CN107002105A - 生物催化环化香叶基芳樟醇的方法和由此获得的环化产物 - Google Patents
生物催化环化香叶基芳樟醇的方法和由此获得的环化产物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107002105A CN107002105A CN201580064485.3A CN201580064485A CN107002105A CN 107002105 A CN107002105 A CN 107002105A CN 201580064485 A CN201580064485 A CN 201580064485A CN 107002105 A CN107002105 A CN 107002105A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cyclase
- sequence
- enzyme
- nucleic acid
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
- C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
- C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
- C07D311/92—Naphthopyrans; Hydrogenated naphthopyrans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
- C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
- C12Y504/99017—Squalene--hopene cyclase (5.4.99.17)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及使用来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,Zm‑SHC)的角鲨烯‑藿烯环化酶或与Zm‑SHC具有至少80%序列同一性的环化酶来环化香叶基芳樟醇的新方法,以及在该方法中获得的环化产物。
Description
本发明涉及使用来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis,Zm-SHC)的角鲨烯-藿烯(squalene-hopene)环化酶或与Zm-SHC具有至少80%序列同一性的环化酶来环化香叶基芳樟醇(geranyllinalool)的新方法,以及在该方法中获得的环化产物。
背景技术
已经阐明了在相应的生产生物体中大量单萜的生物合成。通常,线性前体分子被高度特异性的生物催化剂环化。这些前体通常是直链萜醇和二磷酸(diphosphoric acid)的酯。这样的前体的典型实例是焦磷酸香叶酯。焦磷酸盐基团从分子中被酶促消除,随后水解得到两个磷酸根离子。另一方面,这产生了碳阳离子,其现在能够进行进一步的分子内反应并重组以产生环状单萜,例如消除质子(Curr.Opin.Chem.Biol.2009,13:180-188)。
众所周知,非激活三萜烯如角鲨烯或氧鲨烯(oxidosqualene)在体内通过角鲨烯-藿烯环化酶(SHC)反应,得到相应的环状化合物(Siedenburg,G.和Jendrossek,D.,应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology),2011,77,(12),3905)。
某些角鲨烯-藿烯环化酶(SHC)的活性并不限于三萜烯。将其公开内容完整引入本文的国际申请PCT/EP2011/070304(WO 2012066059 A2),描述了角鲨烯-藿烯环化酶突变体,其催化香茅醛异构体环化成异蒲勒醇异构体。
将其公开内容完整引入本文的国际申请PCT/EP2010/057696(WO 2010139719A2),提出了角鲨烯-藿烯环化酶作为用于将homofarnesol环化成ambroxan的生物催化剂。
来自细菌运动发酵单胞菌(Zm-SHC)的角鲨烯-藿烯环化酶的基因和蛋白质序列是已知的(Genpept Accession No AAV90172 2004和Nat Biotechnol 2005,23:63-68,参见SEQ ID No.1和2)。
本发明的目的是提供一种使香叶基芳樟醇环化的方法。
发明概述
通过式(I)化合物的生物催化环化的方法解决了上述问题,
在具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID No.2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的环化酶存在下进行。
优选地,式(I)化合物在本发明的方法中反应,得到至少一种式(II)化合物。
本发明还涉及式(II)的化合物。
发明详述
A.一般定义
为了本发明的目的,“环化酶”通常是酶或酶突变体,其具体显示香叶基芳樟醇环化酶的活性。香叶基芳樟醇环化酶的活性是指香叶基芳樟醇(I)的异构化的酶活性,其形成至少一个5或6元环,具体地讲是类似色烯,特别是类似苯并色烯的环化结构。具有香叶基芳樟醇环化酶活性的合适的酶是来自异构酶亚类的分子内转移酶;也就是EC编号为EC 5.4的蛋白质(根据Eur.J.Biochem.1999,264,610-650的酶代码)。具体地讲,它们采取EC5.4.99.17代表的形式。具体地讲,具有香叶基芳樟醇环化酶活性的合适的酶是还引起homofarnesol环化成ambroxan,香茅醛异构体环化成异蒲勒醇异构体,或角鲨烯环化成藿烯的那些酶(因此有时也称为“SHC”角鲨烯-藿烯环化酶),并且在国际申请PCT/EP2010/057696和PCT/EP2011/070304中有详细描述,在此明确地引用这一点。
由于酶反应的可逆性,本发明涉及两个反应方向的本文所述的酶反应。
“环化酶”的“功能突变体”包括这些酶的“功能等同物”,其在下文中定义。
术语“生物催化方法”涉及任何“式(I)化合物的生物催化环化方法”,即在粗制、纯化、溶解、分散或固定化酶存在下的方法,或在显示或表达香叶基芳樟醇环化酶活性的微生物的显示环化酶细胞的存在下。因此,生物催化过程包括酶和微生物过程以及发酵过程。
术语“立体专一性”是指具有至少一个不对称中心的化合物的几种可能的立体异构体之一,该化合物根据本发明产生,是通过本发明酶的作用在高“对映体过量”或高“对映体纯度”中产生,例如至少90%ee,具体地讲是至少95%ee或至少98%ee或至少99%ee。ee%值由以下公式计算:
ee%=[XA-XB]/[XA+XB]*100,
其中XA和XB分别代表对映异构体A和B的摩尔分数。
“第一球体残基”和“第二球体残基”是氨基酸残基,其基于蛋白质的结构分析被指定与环化酶的反应中心特别接近。第一球体的标准是与已发表的x射线结构(pdb:1ump)中指定的配位体2-azasqualene的距离。使用计算机程序自动确定这些残基(http://ligin.weizmann.ac.il/cgi-bin/lpccsu/LpcCsu.cgi;Sobolev V,Sorokine A,PriluskyJ,Abola EE,Edelman M.,蛋白质中原子间接触的自动分析(Automated analysis ofinteratomic contacts in proteins)。生物信息学(Automated analysis ofinteratomic contacts in proteins.Bioinformatics)1999;15(4):327-332.)。当它们的原子之间的距离对应于它们的范德华半径的和时,该程序假设两个分子彼此接触。第二球体包括位于第一球体的每个残基的半径范围内的所有氨基酸。因此,这样的残基似乎特别适用于进行定向突变,以进一步以目标方式修饰酶活性。
在标准条件下用式(I)的香叶基芳樟醇,具体地讲是E,E-香叶基芳樟醇作为参考底物测定的“环化酶活性”是描述环化反应产物形成的酶活性。
“标准条件”是,例如,底物浓度为10mM至0.2M,具体地讲是15至100mM,例如约20至25mM;pH 4至8;并且温度为,例如15至45或20至25℃。它们可以使用重组环化酶表达细胞,破碎的环化酶表达细胞,这些的部分或富集或纯化的环化酶确定。参考基质,具体地讲是式(I)的香叶基芳樟醇;具体地讲是浓度为15至100mM或约20至25mM,在20至25℃和pH 6-7,例如6.5的E,E-香叶基芳樟醇;如也在实施例中更详细描述的。
通常还根据本发明包括的是本文所述化合物的所有异构体形式,例如构成异构体,具体地讲是立体异构体和这些的混合物,例如旋光异构体或几何异构体,例如E-和Z-异构体,以及这些的组合。如果分子中存在几个不对称中心,则本发明包括这些不对称中心的不同构象的所有组合,例如对映异构体对或立体异构形式的任何混合物。
B.本发明的具体发展
具体地讲本发明涉及以下具体实施方案:
1.式(II)的化合物
以纯的立体异构体形式和作为包含该化合物的至少一种可能的立体异构体的混合物。
2.根据实施方案1的混合物形式的化合物,其包含式(II)化合物的多种立体异构体。
3.根据前述实施方案中任一项的化合物,其以立体异构体的形式存在。
4.式(I)化合物的生物催化环化的方法
在环化酶存在下,其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或具有与SEQ ID No.2至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性,其中至少一种式(I)化合物将在液体中与环化酶接触,具体地讲是在单相水相或两相水-有机反应介质中,具体地讲是在不会对所需反应产生不利影响的条件下,并且特别是在有利于所需反应的条件下。合适的反应条件(例如,底物的最佳浓度、酶、pH、任选使用的缓冲液的性质、反应的温度和持续时间、有机溶剂)可以在较少的初步测试的基础上由本领域技术人员确定。
5.根据实施方案4的方法,其中式(I)化合物以两种对映异构体的混合物的形式使用。
6.根据实施方案5的方法,其中混合物是外消旋混合物。
7.根据实施方案5的方法,其中混合物中的两种对映异构体之一以过量存在。
8.根据实施方案4至7中任一项的方法,其中使式(I)化合物反应得到式(II)化合物。
9.根据实施方案4至8中任一项的方法,其中环化酶以粗制、纯化、溶解、分散或固定化形式存在,或在微生物的环化酶显示细胞的存在下。
10.根据实施方案4至9中任一项的方法,其中环化酶以选自以下的形式存在:
a)游离、任选纯化或部分纯化的环化酶;
b)固定化环化酶;
c)根据a)或b)从细胞分离的环化酶;
d)完整的、任选重组体、细胞、任选的静止或破碎的含环化酶的细胞;
e)细胞裂解物或d)所述细胞的细胞匀浆。
11.根据实施方案4至10中任一项的方法,在重组微生物的存在下,其包含编码环化酶的核苷酸序列。
12.根据实施方案11的方法,其中核苷酸序列是表达盒的一部分,并且其中处于至少一个调节序列的控制之下。
13.根据实施方案12的方法,其中表达盒是表达载体的一部分。
14.根据权利要求13所述的方法,其中表达载体选自质粒。
15.根据实施方案4至14中任一项的方法,其中微生物选自细菌、真菌和酵母。
16.根据实施方案4至15中任一项的方法,其中微生物选自物种大肠杆菌(Escherichia coli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、铅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
17.根据实施方案4至16中任一项的方法,其中微生物是大肠杆菌(E.Coli)。
18.根据实施方案4至17中任一项的方法,其中生物催化环化在单相水相体系中或在两相体系中进行;或在无水体系中,例如在离子流体或深共晶溶剂中。
19.根据实施方案4至18中任一项的方法,其中生物催化环化在20至45℃的温度和/或4至8的pH范围内进行。
C.本发明的进一步发展
1.本发明的方法中使用的环状酶
本发明不限于使用本文具体公开的环化酶的方法,而是还涉及使用具体描述的环化酶的功能等同物进行的方法。
在本发明的范围内,具体公开的酶和酶突变体(衍生自SEQ ID No.2)的“功能等同物”或类似物是与它们不同的多肽,并且还保留所需的环化酶活性。
因此,例如,“功能等同物”包括酶和突变体,在用于本发明目的的“环化酶活性”的使用试验中(即在标准条件下具有参考底物),显示酶的活性至少为1%,具体地讲是至少约5%至10%,例如至少10%或至少20%,例如至少50%或75%或90%以上或以下,包括本文具体定义的来自SEQ ID No.2的氨基酸序列。
在本文中功能等同物的活性数据除非另有规定,涉及通过参考底物进行的活性测定,例如在本文定义的“标准条件”下进行的活性测定。
用于本发明目的的“环化酶活性”可以借助于使用参考底物,例如香叶基芳樟醇的试验,在如上所述并在实验部分中说明的标准条件下测定。
此外,功能等同物是稳定的,例如在pH 4至11之间,并且有利地具有在pH 5至10范围内的最佳pH,例如具体地讲是6.5至9.5或7至8或约7.5,以及具有在15℃至80℃或20℃至70℃范围内的最佳温度,例如30至60℃或约35至45℃,例如40℃。
上述意义上的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”和多肽的“功能衍生物”和“盐”。
“功能等同物”包括可通过一个或多个,例如1至50、2至30、2至15、4至12或5至10个“突变”获得的突变体,例如氨基酸添加、取代、缺失和/或反转,其中上述修饰可以发生在任何序列位置,只要它们导致具有本发明的性质特征的突变体。在质量方面,即,例如当相同的底物以不同的速率反应时,突变体和未修饰的多肽之间的反应性特征一致,功能等同性也尤其显著。
合适的氨基酸取代的非限制性实例在下表中汇总:
在本文中“前体”是具有或不具有所需生物活性多肽的天然或合成前体。
术语“盐”被理解为不仅意指羧基的盐,而且意味着环化酶的氨基的酸加成盐。羧基的盐可以以本身已知的方式产生,并且包含无机盐,例如钠、钙、铵、铁和锌盐,以及与有机碱的盐,例如胺类,例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。酸加成盐也是本发明的主题,例如与无机酸的盐,如盐酸或硫酸,以及与有机酸的盐,如乙酸和草酸。
环化酶的“功能衍生物”同样可以借助已知技术产生,无论是在功能氨基酸侧基上,还是在其N-末端或C-末端。此类衍生物包括例如羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺,可通过与氨或伯胺或仲胺反应获得;通过与酰基反应制备的游离氨基的N-酰基衍生物;或通过与酰基反应制备的游离羟基的O-酰基衍生物。
“功能等同物”自然也包括可从其他生物体获得的多肽,以及天然存在的变体。例如,可以通过序列比较建立同源序列区的区域,并且可以基于本发明的具体信息来确定的等同的酶。
“功能等同物”同样包含环化酶的片段,优选单个结构域或序列基序,其具有例如所需的生物学功能。
此外,“功能等同物”还具有上述多肽序列或其功能等同物之一的融合蛋白,以及功能性N-或C-末端连接中至少一个功能上不同的异源序列(即没有融合蛋白基团的相互实质功能障碍)。这种异源序列的非限制性实例是,例如信号肽、组氨酸锚或酶。
如果蛋白质糖基化是可能的,则环化酶包含去糖基化或糖基化形式和修饰形式的“功能等同物”,其可通过改变糖基化模式获得。
可通过诱变产生环化酶同源物,例如通过点突变、延长或截短蛋白质。
本发明的蛋白质的同系物可以通过筛选突变体的组合文库,例如截短的突变体来鉴定。例如,蛋白质变体的多样化文库可以通过在核酸水平上的组合诱变产生,例如通过酶连接合成寡核苷酸的混合物。存在可用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同系物文库的多种方法。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行,然后将合成基因连接到合适的表达载体中。使用简并基因的集合使得可以在混合物中提供编码所需潜在蛋白质序列集合的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人(1984)Science 198:1056;Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。
用于筛选由点突变或截短产生的组合文库的基因产物,以及用于筛选具有选定性质的基因产物的cDNA文库的多种技术是本领域已知的。这些技术可以适应于基因文库的快速筛选,其通过本发明的同系物的组合诱变产生。作为高通量分析的基础,用于筛选大基因文库的最常用的技术包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中,用所得的载体文库转化合适的细胞,并在检测条件下表达组合基因,其中所需活性的检测促进了编码已被检测的产物基因的载体分离。递归综合诱变(REM),一种增加文库中功能突变体频率的技术,可以与鉴定同系物的筛选试验结合使用(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89:7811-7815;Delgrave等人(1993),蛋白工程(Protein Engineering)6(3):327-331)。
根据本发明还包含的“功能等同物”是特定公开蛋白质的同系物。它们与特定公开的氨基酸序列之一具有至少60%,优选至少75%,具体地讲是至少85%,例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性(或同一性),通过Pearson和Lipman的算法计算,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448。基于本文具体描述的氨基酸序列的总长度,本发明的同源多肽以百分比表示的同源性或同一性,具体地讲是指氨基酸残基以百分比表示的同一性。
以百分比表示的同一性数据也可以借助于BLAST比对、blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)算法或通过应用以下指定的Clustal设置来确定。
2.核酸和构建体
2.1核酸
本发明的方法可以在包含编码环化酶的核苷酸序列,也就是核酸分子的微生物的存在下进行。
本文提及的所有核酸分子(单链和双链DNA和RNA序列,例如cDNA和mRNA)可以以本身已知的方式从核苷酸构建单元通过化学合成制备,例如,通过双螺旋的单个重叠互补核酸构建单元的片段缩合。寡核苷酸的化学合成可以,例如以已知方式通过磷亚酰胺(phosphoamidite)方法进行(Voet,Voet,第二版,Wiley Press New York,第896-897页)。在Sambrook等人(1989),分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室出版社(MolecularCloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press)中,描述了借助于DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应以及一般的克隆方法,合成寡核苷酸的附加原件和间隙的填充。
一种区分编码环化酶或其生物活性片段的分离的核酸分子和核苷酸片段,其可用于,例如用作于鉴定或扩增编码环化酶的核酸的杂交探针或引物。
核酸分子还可以包含编码基因区的3'-和/或5'-末端的非翻译序列。
存在与具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其片段。
核苷酸序列使得可以产生探针和引物,其可用于鉴定和/或克隆在其他类型的细胞和生物体中的同源序列。这样的探针或引物通常包含核苷酸序列区,其在“严格”条件(见下文)下与核酸序列的有义链或相应的反义链的至少约12个连续核苷酸杂交,优选与至少约25个连续核苷酸杂交,例如与约40、50或75个连续核苷酸杂交。
