CN101796192B

CN101796192B - 使用固氮弧菌属物种(Azoarcus Sp)EBN1脱氢酶产生光学活性醇的方法

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Publication number: CN101796192B
Application number: CN200880103213.XA
Authority: CN
Inventors: M·布罗伊尔; R·拉布斯; J·海德
Original assignee: BASF SE; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: BASF SE; Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2008-06-16
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2028-06-16
Also published as: JP2010530230A; US8338146B2; WO2008155302A1; MX2009014055A; EP2171074A1; EP2171074B1; JP5503534B2; US20100143991A1; ATE535608T1; CN101796192A; CA2691799A1; CA2691799C; ES2377907T3

Abstract

通过还原相应的酮产生式(Ia)或(Ib)的光学活性醇的方法，

式Ia 式Ib其中R¹，R²为烷基、链烯基、芳基或烷基芳基，其可依次被烷基、卤素、SH、SR²、OH、OR²、NO₂、CN、CO、COOR²、NR²R³或NR²R³R⁴⁺X单取代或多取代，其中R²、R³和R⁴相互独立的为H、或低级烷基、或低级烷氧基，并且X^-为相反离子，条件是R¹与R²不同，其中还原用脱氢酶进行，所述脱氢酶具有SEQ ID NO：2或NO：4多肽序列，或具有相对于SEQ IDNO：2或NO：4，其中高至25％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而被修饰的多肽序列。

Description

使用固氮弧菌属物种(Azoarcus Sp)EBN1脱氢酶产生光学活性醇的方法

本发明涉及制备式Ia或Ib的光学活性醇的方法。

式Ia 式Ib

现有技术

脱氢酶作为生物催化剂的功能是众所周知的[Chemico-BiologicalInteractions(2003)143：247，Journal of Biological Chemistry(2002)277：25677]。特别是，已有文献记载了这种酶类在制备精细化学品中的工业用途[Tetrahedron(2004)60：633，Trends Biotechnol(1999)17：487]。已知的脱氢酶在活性和特异性上的不同取决于底物。根据其立体选择性，脱氢酶分为所谓的Prelog酶和反Prelog(anti-Prelog)酶(Pure and AppliedChemistry，(1964)，9：119)。

因此，之前所述的用于制备光学活性苯乙醇衍生物的生物催化剂主要是那些表现出“Prelog”选择性的，而表现出相反的对映选择性的酶虽然已知，却是罕见的[Trends Biotechnol(1999)17：487，J.Org.Chem.(1992)57：1532]。

本发明涉及通过还原相应的酮制备式Ia或Ib的光学活性醇的方法，

式Ia 式Ib

其中

R¹，R²为烷基、链烯基、芳基或烷基芳基，其可依次被烷基、卤素、SH、SR²、OH、OR²、NO₂、CN、CO、COOR²、NR²R³或NR²R³R⁴⁺X取代一次或多次，其中R²、R³和R⁴相互独立的为H、或低级烷基、或低级烷氧基，并且X^-为相反离子，条件是R¹不等于R²，

其中还原用具有SEQ ID NO：2或NO：4多肽序列的脱氢酶，或用与SEQ ID NO：2或NO：4相比，其中高至25％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合而被改变的多肽序列进行。

本发明一个特别好的实施方案由制备式Ia或Ib的光学活性醇的方法组成，其中R¹为C1-C10-烷基，并且R²为苯基，其中R1基和/或R2基任选地被卤素单基取代。

本发明特别涉及制备式Ia的光学活性醇的方法，其中R¹基比R²基体积小。

式Ia

如果R²基比R¹基的体积大，根据Prelog，V.，Pure and AppliedChemistry，(1964)，9，119-130，该醇属于“反Prelog”种类。

手性醇可以根据其构型区分为所谓的“Prelog”和“反Prelog”对映异构体。根据邻近醇基的两个基团的大小(体积)，以及涉及这两个基团的羟基官能的排列，进行这两类之一的分配。具有“反Prelog”构型的光学活性醇是多种活性成分的重要前体。

通用术语和定义

除非另有说明，否则应用下列通用含义：

“卤素”表示氟、氯、溴或碘，特别是氟或氯。

“低级烷基”表示含有1至6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或2-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基丁基。

“低级链烯基”表示上述含有2至6个碳原子的烷基的单或多不饱和的、优选单或二不饱和类似物，其中双键可以位于碳链的任何位置。

“低级烷氧基”表示上述烷基的氧封端的类似物。

“芳基”表示单核或多核、优选单核或双核、任选地取代的芳香基，特别是苯基或经由环上任意位置键合的萘基，例如1-萘基或2-萘基。这些芳基可以任选地包含1个或2个相同或不同的取代基，例如如上所定义的卤素、低级烷基、低级烷氧基或三氟甲基。

本发明上下文中的“对映选择性”是指，在两种可能的对映体中，其中一种对映体过量ee(％)至少为50％，优选至少为80％，特别至少为90％，尤其至少为95％。ee计算方法如下：

ee(％)＝对映体A-对映体B/(对映体A+对映体B)x100

生物化学实施方案

特别适合的脱氢酶(EC 1.1.X.X)尤其是NAD-或NADP-依赖型脱氢酶(E.C.1.1.1.x)，特别是能将酮选择性还原生成“反Prelog”醇的醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1或E.C.1.1.1.2)。该脱氢酶优选从在每种情形下存放在菌株集合中的微生物中获得，特别优选从细菌、真菌，尤其是酵母中获得，或是从天然来源例如土壤样品、生物质样品等的分离物中获得，或者通过从头基因合成获得。

脱氢酶可以以纯化或部分纯化的形式使用，或以原始微生物形式使用，或以表达脱氢酶的重组宿主生物体形式使用。从微生物中获得和纯化脱氢酶的方法为本领域技术人员所熟知的，例如从K.Nakamura & T.Matsuda，“Reduction of Ketones”，在K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysisin Organic Synthesis 2002，卷III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中获知。产生脱氢酶的重组过程也同样是众所周知的，例如从W.Hummel，K.Abokitse，K.Drauz，C.Rollmann和H.

，Adv.Synth.Catal.2003，345，No.1+2，第153-159页中获知。

适合的细菌为例如下述目中的那些：伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氢菌目(Hydrogenophilales)、嗜甲基菌目(Methylophilales)、奈瑟菌目(Neisseriales)、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)、普罗卡杆菌目(Procabacteriales)或红环菌目(Rhodocyclales)。

特别优选的脱氢酶从红环菌科(Rhodocyclaceae)细菌中获得。

特别优选的脱氢酶从固氮弧菌属(Azoarcus)、Azonexus、固氮螺菌属(Azospira)、固氮弧菌属(Azovibrio)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、高铁杆菌属(Ferribacterium)、嗜氢菌属(Petrobacter)、丙酸弧菌属(Propionivibrio)、Quadricoccus、红环菌属(Rhodocyclus)、Sterolibacterium、索氏菌属(Thauera)和动胶菌属(Zoogloea)中获得。

非常特别优选的脱氢酶从固氮弧菌属的物种中获得。

用脱氢酶的还原通常在存在合适的辅因子(也称为辅底物)时发生。一般用于还原酮的辅因子为NADH和/或NADPH。除了使用脱氢酶作为本身包含辅因子的细胞系统外，或者还可以加入其他可选择的氧化还原介质(A.Schmidt，F.Hollmann和B.Bühler“Oxidation of Alcohols”，在K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，卷III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim)。

用脱氢酶的还原还通常在存在合适的、使还原过程中已氧化的辅因子再生的还原剂时发生。

合适的还原剂的实例为糖，特别是己糖，例如葡萄糖、甘露糖、果糖，和/或可氧化的醇，特别是乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或异丙醇，以及甲酸、亚磷酸盐或氢分子。为了氧化还原剂及其连接物质，以使辅酶再生，有可能增加第二脱氢酶，例如，当以葡萄糖作为还原剂时，增加葡萄糖脱氢酶，当以亚磷酸盐作为还原剂时，增加亚磷酸盐脱氢酶，或者当以甲酸作为还原剂时，增加甲酸脱氢酶。这种脱氢酶能够作为游离酶、或固定化酶、或游离或固定化细胞的形式使用。该脱氢酶可单独制备或通过(重组)脱氢酶菌株的共表达制备。

本发明所用脱氢酶可以游离或固定化地被使用。固定化酶是指被固定在惰性载体上的酶。合适的载体材料及固定在其上的酶已在EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-A 100193773及其提及的参考资料中公开。本领域中这些出版物所公开的内容以其整体引入作为参考。合适的载体材料包括例如粘土，粘土矿物质如高岭土、硅藻土、珍珠岩，二氧化硅，氧化铝，碳酸钠，碳酸钙，纤维素粉，阴离子交换材料，合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸类树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯，以及聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。载体材料通常以精细分开的颗粒化的形式使用，以制备与载体结合的酶，优先多孔形式。载体材料微粒的大小通常不超过5mm，特别是不超过2mm(分级曲线)。在利用脱氢酶作为全细胞催化剂时，也能类似地选择游离或固定化的形式。载体材料的实例为藻酸钙和角叉菜聚糖。酶和细胞两者也都可以和戊二醛直接交联(交联以提供CLEA)。相应的和其它的固定化方法在例如J.Lalonde和A.Margolin“Immobilization ofEnzymes”，在K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis 2002，卷III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中描述。

反应可以在水性反应介质、或非水反应介质、或两相系统、或(微)乳液中进行。水性反应介质是优选的经缓冲的溶液，其通常具有的pH值为4-8，优选5-8。水性溶剂除了水以外，还可以另外包含至少一种醇，例如乙醇或异丙醇，或二甲基亚砜。

非水反应介质，是指基于反应介质的总重量，包含按重量计少于1％，优选按重量计少于0.5％的水的反应介质。反应优选在有机溶剂中进行。合适的溶剂的实例为脂族烃，其优选具有5至8个碳原子，例如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷；卤代脂族烃，其优选具有1或2个碳原子，例如二氯甲烷、氯仿、四氯甲烷、二氯乙烷或四氯乙烷；芳烃，例如苯、甲苯、二甲苯，氯苯或二氯苯；脂肪族无环和环的醚类或醇类，其优选具有4至8个碳原子，例如乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、四氢呋喃，或酯类例如乙酸乙酯、乙酸正丁酯，或酮类例如甲基异丁基酮或二噁烷，或其混合物。

具有脱氢酶的还原反应在例如水性-有机性，特别是水性反应介质中进行。

要被还原的酮优选在0.1g/l至500g/l，特别优选在1g/l至50g/l的浓度下，在酶促还原中被使用，其可被连续的或不连续的提供。

酶促还原通常要在反应温度低于所用脱氢酶失活温度时进行，优选至少是在-10℃。特别优选范围从0到100℃，特别从15至60℃，尤其从20到40℃，例如在大约30℃。

可能的过程例如：将酮与脱氢酶、溶剂、辅酶(根据需要)、第二种脱氢酶(根据需要，以再生辅酶和/或其它还原剂)通过例如搅拌或振荡充分混合。但是，也可以使脱氢酶在反应器例如在柱子中固定化，并且将包含酮、辅酶(根据需要)和/或共底物的混合物通过反应器。为此，该混合物可以循环通过反应器，直到达到所需的转化。在这种情况下，酮的酮基被还原成OH基，实质上生成醇的两种对映体之中的一种。所述还原一般被控制直到基于混合物中存在的酮，转化率至少为70％，特别优选至少85％，尤其至少95％。在这一情形中，该反应过程(即酮的相继还原)之后为常规方法例如气相色谱或高压液相色谱。

本发明过程中使用的脱氢酶特别优选是具有下列性质的醇脱氢酶：

来自固氮弧菌属的具有SEQ ID 2或SEQ ID 4所示氨基酸序列的醇脱氢酶，以及具有下述氨基酸序列的醇脱氢酶，在所述氨基酸序列中，通过与SEQ ID 2或SEQ ID 4相比，高至25％，优选高至15％，特别优选高至10％，尤其高至5％的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被改变。

将简单的醇例如异丙醇、丁-2-醇、戊-2-醇或环己醇氧化至相应羰基，同时伴随着NAD⁺或NADP⁺的还原。

催化还原的醇脱氢酶，其对映体纯度至少为95％ee(存在NADH和/或NADPH，30℃，pH 7.0)。

本发明还涉及具有至少一种前述性质的“反Prelog”脱氢酶。

该醇脱氢酶在下列溶剂存在时表现出活性：庚烷、己烷、MtBE、正丁醇、丁-2-醇、正戊醇、戊-2-醇、戊-3-醇、DMSO、异丙醇、正丙醇、乙醇。

它们优选具有26±2k道尔顿区域中的分子量。

本发明的脱氢酶的其它修饰：

本发明还包括具有脱氢酶活性的具体公开的酶的“功能等同物”及其在本发明方法中的用途。

在本发明的上下文中，具体公开的酶的“功能等同物”或类似物是与这些酶不同但是仍然具有所需生物活性(例如底物特异性)的多肽。由此，“功能等同物”是指例如下述酶，其将酮还原成相应的“反Prelog”醇，并具有含有SEQ ID 2或SEQ ID 4中所列氨基酸序列之一的酶的至少20％，优选50％，特别优选75％，非常特别优选90％活性。功能等同物还优选在pH 4至10之间稳定并有利地具有pH 5至8之间的pH最优值及20℃至80℃的范围内的温度最优值。

根据本发明，“功能等同物”还特别是指突变体，其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置中具有与特别提及的氨基酸不同的氨基酸，但仍然具有上述生物活性之一。“功能等同物”由此包括通过一个或多个氨基酸添加、取代、缺失和/或倒置获得的突变体，所述改变可以在任何序列位置上发生，只要其产生具有本发明的性质谱(property profile)的突变体。特别地，当突变体和未修饰多肽的反应性模式(pattern)在性质上相符，也就是例如以不同的速率转化相同的底物时，也存在功能等同性。

可以在下表中找到合适的氨基酸取代的实例：

原始残基取代实例

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln；His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn；Gln

Ile Leu；Val

Leu Ile；Val

Lys Arg；Gln；Glu

Met Leu；Ile

Phe Met；Leu；Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp；Phe

Val Ile；Leu

上述意义上的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”、所述多肽的“功能衍生物”及“盐”。

在本文中，“前体”是具有或没有所需生物活性的多肽的天然或合成前体。

术语“盐”是指本发明蛋白质分子的羧基的盐及氨基的酸加成盐。羧基的盐可以以本身已知的方式制备并包含无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐，以及含有有机碱的盐，例如胺，例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。本发明还涉及酸加成盐，例如无机酸(例如盐酸或硫酸)的盐，和有机酸(例如乙酸和草酸)的盐。

也可以借助于已知技术，在官能氨基酸侧基或在它们的N-末端或C-末端上制备本发明多肽的“功能衍生物”。这种衍生物包括，例如，羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺(可通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得)；游离氨基的N-酰基衍生物(通过与酰基的反应制成)；或游离羟基的O-酰基衍生物(通过与酰基的反应制成)。

在蛋白质可能糖基化的情况下，本发明的“功能等同物”包含去糖基或糖基化形式的上述指定类型蛋白质，以及通过改变糖基化模式获得的修饰的形式。

“功能等同物”自然还包括可由其他微生物获得的多肽以及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较确定同源序列区域的范围，并可以根据本发明的具体要求确定等同的酶。

“功能等同物”还包括本发明多肽的片段，优选各个结构域或序列基序，这些片段具有，例如，所需的生物功能。

此外，“功能等同物”是包含上述多肽序列或自其衍生的功能等同物之一，以及至少一个在功能上与其不同、并处于功能性N-末端或C-末端连接中的其他异源序列(即融合蛋白各部分间相互没有显著的功能损害)的融合蛋白。这种异源序列的非限制性实例是例如信号肽或酶。

本发明包含的“功能等同物”也是具体公开的蛋白质的同源物。通过使用Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法计算，所述同源物与具体公开的氨基酸序列之一具有至少75％，特别至少85％，例如90％，95％，97％或99％的同源性。本发明同源多肽的同源性百分比特别是指基于本文具体描述的一条氨基酸序列全长的氨基酸残基同一性百分比。

本发明的蛋白质或多肽的同源物可以通过诱变产生，例如通过蛋白质的点突变或截短产生。

可以通过筛选突变体(例如截短突变体)的组合文库来鉴定本发明蛋白质的同源物。例如，可以通过核酸水平的组合诱变(例如，通过合成寡核苷酸混合物的酶促连接)产生蛋白质变体的花斑文库(variegated library)。有多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列制备可能的同源物文库。可以在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，并且可将合成基因连接到合适的表达载体上。基因简并集的使用使得可能在一种混合物中提供编码需要的可能的蛋白质序列集合的全部序列。合成简并寡核苷酸的方法为本领域技术人员所公知(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。

一些筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物的技术，以及筛选cDNA文库以寻找具有所选特性的基因产物的技术是本领域公知的。可以改变以使这些技术适用于快速筛选通过本发明同源物的组合诱变产生的基因文库。筛选进行高通量分析的大基因文库最常使用的技术包括：将基因文库克隆进可复制的表达载体、将得到的载体文库转入合适的细胞、以及在所需活性的检测便于分离载体的条件下表达组合基因，所述载体编码其产物已被检测的基因。循环系综诱变(Recursive ensemblemutagenesis，REM)技术是能提高文库中功能性突变体频率的技术，可与筛选测试组合应用以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。

本发明编码核酸序列的其它方案(configuration)

本发明涉及编码具有本发明脱氢酶活性的酶的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)的用途。优选核酸序列编码例如在SEQ ID 2或SEQ ID 4所示氨基酸序列或者其特征部分序列，或者包含在SEQ ID 1或SEQ ID 3所示核酸序列或其特征部分序列。

本文所述的所有核酸序列可以本身已知的方式从核苷酸构件通过化学合成制备，例如，通过双螺旋各个重叠的互补核酸构件的片段凝聚。寡核苷酸的化学合成可例如按已知方式发生，通过亚磷酰胺(phosphoamidite)法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，第896-897页)。在Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning：A laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中，描述了合成寡核苷酸的添加，和使用DNA聚合酶Klenow片段和连接反应填补空位，以及常规的克隆法。

本发明还涉及核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，所述核酸序列编码上述多肽及其例如通过使用人工核苷酸类似物得到的功能等同物之一。

本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性区段的分离的核酸分子，以及可用于例如用作杂交探针或引物以鉴定或扩增本发明编码核酸的核酸片段。

本发明的核酸分子还可包含来自编码基因区3’和/或5’端的非翻译序列。

本发明还包含与具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其区段。

本发明的核苷酸序列可能产生可用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中同源序列的探针和引物。这些探针或引物通常含有核苷酸序列区域，其在“严格”条件(见下文)下与本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少约12、优选至约25(例如大约40、50或75)个连续核苷酸杂交。

“分离的”核酸分子与该核酸天然来源中存在的其他核酸分子分离，另外，如果通过重组技术产生，则基本上不含其他细胞材料或培养基；如果是化学合成则不含化学前体或其他化学物。

本发明的核酸分子可按照标准分子生物学技术和按照本发明提供的序列信息来分离。例如，可通过使用一种具体公开的全长序列或其区段作为杂交探针和标准杂交技术(例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所描述的)从适当的cDNA文库中分离cDNA。另外，通过聚合酶链式反应分离含有一种公开的序列或其区段的核酸分子，这是使用基于该序列构建的寡核苷酸引物。通过这种方法扩增的核酸可以被克隆进入合适的载体，并通过DNA序列分析进行表征。本发明的寡核苷酸可通过标准合成方法(例如使用自动DNA合成仪)制备。

原则上可从所有生物中鉴定和分离本发明的核酸序列。有利地，可从真菌、酵母、古细菌或细菌中分离本发明的核酸序列或其同源物。此处可能提到的细菌指革兰氏阴性和革兰氏阳性菌。本发明的核酸优选来自革兰氏阴性菌，有利地来自α-蛋白菌(proteobacteria)、β-蛋白菌或γ-蛋白菌，特别优选来自下述目的细菌：伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氢菌目(Hydrogenophilales)、嗜甲基菌目(Methylophilales)、奈瑟菌目(Neisseriales)、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)、普罗卡杆菌目(Procabacteriales)或红环菌目(Rhodocyclales)。非常特别优选来自下述科的细菌：红环菌科(Rhodocyclaceae)。特别优选来自固氮弧菌属(Azoarcus)。特别优选来自物种：Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、普通固氮弧菌(Azoarcus communis)、埃文固氮弧菌(Azoarcus evansii)、需求固氮弧菌(Azoarcus indigens)、Azoarcus toluclasticus、Azoarcustolulyticus、Azoarcus toluvorans、固氮弧菌属物种(Azoarcus sp.)、固氮弧菌属物种22Lin、固氮弧菌属物种BH72、固氮弧菌属物种CC-11、固氮弧菌属物种CIB、固氮弧菌属物种CR23、固氮弧菌属物种EB1、固氮弧菌属物种EbN1、固氮弧菌属物种FL05、固氮弧菌属物种HA、固氮弧菌属物种HxN1、固氮弧菌属物种mXyN1、固氮弧菌属物种PbN1、固氮弧菌属物种PH002、固氮弧菌属物种T和固氮弧菌属物种ToN1。

特别优选使用来自固氮弧菌属物种EbN1的脱氢酶。

例如可通过常规杂交方法或PCR技术，通过例如基因组或cDNA文库，从其他生物中分离本发明的核酸序列。这些DNA序列在标准条件下与本发明序列杂交。有利地使用保守区(如来自活性中心)的短寡核苷酸进行杂交，这些保守区可以通过技术人员已知的方式与本发明的脱氢酶进行比较来鉴定。然而，也可以使用本发明核酸的较长片段或全序列进行杂交。这些标准条件根据使用的核酸(寡核苷酸、长片段或全序列)或根据用于杂交的核酸类型(DNA或RNA)而变化。因此，例如DNA:DNA杂交体的解链温度比同样长度的DNA:RNA杂交体约低10℃。

根据核酸，标准条件是指例如在42至58℃的温度，在具有0.1至5xSSC(1XSSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)浓度的水性缓冲溶液或另外存在50％甲酰胺中，例如42℃、5xSSC、50％甲酰胺。DNA:DNA杂交体的杂交条件有利为0.1xSSC且温度为大约20℃至45℃，优选为大约30℃至45℃。DNA:RNA杂交体的杂交条件有利为0.1xSSC且温度为大约30℃至55℃，优选为大约45℃至55℃。这些给出的杂交温度为针对解链温度计算的值，例如针对具有约100个核苷酸长度且G+C含量为50％的核酸在不存在甲酰胺时。DNA杂交的实验条件描述于相关的遗传学教科书中，例如Sambrook等人，“Molecular Cloning”，Cold Spring HarborLaboratory，1989，并可例如根据核酸长度、杂交体类型或G+C含量，通过技术人员所公知的公式计算。技术人员可在以下教科书中找到其它有关杂交的信息：Ausubel等人(编著)，1985，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York；Hames和Higgins(编著)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford；Brown(编著)，1991，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford.

本发明还涉及具体公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。

因此，本发明的其他核酸序列可以来自SEQ ID 1或SEQ ID 3，并通过添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸与其相区别，但是仍然能编码具有所需性质谱的多肽。

本发明还包括下述核酸序列(其含有所谓的“沉默”突变或与具体提到的序列相比按照特定来源生物或宿主生物的密码子选择而被修饰)，以及其天然存在的变体例如其剪接变体或等位变体。

还涉及通过保守核苷酸取代(即相关氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸替换)得到的序列。

本发明还涉及通过序列多态性来自具体公开核酸的分子。由于天然变异，这些遗传多态性可存在于种群内的个体间。这些天然变异通常导致基因核苷酸序列中1到5％的变异。

本发明核酸序列的衍生物意思是例如等位变体，其在推断的氨基酸水平上，在完整序列区上表现出至少40％同源性、优选至少60％同源性、非常特别优选至少80％、85％、90％、93％、95％或98％同源性(关于氨基酸水平的同源性，可以参考上文关于多肽的阐述)。有利的是，在序列的部分区域上同源性可以更高。

另外，衍生物也指本发明核酸序列的同源物，例如真菌或细菌同源物、截短序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。它们具有例如在DNA水平，在所示完整DNA区域上至少有40％、优选至少60％、特别优选至少70％、非常特别优选至少80％的同源性。

另外，衍生物还指例如带有启动子的融合体(fusion)。位于所示核苷酸序列上游的所述启动子可以通过一个或多个核苷酸的改变、插入、倒置和/或缺失被修饰，而不损害该启动子的功能或活性。另外，可以通过修饰其序列提高所述启动子的活性，或者该启动子可被更有效的启动子、甚至是不同种生物的启动子完全替换。

衍生物还指下述变体，其核苷酸序列以下述方式在起始密码子上游从-1到-1000碱基的区域或终止密码子下游从0到1000碱基区域中被修饰，所述方式使得基因表达和/或蛋白质表达被改变，优选增加。

本发明还包括在“严格条件”下与前述编码序列杂交的核酸序列。这些多核苷酸可通过筛选基因组文库或cDNA文库找到，并可根据需要使用合适的引物通过PCR方法从中扩增出来，接着使用例如合适的探针进行分离。另外，还可能通过化学途径合成本发明的多核苷酸。这一性质意味着多或寡核苷酸能在严格条件下与实际上互补的序列结合的能力，而在这些条件下非互补的配偶体(partner)间不发生非特异的结合。为此，序列应为70-100％，优选90-100％互补。互补序列能彼此特异结合的特性被利用，例如在Northern或Southern印迹技术或PCR或RT-PCR中的引物结合情形中。为此，通常使用长度为30个碱基对或更多的寡核苷酸。严格条件是指，例如在Northern印迹技术中，为洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸，在50-70℃，优选为60-65℃下使用洗涤溶液，例如含有0.1％SDS的0.1x SSC缓冲液(20xSSC：3M氯化钠、0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)。在该情形中，如前所述，只有具有高度互补性的核酸仍然彼此结合。严格条件的设置为技术人员所公知，并在例如Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中有描述。

本发明构建体的结构

本发明还涉及表达构建体，其含有在调控核酸序列的遗传控制下，编码本发明多肽的核酸序列；并且涉及含有至少一个所述表达构建体的载体。

本发明的此类构建体优选含有各自编码序列的5’-上游启动子和3’-下游终止子序列，并且，如果需要还可以含有其他常规调控元件，特别是其在每种情形中与编码序列有效连接。

“有效连接”指启动子、编码序列、终止子和(根据需要)其他调控元件以使每个调控元件能在编码序列的表达中发挥其想要的功能的方式顺序排列。有效连接序列的实例为靶向序列和增强子、多腺苷酸化信号等等。其他调控元件包括可选择标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调控序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有所描述。

本发明的核酸构建体具体指下述那些，其中本发明的脱氢酶基因与一个或多个调控信号有效或功能性连接以控制，例如增加基因表达。

除这些调控序列之外，还可能有下述这些序列的天然调控，所述这些序列仍然存在于实际的结构基因前面，并且根据需要已经被遗传修饰从而关闭天然调控并且增加基因的表达。然而，核酸构建体也可以具有更简单的结构，即没有额外的调控信号被插入到编码序列之前，且不去除天然启动子的调控。反之，以使得调控不再发生并提高基因表达的方式突变天然调控序列。

优选的核酸构建体还有利地含有一个或多个上述增强子序列，其与使核酸序列表达增加成为可能的启动子功能性连接。其他有利的序列(例如其他调控元件或终止子)也可被插入DNA序列的3’末端。构建体中可存在一个或多个拷贝的本发明核酸。根据需要为选择构建体，构建体还可以含有其他标记，例如抗生素抗性或辅源营养补充基因。

本发明方法的有利调控序列例如存在于启动子中，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacI^q、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaP_BAD)SP6、λ-P_R或λ-P_L的启动子中，所述启动子可有利的用于革兰氏阴性菌中。其他有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中，酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在本文中，例如来自汉逊酵母属(Hansenula)的丙酮酸脱羧酶和甲醇氧化酶的启动子也是有利的。也可用人工启动子来调控。

为了在宿主生物中表达，核酸构建体可有利地被插入到载体中，例如插入到使基因在宿主中得到最佳表达成为可能的质粒或噬菌体中。除了质粒和噬菌体以外，载体还意指技术人员已知的所有其它载体，例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒等)、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环形DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制或染色体复制。这些载体代表本发明的方案(configuration)。合适的质粒为，例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、lgt11或pBdCI，链霉菌属(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116，酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述的质粒代表可能的质粒的小部分的选择。其他质粒为技术人员所熟知并可以在例如《克隆载体》(Cloning Vectors，编著Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)一书中找到。

为了表达存在的其他基因，核酸构建体有利地额外含有3’-和/或5’-末端调节序列以增加表达，其选择是针对取决于基因或所选宿主生物的最佳表达。

这些调控序列旨在使基因的特定表达及蛋白质表达成为可能。例如取决于宿主生物，这是指基因只在诱导后被表达或过表达，或其立即被表达和/或过表达。

此外，调控序列或因子可优选具有正面影响，并因此提高引入基因的表达。因此，通过使用强转录信号(例如启动子和/或“增强子”)，可以有利地在转录水平上发生调控元件的增强。然而，另外也可通过例如提高mRNA稳定性来增强翻译。

在载体的另一实施方案中，含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体还可以有利地以线性DNA的形式被引入微生物，并通过异源或同源重组被整合入宿主生物基因组。该线性DNA可由线性化载体(如质粒)或仅由核酸构建体或本发明的核酸组成。

为了异源基因在生物体中的最佳表达，可有利地按照该生物体使用的特定密码子选择来修饰核酸序列。密码子选择可以在相关生物体其他已知基因的计算机分析基础上容易的确定。

本发明表达盒通过将适当的启动子与适当的核苷酸编码序列以及终止子或多腺苷酸化信号融合而制备。为此，使用常规重组和克隆技术，例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experimentswith Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)，和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)中所描述的。

为了在适当的宿主生物中表达，重组核酸构建体或基因构建体有利地被插入到能使基因在宿主中最佳表达成为可能的宿主特异载体中。载体为技术人员所熟知，并可以在例如《克隆载体》(Cloning Vectors，Pouwels P.H.等人，编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。

根据本发明可使用的宿主生物体

可以借助本发明载体或构建体制备转化了例如至少一种本发明载体、并可用于产生本发明多肽的重组微生物。有利地将上述本发明的重组构建体引入合适的宿主系统并表达。优选使用技术人员熟悉的普通的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等等，以在特定表达系统中产生所述核酸的表达。合适的系统描述于例如CurrentProtocols in Molecular Biology，F.Ausubel等人，编辑，Wiley Interscience，New York 1997，或Sambrook等人Molecular Cloning：A LaboratoryManual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。

根据本发明，也可以制备同源重组微生物。这需要制备含有本发明基因或编码序列的至少一个区段的载体，其中根据需要，已经引入了至少一个氨基酸缺失、添加或取代，以修饰例如功能性破坏本发明的序列(敲除载体)。引入序列也可以是例如来自相关微生物的同源物，或是来自哺乳动物、酵母或昆虫来源。可以备选地设计用于同源重组的载体，使得在同源重组过程中内源基因被突变或者另外修饰但仍然编码功能蛋白质(例如，可以改变内源蛋白质的表达的方式修饰位于上游的调控区)。本发明基因的修饰区段存在于同源重组载体中。用于同源重组的适当载体的构建描述于例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503中。

用于本发明核酸或核酸构建体的适当的重组宿主生物体原则上是所有的原核或真核生物。有利的使用微生物作为宿主生物体，例如细菌、真菌或酵母。有利的使用革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，优选下述科：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡尔菌科(Nocardiaceae)的细菌，特别优选下述属埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡尔菌属(Nocardia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。非常特别优选属和物种大肠杆菌(Escherichia coli)。另外，其他有利的细菌可见于α-蛋白菌、β-蛋白菌或γ-蛋白菌的组。

此外，本发明的一种或多种宿主生物体优选包含至少一种本发明中所述的、编码本发明具有脱氢酶活性的酶的核酸序列、核酸构建体或载体。

本发明方法中所使用的生物体以技术人员公知的方法根据宿主生物进行培养或生长。微生物一般在液体培养基中生长，所述培养基包含通常以糖形式存在的碳源、通常以有机氮源形式(例如酵母提取物)或盐形式(如硫酸铵)存在的氮源、痕量元素(如铁、锰、镁盐)，及适当时维生素，温度为0℃到100℃之间，优选10℃到60℃之间，同时在氧气中通过。在培养过程中，营养液的pH可保持(即培养过程中受控)或不保持恒定值。培养可是分批的、半分批的或连续的进行。营养物可在发酵起始时引入或半连续或连续地随后加入。酮可直接加入用于培养或有利的在培养后加入。酶可依照实施例中所述方法从生物体中分离，或作为粗提取物用于反应。

本发明多肽的重组制备

本发明另外涉及重组制备本发明多肽或其功能性、生物活性片段的方法，其中培养产生多肽的微生物，根据需要诱导所述多肽的表达，将后者从培养物中分离出来。如果需要的话，也可以通过这种方法以工业规模生产多肽。

重组微生物可通过已知方法培养和发酵。例如，可以在20到40℃、pH6到9下，在TB或LB培养基中生长细菌。合适的培养条件在例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中有详细描述。

如果多肽不分泌进入培养基，则随后破裂细胞以及通过已知的蛋白质分离方法从裂解物中获得产物。备选地破裂细胞可通过高频超声、通过高压(例如弗氏压碎器)、通过渗透裂解、通过洗涤剂、分解酶或有机溶剂的作用、通过匀浆器或通过多种所示方法的组合。

多肽的纯化可通过已知的层析方法如分子筛层析(凝胶过滤)，例如Q琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析，以及其他常用方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳进行。合适的方法在例如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，NewYork，或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中有所描述。

为了分离重组蛋白质有利地使用载体系统或寡核苷酸，所述载体系统或寡核苷酸通过特定的核苷酸序列延伸cDNA，并因而编码经修饰多肽或融合蛋白质，其作用为例如更简单的纯化。例如，这类合适的修饰为所谓的“标签”，其作用为锚(例如已知为六-组氨酸锚的修饰)，或被抗体识别为抗原的表位(在例如Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中有所描述)。这些锚可用于将蛋白质附着于固体支持物上或用于微滴定板或其他支持物上，所述固体支持物例如聚合物基质上，其可以例如被包装到层析柱中。

同时，这些锚也可以用于识别蛋白质。还可以单独或与锚组合(用于衍生蛋白质)使用常用标记物用于蛋白质识别，所述标记物例如荧光染料、与底物反应后形成可检测的反应产物的酶标记物或者放射性标记物。

进行本发明酶促还原过程的其他方案

本发明方法所使用的脱氢酶可作为游离酶或固定化酶使用，或作为仍在重组生产生物体中存在的催化剂使用。

本发明的方法有利地在0℃至95℃，优选10℃至85℃，特别优选15℃至75℃之间进行。

在本发明的方法中，pH有利地保持pH 4至12，优选4.5至9，特别优选pH 5至8。

在本发明的方法中，对映纯性或手性产物是指表现出对映体富集性(enrichment)的对映体。优选在该方法中实现至少70％ee，优选至少80％ee，特别优选至少90％ee，非常特别优选至少98％ee的对映体纯度。

可以为本发明方法使用含有本发明的核酸、核酸构建体或载体的生长细胞。也可以使用静止的或破碎的细胞。破碎的细胞是指例如，通过如溶剂处理为可渗透的细胞，或通过酶处理、通过机械处理(如弗氏压碎或超声)或通过其他方法破碎(disintegrated)的细胞。通过这种方法获得的粗提取物有利地适用于本发明的方法。纯化的或部分纯化的酶也可以用于该方法。可在反应中有利地使用的固定化微生物或酶同样适用。

本发明的方法可以分批、半分批或连续进行。

该方法可以有利地在例如Biotechnology，卷3，第2版，Rehm等人编辑，(1993)，特别是第二章中所述的生物反应器中进行。

以下实施例用于阐述本发明而不是限制。

实验部分

实施例1：克隆来自固氮弧菌属物种EbN1的醇脱氢酶EbN2。

源自固氮弧菌属物种EbN1的EbN2脱氢酶的基因序列记录于数据库中(SEQ ID 1，[Genbank ID 56475432，区域：2797788..2798528])。

寡核苷酸衍生自基因的核酸序列，并且通过已知方法用于扩增来自固氮弧菌属物种EbN1基因组DNA的基因。由此产生的序列与已公开序列相对应。表1概括了所述寡核苷酸的DNA序列。

PCR条件：

2μl 10＊Pfu ultra缓冲液(Stratagene)

100ng 引物#1(参见表1)

100ng 引物#2(参见表1)

1μl dNTP(每种10mM)

大约(ca.)30ng来自固氮弧菌属物种EbN1的染色体DNA

1U Pfu ultra DNA聚合酶

ad 20μl H₂O

温度程序：

5分钟，94℃，

10分钟，72℃，

∞，10℃

用限制性内切核酸酶NdeI和BamHI消化PCR产物(大约751bp)，并将其克隆到相应的已消化的pDHE19.2载体(DE19848129)中。将连接混合物转入大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。

将由此产生的pDHE-PDH-L质粒转化入大肠杆菌菌株TG10 pAgro4pHSG575(TG10：大肠杆菌TG1的RhaA^-衍生物(Stratagene)；pAgro4：Takeshita，S；Sato，M；Toba，M；Masahashi，W；Hashimoto-Gotoh，T(1987)Gene 61，63-74；pHSG575：T.Tomoyasu等人(2001)，Mol.Microbiol.40(2)，397-413)。

该重组大肠杆菌被称作LU 13151。

实施例2：克隆来自固氮弧菌属物种EbN1的醇脱氢酶ChnA。

源自固氮弧菌属物种EbN1的脱氢酶基因ChnA的序列记录于数据库中([Genbank ID 56475432，区域：(互补)192247..192993])。

寡核苷酸衍生自基因的核酸序列，并且通过已知方法用于扩增来自固氮弧菌属物种EbN1基因组DNA的基因。由此产生的序列与已公开序列相对应。表2概括了所述寡核苷酸的DNA序列。

PCR条件：

2μl 10＊Pfu ultra缓冲液(Stratagene)

100ng 引物#3(参见表2)

100ng 引物#4(参见表2)

1μl dNTP(每种10mM)

大约(ca.)30ng来自固氮弧菌属物种EbN1的染色体DNA

1U Pfu ultra DNA聚合酶

ad 20μl H₂O

温度程序：

5分钟，94℃，

10分钟，72℃，

∞，10℃

用限制性内切核酸酶NdeI和BglI消化PCR产物(大约743bp)，并将其克隆到已用NdeI和BamHI限制性(消化过)的pDHE19.2载体(DE19848129)中。将连接混合物转化入大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。

该重组大肠杆菌被称作LU 13283.

实施例3：提供重组“反Prelog”脱氢酶

在100毫升锥形烧瓶(挡板(bafflers))中，将LU 13151或LU 13283在20毫升LB-Amp/Spec/Cm(100μg/l氨苄青霉素；100μg/l壮观霉素；20μg/l氯霉素)、0.1mM IPTG、0.5g/l鼠李糖中37℃培养18小时，以5000＊g/10分钟离心，用10mM TRIS＊HCl(pH 7.0)洗涤一次，并再重悬于2毫升相同的缓冲液中。

在震荡粉碎机(vibratory mill)(3×5分钟，中间在冰上冷却)中，用0.7毫升玻璃珠(d＝0.5毫米)破碎LU 13151或LU 13283细胞糊(cell paste)，由此制备无细胞的蛋白质粗提物。

实施例4：来自固氮弧菌属物种EbN1的重组“反Prelog”脱氢酶活性的测定

在每种情况下，在100毫升锥形瓶(挡板(bafflers))中，将6种转化体在20毫升LB Amp/Spec/Cm(100μg/l氨苄青霉素；100mg/l壮观霉素；20μg/l氯霉素)、0.1mM IPTG、0.5g/l鼠李糖中37℃培养18小时，以5000＊g/10分钟离心，用10mM TRIS/HCl(pH 7.0)洗涤一次，并重悬于2毫升相同的缓冲液中。

在震荡粉碎机(3×5分钟，中间在冰上冷却)中，用0.7毫升玻璃珠(d＝0.5毫米)破碎细胞，由此获得包含脱氢酶基因的重组大肠杆菌的无细胞粗提物。

在340nm光度计中，可追踪酮还原过程中已还原共底物的消耗。将10μl稀释的无细胞粗提物

)、10μmol酮和250nmolNADH或NADPH在30℃下温育于1ml的50mM KP_i、1mM MgCl₂pH 6.5中。1单位(1U)对应在1分钟内还原1μmol酮的酶量。

实施例5：苯基乙醇分析

可以通过HPLC测定苯乙酮和苯基乙醇的浓度。除浓度外，还可以根据固定相和流动相的选择测定ee值。

固定相：Hydrodex β-6-TBDM(Macherey&Nagel)，长度：25m，250μm，

流动相：氦，分裂100∶1，总流速：92ml/min，压力：17psi

流速： 1.0ml/min

检测： FID

温度梯度：t＝0min：90℃，以3°/min加热至140℃

检测器温度：250℃

驻留时间：苯乙酮：大约7.5min

(1S)-苯基乙醇：大约12.5min

(1R)-苯基乙醇：大约12.1min

使用可靠材料，构建校准系列，使得能够测定未知样品的浓度。

实施例6：提供用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶以及通过葡萄糖脱氢酶进行的辅因子再生(酶偶联)

葡萄糖脱氢酶可用于辅因子再生。该酶可获自商业来源(例如JülichFine Chemicals，订购号第22.10或19.10)或获自我们的来源。后者为大肠杆菌XL10 Gold克隆，所述克隆在质粒pUC19(此构建体称为大肠杆菌LU11293)中包含来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Genbank登录号M12276)的葡萄糖脱氢酶基因。

配制以下培养基用于大肠杆菌LU11293的发酵：

560g	酵母提取物(65％)
		448g	胰蛋白胨(Difco)
42g	KH₂PO₄
		84g	Na₂HPO₄
644g	甘油(99％)
		100ml	SL4溶液(5x)

		1g	Tegosipon 3062
	用水将培养基配至13.5l，
			调整pH值至7.0，移出约300ml用于预培养
	然后在122℃下灭菌30分钟。

	添加无菌盐溶液^＊(预先移出用于摇瓶的盐溶液；见报告)。

^＊盐溶液：2.1g CaCl₂＊2H₂O

3.5g MgSO₄＊7H₂O

14g NH₄Cl

14ml 氨苄青霉素溶液(100mg/ml)

溶解于500ml水中并通过过滤灭菌

将150ml部分培养基在两个1l锥形瓶中灭菌且补充5ml无菌盐溶液。从LB-氨苄青霉素琼脂板接种后，将预培养物在37℃及200rpm下孵育12小时，并加至发酵培养基中。在37℃、0.1bar内压、pH 7.0(用20％磷酸和25％NaOH控制)下，以7.5l/min的充气速度(aeration rate)和300rpm(通过10-20l/min进气和500-1500rpm，将pO₂控制在20至50％之间)开始发酵。两小时后，添加0.1mM IPTG用于诱导，且总计13小时后，发酵终止。收获并洗涤细胞(1.3kg)，将它们在-20℃下储存直至使用(2-20g/l，于混合物中)。

将等摩尔量的葡萄糖和酮与1-30U/ml葡萄糖脱氢酶粗提物、1-30U/mL醇脱氢酶粗提物、0.02-1mmol/l NAD或NADP、或NADH或NADPH一起在缓冲液中溶解，并且在10-60℃中温育。pH值通过自动添加碱保持恒定。

实施例7：用底物偶联的辅因子再生

辅因子再生也可通过两种醇脱氢酶自身进行。在此情况下，不必要添加单独的再生酶。醇脱氢酶ChnA和Ebn2接受多种简单醇(simplealcohols)作为还原剂。其经氧化成相应的羰基化合物。适合于再生NADH或NADPH的简单醇为异丙醇、丁-2-醇和戊-2-醇。

实施例8：用甲酸脱氢酶的辅因子再生(酶偶联)

甲酸脱氢酶可用于辅因子再生。该酶可获自商业来源(例如Jülich FineChemicals，订购号第09.11、24.11或25.10)或获自我们的来源。因此辅因子再生还可用甲酸脱氢酶类似实施例6的进行。在此情况下，将等摩尔量的甲酸和酮与1-30U/ml甲酸脱氢酶粗提物、1-30U/mL醇脱氢酶粗提物、0.02-1mmol/l NAD或NADP、或NADH或NADPH在缓冲液中溶解，并且在10-60℃中温育。pH值通过自动添加酸保持恒定。

实施例9：使用重组“反Prelog”脱氢酶制备R-苯基乙醇

根据实施例3生长、收获和破碎大肠杆菌LU 13151或LU 13283。

将每升反应容积，0.2mmol NAD、500U葡萄糖脱氢酶、1mol D-葡萄糖、1mol苯乙酮、100-1000U来自LU 13283或LU 13151的醇脱氢酶溶解在KP_i缓冲液(50mM KP_i，1mM MgCl₂，pH 6.5)中，并于30℃温育。pH值通过自动添加2M NaOH保持恒定。

如果在反应(分批补料程序)过程中测量苯乙酮，完全可能达到更高的R-苯基乙醇终浓度。

同样，在存在有机的、不溶于水的溶剂中可能反应。

序列表

<110>巴斯夫欧洲公司(BASF SE)和马克思-普朗克科学促进协会公司

(Max-Planck-Gesellschaft)和阿尔伯特路德维希的弗赖堡大学(

Freiburg)

<120>使用固氮弧菌属物种(Azoarcus Sp)EBN1脱氢酶产生光学活性醇的方法

<130>PF 0000059328

<160>8

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>741

<212>DNA

<213>固氮弧菌属物种(Azoarcus sp.)EbN1

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(741)

<223>

<400>1

atg aat cag aaa gtc gca ctc gtc acc ggc gcc atg ggt ggc ctg ggt 48

Met Asn Gln Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Met Gly Gly Leu Gly

1 5 10 15

acc gct atc tgc cag gcg ctg gca aag gac gga atg aag gtc gtg gcc 96

Thr Ala Ile Cys Gln Ala Leu Ala Lys Asp Gly Met Lys Val Val Ala

20 25 30

aat tgt ctc ccc ggc ttt ccg cag aag gat gag tgg ctg gga cgg cag 144

Asn Cys Leu Pro Gly Phe Pro Gln Lys Asp Glu Trp Leu Gly Arg Gln

35 40 45

aag gag ctc ggc ttc gat ttc atc gct gcc gaa ggc gac gta tcg gac 192

Lys Glu Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ala Glu Gly Asp Val Ser Asp

50 55 60

tat gac tcc tgt cgc gcg atg gtg gcg aag atc gag ggc gag gtg ggt 240

Tyr Asp Ser Cys Arg Ala Met Val Ala Lys Ile Glu Gly Glu Val Gly

65 70 75 80

gcg atc gat gtg ctg gtg aac aac gcc ggg atc acc cgc gac aag ttc 288

Ala Ile Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Lys Phe

85 90 95

ttc ccg aag atg gaa aag gtg cag tgg gat gcg gtc atc aac acc aac 336

Phe Pro Lys Met Glu Lys Val Gln Trp Asp Ala Val Ile Asn Thr Asn

100 105 110

ctc aac agc ctt ttc aac gtc act cac cac gtt tcg ccg aag atg gca 384

Leu Asn Ser Leu Phe Asn Val Thr His His Val Ser Pro Lys Met Ala

115 120 125

gaa cgg ggc tat ggc cga atc atc aat att tct tcg gtg aac ggc gtc 432

Glu Arg Gly Tyr Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Val

130 135 140

aag ggc cag gcc ggc cag acc aac tac tcg act gcc aag gcg ggc gtg 480

Lys Gly Gln Ala Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Val

145 150 155 160

ctc ggc ttc acg aaa gcc ctt gcc gcg gaa ctg gcg acg aaa ggc gtg 528

Leu Gly Phe Thr Lys Ala Leu Ala Ala Glu Leu Ala Thr Lys Gly Val

165 170 175

acc gtc aat gcg atc gcg ccg ggc tat atc ggc acc gag atg gtg atg 576

Thr Val Asn Ala Ile Ala Pro Gly Tyr Ile Gly Thr Glu Met Val Met

180 185 190

gcg att cgc gaa gac att cgc cag ggc atc atc gac agc gtc ccg atg 624

Ala Ile Arg Glu Asp Ile Arg Gln Gly Ile Ile Asp Ser Val Pro Met

195 200 205

aag cgc ctg ggc aag ccg gaa gaa atc ggc gct ctg tgc tcc tac ctg 672

Lys Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Ile Gly Ala Leu Cys Ser Tyr Leu

210 215 220

tct tcc gat ctg gcc ggt tac gtg acc ggc gcg acg atc aac atc aac 720

Ser Ser Asp Leu Ala Gly Tyr Val Thr Gly Ala Thr Ile Asn Ile Asn

225 230 235 240

ggc ggc ctc cac atg tgc tga 741

Gly Gly Leu His Met Cys

245

<210>2

<211>246

<212>PRT

<213>固氮弧菌属物种EbN1

<400>2

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1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Glu Arg Gly Tyr Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Val

130 135 140

Lys Gly Gln Ala Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Val

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Leu Gly Phe Thr Lys Ala Leu Ala Ala Glu Leu Ala Thr Lys Gly Val

165 170 175

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180 185 190

Ala Ile Arg Glu Asp Ile Arg Gln Gly Ile Ile Asp Ser Val Pro Met

195 200 205

Lys Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Ile Gly Ala Leu Cys Ser Tyr Leu

210 215 220

Ser Ser Asp Leu Ala Gly Tyr Val Thr Gly Ala Thr Ile Asn Ile Asn

225 230 235 240

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<220>

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<223>

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1 5 10 15

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35 40 45

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85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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130 135 140

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<213>人工序列

<220>

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<212>DNA

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<220>

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<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR-引物

<400>8

ctgatagatc ttagtgagcg atgaggatca 30

Claims

1.通过还原相应的酮制备式Ia或Ib的光学活性醇的方法，

其中

R¹，R²为烷基、链烯基、芳基或烷基芳基，其可依次被烷基、卤素、SH、SR²、OH、OR²、NO₂、CN、CO、COOR²、NR²R³或NR²R³R⁴⁺X取代一次或多次，其中R²、R³和R⁴相互独立的为H、或C1-C6烷基、或C1-C6烷氧基，并且X^-为相反离子，条件是R¹不等于R²，

其中还原用脱氢酶进行，所述脱氢酶的多肽序列为SEQ ID NO：2。

2.根据权利要求1的方法，其中脱氢酶在宿主生物体中重组表达，并且反应溶液与该宿主生物体一起孵育。

3.根据权利要求2的方法，其中宿主生物体已预先被处死。

4.根据权利要求1的方法，其中还原在20-40℃的温度下进行。

5.根据权利要求1的方法，其中还原的辅因子通过酶本身再生，或者其中将葡萄糖脱氢酶、亚磷酸盐脱氢酶、甲酸脱氢酶或另一醇脱氢酶用作辅因子再生系统。