼苗的重量，为每毫克幼苗中初始病原菌数。另一部分放置在垫有湿滤纸的培养皿中培养，三天后利用上述同样的方法统计每毫克幼苗中最终病原菌菌落数。分别用最终病原菌菌落数的Log值减去初始病原菌菌落数的Log值，得到的数值即为植物病原菌的增长量。如图2中所示，UGT73C7OE转基因植株中病原菌数量的增长明显变慢,说明UGT73C7OE转基因植株获得了对病原菌PstDC3000的明显抗性。

KB培养基：

培养基高压灭菌。

(3)UGT73C7转基因植物抗病性增强的证据之三。

UGT73C7转基因植物对病原菌FOC699的抗性明显增强。

在22℃条件下，将受试植物培养到7d的幼苗，分别浸没到浓度为1×10⁶个/ml FOC699(GFP)病原菌中，1h后取出。放置在垫有湿滤纸的培养皿中培养，分别在12h、24h取材，在荧光显微镜下观察各个植株下胚轴的荧光强度。由于拟南芥不具有GFP基因，不能表达GFP蛋白，而FOC699(GFP)的菌体中含有GFP基因，可以表达GFP蛋白，这样通过观察植物体内的荧光强度，就可以说明植物体内FOC699的菌体数量。图3-A中亮度高的代表荧光强度强，荧光检测结果说明，UGT73C7OE转基因植株下胚轴中荧光强度明显减弱，说明UGT73C7OE植株中FOC699菌体数量明显少于野生型(图3-A)。另外，利用Real-time PCR技术分析各个株系中GFP基因的含量，也可以反映植株中FOC699菌的数量多少。实际检测结果显示，12h时取材时UGT73C7OE植株中GFP基因的数量明显少于野生型(图3-B)。以上两种检测方法均说明UGT73C7OE转基因植物对病原菌FOC699的抗性明显增强。

(4)UGT73C7转基因植物抗病性增强的证据之四。

UGT73C7转基因过表达体中免疫相关基因的表达分析。

在22℃条件下，将受试植物培养到4周，提取RNA，反转录为cDNA后，利用Real-timePCR分析植物抗病相关的SNC1、RPP4、EDS1、EDS5、PAD4、PR1、PR2基因的表达量。发现这些基因在UGT73C7OE中均具有显著的上调，其中PR1、PR2的表达上调了几百倍至上千倍(图4)。说明UGT73C7可以组成型的激活植物的抗病相关基因的表达，使植物获得抗病性，从而增强植物对病原菌的抵抗能力。

(5)UGT73C7转基因植物抗病性增强的证据之五。

UGT73C7转基因过表达体中水杨酸(SA)的含量明显增加。

在22℃条件下，将受试植物培养到4周，根据Christiane Nawrath and Jean-Pierre Métraux(1999)报道的方法提取植物中积累的游离态SA及总SA。利用高效液相色谱(HPLC)技术分析测定提取物中的SA含量。结果发现无论游离态的SA还是总SA的含量在转基因植物中均有明显提高(图5)。根据已有的报道，SA在激活植物抗病中具有极其重要的作用。UGT73C7转基因可以组成型的激活植物产生SA，从而可以增强植物对病原菌的抵抗能力。

Claims

1.拟南芥糖基转移酶基因UGT73C7在提高植物抗病性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖基转移酶基因UGT73C7的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述抗病是指对病原菌PstDC3000或FOC699的抗性。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是拟南芥、油菜、白菜、甘蓝或芥菜。