从存在于核酸的天然来源的其他核酸分子中分离出“分离的”核酸分子,并且此外如果通过重组技术制备,或者如果化学合成中不含化学前体或其他化学物质,则“分离的”核酸分子可以基本上不含其他细胞物质或培养基。
可以通过分子生物学的标准技术和提供的序列信息分离核酸分子。例如,可以通过使用具体公开的完整序列之一或其片段作为杂交探针和标准杂交技术,从合适的cDNA文库中分离(如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.分子克隆:实验室手册。第二版,冷泉港实验室,冷泉港实验室出版社,冷泉港(Molecular Cloning:A LaboratoryManual.2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor),NY,1989中所述)。此外,可以通过聚合酶链式反应来分离包含所公开的序列之一或其片段的核酸分子,其中使用基于该序列产生的寡核苷酸引物。因此扩增的核酸可以克隆到合适的载体中,并通过DNA序列分析进行表征。此外可以通过标准合成方法制备寡核苷酸,例如使用自动DNA合成仪。
核酸序列或其衍生物,这些序列的同系物或部分可以从其他细菌中分离,例如使用常规杂交方法或PCR技术,例如通过基因组文库或cDNA文库。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。
“杂交”被理解为意指聚或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补的序列结合的能力,而在这些条件下不发生非互补配偶体之间的非特异性结合。为此,序列可以为90-100%互补。利用能够彼此特异性结合的互补序列的性质,例如在Northern或Southern印迹技术中,或在PCR或RT-PCR的引物结合中。
对于杂交,使用保守区域的短寡核苷酸是有利的。然而,本发明的核酸的较长片段或完整序列也可用于杂交。根据所使用的核酸(寡核苷酸、更长的片段或完整序列),或根据其核酸的类型、DNA或RNA用于杂交,这些标准条件是不同的。因此,例如DNA:DNA杂交体的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂交体低约10℃。
根据核酸,标准条件被理解为,例如在温度为42至58℃,浓度为0.1至5×SSC(1×SSC=0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.2)的含水缓冲溶液中,或另外在50%甲酰胺存在下,例如在42℃、5×SSC、50%甲酰胺中。有利地,DNA:DNA杂交体的杂交条件为0.1×SSC,并且温度为约20℃至45℃之间,优选为约30℃至45℃之间。对于DNA:RNA杂交体,有利地杂交条件为0.1×SSC,并且温度为约30℃至55℃之间,优选为约45℃至55℃之间。杂交的这些规定的温度是在不存在甲酰胺的情况下,以长度为约100个核苷酸且G+C含量为50%的核酸计算的解链温度值的实例。在遗传学的相关教科书中描述了关于DNA杂交的实验条件,例如Sambrook等人,“分子克隆”,冷泉港实验室("Molecular Cloning",Cold Spring HarborLaboratory),1989,并且可以使用本领域技术人员已知的公式计算,例如作为核酸的长度、杂交的类型或G+C含量的函数。关于杂交的进一步信息可以由本领域技术人员从以下教科书中获得:Ausubel等人(编著),1985,当代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology),John Wiley&Sons,New York;Hames和Higgins(编著),1985,核酸杂交:实用方法(Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach),IRL Press atOxford University Press,Oxford;Brown(编著),1991,基础分子生物学:实践方法(Essential Molecular Biology:A Practical Approach),IRL牛津大学出版社出版,牛津。
具体地讲“杂交”可能在严格条件下发生。这样的杂交条件,例如描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,分子克隆(实验室手册),第二版,冷泉港实验室出版社,第9.31-9.57页中或在当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology),John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。
具体地讲是将“严格”杂交条件表示为:42℃下,在由50%甲酰胺、5×SSC(750mMNaCl,75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA组成的溶液中孵育过夜,随后的步骤在65℃用0.1×SSC洗涤滤器。
核苷酸序列可以与启动子融合。排列在指定核苷酸序列上游的启动子可以通过至少一个核苷酸取代、至少一个插入、倒位和/或缺失而改变,但不会对启动子的功能/活性产生不利影响。此外,可通过修饰其序列来增强启动子的功效,或者可以完全交换启动子用于更有效的启动子,也可以来自外来生物体。
两个核酸之间的“同一性”理解为意指在每种情况下核酸的整个长度的核苷酸同一性,具体地讲是通过与来自Informax(USA)的Vector NTI Suite 7.1软件的帮助进行比较,使用Clustal方法计算的同一性(Higgins DG,Sharp PM.微计算机上快速灵敏的多序列比对(Fast and sensitive and sequence multiple sequence alignments on amicrocomputer).Comput Appl Biosci.1989年4月;5(2):151-1),设置以下参数:
多重比对参数:
成对比对参数:
作为替代,同一性也可以根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D。与Clustal系列程序的多重序列比对(Multiple sequence alignment with the Clustal series ofprograms).(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500,根据网址http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#并使用以下参数:
2.2功能突变体的产生
此外,本领域技术人员熟悉产生功能突变体的方法,也就是说编码与SEQ ID No.2具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的环化酶的核苷酸序列。
根据所使用的技术,本领域技术人员可以将完全随机的突变或更为定向的突变引入到基因或其他非编码核酸区(其例如对于调节表达是重要的)中,并随后产生遗传文库。为此目的所需的分子生物学方法是本领域技术人员已知的,例如在Sambrook和Russell,分子克隆。第3版,冷泉港实验室出版社(Molecular Cloning.3rd Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press)2001中所述。
用于修饰基因并因此修饰它们编码的蛋白质的方法是本领域技术人员长期已知的,例如
-位点特异性诱变,其中基因的单个或几个核苷酸以定向的方式被替换(TrowerMK(Ed.)1996;体外诱变方案(In vitro mutagenesis protocols).Humana Press,NewJersey),
-饱和诱变,其中任何氨基酸的密码子可以在基因的任何点交换或添加(Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res 22:1593;Barettino D,Feigenbutz M,ValcárelR,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541;Barik S(1995)Mol Biotechnol 3:1),
-易错聚合酶链反应,其中核苷酸序列由易错DNA聚合酶突变(Eckert KA,KunkelTA(1990)Nucleic Acids Res 18:3739);
-SeSaM方法(序列饱和方法),其中优选的交换被聚合酶阻止。Schenk等人,Biospektrum,第3卷,2006,277-279
-突变株中基因的传代,其中例如由于DNA修复机制缺陷,核苷酸序列的突变率增加(Greener A,Callahan M,Jerpseth B(1996)使用大肠杆菌变异体菌株的有效随机诱变技术(An efficient random mutagenesis technique using a E.coli mutatorstrain)。在Trower MK(Ed.)体外诱变方案(In vitro mutagenesis protocols).HumanaPress,New Jersey)中,或
-DNA改组,其中形成和消化了密切相关的基因库,并且将该片段用作聚合酶链式反应的模板,其中通过重复的链分离和重新连接,最终产生全长嵌合基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
使用所谓的定向进化(特别是在Reetz MT和Jaeger K-E(1999),Topics CurrChem 200:31;Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),通过定向进化优化工业酶的方法(Methods for optimization industrial enzymes by directed evolution)描述中,在Demain AL,Davies JE(Ed.)工业微生物学和生物技术手册。美国微生物学会(Manualof industrial microbiology and biotechnology.American Society forMicrobiology))中,技术人员可以以定向性的方式大规模生产功能性突变体。为此,在第一步中,首先制备各蛋白质的基因文库,例如使用上述给出的方法。基因文库以合适的方式表达,例如细菌或噬菌体展示系统。
表达功能突变体的宿主生物体的相关基因,具有与所需性质大致相符的性质,可以进行另一个突变周期。可以迭代地重复突变和选择或筛选的步骤,直到本发明的功能突变体具有足够的所需性质。使用这种迭代程序,可以分阶段进行有限数量的突变,例如1、2、3、4或5个突变,并对所讨论的其对酶性质的影响进行评估和选择。然后可以以相同的方式将选定的突变体进行进一步的突变步骤。以这种方式,可以显着降低待研究的各个突变体的数量。
本发明的结果还提供了与相关酶的结构和序列相关的重要信息,其是以目标方式产生具有所需修饰特性的其他酶所必需的。具体地讲,可以定义所谓的“热点”,即潜在地适用于通过引入靶向突变来修饰酶性质的序列片段。
关于氨基酸序列位置的信息,也可以在应该对酶活性几乎没有影响的可以实现突变的区域中推导出,并且可以被指定为潜在的“沉默突变”。
2.3构建体
在本发明的方法中,核苷酸序列可以是表达盒的一部分。同义使用术语表达盒和表达构建体。优选重组表达构建体含有编码本发明的多肽的核酸序列,并且其在调控核酸序列的遗传控制下。
在本发明的方法中,表达盒可以是表达载体的一部分,具体地讲是重组表达载体的一部分。
“表达单位”被理解为根据本发明具有表达活性的核酸,其包含如本文所定义的启动子,并且在与待表达的核酸或基因功能连接之后调节表达,即调节所述核酸或所述基因的转录和翻译。因此在这方面也被称为“调节性核酸序列”。除了启动子之外,还可以存在其他调节元件,例如增强子。
根据本发明,“表达盒”或“表达构建体”被理解为与待表达的核酸或待表达的基因功能性连接的表达单元。因此与表达单位相比,表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列,还包含作为转录和翻译结果表达为蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中,术语“表达”或“过表达”描述了在微生物中,由相应DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性的产生或增加。为此,例如可以将基因引入到生物体中,用另一个基因替换现有基因,增加基因的拷贝数,使用强启动子或使用编码具有相应高活性酶的基因;可选地,可以组合这些措施。
优选地,本发明的这种构建体包含在每种情况下与编码序列有效连接的,相应编码序列5’-上游的启动子,3’-下游的终止子序列和任选的其他通常的调节元件。
根据本发明,“启动子”,“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”被理解为,当与要转录的核酸功能性连接时调节所述核酸的转录。
在此上下文中,“功能”或“有效”连接被理解为,例如具有启动子活性的核酸之一与要转录的核酸序列和任何其他调节元件,例如确保核酸转录的核酸序列,例如终止子的顺序排列,以这样的方式每个调控元件可以在核酸序列转录时发挥其功能。这不一定需要在化学意义上的直接连接。遗传控制序列,例如增强子序列,甚至可以从更远的位置,或甚至从其他DNA分子发挥其在靶序列上的功能。优选的排列是其中待转录的核酸序列位于启动子序列之后(即在启动子序列的3'端),使得两个序列共价连接在一起。启动子序列与重组表达的核酸序列之间的距离可以小于200个碱基对,或小于100个碱基对或小于50个碱基对。
除了启动子和终止子之外,可以提及以下作为其他调控元件的实例:靶向序列、增强子、聚腺苷酸化信号、选择性标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调节序列描述于,例如Goeddel,基因表达技术:酶学方法185(Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185),Academic Press,San Diego,CA(1990)中。
具体地讲,本发明的核酸构建体包含编码环化酶的序列,例如衍生自SEQ ID No.1的核酸序列,或编码根据SEQ ID No.2的环化酶或其衍生物和同系物的核酸序列,以及可以从这些序列衍生的核酸序列,并且其已经与一个或多个调节信号有效地或功能性连接,有利地用于控制,例如增加基因表达。
除了这些调节序列之外,这些序列的天然调节可能仍然存在于实际的结构基因之前,并且任选地可以被遗传修饰,使得自然调节已被关闭并且基因的表达已被增强。然而,核酸构建体也可以是更简单的构建,即在编码序列和天然启动子之前没有其他调节信号已被插入,并且其调控尚未被去除。相反,自然调节序列被突变,使得调节不再发生并且基因表达增加。
优选的核酸构建体有利地还包含一个或多个已经提及的与启动子功能性连接的“增强子”序列,该序列使核酸序列增强的表达成为可能。还可以在DNA序列的3'-末端插入另外的有利序列,例如其他调控元件或终止子。本发明的核酸的一个或多个拷贝可以存在于构建体中。在构建体中,也可任选地存在其他标记,例如补体营养缺陷型或抗生素抗性的基因,以便选择构建体。
合适的调节序列的实例存在于启动子中,如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-PL启动子,并且它们有利地用于革兰氏阴性细菌中。其他有利的调节序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中,酵母或真菌中的启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人造启动子也可用于调节。
为了在宿主生物体中表达,将核酸构建体有利地插入载体中,例如质粒或噬菌体,这使得宿主中的基因表达最佳。载体也被理解为除了质粒和噬菌体之外,本领域技术人员已知的所有其他载体,也就是说例如病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、质粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体能够在宿主生物体中自主复制或者其他在染色体上复制。这些载体是本发明的进一步发展。
合适的质粒是,例如在大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI,在链霉菌属(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361中,在芽孢杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214,在棒状杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667,在真菌中的pALS1、pIL2或pBB116,在酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23,或在植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述质粒是可能的质粒的小部分选择。另外的质粒是本领域技术人员熟知的,例如可以在书籍,克隆载体(Cloning Vectors)(Pouwels P.H.等人编著,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中找到。
在载体的进一步发展中,包含本发明的核酸构建体或本发明的核酸,也可以有利地以线性DNA的形式引入到微生物中,并通过异源或同源重组整合到宿主生物体的基因组中。该线性DNA可以由线性化的载体组成,诸如质粒或或仅本发明的核酸构建体或核酸。
为了在生物体中最佳表达异源基因,修饰核酸序列以匹配生物体中使用的特定“密码子选择”是有利的。“密码子选择”可以通过对所讨论的生物体的其他已知基因的计算机评估来容易地确定。
通过将合适的启动子融合到合适的编码核苷酸序列和终止子或聚腺苷酸化信号,来产生本发明的表达盒。常规重组和克隆技术用于此目的,如描述于,例如T.Maniatis,EFFritsch和J.Sambrook,分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室,冷泉港(MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor),NY(1989)中和在TJ Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,基因融合实验,冷泉港实验室,冷泉港(Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor),NY(1984)中和在Ausubel,F.M.等人,当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology),Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)中。
为了在合适的宿主生物体中表达,有利地将重组核酸构建体或基因构建体插入到宿主特异性载体中,其使宿主中基因的最佳表达成为可能。载体是本领域技术人员熟知的,例如可以在“克隆载体(cloning vectors)”(Pouwels P.H.等人编著,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中找到。
3.微生物
根据上下文,术语“微生物”可以指野生型微生物或遗传修饰的重组微生物,或这两者。
借助于本发明的载体,可以产生重组微生物,其例如用至少一种本发明的载体转化,并可用于生产本发明的多肽。有利地,将上述本发明的重组构建体引入到合适的宿主系统中并在其中表达。在本文中,优选使用本领域技术人员已知的常规克隆和转染方法,例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等,以便将上述核酸在所讨论的表达系统中表达。合适的系统描述于,例如当代分子生物学方法(Current Protocols in MolecularBiology),F.Ausubel等人编著,Wiley Interscience,New York 1997或Sambrook等人。分子克隆:实验室手册。第二版,冷泉港实验室,冷泉港实验室出版社,冷泉港(MolecularCloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor),NY,1989。
原则上,本发明的核酸或核酸构建体的合适的重组宿主生物体是所有原核生物或真核生物。微生物如细菌、真菌或酵母有利地用作宿主生物体。有利地,使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌,优选来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌,特别优选来自埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)、梭菌属(Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)。非常特别优选的属和物种是大肠杆菌。另外可以在α-变形细菌纲(alpha-proteobacteria)、β-变形细菌纲(beta-proteobacteria)或γ-变形杆菌纲(gamma-proteobacteria)中发现更有利的细菌。
在本文中,本发明的宿主生物体优选含有本发明中描述的核酸序列、核酸构建体或载体中的至少一种,其编码具有如上文所定义的苯乙醇脱氢酶活性的酶。
根据宿主生物体,本发明的方法使用的生物体以本领域技术人员熟悉的方式生长或培养。通常,微生物在液体培养基中生长,该液体培养基包含通常为糖形式的碳源,通常为有机氮源形式的氮源,例如酵母提取物或诸如硫酸铵的盐,微量元素如铁盐、锰盐、镁盐和任选的维生素,在0℃至100℃之间的温度下,优选在10℃至60℃之间,同时送入氧气。液体培养基的pH可以保持在固定值,也就是可以或不在培养期间调节。培养可以分批、半分批或连续进行。可以在发酵开始时提供营养物,或以半连续或连续方式补料。
4.本发明酶的重组生产
本发明还涉及本发明的酶或其功能性生物活性片段的重组生产方法,其中培养产酶微生物,任选地诱导多肽的表达,并从培养物中分离多肽。如果需要,也可以用这种方式在工业规模上生产多肽。
因此产生的微生物可以通过分批法或补料分批法或重复补料分批法连续或不连续地培养。已知培养方法的概述可以在Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik1.Einführungin die Bioverfahrenstechnik[生物处理技术1。生物处理技术导论(Bioprocesstechnology 1.Introduction to bioprocess technology)](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或在Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[生物反应器和外围设备(Bioreactors and peripheral equipment)](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中找到。
要使用的培养基必须适当地满足各菌株的要求。美国细菌学会(AmericanSociety for Bacteriology)在手册“一般细菌学方法手册(Manual of Methods forGeneral Bacteriology)”(Washington D.C.,USA,1981)中给出了各种微生物培养基的描述。
根据本发明可以使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖,例如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源是,例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。还可以通过复合化合物,例如糖蜜或糖精炼的其他副产物将糖加入到培养基中。添加不同碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪,例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂肪,脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸,醇例如甘油、甲醇或乙醇,和有机酸例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的材料。氮源的实例包括氨气或铵盐,例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源,例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
可存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
可以使用无机含硫化合物,例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物以及有机硫化合物,如硫醇作为硫源。
可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。
为了将金属离子保持在溶液中,螯合剂可以加入到培养基中。特别合适的螯合剂包括二羟基苯酚,如邻苯二酚或原儿茶酸,或有机酸,如柠檬酸。
根据本发明使用的发酵培养基通常还包含其他生长因子如维生素或生长促进剂,其包含例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐(panthothenate)和吡哆醇。生长因子和盐通常来自复合培养基的组分,例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外,可以将合适的前体加入到培养基中。培养基中化合物的确切组成在很大程度上取决于相应的实验,并且分别针对每个具体情况而定。关于培养基优化的信息可以在教科书“应用微生物。生理学,实践方法(Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach)”(P.M.Rodes编著,P.F.Standbury,IRL Press(1997),第53-73页,ISBN 0 19 963577 3)中找到。还可以从商业供应商获得生长培养基,例如标准1(Merck)或BHI(脑心脏浸液,DIFCO)等。
所有培养基组分均通过加热(1.5巴和121℃20分钟)灭菌或通过过滤灭菌。如果需要,组分可以一起灭菌或分开灭菌。所有培养基组分可以在培养开始时存在,或者可以连续加入或分批加入。
培养温度通常在15℃至45℃之间,优选25℃至40℃,并且可以在实验期间变化或保持恒定。培养基的pH应在5至8.5的范围内,优选约7.0。通过添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水,或酸性化合物如磷酸或硫酸,可以在生长过程中控制生长的pH。消泡剂,例如脂肪酸聚乙二醇酯,可用于控制发泡。为了保持质粒的稳定性,可以向培养基中加入合适的选择性作用物质,例如抗生素。为了维持好氧条件,将氧或含氧气体混合物,例如环境空气送入到培养物中。培养物的温度通常在20℃至45℃的范围内。继续培养直到形成所需产物的最大值。该目标通常在10小时至160小时内达到。
随后进一步处理发酵液。根据要求,通过分离技术,例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合,生物质可以完全或部分地从发酵液中除去,或者可以完全留在发酵液中。
如果多肽不分泌到培养基中,也可以裂解细胞,并且可以通过已知的蛋白质分离方法从裂解物获得产物。细胞可以任选地通过高频超声、高压(例如在费氏压碎器中)、通过渗透、通过洗涤剂、溶解酶或有机溶剂的作用,通过均化器或通过上述几种方法的组合破碎。
多肽可以通过已知的层析技术纯化,例如分子筛层析(凝胶过滤),例如Q-琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析,以及其他常规技术如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳。合适的方法描述于,例如Cooper,T.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[生化方法(Biochemical processes)],Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York中,或在Scopes,R.,蛋白质纯化(Protein Purification),Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin中。
为了分离重组蛋白,使用载体系统或寡核苷酸可能是有利的,其通过限定的核苷酸序列延伸cDNA并因此编码修饰的多肽或融合蛋白,其例如用于更容易的纯化。这种类型的合适修饰是,例如用作锚的所谓“标签”,例如称为六组氨酸锚的修饰,或可被认为是抗体抗原的表位(例如,描述于Harlow,E.and Lane,D.,1988,抗体:实验室手册。冷泉港(纽约)出版社。(Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)中)。这些锚可以用于将蛋白质连接到固体载体上,例如聚合物基质,其可以例如在层析柱中用作填充物,或可以用于微量滴定板或其他载体上。
同时,这些锚也可以用于蛋白质的识别。为了识别蛋白质,还可以使用通常的标记物,例如荧光染料、酶标记物,其在与底物反应之后形成可检测的反应产物,或放射性标记物,单独的或与锚组合使用用于衍生化蛋白质。
类似地,这种表达环化酶的微生物也可用于式II化合物的发酵生产,其中式I化合物另外加入到培养基中作为底物,并且培养微生物,并且将有价值的产物任选地与发酵液分离。此外,式(I)化合物也可以由微生物自主产生,因为该微生物具有用于从简单前体合成(I)的相应的生物化学装备。
6.酶固定化
根据本发明使用的酶可以在本文所述的方法中以游离或固定形式使用。固定化酶是固定在惰性载体上的酶。合适的载体材料和固定在其上的酶从EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-OS-100193773以及其中引用的参考文献中已知。在这方面,这些文献的公开内容通过引用整体并入本文。合适的载体材料包括例如粘土、粘土矿物如高岭土、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉末、阴离子交换材料,合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、苯酚/甲醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃,如聚乙烯和聚丙烯。为了制备支持的酶,载体材料通常使用细碎的颗粒形式,优选多孔形式。载体材料的粒径通常不大于5mm,具体地讲是不超过2mm(粒径分布曲线)。类似地,当使用脱氢酶作为全细胞催化剂时,可以选择游离或固定的形式。载体材料是例如藻酸钙和角叉菜胶。酶和细胞也可以直接与戊二醛交联(与CLEA交联)。相应的和其他的固定化技术描述于,例如在J.Lalonde和A.Mololin“酶的固定化(Immobilization of Enzymes)”中,在K.Drauz and H.Waldmann,在有机合成中的酶催化(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis)2002,第III卷,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim中。关于用于实施本发明的方法的生物转化和生物反应器的进一步信息也可以在,例如Rehm等人(编著)生物技术(Biotechology),第二版,第3卷,第17章,VCH,Weinheim中给出。
6.香叶基芳樟醇的酶环化
本发明的环化方法具体地讲是在酶的存在下进行,其中酶由根据SEQ ID No.1的核酸序列或其功能等同物编码,其中核酸序列是基因构建体或载体的成分。这些基因构建体或载体在国际申请PCT/EP2010/057696第16至20页中有详细描述,在此明确引用。
宿主细胞含有基因构建体或载体,其中存在编码具有所需活性的酶的核酸序列,该宿主细胞也被称为转基因生物体。原则上已知这种转基因生物的产生,例如在国际申请PCT/EP2010/57696第20页中进行了讨论,在此也明确引用。
选自包含细菌、蓝细菌、真菌和酵母的细胞优选作为转基因生物体。细胞优选选自毕赤酵母属的真菌或埃希氏杆菌属、棒状杆菌属、拉氏菌属(Ralstonia)、梭菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、发酵单胞菌属(Zymomonas)、红细菌属(Rhodobacter)、链霉菌属、伯克霍尔德氏菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)的细菌。细胞特别优选选自大肠杆菌、恶臭假单胞菌、水稻细菌性谷枯病菌、铅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌或运动发酵单胞菌的细菌。
优选本发明的方法,其特征在于具有环化酶活性的酶由从选自运动发酵单胞菌的微生物中分离的基因编码。
此外还优选本发明的方法,其特征在于具有环化酶活性的酶是由过量产生酶的微生物产生的,并且该微生物选自包含埃希氏菌属、棒状杆菌属、拉氏菌属、梭菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、发酵单胞菌属、红细菌属、链霉菌属、伯克霍尔德氏菌属、乳杆菌属和乳球菌属的微生物。
具体提及本发明的方法,其特征在于具有环化酶活性的酶已经由大肠杆菌、恶臭假单胞菌、水稻细菌性谷枯病菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、铅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、枯草芽孢杆菌或运动发酵单胞菌的转基因微生物产生,其过度产生具有环化酶活性的酶。
本发明的方法的特征在于酶以下列形式中的至少一种存在:
a)游离、任选纯化或部分纯化的多肽;
b)固定化多肽;
c)按照a)或b),从细胞分离的多肽;
d)完整细胞,任选包含至少一种此类多肽的静止或生长细胞;
e)在d)下描述的细胞的裂解物或匀浆。
本发明的方法的另一个实施方案的特征在于细胞是微生物,优选细胞是转基因微生物,其表达至少一种编码具有环化酶活性的多肽的异源核酸分子。
本发明的方法的优选实施方案至少包括以下步骤a)、b)和d):
a)分离或产生重组微生物,其从天然来源生产具有环化酶活性的酶,
b)使该微生物繁殖,
c)任选地从微生物中分离具有环化酶活性的酶或制备包含该酶的蛋白质组分,并且
d)将步骤b)的微生物或步骤c)的酶转移到包含通式(I)的底物的培养基中。
在本发明的方法中,使底物与介质中的环化酶接触和/或温育,使得底物在酶的存在下反应。介质优选为水性反应介质。
进行本发明的方法的水性反应介质的pH优选有利地保持在pH 4和12之间,优选在pH 4.5和9之间,特别优选在pH 5和8之间。
水性反应介质优选为缓冲溶液,其通常具有优选5至8的pH。可以使用的缓冲液可以是柠檬酸盐、磷酸盐、TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)或MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)。反应介质还可以包含另外的添加剂,例如洗涤剂(例如牛磺脱氧胆酸盐)。
底物优选以2-200mM,特别优选5-25mM的浓度引入到酶环境中,并且可以连续或分批地重新供给。
通常,酶的环化发生在低于所用酶的失活温度和高于-10℃的反应温度下。优选地,本发明的方法在0℃至95℃之间的温度下进行,特别优选在15℃至60℃之间的温度下进行,具体地讲是20至45℃的温度下进行,例如在约25至30℃的温度下进行。
特别优选的是本发明的方法,其中反应在20至40℃的温度范围内和/或4至8的pH范围内进行。
除了这些单相水系统之外,在本发明的另一变型中,也使用两相系统。这里,和水相一样,使用有机非水溶性反应介质作为第二相。结果,反应产物在有机相中积聚。反应后,有机相中的产物可以容易地从包含生物催化剂的水相中分离出来。
反应产物可以使用有机溶剂萃取和任选地蒸馏纯化。
合适的有机溶剂的实例是优选具有5-8个碳原子的脂肪烃,例如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷,优选具有一个或两个碳原子的卤代脂肪烃,如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷,芳香烃如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯,优选具有4-8个碳原子的脂肪族无环和环醚或醇,如乙醇、异丙醇、乙醚、甲基叔丁醚、乙基叔丁醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、四氢呋喃,或酯如乙酸乙酯或乙酸正丁酯,或酮如甲基异丁基酮或二噁烷,或它们的混合物。特别优选使用上述庚烷、甲基叔丁基醚、二异丙基醚、四氢呋喃、乙酸乙酯。
根据本发明使用的环化物可以按照本发明的方法用作游离或固定化酶,如上所述。
对于本发明的方法,可以使用包含编码环化酶的核酸、核酸构建体或载体的静止或生长、游离或固定的细胞。还可以使用破碎的细胞,例如细胞裂解物或细胞匀浆。破裂的细胞被理解为这样的意思,例如,已经通过例如用溶剂处理透化的细胞,或已经通过酶处理,通过机械处理(例如费氏压碎器或超声波)或通过其他方法破裂的细胞。由此获得的粗提取物有利地适用于本发明的方法。纯化或部分纯化的酶也可用于该方法。
如果本发明的方法使用游离生物体或酶,则它们在萃取之前有利地分离,例如通过过滤或离心。
本发明的方法可以分批、半分批或连续操作。
在该方法的一个特别优选的实施方案中,具有环化酶活性的酶选自包含SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列或由其衍生的序列的酶,其中高达25%,优选高达20%,特别优选高达15%,具体地讲是高达10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基已通过删除、取代、插入或删除、取代和插入的组合被修饰。在这里,关于SEQ ID No.2修饰的这些多肽序列仍然可以保留SEQ ID No.2的酶活性的至少50%,优选65%,特别优选80%,具体地讲是大于90%。在本文中,SEQ ID No.2的酶活性被理解为通式(I)化合物的生物催化环化,得到相应的式(II)化合物的能力。
实验部分
除非在以下实施例中给出了具体信息,以下的一般信息将适用。
A.一般信息
所用的所有材料和微生物都是可商购的产品。
