JP2016506743A - 組み換え宿主におけるステビオールグリコシドの効率的生産 - Google Patents

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Abstract

組み換え微生物が開示され、それらはステビオールグリコシドを生産し、且つ１つまたは２つ以上の内在性の輸送体もしくは転写因子遺伝子の改変された発現を有するか、または、１つまたは２つ以上の異種輸送体を過剰発現して、目的のステビオールグリコシドの増大した排出をもたらす。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１３年２月１１日出願の米国仮出願第61/763,290号および２０１３年２月１１日出願の米国仮出願第61/763,308号の利益を主張する。それらの各開示は参照によって組み込まれる。
技術分野
本開示はステビオールグリコシドの組み換え生産とその単離方法とに関する。特に、本開示は、組み換え微生物などの組み換え宿主によるステビオールグリコシド（レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウジオシドＢ（ＲｅｂＢ）、レバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）、レバウジオシドＥ（ＲｅｂＥ）およびレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）など）の生産に関する。本開示は、かかるステビオールグリコシドの生産、排出または両方を増大させるための組み換え宿主の輸送系の改変にも関する。
背景
甘味料は、食品、飲料または製菓産業によって最も一般的に用いられる成分として周知である。甘味料は生産中の最終的な食品中に組み込まれ得、または、適当に希釈されて卓上甘味料もしくはパン焼きの砂糖の家庭代用品として単独使用向けであり得る。甘味料は、天然甘味料（ショ糖、高果糖コーンシロップ、糖蜜、メープルシロップおよび蜂蜜など）および人工甘味料（アスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースなど）を含む。ステビア抽出物は天然甘味料であり、多年生低木のStevia rebaudianaから単離および抽出され得る。ステビアは、一般に、南アメリカおよびアジアで、ステビア抽出物の商業生産用に栽培されている。ステビア抽出物は様々な程度に精製され、食品の強力な甘味料として、さらにブレンドまたは単独で卓上用甘味料として商業利用されている。
ステビア草の抽出物はレバウジオシドおよび他のステビオールグリコシドを含有しており、それらが甘味に寄与している。ただし、各グリコシドの量は多くの場合、生産バッチ間において異なる。通常は、ステビオシドおよびレバウジオシドＡが、商業生産されるステビア抽出物中の主な化合物である。ステビオシドはレバウジオシドＡよりも苦くて且つ甘くない味を有すると報告されている。ステビア抽出物の組成は、この植物が栽培される土壌および気候に応じてロット毎に異なり得る。仕入れた植物、気候条件および抽出プロセスに応じて、市販調製物中のレバウジオシドＡの量は、全ステビオールグリコシド含量の２０から９７％までばらつくと報告されている。他のステビオールグリコシドはステビア抽出物中に様々な量で存在する。例えば、レバウジオシドＢは通常１〜２％未満で存在しているが、レバウジオシドＣは７〜１５％もの高いレベルで存在し得る。レバウジオシドＤは通常２％以下のレベルで存在し、レバウジオシドＭは通常微量レベル（＜０．１％）で存在し、レバウジオシドＦは通常全ステビオールグリコシドの３．５％以下で組成物中に存在する。これらの少量ステビオールグリコシドの量はステビア抽出物の味質に影響し得る。
ステビア抽出物中に見出される化合物のいくつかの化学構造が図１に示されており、それらはジテルペンのステビオールおよび種々のステビオールグリコシドを含む。CAS番号は下の表１に示されている。Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA, prepared by Harriet Wallin, Food Agric. Org. (2007) も参照。
概要
本出願は、ステビオールグリコシドの排出に関わる組み換え宿主の輸送系の改変によって、ステビオールグリコシド組成物を効率的に生産するために用いられ得る材料および方法を記載する。いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え宿主は、少なくとも１つのステビオールグリコシドを生産し、抗生物質を能動的に排出する輸送体などの異種輸送体を発現できる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え宿主は少なくとも１つのステビオールグリコシドを生産し、内在性の輸送体遺伝子の発現が宿主内において改変されており、および／または、転写因子遺伝子の発現が改変されており、転写因子は少なくとも１つの内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する。抗生物質を能動的に分泌する内在性の輸送体の発現を改変することは、特に有用である。いくつかの態様において、内在性の輸送体遺伝子、転写因子遺伝子または両方の複数の発現が改変される。かかる組み換え宿主は、その発現がレバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭなどのステビオールグリコシドの生産をもたらす１つまたは２つ以上の生合成遺伝子を含み得る。かかる生合成遺伝子は、１３−モノグルコシドβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼおよび／または１９−モノグルコシドβ−１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（例えば９１Ｄ２ｅおよびＥＵＧＴ１１）および他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（例えばＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１および／またはＵＧＴ８５Ｃ２）を含んでおり、組み換え宿主によるステビオールグリコシドの生産を可能にする。
本出願は、ステビオールグリコシド製品を生産するための方法も特徴とする。それらの方法は、内在性の輸送体遺伝子の改変された発現を有する組み換え微生物（例えばSaccharomyces cerevisiae）を用いてステビオールグリコシドを生産する発酵方法を含み、ステビオールグリコシドは任意に、その後発酵培養液から精製され得る。
一側面において、本出願は、ステビオールグリコシドの排出を変化させる遺伝子（単数または複数）を同定すること、さらにはその組み換え態様を用いて組み換え細胞（特に微生物）を遺伝子操作して、本明細書に記載のステビオールグリコシドを生産することのための方法を特徴とする。それらの方法は、ステビオールまたはステビオールグリコシドを生産できる組み換え微生物による少なくとも１つの内在性の輸送体の発現を改変すること；ステビオールグリコシドが合成される条件下において培地中で改変微生物を培養すること；ならびに、培養ステップの間に生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシドの量を、改変を有さない相当する微生物によって生産された量と比較して測定し、それによってステビオールグリコシドの排出を変化させるものとして内在性の輸送体を同定すること、を含む。
本願は、ステビオールグリコシドの排出を変化させる遺伝子（単数または複数）を同定すること、さらにはその組み換え形態を用いて組み換え細胞（特に微生物）を遺伝子操作して、本明細書に記載のステビオールグリコシドを生産することのための代替的な方法も特徴とする。方法は、微生物の少なくとも１つの内在性の輸送体の発現を改変して改変微生物を作製すること；ステビオールグリコシドを生産できる１つまたは２つ以上の組み換え遺伝子を改変微生物内に導入すること；ステビオールグリコシドが合成される条件下において培地中で改変微生物を培養すること；ならびに、培養ステップの間に生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシドの量を、改変を有さない相当する微生物によって生産された量と比較して測定し、それによってステビオールグリコシドの排出を変化させるものとして内在性の輸送体を同定すること、を含む。
本願は、ステビオールグリコシドの排出を変化させる遺伝子（単数または複数）を同定するためのさらなる方法も特徴とする。それらの方法は、ステビオールまたはステビオールグリコシドを生産できる組み換え微生物の内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する少なくとも１つの内在性の転写因子の発現を改変すること；ステビオールグリコシドが合成される条件下において培地中で改変微生物を培養すること；ならびに、培養ステップの間に生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシドの量を、改変を有さない相当する微生物によって生産された量と比較して測定し、それによってステビオールグリコシドの排出を変化させるものとして転写因子を同定すること、を含む。
別の態様において、本願は、ステビオールグリコシドの排出を変化させる遺伝子（単数または複数）を同定するためのさらなる方法を特徴とする。それらの方法は、微生物の内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する少なくとも１つの内在性の転写因子の発現を改変して、改変微生物を作製すること；、ステビオールグリコシドを生産できる１つまたは２つ以上の組み換え遺伝子を改変微生物内に導入すること；ステビオールグリコシドが合成される条件下において培地中で改変微生物を培養すること；ならびに、培養ステップの間に生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシドの量を、改変を有さない相当する微生物によって生産された量と比較して測定し、それによってステビオールグリコシドの排出を変化させる転写因子を同定すること、を含む。
別の側面において、本願は、ステビオールグリコシドの排出を変化させるものと同定された遺伝子（単数または複数）の発現を改変することによってステビオールグリコシドの排出を増大させる方法に関し、ステビオールまたはステビオールグリコシドを生産できる組み換え微生物について、同定された遺伝子の発現が改変される。いくつかの態様において、同定された遺伝子（単数または複数）は内在性の遺伝子であり、野生型プロモーターと比較してそれぞれより強いプロモーターまたはより弱いプロモーターによって内在性のプロモーターを置換することによって、過剰発現または抑制され得る。別の態様において、同定された遺伝子（単数または複数）は内在性の遺伝子であり、内在性の遺伝子（単数または複数）を過剰発現または抑制するように操作された外来性のＤＮＡを導入することによって、過剰発現または抑制され得る。さらに別の態様において、同定された内在性の遺伝子の相同またはオルソログ遺伝子が過剰発現され得る。さらなる態様において、内在性の遺伝子が、組み換え微生物の天然の機構（例えば、熱ショック、ストレス、重金属、または抗生物質の曝露）を用いて過剰発現または抑制されるように誘導され得る。
本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、発現を改変することが、内在性の輸送体または転写因子の発現または活性を、相当する未改変の微生物について観察される発現のレベルから少なくとも５％増大または減少させることを含み得る。
本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、組み換え遺伝子は、外来性の核酸によってコードされる次の遺伝子の１つまたは２つ以上を含み得る：
（ａ） スクロース輸送体およびスクロースシンターゼをコードする１つまたは２つ以上の組み換え遺伝子；
（ｂ） ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ） ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ） カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドをコードする核酸；
（ｅ） カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする核酸；
（ｆ） ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする核酸；
（ｇ） シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする核酸；および、さらに適切な組み合わせで、
（ｈ） ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする核酸；
（ｉ） ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸；
（ｊ） ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸；
（ｋ） ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする核酸；または
（ｌ） ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする核酸。
本願は、ステビオールグリコシドの排出を変化させる遺伝子（単数または複数）を同定すること、さらにはその組み換え態様を用いて組み換え細胞（特に微生物）を遺伝子操作し、本明細書に記載のステビオールグリコシドを生産するための方法を特徴とする。方法は、ステビオールまたはステビオールグリコシドを生産できる組み換え微生物によって少なくとも１つの異種輸送体を発現すること；ステビオールグリコシドが合成される条件下において培地中で微生物を培養すること；ならびに、培養ステップにおいて生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシドの量を、改変を有さない相当する微生物によって生産された量と比較して測定し、それによってステビオールグリコシドの排出を変化させる異種輸送体を同定することと、を含む。異種輸送体はStevia輸送体であり得る。
本明細書に記載された方法のいずれかにおいて、微生物は、Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium/Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowiaからなる群から選択される属由来の好適な種を含むが、これらに限定されない。かかる属由来の例示的な種は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhousまたはCandida albicans種を含むが、これらに限定されない。
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、添付のクレームと併せて、以下の本発明の詳細な説明からより詳しく理解されるであろう。ただし、クレームの範囲は、本明細書に記載の特徴および利点の具体的な説明によってではなく、クレームの記述によって定義される。
図面の説明
図１は、種々のステビオールグリコシドの化学構造および合成経路を示す。 図２は、輸送体遺伝子を過剰発現するＲｅｂＡ生産酵母株の培養上清中のパーセントＲｅｂＡの棒グラフである。天然の輸送体プロモーターが、相同組み換えによって強力な構成的プロモーターＴＥＦ１によって置換された。株は合成完全（ＳＣ）培地によって４８時間増殖させられ、ペレットおよび上清画分のＲｅｂＡ含量がＬＣ−ＭＳによって測定された。
図３は、ＹＯＲ１遺伝子の前に天然のプロモーターを有する野生型株と比較された、ＹＯＲ１過剰発現酵母株の上清中のパーセントＲｅｂＡの棒グラフである。ペレットおよび上清画分のＲｅｂＡ含量がＬＣ−ＭＳによって測定された。
図４Ａ〜Ｍは、酵母株ＥＦＳＣ２７９７によって２ミクロンプラスミドを用いて過剰発現された種々の輸送体の、上清または全量（各図に表示する）の各ステビオールグリココシドの排出されたパーセント（図４Ａ〜Ｉ）またはマイクロモラー／ＯＤ６００（図４Ｊ〜Ｋ）またはマイクロモラー濃度（図４Ｌ〜Ｍ）の棒グラフである。空プラスミドを含有する酵母株（ＰＳＢ３１４）と比較した。内在性の酵母輸送体遺伝子ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ１３、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１＿ＢＹ、ＹＯＲ１＿ＩＳ１、ＦＬＲ１、ＡＺＲ１およびＤＴＲ１が、ＰＳＢ３１４を用いてＥＦＳＣ２７９７のＲｅｂ生産株によって過剰発現された。ペレットおよび上清画分の各ステビオールグリコシド含量がＬＣ−ＭＳによって測定された。
図５Ａ〜Ｉは、酵母株ＥＦＳＣ２７９７によってＰＳＢ３１４を用いて過剰発現された内在性の酵母輸送体遺伝子ＰＤＲ１、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１＿ＢＹ、ＹＯＲ１＿ＩＳ１およびＦＬＲ１の上清の、排出された各ステビオールグリココシドの量（図５Ａ〜ＤのＡＵＣ）またはパーセント（図５Ｅ〜Ｉ）の棒グラフである。対照株（ＰＳＢ３１４）と比較した。内在性の酵母輸送体遺伝子ＰＤＲ１、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１＿ＢＹ、ＹＯＲ１＿ＩＳ１およびＦＬＲ１が、ＥＲＳＣ２７９７のＲｅｂ生産株によってＰＳＢ３１４プラスミドを用いて過剰発現され、ペレットおよび上清画分の各ステビオールグリコシドの含量がＬＣ−ＭＳによって測定された。
図６は、酵母ＥＲＳＣ２７９７株によって内在性の酵母輸送体遺伝子ＰＤＲ１、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１＿ＢＹ、ＹＯＲ１＿ＩＳ１およびＦＬＲ１を過剰発現させたことによる、酵母の増殖に及ぼす影響を示す棒グラフである。 図７は、ＲｅｂＡ生産株においてS.rebaudiana輸送体を発現することの影響を示す棒グラフである。
図８は、４つの内在性の輸送体の遺伝子座に変異を有する酵母株がステビオール添加培地によって培養された後に、生産されたステビオール−１９−Ｏ−グルコシドの濃度（マイクロモラー）を示す棒グラフである。Sup 19-SMG＝上清中のステビオール−１９−Ｏ−グルコシドの量。Pel 19-SMG＝細胞ペレット中のステビオール−１９−Ｏ−グルコシドの量。ＷＴ＝４つのS.rebaudiana ＵＧＴ（７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅおよび８５Ｃ２）を発現する野生型。４×ＫＯ＝４×輸送体破壊変異体酵母株であって、４つのS.rebaudiana ＵＧＴを発現し、ｐｄｒ５、ｐｄｒｌＯ、ｐｄｒｌ５、ｓｎｑ２輸送体遺伝子座の欠失を有する。
図９は、ステビオール添加培地による４×輸送体破壊酵母株の培養後の、生産された１９−ＳＭＧおよびレバウジオシドＡの濃度（マイクロモラー）を示す棒グラフである。示されている量は、各株の細胞外（左側のバー）および細胞内（右側のバー）１９−ＳＭＧおよびレバウジオシドＡ全量である。
図１０は、４つのS.rebaudiana ＵＧＴ（７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅおよび８５Ｃ２）を発現する酵母野生型株によって生産されたステビオールグリコシドのクロマトグラフィー曲線である。Ｙ軸＝表示情報の自動縮尺による相対量。上から下に向かって、横列は、モノグルコシド、ビオシド、ステビオール＋３グルコース残基、ステビオール＋４グルコース残基およびステビオール＋５グルコース残基に対応するｍ／ｚ曲線である。
図１１は、４つのS.rebaudiana ＵＧＴ（７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅおよび８５Ｃ２）を発現する酵母４×輸送体破壊変異体株によって生産されたステビオールグリコシドのクロマトグラフィー曲線である。Ｙ軸＝表示情報の自動縮尺による相対量。上から下に向かって、横列は、モノグルコシド、ビオシド、ステビオール＋３グルコース残基、ステビオール＋４グルコース残基およびステビオール＋５グルコース残基に対応するｍ／ｚ曲線である。
図１２は、４つのS.rebaudiana ＵＧＴ（７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅ、および８５Ｃ２）を発現する酵母の７×輸送体破壊変異体株によって生産されたステビオールグリコシドのクロマトグラフィー曲線である。Ｙ軸＝表示情報の自動縮尺による相対量。上から下に向かって、横列は、モノグルコシド、ビオシド、ステビオール＋３グルコース残基、ステビオール＋４グルコース残基およびステビオール＋５グルコース残基に対応するｍ／ｚ曲線である。
図１３Ａ〜Ｄは、特定の輸送体遺伝子（ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１、ＹＨＫ８、ＦＬＲ１）の１つの欠失を有する酵母株の上清中に排出された各ステビオールグリココシドの、濃度（図１３Ａ〜Ｂ）またはマイクロモラー／ＯＤ６００（図１３Ｃ）またはパーセント（図１３Ｄ〜Ｆ）の棒グラフである。
詳細な説明
別段の定めがない限り、本明細書に用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は本発明を実施するために用いられ得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書で挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれる。矛盾がある場合には、本明細書が、定義も含めて優先される。さらに、材料、方法および例は例示的に過ぎず、限定することは意図されていない。本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかとなる。出願人は、特許法の標準慣行に従って移行句「を含む」、「から本質的になる」、または「からなる」を用い、任意の開示される発明を択一的にクレームする権利を有する。
当業者に周知の方法が、本発明の遺伝子発現構築物および組み換え細胞を構築するために用いられ得る。それらの方法は、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組み換え技術およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む。例えば、Maniatis et al, 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, New York；Ausubel et al, 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York；およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al, 1990, Academic Press, San Diego, CA)に記載の技術を参照。
本発明を詳しく説明する前に、いくつかの用語が定義される。本明細書で用いられる場合、単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに別段に指示しない限り複数の指示物も包含する。例えば、「核酸」と言うことは１つまたは２つ以上の核酸を意味する。
「好ましくは」、「一般に」、および「通常は」などの用語は、本明細書において、クレームされる発明の範囲を限定するためまたはクレームされる発明の構造もしくは機能にとって特定の特徴が決定的、必須、もしくは、さらに重要であるということを意味するためには用いられないことに留意する。むしろ、それらの用語は、本発明の特定の態様に用いられるかまたは用いられない択一的または付加的な特徴を強調することを意図されているに過ぎない。
本発明を説明し定義するために、用語「実質的に」が、任意の量的な比較、数値、測定または他の表現に帰せられる内在的な不確実性の程度を表すために本明細書において用いられることに留意する。用語「実質的に」は、その対象の事物の基本的な働きの変化をもたらすことなく量的表現が記載の参照物から変動し得る程度を表すために本明細書において同じく用いられる。
本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、交換可能に用いられてＤＮＡ、ＲＮＡ、その誘導体またはそれらの組み合わせを含む核酸を指し得る。
本明細書で用いられる場合、用語「および／または」は、複数の構成要素を組み合わせてまたは互いを含めないで表すために用いられる。例えば、「ｘ、ｙおよび／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙおよびｚ」、「（ｘおよびｙ）またはｚ」、「ｘおよび（ｙまたはｚ）」または「ｘまたはｙまたはｚ」を指し得る。いくつかの態様において、「および／または」は、組み換え細胞が含む外来性の核酸を示すために用いられ、組み換え細胞はある群から選択される１つまたは２つ以上の外来性の核酸を含む。いくつかの態様において、「および／または」は、ステビオールグリコシドの生産を示すために用いられ、ある群から選択される１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドが生産される。いくつかの態様において、「および／または」はステビオールグリコシドの生産を指すために用いられ、１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドが次のステップの１つまたは２つ以上によって生産される：組み換え微生物を培養すること、組み換え微生物によって１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドを合成すること、および、１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドを単離すること。
本願は、ステビオールグリコシドの排出に関わる組み換え宿主の輸送系の改変によって、ステビオールグリコシド組成物を効率的に生産するために用いられ得る材料および方法を記載する。いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え宿主は少なくとも１つのステビオールグリコシドを生産でき、抗生物質を能動的に排出する輸送体などの異種輸送体を発現できる。いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え宿主は少なくとも１つのステビオールグリコシドを生産し、宿主の内在性の輸送体遺伝子の発現が改変および／または転写因子遺伝子の発現が改変され、転写因子は少なくとも１つの内在性の輸送体遺伝子の発現を制御する。抗生物質を能動的に分泌する内在性の輸送体の発現を改変することは特に有用である。いくつかの態様において、内在性の輸送体遺伝子、転写因子遺伝子または両方の複数の発現が改変される。かかる組み換え宿主は、その発現がステビオールグリコシド（例えば、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭ）の生産をもたらす１つまたは２つ以上の生合成遺伝子を含み得る。かかる生合成遺伝子は１３−モノグルコシドβ‐１，２グリコシルトランスフェラーゼおよび／または１９−モノグルコシドβ‐１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（例えばＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびＥＵＧＴ１１）および他のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（例えばＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１および／またはＵＧＴ８５Ｃ２）を含み、組み換え宿主によるステビオールグリコシドの生産を可能にする。
一側面において、本願は少なくとも１つのステビオールグリコシドを合成できる組み換え微生物に関し、これが輸送体遺伝子である少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子または両方の改変された発現を含む。一態様において、輸送体遺伝子は内在性の輸送体遺伝子または異種輸送体遺伝子であり得る。別の態様において、輸送体遺伝子はＡＢＣ輸送体またはＭＦＳ輸送体をコードし、輸送体遺伝子、輸送体遺伝子または転写因子遺伝子は、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＰＤＲ８、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、ＰＤＲ１２、ＰＤＲ１５、ＰＤＲ１８、ＹＯＲｌ、ＡＵＳ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ１２、ＳＴＥ６、ＴＨＩ７３、ＮＦＴ１、ＡＤＰ１、ＦＬＲ１、ＱＤＲ１、ＱＤＲ２、ＱＤＲ３、ＤＴＲ１、ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、ＴＰＯ４、ＴＰＯ３、ＡＱＲ１、ＡＺＲ１、ＥＮＢ１、ＳＧＥ１、ＹＨＫ８、ＧＥＸ２、ＨＯＬ１、ＡＴＲ１、ＨＸＴ１１、ＥＮＢ１、ＡＲＮ１、ＡＲＮ２、ＳＳＵ１、ＴＨＩ７、ＴＰＮ１、ＳＥＯ１、ＳＩＴ１またはＤＴＲ１である。
別の態様において、組み換え微生物の標的遺伝子の改変された発現は、輸送体遺伝子または転写因子遺伝子の過剰発現または減少した発現を含む。さらに別の態様において、組み換え微生物は、複数の内在性の輸送体遺伝子または転写因子遺伝子の過剰発現または減少した発現を含む。一態様において、組み換え微生物は、各遺伝子座を破壊することによって、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５、およびＳＮＱ２遺伝子の減少した発現を含む。別の態様において、組み換え微生物は、各遺伝子座を破壊することによって、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１Ｏ、ＰＤＲ１５、ＳＮＱ２およびＴＰＯ１遺伝子の減少した発現を含む。
さらなる態様において、本出願の組み換え微生物は、次の外来性の核酸の１つまたは２つ以上を含む：スクロース輸送体およびスクロースシンターゼをコードする１つまたは２つ以上の組み換え遺伝子；ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする核酸；ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸；カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドをコードする核酸；カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする核酸；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする核酸；シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする核酸；ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする核酸；ＵＧＴ７６Ｇポリペプチドをコードする核酸；ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸；ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする核酸；またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする核酸。一態様において、組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む。別の態様において、組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む。さらに別の態様において、組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む。さらに別の態様において、組み換え微生物は、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２（特に９１Ｄ２ｅ、９１Ｄ２ｍ、９１Ｄ２ｅ−ｂおよびそれらの機能的なホモログを含む）、および、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む。
別の側面において、本出願はレバウジオシドを生産する方法に関し、これは本明細書に記載の組み換え微生物を、培養培地中で、ＧＧＰＰＳ；ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド；カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド；カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド；シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド；ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド；またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子が発現される条件下において培養することを含み、それらの遺伝子の発現を誘導またはそれらの遺伝子を構成的に発現すること；組み換え微生物によってレバウジオシドを含む化合物の１つまたは２つ以上を合成すること；および、レバウジオシドを含む化合物の１つまたは２つ以上を単離することを含む。一態様において、レバウジオシドは、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭである。別の態様において、組み換え微生物は、ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ１またはＦＬＲ１を過剰発現する。
一態様において、組み換え微生物は、これらに限定されないが、Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium/Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowiaの属から選択される、本明細書に記載の微生物である。別の態様において、組み換え微生物は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhousまたはCandida albicans種の酵母細胞である。
さらに別の側面において、本出願はステビオールグリコシドの排出を変化させる方法に関し、ステビオールグリコシドを生産するために本明細書に記載の方法を用い、少なくとも１つの組み換え遺伝子が発現されること；ステビオールグリコシドが合成される条件下において培地中で組み換え微生物を培養すること；輸送体遺伝子である少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子または両方を発現すること；および、培養ステップの間に生産されたステビオールグリコシドを単離すること、を含む。
Ｉ．ステビオールおよびステビオールグリコシドの生合成ポリペプチド
Ａ．ステビオール生合成ポリペプチド
異種輸送体および／もしくは転写因子の遺伝子を発現すること、または、上記の内在性の輸送体遺伝子の発現を改変することに加えて、本明細書に記載の宿主は、イソプレノイド前駆体からステビオールへの変換に関与する遺伝子産物を含有および発現する。
ステビオールを生産するための生化学的経路は、ゲラニルゲラニル二リン酸の生成、（−）コパリル二リン酸への環化、その後のステビオールを生成する酸化およびヒドロキシル化を含む。したがって、組み換え微生物によるゲラニルゲラニル二リン酸からステビオールへの変換は、カウレンシンターゼ（ＫＳ）をコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）をコードする遺伝子およびステビオールシンテターゼ（ＫＡＨ）をコードする遺伝子の発現を含む。ステビオールシンテターゼはカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼとしても公知である。
好適なＫＳポリペプチドが公知である。例えば、好適なＫＳ酵素は、Stevia rebaudiana、Zea mays、Populus trichocarpaおよびArabidopsis thalianaによって作られるものを含む。表２およびＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号およびPCT/US2011/038967号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。
好適なＫＯポリペプチドは公知である。例えば、好適なＫＯ酵素は、Stevia rebaudiana、Arabidopsis thaliana、Gibberella fujikoroiおよびTrametes versicolorによって作られるものを含む。表３ならびにＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号およびPCT/US2011/038967号（これらはその全体が参照によって組み込まれる）を参照。
好適なＫＡＨポリペプチドは公知である。例えば、好適なＫＡＨ酵素は、Stevia rebaudiana、Arabidopsis thaliana、Vitis viniferaおよびMedicago trunculataによって作られるものを含む。例えば、表４、ＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号およびPCT/US2011/038967号、米国特許公開公報第2008/0271205号および2008/0064063号ならびにGenbank登録No.gi189098312（配列番号１１）およびGenBank登録ABD60225、GL89242710（配列番号１２）を参照（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。Arabidopsis thaliana由来のステビオールシンテターゼはCYP714A2に分類される。
さらに、ＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号によって記載され同定されたStevia rebaudiana由来のＫＡＨポリペプチドは、組み換え宿主に特に有用である。S.rebaudiana ＫＡＨ（ＳｒＫＡＨｅ１、配列番号１８）および酵母による発現用にコドン最適化されたS.rebaudiana ＫＡＨをコードするヌクレオチド配列が同ＰＣＴ出願に記載されており、S.rebaudiana ＫＡＨのコードされるアミノ酸配列（配列番号１９）も同様である。S.rebaudiana ＫＡＨは、S.cerevisiaeによって発現されたときに、Yamaguchi et al.（米国特許公開公報第2008/0271205A1号）記載のArabidopsis thaliana ｅｎｔ−カウレン酸ヒドロキシラーゼと比較して、かなり高いステビオールシンターゼ活性を示す。S.rebaudianaのＫＡＨポリペプチドは、米国特許公開公報第2008/0271205号のＫＡＨに対して２０％未満の同一性を、米国特許公開公報第2008/0064063号のＫＡＨに対して３５％未満の同一性を有する。
いくつかの態様において、組み換え微生物は、ＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含有する。かかる微生物は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子をも通常は含有する。なぜなら、ＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドの一部の組み合わせは外来性のＣＰＲポリペプチドの発現を必要とするからである。特に、輸送体由来のＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドの活性は、外来性のＣＰＲポリペプチドをコードする組み換え遺伝子の包含によってかなり増大し得る。好適なＣＰＲポリペプチドは公知である。例えば、好適なＣＰＲ酵素は、Stevia rebaudianaおよびArabidopsis thalianaによって作られるものを含む。例えば、表５ならびにＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号およびPCT/US2011/038967号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。
例えば、Stevia rebaudiana ＫＡＨｅ１によってコードされるステビオールシンターゼは、遺伝子ＮＣＰ１によってコードされるS.cerevisiae ＣＰＲ（ＹＨＲ０４２Ｗ）によって活性化される。ＳｒＫＡＨｅ１によってコードされるステビオールシンターゼのさらに良好な活性化が、遺伝子ＡＴＲ２（配列番号９９）によってコードされるArabidopsis thaliana ＣＰＲまたは遺伝子ＣＰＲ７（配列番号２３）もしくはＣＰＲ８（配列番号２４）によってコードされるS.rebaudiana ＣＰＲが共発現されるときに観察される。A.thalianaのポリペプチドＡＴＲ１（配列番号２５）およびＡＴＲ２（配列番号２６）ならびにS.rebaudianaのＣＰＲ７（配列番号２７）およびＣＰＲ８（配列番号２８）ポリペプチドのアミノ酸配列はＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号によって示されている。
これらの遺伝子の組み換え微生物による発現は、ゲラニルゲラニル二リン酸からステビオールへの変換をもたらす。
Ｂ．ステビオールグリコシド生合成ポリペプチド
上記の輸送変異に加えて、本明細書に記載の宿主細胞はステビオールをステビオールグリコシドに変換できる。かかる宿主（例えば微生物）は、１つまたは２つ以上のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴとしても知られる）をコードする遺伝子を含有する。ＵＧＴは、活性化した糖ヌクレオチドの単糖ユニットをアクセプター部分（この場合、ステビオールの−ＯＨまたは−ＣＯＯＨ部分、ステビオールグリコシドのグルコース部分またはステビオール誘導体）に転移させる。ＵＧＴは配列相同性に基づいて種々のファミリーおよびサブファミリーに分類されている。Li et al. J. Biol. Chem. 276:4338-4343 (2001)。
Ｂ．１．ルブソシド生合成ポリペプチド
ルブソシドの生合成はステビオールの１３−ＯＨおよび１９−ＣＯＯＨのグリコシル化を必要とする。図１参照。微生物などの組み換え宿主によるステビオールからルブソシドへの変換は、ＵＧＴの８５Ｃ２および７４Ｇ１をコードする遺伝子（単数または複数）の発現によって達成され得、それらはそれぞれグルコースユニットをステビオールの１３−ＯＨまたは１９−ＣＯＯＨに転移させる。
好適なＵＧＴ８５Ｃ２はウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−ＯＨトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド１３−ＯＨトランスフェラーゼとして機能する。機能的なＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、ステビオールおよびステビオール−１９−Ｏ−グルコシド以外のステビオールグリコシド基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応も触媒し得る。
好適なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能する。機能的なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、ステビオールおよびステビオール−１３−Ｏ−グルコシド以外のステビオールグリコシド基質を利用するまたはウリジン二リン酸グルコース以外のドナーの糖部分を転移させるグリコシルトランスフェラーゼ反応をも触媒し得る。
機能的なＵＧＴ７４Ｇ１および機能的なＵＧＴ８５Ｃ２を発現する組み換え微生物は、培地中のフィードストックとしてステビオールが用いられたときに、ルブソシドおよび両方のステビオールモノシド（すなわちステビオール１３−Ｏ−モノグルコシドおよびステビオール１９−Ｏ−モノグルコシド）を作り得る。かかる遺伝子の１つまたは２つ以上は宿主内に天然に存在し得る。しかしながら、通常は、かかる遺伝子はそれらを天然に有さない宿主（例えば微生物）に形質転換された組み換え遺伝子である。
本明細書で用いられる場合、用語「組み換え宿主」は、少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列によってゲノムが補われた宿主を指すことが意図される。かかるＤＮＡ配列は、天然に存在しない遺伝子、通常はＲＮＡに転写または蛋白質に翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列および非組み換え宿主内に導入したい他の遺伝子またはＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない。当然のことながら、通常は、本明細書に記載の組み換え宿主のゲノムは、１つまたは２つ以上の組み換え遺伝子の安定した導入によって補われる。一般に、導入されるＤＮＡはＤＮＡのレシピエントである宿主に元々内在していない。しかし、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離して、次に同じ宿主内にそのＤＮＡの１つまたは２つ以上のさらなるコピーを導入し、例えば遺伝子の産物の生産を向上させるかまたは遺伝子の発現パターンを改変するということは、本発明の範囲内である。いくつかの例では、導入されるＤＮＡは内在性の遺伝子またはＤＮＡ配列を改変またはさらには置換し、これが例えば相同組み換えまたは部位特異的変異導入による。好適な組み換え宿主は微生物を含む。
用語「組み換え遺伝子」は、レシピエントの宿主内に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指し、同一または類似の遺伝子またはＤＮＡ配列がかかる宿主内に予め存在しているかどうかに関わらない。この場合の「導入される」または「補われる」は、人為的に導入されることまたは補われることを意味するものとして当該分野では理解される。したがって、組み換え遺伝子は別の種に由来するＤＮＡ配列であり得、または同じ種に由来または存在するＤＮＡ配列であり得るが、組み換え法によって宿主内に取り込まれて組み換え宿主を生ずる。当然のことながら、宿主内に導入される組み換え遺伝子は、形質転換されようとする宿主内に通常存在するＤＮＡ配列と同一であり得、導入されてそのＤＮＡの１つまたは２つ以上のさらなるコピーを提供することによって、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にする。
好適なＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、Stevia rebaudianaによって作られるものを含む。ステビア由来の機能的なＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする遺伝子は、Richman et al. Plant J. 41: 56-67 (2005)によって報告されている。S.rebaudianaのＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号２９）およびＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３０）ポリペプチドのアミノ酸配列はそれぞれＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号の配列番号１および３に示されている）。ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１００）およびＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３１）ならびに酵母による発現用に最適化されたＵＧＴ配列、例えばＵＧＴの８５Ｃ２（配列番号３２）、９１Ｄ２ｅ、９１Ｄ２ｅ−ｂ、ＥＵＧＴ１１および７６Ｇ１をコードするヌクレオチド配列が提供される。「機能的なホモログ」の項の下記のＵＧＴ８５Ｃ２およびＵＧＴ７４Ｇ１バリアントも参照。例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは位置６５、７１、２７０、２８９および３８９の置換を含有し得、用いられ得る（例えばＡ６５Ｓ、Ｅ７１Ｑ、Ｔ２７０Ｍ、Ｑ２８９ＨおよびＡ３８９Ｖ）。
いくつかの態様において、組み換え宿主は微生物である。組み換え微生物はルブソシドを生産するためにステビオールを含有する培地を用いて増殖させられ得る。しかしながら別の態様において、組み換え微生物は、ステビオールの生合成に関与する１つまたは２つ以上の組み換え遺伝子、例えばＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子および／またはＫＡＨ遺伝子を発現する。好適なＣＤＰＳポリペプチドは公知である。
例えば、好適なＣＤＰＳ酵素は、Stevia rebaudiana、Streptomyces clavuligerus、Bradyrhizobium japonicum、Zea maysおよびArabidopsisによって作られるものを含む。例えば、表６ならびにＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号およびPCT/US2011/038967号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。
いくつかの態様において、未改変のポリペプチドのアミノ末端にある葉緑体トランジットペプチドを欠くＣＤＰＳポリペプチドが用いられ得る。例えば、ＰＣＴ公報第PCT/US2012/050021号の図１４に示されたZea mays ＣＤＰＳのコード配列の５’末端から、最初の１５０ヌクレオチドが除去される。このようにすることは、葉緑体トランジットペプチドをコードするアミノ酸配列のアミノ末端の５０残基を除去する。末端欠失ＣＤＰＳ遺伝子は新たなＡＴＧ翻訳開始部位が取り付けられて、プロモーター（通常は構成的または高発現プロモーター）と作動可能に連結され得る。複数コピーの末端欠失コード配列が微生物内に導入されるときには、プロモーターによるＣＤＰＳポリペプチドの発現は、ｅｎｔ−カウレン生合成に向かう増大した炭素フラックスをもたらす。
ＣＤＰＳ−ＫＳ二機能性蛋白質も用いられ得る。表７に示されているＣＤＰＳ−ＫＳ二機能性酵素をコードするヌクレオチド配列が酵母による発現用に改変された（ＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号参照）。Gibberella fujikuroi由来の二機能性酵素も用いられ得る。
したがって、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子をＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２遺伝子に加えて含有する微生物は、ステビオールモノシドおよびルブソシドを両方生産でき、ステビオールをフィードストックとして用いる必要がない。
いくつかの態様において、組み換え微生物は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）をコードする組み換え遺伝子をさらに発現する。好適なＧＧＰＰＳポリペプチドは公知である。例えば、好適なＧＧＰＰＳ酵素は、Stevia rebaudiana、Gibberella fujikuroi、Mus musculus、Thalassiosira pseudonana、Streptomyces clavuligerus、Sulfulobus acidocaldarius、Synechococcus sp.およびArabidopsis thalianaによって作られるものを含む。表８ならびにＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号およびPCT/US2011/038967号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。
いくつかの態様において、組み換え微生物は、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の生産に関与する組み換え遺伝子、例えば下記のメチルエリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）経路の遺伝子またはメバロン酸（ＭＥＶ）経路の遺伝子をさらに発現でき、減少したホスファターゼ活性を有し、および／または本明細書に記載のスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を発現する。別の態様において、何らかのＧＧＰＰ／ＦＰＰ前駆体の利用可能性を変化させるために、内在性の遺伝子（例えばＤＰＰ１）が不活性化または欠失させられ得る。
Ｂ．２．レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよびレバウジオシドＭ生合成ポリペプチド
レバウジオシドＡの生合成はアグリコンのステビオールのグルコシル化を必要とする。具体的には、レバウジオシドＡは、１３−Ｏ−ステビオールモノシドを生成するステビオールの１３−ＯＨのグルコシル化、ステビオール−１，２−ビオシドを生成するステビオールモノシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化、ステビオシドを生成するステビオール−１，２−ビオシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化、および、ステビオシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグルコシル化によって生成し得る。各グルコシル化反応が起こる順序は様々であり得る。図１参照。
レバウジオシドＢの生合成はアグリコンのステビオールのグルコシル化を必要とする。具体的には、レバウジオシドＢは、１３−Ｏ−ステビオールモノシドを生成するステビオールの１３−ＯＨのグルコシル化、ステビオール−１，２−ビオシドを生成するステビオールモノシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化、および、ステビオール−１，２−ビオシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグルコシル化によって生成し得る。各グルコシル化反応が起こる順序は様々であり得る。
レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＤの生合成はアグリコンのステビオールのグルコシル化を必要とする。具体的には、レバウジオシドＥは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドを生成するステビオールの１３−ＯＨのグルコシル化、ステビオール−１，２−ビオシドを生成するステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化、１，２−ステビオシドを生成する１，２−ビオシドのＣ−１９カルボキシルのグルコシル化、および、レバウジオシドＥを生成する１，２−ステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化によって生成し得る。レバウジオシドＤは、レバウジオシドＥのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’のグルコシル化によって生成し得る。各グリコシル化反応が起こる順序は様々であり得る。例えば、１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’のグルコシル化が経路の最終ステップであり得、その場合にはレバウジオシドＡは経路の中間体となる。図１参照。
組み換え宿主によるステビオールからレバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭおよび／またはレバウジオシドＥへの変換が、次の機能的なＵＧＴを発現することによって達成され得るということが発見された：ＥＵＧＴ１１、９１Ｄ２、７４Ｇ１、８５Ｃ２および７６Ｇ１。すなわち、これらのＵＧＴの組み合わせを発現する組み換え微生物は、ステビオールがフィードストックとして用いられたときにレバウジオシドＡおよびレバウジオシドＤを生産し得る。通常は、それらの遺伝子の１つまたは２つ以上は、それらを天然には有さない微生物に形質転換された組み換え遺伝子である。本明細書でＳＭ１２ＵＧＴと呼ぶＵＧＴがＵＧＴ９１Ｄ２の代用となり得ることも発見された。
いくつかの態様において、５つ未満の（例えば１、２、３または４つの）ＵＧＴが宿主内で発現される。例えば、機能的なＥＵＧＴ１１を発現する組み換え微生物は、レバウジオシドＡがフィードストックとして用いられたときにレバウジオシドＤを生産し得る。ＵＧＴの８５Ｃ、９１Ｄ２ｅまたはＥＵＧＴ１１、好ましくは９１Ｄ２ｅおよび７６Ｇ１を発現する組み換え微生物は、レバウジオシドＢを生産できる。ＥＵＧＴ１１、７６Ｇ１および９１Ｄ１２（例えば９１Ｄ２ｅ）を発現する組み換え微生物は、ルブソシドまたは１，２−ステビオシドがフィードストックとして用いられるときにレバウジオシドＤを生産できる。もう１つの代替として、３つの機能的なＵＧＴのＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１、７６Ｇ１、および任意に９１Ｄ２、を発現する組み換え微生物は、培地中にモノシドのステビオール−１３−Ｏ−グルコシドが添加された場合にレバウジオシドＤを生産し得る。同様に、組み換え微生物によるステビオール−１９−Ｏ−グルコシドからレバウジオシドＤへの変換は、ＵＧＴのＥＵＧＴ１１、８５Ｃ２、７６Ｇ１および９１Ｄ２（例えば９１Ｄ２ｅ）をコードする遺伝子の発現によって、ステビオール−１９−Ｏ−グルコシドが添加されるときに達成され得る。通常は、これらの遺伝子の１つまたは２つ以上は、それらを天然には有さない宿主に形質転換された組み換え遺伝子である。
レバウジオシドＭポリペプチド
組み換え宿主によるステビオールからレバウジオシドＭへの変換は、次の機能的なＵＧＴの組み合わせを発現することによって達成され得る：９１Ｄ２、ＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１、８５Ｃ２および７６Ｇ１。図１参照。多コピー数プラスミドを用いること、または、強力なプロモーターもしくは遺伝子の複数のインテグレーションコピーもしくは遺伝子の高コピー数の選択を受けるエピソームを用いることによって、高レベルでＥＵＧＴ１１を発現することは特に有用である。したがって、これらのＵＧＴの組み合わせを発現する組み換え微生物は、レバウジオシドＡ（８５Ｃ２、７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅ）、レバウジオシドＤ（８５Ｃ２、７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅ、ＥＵＧＴ１１）、レバウジオシドＥ（８５Ｃ２、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅ、ＥＵＧＴ１１）またはレバウジオシドＭ（８５Ｃ２、７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅ、ＥＵＧＴ１１）を生産し得る。図１参照。通常は、それらの遺伝子の１つまたは２つ以上は、それらを天然には有さない微生物に形質転換された組み換え遺伝子である。本明細書でＳＭ１２ＵＧＴと呼ぶＵＧＴがＵＧＴ９１Ｄ２の代用となり得るということも発見された。
図１に示された個々のレバウジオシドの標的指向型生産は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性の相対レベルを調節することによって達成される。これは、ＵＧＴをコードする遺伝子の差別的なコピー数、差別的なプロモーター強度、および／または、目的の産物を指向する増大した特異性／活性を有する変異体の使用によって達成され得る。図１参照。例えば、他のＵＧＴと比較してＥＵＧＴ１１が低レベルで発現されると、低レベルのレバウジオシドＤ、ＥおよびＭが生成するが、これはレバウジオシドＡの生成に有利となる。高レベルのＥＵＧＴ１１発現は、レバウジオシドＭを生成するためにＵＧＴ７６Ｇ１が反応する１９−Ｏ１，２ジグルコシド基質をより多くもたらす。これはＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドの好ましい活性ではないので、ＵＧＴ７６Ｇ１のさらなるコピーまたは変異体の異形は、レバウジオシドＤからのレバウジオシドＭの生成速度を改善し得る。好適なＵＧＴ７６Ｇ１は、アクセプター分子の１９−ＯグルコースのＣ−３’へのグルコース部分の転移も触媒し、アクセプター分子はステビオールの１９−Ｏ位に１，２グリコシド部分を有し得る。
