CN109072265A - 高法呢酸的酶促环化 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过生物催化环化多不饱和羧酸化合物制备香紫苏内酯和相关化合物、尤其高法呢酸和相关化合物的方法;并涉及通过高法呢酸至香紫苏内酯的生物催化环化制备龙涎香醚的方法。
Description
本发明涉及通过生物催化环化多不饱和羧酸化合物、尤其高法呢酸和相关化合物制备香紫苏内酯和相关化合物的方法;并涉及通过高法呢酸至香紫苏内酯的生物催化环化制备龙涎香醚的方法。
发明背景
具有十二氢萘并[2.1-b]呋喃骨架的化合物具有作为芳香化学物质的巨大经济意义。在这种情况下,应当提到化合物(-)-2;即,(3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-四甲基十二氢萘并[2.1-b]-呋喃,称作龙涎香烷的左旋立体异构体。
龙涎香烷(Ambroxan)最初从抹香鲸龙涎香获得并且目前可以主要通过二个途径制备。往往使用香紫苏醇(3)(鼠尾草(香紫苏(Salvia sclarea))组分)作为半合成物质的合适原料,因为它已经含有化合物((-)-2)的光学信息。这里,可以使用铬酸、高锰酸盐、H2O2或臭氧,实施氧化性降解[Stoll等人;Helv Chim Acta(1950),33:1251]。所产生的香紫苏内酯(4)随后转化(例如使用LiAlH4或NaBH4)成降龙涎-1,4-二醇(5)[Mookherjee等人;Perfumer and Flavourist(1990),15:27]。也可以用Hyphozyma roseoniger通过生物转化,实现从香紫苏醇(3)制备化合物(4)[EP 204009]。
最后,降龙涎-1,4-二醇(5)可以在一系列化学过程中环化以产生化合物((-)-2)。已经对尤其借助高法呢酸[US 513,270;Lucius等人;Chem Ber(1960),93:2663]和4-(2,6,6-三甲基环己-1-烯基)丁-2-酮[Büchi等人;Helv Chim Acta(1989),72:996]制备龙涎香烷消旋物(rac-2)实施了研究。
在2002年,龙涎香烷的市场容量平均是20吨/年。这需要每年大约33吨香紫苏醇的起始基体。生产一吨龙涎香烷需要207吨各种独立物质,这转而导致产生206吨废物。日益蓄积的物质对健康和环境具有不同但总体上相对强的影响[Deutsche BundesstiftungUmwelt]。因此,这种合成过程消耗大量的能量并且需要使用有污染性的化学物质。
已经在文献中描述化合物((-)-2)的生物催化合成[Neumann等人;Biol ChemHoppe Seyler(1986),367:723]。这里,该分子从高法呢醇(化合物(1a),(3Z,7E)-4,8,12-三甲基-十三碳-3,7,11-三烯-1-醇)获得。使用的催化剂是来自酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)(前称酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius))的鲨烯-禾烯环化酶(SHC)。已经在专利说明书(例如WO 2012/066059)中和文献[Neumann等人,参见上述引文]中描述了催化高法呢醇环化成降龙涎香醚的其他酶。
Seitz,M.等人在ChemBioChem 2013,14,436-439中描述了一种使用运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)鲨烯-禾烯环化酶(Zm SHCI)从高法呢酸制备香紫苏内酯的酶促方法。但是,其中获得的产物产率仅是大约7.7%至22.9%。
本发明的目的是提供一种制备龙涎香醚前体、尤其香紫苏内酯和相关化合物的改进方法,所述方法可以按照比传统化学方法更简单和更经济的方式实施(例如要求的反应步骤数目减少和/或原料更便利)。又一个目的是通过使用轻易可获得的原料和通过减少化学反应(或步骤)的数目,额外减少日渐上升的成本。具体地说,应当提供改进的制备香紫苏内酯的生物催化方法。
发明简述
通过提供用于制备通式(4)的龙涎香醚前体,优选地香紫苏内酯的方法实现以上目的,所述方法的特征在于生物催化方式环化高法呢酸衍生物、尤其通式1b的高法呢酸,如下文更详细描述。
附图简述
图1显示与(B)市售香紫苏内酯制品的GC相比,根据本发明制备的高法呢酸环化产物的气相色谱(GC)谱图(A)。
发明详述
A.一般定义
“高法呢酸”(化合物(1b))等同于“(3E,7E)-4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯酸”。
“香紫苏内酯”(化合物(4))等同于“(3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-四甲基-1,4,5,5a,7,8,9,9b-八氢苯并[e]苯并呋喃-2-酮”。
左旋香紫苏内酯(或化合物(-)-4)具有以下式:
“降龙涎香醚”、“龙涎香烷”和“Amroxide”在本文中以同义方式使用。它们包含全部立体异构形式,尤其如(+)-降龙涎香醚、3a-表-(-)降龙涎香醚、9b-表-(-)降龙涎香醚和尤其(-)降龙涎香醚。
出于本发明目的,“环化酶”通常是尤其显示高法呢酸环化酶活性的酶或酶突变体。具有高法呢酸环化酶的活性的合适酶是来自异构酶亚类的分子间转移酶;也就是说,具有EC编号EC 5.4(按照Eur.J.Biochem.1999,264,610-650的酶代码)的蛋白质。它们尤其是EC 5.4.99.17的表现形式。具有高法呢酸环化酶的活性的合适酶是尤其这些环化酶,它们还导致高法呢酸环化成香紫苏内酯和/或导致鲨烯环化成禾烯(因此还偶尔称作“SHC”鲨烯-禾烯环化酶)并且详述于本文明确引用的国际申请PCT/EP2010/057696中。例如在本文明确引用的WO 2012/066059中描述了其突变体。
鉴于酶促反应的可逆性,本发明涉及本文所述的处于两个反应反向的酶促反应。
“环化酶”的“功能突变体”包括下文限定的这类酶的“功能性等同物”。
术语“生物催化方法”指在本发明“环化酶”的催化活性或具有“环化酶活性”的酶存在下(即在粗制或纯化、溶解、分散或固定化的酶存在下或在具有或表达这种酶活性的完好微生物细胞存在下)实施的任何方法。因此,生物催化方法包括酶促方法和微生物方法。
术语“立体异构体”包括构象异构体和尤其构型异构体,如对映异构体和非对映异构体。
根据本发明,通常还涵盖本文所述的化合物的全部立体异构形式,如构造异构体和尤其立体异构体及混合的立体异构体,例如光学异构体或几何异构体,如E和Z异构体,及这些的组合。如果于分子中存在多个非对称中心,则本发明包含这些非对称中心的不同构象的全部组合,例如,对映异构体对。
术语“立体特异性”意指根据本发明制备的具有至少一个非对称中心的化合物的几种可能立体异构体之一,因为本发明酶的活性,以高“对映异构过量”或高“对映异构纯度”(例如至少90%ee、尤其至少95%ee或至少98%ee或至少99%ee)产生。使用以下式计算ee%值:
ee%=[XA-XB]/[XA+XB]*100,
----------------------------------------------
其中XA和XB分别是对映异构体A和B的摩尔分数。
已经对“参考底物在标准条件下”测定的“环化酶活性”例如是描述从非环状底物形成环状产物的酶活性。标准条件的例子是在pH 4至8并且在例如15至30℃或20至25℃的温度下,从10mM至0.2M、尤其15至100mM,例如,大约20至25mM的底物浓度。这里,可以使用重组环化酶表达细胞、破碎的环化酶表达细胞、其级分或富集或纯化的环化酶实施测定。参考底物尤其是式(Ia)的高法呢酸;标准条件尤其是在20至25℃和pH 4–6,如4.5,大约20至25mM式(Ia)的高法呢酸;如还在实施例中更详细地描述。
将高法呢酸借助本发明的环化酶转化成香紫苏内酯期间,在限定的时间范围内(例如、4、6、8、10、12、16、20、24、36或48小时)测定本发明反应的“产率”和/或“转化率”。尤其,在精确限定的条件(例如,25、30、40、50或60℃)下实施转化。特别地,借助本发明环化酶在30℃历经16小时实施将高法呢酸转化成香紫苏内酯的反应,测定产率和/或转化率。
为了确定产率和/或转化率,将尤其使10mM高法呢酸溶液与环化酶溶液反应,酶作为表达环化酶的细胞的膜蛋白提取物(例如,如[Ochs D.等人;J.Bacteriol,(1992),174:298]所述那样分离)以重量计按0.08%的蛋白质含量浓度存在。
本发明的环化酶也可以特征在于,相同条件下将高法呢酸转化成香紫苏内酯时,与来自酸热脂环酸杆菌(前称酸热芽孢杆菌)的鲨烯-禾烯环化酶(SHC)相比,它显示2-,3-,4-,5-,6-,7-,8-,9-,10-,11-,12-,13-,14-,15-,16-,17-,18-,19-,20-,21-,22-,23-,24-,25-,26-,27-,28-,29-,30-,31-,32-,33-,34-,35-,36-,37-,38-,39-,40-,41-,42-,43-,44-,45-,46-,47-,48-,49-,50-,51-,52-,53-,54-,55-,56-,57-,58-,59-,60-,61-,62-,63-,64-,65-,66-,67-,68-,69-,70-,71-,72-,73-,74-,75-,76-,77-,78-,79-,80-,81-,82-,83-,84-,85-,86-,87-,88-,89-,90-,91-,92-,93-,94-,95-,96-,97-,98-,99-,100-,200-,500-,1000倍或更高的产率和/或转化率。这里,术语“条件”指诸反应条件,如底物浓度、酶浓度、反应时间和/或温度。
术语“羧酸”包括游离酸和其盐形式,例如,其碱或碱土金属盐。这类似地适用于本文提到的全部羧酸,例如,高法呢酸。
术语“大约”指所述值的±25%、尤其±15%、±10%、优选地±5%、±2或±1%的潜在变化。
术语“基本上”涵盖大约80%直至并包括100%的值范围,如85-99.9%、特别地90%至99.9%、优选地95%至99.9%或98%至99.9%、尤其99%至99.9%。
除非另外说明,否则以下一般化学定义适用于本文中:
“烷基”表示饱和的、直链或分枝的、尤其具有1至6个、尤其1个至4个碳原子的直链烃基,例如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基和1,1-二甲基乙基作为C1-C4-烷基代表的例子;和戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基和尤其甲基、乙基、正丙基和正丁基。
B.本发明的具体实施方案
本发明特别地涉及以下具体实施方案:
1.一种用于生物催化制备立体异构纯形式或作为立体异构体混合物的通式II的化合物的方法,
其中R1、R2、R3和R4彼此独立地代表H或C1-C4-烷基、尤其甲基或乙基、优选地甲基,
其中使化合物与蛋白质、尤其具有环化酶活性的蛋白质接触,所述蛋白质能够环化多不饱和羧酸、尤其高法呢酸。
2.根据实施方案1的方法,其中使式I的化合物与具有鲨烯-禾烯环化酶(SHC)的酶活性的蛋白质接触。
3.根据实施方案1或2的方法,其中使用的底物是通式I的多不饱和羧酸,
其中R1、R2、R3和R4具有上述含义,
尤其处于基本上立体异构纯形式。
4.根据前述实施方案中任一项的方法,其中将式Ia的高法呢酸,
使用作为原料,尤其以基本上立体异构纯形式,基于存在的高法呢酸异构体的总量,优选地以至少70mol%,特别优选地至少75、80或85mol%、最优选地90、95或99或99.9mol%的(3E,7E)-高法呢酸比例使用。
5.根据实施方案4的方法,其中式IIa的香紫苏内酯
以立体异构纯形式或作为立体异构体混合物获得。
6.根据前述实施方案中任一项的方法,其中SHC选自
a)包含多肽的蛋白质,所述多肽具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列,
b)根据a)通过缺失、插入、取代、添加、倒位或组合所衍生的蛋白质,包含与根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、尤其至少75%或80%、优选地至少85%,例如,至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性的多肽;
c)功能上与a)或b)等同并且催化高法呢酸环化成香紫苏内酯的蛋白质。
7.根据实施方案6的方法,其中功能上等同的蛋白质包含具有选自以下的氨基酸序列的多肽:
a)SEQ ID NO:326至326和
b)通过缺失、插入、取代、添加、倒位或组合从中衍生并且与之具有至少60%、65%、70%、尤其至少75%或80%、优选地至少85%,例如,至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性程度的氨基酸序列。
8.根据前述实施方案中任一项的方法,其中酶促环化酶活性、尤其SHC活性以选自以下的形式存在:
a)游离的、任选地部分或完全纯化的天然或重组产生的环化酶,
b)固定形式的根据a)的环化酶;
c)包含至少一种环化酶的完整细胞;
d)根据c)的细胞的细胞裂解物或细胞匀浆。
9.根据前述实施方案中任一项的方法,其中转化在单相含水体系或在双相水-有机或固-液体系中实施。
10.根据前述实施方案中任一项的方法,其中转化在0至60℃、尤其10至50℃、优选地20℃至40℃的温度和/或4至8、尤其5至7的pH值实施。
11.根据前述实施方案中任一项的方法,其中SHC从选自荚膜甲基球菌(Methylococcus capsalatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弗兰克菌属(Frankia)物种、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和尤其运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的微生物分离。
12.根据前述实施方案中任一项的方法,其中SHC从选自以下属的细菌的过量表达SHC的微生物分离:埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、红杆菌属(Rhodobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、乳杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus)。
13.根据前述实施方案中任一项的方法,其中SHC从以下物种的过量表达SHC的转基因细菌分离:大肠杆菌(Escherichia coli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荚壳伯克霍尔德菌(Burkholderia glumae)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和运动发酵单胞菌。
14.根据前述实施方案中任一项的方法,其中转化按分批模式、补料分批模式或连续模式实施。
15.根据前述实施方案中任一项的方法,其中生物催化转化在以下条件至少之一下实施:
a)在大约4至5.9或5.8或4.5至5.8、尤其4.5至5.5或5至5.5的反应介质pH值;
b)在至少15mM,例如,直至100mM、尤其直至50mM、尤其15至30mM、尤其15至25mM的底物浓度;
c)在至少5mg/ml;尤其5至100、优选地10至50或15至40或15至30mg/ml的酶浓度;
d)在范围从32至40℃、尤其35至38℃的反应温度;
e)在柠檬酸盐缓冲液、尤其柠檬酸钠缓冲液中,尤其包含1至20mM或5至10mMMgCl2的缓冲液;
f)在大约10至100、尤其20至50mM的缓冲液浓度下。
优选地在以上条件a)至b)或a)至c)或a)至d)或a)至e)或a)至f)同时实现的情况下实施本发明的方法。这里,参数范围的任何组合均是本公开的部分,与各个范围的相应优选程度无关。
16.用于制备3a,6,6,9a-四甲基十二氢萘并[2.1-b]呋喃(龙涎香醚)的方法,其中
a)将高法呢酸根据权利要求1至13中任一项所述的方法转化成香紫苏内酯;
b)将步骤a)的产物按本身已知的方式化学还原成降龙涎二醇,并且
c)把来自步骤b)的降龙涎二醇按本身已知的方式化学环化成龙涎香醚。
17.根据实施方案16的方法,其中龙涎香醚是(-)-龙涎香醚((3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-四甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃[CAS 6790-58-5])。
C.本发明的其他实施方案
1.特别合适的环化酶序列
根据本发明有用的环化酶是SHC,其相应野生型序列的SEQ ID NO、源生物和Genbank参考号编纂于下表中。
SEQ ID NO:2是本文中也称作Zm-SHC-1的环化酶的氨基酸序列。
2.本发明的其他蛋白质/酶突变体
本发明不限于本文中具体公开的具有环化酶活性的蛋白,反而还扩展至其功能性等同物。
在本发明的范围内,具体公开的酶、尤其SEQ ID NO:2至6的“功能性等同物”或类似物是与它们不同并仍保留所需生物学活性、尤其如环化酶活性的多肽。
因此,例如,“功能性等同物”理解为意指这些酶和突变体,它们在本发明意思范围内所用(即采用参考底物在标准条件下)的“环化酶活性”试验中具有包含本文中具体限定的氨基酸序列(尤其SEQ ID NO:2至6)的酶的至少1%、尤其至少大约5至10%,例如,至少10%或至少20%,例如,至少50%或75%或90%更高或更低活性。
除非另外说明,否则功能性等同物的活性数据将在本文中指在如本文定义的标准条件下借助参考底物所实施的活性测定值。
在本发明的意思范围内,“环化酶活性”可以借助多种已知的试验检出。不受其限制,应当提到在如上文所述和在实验部分中解释的标准条件下使用参考底物(例如,高法呢酸)的试验。
另外,功能性等同物例如在pH 4至11之间稳定并有利地具有范围从pH 5至10、尤其如6.5至9.5或7至8或在大约7.5的最适pH和范围从15℃至80℃或20℃至70℃例如大约30至60℃或大约35至45℃如在40℃的最适温度。
根据本发明,“功能性等同物”尤其还理解为意指这样的“突变体”,其从SEQ IDNO:2至326、尤其从SEQ ID NO:2至6衍生并且在上述氨基酸序列的至少一个序列位置中显示除具体提到的氨基酸之外的氨基酸,但仍具有上述生物学活性之一。
“功能性等同物”包括因一个或多个例如1至50、2至30、2至15、4至12或5至10个突变如氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位可获得的突变体,其中上述修饰可以出现在任何序列位置内,只要它们导致具有本发明特征曲线的突变体即可。当突变体和未修饰的多肽之间的反应性样式就性质而言相符,即,例如相同底物以不同速率转化时,则尤其还存在功能性等同物。
下表中编纂合适氨基酸取代的非限制性例子:
上文意义下的“功能等同物”还是所述多肽的“前体”并且还是这些多肽的“功能性衍生物”和“盐”。
“前体”在此是这些多肽的具有或没有所需生物学活性的天然或合成前体。
术语“盐”理解为不仅意指羧基的盐,还意指本发明蛋白质分子的氨基的酸加成盐。羧基的盐可以按照本身已知的方式制备并且包括无机盐,例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐,和与有机碱(例如,胺类如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等)的盐。同样地,酸加成盐,例如与无机酸(如氢氯酸或硫酸)的盐和与有机酸(如乙酸和草酸)的盐,是本发明的主题。
同样地,本发明多肽的“功能性衍生物”可以借助已知的技术,在功能性氨基酸侧基团上或在其N末端或C末端制备。这类衍生物包括例如羧酸基的脂族酯、通过与氨或者与伯胺或仲胺反应可获得的羧酸基的酰胺;通过与酰基反应制备的游离氨基的N-酰基衍生物;或通过与酰基反应制备的游离羟基的O-酰基衍生物。
天然地,“功能性等同物”还包括从其他生物可以获得的多肽和天然存在的变体。借助序列比较,例如,可以通过序列比较建立同源序列区域的区域,并且可以基于本发明的具体信息确定等同酶。
“功能性等同物”同样地包括本发明多肽的片段,优选地各个结构域或序列基序,它们例如显示所需要的生物学功能。
“功能性等同物”进一步是融合蛋白,所述融合蛋白具有前述多肽序列或从中衍生的功能性等同物之一和处于功能性N端或C端连接(即对融合蛋白部分不造成明显突变性功能损害的情况下)的功能上不同的至少一个其他异源序列。这个种类的异源序列的非限制性例子例如是信号肽、组氨酸锚定物或酶。
还根据本发明包括的“功能性等同物”是具体公开的蛋白质的同源物。这些同源物与具体公开的氨基酸序列之一具有至少60%、优选地至少75%,尤其至少85%,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性(或同一性),所述同源性借助Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法算得。本发明的同源多肽的同源性或同一性(表述为百分数)尤其意指基于本文具体所述的氨基酸序列之一的总长度,氨基酸残基的同一性(表述为百分数)。
也可以借助BLAST比对、算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或通过应用如本文以下指明的Clustal设置,确定同一性数据(表述为百分数)。
如果蛋白质糖基化是可能的,则本发明的“功能性等同物”包括上述类型的蛋白质,所述蛋白质处于去糖基化和糖基化形式及通过改变糖基化模式可获得的修饰形式。
本发明蛋白质或多肽的同源物可以通过诱变(例如点突变、延伸或缩短)该蛋白质来产生。
可以通过筛选突变体(例如,截短型突变体)的组合文库,鉴定本发明蛋白质的同源物。例如,可以通过核酸水平的组合诱变(例如通过酶促连接合成性寡核苷酸的混合物),产生多样化的蛋白质变体文库。存在可以用于从简并性寡核苷酸序列产生潜在同源物文库的多种方法。可以在自动DNA合成仪上实施简并性基因序列的化学合成,并且随后可以将合成性基因连接入合适的表达载体。简并性基因集合的使用有可能在一种混合物中提供编码所需潜在蛋白质序列集合的全部那些序列。合成简并性寡核苷酸的方法是技术人员已知的(例如,Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人,(1984)Science 198:1056;Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。
本领域中已知多项用于筛选已经通过点突变或截短过程产生的组合文库的基因产物或针对具有所选择特性的基因产物筛选cDNA文库的技术。这些技术可以适应于快速筛选已经通过组合诱变本发明同源物来产生的基因文库。作为高通量分析之基础,最频繁使用的大型基因文库筛选技术包括:将基因文库克隆入复制型表达载体中,用所得到的载体文库转化合适的细胞并且在这样的条件下表达组合基因,其中在所述条件下,所需活性的检测促进了编码已检出其产物的基因的载体的分离。递归总体诱变(REM),一项增加文库中功能突变体频率的技术,可以与筛选试验组合地用于鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89:7811-7815;Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。
3.核酸和构建体
3.1核酸
本发明的主题还是核酸,所述核酸编码具有如上文所述的环化酶活性的酶。
本发明也涉及与本文所述的具体序列具有某种“同一性”程度的核酸。
两个核酸之间的“同一性”理解为意指在每种情况下,在核酸总长度范围内核苷酸的同一性,尤其这样的同一性,所述同一性通过设定以下参数,使用Clustal方法(HigginsDG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignments on amicrocomputer.Comput Appl.Biosci.1989年4月;5(2):151-1),借助来自Informax(美国)公司的Vector NTI Suite 7.1软件比较来算得:
多重比对参数:
配对比对参数:
备选地,还可以根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.,Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500的方法,根据网站:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#并使用以下参数,确定同一性:
本文中提到的全部核酸序列(单链和双链DNA序列和RNA序列,例如,cDNA和mRNA)均可以通过化学合成法,从核苷酸结构单元以本身已知的方式制备,例如,通过各个重叠性互补性双螺旋核酸结构单元的片段缩合制备。寡核苷酸的化学合成可以例如按本身已知的方式,通过亚磷酰胺(phosphoamidite)方法实现(Voet,Voet,第2版,Wiley Press NewYork,pages 896–897)。Sambrook等人(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了添加合成性寡核苷酸和借助DNA聚合酶Klenow片段填补缺口及连接反应以及一般克隆方法。
本发明的主题还是编码以上多肽及其功能性等同物之一的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,例如cDNA和mRNA),所述核酸序列可以是例如使用人工核苷酸类似物可获得的。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性区段的分离核酸分子,和可以例如作为杂交探针或作为引物用于鉴定或扩增本发明编码性核酸的核酸片段。
本发明的核酸分子可以额外地在编码性基因区的3'末端和/或5'末端含有非翻译序列。
本发明还包括与具体所述的核苷酸序列或其区段互补的核酸分子。
本发明的核苷酸序列有可能产生可以用于鉴定和/或克隆其他类型细胞和生物中同源序列的探针和引物。此类探针或引物一般包含在“严格”条件(参见下文)与本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少大约12个、优选至少大约25个,例如大约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
“分离的”核酸分子与该核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分开,并且如果通过重组技术制备,则可以另外基本上不含细胞物质或培养基,或如果以化学方式合成,则可以不含化学前体或其它化学物质。
可以借助分子生物学标准技术和根据本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子。例如,通过使用具体公开的完整序列之一或其区段作为杂交探针和(如在例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989中描述的)标准杂交技术,可以从合适的cDNA文库分离cDNA。另外,包含所公开的序列之一或其区段的核酸分子可以通过聚合酶链反应,用寡核苷酸引物分离,所述寡核苷酸引物已经基于正在使用的这种序列产生。可以将如此扩增的核酸克隆至合适的载体并通过DNA序列分析法表征。本发明的寡核苷酸还可以通过标准合成方法制备,例如使用自动DNA合成仪制备。
本发明的核酸序列或其衍生物、这些序列的同源物或部分可以例如使用惯用杂交方法或PCR技术,例如借助基因组文库或cDNA文库,从其他细菌分离。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。
“杂交”理解为意指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补性序列结合,同时在这些条件下非互补的配偶物之间不发生非特异性结合。为此目的,序列可以是90-100%互补的。互补性序列能够彼此特异性结合的特性例如用于Northern印迹或Southern印迹技术中或用于PCR或RT-PCR的引物结合过程中。
对于杂交,有利地使用保守区的短寡核苷酸。但是,本发明核酸的较长片段或完整序列也可以用于杂交。这些标准条件根据核酸(寡核苷酸、较长片段或完整序列)或根据何种类型的核酸(DNA或RNA)正在用于杂交而变化。因此,例如,DNA:DNA杂交分子的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂交分子的解链温度低大约10℃。
例如,取决于核酸,标准条件理解为意指例如,在浓度为0.1至5x SSC(1x SSC=0.15M NaCI,15mM柠檬酸钠,pH 7.2)之间或另外在50%甲酰胺存在下的缓冲水溶液中于42℃和58℃之间的温度,例如,42℃在5x SSC,50%甲酰胺中。有利地,DNA:DNA杂交分子的杂交条件是0.1x SSC和大约20℃至45℃之间、优选大约30℃至45℃之间的温度。对于DNA:RNA杂交分子,杂交条件有利地是0.1x SSC和大约30℃至55℃之间、优选大约45℃至55℃之间的温度。这些所述的杂交温度是在甲酰胺不存在下,对长度为大约100个核苷酸及G+C含量为50%的核酸计算的解链点值实例。DNA杂交的实验条件在相关遗传学教材(例如,Sambrook等人,"Molecular Cloning",Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中描述,并且可以使用本领域技术人员已知的公式,例如作为核酸长度、杂交分子类型或G+C含量的函数,进行计算。关于杂交的其他信息可以由本领域技术人员从以下教材获得:Ausubel等人(编著),1985,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York;Hames和Higgins(编著),1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford;Brown(编著),1991,EssentialMolecular Biology:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。
“杂交”可以尤其在严格条件下进行。这类杂交条件例如由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,于:Molecular Cloning(A Laboratory Manual),第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989,第9.31-9.57页中或在Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6.描述。
“严格”杂交条件特别意指:在42℃于50%甲酰胺、5x SSC(750mM NaCI,75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20g/ml变性剪切鲑精DNA组成的溶液中温育过夜,接着是用0.1x SSC在65℃洗涤滤膜的步骤。
本发明的主题还是具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此,例如,本发明编码环化酶突变体的其他核酸序列可以例如通过F486突变或F486同功突变,从SEQ ID NO:1或从SEQ ID NO:2至326、尤其SEQ ID NO:2至6的编码序列衍生,并且因添加、取代、插入或缺失单个或几个核苷酸与之不同,但继续编码具有所需特性谱的多肽。
根据本发明还包含那些核酸序列,所述核酸序列包含所谓的沉默突变,或与具体提到的序列相比,根据特定来源或宿主生物的密码子选择加以修饰,如同其天然存在的变体(如剪接变体或等位变体)那样。
主题同样地是通过保守性核苷酸取代(即所讨论的氨基酸由具有相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替换)可获得的序列。
本发明的主题还是借助序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。这些遗传多态性可以因自然变异存在于群体内部的个体之间。这些天然的变异通常在基因的核苷酸序列中引起1%至5%变异。
从序列SEQ ID NO:1或从SEQ ID NO:2至326、尤其SEQ ID NO:2至6的编码序列之一衍生的本发明编码环化酶的核酸序列的衍生物理解为意指例如这样的等位变体,所述等位变体在整个序列区域范围内在衍生的氨基酸水平具有至少60%同源性、优选至少80%同源性、特别优选至少90%同源性(关于氨基酸水平的同源性,可以参考上文已经涉及多肽所作的描述)。有利地,同源性可以在序列的部分区域内较高。
另外,衍生物理解为意指本发明核酸序列的同源物,例如真菌或细菌同源物、编码性和非编码性DNA序列的截短型序列、单链DNA或RNA。
另外,衍生物理解为意指例如具有启动子的融合物。布置所述核苷酸序列上游的启动子可能已经借助至少一个核苷酸取代、至少一个插入、倒位和/或缺失改变,然而,并未不利地影响启动子的功能/活性。另外,启动子的效能可以因修饰其序列而增强,或启动子可以完全交换成更有效的启动子,后者也来自不同物种的生物。
3.2功能突变体的产生
另外,本领域技术人员熟悉产生本发明酶的功能突变体的方法。
取决于所用的技术,本领域技术人员可以将完全随机或另外更为定向的突变引入基因或非编码的核酸区域(例如,所述区域对调节表达重要)中并且随后构建基因文库。为此目的所需要的分子生物学方法是本领域技术人员已知的并且例如在Sambrook和Russell,Molecular Cloning.第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001中描述。
用于修饰基因并且因此修饰它们编码的蛋白质的方法早已为本领域技术人员所知,例如,
-位点定向诱变,其中按定向方式替换某基因的单个或几个核苷酸(Trower MK(编著)11996;In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey),
-饱和诱变,其中可以在任何基因座替换或添加任何氨基酸的密码子(Kegler-EboDM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res22:1593;Barettino D,FeigenbutzM,Valcárel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541;Barik S(1995)MolBiotechnol 3:1),
-易错聚合酶链反应(易错PCR),其中通过错误方式发挥作用的DNA聚合酶突变核苷酸序列(Eckert KA,Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res.18:3739);
-SeSaM法(序列饱和法),其中偏好性取代被聚合酶阻止。Schenk等人,Biospektrum,第3卷,2006,277-279;
-基因在致突变株系中传代,其中例如由于DNA修复机制缺陷,核苷酸序列的突变率升高(Greener A,Callahan M,Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesistechnique using an E.coli mutator strain.引自:Trower MK(编著)In vitromutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey),或
-DNA改组,其中形成并消化密切相关的基因汇集物并且利用这些片段作为聚合酶链反应的模板,在所述聚合酶链反应中,通过重复的链分离和装配,最终产生全长嵌合基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA91:10747)。
使用“定向进化”(尤其在以下文献中所述:Reetz MT和Jaeger K-E(1999),TopicsCurr Chem 200:31;Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods foroptimizing industrial enzymes by directed evolution,引自:Demain AL,Davies JE(编著)Manual of industrial microbiology and biotechnology.American Societyfor Microbiology),本领域技术人员还可以按选择性方式且还按大规模产生功能突变体。这里,在第一步骤中,最初产生相应蛋白质的基因文库,有可能例如利用上文所示的方法。基因文库以合适的方式表达,例如通过细菌或通过噬菌体展示系统表达。
可以使表达特性与所需特性大体对应的功能突变体的宿主生物的相关基因经历另外轮次的突变。可以迭代地重复突变步骤和选择或筛选步骤,直至以适当的量度,功能突变体具有所需的性质。作为这个迭代流程的结果,可以逐步进行有限数目的突变,例如1、2、3、4或5个突变,并且可以针对这些突变对相应酶特性的影响评估和选择。随后,选出的突变体可以按相同方式经受又一个突变步骤。因而可以显著地减少待研究的独立突变体的数目。
本发明的结果还提供相应酶的结构和序列方面的重要信息,这些信息是以定向方式产生具有所需的改良特性的其他酶必需的。特别地,有可能确定所谓的“热点”,即潜在适于通过引入定向突变而修饰酶特性的序列区段。
同样地,可导出氨基酸序列位置方面的信息,在所述氨基酸序列位置周围可以实施将假定对酶活性影响甚微并且可以称作潜在“沉默突变”的突变。
3.3构建体
本发明的主题还特别地是重组表达构建体,所述构建体包含处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发明多肽的核酸序列;并且还特别地是包含这些表达构建体中至少之一的重组载体。
根据本发明,“表达单元”理解为意指这样的核酸,所述核酸具有表达活性并且包含如本文中所定义的启动子,并且与某个待表达的核酸或与某个基因功能性连接后,将调节该核酸或该基因的表达,换而言之,调节转录和翻译。这是为何在这种语境下它也称“调节性核酸序列”的原因。除启动子之外,也可以存在其他的调节元件,例如增强子。
根据本发明,“表达盒”或“表达构建体”理解为意指与待表达的核酸或待表达的基因功能性连接的表达单元。与表达单元相反,表达盒因此不仅包含调节转录和翻译的核酸序列,还包含那些将因转录和翻译而作为蛋白质表达的核酸序列。
在本发明的上下文中,术语“表达”或“过量表达”描述了微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的产生或其胞内活性增加。为此,例如有可能将基因引入生物中、将现有基因替换为另一个基因、增加该(诸)基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因,并且这些措施可以任选地组合。
优选地,本发明的此类构建体包含在各自编码序列5’-上游的启动子和其3'-下游的终止子序列,并且任选地还包含惯用调节元件,在每种情况下它们均与编码序列有效连接。
根据本发明,“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”理解为意指与待转录的核酸功能性连接时调节这种核酸的转录的核酸。
在这种情况下,“功能性”或“有效”连接理解为意指例如具有启动子活性的核酸之一和待转录的核酸序列和任选地其他调节元件(例如,确保核酸转录的核酸序列和例如终止子)以如此方式依次排列,从而所述每个调节元件可以在该核酸序列的转录时履行其功能。为此目的,不是必需要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列也能够从位于更远距离的位置或甚至从其它DNA分子对靶序列产生其作用。优选的排列是那些排列,其中待转录的核酸序列位于启动子序列之后(即在3'末端),从而这两个序列彼此共价结合在一起。在这种情况下,启动子序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离可以小于200碱基对、或小于100碱基对、或小于50碱基对。
除启动子和终止子之外,作为其他调节元件的实例,以下可以提到:引导序列(targeting sequence)、增强子、多聚腺苷化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列例如在Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述。
本发明的核酸构建体尤其包含编码环化酶(例如SEQ ID NO:1)或编码根据SEQ IDNO:2至326的环化酶或其衍生物和同源物的序列,和可以从其中衍生并且已经有效地或功能地与一个或多个调节信号连接的核酸序列,所述调节信号有利地用于控制(例如增加)基因表达。
除这些调节序列之外,这些序列的天然调节作用仍可以在实际结构基因之前存在并且任选地可以经基因修饰,从而已经关闭天然调节作用并且已经增强基因的表达。然而,核酸构建体还可以具有更简单的构造,即在编码序列之前没有插入额外的调节信号,并且天然启动子及其调节作用尚未被除去。相反,将天然调节序列突变,从而调节作用不再发生并且基因表达增加。
优选的核酸构建体还有利地包含与启动子功能性连接的一个或多个已经提到的“增强子”序列,所述启动子的序列使得增强核酸序列表达成为可能。也可以在DNA序列的3'端插入额外的有利序列,如其他的调节元件或终止子。本发明核酸的一个或多个拷贝可以存在于一个构建体中。在该构建体中,在构建体中,也可任选地存在其他标记,例如补充营养缺陷型或抗生素抗性的基因,以便选择构建体。
合适调节序列的实例存在于多种启动子中如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)、SP6、λ-PR或λ-PL启动子中,并且这些序列有利地用于革兰氏阴性细菌中。其他的有利调节序列存在于例如革兰氏阳性细菌启动子amy和SPO2中,存在于酵母启动子或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人工启动子也可以用于调节。
为了在宿主生物中表达,将核酸构建体有利地插入有可能该宿主中使基因最佳表达的载体,例如质粒或噬菌体。除噬菌体和质粒外,载体还理解为意指技术人员已知的全部其他载体,也就是说,例如,病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体能够在宿主生物中自主复制或另外以染色体方式复制。这些载体是本发明的进一步发展。
合适的质粒例如是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pl_G200、pUR290、plN-lll113-B1、λgt11或pBdCI,链霉菌属(Streptomyces)中的plJ101、plJ364、plJ702或plJ361,芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214,棒杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667,真菌中的pALS1、plL2或pBB116;酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述质粒是可能质粒的少量选项。其它质粒是本领域技术人员熟知的并且可以在例如书籍Cloning Vectors(编者Pouwels P.H.等人,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中找到。
在载体的进一步发展中,还可以将包含本发明核酸构建体或本发明核酸的载体有利地以线性DNA形式引入微生物并且通过异源或同源重组整合入宿主生物的基因组。这种线性DNA由线性化载体如质粒或仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。
为了在生物中最佳表达异源基因,有利的是修饰核酸序列以匹配该生物中所用的特定“密码子选择”。可以通过计算机评价所讨论生物的其他已知基因,轻易地确定“密码子选择”。
通过将合适启动子与合适的编码性核苷酸序列及终止子或多聚腺苷酸化信号融合,产生本发明的表达盒。为此目的使用惯常重组技术和克隆技术,例如,如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)以及T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1984)中以及Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)中描述的重组技术和克隆技术。
为了在合适的宿主生物中表达,将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入使基因在该宿主中最佳表达成为可能的宿主特异性载体。载体是本领域技术人员熟知的并且可以在例如书籍Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编辑,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中找到。
4.微生物
取决于上下文,术语“微生物”可以指野生型微生物或指遗传修饰的重组微生物或指这两者。
借助本发明的载体,有可能产生重组微生物,所述重组微生物用例如至少一种本发明载体转化并且可以用于产生本发明的多肽。有利地,将上述的本发明重组构建体引入合适的宿主系统并在其中表达。在这种情况下,优选使用技术人员已知的惯用克隆和转染方法,例如,共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等,从而允许上述核酸在所讨论的表达系统中表达。合适的系统例如在Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人编著,Wiley Interscience,New York 1997或Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中描述。
用于本发明核酸或核酸构建体的合适重组宿主生物原则上是全部原核或真核生物。有利地使用微生物,如细菌、真菌或酵母作为宿主生物。有利地使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌,优选来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)的细菌或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌,特别优选来自埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、奴卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)、梭菌属(Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。非常特别优选大肠杆菌(Escherichiacoli)属和物种。可以在α-变形菌门(proteobacteria)、β-变形菌门或γ-变形菌门的分类中额外地找到其他有利的细菌。
在这种情况下,本发明的宿主生物或多个宿主生物优选含有本发明中描述的并且编码具有如上文所述的苯乙醇脱氢酶活性的核酸序列、核酸构建体或载体中至少一者。
取决于宿主生物,本发明方法中使用的生物按照技术人员熟悉的方式培育或培养。通常,将微生物在液体培养基中,在0℃和100℃之间、优选10℃和60℃之间的温度下培育,同时通入氧气,其中所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源、通常为有机氮源(如酵母提取物)形式的氮源或盐如硫酸铵、微量元素如铁盐、锰盐和镁盐并且任选地含有维生素。可以将液体培养基的pH维持在固定值上,也就是说,可以在培育期间调节或不调节。培养可以按分批、半分批或连续方式进行。可以在发酵开始时提供或半连续或连续地输入养分。
5.本发明酶的重组产生
本发明还涉及用于重组产生本发明的多肽或其功能性生物学活性片段的方法,其中培育产生多肽的微生物,任选地诱导多肽的表达并且从培养物分离这些多肽。如果需要,也可以按这种方式以产业规模产生这些多肽。
可以通过批次方法或补料分批方法或重复补料分批方法,连续或不连续地培养根据本发明产生的微生物。可以在(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to bioprocesstechnology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheralequipment](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中找到已知培养方法的综述。。
待使用的培养基必须适当地满足相应菌株的要求。美国细菌学协会的手册“Manual of Methods for General Bacteriology(普通细菌学方法手册)”(WashingtonD.C.,USA,1981)中给出了用于各种微生物的培养基介绍。
这些可以根据本发明使用的培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖,如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源例如是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可以通过复杂化合物如糖蜜或糖精炼的其他副产品添加糖至培养基。添加不同碳源的混合物也可以是有利的。其他可能碳源是油和脂肪,例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂、脂肪酸,例如,棕榈酸、硬脂酸或亚油酸,醇类,例如甘油、甲醇或乙醇,和有机酸,例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的物质。氮源的实例包括氨气或铵盐,如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、脲、氨基酸或复杂氮源,如玉米浸液、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉浸汁等。氮源可以单独或作为混合物使用。
可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
无机含硫化合物,例如,硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物,以及有机硫化合物,如硫醇(mercaptan)和硫醇(thiol),可以用作硫源。
磷酸、磷酸二氢钾盐或磷酸氢二钾或相应含钠的盐可以用作磷源。
可以将螯合剂加入培养基中,以将金属离子保持在溶液中。尤为合适的螯合剂包括二羟基酚类,如儿茶酚,或原儿茶酸,或有机酸,如柠檬酸。
根据本发明使用的发酵介质一般还包含其他生长因子,如维生素或生长促进剂,这包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐经常源自复杂基质的组分,如酵母提取物、糖蜜、玉米浸液等。另外,可以将合适的前体添加至培养基。培养基中确切的化合物组成主要取决于相应的实验并且针对每种具体情况逐一决定。关于培养基优化的信息可以在教科书"Applied Microbiol.Physiology,A PracticalApproach"(P.M.Rhodes,P.F.Stanbury编著,IRL Press(1997),第53-73页,ISBN 0 19963577 3)”中找到。也可以从供应商处获得生长培养基,如标准1(Merck)或BHI(心脑浸液,DIFCO)等。
将全部培养基组分通过加热(在1.5巴和121℃时20分钟)或过滤消毒法消毒。可以将组分酌情一起灭菌或分开灭菌。全部的培养基组分可以在培养伊始就存在,或可以将其连续或分批地添加。
培养温度通常在15℃和45℃之间,优选是25℃至40℃并且可以在实验期间变化或保持恒定。培养基的pH应当在5至8.5范围内,优选约为7.0。可以通过添加碱性化合物,如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水,或酸性化合物,如磷酸或硫酸,在培养期间控制用于培养的pH。消泡剂,例如,脂肪酸乙二醇酯、可以用于控制起泡。为了维持质粒的稳定性,可以向培养添加选择发挥作用的合适物质,例如,抗生素。为了维持有氧条件,将氧气或含氧的气体混合物例如环境空气通入培养物。培养物的温度通常在20℃至50℃的范围内。持续培养直至已经形成最多的所需产物。这个目标通常在10小时至160小时内达到。
随后进一步加工发酵液。取决于要求,可以通过分离技术例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合从发酵液完全或部分取出生物质,或其可以完全留在发酵液中。
如果多肽未分泌入培养基,也可以破碎细胞并且可以通过已知的蛋白质分离方法从裂解物获得产物。还可以任选地通过高频超声波,通过高压(例如,在弗氏压碎器中)、通过渗透裂解、通过去垢剂、裂解酶或有机溶剂的作用,通过均化器、或通过几种前述方法的组合,破碎细胞。
可以通过已知层析技术如分子筛层析(凝胶过滤)如Q-琼脂糖凝胶层析、离子交换层析和疏水性层析并采用其他常规技术如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳纯化多肽。合适的方法例如在Cooper,T.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[Biochemicalmethods],Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York,or in Scopes,R.,ProteinPurification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin中描述。
为了分离重组蛋白,可以有利的是使用例如起到更易纯化作用的载体系统或寡核苷酸,所述载体系统或寡核苷酸通过确定的核苷酸序列延伸cDNA并因此编码修饰的多肽或融合蛋白。这种类型的合适修饰例如是所谓的“标签”,其起锚定作用,例如称为六组氨酸锚定物的修饰,或可以被抗体识别的抗原的表位(例如在Harlow,E.和Lane,D.,1988,Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)。这些锚定物可以起到将蛋白质连接至固态介质(例如聚合物基质)的作用,所述固态介质可以例如用作层析柱中的填料或可以在微量滴定平板上或某种其他载体上使用。
同时,这些锚定物也可以用于蛋白质的识别。为了识别蛋白质,还可以进一步单独或与锚定物组合使用常规标志物,如荧光染料、与底物反应后形成可检测反应产物的酶标志物或放射性标记用于蛋白质的衍生化。
为了表达本发明的突变体,可以参考明确引用的WO2005/108590和WO2006/094945中,对表达野生型酶EbN1和因而可用的表达系统的描述。
6.酶固定
根据本发明使用的酶可以在本文所述的过程中以游离或固定形式使用。固定的酶理解为固定至惰性载体的酶。合适的载体材料和其上所固定的酶从EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-A 100193773和从中引用的参考文献已知。在这个方面,这些文件的公开内容通过引用的方式完整并入本文。合适的载体材料例如包括、粘土、粘土矿物质如高岭土、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉末、阴离子交换材料、合成聚合物,如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚/醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃,如聚乙烯和聚丙烯。为了产生支撑的酶,载体材料通常以精细分开的粒状形式形式使用,优选多孔形式。载体材料的粒度通常不大于5mm,尤其不大于2mm(粒度分布曲线)。类似地,当使用脱氢酶作为完整细胞催化剂时,可以选择游离形式或固定形式的脱氢酶。载体材料例如是藻酸钙和角叉菜胶。酶和细胞也可以用戊二醛直接交联(交联至CLEA)。例如在K.Drauz和H.Waldmann,EnzymeCatalysis in Organic Synthesis 2002,第III卷,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim中的J.Lalonde和A.Margolin"Immobilization of Enzymes"中描述了相应的和其他的固定技术。例如在Rehm等人(编著)Biotechnology,第2版,第3卷,第17章,VCH,Weinheim中还给出关于实施本发明方法的生物转化法和生物反应器的其他信息。
7.多不饱和羧酸的酶促环化
7.1一般方面
本发明的环化过程尤其在酶存在下实施,其中所述酶由根据SEQ ID NO:1的核酸序列或其功能性等同物编码,其中核酸序列是基因构建体或载体的组分。这类基因构建体或载体在此处明确引用的国际申请PCT/EP 2010/057696中第16至20页中中详述。
还将含有基因构建体或载体的宿主细胞称作转基因生物,在所述载体中,存在编码具有所需活性的酶的核酸序列。原则上已知并且例如在此处明确引用的国际申请PCT/EP2010/057696第20页中页中讨论了此类转基因生物的产生。
优选选择细菌、蓝细菌(Cyanobacteria)、真菌和酵母中的细胞作为转基因生物。细胞优选选自毕赤酵母属(Pichia)的真菌或埃希氏菌属、棒杆菌属、罗尔斯顿菌属、梭菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、酵单胞菌属、红细菌属、链霉菌属、伯克霍尔德菌属、乳酸杆菌属或乳球菌属的细菌。细胞特别优选选自如下物种的细菌:大肠杆菌、恶臭假单胞菌、荚壳伯克霍尔德氏菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌或运动发酵单胞菌。
优选特征如下的本发明方法:具有高法呢酸(homofarnesylic acid)环化酶的活性的酶由已经从选自以下的微生物分离的基因编码:运动发酵单胞菌、荚膜甲基球菌、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、大豆根瘤菌、弗兰克氏菌属物种、天蓝色链霉菌和巴氏醋杆菌。特别提到来自运动发酵单胞菌、天蓝色链霉菌、大豆根瘤菌和巴氏醋杆菌的有关基因。
进一步优选特征如下的本发明方法:具有环化酶活性的酶由已经微生物产生,所述微生物过量产生该酶且已经选自以下微生物:埃希氏属、棒杆菌属、罗尔斯顿菌属、梭菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、发酵单胞菌属、红细菌属、链霉菌属、伯克霍尔德菌属、乳酸杆菌属和乳球菌属。
特别提到特征如下的本发明方法:具有环化酶活性的酶由已经由以下物种的转基因微生物产生:大肠杆菌、恶臭假单胞菌、荚壳伯克霍尔德氏菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、枯草芽孢杆菌或运动发酵单胞菌,所述转基因微生物过量产生具有环化酶活性的酶。
实施本发明生物催化环化过程的其他实施方案。
本发明方法的特征在于:酶以以下形式中的至少之一存在:
a)游离、任选地纯化或部分纯化的多肽;
b)固定化多肽;
c)从细胞分离的按照a)或b)的多肽;
d)包含至少一种该多肽的完整细胞,任选休眠休眠细胞或正在生长的细胞;
e)按照d)的细胞的裂解物或匀浆。
本发明方法的又一个实施方案特征在于:细胞是表达至少一种编码具有环化酶活性的多肽的异源核酸分子的微生物、优选转基因微生物。
本发明方法的优选实施方案至少包括以下步骤a)、b)和d):
a)从天然来源分离或重组产生微生物,所述微生物产生具有环化酶活性的酶,
b)繁殖这种微生物,
c)任选地从微生物分离具有环化酶活性的酶或制备包含这种酶的蛋白质级分,并且
d)将微生物步骤b)或酶步骤c)转移入包含底物(例如通式(Ia)的高法呢酸)的介质(medium)。
在本发明方法中,使底物以如此方式与介质中具有环化酶活性酶接触和/或温育,从而底物(例如高法呢酸)在酶存在下发生反应以产生香紫苏内酯(sclareolide)。介质优选是含水反应介质。
其中优选实施本发明方法的含水反应介质的pH有利地维持在pH 4和12之间,优选在pH 4.5和9之间,特别优选在pH 5和8之间。
含水反应介质优选是缓冲的溶液,其通常具有优选5至8的pH。可以使用的缓冲剂可以是柠檬酸盐、磷酸盐、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)或MES(2-(N-吗啉代)-乙磺酸)缓冲剂。反应介质可以另外还包含其他添加物,例如去垢剂(例如牛磺脱氧胆酸盐)。
底物(例如,高法呢酸)优选以2-200mM、特别优选5-25mM的浓度引入酶促反应中,并且可以连续或分批地再供给。
通常,酶促环化通常在低于所用酶的失活温度和高于-10℃的反应温度发生。优选地,本发明的方法在0℃和95℃之间的温度实施,特别优选在15℃和60℃之间、尤其在20℃和40℃之间、例如在约25℃至30℃的温度实施。
特别优选如下的本发明方法,其中在20℃至40℃的温度和/或4至8的pH实施高法呢酸至香紫苏内酯的反应。
除了这些单相含水体系之外,在本发明的另一个变化形式中,还使用双相体系。这里,除水相外,有机非水溶混性反应介质用作第二相。因此,反应产物在有机相中积累。在反应后,有机相中的产物可以与包含生物催化剂的水相轻易分离。
优选特征如下的本发明方法:在单相含水体系或双相体系中实施高法呢酸的转化或在双相含水/固态体系中实施微溶性高法呢酸盐的转化。
可以使用有机溶剂提取反应产物并且任选地蒸馏以纯化。
合适有机溶剂的实例是脂肪族烃、优选具有5至8个碳原子的脂肪族烃,如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷、卤代脂肪族烃、优选具有一个或两个碳原子的卤代脂肪族烃,如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷、芳香烃,如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯、脂族非环和环状醚或醇、优选具有4至8个碳原子的脂族非环和环状醚或醇,如乙醇、异丙醇、二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、四氢呋喃或酯类如乙酸乙酯或乙酸正丁酯或酮类如甲基异丁酮或二噁烷或前者的混合物。特别优选使用上述的庚烷、甲基叔丁基醚、二异丙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯。
如上文所述,根据本发明使用的环化酶可以在本发明方法中作为游离酶或固定酶使用。
对于本发明的方法,可以使用休眠或正在生长的、游离或固定的细胞,所述细胞包含编码环化酶的核酸、核酸构建体或载体。也可以使用破碎的细胞,如细胞裂解物或细胞匀浆。破碎的细胞理解为意指例如已经通过例如用溶剂处理而透化的细胞,或已经通过酶促处理、通过机械处理(例如弗氏压碎器或超声法)或通过某种其他方法破碎的细胞。如此得到的粗提物有利地适于本发明的方法。纯化的或部分纯化的酶也可以用于该方法。
如果游离的生物或酶用于本发明的方法,则方便地在提取之前分离它们,例如借助过滤法或离心法分离。
本发明的方法可以分批、半分批或连续地运行。
7.2优选的高法呢酸至香紫苏内酯转化过程
特别地,本发明涉及一种用于制备香紫苏内酯的方法,其中
a)使高法呢酸与高法呢醇龙涎香烷(ambroxan)环化酶接触和/或与之温育,并且
b)分离香紫苏内酯。
在本发明的一个实施方案中,使高法呢酸在介质中与环化酶接触和/或温育,从而高法呢酸至香紫苏内酯的转化在环化酶存在下发生。优选地,介质是含水反应介质。含水反应介质优选是缓冲的溶液,其通常具有优选5至8的pH。可以使用柠檬酸盐、磷酸盐、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)、MES(2-(N-吗啉代)-乙磺酸)缓冲剂作为缓冲剂。另外,反应介质可以另外包含其他添加物,例如,去垢剂(例如牛磺脱氧胆酸盐)。
底物优选以5–100mM、特别优选15–25mM的浓度用于酶促转化中,并且可以连续或分批地供给。
通常,酶促环化通常在低于所用环化酶的失活温度和高于-10℃的反应温度实施。特别优选在0至100℃,特别地15至60℃和尤其20℃至40℃的范围内,例如在大约30℃。
反应产物香紫苏内酯可以用有机溶剂提取,所述有机溶剂选自本文中提到的那些,并且经纯化,任选地经蒸馏。
除了这些单相含水体系外,在本发明的又一个变化形式中,还使用双相体系。这里,使用离子液体作为第二相,但是优选地,使用与水不溶混的有机反应介质作为第二相。反应产物因而在有机相中积累。在该反应后,有机相中存在的龙涎香烷可以与含有生物催化剂的水相轻易地分离。
非水反应介质理解为意指基于液体反应介质的总重量,包含以重量计小于1%、优选以重量计小于0.5%的水的反应介质。转化可以尤其在有机溶剂中实施。
合适有机溶剂的实例是脂肪族烃、优选具有5至8个碳原子的脂肪族烃,如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷、卤代脂肪族烃、优选具有一个或两个碳原子的卤代脂肪族烃,如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷、芳香烃,如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯、脂族非环和环状醚或醇、优选具有4至8个碳原子的脂族非环和环状醚或醇,如乙醇、异丙醇、二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、四氢呋喃或酯类如乙酸乙酯或乙酸正丁酯或酮类如甲基异丁酮或二噁烷或前者的混合物。特别优选使用上述的庚烷、甲基叔丁基醚、二异丙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯。
高法呢酸至香紫苏内酯的转化不仅可以单相含水体系中进行,还可以在双相体系中进行。在双相体系的情况下,使用本文中提到的那些体系。优选使用与水不溶混的上述有机溶剂作为第二相。因而,反应产物在有机相中积累。在该反应后,处于无机相中的龙涎香烷可以与包含生物催化剂的水相轻易地分离。
本发明的又一个主题是一种用于生物催化制备香紫苏内酯的方法,其特征在于酶是由核酸分子编码的多肽,所述核酸分子包含至少一个选自以下的核酸分子:
a)核酸分子,其编码包含SEQ ID NO:2中所示序列的多肽;
b)核酸分子,其包含在SEQ ID NO:1中所示序列的至少一个多核苷酸;
c)核酸分子,其编码其序列与序列SEQ ID NO:2具有至少45%同一性的多肽;
d)根据(a)至(c)的核酸分子,其编码根据SEQ ID NO:2的序列的功能等同多肽或片段;
e)核酸分子,其编码具有高法呢酸环化酶的活性的功能等同多肽,所述核酸分子借助SEQ ID.NO:327和328的引物,通过扩增来自cDNA文库或来自基因组DNA的核酸分子或通过从头合成法化学合成的核酸分子来获得;
f)核酸分子,其编码具有高法呢酸环化酶的活性的功能等同多肽,所述核酸分子在严格条件下与根据(a)至(c)的核酸分子杂交;
g)核酸分子,其编码具有高法呢酸环化酶的活性的功能等同多肽,所述核酸分子可以使用根据(a)至(c)的核酸分子或其至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt的子片段作为探针在严格杂交条件下,从DNA文库分离;和
h)核酸分子,其编码具有高法呢酸环化酶的活性的功能等同多肽,其中多肽的序列与序列SEQ ID NO:2具有至少30%的同一性;
i)核酸分子,其编码具有高法呢酸环化酶的活性的功能等同多肽,其中多肽由选自a)至h)中所述的核酸的核酸分子编码;
j)核酸分子,其编码具有高法呢酸环化酶的活性的功能等同多肽,其中多肽具有与下述多肽类似或相似的结合位点,所述多肽由选自a)至h)中所述的那些核酸分子编码。
出于本发明的目的,类似或相似的结合位点是具有80%、特别优选85%、86%、87%、88%、89%、90%、尤其91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或100%的同源性的氨基酸序列的保守结构域或基序,这确保结合相同的底物、尤其高法呢酸。
优选地,核酸分子c)与SEQ ID NO:1具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、特别优选85%、86%、87%、88%、89%、90%、尤其91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
同样地,功能等同的多肽与SEQ ID NO:2具有至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、特别优选85%、86%、87%、88%、89%、90%、尤其91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。代替术语“同一性”,术语“同源的”或“同源性”也可以同义使用。
现在将参考以下非限制性实施例描述本发明。
实验部分
除非在以下实施例中给出了具体信息,否则适用下文的一般信息。
A.一般信息:
使用的全部材料和微生物均是市售产品。
除非另外声明,否则通过标准方法克隆和表达重组蛋白,如例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989中所述那样。
B.实施例
实施例1克隆Zm-SHC并在大肠杆菌中表达
环化酶基因可以借助寡核苷酸Zm-SHC_fw和Zm-SHC_rev从运动发酵单胞菌扩增。
在每种情况下,将100ng引物Zm-SHC_fw和Zm-SHC_rev按等摩尔比率混合。遵循生产商的说明,使用Pwo-聚合酶(Roche Applied Science)和以下温度梯度程序:95℃3分钟;95℃30秒、50℃30秒和72℃3分钟,30个循环;72℃10分钟;4℃直至使用,用来自运动发酵单胞菌(ATCC31821)的基因组DNA实施PCR。通过琼脂糖凝胶电泳(1.2%电泳凝胶,Invitrogen)和柱层析(GFX Kit,Amersham Pharmacia)分离PCR产物(~2.2kb)并随后测序(测序引物:Zm-SHC_fw和Zm-SHC_rev)。获得的序列匹配公开的序列。
将PCR产物用限制性核酸内切酶NdeI和BamHI消化并连接入适当消化的载体pDHE19.2[9]。对所产生的质粒测序,得到SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。以下文本/(SEQID NO:2)中显示相应的氨基酸序列:
将质粒pDHE-Zm-SHC-1转化入大肠杆菌菌株TG10pAgro4pHSG575[Takeshita等人,Gene 1987,61:63-74;Tomoyasu等人,Mol Microbiol 2001,40:397-413]。重组大肠杆菌命名为大肠杆菌LU15568。
实施例2:从运动发酵单胞菌提供重组高法呢醇环化酶
从合适的2ml预培养物接种,将大肠杆菌LU15568在37℃于100ml锥形烧瓶(带挡板)的20ml LB-Amp/Spec/Cm(100μg/l氨苄青霉素;100μg/l壮观霉素;20μg/l氯霉素),0.1mM IPTG,0.5g/l鼠李糖中培育16小时,以5000*g/10分钟离心并储存在4℃。通过将细胞沉淀物悬浮于15ml破碎缓冲液(0.2M Tris/HCl,0.5M EDTA,pH8.0)、375U全能核酸酶(benzonase,例如Novagen,25U/μL)、40μL PMSF(100mM,溶解于i-PropOH中)、0.8g蔗糖和大约0.5mg溶菌酶中,制备蛋白质提取物。将反应混合物混合并在冰上温育30分钟。此后,将混合物在-20℃冷冻。
在反应混合物已经解冻后,用蒸馏水补足至大约40ml并且在冰上温育30分钟。
此后,使用超声,将细胞破碎3次,每次3分钟(HTU-Soni 130,G.Heinemann,-Hall,振幅80%,15秒脉冲/15秒停顿)。在破碎后,通过4℃和26 900*g离心60分钟移除细胞碎片。弃去上清并将沉淀物重悬于100ml增溶缓冲液(50mM Tris/HCl,10mMMgCl2x 6H2O,1%Triton X-100,pH 8.0)并在Potter中粉碎大约5分钟。此后,悬液维持在冰上30分钟。
将均化的提取物在4℃和26 900*g离心1小时,并弃去沉淀物。提取物用于酶测定法并且可以在-20℃储存几周,同时活性不丧失。蛋白质含量为1mg/ml。
实施例3:来自大肠杆菌LU15568的重组环化酶的活性测定
将高法呢酸(1b,(3E,7E)-4,8,12-三甲基十三碳-3,7,11-三烯酸(1b,(3E,7E)-4,8,12-trimethyltrideca-3,7,11-trienoic acid))与实施例2中描述的蛋白质制备物温育。具体而言,将0.0412g高法呢酸称重(反应混合物中20mM;纯度85.1%,由Z,Z 0.44%、E,Z 10.13%、E,E 74.93%组成),吸入2.913ml水;0.350ml柠檬酸钠缓冲液(1M柠檬酸钠pH5.4)、0.560ml MgCl2(0.5M溶液),并将混合物在37℃搅拌加温30分钟。通过加入加温至37℃的大肠杆菌LU15568匀浆(蛋白质含量为35mg/ml)启动反应。将反应混合物在油浴中,在pH 5.0于37℃以最高搅拌速度,在磁力搅拌器上搅拌24小时。反应期间使用0.5M HCl调节pH。在温育后24小时,通过随1000ml的3:2正庚烷/正丙醇一起涡旋混合30秒,提取来自反应混合物的0.500ml。相分离后,有机上清用于GC分析中(参考图1)。
使用下文更详细描述的分析,测定转化率为74.5%,总计82.7%来自E,E异构体。
可以用以下GC系统确定高法呢酸(1b)转化成香紫苏内酯(3):
柱:10米Optima 1
温度曲线:
0分钟:100℃
5℃/分钟到达200℃
5分钟后:30℃/分钟到达320℃
此后恒定
方法持续时间:30分钟
进样器温度:280℃
保留时间
高法呢酸:11.7分钟时峰1,12.1分钟时峰2;
香紫苏内酯:大约13.5分钟
使用可靠材料(Sigma,目录号:358002)建立系列校正液,籍此测定未知样品的浓度。
明确地参考本文引用的出版物的公开内容。
序列:
SEQ ID NO:1-326各种SHC基因的核酸序列/氨基酸序列
SEQ ID NO:327-328 PCR引物
以下是根据本发明特别有用的SHC酶序列表:
酶序列
Claims (15)
1.一种用于生物催化制备立体异构纯形式或作为立体异构体混合物的通式II的化合物的方法,
其中R1、R2、R3和R4彼此独立地代表H或C1-C4-烷基,
其中使化合物与蛋白质接触,所述蛋白质能够环化多不饱和羧酸,尤其能够环化高法呢酸。
2.如权利要求1中所述的方法,其中使式I的化合物与具有鲨烯-禾烯环化酶(SHC)的酶活性的蛋白质接触。
3.如权利要求1或2中所述的方法,其中使用的底物是通式I的多不饱和羧酸,尤其是处于基本上立体异构纯形式的多不饱和羧酸
其中R1、R2、R3和R4具有上述含义。
4.如前述权利要求任一项所述的方法,其中将式Ia的高法呢酸
用作原料,高法呢酸尤其是以基本上立体异构纯形式,基于存在的高法呢酸异构体的总量,优选以至少70mol%,特别优选至少75、80或85mol%,最优选90、95或99mol%的(3E,7E)-高法呢酸比例使用。
5.如权利要求4中所述的方法,其中式IIa的香紫苏内酯
以立体异构纯形式或作为立体异构体混合物获得。
6.如前述权利要求任一项中所述的方法,其中SHC选自
a)包含多肽的蛋白质,所述多肽具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列,
b)根据a)通过缺失、插入、取代、添加、倒位或组合所衍生的蛋白质,其包含与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少45%的序列同一性的多肽;和
c)功能上与a)或b)等同并且催化高法呢酸环化成香紫苏内酯的蛋白质。
7.如前述权利要求任一项所述的方法,其中生物催化转化
a)在大约4至5.8、尤其4.5至5.5的反应介质pH值和至少一个以下其他条件下实施:
b)在至少15mM、尤其15至30mM的底物浓度;
c)在至少5mg/ml的酶浓度;
d)在范围从32至40℃、尤其35至38℃的反应温度;
e)在包含1至20mM MgCl2的柠檬酸钠缓冲液中;和/或
f)在大约10至100mM的缓冲液浓度。
8.如前述权利要求任一项中所述的方法,其中酶促环化酶活性、尤其SHC活性以选自以下的形式存在:
a)游离的、任选部分或完全纯化的天然或重组产生的环化酶,
b)固定形式的根据a)的环化酶;
c)包含至少一种环化酶的完整细胞;
d)根据c)的细胞的细胞裂解物或细胞匀浆。
9.如前述权利要求任一项中所述的方法,其中转化在单相含水体系或在双相水-有机或固-液体系中实施。
10.如前述权利要求任一项中所述的方法,其中转化在37℃的温度和5至5.2的pH值实施。
11.如前述权利要求任一项中所述的方法,其中SHC从选自荚膜甲基球菌(Methylococcus capsalatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spec.)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和尤其运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的微生物分离。
12.如前述权利要求任一项中所述的方法,其中SHC从选自以下属细菌的过量表达SHC的微生物分离:埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)和乳球菌属(Lactococcus),尤其埃希氏菌属(Escherichia)。
13.如前述权利要求任一项中所述的方法,其中SHC从以下物种的过量表达SHC的转基因细菌分离:大肠杆菌(Escherichia coli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荚壳伯克霍尔德氏菌、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌和运动发酵单胞菌,尤其大肠杆菌。
14.用于制备3a,6,6,9a-四甲基十二氢萘并[2.1-b]呋喃(龙涎香醚)的方法,其中
a)用根据权利要求1至13中任一项所述的方法将高法呢酸转化成香紫苏内酯;
b)将步骤a)的产物化学还原成降龙涎二醇,并且
c)把来自步骤b)的降龙涎二醇化学环化成龙涎香醚。
15.如权利要求中所述的方法14,其中龙涎香醚是(-)-龙涎香醚((3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-四甲基十二氢萘并[2.1-b]呋喃[CAS6790-58-5])。
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