除非另有说明,重组蛋白质通过标准方法克隆并表达,例如,如Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T.,分子克隆:实验室手册,第二版,冷泉港实验室,冷泉港实验室出版社,冷泉港(Molecular cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor),NY,1989所述。
a)细菌菌株,质粒和生长条件
从合适的2-ml预培养物接种,将大肠杆菌LU15568在100-ml锥形瓶(挡板)中生长于20ml Lyth Broth-Amp/Spec/Cm(100μg/l氨苄青霉素;100μg/l壮观霉素;20μg/l氯霉素)中,在37℃0.1mM IPTG,0.5g/l鼠李糖下存在16小时,并以5000*g离心10分钟。
b)用香叶基芳樟醇进行环化测定(标准条件)
将重组大肠杆菌细胞悬浮于20mM Tris-HCl pH 8.0(每g湿细胞3ml)中。环化混合物包含250μl细胞悬浮液,50μl 1M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5),20mM(终浓度)底物和水至500μl。当角鲨烯环化时,加入1%(v/v)Triton-X100。对于环化反应,将大肠杆菌细胞(6g潮湿细胞)悬浮于溶解缓冲液(50mM磷酸盐,10mM MgCl2(pH6.5;总体积:25ml))中,使用Manton-Gaulin均化器在1500巴下破碎细胞。通过离心除去不溶性细胞碎片(4℃并且7150×g下15分钟)。
对于香叶基芳樟醇的反应,将1.2ml KPi缓冲液(50mM磷酸钾,pH 6.5;10mMMgCl2)与1ml粗酶提取物(50mM KPi缓冲液中的蛋白质含量为39.3mg/ml)和22μl香叶基芳樟醇(来自Sigma-Aldrich-Fluka;订货号48809),并在装有磁力搅拌器的10ml螺旋罐中在37℃和300转/分钟下孵育3或20小时。
在孵育结束时,用5ml正庚烷/1-丙醇(3:2)提取样品,并通过GC分析。用含有空载体的大肠杆菌细胞和热灭活的表达SHC的细胞进行对照。
c)气相色谱
仪器:Agilent 6890系列
柱:OPTIMA-1TG ID:0.32mm,长度:10m
(Macherey-Nagel,Düren,德国)
流速:5.1psi(和80℃)下1.0/min
分流:1:50,分流量:50ml/min,
载体:氮
注射器:分流/不分流衬套(Restec GmbH,Bad Homburg,德国;
Siltec失活,4*6.3*78.5mm,玻璃棉)注射器温度280℃
注射体积:1μl
检测器:具有300ml/min空气,30ml/min氢气和
30ml/min氮气的FID
检测器温度:320℃
温度程序:
开始:100℃
保持时间1:0分钟
T斜坡1:5℃/min
T端1:200℃
保持时间2:5分钟
T斜坡2:30℃/min
T端2:320℃
保持时间3:20分钟
总时间:49.0分钟
数据分析:Empower-3软件服务版本1(Waters GmbH,Eschborn,德国)
香叶基芳樟醇保留时间:14.4分钟
B.实施例
实施例1:通过Zmo-SHC(SEQ ID No.2)使香叶基芳樟醇的环化
a)程序:
如所述通过生长和破坏LU 15568(参见PCT/EP2010/057696(WO2010139719A2))产生重组体Zmo-SHC。为了检查该酶制剂,使用homofarnesol作为参考底物重新确定活性。所获得的活性(用39mg总蛋白3小时内转化率为63%)在这些条件下迄今获得的结果范围内。
香叶基芳樟醇的反应如上所述在标准条件下进行。
在孵育期结束时,用5ml正庚烷/1丙醇(3:2)萃取样品,并通过GC分析。
反应方程式:
b)结果
20小时后,发现两个酶依赖性峰(保留时间分别为13.3和13.7分钟)。基于所用的香叶基芳樟醇的转化率约为11%。通过GC-MS分析和解释质谱,将苯并色烯衍生物2的两个结构异构体归入两个峰。
分别在13.3和13.7分钟的两个峰之间的差异不能被MS阐明。例如,它们可能是化合物2的立体异构体。
在没有添加酶的情况下孵育的阴性对照中无法检测到这些峰。
该结果表明Zmo-SHC还能够环化香叶基芳樟醇(1)。然而,反应中似乎出现至少两种异构体。
c)总结:
第一次可以通过来自运动发酵单胞菌的重组角鲨烯-藿烯环化酶证明香叶基芳樟醇环化为三环乙烯基苯并色烯衍生物。
序列:
SEQ ID No.1:Zmo-SHC的核酸序列
SEQ ID No.2:Zmo-SHC的氨基酸序列
明确引用本文中引用的出版物的公开内容。
Claims (11)
1.式(I)化合物的生物催化环化方法,
其中存在具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的环化酶,或与SEQ ID No.2具有至少80%序列同一性的氨基酸序列的环化酶。
2.根据权利要求1的方法,其中环化酶与SEQ ID No.2具有至少90%的序列同一性。
3.根据权利要求1的方法,其中环化酶与SEQ ID No.2具有至少95%的序列同一性。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法,式(I)化合物反应得到式(II)化合物。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法,其中环化酶以粗制、纯化、溶解、分散或固定的形式存在,或以微生物的环化酶展示细胞存在。
6.根据权利要求1至35中任一项的方法,其中存在包含编码环化酶的核苷酸序列的重组微生物。
7.根据权利要求6的方法,其中核苷酸序列是表达盒的一部分,并且在表达盒中处于至少一个调节序列的控制之下。
8.根据权利要求7的方法,其中表达盒是表达载体的一部分。
9.根据权利要求8的方法,其中表达载体选自质粒。
10.根据权利要求5至9中任一项的方法,其中微生物选自细菌、真菌和酵母。
11.根据权利要求10的方法,其中微生物是大肠杆菌。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14186830 | 2014-09-29 | ||
EP14186830.7 | 2014-09-29 | ||
PCT/EP2015/072262 WO2016050690A1 (de) | 2014-09-29 | 2015-09-28 | Verfahren zur biokatalytischen cyclisierung von geranyllinalool und dabei erhaltene cyclisierungsprodukte |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107002105A true CN107002105A (zh) | 2017-08-01 |
Family
ID=51619096
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580064485.3A Pending CN107002105A (zh) | 2014-09-29 | 2015-09-28 | 生物催化环化香叶基芳樟醇的方法和由此获得的环化产物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10179923B2 (zh) |
EP (1) | EP3201184B1 (zh) |
JP (1) | JP6598852B2 (zh) |
CN (1) | CN107002105A (zh) |
ES (1) | ES2718753T3 (zh) |
MX (1) | MX2017004162A (zh) |
WO (1) | WO2016050690A1 (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6695890B2 (ja) | 2015-03-05 | 2020-05-20 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアBasf Se | テトラヒドロピラニルエステルを製造するための方法 |
CN107454915B (zh) | 2015-03-26 | 2022-03-22 | 巴斯夫欧洲公司 | L-岩藻糖的生物催化生产方法 |
US10202324B2 (en) | 2015-05-04 | 2019-02-12 | Basf Se | Process for the preparation of melonal |
BR112018000481B1 (pt) | 2015-07-10 | 2022-01-11 | Basf Se | Processos para preparação de compostos e de (-)- ambrox (v) |
MX2018000606A (es) | 2015-07-15 | 2018-05-28 | Basf Se | Proceso para preparar un arilpropeno. |
EP3322685A1 (en) | 2015-07-15 | 2018-05-23 | Basf Se | Process for preparing an arylpropene |
EP3386919B1 (en) | 2015-12-08 | 2021-10-20 | Basf Se | A tin-containing zeolitic material having a bea framework structure |
MY196447A (en) | 2016-02-19 | 2023-04-12 | Basf Se | Enzymatic Cyclization Of Homofarnesylic Acid |
MX2018014918A (es) | 2016-05-31 | 2019-09-05 | Basf Se | Esteres de tetrahidropiranilalquilo inferior y su produccion usando un compuesto de ceteno. |
GB202005468D0 (en) * | 2020-04-15 | 2020-05-27 | Givaudan Sa | Enzyme-media process |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102449158A (zh) * | 2009-06-05 | 2012-05-09 | 巴斯夫欧洲公司 | 龙涎呋喃的生物催化产生 |
US20120237991A1 (en) * | 2010-11-17 | 2012-09-20 | Basf Se | Method for the biocatalytic cyclization of terpenes and cyclase mutants employable therein |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19931847A1 (de) | 1999-07-09 | 2001-01-11 | Basf Ag | Immobilisierte Lipase |
DE10019380A1 (de) | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von kovalent gebundenen biologisch aktiven Stoffen an Polyurethanschaumstoffen sowie Verwendung der geträgerten Polyurethanschaumstoffe für chirale Synthesen |
DE10019377A1 (de) | 2000-04-19 | 2001-10-25 | Basf Ag | Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Stoffen auf Trägermaterialien und Verwendung der mit biologisch aktiven Stoffen geträgerten Materialien für chirale Synthesen |
EP4112727A3 (de) * | 2010-11-17 | 2023-03-15 | Basf Se | Verfahren zur biokatalytischen cyclisierung von terpenen und darin einsetzbare cyclase-mutanten |
-
2015
- 2015-09-28 US US15/514,706 patent/US10179923B2/en active Active
- 2015-09-28 WO PCT/EP2015/072262 patent/WO2016050690A1/de active Application Filing
- 2015-09-28 MX MX2017004162A patent/MX2017004162A/es active IP Right Grant
- 2015-09-28 EP EP15770541.9A patent/EP3201184B1/de active Active
- 2015-09-28 JP JP2017516674A patent/JP6598852B2/ja active Active
- 2015-09-28 CN CN201580064485.3A patent/CN107002105A/zh active Pending
- 2015-09-28 ES ES15770541T patent/ES2718753T3/es active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102449158A (zh) * | 2009-06-05 | 2012-05-09 | 巴斯夫欧洲公司 | 龙涎呋喃的生物催化产生 |
US20120237991A1 (en) * | 2010-11-17 | 2012-09-20 | Basf Se | Method for the biocatalytic cyclization of terpenes and cyclase mutants employable therein |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GARIELE SIEDENBURG 等: "Squalene-Hopene Cyclases", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
NILS GÜNNEWICH 等: "A diterpene synthase from the clary sage Salvia sclarea catalyzes the cyclization of geranylgeranyl diphosphate to (8R)-hydroxy-copalyl diphosphate", 《PHYTOCHEMISTRY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US10179923B2 (en) | 2019-01-15 |
EP3201184B1 (de) | 2019-01-02 |
EP3201184A1 (de) | 2017-08-09 |
ES2718753T3 (es) | 2019-07-04 |
JP6598852B2 (ja) | 2019-10-30 |
US20170233780A1 (en) | 2017-08-17 |
WO2016050690A1 (de) | 2016-04-07 |
MX2017004162A (es) | 2017-07-19 |
JP2017529091A (ja) | 2017-10-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107002105A (zh) | 生物催化环化香叶基芳樟醇的方法和由此获得的环化产物 | |
de Carvalho | Whole cell biocatalysts: essential workers from nature to the industry | |
JP7011529B2 (ja) | テルペンの生体触媒環化のための方法及びその方法で使用され得るシクラーゼ変異体 | |
Van Beilen et al. | Biocatalytic production of perillyl alcohol from limonene by using a novel Mycobacterium sp. cytochrome P450 alkane hydroxylase expressed in Pseudomonas putida | |
US10717973B2 (en) | Method for the biocatalytic cyclization of terpenes and cyclase mutants employable therein | |
Karande et al. | Biocatalytic conversion of cycloalkanes to lactones using an in‐vivo cascade in Pseudomonas taiwanensis VLB120 | |
Gong et al. | Bio-resolution of a chiral epoxide using whole cells of Bacillus megaterium ECU1001 in a biphasic system | |
CN108779429A (zh) | 单加氧酶的功能性表达和使用方法 | |
JP2024038047A (ja) | ホモファルネシル酸の酵素的環化 | |
CN104364387B (zh) | 使用醛肟脱水酶从萜肟产生萜腈的方法 | |
CN102007210A (zh) | 新的12α-羟类固醇脱氢酶,产生及其用途 | |
JP2021519579A (ja) | バニリンの製造方法 | |
CN101796192B (zh) | 使用固氮弧菌属物种(Azoarcus Sp)EBN1脱氢酶产生光学活性醇的方法 | |
CN110325646A (zh) | 制备(3e,7e)-高法尼酸或(3e,7e)-高法尼酸酯的方法 | |
Oelschlägel et al. | Immobilization of an integral membrane protein for biotechnological phenylacetaldehyde production | |
JP2022502008A (ja) | ドリマニルアセテート化合物を生成する方法 | |
Soni et al. | Optimization of process parameters for the production of carbonyl reductase by Candida viswanathii in a laboratory-scale fermentor | |
JP2015195771A (ja) | ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用 | |
CN102317450A (zh) | 用于制备度洛西汀(duloxetine)醇之改良生物催化剂 | |
US9080191B2 (en) | Method for biocatalytic production of nitriles from oximes and oxime dehydratases usable therein | |
Schmid | Hiltrud Lenke |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |