CN104928304A

CN104928304A - 拟南芥糖基转移酶基因ugt76e11在提高植物耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN104928304A
Application number: CN201510376825.8A
Authority: CN
Inventors: 侯丙凯; 李琴; 李燕洁
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11在提高植物耐盐性中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT76E11的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其是通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆获得。本发明利用基因UGT76E11构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐盐性得到明显提高，预示本发明实施后将会创造新型耐盐植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

Description

拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11在提高植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及一种糖基转移酶基因的应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11在提高植物耐盐性中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

盐胁迫是影响植物生长和粮食产量的最主要的环境因素之一，也是植物需要适应的逆境之一。一般情况下，土壤中含盐量超过0.2％时，就能引发盐胁迫。据不完全统计，全世界有800多万平方公里的土地受到不同程度盐渍化的影响，约占世界陆地面积的6％，并且这一数字正在逐步扩大(Munns and Tester,2008)，而我国也有许多盐渍化土地，全国约有1亿亩的盐碱耕地和3亿亩左右的盐碱荒地，严重制约着农作物产量的提高。因此，开发利用盐碱地，提高盐渍化土地上的作物产量，对我国的农业发展有着极其重要的现实意义。基因工程技术的应用可以获得具有耐盐性的农作物，有望缓解土壤的盐渍化对农作物产量的影响。

糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，拟南芥糖基转移酶家族1中共有119个可能的糖基转移酶。虽然这些糖基转移酶基因的序列已公开于核酸序列数据库中，但是这些糖基转移酶基因的特殊功能还远远没有被揭示，如拟南芥糖基转移酶家族1中的UGT76E11基因能够增强转基因植物耐盐性的功能和应用目前未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11在提高植物耐盐性中的应用。

本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11在提高植物耐旱性中的应用。

其中：所述糖基转移酶基因UGT76E11的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、白菜、油菜、甘蓝或芥菜。

本发明利用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆糖基转移酶基因UGT76E11，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐盐性得到显著提高(见图1、图2、图3、图4)，证明拟南芥糖基转移酶家族1中的UGT76E11基因能够具有增强转基因植物耐盐性的功能。

本发明实施后可能带来的有益效果：

实验证实，应用本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11进行植物转基因操作，可以显著提高转基因植物的耐盐性(见附图1、附图2、附图3和附图4)。预示本发明实施后将会创造新型耐盐植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

附图说明

图1.种子在含盐培养基上的萌发实验统计结果。

图中WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个转基因过表达株系。MS(-)表示不含盐的培养基，125mM NaCl表示含有125mM NaCl的MS培养基，其余类推。统计结果显示两个过表达株系在含盐的培养基上，萌发率明显高于野生型对照。这说明UGT76E11基因过表达之后明显增强了植株萌发期的耐盐性。

图2.在含盐培养基上根的生长实验结果统计。

图中WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个转基因过表达株系。MS(-)表示不含盐的培养基，100mM NaCl表示含有100mM NaCl的MS培养基，其余类推。实验结果显示在含盐培养基上，两个过表达株系的根长明显高于野生型。因为在株系OE-87中UGT76E11的表达水平高于OE-69，株系OE-87表现出更强的根系生长。这说明UGT76E11基因过表达之后能够增强植株的抗盐性。

图3.伊文思蓝(Evans Blue)染色实验结果统计。

图中WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个转基因过表达株系。“Control”表示未经过盐水胁迫的叶片染色，“100mM NaCl”表示经过100mM NaCl胁迫处理的叶片进行染色，其余类推。实验结果发现在盐胁迫处理以后，两个过表达株系的染色比野生型对照浅很多，说明过表达株系经过盐处理之后细胞死亡比野生型对照少。证明UGT76E11基因可用于增强植物耐盐性。

图4.植物苗期浇盐水实验。

图中WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个过表达株系。浇盐水之前转基因株系与对照生长状态一致，浇盐水之后发现野生型对照几乎全部死亡(叶片变白)，而两个过表达株系只有少量叶片出现死亡，这说明UGT76E11基因过表达之后明显增强了植株的耐盐性。

具体实施方式

实施例1 克隆拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11

1.拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11的克隆

通过公开网站http://www.cazy.org获得UGT76E11基因的cDNA序列。根据cDNA序列设计引物，正向引物为76E11-F:5’-GGATCCATGGAGGAAAAGCCGGCGGG-3’，反向引物为76E11-R:5’-GTCGACTCATAGAGTCCTCATGTAGTGTACAAACTC-3’。利用TRIzol试剂盒提取拟南芥RNA，RT-PCR方法扩增UGT76E11基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过BamHI和SalⅠ酶切，之后连入相应酶切的pBluescript II SK(+)载体中，构建成测序中间载体，称为pK76E11，然后用载体进行基因全长PCR扩增和BamHI和SalⅠ酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。

2.拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11的序列信息与特性分析

UGT76E11基因的编码区cDNA为1356bp，编码451个氨基酸的57.6kDa蛋白，C端具有44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。

3.拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11受逆境胁迫诱导表达

将两周大小的野生型拟南芥(Col-0)小苗用200mM NaCl(盐胁迫)、300mM甘露醇(渗透胁迫)分别处理3h、6h、12h、24h，以蒸馏水处理为对照。然后提取处理过的样本RNA进行RT-PCR分析。结果发现UGT76E11基因的表达受盐胁迫和渗透胁迫的诱导。其中盐胁迫处理3h后UGT76E11表达水平上调最明显，达到了对照的8倍左右。盐胁迫处理6h、12h，表达水平上调5～6倍。

实验结果说明UGT76E11基因在植物应对盐胁迫时可能发挥重要作用。

实施例2 拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11的耐盐性应用

1.含有UGT76E11编码区cDNA表达载体的构建

pK76E11中间测序载体经过BamHI和SalⅠ双酶切后，获得带有酶切粘性末端的全长cDNA序列。将此基因片段与用相应酶酶切后的pBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为pBI76E11。

2.农杆菌介导植物转化

农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGT76E11植物表达载体(pBI76E11)转入农杆菌，然后进行PCR验证和酶切验证。利用浸花法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集T1代种子并在筛选培养基(MS培养基附加30mg/L卡那霉素)上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉素筛选，挑选出绿苗：白苗为3：1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子(T3代)。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合转基因株系。

3.转基因植株分子鉴定

对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。UGT76E11在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。利用两个UGT76E11表达量高的株系，即OE-69、OE-87，来进行后续的工作。其中OE-87株系的表达量高于OE-69。

4.UGT76E11基因的耐盐性功能验证

(1)种子在含盐培养基上的萌发实验。WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个转基因过表达株系。MS(-)表示不含盐的培养基，125mM NaCl表示含有125mM NaCl的MS培养基，其余类推。将拟南芥对照植物和过表达株系的种子点在含0Mm NaCl、125mM NaCl和175mM NaCl的MS培养基上，连续7天统计萌发率。统计结果显示两个过表达株系在含盐的培养基上，萌发率明显高于野生型对照。这说明UGT76E11基因过表达之后明显增强了植株萌发期的耐盐性(见图1)。

(2)在含盐培养基上根的生长实验。WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个转基因过表达株系。MS(-)表示不含盐的培养基，100mM NaCl表示含有100mM NaCl的MS培养基，其余类推。将拟南芥对照植物和过表达株系在MS(-)培养基上垂直培养3天，然后转移到含不同浓度NaCl的MS培养基上。10天之后统计植株的根长。实验结果显示在含盐培养基上，两个过表达株系的根长明显高于野生型。因为在株系OE-87中UGT76E11的表达水平高于OE-69，株系OE-87表现出更强的根系生长。这说明UGT76E11基因过表达之后能够增强植株的抗盐性(见图2)。

(3)伊文思蓝(Evans Blue)染色实验。伊文思蓝是一种常用的偶氮染料制剂，在染色时因为有活性的细胞具有外排功能而无法被伊文思蓝染色，而死细胞可以吸收染色而成蓝色，因此通过染色可以区分死细胞与活细胞。WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个转基因过表达株系。“Control”表示未经过盐水胁迫的叶片染色，“100mMNaCl”表示经过100mM NaCl胁迫处理的叶片进行染色，其余类推。将正常生长四周的拟南芥对照植物和过表达株系分别浇含有100mM NaCL、200mM NaCL和300mM NaCL的盐水，以不浇盐水的植物作为对照。处理12小时之后剪取大小相近的叶片，进行Evans Blue染色。实验结果发现在盐胁迫处理以后，两个过表达株系的染色比野生型对照浅很多，说明过表达株系经过盐处理之后细胞死亡比野生型对照少。证明UGT76E11基因可用于增强植物耐盐性(见图3)。

(4)植物苗期浇盐水实验。WT为拟南芥对照植物，OE-69和OE-87为UGT76E11的两个过表达株系。实验材料是正常生长2周的拟南芥对照植物和两个过表达株系。选取生长状态一致的植株，先浇一次150mM NaCl的盐水,一周之后再浇一次200mM NaCl的盐水,之后再浇250mM NaCl的盐水两周，每周一次。浇盐水之前转基因株系与对照生长状态一致，浇盐水之后发现野生型对照几乎全部死亡(叶片变白)，而两个过表达株系只有少量叶片出现死亡，这说明UGT76E11基因过表达之后明显增强了植株的耐盐性(见图4)。

Claims

1.拟南芥糖基转移酶基因UGT76E11在提高植物耐盐性中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖基转移酶基因UGT76E11的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是拟南芥、油菜、白菜、甘蓝或芥菜。