好適なＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは上記のものを含む。好適なＵＧＴ７６Ｇ１は、アクセプター分子のステビオール１，２グリコシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’にグルコース部分を付加する。すなわち、ＵＧＴ７６Ｇ１は、例えばウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−Ｏ−１，２グルコシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−Ｏ−グルコース，１３−Ｏ−１，２ビオシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する。機能的なＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、グルコース以外の糖を含有するステビオールグリコシド基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応をも触媒し得る。好適なＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、S.rebaudianaによって作られ、Richman et al. Plant J. 41: 56-67 (2005) によって報告されたものを含む。S.rebaudiana ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド（例えば配列番号８５）のアミノ酸配列はＰＣＴ公報第PCT/US2012/050021号に記載されており、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も同様であり、酵母による発現用に最適化される。「機能的なホモログ」の項に記載のＵＧＴ７６Ｇ１バリアントも参照。
好適なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドはウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼ（ステビオール−１３−モノグルコシド１，２−グルコシラーゼとも呼ばれる）として機能し、アクセプター分子のステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’にグルコース部分を転移させる。
好適なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドはウリジン５’−ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとしても機能し、アクセプター分子のルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’にグルコース部分を転移させて、ステビオシドを生産する。ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、さらにアクセプター分子のルブソシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’にグルコース部分を効率的に転移させて、１９−Ｏ−１，２−ジグリコシル化ルブソシドを生産できる。ＥＵＧＴ１１は、１９−Ｏ−グルコース置換されたステビオールグリコシド分子へのグルコース分子の転移が特に効率的である。
機能的なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドおよびルブソシド以外のステビオールグリコシド基質を利用する反応をも触媒し得る。例えば、機能的なＥＵＧＴ１１ポリペプチドは基質としてステビオシドを効率的に利用でき、１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’にグルコース部分を転移させて、レバウジオシドＥを生産する。機能的なＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは基質としてレバウジオシドＡを利用でき、レバウジオシドＡの１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’にグルコース部分を転移させて、レバウジオシドＤを生産する。ＥＵＧＴ１１（配列番号５１）は、反応が同様の条件下（すなわち同様の時間、温度、純度および基質濃度）において実施される場合には、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５４）の速度よりも少なくとも２０倍速い（例えば、少なくとも２５倍または少なくとも３０倍速い）速度で、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換できる。したがって、ＥＵＧＴ１１は、同様の条件下においてインキュベーションされた場合にＵＧＴ９１Ｄ２ｅよりも大量のＲｅｂＤを生産する。
さらに、機能的なＥＵＧＴ１１はかなりのＣ−２’１９−Ｏ−ジグリコシル化活性を基質のルブソシドまたはステビオシドに対して示すが、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅはより少ないジグリコシル化活性をそれらの基質に対して有する。したがって、機能的なＥＵＧＴ１１はステビオールグリコシド基質特異性の違いによってＵＧＴ９１Ｄ２ｅと区別され得る。
機能的なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、Ｃ−１３位に１，３結合したグルコースを有するステビオール化合物に、グルコース部分を通常は転移させない。すなわち、ステビオール１，３−ビオシドおよび１，３−ステビオシドへのグルコース部分の転移は大部分の条件下においては検出可能なレベルで起こらない。
好適なＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、Oryza sativaのＥＵＧＴ１１ポリペプチド（GenBank登録No.AC133334、配列番号５１）を含み得る。例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性）を配列番号５１に示されたアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列を有し得る。ＥＵＧＴ１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も配列番号５２に示されており、同様に酵母による発現用のコドン最適化されたヌクレオチド配列は配列番号５３に示されている。
好適な機能的なＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびＵＧＴ９１Ｄ２ｍと呼ばれるポリペプチドを含む。Stevia rebaudianaの例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号５４に示されている（ＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号のヌクレオチド配列番号５によってコードされる）。ポリペプチドをコードするS.rebaudianaヌクレオチド配列、ポリペプチドをコードし且つ酵母による発現用にコドン最適化されたヌクレオチド配列（配列番号１５８）、S.rebaudianaの例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｍポリペプチドのアミノ酸配列および例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｍポリペプチドをコードする核酸配列も開示されている。例示的なＵＧＴ９１Ｄ２ｍのアミノ酸配列は配列番号５５に示されている。アミノ酸残基２０６、２０７および３４３に置換を有するＵＧＴ９１Ｄ２バリアントも用いられ得る。例えば、野生型ＵＧＴ９２Ｄ２ｅと比較してＧ２０６Ｒ、Ｙ２０７ＣおよびＷ３４３Ｒ変異を有するアミノ酸配列が用いられ得る。さらに、アミノ酸残基２１１および２８６の位置に置換を有するＵＧＴ９１Ｄ２バリアントが用いられ得る。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２バリアントは位置２１１のロイシンに対するメチオニンの置換と位置２８６のバリンに対するアラニンの置換とを含み得る。「機能的なホモログ」の項に記載のＵＧＴ９１Ｄ２バリアントも参照。
上記のように、本明細書においてＳＭ１２ＵＧＴと呼ばれるＵＧＴはＵＧＴ９１Ｄ２の代用となり得る。好適な機能的なＳＭ１２ＵＧＴポリペプチドはIpomoea purpurea（日本アサガオ）によって作られるものを含み、Morita et al. Plant J. 42: 353-363 (2005) に記載されている。I.purpurea ＩＰ３ＧＧＴポリペプチド（配列番号５６）をコードするアミノ酸配列は、ＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号によって配列番号７６を用いて示されており、ポリペプチドをコードし且つ酵母による発現用にコドン最適化されたヌクレオチド配列（配列番号５７）も同様である。別の好適なＳＭ１２ＵＧＴポリペプチドは、Ｒ２５Ｓ変異を有するＢｐ９４Ｂ１ポリペプチドである。Osmani et al. Plant Phys. 148: 1295-1308 (2008) およびSawada et al. J. Biol. Chem. 280: 899-906 (2005) 参照。Bellis perennis（ヒナギク）のＵＧＴ９４Ｂ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５８）は、ＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号によって配列番号７８を用いて示されており、ポリペプチドをコードし且つ酵母による発現用にコドン最適化されたヌクレオチド配列（配列番号５９）も同様である。
いくつかの態様において、組み換え微生物は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＭを生産するために、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドまたはステビオール−１９−Ｏ−グルコシドを含有する培地を用いて増殖させられる。かかる態様において、微生物は機能的なＥＵＧＴ１１、機能的なＵＧＴ７４Ｇ１、機能的なＵＧＴ８５Ｃ２、機能的なＵＧＴ７６Ｇ１および機能的なＵＧＴ９１Ｄ２をコードする遺伝子を含有および発現し、ステビオール、ステビオールモノシドの１つまたは両方、または、ルブソシドがフィードストックとして用いられた場合にはレバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＭを蓄積できる。
別の態様において、組み換え微生物は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＭを生産するためにルブソシドを含有する培地を用いて増殖させられる。かかる態様において、微生物は、機能的なＥＵＧＴ１１、機能的なＵＧＴ７６Ｇ１および機能的なＵＧＴ９１Ｄ２をコードする遺伝子を含有および発現し、ルブソシドがフィードストックとして用いられる場合にはレバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＭを生産できる。
別の態様において、組み換え微生物は、ステビオール生合成に関与する１つまたは２つ以上の遺伝子、例えばＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子および／またはＫＡＨ遺伝子を発現する。すなわち、例えば、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子をＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１および任意に機能的なＵＧＴ９１Ｄ２（例えばＵＧＴ９１Ｄ２ｅ）に加えて含有する微生物は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＭを生産できるが、培養培地にステビオールを含ませる必要がない。別の例では、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子をＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１および任意に機能的なＵＧＴ９１Ｄ２（例えばＵＧＴ９１Ｄ２ｅ）に加えて含有する微生物は、レバウジオシドＡを生産できるが、培養培地にステビオールを含ませる必要がない。さらに別の例では、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子をＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、および任意に機能的なＵＧＴ９１Ｄ２（例えばＵＧＴ９１Ｄ２ｅ）に加えて含有する微生物は、レバウジオシドＢを生産できるが、培養培地にステビオールを含ませる必要がない。
いくつかの態様において、組み換え宿主は、ステビオール生合成経路の増大したフラックスのためのジテルペン前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸の増大したレベルを提供するために、組み換えＧＧＰＰＳ遺伝子をさらに含有および発現する。
いくつかの態様において、組み換え宿主は、ゲラニルゲラニル二リン酸、ｅｎｔ−カウレン酸またはファルネシルピロリン酸を消費する非ステビオール経路の発現をサイレンシングするための構築物をさらに含有し、それによってステビオールおよびステビオールグリコシドの生合成経路の増大したフラックスを提供する。例えば、エルゴステロールなどのステロール生産経路へのフラックスはＥＲＧ９遺伝子の下方制御によって減少し得る。下記の項Ｃ．４参照。ジベレリンを生産する細胞では、ジベレリン合成が下方制御されて、ｅｎｔ−カウレン酸からステビオールへのフラックスを増大させ得る。カロテノイド生産生物では、ステビオールへのフラックスは１つまたは２つ以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方制御によって増大し得る。いくつかの態様において、組み換え微生物は、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の生産に関与する組み換え遺伝子、例えばＭＥＰもしくはＭＥＶ）経路の遺伝子をさらに発現でき、減少したホスファターゼ活性を有し、および／または、ＳＵＳを発現する。
当業者には当然のことながら、種々のＵＧＴ遺伝子の相対的な発現レベルを調整することによって、組み換え宿主は所望の割合でステビオールグリコシド産物を特異的に生産するように仕立てられ得る。ステビオール生合成遺伝子およびステビオールグリコシド生合成遺伝子の転写制御は、当業者にとって公知の技術を用いて、転写の活性化および抑制の組み合わせによって達成され得る。インビトロ反応に関して当業者にとっては当然のことながら、組み合わせた種々のレベルのＵＧＴ酵素の添加または組み合わせた種々のＵＧＴの相対的な活性に影響する条件下での添加は、各ステビオールグリコシドの所望の割合に向けて合成を導くであろう。当業者には当然のことながら、レバウジオシドＤもしくはＥのより高い割合またはレバウジオシドＤまたはＥへのより効率的な変換は、１３−Ｏ−グルコシド反応（基質はレバウジオシドＡおよびステビオシド）と比較して１９−Ｏ−グルコシド反応により高い活性を有するジグリコシル化酵素によって得られる。
いくつかの態様において、微生物などの組み換え宿主が、レバウジオシドＤが濃縮されたステビオールグリコシド組成物を生産し、これは少なくとも３重量％レバウジオシドＤを超える全ステビオールグリコシド、例えば、少なくとも４％のレバウジオシドＤ、少なくとも５％のレバウジオシドＤ、１０〜２０％のレバウジオシドＤ、２０〜３０％のレバウジオシドＤ、３０〜４０％のレバウジオシドＤ、４０〜５０％のレバウジオシドＤ、５０〜６０％のレバウジオシドＤ、６０〜７０％のレバウジオシドＤ、７０〜８０％のレバウジオシドＤを有する。
いくつかの態様において、微生物などの組み換え宿主が、少なくとも９０％のレバウジオシドＤ、例えば９０〜９９％のレバウジオシドＤを有するステビオールグリコシド組成物を生産する。存在する他のステビオールグリコシドはステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥおよびステビオシドを含み得る。いくつかの態様において、宿主（例えば微生物）によって生産されたレバウジオシドＤが濃縮された組成物はさらに精製され得、精製されたレバウジオシドＤまたはレバウジオシドＥは他のステビオールグリコシド、香味料または甘味料と混合されて、所望の味付けシステムまたは甘味組成物を得ることができる。例えば、組み換え宿主によって生産されたレバウジオシドＤが濃縮された組成物は、別の組み換え宿主によって生産されたレバウジオシドＡもしくはＦが濃縮された組成物と、ステビア抽出物から精製されたレバウジオシドＡもしくはＦと、またはインビトロで生産されたレバウジオシドＡもしくはＦと、組み合わせられる。
いくつかの態様において、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥおよび／またはレバウジオシドＭは、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドなどの前駆体分子（植物抽出物由来のステビオールグリコシドの混合物を含む）を含有する原料を添加された生組み換え細胞を用いて生産され得る。これらの組み換え細胞はＵＧＴポリペプチドの全てまたは適切な組み合わせを発現して、そのステビオールから特定のグルコシル化レバウジオシドのそれぞれへのグルコシル化を実現する。いくつかの態様において、組み換え細胞は任意に輸送体を発現し、それによって透過処理剤が添加される必要なくレバウジオシドを効率的に排出し得る。原料は細胞増殖中または細胞増殖後に添加され得る。生細胞は懸濁液としてまたは固定化されてあり得る。生細胞は、ビーズ（例えばアルギン酸カルシウムまたはナトリウムビーズ）によって捕捉され得る。生細胞は中空糸管型反応器システムにつながれ得る。生細胞は濃縮され、膜反応器システムによって捕捉され得る。生細胞は発酵培養液中または反応緩衝液中にあり得る。いくつかの態様において、細胞内への基質の効率的な移動のために透過処理剤が用いられる。いくつかの態様において、細胞は、トルエンなどの溶剤によってまたはTriton-XもしくはTweenなどの界面活性剤によって透過処理される。
いくつかの態様において、細胞は、界面活性剤（例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤）によって透過処理される。いくつかの態様において、細胞は、周期的な機械的衝撃（例えばエレクトロポレーションまたは軽い浸透圧ショック）によって透過処理される。細胞は１つの組み換えＵＧＴまたは複数の組み換えＵＧＴを含有し得る。例えば、細胞がＵＧＴ７６Ｇ１およびＥＵＧＴ１１を含有して、それによってステビオシドとＲｅｂＡとの混合物がＲｅｂＤに効率的に変換され得る。いくつかの態様において、生細胞は項ＩＩＩＡに記載の宿主細胞である。いくつかの態様において、生細胞はE.coliなどのグラム陰性細菌である。いくつかの態様において、生細胞はBacillusなどのグラム陽性細菌である。いくつかの態様において、生細胞はAspergillusなどの真菌種またはSaccharomycesなどの酵母である。いくつかの態様において、用語「生細胞の生体触媒」は、生細胞が上記（例えば培地中にあって任意に透過処理される）のように増殖させられ、ｒｅｂＡまたはステビオシドなどの基質が提供され、細胞の酵素を用いて最終産物に変換されるプロセスを指すために用いられる。細胞は生存可能であってもなくてもあり得、生体内変換反応中に増殖してもしなくてもあり得る。対照的に、発酵では、細胞は増殖培地によって培養されてグルコースなどの炭素およびエネルギー源を添加され、最終産物は生細胞によって生産される。
Ｃ．他のポリペプチド
その発現がステビオールまたはステビオールグリコシドのより効率的またはより大規模な生産を容易にするさらなるポリペプチドの遺伝子も、組み換え宿主内に導入され得る。例えば、組み換え微生物は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ。ＧＧＤＰＳとも呼ばれる）をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子も含有し得る。別の例としては、組み換え宿主は、ラムノースシンテターゼをコードする１つまたは２つ以上の遺伝子またはＵＤＰ−グルコースデヒドロゲナーゼおよび／もしくはＵＤＰ−グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする１つまたは２つ以上の遺伝子を有し得る。別の例として、組み換え宿主は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子をも有し得る。組み換えＣＰＲの発現は、ＮＡＤＰ＋の回転を容易にして、ＮＡＤＰＨ（これはテルペノイド生合成のコファクターとして利用される）を再生する。ＮＡＤＨＰレベルを再生するためには他の方法も用いられ得る。ＮＡＤＰＨが制限要因となる状況では、株は外来性のトランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含むようにさらに改変され得る。例えばSauer et al. J. Biol. Chem. 279: 6613-6619 (2004) 参照。所望のコファクターレベルが増大するようにＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの比を減少させるまたは改変するための他の方法は、当業者にとって公知である。
別の例として、組み換え宿主は、ＭＥＰ経路またはメバロン酸経路の１つまたは２つ以上の酵素をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子を有し得る。かかる遺伝子は、ジテルペン生合成経路への炭素フラックスを増大させ、経路によって生成されるイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸からゲラニルゲラニル二リン酸を生産できるので有用である。このように生産されたゲラニルゲラニル二リン酸は、ステビオール生合成ポリペプチドおよびステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの発現によって、ステビオールおよびステビオールグリコシドの生合成に向けられ得る。
別の例として、組み換え宿主はスクロースシンターゼをコードする１つまたは２つ以上の遺伝子を有し得、さらに必要ならばスクロース取り込み遺伝子を有し得る。スクロースシンターゼ反応は、発酵宿主または生細胞のバイオコンバージョンプロセスのＵＤＰ−グルコースプールを増大させるために用いられ得る。これはグリコシル化中に生じたＵＤＰとスクロースとからＵＤＰ−グルコースを再生し、効率的なグリコシル化を可能にする。一部の生物では、内在性のインベルターゼの破壊はスクロースの分解を防ぐために有利である。例えば、S.cerevisiae ＳＵＣ２インベルターゼが破壊され得る。スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）は任意の適当な生物由来であり得る。例えば、限定なしに、Arabidopsis thaliana、Stevia rebaudianaまたはCoffea arabica由来のスクロースシンターゼのコード配列が、好適なプロモーターの制御下にある発現プラスミド中にクローニングされて、微生物によって発現され得る。スクロースシンターゼは、かかる株によって、スクロース輸送体（例えばA.thaliana ＳＵＣ１輸送体またはその機能的なホモログ）および１つまたは２つ以上のＵＧＴ（例えばＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＥＵＧＴ１１またはそれらの機能的なホモログの１つまたは２つ以上）と組み合わせて発現され得る。スクロースを含有する培地によって宿主を培養することは、ＵＤＰ−グルコースおよび１つまたは２つ以上のグルコシド（例えばステビオールグリコシド）の生産を促進し得る。
スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）をコードするＥＲＧ９遺伝子の発現が組み換え宿主内にあって減らされて、組み換え宿主内でスクアレンシンターゼの前駆体の増加が起こるようにもできる。ＳＱＳはEC2.5.1.21に分類され、ステロールの生産をもたらす生合成経路の第１段階の酵素である。ファルネシルピロリン酸から中間体のプレスクアレンピロリン酸を経るスクアレンの合成を触媒する。この酵素はテルペノイド／イソプレノイドの生合成の重要な分岐点酵素であり、ステロール経路のイソプレン中間体のフラックスを制御すると考えられている。この酵素は場合によってはファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＤＦＴ１）と呼ばれる。ＳＱＳの機構は、ファルネシルピロリン酸の２つのユニットをスクアレンに変換することである。ＳＱＳは真核生物または高等生物の酵素であると考えられる。ただし、少なくとも１つの原核生物は機能的に類似の酵素を有することが示されている。
その不活性化によってステビオールまたはステビオールグリコシドのより効率的またはより大規模な生産を容易にするポリペプチドの遺伝子が、組み換え宿主内にあって改変され得る。例えば、ホスファターゼ（例えば、ＤＰＰ１遺伝子によってコードされる酵母ジアシルグリセロールピロリン酸ホスファターゼおよび／またはＬＰＰ１遺伝子によってコードされる酵母脂質リン酸ホスファターゼ）をコードする内在性の遺伝子が不活性化されて、その結果としてファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からファルネソールへの分解が減少し、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ））からゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）への分解が減少し得る。かかる遺伝子は、相同組み換え、変異導入、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの公知技術によって不活性化または発現を減少させられ得る。
Ｃ．１．ＭＥＰ生合成ポリペプチド
いくつかの態様において、組み換え宿主は、イソプレノイド生合成のためにメチルエリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）経路に含まれる酵素をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子を含有する。ＭＥＰ経路の酵素は、デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ（ＣＭＳ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）および１−ヒドロキシ−２−メチル−２（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）を含む。１つまたは２つ以上のＤＸＳ遺伝子、ＤＸＲ遺伝子、ＣＭＳ遺伝子、ＣＭＫ遺伝子、ＭＣＳ遺伝子、ＨＤＳ遺伝子および／またはＨＤＲ遺伝子が組み換え微生物内に組み込まれ得る。Rodriguez-Concepcion and Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002) 参照。
ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＣＭＳ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＳおよび／またはＨＤＲポリペプチドをコードする好適な遺伝子は、E.coli、Arabidopsis thaliana、およびSynechococcus leopoliensisによって作られるものを含む。ＤＸＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば米国特許第7,335,815号に記載されている。
Ｃ．２．メバロン酸生合成ポリペプチド
いくつかの態様において、組み換え宿主は、イソプレノイド生合成のためにメバロン酸経路に含まれる酵素をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子を含有する。宿主の形質転換に適した遺伝子は、メバロン酸経路の酵素、例えば末端欠失３−ヒドロキシ−３−メチル-グルタリル（ＨＭＧ）−ＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧ）、および／またはメバロン酸キナーゼ（ＭＫ）をコードする遺伝子、および／またはホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする遺伝子、および／またはメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＰＰＤ）をコードする遺伝子をコードする。したがって、１つまたは２つ以上のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、ＭＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子、および／またはＭＰＰＤ遺伝子が微生物などの組み換え宿主内に取り込まれ得る。
メバロン酸経路ポリペプチドをコードする好適な遺伝子は公知である。例えば、好適なポリペプチドは、E.coli、Paracoccus denitrificans、Saccharomyces cerevisiae、Arabidopsis thaliana、Kitasatospora griseola、Homo sapiens、Drosophila melanogaster、Gallus gallus、Streptomyces sp. KO-3988、Nicotiana attenuata、Kitasatospora griseola、Hevea brasiliensis、Enterococcus faeciumおよびHaematococcus pluvialisによって作られるものを含む。例えば、表９、米国特許第7,183,089号、5,460,949号および5,306,862号ならびにＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号およびPCT/US2011/038967号（これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。
Ｃ．３．スクロースシンターゼポリペプチド
スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）は、ＵＤＰ−糖を生成するためのツールとして用いられ得る。ＳＵＳ（EC2.4.1.13）は、ＵＤＰ−グルコースおよび果糖のスクロースおよびＵＤＰからの生成を触媒する。そのようにしてＵＧＴの反応によって生成したＵＤＰは、スクロース存在下においてＵＤＰ−グルコースに変換され得る。例えば、Chen et al. (2001) J. Am. Chem. Soc. 123:8866-8867、Shao et al. (2003) Appl. Env. Microbiol. 69:5238-5242、Masada et al. (2007) FEBS Lett. 581: 2562-2566およびSon et al. (2009) J. Microbiol. Biotechnol. 19:709-712参照。
スクロースシンターゼはＵＤＰ−グルコースを生成およびＵＤＰを除去するために用いられ得、種々の系において化合物の効率的なグリコシル化を容易にする。例えば、スクロース輸送体およびＳＵＳを導入することによって、スクロースを利用する能力を欠く酵母がスクロースを利用して増殖するようにできる。例えばSaccharomyces cerevisiaeは効率的なスクロース取り込み系を有さず、スクロースを利用するには細胞外のＳＵＣ２に依存している。内在性のS.cerevisiae ＳＵＣ２インベルターゼを破壊することと組み換えＳＵＳを発現することとの組み合わせは、細胞内のスクロースを代謝できるが細胞外のものは代謝できない酵母株をもたらした（Riesmeier et al. ((1992) EMBO J. 11 :4705-4713）。この株は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーによる形質転換とスクロースを取り込む能力を獲得した形質転換体の選抜とによってスクロース輸送体を単離するために用いられた。
組み換えスクロースシンターゼとスクロース輸送体とのインビボにおける共発現は、増大したＵＤＰ−グルコース利用可能性と望ましくないＵＤＰの除去とをもたらし得る。例えば、組み換えスクロースシンターゼ、スクロース輸送体、およびグリコシルトランスフェラーゼの機能的な発現は、天然のスクロース分解系（S.cerevisiaeの場合はＳＵＣ２）のノックアウトと組み合わされると、増大した量のグリコシル化化合物（ステビオールグリコシドなど）を生産できる細胞を作製するために用いられ得る。このより高いグリコシル化能は、少なくとも（ａ）ＵＤＰ−グルコースをよりエネルギー効率良く生産するためのより高い能力と、（ｂ）増殖培地からのＵＤＰの除去と（ＵＤＰはグリコシル化反応を阻害し得るため）に帰せられる。
スクロースシンターゼはあらゆる好適な生物に由来し得る。例えば限定なしに、Arabidopsis thaliana（例えば配列番号７８または７９）またはCoffea arabica（例えば配列番号８０）由来のスクロースシンターゼのコード配列（例えばPCT/US2012/050021の配列番号１７８、１７９および１８０参照）が、好適なプロモーターの制御下にある発現プラスミドにクローニングされて、宿主（例えば微生物または植物）によって発現され得る。ＳＵＳコード配列はＳＵＣ２（スクロース加水分解酵素）欠損S.cerevisiae株によって発現されて、酵母による細胞外のスクロースの分解を回避し得る。スクロースシンターゼは、かかる株によって、スクロース輸送体（例えば、A.thaliana ＳＵＣ１輸送体またはその機能的なホモログ）および１つまたは２つ以上のＵＧＴ（例えばＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅまたはそれらの機能的なホモログの１つまたは２つ以上）と組み合わせて発現され得る。スクロースを含有する培地によって宿主を培養することは、ＵＤＰ−グルコースおよび１つまたは２つ以上のグルコシド（例えばステビオールグルコシド）の生産を促進し得る。尚、場合によっては、スクロースシンターゼおよびスクロース輸送体が、特定の化合物（例えばステビオール）の生産用の組み換え体である宿主細胞によってＵＧＴと一緒に発現され得る。
Ｃ．４．スクアレンシンターゼポリペプチド
内在性のスクアレンシンターゼ遺伝子の発現は、本明細書に記載の組み換え宿主内にあって改変され得、例えば、スクアレンシンターゼをコードする遺伝子のプロモーターまたはスクアレンシンターゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端のゲノム配列の一部に対してそれぞれ相同な、２つの領域を含有する核酸構築物を用いる。酵母では、例えば、かかる構築物は、ＥＲＧ９プロモーターまたはＥＲＧ９オープンリーディングフレームの５’末端のゲノム配列の一部に対してそれぞれ相同な２つの領域を含有し得る。構築物は、酵母の野生型ＳｃＫｅｘ２または野生型ＳｃＣｙｃ１などのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、その３’末端にヘアピンなどの異種挿入物をさらに含み得る。ＯＲＦによってコードされるポリペプチドは、少なくとも７０％の同一性をスクアレンシンターゼ（EC2.5.1.21）またはその生物活性断片に対して有し、この断片は少なくとも１００アミノ酸の重ね合わせの範囲において少なくとも７０％の配列同一性をスクアレンシンターゼに対して有する。例えばPCT/US2012/050021参照。
異種挿入物は、ヘアピンループを有するヘアピンの２次構造エレメントを適用し得る。異種挿入物の配列は一般式（Ｉ）：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
を有する。
Ｘ２は少なくとも４個の連続したヌクレオチドを含み、これはＸ４の少なくとも４個の連続したヌクレオチドに対して相補的であり、Ｘ４と一緒になってヘアピン２次構造エレメントを形成する。Ｘ３は任意であるが、存在する場合には、Ｘ２とＸ４との間にヘアピンループを形成することに関与するヌクレオチドを含む。
Ｘ１およびＸ５は、それぞれ任意に１つまたは２つ以上のヌクレオチドを含む。Ｘ２の少なくとも４ヌクレオチドの連続した配列がＸ４の少なくとも４ヌクレオチドの連続した配列に対して相補的である限り、Ｘ２およびＸ４はそれぞれいずれか好適な個数のヌクレオチドからなり得る。いくつかの態様において、Ｘ２およびＸ４は同数のヌクレオチドからなる。
異種挿入物は、ヘアピンを完成させるに足りるほど長いが、異種挿入物の直ぐ３’側にインフレームで存在するＯＲＦの限定的な翻訳を可能にするに足りるほど短い。通常は、異種挿入物は、長さ１０〜５０ヌクレオチド、例えば長さ１０〜３０ヌクレオチド、１５〜２５ヌクレオチド、１７〜２２ヌクレオチド、１８〜２１ヌクレオチド、１８〜２０ヌクレオチドまたは１９ヌクレオチドである。
Ｘ２は例えば４〜２５ヌクレオチドの範囲、例えば４〜２０、４〜１５、６〜１２、８〜１２または９〜１１ヌクレオチドの範囲からなり得る。
Ｘ４は、例えば４〜２５ヌクレオチドの範囲、例えば４〜２０、４〜１５、６〜１２、８〜１２または９〜１１ヌクレオチドの範囲からなり得る。
いくつかの態様において、Ｘ２は、Ｘ４のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなり、Ｘ２の全ヌクレオチドはＸ４のヌクレオチド配列に対して相補的である。
Ｘ３は不在であり得る。すなわちＸ３は０個のヌクレオチドからなり得る。Ｘ３が１〜５ヌクレオチドの範囲、例えば１〜３ヌクレオチドの範囲からなることも可能である。
Ｘ１は不在であり得る。すなわちＸ１は０個のヌクレオチドからなり得る。Ｘ１が１〜２５ヌクレオチドの範囲、例えば１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５または１〜３ヌクレオチドの範囲からなることも可能である。
Ｘ５は不在であり得る。すなわち、Ｘ５は０個のヌクレオチドからなり得る。Ｘ５が１〜５ヌクレオチドの範囲、例えば１〜３ヌクレオチドの範囲からなることも可能である。
異種挿入物は、本明細書に記載の要件を満たす任意の適当な配列であり得る。例えば、異種挿入物はｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａｔｔｃ（配列番号８１）、ｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａｃｔｃ（配列番号８２）、ｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａｇｔｃ（配列番号８３）またはｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａａｔｔ（配列番号８４）を含み得る。
特定の機序に拘束されるものではないが、酵母によるＥＲＧ９の発現は、ＲＮＡとリボソームとの結合を少なくとも部分的に立体的に妨害して、スクアレンシンターゼの翻訳を減少させることによって減らされ得る。構築物を用いることは、ファルネシルピロリン酸からスクアレンへの回転率を下げ得、ならびに／またはファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸からなる群から選択される化合物の蓄積を増強し得る。
場合によっては、本明細書に記載の組み換え宿主を培養時にスクアレンシンターゼ阻害剤を含むことが有利であり得る。例えばラパキスタットによるスクアレンシンターゼの薬物的阻害は当分野では公知である。他のスクアレンシンターゼ阻害剤はザラゴジン酸およびＲＰＲ１０７３９３を含む。したがって一態様において、本明細書に定められる方法（単数または複数）の培養ステップはスクアレンシンターゼ阻害剤の存在下において実施される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え酵母宿主はＥＲＧ９オープンリーディングフレームに変異を有する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の組み換え酵母宿主はＥＲＧ９［Δ］：：ＨＩＳ３欠失／挿入アレルを含有する。
Ｄ．機能的なホモログ
本明細書に記載のポリペプチドの機能的なホモログも、組み換え宿主によってステビオールまたはステビオールグリコシドを生産する際の使用に好適である。機能的なホモログは、参照ポリペプチドに対する配列類似性を有し、且つ参照ポリペプチドの生化学的または生理的機能（単数または複数）の１つまたは２つ以上を果たすポリペプチドである。機能的なホモログおよび参照ポリペプチドは天然に存在するポリペプチドであり得、配列類似性は収斂または分岐進化イベントに起因し得る。したがって、機能的なホモログは、文献中、ホモログもしくはオルソログまたはパラログと呼ばれることもある。天然に存在する機能的なホモログのバリアント（例えば、野生型のコード配列の変異体によってコードされるポリペプチド）は、それら自体が機能的なホモログとなり得る。機能的なホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異導入によって、または異なる天然に存在するポリペプチド同士のコード配列に由来するドメインを組み合わせることによって、作製され得る（「ドメインスワッピング」）。本明細書に記載の機能的なＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は公知であり、特に指向性進化技術、部位特異的変異導入技術およびランダム変異導入技術を含み、望ましくポリペプチドの特異的活性を増大させる、基質特異性を改変する、発現レベルを改変する、細胞内局在部位を改変する、または、ポリペプチド間相互作用を改変する、ために有用であり得る。かかる改変ポリペプチドは機能的なホモログと考えられる。用語「機能的なホモログ」は場合によっては機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
機能的なホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列アラインメントの分析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドあるいはポリペプチド配列のデータベース上でクエリーを行うことは、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドあるいは輸送体遺伝子もしくは蛋白質または少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子もしくは蛋白質のホモログを同定できる。配列解析は非冗長データベースのBLAST、Reciprocal BLASTまたはPSI-BLAST解析を含み、ＧＧＰＰＳ、ＣＤＰＳ、ＫＳ、ＫＯ、ＫＡＨまたは輸送体もしくは転写因子のアミノ酸配列を参照配列として用い得る。アミノ酸配列は場合によってヌクレオチド配列から推測される。４０％超の配列同一性を有するデータベースのポリペプチドは、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの機能的なホモログとしてまたは輸送体蛋白質もしくは少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子の機能的なホモログとしての適性について、さらなる検討の候補となる。アミノ酸配列の類似性は、保存的アミノ酸置換、例えば１つの疎水性残基からもう１つの疎水性残基への置換または１つの極性残基からもう１つの極性残基への置換を可能にする。必要ならば、さらに検討されるべき候補数を絞り込むためにかかる候補のマニュアル検査が実施され得る。マニュアル検査は、ステビオール生合成ポリペプチドまたは輸送体蛋白質もしくは少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子の中に存在するドメイン（例えば保存された機能ドメイン）を有するように見える候補を選択することによって実施され得る。
保存された領域は、ステビオールもしくはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドまたは輸送体遺伝子もしくは少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子の１次アミノ酸配列中にあり、繰返し配列である、何らかの２次構造（例えばヘリックスおよびβシート）を形成する、正もしくは負荷電ドメインを示す、または、蛋白質モチーフもしくはドメインに相当する領域を位置づける、ことによって同定され得る。例えば、様々な蛋白質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を記載しているPfamウェブサイト参照（ワールドワイドウェブ上、sanger.ac.uk/Software/Pfam/およびpfam.janelia.org/）。Pfamデータベースに含まれる情報はSonnhammer et al. Nucl. Acids Res. 26: 320-322 (1998)、Sonnhammer et al. Proteins 28: 405-420 (1997)およびBateman et al. Nucl. Acids Res. 27: 260-262 (1999) に記載されている。保存された領域は、近縁種由来の同一または同族のポリペプチド同士の配列をアラインメントすることによっても確認され得る。近縁種は好ましくは同じ科であり得る。いくつかの態様において、２種類の種に由来する配列のアラインメントが十分である。
通常は、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチド同士は、保存された領域を同定するために有用である。同族のポリペプチドの保存された領域は少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの態様において、保存された領域は少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
例えば、組み換え宿主によってステビオールグリコシドを生産するのに好適なポリペプチドは、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ、ＵＧＴ８５ＣおよびＵＧＴ７６Ｇの機能的なホモログを含む。かかるホモログは、９０％超（例えば少なくとも９５％または９９％）の配列同一性を、ＰＣＴ出願第PCT/US2012/050021号に記載のＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ、ＵＧＴ８５ＣまたはＵＧＴ７６Ｇのアミノ酸配列に対して有する。ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ８５ＣおよびＵＧＴ７６Ｇポリペプチドのバリアントは、１次アミノ酸配列の１０個以下のアミノ酸置換、例えば７個以下のアミノ酸置換、５個もしくは保存的アミノ酸置換または１〜５個の置換を通常は有する。ただしいくつかの態様において、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ８５ＣおよびＵＧＴ７６Ｇポリペプチドのバリアントは１０個以上のアミノ酸置換（例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、１０〜２０、１０〜３５、２０〜３０または２５〜３５個のアミノ酸置換）を有し得る。置換は保存的であり得、いくつかの態様において非保存的であり得る。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドの非保存的な変化の限定しない例は、グリシンからアルギニンおよびトリプトファンからアルギニンを含む。ＵＧＴ７６Ｇポリペプチドの非保存的置換の限定しない例は、バリンからグルタミン酸、グリシンからグルタミン酸、グルタミンからアラニン、および、セリンからプロリンを含む。ＵＧＴ８５Ｃポリペプチドの変化の限定しない例は、ヒスチジンからアスパラギン酸、プロリンからセリン、リシンからトレオニン、および、トレオニンからアルギニンを含む。
いくつかの態様において、有用なＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、予測されるループの外側のポリペプチド領域にアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有し得る。例えば、残基２０〜２６、３９〜４３、８８〜９５、１２１〜１２４、１４２〜１５８、１８５〜１９８および２０３〜２１４はＮ末端ドメインの予測されるループであり、残基３８１〜３８６はＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号５４参照）のＣ末端ドメインの予測されるループである。例えば、有用なＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは少なくとも１つのアミノ酸置換を残基１〜１９、２７〜３８、４４〜８７、９６〜１２０、１２５〜１４１、１５９〜１８４、１９９〜２０２、２１５〜３８０または３８７〜４７３の位置に含み得る。いくつかの態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、残基３０、９３、９９、１２２、１４０、１４２、１４８、１５３、１５６、１９５、１９６、１９９、２０６、２０７、２１１、２２１、２８６、３４３、４２７および４３８からなる群から選択される１つまたは２つ以上の残基の位置にアミノ酸置換を有し得る。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２の機能的なホモログは、残基２０６、２０７および３４３の１つまたは２つ以上のアミノ酸置換、例えば残基２０６のアルギニン、残基２０７のシステインおよび残基３４３のアルギニンを有し得る。例えば配列番号８６参照。
ＵＧＴ９１Ｄ２の他の機能的なホモログは次の１つまたは２つ以上を有し得る：残基３０のチロシンまたはフェニルアラニン、残基９３のプロリンまたはグルタミン、残基９９のセリンまたはバリン、残基１２２のチロシンまたはフェニルアラニン、残基１４０のヒスチジンまたはチロシン、残基１４２のセリンまたはシステイン、残基１４８のアラニンまたはトレオニン、残基１５２のメチオニン、残基１５３のアラニン、残基１５６のアラニンまたはセリン、残基１６２のグリシン、残基１９５のロイシンまたはメチオニン、残基１９６のグルタミン酸、残基１９９のリシンまたはグルタミン酸、残基２１１のロイシンまたはメチオニン、残基２１３のロイシン、残基２２１のセリンまたはフェニルアラニン、残基２５３のバリンまたはイソロイシン、残基２８６のバリンまたはアラニン、残基４２７のリシンまたはアスパラギン、残基４３８のアラニン、および、残基４６２のアラニンまたはトレオニン。別の態様において、ＵＧＴ９１Ｄ２の機能的なホモログは、残基２１１のメチオニンおよび残基２８６のアラニンを含有する。
いくつかの態様において、有用なＵＧＴ８５Ｃホモログは１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を残基９、１０、１３、１５、２１、２７、６０、６５、７１、８７、９１、２２０、２４３、２７０、２８９、２９８、３３４、３３６、３５０、３６８、３８９、３９４、３９７、４１８、４２０、４４０、４４１、４４４および４７１に有し得る。有用なＵＧＴ８５Ｃホモログの限定しない例は、（配列番号３０に関して）残基６５（例えば残基６５の例えばセリン）、残基６５且つ残基１５（残基１５のロイシン）、２７０（例えば、残基２７０のメチオニン、アルギニンまたはアラニン）、４１８（例えば残基４１８のバリン）、４４０（例えば残基４４０の残基のアスパラギン酸）、または４４１（例えば残基４４１のアスパラギン）、残基１３（例えば残基１３のフェニルアラニン）、１５、６０（例えば残基６０のアスパラギン酸）、２７０、２８９（例えば残基２８９のヒスチジン）、および４１８の置換、残基１３、６０および２７０の置換、残基６０および８７の置換（例えば残基８７のフェニルアラニン）、残基６５、７１（例えば残基７１のグルタミン）、２２０（例えば残基２２０のトレオニン）、２４３（例えば残基２４３のトリプトファン）および２７０の置換、残基６５、７１、２２０、２４３、２７０および４４１の置換、残基６５、７１、２２０、３８９（例えば残基３８９のバリン）および３９４（例えば残基３９４のバリン）の置換、残基６５、７１、２７０および２８９の置換、残基２２０、２４３、２７０および３３４の置換（例えば残基３３４のセリン）あるいは残基２７０および２８９の置換、を有するポリペプチドを含む。次のアミノ酸変異は８５Ｃ２ポリペプチドの活性低下をもたらさなかった：Ｖ１３Ｆ、Ｆ１５Ｌ、Ｈ６０Ｄ、Ａ６５Ｓ、Ｅ７１Ｑ、Ｉ８７Ｆ、Ｋ２２０Ｔ、Ｒ２４３Ｗ、Ｔ２７０Ｍ、Ｔ２７０Ｒ、Ｑ２８９Ｈ、Ｌ３３４Ｓ、Ａ３８９Ｖ、Ｉ３９４Ｖ、Ｐ３９７Ｓ、Ｅ４１８Ｖ、Ｇ４４０ＤおよびＨ４４１Ｎ。活性なクローン中に見られたさらなる変異は、Ｋ９Ｅ、Ｋ１０Ｒ、Ｑ２１Ｈ、Ｍ２７Ｖ、Ｌ９１Ｐ、Ｙ２９８Ｃ、Ｋ３５０Ｔ、Ｈ３６８Ｒ、Ｇ４２０Ｒ、Ｌ４３１Ｐ、Ｒ４４４ＧおよびＭ４７１Ｔを含む。いくつかの態様において、ＵＧＴ８５Ｃ２は置換を位置６５（例えばセリン）、７１（グルタミン）、２７０（メチオニン）、２８９（ヒスチジン）および３８９（バリン）に有する。
ヒトＭＤＭ２蛋白質の最初の１５８アミノ酸のＮ末端インフレーム融合物を有するStevia rebaudiana ＵＧＴの７４Ｇ１、７６Ｇ１および９１Ｄ２ｅならびに合成ＰＭＩペプチドの４つの繰り返し（４×ＴＳＦＡＥＹＷＮＬＬＳＰ、配列番号８７）のＮ末端インフレーム融合物を有するStevia rebaudiana ＵＧＴ８５Ｃ２のアミノ酸配列は、配列番号８８、８９、９０および９１に示されている。
いくつかの態様において、有用なＵＧＴ７６Ｇホモログは、１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を配列番号８５の残基２９、７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、２９１、３３０、３３１および３４６の位置に有し得る。
有用なＵＧＴ７６Ｇホモログの限定しない例は、残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８および２９１、残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５および２９１、または、残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、２９１、３３０、３３１および３４６の位置に置換を有するポリペプチドを含む。表１０参照。
例えばＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅの基質特異性を改変するための方法は当業者にとって公知であり、限定なしに、部位特異的／合理的変異導入法、ランダム指向性進化法およびランダム変異導入／飽和技術が酵素の活性部位近辺において実施される組み合わせを含む。例えばOsmani et al. Phytochemistry 70: 325-347 (2009)を参照。
候補配列は、参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００％の長さを通常は有する。機能的なホモログポリペプチドは、参照配列の長さの９５％〜１０５％、例えば参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５もしくは１２０％またはその間の任意の範囲の長さを通常は有する。任意の候補核酸またはポリペプチドが参照核酸またはポリペプチドに対して示す同一性（％）は、次のように決められる。参照配列（例えば核酸配列またはアミノ酸配列）が、１つまたは２つ以上の候補配列に対して計算機プログラムClustalW（version 1.83、デフォルトのパラメータ）を用いてアラインメントされる。これは、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントがそれらの全長に渡って実行されることを可能にする（グローバルアラインメント）。Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003)。
ClustalWは、参照と１つまたは２つ以上の候補配列との間のベストマッチを計算してそれらをアラインメントする。その結果として同一性、類似性および差異が決定され得る。１つまたは２つ以上の残基のギャップが参照配列、候補配列または両方に挿入されて、配列アラインメントが最大化され得る。核酸配列の高速ペアワイズアラインメントには次のデフォルトパラメータが用いられる：word size：２、window size：４、scoring method：％、number of top diagonals：４、gap penalty：５。核酸配列のマルチプルアラインメントには次のパラメータが用いられる：gap opening penalty：１０．０、gap extension penalty：５．０、weight transitions：yes。蛋白質配列の高速ペアワイズアラインメントには、次のパラメータが用いられる：word size：１、window size：５、scoring method：％、number of top diagonals：５、gap penalty：３。蛋白質配列のマルチプルアラインメントには次のパラメータが用いられる：weight matrix：blosum、gap opening penalty：１０．０、gap extension penalty：０．０５、hydrophilic gaps：ｏｎ、hydrophilic residues：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＡｒｇおよびＬｙｓ、residue-specific gap penalties：ｏｎ。ClustalWの出力は、配列間の関係性を反映した配列アラインメントである。ClustalWは、例えばワールドワイドウェブのベイラー医科大学の検索ランチャーサイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）およびワールドワイドウェブの欧州バイオインフォマティクス研究所サイト（ebi.ac.uk/clustalw）において実行され得る。
候補の核酸またはアミノ酸配列が参照配列に対して示すパーセント同一性を求めるために、配列はClustalWを用いてアラインメントされ、アラインメント中の同一のマッチの個数が参照配列の長さによって除算され、結果は１００によって乗算される。尚、パーセント同一性の値は小数第１位に丸められ得る。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３および７８．１４は切り下げられて７８．１となるが、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９は切り上げられて７８．２となる。
当然のことながら、機能的なＵＧＴは、酵素が果たすグルコシル化または他の酵素活性には関与しないさらなるアミノ酸を含み得る。したがって、かかるポリペプチドはそうでない場合よりも長くなり得る。例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、精製タグ（例えばＨＩＳタグまたはＧＳＴタグ）、葉緑体トランジットペプチド、ミトコンドリアトランジットペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチドまたは排出タグをアミノまたはカルボキシ末端に付加されて含み得る。いくつかの態様において、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドがレポーター（例えば緑色蛍光蛋白質または黄色蛍光蛋白質）として働くアミノ酸配列を含む。
ＩＩ．ステビオールおよびステビオールグリコシドの生合成核酸
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、そのポリペプチドを発現するのに好適な１つまたは２つ以上の制御領域とセンスの向きに作動可能に連結されたそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物はポリシストロニックｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現できるので、複数のポリペプチドが必要に応じてそれらの微生物では１つの制御領域の制御下で発現され得る。コード配列および制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように制御領域およびコード配列が位置する場合に、作動可能に連結されていると見なされる。通常は、コード配列の翻訳の読み枠の翻訳開始部位はモノシストロニック遺伝子の制御領域の１〜約５０ヌクレオチド下流に位置する。
多くの場合には、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は組み換え宿主以外の種において見出され、すなわち異種核酸である。したがって、組み換え宿主が微生物である場合、コード配列は他の原核もしくは真核微生物由来、植物由来または動物由来であり得る。しかしながら場合によっては、コード配列は宿主にとって天然の配列であり、その生物内に再導入される。天然の配列は、外来性の核酸に連結された非天然配列（例えば、組み換え核酸構築物中の天然の配列の外側にある非天然の制御配列）の存在によって、天然に存在する配列から多くの場合に判別され得る。さらに、安定に形質転換された外来性の核酸は、天然の配列が見出される位置以外の位置に通常はインテグレートされる。「制御領域」は、転写または翻訳の開始および速度ならびに転写または翻訳の産物の安定性および／または移動性に影響するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。
制御領域は、限定なしに、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、蛋白質認識部位、誘導性エレメント、蛋白質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロンならびにそれらの組み合わせを含む。制御領域は少なくともコア（基本）プロモーターを通常は含む。制御領域は、少なくとも１つの調節エレメント、例えばエンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）も含み得る。制御領域は、制御領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように制御領域およびコード配列を配置することによって、コード配列と作動可能に連結される。例えば、コード配列とプロモーター配列とを作動可能に連結するためには、コード配列の翻訳の読み枠の翻訳開始部位はプロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に通常は位置する。しかしながら、制御領域は翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドも上流に、または、転写開始部位の約２，０００ヌクレオチドも上流に位置し得る。
含まれるべき制御領域の選択はいくつかの因子によって左右され、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベルおよび特定の培養ステージにおける優先的発現を含むが、これらに限定されない。コード配列に対して制御領域を適切に選択および配置することによってコード配列の発現を調節することは、当業者にとって慣行である。当然のことながら、複数の制御領域、例えばイントロン、エンハンサー、上流の活性化領域、転写ターミネーターおよび誘導性エレメントが存在し得る。
ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドの生産の特定の局面にとって有用な「モジュール」として、１つの組み換え核酸構築物の中に１つまたは２つ以上の遺伝子が組み合わされ得る。複数の遺伝子を組み合わせてモジュール、特にポリシストロニックなモジュールとすることは、様々な種へのモジュールの使用を容易にする。例えば、ステビオール生合成遺伝子クラスターまたはＵＧＴ遺伝子クラスターが組み合わされて１つのポリシストロニックなモジュールとなり、その結果として、好適な制御領域の挿入後にモジュールが様々な種に導入されるようにできる。別の例として、各ＵＧＴコード配列が別の制御領域と作動可能に連結されてＵＧＴモジュールを生ずるように、ＵＧＴ遺伝子クラスターが組み合わされ得る。かかるモジュールは、モノシストロニックな発現が必要であるまたは望ましい種に用いられ得る。ステビオールまたはステビオールグリコシドの生産にとって有用な遺伝子に加えて、組み換え構築物は、複製起点と適切な種による構築物の維持のための１つまたは２つ以上の選択マーカーとを通常はさらに含有している。
当然のことながら、遺伝暗号の縮重性ゆえに、複数の核酸が１つの特定のポリペプチドをコードし得る。すなわち、多くのアミノ酸ではそのアミノ酸のコドンとして働く複数のヌクレオチドトリプレットが存在している。したがって所与のポリペプチドのコード配列中のコドンは、特定の宿主による最適な発現が得られるように、その宿主（例えば微生物）の適切なコドンバイアス表を用いて改変され得る。単離された核酸として、それらの改変配列は精製された分子として存在し得、ベクターまたはウィルス中に取り込まれて組み換え核酸構築物用のモジュールを構築するために用いられ得る。
場合によっては、代謝中間体をステビオールまたはステビオールグリコシド生合成に向けるために、内在性のポリペプチドの１つまたは２つ以上の機能を阻害することが望ましい。例えば、スクアレンエポキシダーゼの下方制御によって、ステビオールまたはステビオールグリコシドの生産をさらに増大させるために、酵母株によるステロールの合成を下方制御することが望ましくあり得る。別の例として、一部の内在性の遺伝子産物の分解作用（例えば、２次代謝産物のグルコース部分を除去するグリコヒドロラーゼまたは本明細書に記載のホスファターゼ）を阻害することが望ましくあり得る。別の例として、ステビオールグリコシドの輸送に関与する膜輸送体の発現が阻害されて、それによってグリコシル化ステビオシドの排出が阻害され得る。ステビオールグリコシドの排出が微生物の培養中に所望の期間阻害され、それによって回収時のグリコシド産物（単数または複数）の収量を増大させ得るという点で、かかる制御は有利であり得る。かかる場合には、ポリペプチドまたは遺伝子産物の発現を阻害する核酸が、株に形質転換される組み換え構築物中に含まれ得る。または変異導入が用いられて、機能を阻害することが望まれる遺伝子の変異体を作製し得る。
ＩＩＩ．輸送体の発現
本願は、内在性の輸送体遺伝子の発現が改変されたまたは異種輸送体遺伝子が発現された組み換え宿主細胞に関する。いくつかの態様において、内在性のプロモーターを異なるプロモーターによって置換することによって内在性の輸送体の発現が改変されて、輸送体蛋白質の増大した発現をもたらし得る（例えば発現の少なくとも５％の増大、例えば発現の少なくとも１０％、１５％、２０％または２５％の増大）。例えば、内在性のプロモーターが構成的または誘導性プロモーターによって置換されて、これが輸送体の増大した発現をもたらし得る。輸送体の増大した発現をもたらす別のプロモーターによって内在性の遺伝子のプロモーターを置換するために、相同組み換えが用いられ得る。別の態様において、誘導性または構成的プロモーターと内在性の輸送体または転写因子遺伝子とが、相同組み換えを用いてゲノムの異なる遺伝子座にインテグレーションされ得る。別の態様において、微生物による輸送体の過剰発現をもたらすプロモーターを有する外来性のプラスミドを用いて、微生物内に輸送体遺伝子が導入され得る。さらに別の態様において、外来性のプラスミドは輸送体遺伝子の複数コピーを含有し得る。さらなる態様において、内在性の輸送体は、組み換え微生物の天然の機構を用いて過剰発現されるように誘導され得る（例えば熱ショック、ストレス、重金属または抗生物質の曝露）。例えば、オリゴマイシンおよび／またはカドミウムが培養培地に添加されて（ＹＯＲ１の発現がこれらの分子によって誘導され得る）、ＹＯＲ１の発現を増大させ、それによってステビオールグリコシドの排出を増大させ得る。例えば、Hallstrom & Moye-Rowley (1998) JBC 273(4): 2098-104、Nagy et al, (2006) Biochimie. 88(11): 1665-71およびKatzmann et al., (1995) Mol Cell Biol. 15(12):6875-83を参照。
本明細書に記載のように、一部の内在性の輸送体の発現を増大させることまたは組み換え宿主によって異種輸送体を発現すること（例えば、S.cerevisiaeなどの微生物によってS.rebaudiana輸送体を発現すること）は、ステビオールグリコシドをより効率的に生産および分泌する能力をその宿主に与え得る。宿主の培養時に生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシドの量は、本明細書に記載のように液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって測定され得る。
輸送体（膜輸送蛋白質とも呼ばれる）は、生体膜を横切る分子およびイオンの移動に関与する膜蛋白質である。輸送体は、それ自体が局在して物質を通過させる膜にまたがっている。輸送体は、促進された拡散によってまたは能動輸送によって種々の物質を移動するように働き得る。輸送蛋白質は輸送体分類データベースの種々の基準に従って分類されている。Saier Jr. et al., Nucl. Acids Res., 37:D274-278 (2009) を参照。形質膜輸送体の２つのファミリーは現存する生物において普遍的だと考えられている。ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体およびMajor Facilitatorスーパーファミリー（ＭＦＳ）輸送体である。ＡＴＰ結合カセット輸送体（ＡＢＣ輸送体）は膜貫通蛋白質であり、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解エネルギーを利用して、膜を通して種々の基質のトランスロケーションを行う。これらは、様々な基質（代謝産物、脂質およびステロールならびに薬物を含む）を細胞外および細胞内の膜を通して輸送できる。蛋白質はそれらのＡＴＰ結合カセットドメインの配列および構成に基づいてＡＢＣ輸送体に分類される。通常は、ＡＢＣファミリー輸送体は多成分１次性能動輸送体であり、ＡＴＰ加水分解に応答して分子を輸送できる。内在性のＡＢＣ輸送体遺伝子の限定しない例は、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１、ＹＯＬ０７５ｃおよびＰＤＲ１８の遺伝子（またはその機能的なホモログ）を含む。
Major Facilitatorスーパーファミリー（ＭＦＳ）輸送体は、化学浸透イオン勾配に応じて小さい溶質を輸送できるポリペプチドである。Saier, Jr. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1: 257-279 (1999)。ＭＦＳ輸送体ファミリーは場合によっては単輸送体−共輸送体−対向輸送体ファミリーとも呼ばれる。ＭＦＳ輸送体は特に糖の取り込みおよび薬物排出系で働く。ＭＦＳ輸送体は保存されたＭＦＳ特異的モチーフを通常は有する。内在性のＭＦＳ輸送体遺伝子の限定しない例は、ＴＰＯ１、ＴＰＯ３およびＦＬＲ１遺伝子座の遺伝子（またはその機能的なホモログ）を含む。
他の輸送体ファミリーは、ＳＭＲ（小型の多剤耐性）ファミリー、ＲＮＤ（耐性−根粒形成−細胞分裂）ファミリーおよびＭＡＴＥ（多剤・毒性化合物排出）ファミリーを含む。ＳＭＲファミリーのメンバーは４つのαヘリックスの膜貫通鎖を特徴とする内在性膜蛋白質であり、広範な殺菌剤、親油性第４級アンモニウム化合物（ＱＡＣ）およびアミノグリコシド耐性に対する細菌の耐性をもたらす。Bay and Turner, BMC Evol Biol, 9: 140 (2009)を参照。例えば、Escherichia coliのＥｍｒＥ排出輸送体（GenBank BAE76318.1、配列番号９２）はアミノグリコシド耐性に関与する。ホモオリゴマーであり、正荷電の芳香族系薬物（すなわちメチルビオロゲンまたはエチジウム）を２個のプロトンと引き換えに排出する。
ＲＮＤファミリーのメンバーはグラム陰性細菌を含めて広く存在しており、多くの抗生物質および化学療法薬の能動的排出を触媒する。Nikaido and Takatsuk, Biochim Biophys Acta., 1794(5):769-81 (2009) を参照。例示的な蛋白質はEscherichia coliのＡｃｒＡＢであり、これはエリスロマイシンＤ輸送に関与する（GenBank:BAE76241.1（配列番号９３）およびAAA23410.1（配列番号９４））。
ＭＡＴＥファミリーメンバーは１２個の膜貫通（ＴＭ）ドメインを含有している。ＭＡＴＥファミリーのメンバーは原核生物、Saccharomyces cerevisiaeおよびSchizosaccharomyces pombeなどの酵母ならびに植物に見出されている。Diener et al., Plant Cell. 13(7): 1625-1638 (2001)。MATEファミリーのメンバーはナトリウムまたはプロトン対向輸送体である。例示的な標的分子はE.coliのｙｄｈＥ（GenBank AAB47941.1、配列番号９５）であり、フルオロキノロン、カナマイシン、ストレプトマイシン、他のアミノグリコシドおよびベルベリンを輸送する。
Ａ．転写因子
転写因子の発現の改変も、輸送体の発現を増大させるために用いられ得る。例えば、酵母の転写因子ＰＤＲｌおよび／またはＰＤＲ３は、ＡＢＣ輸送体ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、およびＹＯＲ１をコードする遺伝子の発現を制御する。したがって、いくつかの態様において、内在性のＰＤＲ１およびＰＤＲ３遺伝子座のプロモーターが異なるプロモーターによって置換されて、転写因子の増大した発現をもたらし得る。これは、内在性の輸送体の増大した生産をもたらし得る。別の態様において、微生物による転写因子の過剰発現をもたらすプロモーターを有する外来性のプラスミドを用いて、転写因子が微生物内に導入され得る。さらに別の態様において、外来性のプラスミドは転写因子の複数コピーも有し得る。さらなる態様において、内在性の転写因子は、組み換え微生物の天然の機構を用いて活性化または過剰発現誘導され得る（例えば熱ショック、ストレス、重金属または抗生物質の曝露）。
Ｂ．ステビオール経路中間体の排出を変化させる遺伝子の同定
ステビオール経路中間体の排出を変化させる遺伝子を同定するための方法が本明細書に開示される。かかる方法は、少なくとも１つの内在性の輸送体遺伝子を不活性化すること、または少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を改変することを含み得る。通常は変異体微生物のライブラリーが調製され、ライブラリーの各変異体は別々の内在性の輸送体遺伝子を不活性化されている。いくつかの態様において、別の内在性の輸送体遺伝子の発現がライブラリーの各微生物について改変される。改変が加えられる元の微生物はステビオールグリコシド経路遺伝子を欠いており得るが、必要ならばかかる遺伝子の１つまたは２つ以上を含み得る。通常は、ステビオールグリコシド経路遺伝子の非存在下において改変を加え、所望の種々の標的グリコシド産物の生産を容易にする経路遺伝子を次に導入することがより便利である。１つまたは２つ以上のステビオールグリコシド経路遺伝子を含有する変異体微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドが合成される条件の培地によって培養され、微生物によって生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシド経路の中間体の量は本明細書に記載のように（例えばLC-MSを用いて）測定される。
特徴付けされる中間体（単数または複数）は、微生物の問題となっている具体的な経路に応じて決まる。例えば、７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅ、および８５Ｃ２のＵＧＴを発現する微生物（下記）は、標的産物のレバウジオシドＡをステビオールから中間体化合物のステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ルブソシドおよびステビオシドを経て合成できる。図１参照。したがって、レバウジオシドＡが標的産物である場合、微生物によって培養上清中に排出された１９−ＳＭＧの量および微生物内に保持された１９−ＳＭＧの量が測定され得る。微生物の培養によって生産された１つの中間体の量または各中間体の量が測定され得る。変異体微生物によって生産された細胞外の経路中間体（単数または複数）の量が輸送体遺伝子に関して野生型の相当する微生物によって生産された量よりも多い場合、内在性の輸送体遺伝子はステビオール経路中間体の排出を変化させるものとして同定される。輸送体が他の中間体の排出を変化させるかどうかを確認するために同様の方法が用いられ得る。
ＩＶ．内在性の輸送体の不活性化
本願は、１つまたは２つ以上の不活性化された内在性の輸送体遺伝子を含む組み換え宿主に関し得る。内在性の輸送体遺伝子は、通常は、遺伝子の発現を破壊すること、または、変異を有する宿主の輸送体活性を減少させるかもしくはさらには完全に排除する変異を導入すること（例えば１つまたは２つ以上の内在性の輸送体遺伝子の破壊）によって不活性化される。その結果として、宿主は破壊された遺伝子によってコードされる輸送体について輸送体の減少した発現または活性を有する。
いくつかの態様において、ノックアウトされる輸送体はより高分子量のレバウジオシド（例えばＲｅｂＡ）の排出に特異性を有し得、したがって培地中へのＲｅｂＡの排出が望まれる株による過剰発現に有用であり得る。経路のＵＧＴの発現によるグリコシル化活性の比率の適切なバランスによって、より低分子量のステビオールグリコシドはさらにグリコシル化された後に培地中に排出される。例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２酵素と比較してＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅならびに／またはＥＵＧＴ１１のより高い発現レベルは、より容易に排出されるステビオールモノグルコシドの蓄積を妨げ得る。ＵＧＴの活性レベルが輸送速度よりも高い（したがってグリコシル化速度がより速い）場合、より高分子量のステビオールグリコシドが生産されることになる。
多くの輸送体は重複する基質特異性を有しており、一部の輸送体の破壊は他の輸送体の上方制御によって補償されるので、複数の不活性化された輸送体遺伝子を有する宿主を作製することが多くの場合に有用である。例えば、本明細書に記載のように、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５およびＳＮＱ２遺伝子座は下記例に記載の通り破壊され得る。いくつかの態様において、ＴＰＯ１、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５およびＳＮＱ２遺伝子座が下記例に記載のように破壊され得る。
不活性化され得るさらなる輸送体遺伝子は、同族の配列（例えば、酵母ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５およびＳＮＱ２遺伝子座に見出される配列）の機能に基づいて同定され得る。内在性の輸送体遺伝子は、遺伝子を破壊する変異によって不活性化され得る。例えば、遺伝子置換ベクターは、相同組み換えを得るのに十分な長さの輸送体遺伝子の一部を５’および３’末端の外側に有する選択マーカー遺伝子を含むようにして構築され得る。選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補する任意の数の遺伝子のものであり得、抗生物質耐性を提供し得、または、変色をもたらし得る。プラスミドＤＮＡもａｒｓエレメントも含まない遺伝子置換ベクターの線状化されたＤＮＡ断片が、次に公知の方法を用いて細胞内に導入される。ゲノム中への線状断片のインテグレーションと輸送体遺伝子の破壊とは選択マーカーに基づいて確認され得、例えばサザンブロット分析によって証明され得る。所産の細胞は、輸送体の遺伝子座への選択マーカーの挿入によって不活性化された変異体輸送体遺伝子を含有する。欠失−破壊遺伝子置換ベクターは、公知技術を用いて同様に構築され、相同組み換えによって内在性の輸送体遺伝子にインテグレーションされ、それによってその遺伝子を不活性化し得る。いくつかの態様において、所望の破壊変異が導入されたことを確認した後に、宿主細胞のゲノムから選択マーカーが除去され得る。例えばGossen et al. (2002) Ann. Rev. Genetics 36: 153-173および米国出願公開公報第20060014264号参照。
内在性の輸送体遺伝子は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）または改変ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて所望の挿入または欠失変異を導入することによっても不活性化され得る。米国特許公開公報第2012-0178169号参照。いくつかの態様において、野生型輸送体遺伝子配列にヌクレオチドの挿入、ヌクレオチドの欠失またはトランジションもしくはトランスバージョン点変異をもたらす変異を導入することによって、内在性の輸送体遺伝子が不活性化される。輸送体遺伝子中に導入され得る変異の他の種類は、野生型配列の重複および逆位を含む。変異は輸送体遺伝子座のコード配列および非コード配列（例えば制御領域、イントロンおよび他の非翻訳配列）に対して加えられ得る。コード配列中の変異は、１つまたは２つ以上のアミノ酸の挿入、１つまたは２つ以上のアミノ酸の欠失および／または非保存的アミノ酸置換をその遺伝子産物にもたらし得る。場合によっては、輸送体遺伝子の配列は複数の変異または複数種類の変異を含む。コード配列のアミノ酸の挿入または欠失は、例えば、所産の遺伝子産物の基質結合ポケットの配座を破壊し得る。
アミノ酸の挿入または欠失は遺伝子産物の活性に重要な触媒部位も破壊し得る。多数の連続したアミノ酸の挿入または欠失は、より小数の挿入または欠失アミノ酸と比較して遺伝子産物を非機能的にする可能性が高いということは当該分野で公知である。非保存的置換は遺伝子産物の電荷または疎水性のかなりの変化をもたらし得る。非保存的アミノ酸置換は残基側鎖の嵩にもかなりの変化を引き起こし得る（例えばアラニン残基によるイソロイシン残基の置換）。非保存的置換の例は、非極性アミノ酸の代わりの塩基性アミノ酸または酸性アミノ酸の代わりの極性アミノ酸を含む。
いくつかの態様において、輸送体遺伝子の変異はアミノ酸の変化をもたらさないが、コードされる輸送体のアミノ酸配列を変化させないとは言え、転写レベルを改変し（例えば転写を増大または減少させる）、翻訳レベルを減少させ、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの２次構造を改変し、転写もしくは翻訳機構の結合部位を改変し、または、ｔＲＮＡ結合効率を減少させ得る。
輸送体遺伝子座の変異は、インビトロにおける輸送体遺伝子配列の部位特異的変異導入の後に、上記のように宿主ゲノムに変異を導入するための相同組み換えによって誘発され得る。ただし、細胞の集団に遺伝子変異を導入する変異導入剤を用いて、宿主の細胞に突然変異誘発を引き起こすことによっても変異は引き起こされ得る。突然変異誘発は、インビトロ変異導入および相同組み換えがあまり十分に確立されていないかまたは不便であるような種または株にとって特に有用である。具体的な種または株のための変異原性物質または放射線の用量は実験的に決定され、致死性または不稔性を特徴とする閾値レベル未満の変異頻度が得られるようにする。
Ａ．転写因子
転写因子の発現の改変も、輸送体の発現を減少させるまたは排除するために用いられ得る。例えば、酵母の転写因子ＰＤＲ１および／またはＰＤＲ３は、ＡＢＣ輸送体ＰＤＲ５、ＳＮＱ２およびＹＯＲ１をコードする遺伝子の発現を制御する。ＰＤＲ１および／またはＰＤＲ３の遺伝子座を破壊することまたは発現を減少させることは、ステビオールグリコシド中間体の排出の検出可能な減少をもたらし得る。したがって、いくつかの態様において、酵母宿主が、不活性化された内在性のＰＤＲ１およびＰＤＲ３遺伝子座を複数の不活性化された輸送体遺伝子と一緒に含有しており、いずれか１つの輸送体または転写因子の不活性化によって提供されるものよりも中間体の排出の大きな減少を提供する。別の態様において、転写因子を破壊することまたはその発現を減少させることによってステビオールグリコシドの排出を減少させるものと同定された転写因子が、ステビオールグリコシドの排出を増大させるために組み換え微生物によって過剰発現され得る。
Ｂ．ステビオール経路中間体の排出を変化させる遺伝子の同定
ステビオール経路中間体の排出を変化させる遺伝子を同定するための方法が本明細書に開示される。かかる方法は、少なくとも１つの内在性の輸送体遺伝子を不活性化すること、破壊すること、または、その発現を減少させることを含む。通常は変異体微生物のライブラリーが調製され、ライブラリーの各変異体は、不活性化された、破壊された、または、減少した発現を有する別々の内在性の輸送体遺伝子を有する。変異が引き起こされる元の微生物はステビオールグリコシド経路遺伝子を欠いており得るが、かかる遺伝子の１つまたは２つ以上を有し得る。通常は、ステビオールグリコシド経路遺伝子の非存在下において変異を発生させ、所望の種々の標的グリコシド産物の生産を容易にする経路遺伝子を次に導入することが便利である。１つまたは２つ以上のステビオールグリコシド経路遺伝子を含有する変異体微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドが合成される条件の培地によって培養され得、微生物によって生産された細胞外および／または細胞内のステビオールグリコシド経路の中間体の量が測定され得る。
特徴付けされる中間体（単数または複数）は、微生物の問題の具体的な経路によって決まる。例えば、７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅおよび８５Ｃ２ ＵＧＴを発現する微生物（下記）は、標的産物のレバウジオシドＡをステビオールから中間体化合物のステビオール−１９−Ｏ−グルコシド（１９−ＳＭＧ）、ステビオール−１３−Ｏ−グルコース（１３−ＳＭＧ）、ルブソシドおよびステビオシドを経て合成できる。図１参照。すなわち、レバウジオシドＡが標的産物である場合、培養上清中に微生物によって排出された１９−ＳＭＧの量と微生物内に保持された１９−ＳＭＧの量とが測定され得る（例えば液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を用いる）。微生物の培養によって生産された個別の中間体の量または各中間体の量が測定され得る。変異体微生物によって生産された細胞外の経路中間体（単数または複数）の量が輸送体遺伝子に関して野生型の相当する微生物によって生産された量よりも多い場合、内在性の輸送体遺伝子はステビオール経路中間体の排出を変化させるものとして同定される。同様の方法は、輸送体が他の中間体の排出を変化させるかどうかを確認するために用いられ得る。
Ｖ．宿主
いくつもの原核生物および真核生物が、本明細書に記載の組み換え微生物を構築する際の使用に好適である（例えば、グラム陰性細菌、酵母および真菌）。ステビオールまたはステビオールグリコシドの生産株としての使用に選ばれた種および株が、どの生産遺伝子が株にとって内在性であるのか、どの遺伝子が存在しないのかを確認するために先ず分析された。内在性の相当物が株内に存在しない遺伝子は組み立てられて１つまたは２つ以上の組み換え構築物にされ、欠けている機能（単数または複数）を補うために次にその株に形質転換された。
例示的な原核および真核種は以下でより詳しく説明される。ただし当然のことながら、他の種も好適であり得る。例えば、好適な種はSaccharomycetesであり得る。さらなる好適な種は、Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium/Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowiaからなる群から選択される属であり得る。
かかる属の例示的な種は、Lentinus tigrinus、Laetiporus sulphureus、Phanerochaete chrysosporium、Pichia pastoris、Physcomitrella patens、Rhodoturula glutinis 32、Rhodoturula mucilaginosa、Phaffia rhodozyma UBV-AX、Xanthophyllomyces dendrorhous、Fusarium fujikuroi／Gibberella fujikuroi、Candida utilisおよびYarrowia lipolyticaを含む。いくつかの態様において、微生物は子のう菌、例えばGibberella fujikuroi、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Aspergillus nigerまたはSaccharomyces cerevisiaeであり得る。いくつかの態様において、微生物は原核生物、例えばEscherichia coli、Rhodobacter sphaeroidesまたはRhodobacter capsulatusであり得る。当然のことながら、一部の微生物は対象の遺伝子をハイスループット的にスクリーニングおよび試験するために用いられ得、所望の生産性または増殖性を有する他の微生物はステビオールグリコシドの大規模生産に用いられ得る。
Saccharomyces cerevisiaeおよび関連酵母種
Saccharomyces cerevisiaeは合成生物学の汎用されるシャシー(chassis)生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして用いられ得る。変異体、プラスミド、代謝の詳しいコンピューターモデルおよび他の情報のライブラリーがS.cerevisiaeに関して利用可能であり、産物収量を向上させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。組み換え微生物を作るための方法は公知である。ステビオール生合成遺伝子クラスターが、酵母（特にSaccharomycetes）によって、いくつもの公知のプロモーターのいずれのものも用いて発現され得る。テルペンを過剰生産する株が公知であり、ステビオールおよびステビオールグリコシドの生産に利用可能なゲラニルゲラニル二リン酸の量を増大させるために用いられ得る。Saccharomyces cerevisiaeは例示的なSaccharomyces種である。
Aspergillus spp.
A.oryzae、A.nigerおよびA.sojaeなどのAspergillus種は食品生産に広く用いられる微生物であり、組み換え微生物プラットフォームとしても用いられ得る。A.nidulans、A.fumigatus、A.oryzae、A.clavatus、A.flavus、A.nigerおよびA.terreusのゲノムについてはヌクレオチド配列が入手可能であり、フラックスを増強して産物収量を増大させるための内在性の経路の合理的設計および改変を可能にする。Aspergillusでは代謝モデルならびにトランスクリプトーム解析およびプロテオミクス研究が進展している。A.nigerはクエン酸およびグルコン酸などのいくつもの食品成分の商業生産用に培養されている。したがって、A.nigerなどの種はステビオールおよびステビオールグリコシドなどの食品成分の生産に通常は好適である。
Escherichia coli
Escherichia coliは合成生物学のもう１つの汎用されるプラットフォーム生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして同じく用いられ得る。Saccharomycesと同様に、変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報のライブラリーがE.coliに関して利用可能であり、産物収量を向上させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。Saccharomycesに関する上記のものと同様の方法が、組み換えE.coli微生物を作るために用いられ得る。
Agaricus、GibberellaおよびPhanerochaete spp.
Agaricus、GibberellaおよびPhanerochaete spp.は培養によって大量のジベレリンを生産することが公知であるので、有用であり得る。すなわち、大量のステビオールおよびステビオールグリコシドを生産するためのテルペン前駆体が内在性の遺伝子によって予め生産されている。したがって、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの組み換え遺伝子を含有するモジュールは、メバロン酸またはＭＥＰ経路遺伝子を導入する必要なしに、かかる属の種に導入され得る。
Arxula adeninivorans（Blastobotrys adeninivorans）
Arxula adeninivoransは二形性酵母であり（４２℃の温度以下ではパン酵母のように出芽酵母として増殖し、この閾値を超えると糸状形態で増殖する）、際立った生化学的特質を有する。様々な基質を利用して増殖でき、硝酸塩を資化できる。天然プラスチックを生産できる株の作製または環境試料中のエストロゲンのバイオセンサーの開発に、首尾よく応用されて来た。
Yarrowia lipolvtica
Yarrowia lipolyticaは二形性酵母であり（Arxula adeninivorans参照）、様々な基質を利用して増殖できる。産業応用の高い可能性を有するが、組み換え産物は未だ市販されていない。
Rhodobacter spp.
Rhodobacterは組み換え微生物プラットフォームとしての使用であり得る。E.coliと同様に、利用可能な変異体のライブラリーおよび適当なプラスミドベクターが存在しており、産物収量を向上させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。カロテノイドおよびＣｏＱ１０の増大した生産のために、Rhodobacterの多膜性の細菌種においてイソプレノイド経路が操作されている。米国特許公開公報第20050003474号および20040078846号参照。E.coliに関する上記のものと同様の方法が、組み換えRhodobacter微生物を作るために用いられ得る。
Candida boidinii
Candida boidiniiはメチロトローフ酵母である（メタノールによって増殖できる）。他のメチロトローフ種（例えばHansenula polymorphaおよびPichia pastoris）と同様に、異種蛋白質の生産用の優れたプラットフォームを提供する。排出される外来蛋白質の複数グラム範囲の収量が報告されている。計算手法のIPROは、Candida boidiniiキシロースレダクターゼのコファクター特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨに実験的に切り換えた変異を最近になって予測した。
Hansenula polymorpha（Pichia angusta）
Hansenula polymorphaはもう１つのメチロトローフ酵母である（Candida boidinii参照）。さらに、様々な他の基質を利用して増殖でき、耐熱性であり、硝酸塩を資化できる（Kluyveromyces lactisも参照）。これは、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎の治療用のインスリンおよびインターフェロンα−２ａ、さらには様々な工業用酵素の生産に利用されて来た。
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactisはケフィアの生産に通常用いられる酵母である。いくつかの糖、最も重要には乳糖（これは牛乳およびホエイ中に存在する）を用いて増殖できる。特にチーズ生産用のキモシン（子牛の胃に通常存在する酵素）の生産に首尾よく応用されて来た。生産は４０，０００Ｌ規模の発酵槽内で行われる。
Pichia pastoris
Pichia pastorisはメチロトローフ酵母である（Candida boidiniiおよびHansenula polymorpha参照）。外来蛋白質の生産用の効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォームの種々の要素はキットとして入手可能であり、蛋白質の生産用に学会では世界的に用いられている。複雑なヒトＮ−グリカンを生産できる株が設計されている（酵母のグリカンはヒトで見出されるものと類似であるが、同一ではない）。
Physcomitrella spp.
Physcomitrella苔は、懸濁培養によって増殖させた場合には、酵母または他の真菌培養物と類似の性質を有する。この属は、他の種類の細胞では生産することが困難であり得る植物の２次代謝産物の生産用に、重要な種類の細胞となりつつある。
ＶＩ．ステビオールグリコシドを生産する方法
本明細書に記載の組み換え微生物は、ステビオールまたはステビオールグリコシドを生産するための方法に用いられ得る。例えば、方法は、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシド生合成遺伝子が発現される条件の培養培地中で組み換え微生物を増殖させることを含み得る。組み換え微生物は流加式または連続式プロセスによって増殖させられ得る。通常は、組み換え微生物は発酵槽内において所定の温度で所望の時間（単数または複数）増殖させられる。方法に用いられる具体的な微生物に応じて、他の組み換え遺伝子、例えばイソペンテニル生合成遺伝子およびテルペンシンターゼおよびシクラーゼ遺伝子も存在して発現され得る。基質および中間体、例えばイソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、カウレンおよびカウレン酸のレベルは、培養培地から試料を抽出して公開された方法による分析に供することによって測定され得る。
組み換え微生物が所望の時間の培養によって増殖させられた後に、当該分野で公知の種々の技術を用いて培養物からステビオールおよび／または１つまたは２つ以上のステビオールグリコシドが回収され得る。いくつかの態様において透過処理剤が添加されて、フィードストックが宿主内に入り産物が出て来るのを促進し得る。例えば、培養された微生物の粗溶解物が遠心されて上清を得ることができる。所産の上清は次にクロマトグラフィーカラム（例えばC18カラム）にかけられ、水で洗浄して親水性化合物を除去した後に、メタノールなどの溶媒による目的の化合物（単数または複数）の溶出を行い得る。化合物（単数または複数）は調製用ＨＰＬＣによってさらに精製され得る。WO2009/140394も参照。
生産されるステビオールグリコシド（例えばレバウジオシドＡまたはレバウジオシドＤ）の量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２０００ｍｇ／Ｌ、例えば約１〜約１０ｍｇ／Ｌ、約３〜約１０ｍｇ／Ｌ、約５〜約２０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約５０ｍｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約２５〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，５００ｍｇ／Ｌまたは約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約少なくとも１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌであり得る。通常は、より長い培養時間はより大量の産物をもたらす。したがって、組み換え微生物は１日間〜７日間、１日間〜５日間、３日間〜５日間、約３日間、約４日間または約５日間培養され得る。
当然のことながら、本明細書に記載の種々の遺伝子およびモジュールは１つの微生物ではなく２つまたは３つ以上の組み換え微生物内に存在し得る。複数の組み換え微生物が用いられるときには、それらは混合培養によって増殖させられてステビオールおよび／またはステビオールグリコシドを生産し得る。例えば、第１の微生物が、ステビオールを生産するための１つまたは２つ以上の生合成遺伝子と内在性の輸送体の第１のグループのヌル変異とを含み得、第２の微生物が、ステビオールグリコシド生合成遺伝子と内在性の輸送体の第２のグループのヌル変異とを含む。
代わりに、２つまたは３つ以上の微生物がそれぞれ別々の培養培地によって増殖させられ得る。第１の培養培地の産物（例えばステビオール）が第２の培養培地中に導入されて変換され、次の中間体にまたはレバウジオシドＡなどの最終産物になり得る。第２または最終の微生物によって生産された産物が次に回収される。微生物同士は、内在性の輸送体の変異の同一または異なるグループを有し得る。同様に当然のことながら、いくつかの態様において、組み換え微生物は培養培地以外の栄養源を用いて、発酵槽以外のシステムを用いて増殖させられる。
ステビオールグリコシド類は、様々な食品の系統において必ずしも等しい性能を有さない。したがって、選ばれたステビオールグリコシド組成物の合成を行う能力を有することが望ましい。本明細書に記載の組み換え宿主は、特定のステビオールグリコシド（例えばレバウジオシドＤ）が選択的に濃縮されて一貫した味質を有する組成物を生産できる。したがって、本明細書に記載の組み換え微生物は、所与の食品に求められる甘味質に適合するように調整され且つバッチ間で一貫した各ステビオールグリコシドの割合を有する組成物の生産を容易にし得る。本明細書に記載の微生物は、ステビア抽出物中に見出される望ましくない植物副産物を生産しない。したがって、本明細書に記載の組み換え微生物によって生産されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア草由来の組成物とは区別可能である。
ＶＩＩ．ステビオールグリコシド、組成物および食品
本明細書に開示の方法によって得られるステビオールグリコシドおよび組成物は、食品、ダイエタリー・サプリメントおよび甘味料組成物を作るために用いられ得る。例えば、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシド、例えばレバウジオシドＡまたはレバウジオシドＤは、アイスクリーム、炭酸飲料、フルーツジュース、ヨーグルト、焼き物、チューインガム、ハードおよびソフトキャンディならびにソースなどの食品中に含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、医薬品、薬用製品、ダイエタリー・サプリメントおよび栄養補助剤などの非食品の製品中にも含まれ得る。実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドは、農産業およびペット産業向けの動物用飼料中にも含まれ得る。または、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシドの混合物が作られ得、それぞれが特定のステビオールまたはステビオールグリコシドを生産する組み換え微生物を個別に培養することと、ステビオールまたはステビオールグリコシドを実質的に純粋な状態で各微生物から回収することと、次にそれらの化合物を組み合わせて所望の割合で各化合物を含有する混合物を得ることとによって作られ得る。本明細書に記載の組み換え微生物は、現行のステビア産物と比較してより精密で一貫した混合物が得られることを可能にする。もう１つの代替では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドが、食品中に他の甘味料（例えばサッカリン、ブドウ糖、スクロース、果糖、エリトリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチンまたはアセスルファムカリウム）と一緒に組み込まれ得る。ステビオールまたはステビオールグリコシドの他の甘味料に対する重量比は、最終的な食品の十分な風味を達成するように適宜変更され得る。例えば米国特許公開公報第2007/0128311号参照。いくつかの態様において、ステビオールまたはステビオールグリコシドは、香味調節剤としての香味（例えば柑橘系）を加えられ得る。
本明細書に記載の組み換え微生物によって生産された組成物は、食品中に組み込まれ得る。例えば、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、食品中に約２０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品〜約１８００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品の量（乾燥重量基準）で組み込まれ得、これはステビオールグリコシドおよび食品の種類に左右される。例えば、組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、デザート、冷製菓子（例えばアイスクリーム）、乳製品（例えばヨーグルト）または飲料（例えば炭酸飲料）中に組み込まれて、食品が最大で５００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を乾燥重量基準で有するようにできる。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、焼き物（例えばビスケット）中に組み込まれて食品が最大で３００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を乾燥重量基準で有するようにできる。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物はソース（例えばチョコレートシロップ）または野菜製品（例えばピクルス）中に組み込まれて、食品が最大で１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を乾燥重量基準で有するようにできる。組み換え微生物によって生産されたステビオールグリコシド組成物はパンに組み込まれて、食品が最大で１６０ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を乾燥重量基準で有するようにできる。組み換え微生物、植物または植物細胞によって生産されたステビオールグリコシド組成物は、ハードまたはソフトキャンディ中に組み込まれて、食品が最大で１６００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を乾燥重量基準で有するようにできる。組み換え微生物、植物または植物細胞によって生産されたステビオールグリコシド組成物は果実加工品（例えば、フルーツジュース、フルーツフィリング、ジャムおよびゼリー）に組み込まれて、食品が最大で１０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ食品を乾燥重量基準で有するようにできる。
例えば、かかるステビオールグリコシド組成物は９０〜９９％レバウジオシドＡとステビア草由来の汚染物の検出不可能な量とを有し得、食品中に乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇで組み込まれ得る。
かかるステビオールグリコシド組成物はレバウジオシドＢが濃縮された組成物であって３％超のレバウジオシドＢを有し得、食品中に組み込まれて製品中のレバウジオシドＢの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるようにできる。通常は、レバウジオシドＢが濃縮された組成物はステビア草由来の汚染物の検出不可能な量を有する。
かかるステビオールグリコシド組成物は、レバウジオシドＤが濃縮された組成物であって、３％超のレバウジオシドＤを有し得、食品中に組み込まれて、製品中のレバウジオシドＤの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるようにできる。通常は、レバウジオシドＤが濃縮された組成物は、ステビア草由来の汚染物の検出不可能な量を有する。
かかるステビオールグリコシド組成物はレバウジオシドＥが濃縮された組成物であって３％超のレバウジオシドＥを有し得、食品中に組み込まれて製品中のレバウジオシドＥの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるようにできる。通常は、レバウジオシドＥが濃縮された組成物は、ステビア草由来の汚染物の検出不可能な量を有する。
かかるステビオールグリコシド組成物は、レバウジオシドＭが濃縮された組成物であって３％超のレバウジオシドＭを有し得、製品中のレバウジオシドＭの量が乾燥重量基準で２５〜１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、２５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜５００ｍｇ／ｋｇまたは５００〜１０００ｍｇ／ｋｇとなるように食品中に組み込まれ得る。通常は、レバウジオシドＭが濃縮された組成物は、ステビア草由来の汚染物の検出不可能な量を有する。
いくつかの態様において、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドが卓上甘味料または「cup-for-cup」品中に組み込まれる。かかる製品は、当業者にとって公知の１つまたは２つ以上の増量剤、例えばマルトデキストリンによって適切な甘味度まで通常は希釈される。レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭが濃縮されたステビオールグリコシド組成物は、小袋のパッケージであって、例えば乾燥重量基準で１０，０００〜３０，０００ｍｇステビオールグリコシド／ｋｇ製品、卓上用であり得る。
本発明は以下の例によってさらに説明されるが、クレーム中に示される本発明の範囲を限定するものではない。
例
例１．ＬＣ−ＭＳ分析の手順
ＬＣ−ＭＳ分析は、Ultimate 3000 UPLCシステム（Dionex）を用いて行った。Waters Acquity UPLC（登録商標）BEHシールドRP18カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ粒子、１３０Å細孔径）が取り付けられており、これは加熱エレクトロスプレーイオン（ＨＥＳＩ）源を備えたTSQ Quantum Access（ThermoFisher Scientific）トリプル四重極型(triple quadropole)質量分析計に接続されている（別段の定めがある場合を除く）。溶出は、溶出剤Ｂ（０．１％ギ酸を含むＭｅＣＮ）および溶出剤Ａ（０．１％ギ酸を含む水）の移動相を用いて、勾配を２５％から４７％Ｂまで増大させ（ｍｉｎ．０．０〜４．０）、４７％から１００％Ｂまで増大させ（ｍｉｎ．４．０〜５．０）、１００％Ｂをｍｉｎ．５．０から６．５の再平衡化まで維持することによって実施した。流速は０．４ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は３５℃であった。ステビオールグリコシドはＳＩＭ（選択イオンモニタリング）を用いて次のｍ／ｚ曲線で検出した。
ステビオールグリコシドのレベルは、LGC Standards社の真正性確認用標準から得られた校正曲線と比較することによって定量した。例えば、０．５〜１００μΜレバウジオシドＡの標準溶液を、校正曲線を作成するために通常用いた。
例２．レバウジオシド生産酵母株の構築
Ａ． 酵母株ＥＦＳＣ２７７２を、３つの栄養要求性改変、すなわちＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３の欠失を有する野生型Saccharomyces cerevisiae株から構築した。野生型株は、標準的な遺伝学的方法を用いて操作し得、通常の２倍体または１倍体酵母株として用い得る。ＥＦＳＣ２７７２は、４つのＤＮＡ構築物のゲノムインテグレーションによってステビオールグリコシド生産酵母に改造した。各構築物は複数の遺伝子を含有し、それらを相同組み換えによって酵母ゲノム中に導入した。さらに、構築物１および２を相同組み換えによって組み立てた。
第１の構築物は、８つの遺伝子を含有し、ＤＰＰ１遺伝子座に挿入した。該構築物は、ＤＰＰ１（ホスファターゼ）を破壊して部分欠失させる。挿入されたＤＮＡは次を含有する：ｎａｔＭＸ遺伝子（選択マーカー）を発現するAshbya gossypii ＴＥＦプロモーター、該遺伝子の後にA.gossypii由来のＴＥＦターミネーターが続く；GeneArtによってコドン最適化されたStevia rebaudiana ＵＧＴ８５Ｃ２（GenBank AAR06916.1、配列番号３２）であって、天然の酵母ＧＰＤ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く；S.rebaudiana ＣＰＲ−８（配列番号２４）であって、天然の酵母ＴＰＩ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＤＨ１ターミネーターが続く；Arabidopsis thalianaカウレンシンターゼ（配列番号９６、GenBank AEE36246.1に類似）であって、天然の酵母ＰＤＣ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＦＢＡ１ターミネーターが続く；Synechococcus sp. ＧＧＰＰＳ（GenBank ABC98596.1、配列番号９７）であって、天然の酵母ＴＥＦ２プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＰＧＩ１ターミネーターが続く；DNA2.0によってコドン最適化されたS.rebaudiana ＫＡＨｅ１（配列番号１８）であって、天然の酵母ＴＥＦ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＥＮＯ２ターミネーターが続く；S.rebaudiana ＫＯ−１（GenBank ABA42921.1、gi 76446107、配列番号９８）であって、天然の酵母ＦＢＡ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＤＨ２ターミネーターが続く；および、Zea maysの末端欠失ＣＤＰＳであって、天然の酵母ＰＧＫ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＡＤＨ２ターミネーターが続く。
第２の構築物は、ＹＰＲＣΔ１５遺伝子座に挿入し、次を含有した：ｋａｎＭＸ遺伝子（選択マーカー）の前にあるA.gossypii由来のＴＥＦ１プロモーター、該遺伝子の後にA.gossypiiのＴＥＦ１ターミネーターが続く；GeneArtによってコドン最適化されたA.thaliana ＡＴＲ２（配列番号９９）であって、天然の酵母ＰＧＫ１プロモーターによって発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＡＤＨ２ターミネーターが続く；S.rebaudiana ＵＧＴ７４Ｇ１（GenBank AAR06920.1、配列番号１００）であって、天然の酵母ＴＰＩ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＤＨ１ターミネーターが続く；GeneArtによってコドン最適化されたS.rebaudiana ＵＧＴ７６Ｇ１（GenBank AAR06912、配列番号１０１）であって、天然の酵母ＴＥＦ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＥＮＯ２ターミネーターが続く；および、GeneArtによってコドン最適化されたS.rebaudiana ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂであって、これは、アミノ酸の改変Ｌ２１１ＭおよびＶ２８６Ａを有するＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドを産生し（野生型配列のＵＧＴ９１Ｄ２ｅアミノ酸配列である配列番号５４；コドン最適化されたヌクレオチド配列は配列番号１０２に示されている）、天然の酵母ＧＰＤ１プロモーターから発現され、その後に天然の酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く。
第１および第２の構築物を、接合および解剖によって組み合わし、同一の胞子クローンにした。この酵母株は、次に、２つの連続したイベントによって構築物３および４を用いて形質転換した。
構築物３は遺伝子ＰＲＰ５とＹＢＲ２３８Ｃとの間にインテグレートされ、次を有した：K.lactis ＬＥＵ２遺伝子を発現するKluyveromyces lactis ＬＥＵ２プロモーター、該遺伝子の後にK.lactisのＬＥＵ２ターミネーターが続く；DNA2.0によって最適化されたS.rebaudiana ＫＡＨｅ１（配列番号１８）を発現する天然の酵母ＧＰＤ１プロモーター、該遺伝子の後に天然の酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く；および、Zea maysの末端欠失ＣＤＰＳ（配列番号１０３）を発現する天然の酵母ＴＰＩ１プロモーター、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＰＩ１ターミネーターが続く。
構築物４は遺伝子ＥＣＭ３とＹＯＲ０９３Ｃとの間のゲノムにインテグレートされ、次を有した：K.pneumoniae ｈｐｈＭＸ遺伝子を発現するA.gossypiiのＴＥＦプロモーター、該遺伝子の後にA.gossypiiのＴＥＦ１ターミネーターが続く；Synechococcus sp. ＧＧＰＰＳ（配列番号９７）であって、天然の酵母ＧＰＤ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く；その後に、A.thalianaカウレンシンターゼ（配列番号９６）を発現する天然の酵母ＴＰＩ１プロモーター、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＰＩ１ターミネーターが続く。
株を、２つのプラスミドｐ４１３ＴＥＦ（ＨＩＳ３マーカーを有するＣＥＮ／ＡＲＳシャトルプラスミド）およびｐ４１６−ＴＥＦ（ＵＲＡ３マーカーを有するＣＥＮ／ＡＲＳシャトルプラスミド）の形質転換による導入によって原栄養性にさせた。これをＥＦＳＣ２７７２と呼んだ。
ＬＣ−ＭＳによって証明されたところでは、合計した細胞内および細胞外の産物濃度は、ＥＦＳＣ２７７２の２つの別々のバッチで９２０〜１６６０ｍｇ／ＬのＲｅｂＡおよび約３００〜３２０ｍｇ／ＬのＲｅｂＤであった。高い方の力価の結果を得たとき、約７００ｍｇ／ＬのＲｅｂＡを培養液から検出した。さらに、大きなピークがＲｅｂＢに関して見られた。当業者には当然のことながら、ＵＧＴ７４Ｇ１のさらなるコピーまたはＵＧＴ７４Ｇ１の上方制御は、ＲｅｂＢからＲｅｂＡへの変換をさらに増大させることになる。逆にＲｅｂＢが標的グリコシドである場合、ＵＧＴ７４Ｇ１を破壊し得るかまたは染色体から欠失し得る。
Ｂ． ＥＦＳＣ２７６３酵母株を、３つの栄養要求性改変（すなわちＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３の欠失）を有する野生型Saccharomyces cerevisiae株から作製した。株の遺伝学的性質は安定しており、通常の２倍体または１倍体酵母株として用いられ得る。ＥＦＳＣ２７６３は、４つのＤＮＡ構築物のゲノムインテグレーションによってステビオールグリコシド生産酵母に改造された。各構築物は複数の遺伝子を含有し、それらは相同組み換えによって酵母ゲノム中に導入された。さらに、構築物１および２が相同組み換えによって組み立てられた。
第１の構築物は、８つの遺伝子を含有し、ＤＰＰ１遺伝子座に挿入され、ＤＰＰ１を破壊して部分的に欠失させる。挿入されたＤＮＡは次を含有する：ＮａｔＭＸ遺伝子（選択マーカー）を発現するA.gossypii ＴＥＦプロモーター、該遺伝子の後にA.gossypiiのＴＥＦターミネーターが続く；GeneArtによってコドン最適化されたS.rebaudiana ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号３２）であって、天然の酵母ＧＰＤ１プロモーターによって発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く；S.rebaudiana ＣＰＲ−８（配列番号２４）であって、ＴＰＩ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＤＨ１ターミネーターが続く；A.thalianaカウレンシンターゼ（ＫＳ−５、配列番号９６）であって、ＰＤＣ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＦＢＡ１ターミネーターが続く；Synechococcus sp. ＧＧＰＰＳ（ＧＧＰＰＳ−７、配列番号９７）であって、ＴＥＦ２プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＰＦＩ１ターミネーターが続く；DNA2.0によってコドン最適化されたS.rebaudiana ＫＡＨｅ１（配列番号１８）であって、ＴＥＦ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後にＥＮＯ２ターミネーターが続く；S.rebaudiana ＫＯ−１（配列番号９８）であって、ＦＢＡ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＤＨ２ターミネーターが続く；および、Zea maysの末端欠失ＣＤＰＳ（配列番号１０３）であって、ＰＧＫ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＡＤＨ２ターミネーターが続く。
第２の構築物をＹＰＲＣΔ１５遺伝子座に挿入した。該構築物は次を含有する：ＫａｎＭＸ遺伝子（選択マーカー）を発現するA.gossypiiの天然の酵母ＴＥＦプロモーター、該遺伝子の後にA.gossypiiのＴＥＦターミネーターが続く；GeneArtによってコドン最適化されたA.thaliana ＡＴＲ２（配列番号９）であって、ＰＧＫ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に酵母ＡＤＨ２ターミネーターが続く；S.rebaudiana ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１００）であって、ＴＰＩ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に酵母ＴＤＨ１ターミネーターが続く；GeneArtによってコドン最適化されたS.rebaudiana ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１０１）であって、ＴＥＦ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に酵母ＥＮＯ２ターミネーターが続く；および、GeneArtによってコドン最適化されたS.rebaudiana ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号１０２）であって、ＧＰＤ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く。
第１および第２の構築物を、接合および解剖によって組み合わし、同一の胞子クローンとした。この酵母株は、後に２つの連続したイベントによって構築物３および４で形質転換した。
構築物３を、遺伝子ＰＲＰ５とＹＢＲ２３８Ｃとの間にインテグレートし、次を含有した：K.lactis ＬＥＵ２遺伝子を発現するA.gossypiiのＴＥＦプロモーター、該遺伝子の後にA.gossypiiのＴＥＦターミネーターが続く；DNA2.0によって最適化されたS.rebaudiana ＫＡＨｅ１（配列番号１８）を発現するＧＰＤ１プロモーター、該遺伝子の後にＣＹＣ１ターミネーターが続く；および、Zea maysの末端欠失ＣＤＰＳ（配列番号１０３）を発現するＴＰＩ１プロモーター。
構築物４を遺伝子ＥＣＭ３とＹＯＲ０９３Ｃとの間のゲノムにインテグレートし、発現カセットは次を含有した：K.pneumoniae ｈｐｈ遺伝子（配列番号１５７。Gritz et al, (1983) Gene 25: 179-88を参照）を発現するA.gossypiiのＴＥＦプロモーター、該遺伝子の後にA.gossypiiのＴＥＦターミネーターが続く；Synechococcus sp. ＧＧＰＰＳであって、ＧＰＤ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後にＣＹＣ１ターミネーターが続く；および、A.thalianaカウレンシンターゼを発現するＴＰＩ１プロモーター。４つの用いられた遺伝マーカーを後に除去した。
細胞および培養液の全ステビオールグリコシドのＤＭＳＯ抽出後に行われたＬＣ−ＭＳによって分析したところでは、深底ウェルプレートで３２０ＲＰＭの振とうによって３０℃のＳＣ（合成完全）培地の３ｍｌ中、４日間の増殖後に、ＥＦＳＣ２７６３は４０〜５０μΜまたは２〜３μΜ／ＯＤ６００のレバウジオシドＡを生産する。
Ｃ． 株ＥＦＳＣ２７９７を、ＹＯＲＷ遺伝子座へのもう１つの構築物の追加によって株ＥＦＳＣ２７６３から作製した。この追加の構築物は次の通りである。S.pombeのＨＩＳ遺伝子（選択マーカー）を発現するA.gossypii ＴＥＦプロモーター、該遺伝子の後にA.gossypiiのＴＥＦターミネーターが続く；S.rebaudiana ＫＯ−１（配列番号９８）であって、ＧＰＤ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ｔＣＹＣ１ターミネーターが続く；S.rebaudiana ＣＰＲ−８（配列番号２４）であって、ＴＰＩ１プロモーターを用いて発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＴＤＨ１ターミネーターが続く；A.thalianaカウレンシンターゼ（ＫＳ−５、配列番号９６）であって、ＰＤＣ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後に天然の酵母ＦＢＡ１ターミネーターが続く；Oryza sativa ＥＵＧＴ１１（配列番号５３）であって、ＴＥＦ２プロモーターから発現され、該遺伝子の後に酵母ＰＧＩ１ターミネーターが続く；DNA2.0によってコドン最適化されたS.rebaudiana ＫＡＨｅ１（配列番号１８）であって、ＴＥＦ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後にＥＮＯ２ターミネーターが続く；Zea mays末端欠失ＣＤＰＳ（配列番号１０３）であって、ＰＧＫ１プロモーターから発現され、該遺伝子の後にＡＤＨ２ターミネーターが続く。
細胞（細胞は２４ウェルプレートによって４日間３０℃で増殖させた）および培養液からの全ステビオールグリコシドのＤＭＳＯ抽出後に行われたＬＣ−ＭＳ分析は、ＥＦＳＣ２７９７が種々の量のＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭおよびルブソシドを生産するということを実証した（下の表１２参照）。
Ｄ． ＥＦＳＣ３２４８酵母株を上記の同じ元の野生型Saccharomyces cerevisiae株から作製し、表１３に記載の次の遺伝子を上記と同様の方法を用いてインテグレートした。さらに、この株は接合型の切り換えを防ぐためにＨＯ−である。
例３.輸送体を過剰発現する酵母株の構築
レバウジオシドを生産する酵母株は、上記例２ならびに国際出願第PCT/US2011/038967（WO/2011/153378）号およびPCT/US2012/050021（WO/2013/022989）号（両方ともその全体が本明細書においては参照によって組み込まれる）に記載されている。同様の株の振とうフラスコ研究による観察は、上清中のＲｅｂＡの割合が経時的に増大するということを示唆した。この効果は細胞の溶解の結果ではないと確認された。Saccharomyces cerevisiaeのステビオールグリコシド排出に及ぼす種々の輸送体の影響を確認するために、輸送体遺伝子の内在性のプロモーターをＴＥＦ１構成的プロモーターに置換することによって、Saccharomyces cerevisiae株のライブラリーを構築した。
ｌｏｘ Ｐ部位によって挟まれたＴＥＦプロモーターおよびＨＩＳ５（Schizosaccharomyces pombe）マーカーからなるカセットを構築した。特異的な尾部を有するプライマーをカセットのＰＣＲ増幅に用い、産物は上記のＲｅｂＡ生産ＥＦＳＣ２７６３の相同組み換えによって目的の遺伝子の上流にインテグレートした。コザック配列を、遺伝子の始まりにアニーリングするプライマー尾部に付加し、したがって開始コドンの直前に配置した。カセットの正しい挿入は、ＰＣＲによってＴＥＦ１プロモーターにアニーリングするフォワードプライマーと特定の輸送体遺伝子にアニーリングする特異的リバースプライマーとを用いて確認した。表１４に４４個の輸送関連遺伝子の一覧を記載する。内在性のプロモーターを置換するためにＴＥＦ１構成的プロモーターを用いた。
４４株をＲｅｂＡ排出について試験した。重複した培養物を、３ｍｌの合成完全（ＳＣ）培地によって４８時間インキュベートした（３０℃、３１０ｒｐｍ、２４ウェルプレート）。上清試料が培養物の１００μＬの遠心によって得られた（４０００ｒｃｆ、７ｍｉｎ）。上清の２５μＬを２倍量の５０％ＤＭＳＯに添加した。
これらの試料をＬＣ−ＭＳによって上清（細胞不含）試料として分析した。用いたＬＣ−ＭＳ法は例１と同様であったが、ただしPhenomenex（登録商標）kinetex C18カラム（１５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ粒子、１００Å細孔径）を用い、４０〜５０％Ｂではより浅い勾配を用いた。これによって通常より長い保持時間がもたらされる。元の試料の残りの上清を除去し、ペレットを１００μｌの水で洗浄した。ペレットを１００μｌの５０％ＤＭＳＯ中に再懸濁し、８０℃まで１０分間加熱した後、試料を遠心した（４０００ｒｃｆ、５ｍｉｎ）。再懸濁されたペレットから得られた上清の２５μＬを等量の５０％ＤＭＳＯおよび等量の水に添加した後、試料をフィルタープレートに移した。試料をフィルタープレートから回収し（２０００ｒｃｆ、２ｍｉｎ）、ＬＣ‐ＭＳを用いてペレット試料として測定した。結果は図２に示す。
株「１２＿ＹＯＲ１」は、ＥＦＳＣ２７６３対照株と比較して、ペレットよりも上清についてＲｅｂＡのより高いパーセンテージを示した。「１８＿ＡＤＰ１」および「ＥＦＳＣ２７６３」株は、他の株よりも合計で少ないＲｅｂＡを生産した。「４０＿ＴＨＩ７」は試料間の大きな偏差を示した。ＹＯＲ１過剰発現株を再度試験した。第２の実験では、ＹＯＲ１過剰発現株「ＹＯＲ１＿ＯＥ」はＥＦＳＣ２７６３対照株よりも少ない全ＲｅｂＡを生産したが、それでも対照株より上清中のＲｅｂＡの高いパーセンテージを示した（図３）。輸送体候補のメッセンジャーＲＮＡレベルが測定され、多くの場合に発現レベルは野生型レベルからあまり増大していなかった。
９つの候補（ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ１３、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１＿ＢＹ、ＹＯＲ１＿ＩＳ１、ＦＬＲ１、ＡＺＲ１およびＤＴＲ１）を、レバウジオシドの生産および排出について、別の生産株ＥＦＳＣ２７９７（上記）によって２ミクロンプラスミド（ＰＳＢ３１４）を用いて再試験した。重複した培養物を、３ｍｌの合成完全（ＳＣ）培地中で４８時間インキュベートした（３０℃、３１０ｒｐｍ、２４ウェルプレート）。上清試料が培養物の１００μＬの遠心によって得られた（１３，０００ｒｃｆ、５ｍｉｎ）。上清の５０マイクロリットルを等量の１００％ＤＭＳＯに添加した。これらの試料をＬＣ−ＭＳによって上清試料として分析した。全培養液試料を等体積の１００％ＤＭＳＯと混合し、８０℃まで１０分間加熱した後に、試料を遠心し（４０００ｒｃｆ、５ｍｉｎ）、液体部分をＬＣ−ＭＳによって「全」ステビオールグリコシドのレベルとして分析した。培養上清中に排出された種々のステビオールグリコシドの量（ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ルブソシド、１３−ＳＭＧ、１．２ステビオシド、１．２ビオシドおよび不明なステビオールグリコシド（４．１３ｍｉｎ．のＬＣ−ＭＳピーク）を含む）および全培養液中の全量を、例１に記載のようにＬＣ−ＭＳによって測定した。結果は図４Ａ〜Ｍにある。排出のプロットされたパーセンテージは、「全」量によって除算された上清の数値である（図４Ａ〜Ｋ）。または、マイクロモル／ＯＤ６００の濃度をプロットし（図４Ｊ〜Ｋ）、上清もしくは全量の濃度をプロットした（図４Ｌ〜Ｍ）。
各９つの候補遺伝子の個別の過剰発現（ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ１３、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１＿ＢＹ、ＹＯＲ１＿ＩＳ１、ＦＬＲ１、ＡＺＲ１およびＤＴＲ１）は、種々のステビオールグリコシドを、対照株と比較して上清中により高いパーセンテージおよび／または濃度で排出するということを実証した（対照は空のＰＳＢ３１４プラスミドを有するＥＦＳＣ２７９７。図４Ａ〜Ｍでは「ＰＳＢ３１４」として示されている）。ＹＯＲ１＿ＢＹ（配列番号１４８）は、ＢＹ４７４１ゲノムＤＮＡから増幅しＵＲＡ栄養要求性マーカーを有する２ミクロンプラスミド（Ｐ４２６−ＧＰＤ）にクローニングしたＹＯＲ１遺伝子のＤＮＡ配列を示す。ＹＯＲ１＿ＩＳ１（配列番号１４９）は、さらなる野生型Saccharomyces cerevisiaeゲノムＤＮＡから増幅しＵＲＡ栄養要求性マーカーを有する２ミクロンプラスミド（Ｐ４２６−ＧＰＤ）にクローニングしたＹＯＲ１遺伝子のＤＮＡ配列を示す。例えば、株「ＳＮＱ２」は、より高いパーセンテージのＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、１．２ステビオシド、１．２ビオシドおよび不明なステビオールグリコシド（４．１３ｍｉｎ）を上清中に示したが、全生産量は空のＰＳＢ３１４プラスミドを含むＥＦＳＣ２７９７対照株（図４〜６では「ＰＳＢ３１４」または「空プラスミド」として示されている）と比較して同じである。株「ＹＯＲ１＿ＩＳ１」は、より高いパーセンテージのＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ルブソシド、１．２ステビオシド、１．２ビオシドおよび不明なステビオールグリコシド（４．１３ｍｉｎ）を、全量試料よりも上清についてＥＦＳＣ２７９７対照株と比較して示した。さらに、ＳＮＱ２およびＹＯＲ１の過剰発現は、対照と比較して上清中のＲｅｂＤおよびＲｅｂＡの濃度の増大を示した（図４Ｊ〜Ｍ参照）。
上記９つの候補のうち４つを、レバウジオシドの生産および排出について、生産するＥＦＳＣ２７９７株によって再度試験した。輸送体を過剰発現するＰＳＢ３１４の２ミクロンプラスミドを用いた。培養物は３ｍｌの合成完全（ＳＣ）培地−ＵＲＡ（選択圧）によって７２時間インキュベートされた（３０℃、３１０ｒｐｍ、２４ウェルプレート）。上清試料が培養物の１００μＬの遠心によって得られた（１３，０００ｒｃｆ、５ｍｉｎ）。上清の５０マイクロリットルを５０μＬの１００％ＤＭＳＯに添加した。これらの試料をＬＣ−ＭＳによって上清試料として分析した。細胞懸濁液の５０μＬを５０μＬの１００％ＤＭＳＯと混合し、８０℃に１０分間加熱した後、試料を遠心した（４０００ｒｃｆ、５ｍｉｎ）。液体部分をＬＣ−ＭＳによって「全量」試料として測定した。培養上清中に排出された種々のステビオールグリコシドの量（ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ルブソシド、１３−ＳＭＧ、１．２ステビオシド、１．２ビオシドおよび不明なステビオールグリコシド（４．１３ｍｉｎ．のＬＣ−ＭＳピーク）を含む）および全培養液中の全量を、例１に記載のようにＬＣ−ＭＳによって測定した。曲線下面積（ＡＵＣ）を、Xcaliburソフトウェア（Thermo）を用いてデータ処理時に積分によって計算した。排出された量を示す結果（ＡＵＣ）は図５Ａ〜Ｄにあり、結果は上清中に排出されたパーセントを示し（上清／全量値の比）、図５Ｅ〜Ｉに示されている。
４つの候補遺伝子のそれぞれの単独の過剰発現（ＰＤＲ１、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１＿ＢＹ、ＹＯＲ１＿ＩＳ１およびＦＬＲ１）は、種々のステビオールグリコシドを、対照株（空のＰＳＢ３１４プラスミドを有するＥＦＳＣ２７９７。図５Ａ〜Ｉでは「ＰＳＢ３１４」として示されている）と比較して上清中により高いパーセンテージおよび／または濃度で排出したということを示した。例えば、株「ＹＯＲ１＿ＢＹ」および「ＹＯＲ１＿ＩＳ１」は両方とも、ＥＦＳＣ２７９７対照株と比較して、全量よりも上清について高いパーセンテージのＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、１．２ステビオシドおよび不明なステビオールグリコシド（４．１３ｍｉｎ）を示した。さらに、別々に過剰発現されたＳＮＱ２、ＹＯＲ１、ＰＤＲ１およびＦＬＲ１は、対照と比較して上清中のＲｅｂＢのＡＵＣの増大を示した（図５Ａ〜Ｄ参照）。４つの候補遺伝子のそれぞれの単独の過剰発現は、対照と比較してＥＦＳＣ２７９７酵母株のＯＤ６００によって測定された増殖速度を有意に変えなかった（図６参照）。
例４．Stevia輸送体を過剰発現する酵母株
６つの推定上のS.rebaudiana ＲｅｂＡ輸送体をパイロシークエンスデータから同定した。ＳｒＤＴＸ２４（配列番号１５０）、ＳｒＭＲＰ１Ｏ（配列番号１５１）、ＳｒＰＤＲ１２（配列番号１５２）、ＳｒＭＲＰ２（配列番号１５３）、ＳｒＭＲＰ４ａ（配列番号１５４）およびＳｒＭＲＰ４ｂ（配列番号１５５）である。推定上の輸送体のうちの５つ、ＳｒＤＴＸ２４、ＳｒＭＲＰ１Ｏ、ＳｒＰＤＲ１２、ＳｒＭＲＰ４ａおよびＳｒＭＲＰ４ｂがさらなる解析用に選択し、クローニングした。クローニングされた輸送体配列は、安定なＲｅｂＡ生産S.cerevisiaeによって発現した。ステビオールグリコシド排出のレベルを測定し、図７に示す。
例５．酵母のレバウジオシド輸送体を同定するための方法
４重輸送体変異体酵母株の構築
レバウジオシドを生産する酵母株は、上記の例２ならびに国際出願第PCT/US2011/038967（WO/2011/153378）号およびPCT/US2012/050021（WO/2013/022989）号（両方とも本明細書においてはその全体が参照によって組み込まれる）に記載されている。同様の株の振とうフラスコ研究による観察は、分子の分子量が増大するにつれて減少するように見える効率でS.cerevisiae細胞からステビオールグリコシドが排出されるということを示唆した。種々の輸送体がS.cerevisiaeによるステビオールグリコシドの排出に及ぼす影響を確認するために、それぞれ内在性の輸送体の破壊を有するS.cerevisiae変異体のライブラリーを構築した。
形質膜に局在するＡＢＣおよびＭＦＳ輸送体が、S.cerevisiae株ＢＹ４７４１および／またはＢＹ４７４２において（ＢＹ４７４１はATCC201388として入手可能であり、ＢＹ４７４２はATCC201389として入手可能である。Brachmann, et al., Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications, Yeast 14: 115-32, 1998を参照）、４５〜６５ｂｐの遺伝子特異的長鎖尾部を有するプライマーによって増幅された抗生物質マーカーカセットを用いて単独で破壊した。カセットを株に形質転換し、特定の輸送体遺伝子を抗生物質マーカーカセットの相同組み換えによって破壊した。天然の輸送体遺伝子の破壊をＰＣＲによって確認し、天然の遺伝子の上流配列に特異的なフォワードプライマーと抗生物質マーカーカセットの内部に位置するリバースプライマーとを用いた。変異体ライブラリーは合計で３４個の輸送体（１４個のＡＢＣ、１９個のＭＦＳおよび１個のその他）および２つの転写因子を包含した。表１５参照。
１次分析は、これらの３６遺伝子の変異体のうち酵母ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５およびＳＮＱ２遺伝子座によってコードされる輸送体が、培養培地中への１９−ＳＭＧおよびルブソシドなどのステビオールグリコシドの排出に対して検出可能な影響を有するということを示した。ＴＰＯ１、ＴＰＯ３、ＹＯＲ１、ＹＯＬ０７５ｃ、ＰＤＲ１８およびＦＬＲ１遺伝子座によってコードされる酵母の内在性の輸送体ならびにＰＤＲ１およびＰＤＲ３遺伝子座によってコードされる転写因子も、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５およびＳＮＱ２のものよりも低い程度ではあったが、ステビオールグリコシド排出に対して検出可能な影響を有した。ステビオールグリコシドの排出を変化させる複数の輸送体を同定したので、酵母によるステビオールグリコシドの排出を単一の輸送体が専ら担っているとは考えられない。
複数の輸送体の破壊がステビオールグリコシド排出に及ぼす影響を確認するために、４重破壊変異体（ｐｄｒ５、ｐｄｒ１Ｏ、ｐｄｒ１５、ｓｎｑ２）を作製した。形質転換による相同組み換えを可能にする尾部としてＰＤＲ１０外側配列を有するプライマーを用いてＰＣＲによって調製された選択マーカー−欠失カセットによって、欠失変異体ｐｄｒ１５（ＢＹ４７４２に基づくS.cerevisiae株によって作製した）を形質転換した。同様にして、ｓｎｑ２欠失株を作製し（ＢＹ４７４１に基づく）、プライマー尾部としてＰＤＲ５外側配列を用いた第２の選択マーカー−欠失カセットによって形質転換した。所産の２つの２重変異体株（ｐｄｒ１５−ｐｄｒ１０およびｓｎｑ２−ｐｄｒ５）が掛け合わされて、全ての４つの輸送体遺伝子が破壊された胞子産物を作製した。破壊は単独破壊変異体について記載のプライマー戦略を用いてＰＣＲによって確認し、４重ｐｄｒ５、ｐｄｒｌＯ、ｐｄｒｌ５、ｓｎｑ２破壊変異体の生成をもたらした。これを４×破壊変異体と呼ぶ。
４×破壊変異体を、４つのStevia rebaudiana ＵＧＴの７６Ｇ１、７４Ｇ１、９１Ｄ２ｅおよび８５Ｃ２をコードする２ミクロンプラスミドによって形質転換した。WO2011/153378A1参照。４つのＵＧＴを発現する４×破壊変異体の培養物を、ヒスチジンおよびウラシルを欠く合成完全（ＳＣ）培地の２〜３ｍｌを含む１３ｍｌ培養管によって終夜予備増殖させた。ＵＧＴプラスミドを有するがＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５、ＳＮＧ２遺伝子座は野生型の元株の培養物を、対照として供した。
翌日に、０．２５のＯＤ６００単位を遠心し、１００μΜステビオールを含む新鮮な培地中に再懸濁し、培養管中で３０℃で２ｈ振とうした。培養物の１００μＬ分取分を遠心し、等体積のＤＭＳＯを上清に添加した。細胞ペレットをＨ２Ｏで洗浄し、続いて２００μＬの５０％ＤＭＳＯ中に再懸濁した。混合物を次にボルテックスし、８０℃で１０分間加熱し、残骸を取り除くために遠心した。所産の溶液（細胞ペレット試料）を、１９−ＳＭＧの量についてＬＣ−ＭＳによって例１に記載のものと同様の方法を用いて分析した。ただしPhenomenex（登録商標）kinetex C18カラム（１５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ粒子、１００Å細孔径）を用い、より浅い勾配を４０〜５０％Ｂに用いた。これによって通常より長い保持時間がもたらされる。結果を図８に示し、４×破壊変異体株によって作られた全１９−ＳＭＧのうち約９０％がペレット中にあるということを示している。対照的に、野生型株によって作られた全１９−ＳＭＧのうちわずかに約２５％しかペレット中にはない。
４つのS.rebaudiana ＵＧＴを発現する４×破壊変異体株を、レバウジオシドＡの生産について試験した。前培養した細胞を、ＯＤ６００＝２０まで２５０μＬのステビオール含有培地（ＳＣ−Ｈｉｓ−Ｕｒａ、１００μΜステビオール）中に濃縮した。２４時間のインキュベーション（３０℃、２００ｒｐｍ）後に細胞を回収した。培養物の１００μＬ分取分を遠心し、等体積のＤＭＳＯをこの試料の上清に添加した。細胞ペレットをＨ２Ｏで１回洗浄し、２００μＬの５０％ＤＭＳＯをペレットに添加した。試料をボルテックスし、８０℃まで１０分間加熱し、遠心した。２つのＤＭＳＯ混合物の上清をプールし、ステビオールグリコシド含量をＬＣ−ＭＳによってPhenomenex（登録商標）kinetex C18カラムを用いて分析した。結果を図９に示す。それらの結果は、４つのS.rebaudiana ＵＧＴを発現する野生型株と比較して、４つのS.rebaudiana ＵＧＴを発現する４×変異体株ではＲｅｂＡの蓄積の大きな増大が観察されたということを示している。これらの結果は、モノグルコシド中間体は４×変異体株によって排出される可能性がより低く、その代わりにこれらの酵母株の細胞質におけるさらなるグリコシル化の基質として働くということを示唆している。ただし、ノックアウトされた輸送体の一部は、ＲｅｂＡなどのより高分子量のレバウジオシドの排出に特異性を有し得、培地中へのＲｅｂＡの排出が望ましい株による過剰発現に有用であり得る。経路のＵＧＴの発現によるグリコシル化活性の比率の適切なバランスによって、より低分子量のステビオールグリコシドはさらにグリコシル化されてから培地中に排出される。例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２酵素と比較して、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅならびに／またはＥＵＧＴ１１ ＵＧＴのより高い発現レベルは、より容易に排出されるステビオールモノグルコシドの蓄積を妨げることになる。ＵＧＴ活性レベルが特定のステビオールグリコシドの輸送速度よりも高い（したがってグリコシル化速度がより速い）場合、より高分子量のステビオールグリコシドが生産されることになる。
７×輸送体変異体酵母株の構築
上記の４重輸送体変異体の結果に基づき、７×輸送体破壊変異体（ｐｄｒ１５−ｐｄｒ１０−ｓｎｑ２−ｐｄｒ５−ｔｐｏ１−ｐｄｒ１−ｐｄｒ３）を作製した。ｐｄｒ１およびｐｄｒ３の２重変異体をＢＹ４７４１バックグラウンドで作製した。二重変異体を作製するのに用いたマーカーを次に除去した。所産の二重変異体を選択マーカー−欠失カセットによって形質転換した。カセットは、形質転換による相同組み換えを可能にする尾部としてＴＰＯ１外側配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲによって調製した。３重変異体ｐｄｒ１−ｐｄｒ３−ｔｐｏ１を上記の４×破壊変異体（ＢＹ４７４２に基づく）と掛け合わせた。所産の胞子から、全ての７つの位置が破壊された株が見出された。遺伝子の破壊をＰＣＲによって確認した。標的遺伝子を置換するカセットの場合には、遺伝子の破壊を確認するために上記のＰＣＲ戦略を用いた。ｐｄｒ１およびｐｄｒ３遺伝子座については、各遺伝子の上流および下流の配列にアニーリングするように設計されたフォワードおよびリバースプライマーを用いて、破壊を確認した。ＰＣＲ産物は全てのクローンで存在し、短いＰＣＲ産物が標的遺伝子の喪失を示した。
上記の４つのS.rebaudiana ＵＧＴを、４×および７×輸送体破壊変異体ならびに野生型株のゲノム中にインテグレートした。相同組み換えを用いた。ステビオール勾配の経時実験を、野生型、４×および７×変異体株がステビオールグリコシド蓄積に及ぼす影響を検討するために実施した。４×および７×破壊変異体株（それぞれ４つのS.rebaudiana ＵＧＴを発現する）の前培養された細胞を、４００μＬのステビオール含有培地（ＳＣ−Ｕｒａ、０μΜ、２０μΜ、５０μΜ、１００μΜまたは２５０μΜステビオール）中でＯＤ６００＝１まで濃縮した。株は９６深底ウェルプレートによって３０℃、３２０ｒｐｍで増殖させた。培養の約０、１、２、４、８または２４時間後に、各培養物の５０μＬ分取分を遠心し、等体積のＤＭＳＯを各分取分の上清に添加した。ステビオールグリコシド含量をＬＣ−ＭＳによって上記のようにPhenomenex（登録商標）kinetex C18カラムを用いて分析した。
結果を図１０〜１２に示す。図１０に示すように、野生型株は１９−ＳＭＧおよび１３−ＳＭＧを細胞外の培養液中に排出した。図１１および図１２に示すように、４×および７×輸送体破壊変異体は１９−ＳＭＧおよび１３−ＳＭＧを細胞外の培養液中に分泌しなかった。しかしながら、４×および７×輸送体破壊変異体は野生型株よりも大量の１，３−ビオシドを実際に排出した（図１２参照）。これらのデータは、内在性の輸送体を破壊することが酵母のステビオールグリコシドの蓄積に影響するということを示している。
上記データは、単独または組み合わせでの酵母の内在性の輸送体のノックアウトとステビオールグリコシドの増大した滞留のスクリーニングとが、培地中へのステビオールグリコシド排出を改善する過剰発現のために、見込みのある輸送体を同定する優れた方法であるということを例示している。
輸送体変異体のさらなるスクリーニング
より高分子量のレバウジオシドの排出に酵母遺伝子のノックアウトが及ぼす影響を、例２に記載の酵母株ＥＦＳＣ３２４８によって試験した。染色体上の個々の輸送体遺伝子（ＰＤＲ５、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１、ＹＨＫ８およびＦＬＲ１）の破壊は、以前に記載のように相同組み換えによって実施した。９６時間のインキュベーション（３０℃、２００ｒｐｍ）後に細胞を回収した。培養物の１００μＬ分取分を遠心し、同体積の１００％ＤＭＳＯを上清に添加した。混合物の８０マイクロリットルを「上清」試料としてＬＣ−ＭＳによって分析した。１００μＬの１００％ＤＭＳＯ中の細胞懸濁液の１００マイクロリットルを、８０℃で１０分間加熱し、次に遠心した。混合物をボルテックスし、８０℃で１０分間加熱し、残骸を除くために遠心した。所産の溶液の４０マイクロリットルを４０μＬのＤＭＳＯ（５０％）と混合し、試料を「全量」試料としてＬＣ−ＭＳによって分析した。培養上清中に排出された種々のステビオールグリコシドの量（ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ルブソシド、１３−ＳＭＧ、１．２ステビオシド、１．２ビオシドおよび不明なステビオールグリコシド（４．１３ｍｉｎ．のＬＣ−ＭＳピーク）を含む）および全培養液中の全量を、例１に記載のようにＬＣ−ＭＳによって測定した。そのデータは、１つの内在性の酵母輸送体遺伝子の破壊が、培養培地の上清中の種々のステビオールグリコシドの排出されるパーセンテージ（図１３Ｄ〜Ｆ）または量（図１３Ａ〜Ｃ）の減少をもたらすということを実証している。具体的には、ＳＮＱ２、ＹＯＲ１およびＦＬＲ１の破壊は、上清もしくは酵母株中に排出されるＲｅｂＡ、ＲｅｂＢおよびＲｅｂＤの減少または酵母株のＲｅｂＡ、ＲｅｂＢおよびＲｅｂＤの濃度の減少を、対照と比較してもたらした（図１３Ａ〜Ｆ参照。図１３の対照は「ＥＦＳＣ３２４８」である）。
その具体的な態様を参照して詳しく本発明を説明してきたが、当然のことながら、添付のクレームにおいて定められる本発明の範囲から逸脱することなく種々の改変および変形が可能である。より具体的には、本発明のいくつかの側面が本明細書において特に有利なものとされているが、本発明は本発明のそれらの特定の側面に必ずしも限定されないと考えられる。

Claims (36)

  1. 輸送体遺伝子である少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子、または両方、の改変された発現を含む、少なくとも１つのステビオールグリコシドを合成できる組み換え微生物。
  2. 輸送体遺伝子が、内在性の輸送体遺伝子または異種輸送体遺伝子である、請求項１に記載の組み換え微生物。
  3. 輸送体遺伝子が、ＡＢＣ輸送体またはＭＦＳ輸送体をコードする、請求項１または２に記載の組み換え微生物。
  4. 内在性の輸送体遺伝子または転写因子遺伝子が、ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＰＤＲ８、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、ＰＤＲ１２、ＰＤＲ１５、ＰＤＲ１８、ＹＯＲ１、ＡＵＳ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ１２、ＳＴＥ６、ＴＨＩ７３、ＮＦＴ１、ＡＤＰ１、ＦＬＲ１、ＱＤＲ１、ＱＤＲ２、ＱＤＲ３、ＤＴＲ１、ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、ＴＰＯ４、ＴＰＯ３、ＡＱＲ１、ＡＺＲ１、ＥＮＢ１、ＳＧＥ１、ＹＨＫ８、ＧＥＸ２、ＨＯＬ１、ＡＴＲ１、ＨＸＴ１１、ＥＮＢ１、ＡＲＮ１、ＡＲＮ２、ＳＳＵ１、ＴＨＩ７、ＴＰＮ１、ＳＥＯ１、ＳＩＴ１、またはＤＴＲ１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  5. 改変された発現が、輸送体遺伝子または転写因子遺伝子を過剰発現させることまたはその発現を減少させることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  6. 複数の内在性の輸送体遺伝子または転写因子遺伝子を過剰発現させることまたはその発現を減少させることを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  7. ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ１、またはＦＬＲ１を過剰発現させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  8. ２、３、４、５、６、７または８つの内在性の輸送体遺伝子または転写因子遺伝子を過剰発現させることまたはその発現を減少させることを含む、請求項６に記載の組み換え微生物。
  9. ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５およびＳＮＱ２遺伝子の発現を、各遺伝子座を破壊することによって、減少させることを含む、請求項６に記載の組み換え微生物。
  10. ＰＤＲ１、ＰＤＲ３、ＰＤＲ５、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１５、ＳＮＱ２およびＴＰＯ１遺伝子の発現を、各遺伝子座を破壊することによって、減少させることを含む、請求項６に記載の組み換え微生物。
  11. 異種輸送体が、ステビアの輸送体遺伝子である、請求項２に記載の組み換え微生物。
  12. 組み換え微生物が、Saccharomycetesである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  13. 組み換え微生物が、Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium／Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowia属から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  14. 組み換え微生物が、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhousまたはCandida albicans種から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  15. 微生物が、属Saccharomyces由来である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  16. 微生物が、Saccharomyces cerevisiaeである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  17. 微生物が、外来性の核酸にコードされる次の遺伝子：
    （ａ） スクロース輸送体およびスクロースシンターゼをコードする１つまたは２つ以上の組み換え遺伝子；
    （ｂ） ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする核酸；
    （ｃ） ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸；
    （ｄ） カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドをコードする核酸；
    （ｅ） カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする核酸；
    （ｆ） ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする核酸；
    （ｇ） シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする核酸；および、さらに適切な組み合わせで；
    （ｈ） ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする核酸；
    （ｉ） ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸；
    （ｊ） ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする核酸；
    （ｋ） ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする核酸；または
    （ｌ） ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする核酸
    の１つまたは２つ以上を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  18. スクロース輸送体が、Arabidopsis thaliana由来のＳＵＣ１であり；スクロースシンターゼが、Coffea arabica、Arabidopsis thalianaまたはStevia rebaudiana由来のＳＵＳ１であり；カウレンシンターゼが、A.thaliana由来であり；および、カウレンオキシダーゼが、S.rebaudiana由来である、請求項１７に記載の組み換え微生物。
  19. 外来性の核酸が、コドン最適化されている、請求項１７または１８に記載の組み換え微生物。
  20. 外来性の核酸が、Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項１９に記載の組み換え微生物。
  21. ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  22. ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  23. ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  24. ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする外来性の核酸を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  25. （ａ） 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組み換え微生物を、培養培地中で、ＧＧＰＰＳ；ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド；カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド；カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド；シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド；および、さらに適切な組み合わせで；ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチド；またはＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子が発現される条件下において培養すること、ここで前記遺伝子の発現を誘導することまたは前記遺伝子を構成的に発現することを含み；
    （ｂ） レバウジオシドを含む化合物の１つまたは２つ以上を組み換え微生物において合成すること；ならびに
    （ｃ） レバウジオシドを含む化合物の１つまたは２つ以上を単離すること
    を含む、レバウジオシドを生産する方法。
  26. レバウジオシドが、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥまたはレバウジオシドＭであり、
    （ａ） レバウジオシドＡが、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２を発現する組み換え微生物において合成され得；
    （ｂ） レバウジオシドＢが、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１およびＵＧＴ９１Ｄ２またはＥＵＧＴ１１を発現する組み換え微生物において合成され得；
    （ｃ） レバウジオシドＤが、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２およびＥＵＧＴ１１を発現する組み換え微生物において合成され得；
    （ｄ） レバウジオシドＥが、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２およびＥＵＧＴ１１を発現する組み換え微生物において合成され得；ならびに
    （ｅ） レバウジオシドＭが、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２およびＥＵＧＴ１１を発現する組み換え微生物において合成され得る、
    請求項２５に記載の方法。
  27. 組み換え微生物が、ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ１またはＦＬＲ１を過剰発現する、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 組み換え微生物が、２、３、４、５、６、７または８つの内在性の輸送体遺伝子または転写因子遺伝子の減少した発現を有する、請求項２５または２６に記載の方法。
  29. 組み換え微生物が、原核生物または真核生物である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 組み換え微生物が、Saccharomycetesである、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
  31. 組み換え微生物が、Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Escherichia、Fusarium／Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowia属から選択される、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 組み換え微生物が、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhousまたはCandida albicans種から選択される、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 微生物が、属Saccharomyces由来である、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 微生物が、Saccharomyces cerevisiaeである、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. レバウジオシドが、約５００ｍｇ／Ｌと約３，０００ｍｇ／Ｌとの間の濃度で生産される、請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. （ａ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組み換え微生物を用いて、ステビオールグリコシドを生産すること、そこで少なくとも１つの組み換え遺伝子が発現される；
    （ｂ）ステップ（ａ）の組み換え微生物を、培地中で、ステビオールグリコシドが合成される条件下において培養すること；および、輸送体遺伝子である少なくとも１つの遺伝子、少なくとも１つの輸送体遺伝子の発現を制御する転写因子遺伝子、または両方、を発現すること；
    （ｃ）培養ステップの間に生産されたステビオールグリコシドを単離すること
    を含む、ステビオールグリコシドの排出を変化させる方法。
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