JP6989513B2 - ホモファルネシル酸の酵素的環化 - Google Patents
ホモファルネシル酸の酵素的環化 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6989513B2 JP6989513B2 JP2018543595A JP2018543595A JP6989513B2 JP 6989513 B2 JP6989513 B2 JP 6989513B2 JP 2018543595 A JP2018543595 A JP 2018543595A JP 2018543595 A JP2018543595 A JP 2018543595A JP 6989513 B2 JP6989513 B2 JP 6989513B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- shc
- acid
- nucleic acid
- homofarnesyl
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01129—Squalene--hopanol cyclase (4.2.1.129)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
- C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
- C12Y504/99017—Squalene--hopene cyclase (5.4.99.17)
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
「ホモファルネシル酸」(化合物(1b))は、「(3E,7E)-4,8,12-トリメチルトリデカ-3,7,11-トリエン酸」と等価である。
ee%=[XA-XB]/[XA+XB]*100,
を使用して計算され、式中XA及びXBはそれぞれ鏡像異性体A及びBのモル分率である。
「アルキル」は、1〜6個、特に1〜4個の、炭素原子を有する飽和直鎖又は分枝鎖、特に直鎖炭化水素基を表し、例えば、C1〜C4アルキルの代表例として、例えば、メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル、ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル及び1,1-ジメチルエチル、並びにペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル及び1-エチル-2-メチルプロピル、特にメチル、エチル、n-プロピル及びn-ブチルがある。
本発明は、特に以下の特定の実施形態に関する:
の化合物の生物触媒製造のための方法であって、
前記化合物を、多価不飽和カルボン酸、特にホモファルネシル酸を環化することができるタンパク質、特にシクラーゼ活性を有するタンパク質と接触させる、方法。
a)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むタンパク質、
b)配列番号2によるアミノ酸配列に対して、少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、特に少なくとも75%又は80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、a)に由来したタンパク質の欠失、挿入、置換、付加、逆位、又は組合せによるタンパク質、及び
c)a)又はb)と機能的に同等であり、ホモファルネシル酸のスクラレオリドへの環化を触媒するタンパク質
から選択される、上記の実施形態のいずれか1つによる方法。
a)配列番号3〜326及び
b)欠失、挿入、置換、付加、逆位又は組合せによりそれから誘導され、少なくとも60%、65%、70%、特に少なくとも75%又は80%、好ましくは少なくとも85%、例えば少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99%の同一性の程度を有するアミノ酸配列。
a)遊離の、場合により部分的又は完全に精製された天然又は組換え的に生成されたシクラーゼ、
b)固定化された形態のa)によるシクラーゼ、
c)少なくとも1つのシクラーゼを含むインタクトな細胞、
d)c)による細胞の細胞溶解物又は細胞ホモジネート。
a)およそ4〜5.9又は5.8又は4.5〜5.8、特に4.5〜5.5又は5〜5.5の反応媒体のpH値、
b)少なくとも15mM、例えば100mMまで、特に50mMまで、特に15〜30mM、とりわけ15〜25mMの基質濃度、
c)少なくとも5mg/ml、特に5〜100、好ましくは10〜50又は15〜40又は15〜30mg/mlの酵素濃度、
d)32〜40℃、特に35〜38℃の反応温度、
e)特に1〜20mM又は5〜10mMのMgCl2を含む、クエン酸緩衝液内、特にクエン酸ナトリウム緩衝液中、
f)およそ10〜100、特に20〜50mMの緩衝液濃度
の少なくとも1つの下で行われる、上記の実施形態のいずれかによる方法。
a)ホモファルネシル酸を、請求項1〜13のいずれかによる方法によってスクラレオリドに変換する工程、
b)工程a)の生成物が、公知の方法でそれ自体がアンブロキシドールに化学的に還元される工程、及び
c)工程b)からのアンブロキシドールが、公知の方法でそれ自体が化学的にアンブロキシドに環化される工程
である、方法。
1. 特に好適なシクラーゼ配列
本発明における有用なシクラーゼは、SHCであり、その対応する野生型配列の配列番号、供給源生物及びGenbank参照番号を以下の表にまとめた。
本発明は、本明細書に具体的に開示されるシクラーゼ活性を有するタンパク質に限定されず、むしろその機能的等価物にも及ぶ。
3.1 核酸
上記のようにシクラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸もまた本発明の対象である。
複数のアライメントパラメータ:
ギャップオープニングペナルティ 10
ギャップ延長ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アライメント遅延の%同一性 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
遷移加重 0
ペアワイズアライメントパラメータ:
FASTアルゴリズム オン
K-tupleサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウィンドウサイズ 5
最良対角線の数 5
DNAギャップオープンペナルティ 15.0
DNAギャップ延長ペナルティ 6.66
DNAマトリックス アイデンティティ
プロテインギャップオープンペナルティ 10.0
タンパク質ギャップ延長ペナルティ 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP -1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
さらに、当業者は、本発明に係る酵素の機能的突然変異体を生成するためのプロセスに精通している。
- 遺伝子の個々の又は複数のヌクレオチドが標的化された様式で置換される、部位特異的突然変異誘発(Trower MK(Ed.)1996; In vitro mutagenesis protocols、Humana Press、New Jersey)、
- 任意のアミノ酸のコドンが任意の遺伝子座で置換又は付加され得る、飽和突然変異誘発(Kegler-Ebo DM、Docktor CM、DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D、Feigenbutz M、Valcarel R、Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541; Barik S(1995)Mol. Biotechnol. 3:1)、
- 誤って作用するDNAポリメラーゼによってヌクレオチド配列が突然変異される、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(エラープローンPCR、error-prone PCR)(Eckert KA、Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res. 18:3739)、
- 優先的な置換がポリメラーゼによって妨げられる、SeSaM法(配列飽和法)。Schenkら、Biospektrum、vol.3、2006、277〜279
- 例えば、ヌクレオチド配列の突然変異率の増加がDNA修復機構の欠陥のために起きるような、突然変異株における遺伝子の継代(Greener A、Callahan M、Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey)、又は
- 密接に関連する遺伝子のプールが形成され、消化され、その断片がポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用され、鎖分離及び再アニーリングの繰り返しによって全長のモザイク遺伝子が最終的に生成される、DNAシャッフリング。(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747)。
さらに、本発明の対象は、特には、調節核酸配列の遺伝子的な制御下に、本発明に係るポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換え発現構築物であり、これらの発現構築物の少なくとも1つを含む、特には組換えの、ベクターである。
文脈に応じて、用語「微生物」は、野生型微生物、又は遺伝子改変された組換え微生物、又はその両方のことを呼び得る。
本発明はさらに、ポリペプチド産生微生物を培養し、場合によりポリペプチドの発現を誘導し、ポリペプチドを培養物から単離する、本発明のポリペプチド又はその機能的に生物学的活性な断片の組換え産生方法に関する。所望の際は、このようにして工業的規模でポリペプチドを製造することもできる。
本発明に従って使用される酵素は、本明細書に記載の方法において遊離又は固定化された形態で使用することができる。固定化された酵素は、不活性担体に固定された酵素として理解されるべきである。適切な担体材料及びその上に固定された酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1069183及びDE-A 100193773及びそこに引用されている参考文献から公知である。これに関して、これらの文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。適切な担体材料としては、例えば、粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、シリカ、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、アニオン交換体材料、ポリスチレンやアクリル樹脂などの合成ポリマー、フェノール/ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン並びにポリエチレン及びポリプロピレンのようなポリオレフィンが挙げられる。担持された酵素を作成するために、担体材料は、通常、微細に分割された粒状形態で使用され、多孔質形態が好ましい。担体材料の粒径は、通常、5mm以下、特に2mm以下(粒度分布曲線)である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼを使用する場合、遊離形態又は固定形態を選択することができる。担体材料は、例えば、アルギン酸カルシウム及びカラゲナンである。酵素だけでなく細胞もまた、グルタルアルデヒドで直接架橋され得る(CLEAへの架橋)。対応する及び他の固定化技術は、例えば、J.Lalonde及びA.Margolin、「酵素の固定化(Immobilization of Enzymes)」、K. Drauz及びH. Waldmann、Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002、Vol. III、991-1032、Wiley-VCH、Weinheimに記載されている。本発明に係る方法を行うためのバイオ形質転換及びバイオリアクターに関するさらなる情報は、例えば、Rehmら(Ed.)Biotechnology、2nd Edn.、Vol. 3、Chapter 17、VCH、Weinheimにおいても与えられる。
7.1 一般的な態様
本発明に係る環化プロセスは、特に、酵素の存在下で行われる。ここで、酵素は、配列番号1の核酸配列又はその機能的等価物によってコードされ、核酸配列は、遺伝子構築物又はベクターの構成物である。そのような遺伝子構築物又はベクターは、国際出願PCT/EP2010/057696の16〜20頁に詳細に記載されており、これは本明細書において明示的に引用される。
a)遊離の、場合により精製されたか又は部分的に精製されたポリペプチド、
b)固定されたポリペプチド、
c)a)又はb)のような細胞から単離されたポリペプチド、
d)インタクトな細胞、場合によっては、少なくとも1つのこのようなポリペプチドを含む休止細胞又は増殖細胞、
e)d)のような細胞の溶解物又はホモジネート。
a)天然源からシクラーゼ活性を有する酵素を生産する微生物を単離するか又は組換えにより生成させること、
b)この微生物を増殖させること、
c)必要に応じて、微生物からシクラーゼ活性を有する酵素を単離するか、又はこの酵素を含むタンパク質画分を調製し、
d)基質、例えば一般式(Ia)のホモファルネシル酸を含む媒体中に、工程b)の微生物又は工程c)の酵素を移すこと。
特に、本発明は、スクラレオリドの製造方法であって、
a)ホモファルネシル酸をホモファルネソールアンブロキサンシクラーゼと接触させ及び/又はインキュベートし、
b)スクラレオリドが単離される、方法に関する。
a)配列番号2に示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子、
b)少なくとも1つの配列番号1に示される配列のポリヌクレオチドを含む核酸分子、
c)その配列が配列番号2の配列に対して少なくとも45%の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、
d)配列番号2に記載の配列の機能的に等価なポリペプチド又は断片をコードする(a)〜(c)に記載の核酸分子、
e)配列番号327及び328に記載のプライマーを用いてcDNAライブラリー又はゲノムDNAから核酸分子を増幅することによって得られるホモファルネシル酸シクラーゼの活性を有する機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸分子、又はde-novo合成によって化学的に合成された核酸分子、
f)(a)〜(c)に記載の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ホモファルネシル酸シクラーゼの活性を有する機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸分子、
g)(a)〜(c)に記載の核酸分子又は少なくとも15nt、好ましくは20nt、30nt、50nt、100nt、200nt又は500ntのそのサブ断片(subfragment)をプローブとしてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で用いてDNAライブラリーから単離することができる、ホモファルネシル酸シクラーゼの活性を有する機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸分子、並びに
h)ホモファルネシル酸シクラーゼの活性を有する機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸分子であって、そのポリペプチドの配列が配列番号2の配列に対して少なくとも30%の同一性を有する核酸分子、
i)ホモファルネシル酸シクラーゼの活性を有する機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記ポリペプチドがa)〜h)に記載の核酸の群から選択される核酸分子によってコードされる、核酸分子、
j)ホモファルネシル酸シクラーゼの活性を有する機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記ポリペプチドが、a)〜h)に記載のものの群から選択される核酸分子によってコードされるポリペプチドと類似又は同様の結合部位を有する、核酸分子。
下に続く例において特定の情報が与えられない限り、下記の一般情報が適用される。
使用される全ての物質及び微生物は、市販されている製品である。
[実施例1]
Zm-SHCのクローニング及び大腸菌における発現
シクラーゼの遺伝子は、オリゴヌクレオチドZm-SHC_fw及びZm-SHC_revの支援を受けてザイモモナス・モビリスから増幅され得る。
Z.モビリス由来の組換えホモファルネソールシクラーゼの提供
適切な2mlの前培養から播種した大腸菌LU15568を100mlの三角フラスコ(バッフル付き)に、20mlのLB-Amp/Spec/Cm(100μg/lアンピシリン、100μg/lスペクチノマイシン、20μg/lクロラムフェニコール)、0.1mMのIPTG、0.5g/lのラムノース中、37℃で16時間増殖させ、5000×g/10分で遠心分離し、4℃で保存した。細胞ペレットを15mlの破砕緩衝液(0.2Mトリス/HCl、0.5M EDTA、pH8.0)、375Uのベンゾナーゼ(例えば、Novagen、25U/μL)、40μLのPMSF(100mM、i-PropOHに溶解したもの)、0.8gのスクロース、及びおよそ0.5mgのリゾチーム内に懸濁することにより、タンパク質抽出物を調製した。反応混合物を混合し、氷上で30分間インキュベートした。その後、-20℃で凍結させた。
大腸菌LU15568由来の組換えシクラーゼの活性測定
ホモファルネシル酸(1b、(3E、7E)-4,8,12-トリメチルトリデカ-3,7,11-トリエン酸))を実施例2に記載のタンパク質調製物と共にインキュベートした。具体的には、0.0412gのホモファルネシル酸を秤量し(反応混合物中20mM、Z,Z 0.44%、E,Z 10.13%、E,E 74.93%からなる純度85.1%)、2.913mlの水、0.350mlのクエン酸ナトリウム緩衝液(1Mクエン酸ナトリウムpH5.4)、0.560mlのMgCl2(0.5M溶液)をピペットで入れ、混合物を37℃で30分間撹拌しながら加温した。反応は、大腸菌LU15568ホモジネート(タンパク質含量35mg/ml)を添加して開始し、37℃に加温した。反応混合物を、pH5.0、37℃で24時間、油浴中にマグネチックスターラー上、最大撹拌速度で撹拌した。反応中、pHを0.5M HClを用いて調整した。24時間のインキュベーション後、反応混合物からの0.500mlを1000mlのn-ヘプタン/n-プロパノール 3:2を用いて30秒間ボルテックスすることにより抽出した。相分離後の有機上清をGC分析に用いた(図1参照)。
温度プロファイル:
0分: 100℃
5℃/分で200℃まで
5分後: 30℃/分で320℃まで
その後、一定
手法の継続時間:30分
インジェクター温度:280℃
保持時間(RT):
ホモファルネシル酸:11.7分においてピーク1、12.1分においてピーク2、
スクラレオリド:およそ13.5分
本発明は、以下の実施形態を包含する。
(実施形態1)
立体異性的に純粋な形態での、又は立体異性体の混合物としての一般式II
の化合物の生物触媒製造のための方法であって、
前記化合物を、多価不飽和カルボン酸、特にホモファルネシル酸を環化することができるタンパク質と接触させる、方法。
(実施形態2)
式Iの化合物を、スクアレン-ホペンシクラーゼ(SHC)の酵素活性を持つタンパク質と接触させる、実施形態1に記載の方法。
(実施形態3)
使用される基質が、特に本質的に立体異性的に純粋な形態の一般式I
の多価不飽和カルボン酸である、実施形態1又は2に記載の方法。
(実施形態4)
式Ia
(実施形態5)
式IIa
(実施形態6)
前記SHCが、
a)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むタンパク質、
b)配列番号2によるアミノ酸配列に対して、少なくとも45%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、a)に由来したタンパク質の欠失、挿入、置換、付加、逆位、又は組合せによるタンパク質、及び
c)a)又はb)と機能的に同等であり、ホモファルネシル酸のスクラレオリドへの環化を触媒するタンパク質
から選択される、実施形態1から5のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態7)
生物触媒による変換が、
a)およそ4〜5.8、特に4.5〜5.5の範囲内の反応媒体のpH値で行われ、以下のさらなる条件:
b)少なくとも15mM、特に15〜30mMの基質濃度、
c)少なくとも5mg/mlの酵素濃度、
d)32〜40℃、特に35〜38℃の範囲内の反応温度、
e)1〜20mMのMgCl 2 を含むクエン酸ナトリウム緩衝液中、及び/又は
f)およそ10〜100mMの緩衝液濃度
のうちの少なくとも1つの下で行われる、実施形態1から6のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態8)
酵素のシクラーゼ活性、特にSHCの活性が:
a)遊離の、場合により部分的又は完全に精製された天然又は組換え的に生成されたシクラーゼ、
b)固定化された形態のa)によるシクラーゼ、
c)少なくとも1つのシクラーゼを含む完全な細胞、
d)c)による細胞の細胞溶解物又は細胞ホモジネートから選択される形態で存在する、実施形態1から7のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態9)
変換が、1相の水性系又は2相の水-有機系又は固体-液体系で行われる、実施形態1から8のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態10)
変換が、37℃の範囲内の温度及び5〜5.2の範囲内のpH値で行われる、実施形態1から9のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態11)
SHCが、メチロコッカス・カプサラツス、ロドシュードモナス・パルストリス、ブラジリゾビウム・ジャポニカム、フランキア属の種、ストレプトマイセス・セリカラー、特にザイモモナス・モビリスから選択される微生物から単離される、実施形態1から10のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態12)
SHCが、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、ラルストニア属、クロストリジウム属、シュードモナス属、バチルス属、ザイモモナス属、ロドバクター属、ストレプトマイセス属、バークホルデリア属、ラクトバチルス属及びラクトコッカス属、特にエシェリキア属の細菌の中から選択されるSHCを過剰発現する微生物から単離される、実施形態1から11のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態13)
SHCが、大腸菌、シュードモナス・プチダ、バークホルデリア・グルマエ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・セリカラー及びザイモモナス・モビリス、特に大腸菌の種のトランスジェニックなSHC過剰発現細菌から単離される、実施形態1から12のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態14)
3a,6,6,9a-テトラメチルドデカヒドロナフト[2,1-b]フラン(アンブロキシド)の製造方法であって、
a)ホモファルネシル酸を、実施形態1から13のいずれか一項に記載の方法によってスクラレオリドに変換し、
b)工程a)の生成物をアンブロキシドールに化学的に還元し、
c)工程b)からのアンブロキシドールを化学的にアンブロキシドに環化する、方法。
(実施形態15)
アンブロキシドが、(-)-アンブロキシド((3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-テトラメチルドデカヒドロナフト[2,1-b]フラン[CAS 6790-58-5])である、実施形態14に記載の方法。
配列番号1〜326 種々のSHC遺伝子の核酸/アミノ酸配列
配列番号327〜328 PCRプライマー
Claims (12)
- ホモファルネシル酸が、出発物質として、本質的に立体異性的に純粋な形態で使用される、請求項1に記載の方法。
- スクラレオリドが、立体異性的に純粋な形態で、又は立体異性体の混合物として得られる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記SHCが、
a)配列番号2のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むタンパク質、
b)配列番号2によるアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドを含む、a)に由来したタンパク質の欠失、挿入、置換、付加、逆位、又は組合せによるタンパク質、及び
c)a)又はb)と機能的に同等であり、ホモファルネシル酸のスクラレオリドへの環化を触媒し、且つ配列番号3から326から選択されるタンパク質
から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - 生物触媒による変換が、
a)およそ4〜5.8、特に4.5〜5.5の範囲内の反応媒体のpH値で行われ、以下のさらなる条件:
b)少なくとも15mM、特に15〜30mMの基質濃度、
c)少なくとも5mg/mlの酵素濃度、
d)32〜40℃、特に35〜38℃の範囲内の反応温度、
e)1〜20mMのMgCl2を含むクエン酸ナトリウム緩衝液中、及び/又は
f)およそ10〜100mMの緩衝液濃度
のうちの少なくとも1つの下で行われる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - SHCが:
a)遊離の、場合により部分的又は完全に精製された天然又は組換え的に生成されたシクラーゼ、
b)固定化された形態のa)によるシクラーゼ、
c)少なくとも1つのシクラーゼを含む完全な細胞、
d)c)による細胞の細胞溶解物又は細胞ホモジネートから選択される形態で存在する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - 変換が、1相の水性系又は2相の水-有機系又は固体-液体系で行われる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 変換が、約37℃の温度及び5〜5.2の範囲内のpH値で行われる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- SHCが、メチロコッカス・カプサラツス、ロドシュードモナス・パルストリス、ブラジリゾビウム・ジャポニカム、フランキア属の種、ストレプトマイセス・セリカラー、特にザイモモナス・モビリスから選択される微生物から単離される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- SHCが、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、ラルストニア属、クロストリジウム属、シュードモナス属、バチルス属、ザイモモナス属、ロドバクター属、ストレプトマイセス属、バークホルデリア属、ラクトバチルス属及びラクトコッカス属、特にエシェリキア属の細菌の中から選択されるSHCを過剰発現する微生物から単離される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- SHCが、プラスミドpDHE-Zm-SHC-1を大腸菌TG10 pAgro4 pHSG575株に形質転換することによって調製された大腸菌LU15568のトランスジェニックなSHC過剰発現細菌から製造される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- アンブロキシドが、(-)-アンブロキシド((3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-テトラメチルドデカヒドロナフト[2,1-b]フラン[CAS 6790-58-5])である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021195857A JP7507739B2 (ja) | 2016-02-19 | 2021-12-02 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
JP2023216816A JP2024038047A (ja) | 2016-02-19 | 2023-12-22 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16156410 | 2016-02-19 | ||
EP16156410.9 | 2016-02-19 | ||
PCT/EP2017/053795 WO2017140909A1 (de) | 2016-02-19 | 2017-02-20 | Enzymatische zyklisierung von homofarnesylsäure |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021195857A Division JP7507739B2 (ja) | 2016-02-19 | 2021-12-02 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019505222A JP2019505222A (ja) | 2019-02-28 |
JP6989513B2 true JP6989513B2 (ja) | 2022-01-05 |
Family
ID=55446622
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018543595A Active JP6989513B2 (ja) | 2016-02-19 | 2017-02-20 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
JP2021195857A Active JP7507739B2 (ja) | 2016-02-19 | 2021-12-02 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
JP2023216816A Pending JP2024038047A (ja) | 2016-02-19 | 2023-12-22 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021195857A Active JP7507739B2 (ja) | 2016-02-19 | 2021-12-02 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
JP2023216816A Pending JP2024038047A (ja) | 2016-02-19 | 2023-12-22 | ホモファルネシル酸の酵素的環化 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10954538B2 (ja) |
EP (2) | EP3816297A1 (ja) |
JP (3) | JP6989513B2 (ja) |
CN (1) | CN109072265A (ja) |
BR (1) | BR112018016789A2 (ja) |
ES (1) | ES2854724T3 (ja) |
MX (2) | MX2018010024A (ja) |
MY (1) | MY196447A (ja) |
WO (1) | WO2017140909A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018153727A2 (de) | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Basf Se | Verfahren zur herstellung von ungesättigten carbonsäuren durch carbonylierung von allylalkoholen und deren acylierungsprodukten |
ES2890814T3 (es) | 2017-02-24 | 2022-01-24 | Basf Se | Procedimiento de preparación del ácido (3E,7E)-homofarnésico o del éster del ácido (3E,7E)-homofarnésico |
CN107828709B (zh) * | 2017-11-09 | 2021-06-25 | 天津大学 | 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法 |
GB202005468D0 (en) * | 2020-04-15 | 2020-05-27 | Givaudan Sa | Enzyme-media process |
JP2024527512A (ja) | 2021-06-21 | 2024-07-25 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | Mn-PNN錯体存在下でのエステルからアルコールへの水素化反応 |
WO2023245039A1 (en) * | 2022-06-15 | 2023-12-21 | International Flavors & Fragrances Inc. | Squalene hopene cyclase variants for producing sclareolide |
Family Cites Families (51)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US513270A (en) | 1894-01-23 | August friedrich wilhelm kreinsen | ||
ATE72457T1 (de) | 1983-07-13 | 1992-02-15 | Basf K & F Corp | Verfahren zur herstellung eines diols und eines furans und dazu faehiger mikroorganismus. |
DE4027419A1 (de) | 1990-08-30 | 1992-03-05 | Huels Chemische Werke Ag | Verfahren zur reaktivierung von desaktivierten hydrierkatalysatoren |
DE19931847A1 (de) | 1999-07-09 | 2001-01-11 | Basf Ag | Immobilisierte Lipase |
DE10019373A1 (de) | 2000-04-18 | 2001-10-31 | Pfreundt Gmbh & Co Kg | Vorrichtung und Verfahren zur Steuerung eines Maschinenbauteils |
DE10019380A1 (de) | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von kovalent gebundenen biologisch aktiven Stoffen an Polyurethanschaumstoffen sowie Verwendung der geträgerten Polyurethanschaumstoffe für chirale Synthesen |
DE10019377A1 (de) | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Basf Ag | Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien und Verwendung der mit biologisch aktiven Stoffen geträgerten Materialien für chirale Synthesen |
JP4663632B2 (ja) * | 2003-06-18 | 2011-04-06 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | α−ヒドロキシカルボン酸の微生物学的異性化方法 |
DE102004022686A1 (de) | 2004-05-05 | 2005-11-24 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole |
DE102005010804A1 (de) | 2005-03-07 | 2006-09-14 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Alkohole |
JP4854418B2 (ja) * | 2006-07-28 | 2012-01-18 | 花王株式会社 | ドデカヒドロ−3a,6,6,9a−テトラメチルナフト[2,1−b]フラン原料の製造方法 |
EP2238256B1 (en) * | 2008-01-29 | 2015-10-14 | Firmenich S.A. | Method for producing sclareol |
CN102449158B (zh) * | 2009-06-05 | 2017-08-25 | 巴斯夫欧洲公司 | 龙涎呋喃的生物催化产生 |
EP3470515B1 (de) | 2010-11-17 | 2022-07-13 | Basf Se | Verfahren zur biokatalytischen cyclisierung von terpenen und darin einsetzbare cyclase-mutanten |
US8932839B2 (en) * | 2010-11-17 | 2015-01-13 | Basf Se | Method for the biocatalytic cyclization of terpenes and cyclase mutants employable therein |
EP2915797A1 (de) | 2014-03-07 | 2015-09-09 | Basf Se | Verfahren zur Herstellung von Menthonen aus Isopulegol in der Gasphase |
EP2865676A1 (de) | 2014-04-14 | 2015-04-29 | Basf Se | Herstellung von 2-substituierten 4-Methyl-tetrahydropyranen aus 2-Alkyl-4,4-dimethyl-1,3-dioxan-haltigen Ausgangsstoffen |
MX2016013560A (es) | 2014-04-14 | 2017-02-13 | Basf Se | Produccion de 4-hidroxi-4-metiltetrahidropiranos 2-sustituidos que tienen calidad odorifera estable. |
MX2016013555A (es) | 2014-04-14 | 2017-02-13 | Basf Se | Produccion de 4-hidroxi-4-metil-tetrahidropiranos 2-sustituidos a partir de materiales de partida que contienen 2-alquil-4,4-dimetil-1,3-dioxanos. |
EP3180310A1 (de) | 2014-08-12 | 2017-06-21 | Basf Se | Verfahren zur herstellung zyklischer alpha-ketoalkohole aus zyklischen alpha-ketoenolen |
US10017465B2 (en) | 2014-08-12 | 2018-07-10 | Basf Se | Method for producing astaxanthin from astacin |
EP2985364A1 (en) | 2014-08-14 | 2016-02-17 | Basf Se | Process for preparing alcohols by electrochemical reductive coupling |
US10533201B2 (en) | 2014-09-10 | 2020-01-14 | Basf Se | Enzymatic transphosphorylation of sugar substrates |
BR112017004761A2 (pt) | 2014-09-11 | 2017-12-05 | Basf Se | método para preparar um diéster de astaxantina, uso não terapêutico de um diéster, e, diéster |
MX2017003238A (es) | 2014-09-12 | 2017-06-29 | Basf Se | Metodo para preparar 2'-o-fucosil-lactosa. |
EP3197987B1 (de) | 2014-09-26 | 2019-01-23 | Basf Se | Verwendung von isomerenreinem oder hoch isomerenangereichertem cis- oder trans-(2-isobutyl-4-methyl-tetrahydropyran-4-yl)acetat |
ES2718753T3 (es) | 2014-09-29 | 2019-07-04 | Basf Se | Procedimiento para la ciclización biocatalítica de geranillinalool y los productos de ciclización obtenidos al respecto |
EP3002003A1 (de) | 2014-09-30 | 2016-04-06 | Basf Se | Verwendung neuartiger cyclischer Carbaldehyde als Aromastoff |
EP3201175B1 (en) | 2014-10-02 | 2020-12-16 | Basf Se | Process for purifying astaxanthin |
US10087395B2 (en) | 2014-10-14 | 2018-10-02 | Basf Se | Use of hexadeca-8,15-dienal as aroma chemical |
MX2017006545A (es) | 2014-11-18 | 2017-08-09 | Basf Se | Proceso para la preparacion de 1-(2,6,6-trimetilciclohexil)-alcan- 3-oles. |
EP3233780B1 (en) | 2014-12-19 | 2018-08-01 | Basf Se | 1-(7,10,10-trimethyl-4-bicyclo(6.2.0)decanyl)ethanone as novel aroma chemical |
MX2017008171A (es) | 2014-12-19 | 2017-09-18 | Basf Se | Proceso para preparar 1-[(1r,4r/s,8s)-10,10-dimetil-7-metilen-4-bi ciclo [6.2.0] decanilo] etanona. |
CN107438600B (zh) | 2015-03-05 | 2021-04-13 | 巴斯夫欧洲公司 | 制备四氢吡喃基酯的方法 |
DE102015103608A1 (de) | 2015-03-11 | 2016-09-15 | Basf Se | Verfahren zur mikrobiellen de novo Synthese von Terpenen |
EP3274465B1 (de) | 2015-03-26 | 2022-08-03 | Basf Se | Biokatalytische herstellung von l-fucose |
ES2821890T3 (es) | 2015-05-04 | 2021-04-28 | Basf Se | Procedimiento de preparación de melonal |
ES2775502T3 (es) | 2015-05-20 | 2020-07-27 | Basf Se | Procedimiento de preparación de una dicetona macrocíclica |
JP2018516914A (ja) | 2015-05-29 | 2018-06-28 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | 環式エステルの製造方法 |
CN107709283B (zh) | 2015-06-03 | 2021-02-02 | 巴斯夫欧洲公司 | 制备3-甲基环十五烷-1,5-二酮的方法 |
US10315975B2 (en) | 2015-07-10 | 2019-06-11 | Basf Se | Method for the hydroformylation of 2-substituted butadienes and the production of secondary products thereof, especially ambrox |
CN107848929A (zh) | 2015-07-15 | 2018-03-27 | 巴斯夫欧洲公司 | 制备芳基丙烯的方法 |
US10202323B2 (en) | 2015-07-15 | 2019-02-12 | Basf Se | Process for preparing an arylpropene |
ES2733802T3 (es) | 2015-08-18 | 2019-12-03 | Basf Se | Procedimiento de preparación de 1,4-bis(etoximetil)ciclohexano |
WO2017029313A1 (en) | 2015-08-18 | 2017-02-23 | Basf Se | Process for preparing alpha-damascone |
CN108026007B (zh) | 2015-09-22 | 2021-04-20 | 巴斯夫欧洲公司 | 制备3-甲基环十五烷-1,5-二醇的方法 |
BR112018006730A2 (pt) | 2015-10-08 | 2018-10-09 | Basf Se | método para preparar um composto, substância ou mistura de substância, uso de pelo menos uma substância ou mistura de substância, composição de fragrância, e, agente. |
EP3153493A1 (de) | 2015-10-08 | 2017-04-12 | Basf Se | Verfahren zur reinigung von cyclohexadec-8-en-1-on |
CN108350401B (zh) | 2015-10-23 | 2021-06-04 | 巴斯夫欧洲公司 | 气味物质和芳香剂与乙烯基内酰胺聚合物的固溶体 |
EP3170828A1 (de) | 2015-11-23 | 2017-05-24 | Basf Se | Verfahren zur herstellung von verbindungen mit 16-oxabicyclo[10.3.1]pentadecengerüst und deren folgeprodukten |
BR112018011459A2 (pt) | 2015-12-08 | 2018-11-27 | Basf Se | processo, material zeolítico, e, uso de um material zeolítico. |
-
2017
- 2017-02-20 BR BR112018016789A patent/BR112018016789A2/pt active Search and Examination
- 2017-02-20 MY MYPI2018001449A patent/MY196447A/en unknown
- 2017-02-20 US US15/999,299 patent/US10954538B2/en active Active
- 2017-02-20 CN CN201780024288.8A patent/CN109072265A/zh active Pending
- 2017-02-20 EP EP20188856.7A patent/EP3816297A1/de active Pending
- 2017-02-20 EP EP17706448.2A patent/EP3417067B1/de active Active
- 2017-02-20 MX MX2018010024A patent/MX2018010024A/es unknown
- 2017-02-20 WO PCT/EP2017/053795 patent/WO2017140909A1/de active Application Filing
- 2017-02-20 ES ES17706448T patent/ES2854724T3/es active Active
- 2017-02-20 JP JP2018543595A patent/JP6989513B2/ja active Active
-
2018
- 2018-08-17 MX MX2021002854A patent/MX2021002854A/es unknown
-
2020
- 2020-12-23 US US17/131,930 patent/US20210381013A1/en active Pending
-
2021
- 2021-12-02 JP JP2021195857A patent/JP7507739B2/ja active Active
-
2023
- 2023-12-22 JP JP2023216816A patent/JP2024038047A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3816297A1 (de) | 2021-05-05 |
BR112018016789A2 (pt) | 2018-12-26 |
ES2854724T3 (es) | 2021-09-22 |
JP2019505222A (ja) | 2019-02-28 |
US20210381013A1 (en) | 2021-12-09 |
MX2018010024A (es) | 2018-11-09 |
US20190144899A1 (en) | 2019-05-16 |
JP7507739B2 (ja) | 2024-06-28 |
EP3417067B1 (de) | 2020-11-18 |
WO2017140909A1 (de) | 2017-08-24 |
CN109072265A (zh) | 2018-12-21 |
MY196447A (en) | 2023-04-12 |
JP2022033873A (ja) | 2022-03-02 |
MX2021002854A (es) | 2021-05-28 |
US10954538B2 (en) | 2021-03-23 |
EP3417067A1 (de) | 2018-12-26 |
JP2024038047A (ja) | 2024-03-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6989513B2 (ja) | ホモファルネシル酸の酵素的環化 | |
JP7418272B2 (ja) | テルペンの生体触媒環化のための方法及びその方法で使用され得るシクラーゼ変異体 | |
JP6598852B2 (ja) | ゲラニルリナロールの生体触媒環化方法及びこれにより得られる環化物 | |
US20230078975A1 (en) | Method for producing vanillin | |
CN110325646B (zh) | 制备(3e,7e)-高法尼酸或(3e,7e)-高法尼酸酯的方法 | |
KR102394701B1 (ko) | 7-베타-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 돌연변이체 및 우르소데옥시콜산의 제조 방법 | |
JP6230549B2 (ja) | アルドキシムデヒドラターゼを使用するテルペンオキシムからのテルペンニトリルの製造方法 | |
US20210310031A1 (en) | Method for producing drimanyl acetate compounds | |
WO2011012632A2 (en) | Biocatalyst for catalytic hydroamination | |
US20060211099A1 (en) | L-carnitin dehydrogenases, their derivatives and method for producing substituted (s) alkanols | |
US20220042051A1 (en) | Lipoxygenase-catalyzed production of unsaturated c10-aldehydes from polyunsatrurated fatty acids | |
JP5820778B2 (ja) | エステラーゼ活性を有するタンパク質 | |
JP2012511922A (ja) | デュロキセチンアルコールを製造するための改良型生体触媒 | |
US9080191B2 (en) | Method for biocatalytic production of nitriles from oximes and oxime dehydratases usable therein | |
EP2280075A1 (en) | Biocatalyst for catalytic hydroamination |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A529 | Written submission of copy of amendment under article 34 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529 Effective date: 20181012 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210330 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210624 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210929 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211102 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211202 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6989513 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |