CN104364387B - 使用醛肟脱水酶从萜肟产生萜腈的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用肟脱水酶从肟生物催化地产生腈的新方法和具有肟脱水酶活性的新突变体及其在用于生物催化产生腈的方法，如特别地用于从柠檬醛肟、橙花醛肟、香叶醛肟或香茅醛肟产生柠檬醛腈、橙花醛腈、香叶醛腈或香茅腈的方法中的用途；和可用于此的肟脱水酶、其核苷酸序列和包含所述核苷酸序列的表达构建体或微生物。

Description

使用醛肟脱水酶从萜肟产生萜腈的方法

本发明涉及使用肟脱水酶从肟以生物催化方式产生腈的新方法和具有肟脱水酶活性的新突变体及其用于生物催化产生腈的方法，如尤其用于从柠檬醛肟、橙花醛肟、香叶醛肟或香茅醛肟产生柠檬醛腈、橙花醛腈、香叶醛腈或香茅腈的方法中的用途；和可用于此的肟脱水酶、其核苷酸序列和包含它们的表达构建体或微生物。

背景技术

萜类是源自异戊二烯骨架并且尤其在自然界中作为生物中存在的次级物质、尤其作为植物中的次生物质存在的有机化合物。萜类经常是有香味或芳香的物质，并且可以例如从植物衍生的精油获得。因此，使用萜类和萜衍生物作为化妆品、身体护理领域产品的成分或用于清洁产品，例如在香水、护肤液、沐浴露、皂类、洗涤剂或清洁剂中作为香味物质或芳香物质的混合物。取决于所用的化合物，可以产生多种香韵，例如相应产品的刺激性的、清新、柑橘样或花香味。

由化学工业为相应产品的混合物所提供的相应起始产物经常是萜类或萜衍生物的腈。例子是具有强烈清新、柑橘样气味的香叶腈或具有玫瑰样芳香的香茅腈。

相应的腈作为天然产物分离或从合适前体化学地合成。因此，申请人的WO 2006/106141描述了从作为前体的不饱和腈产生饱和腈。EP0 491 127描述了添加不饱和腈到己烯醇上，获得修饰的腈。在这两种情况下，均使用已经包含腈基团的起始化合物。因此，需要还可以使用除腈之外的前体的方法。DE 3139358描述了通过肟化学反应为相应的腈产生香味的方法。在这种方法的情况下，必需的脱水作用要求极端反应条件，尤其是苛性脱水剂和沸腾温度。

因此需要从肟产生腈的替代性方法，尤其在较温和反应条件下发生的方法。另外，需要用于实施这种方法的合适试剂。

发明简述

上文提到的第一个问题由一种用于产生通式I的腈的生物催化方法解决，

其中

R代表直链或单次或多重分支的、饱和或单不饱和或多不饱和的、任选地单次或多重取代的具有4至19个碳原子的脂族烃残基；和

n代表1或2；

其中

a)通式II的肟

其中R和n具有上文给出的含义，其中式II的化合物处于立体异构纯形式或作为立体异构体的混合物，

在脂族醛肟脱水酶(4.99.1.5)、苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)(EC4.99.1.7)或吲哚乙醛肟脱水酶(4.99.1.6)存在下反应成式I的化合物，其中式I的化合物处于立体异构纯形式或作为立体异构体的混合物，和

b)任选地，然后进一步纯化反应产物。

通过提供本文中定义的核酸序列解决上文提到的第二个问题，所述核酸序列编码可以在本发明方法的背景下使用的蛋白质。

附图简述

图1示意性地显示香茅醛肟转化成香茅腈。

图2A：用PAOx进行生物催化反应之前E/Z-香茅醛肟的GC色谱图(保留时间：7.816分钟与8.018分钟)。

图2B：用PAOx进行生物催化反应期间E/Z-香茅醛肟的GC色谱图(时间：18小时)。香茅腈是作为反应产物可检测的(保留时间：6.765分钟)。

图2C：用PAOx进行生物催化反应期间形成的香茅腈的GC色谱图(时间：90小时)。E/Z-香茅醛肟完全转化成腈。

发明详述

A.一般定义

在本发明的意义下，“醛肟脱水酶”通常是催化从通式R¹R²C＝N-OH的肟消除水的酶或酶突变体，其中R¹代表任何有机残基并且R²代表氢。术语“醛肟脱水酶”包括其他更精确指定的醛肟脱水酶，如脂族醛肟脱水酶(EC4.99.1.5，根据“国际生物化学和分子生物学联合委员会联盟”命名委员会的国际EC命名)，苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)(EC4.99.1.7)或吲哚乙醛肟脱水酶(EC4.99.1.6)。

鉴于酶促反应的可逆性，本发明涉及本文所述处于两个反应反向的酶促反应。

醛肟脱水酶的“功能突变体”包括下文定义的所述酶的“功能等同物”。

术语“生物催化过程”指在本发明“醛肟脱水酶”的催化活性或具有“醛肟脱水酶活性”的酶存在下实施的任何过程，即在粗制或纯化、溶解、分散或固定的酶存在下或在具有或表达所述酶活性的完整微生物细胞存在下的过程。生物催化过程因此包括酶促过程及微生物过程。

术语“立体异构纯”意指在本发明背景下提到的具有至少一个非对称性中心的化合物的几种可能立体异构体之一以高“对映异构过量”或高“对映异构纯度”，例如至少90％ee、尤其至少95％ee或至少98％ee或至少99％ee存在。从以下式计算ee％值：

ee％＝[X_A-X_B]/[X_A+X_B]*100，

其中X_A和X_B分别代表对映异构体A和B的摩尔分数。

采用“参考底物在标准条件下”测定的“醛肟脱水酶活性”例如意指描述从肟底物形成腈产物的酶活性。标准条件是例如在pH 4至8并且在例如15至30℃或20至25℃的温度从10mM至0.2M、尤其15至100mM、例如约20至25mM的底物浓度。可以用表达醛肟脱水酶的重组细胞、表达醛肟脱水酶的裂解细胞、其级分或富集或纯化的醛肟脱水酶进行测定。具体而言，参考底物是式(II)的肟；尤其香茅醛肟，或香茅醛肟外消旋物，还如实施例中更详细地描述。用于检测醛肟脱水酶活性的具体标准测定法例如由Kato,Y.等人,在Biochemistry2000,39,800-809中描述。根据这种表述，标准制备物含有50μmol磷酸钾缓冲液，pH 7.0，125nmol FMN，2.5μmol酶。在10分钟后通过添加500μL 0.5M H₃PO₄终止反应，并且随后对通过离心(18000g，10分钟)获得的上清液分析形成的产物。

“萜”是由异戊二烯单位(C₅单位)、尤其非环状萜(例如鲨烯)组成的烃，碳数目被5可整除。

“类萜”是例如通过额外插入碳原子和/或杂原子从萜类、尤其非环状萜衍生的物质，例如香茅醛。

在本发明意义下的“萜样”化合物尤其包括这类化合物，它们采取如下文定义的结构通式(IV)。

通常而言，根据本发明，包括本文所述的化合物的全部异构形式，如组成异构体和尤其立体异构体及其混合物，例如光学异构体或几何异构体，如E和Z异构体，及其组合。如果在分子中存在几个非对称性中心，则本发明包含这些非对称性中心的不同构象的全部组合，例如对映异构对子。

除非另外声明，否则以下一般化学定义在本文中适用：

脂族烃残基包含源自无环或环状、饱和或不饱和碳化合物的残基，例外是芳族化合物。脂族烃残基尤其包含直链或分支的烷基残基和直链或分支的烯基残基。下文列出非限制性例子：

烷基和残基中从其衍生的全部烷基部分，例如羟烷基：饱和，直链或单次或多次分支例如1次、2次、3次或4次分支的具有1至4、1至6、1至8、1至10或4至10个碳原子的烃残基，例如

-C₁-C₁₀-烷基或C₁-C₆-烷基或C₄-C₁₀-烷基：如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、和1,1-二甲基乙基作为C₁-C₄-烷基的常见代表；和戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基，例如尤其作为表4中给出的R的意思，例如己基

-羟基-C₁-C₁₀-烷基，例如羟基-C₁-C₆-烷基或羟基-C₁-C₄-烷基或羟基-C₄-C₁₀-烷基：例如羟甲基、1-或2-羟乙基、1-、2-或3-羟丙基、1-羟甲基乙基、1-、2-、3-或4-羟丁基、1-羟甲基丙基和2-羟甲基丙基；或以上烷基残基的其他羟基取代类似物，例如尤其作为表4中给出的R的意思，例如6-羟基-6-甲基庚-1-基。

-烯基代表单不饱和或多不饱和、尤其单不饱和或双不饱和的直链或单次或多次分支、例如1次、2次、3次或4次分支的具有2至4、2至6、2至8、2至10、4至10、2至20或4至20个碳原子和在任何位置具有双键或2个非累积性共轭或尤其非共轭双键的烃残基，例如C₂-C₆-烯基如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-1-丙烯基、1,2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-1-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-1-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-1-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、3,3-二甲基-1-丁烯基、3,3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-甲基-1-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基，例如尤其作为表4中给出的R的意思，如2,6-二甲基庚-1,5-二烯-1-基、2,6-二甲基庚-5-烯-1-基、2,6-二甲基辛-1,5-二烯-1-基、辛-1,5-二烯-1-基、1,5-二甲基己-4-烯-1-基、1,5,9-三甲基壬-8-烯-1-基。

“氧代”例如代表连同与之结合的碳原子一起形成酮基(C＝O)的残基。因此，例如，前述烃残基的衍生残基是携带一个或多个酮基的那些。

“亚甲基(＝CH₂)”例如代表连同与之结合的碳原子一起形成乙烯基残基(-CH＝CH₂)的残基。

B.本发明的具体实施方案

本发明尤其涉及以下具体实施方案：

1.用于产生通式I的腈的生物催化方法

其中

R代表直链或单次或多重分支的、饱和或单不饱和或多不饱和的、任选地单次或多重取代的具有4至19个碳原子的脂族烃残基；尤其如直链或分支的C₁-C₁₀-烷基，或直链或分支的羟基-C₁-C₁₀-烷基，或直链或分支的C₂-C₁₀-烯基，或直链或分支的双不饱和C₄-C₁₀-烯基；并且

n代表1或2、尤其1；

其中通式II的肟

其中R和n具有上文给出的含义，其中式II的化合物处于立体异构纯形式或作为立体异构体的混合物，

在脂族醛肟脱水酶(4.99.1.5)、苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)(EC4.99.1.7)或吲哚乙醛肟脱水酶(4.99.1.6)、例如包含选自SEQ ID NO:1和4至28的氨基酸序列或具有与这些序列之一至少60％例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的酶；尤其苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)(EC4.99.1.7)，尤其包含SEQ ID NO:1或具有与该序列至少60％例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的酶存在下反应成式I的化合物，其中式I的化合物处于立体异构纯形式或作为立体异构体的混合物，和

b)任选地，然后进一步纯化反应产物。

2.根据实施方案1的方法，其中PAOx是来自红球菌属物种(Rhodococcus sp.)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)或特别地来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的酶。

3.根据前述实施方案之一的方法，其中PAOx具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与这个序列至少60％例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列；或其中多达25％，例如多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸残基相对于SEQ ID NO:1因添加、缺失、插入、置换、倒位或其组合而改变，并且其仍具有SEQ ID NO:1的至少50％，例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％酶活性。

4.根据前述实施方案之一的方法，其中使式II的肟反应，式II中残基R，连同与之结合的碳原子，衍生自非环状萜残基，选自半萜(C₅)、单萜(C₁₀)、倍半萜(C₁₅)、二萜(C₂₀)、二倍半萜(C₂₅)、三萜(C₃₀)或四萜(C₄₀)残基(特别地被部分或完全氢化)，或源自缩短1至3个碳原子的相应萜残基。

5.根据前述实施方案之一的方法，其中使式II的肟反应，其中n代表1并且残基R具有上文给出的含义之一。

6.根据前述实施方案之一的方法，其中使选自柠檬醛肟、橙花醛肟、香叶醛肟、香茅醛肟和它们的部分或完全氢化的类似物如6,7-二氢香茅肟的式II化合物转化成相应的腈。

7.根据实施方案6的方法，其中式IIa的香茅醛肟

转化成式Ia的香茅腈

其中式IIa的化合物以立体异构纯形式或作为立体异构混合物如尤其R/S和/或E/Z混合物、尤其R/S和E/Z混合物使用。

8.根据前述实施方案之一的方法，其中反应在PAOx、含有PAOx的蛋白质混合物存在下或在功能性表达PAOx的重组微生物、从其衍生的含有PAOx的细胞匀浆或其含有PAOx的级分存在下酶促地进行。

9.根据前述实施方案之一的方法，其中PAOx或功能性表达PAOx的微生物在反应混合物中以游离形式或以固定化形式存在。

10.根据实施方案8和9中的一个实施方案的方法，其中重组微生物是功能性表达PAOx的细菌菌株，特别地是大肠杆菌菌株。

11.根据实施方案10的方法，其中重组微生物携带具有编码PAOx的核苷酸序列的表达构建体，所述核苷酸序列任选地适应于所述微生物的密码子选择。

12.根据实施方案8至11中的一个实施方案的方法，其中微生物额外地表达至少一种支持PAOx功能性表达(尤其正确折叠)的伴侣蛋白。

13.根据实施方案12的方法，其中重组微生物是除了表达PAOx之外还表达一种或多种选自GroEL和GroES的伴侣蛋白的细菌菌株。

14.根据前述实施方案之一的方法，其中反应尤其在纯底物中即在不进一步添加常用添加物如水或缓冲液作为反应介质的情况下实施，其中尤其使用表达脱水酶酶的完整细胞。

15.编码PAOx的根据SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列，其中将核苷酸序列适应于微生物大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子选择。

16.表达构建体，根据实施方案11至14之一中定义或包含根据实施方案15的核苷酸序列。

17.重组微生物，根据在前述实施方案8至14之一中定义或包含根据实施方案15的核苷酸序列或根据实施方案16的表达构建体。

C.本发明的其他实施方案

1.本发明的蛋白质/酶突变体

本发明不限于本文中具体公开的具有醛肟脱水酶活性的酶，另外还扩展至它们的功能等同物。

在本发明的上下文中，具体公开的酶和酶突变体的“功能等同物”或类似物是其也拥有所需生物学活性例如醛肟脱水酶活性的多种多肽。

因此，例如“功能等同物”意指酶和突变体，所述酶和突变体在本发明意义下使用(即采用参考底物在标准条件下)的“醛肟脱水酶活性”测定法中具包含本文中具体限定的氨基酸序列(例如，源自SEQ ID NO:1或源自根据SEQ ID NO:4至28的序列之一的突变体)的酶的活性，所述活性更高或更低至少1％、尤其至少约5至10％，例如至少10％或至少20％，例如至少50％或75％或90％。

除非另外声明，否则关于功能等同物活性的数据在本文中指如本文定义的借助参考底物在标准条件下进行的活性测定。

在本发明的意义下，可以借助各种已知的测定法检测“醛肟脱水酶活性”。在不受这种情况限制的情况下，我们可以提到在标准条件下使用参考底物(例如香茅醛肟或香茅醛肟外消旋物)的测定法，如上文描述(参见Kato等人，Biochemistry,2000,39,800-809；对PAOx描述；并且类似地可应用于或可适用于其他醛肟脱水酶)和实验部分中解释。

功能等同物还例如在pH 4至11之间稳定并有利地拥有在pH 5至10、尤其如6.5至9.5或7至8范围内或在约7.5的最适pH和在15℃至80℃或20℃至70℃例如约30至60℃或约35至45℃范围内如在40℃的最适温度。

“功能等同物”包括因一个或多个例如1至50、2至30、2至15、4至12或5至10个“额外突变”如氨基酸添加、置换、缺失和/或倒位可获得的突变体，其中所述的变化可以出现在任何序列位置处，条件是它们导致具有本发明特性谱的突变体。当突变体和未改变的多肽之间的反应性样式定性地重合，即例如以不同速率转换相同底物时，尤其还获得功能等同物。

这个种类的“额外突变”可以出现在任何相应氨基酸序列的任何位置处。

下表中提出合适氨基酸置换的非限制性例子：

以上意义下的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”以及该多肽的“功能衍生物”和“盐”。

“前体”是所述多肽的具有或没有所需生物学活性的天然或合成前体。

表述“盐”意指本发明蛋白质分子的羧基的盐和氨基的酸加成盐。羧基的盐可以按照本身已知的方式产生并包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐，和与有机碱(例如，胺如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等)的盐。本发明也涵盖酸加成盐，例如与无机酸(如氢氯酸或硫酸)的盐和与有机酸(如乙酸和草酸)的盐。

本发明多肽的“功能衍生物”也可以通过已知技术在功能性氨基酸侧基团上或在它们的N末端或C末端处产生。这类衍生物包括例如羧酸基的脂族酯、通过与氨或者与伯胺或仲胺反应可获得的羧酸基的酰胺；通过与酰基反应产生的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基反应产生的游离羟基的O-酰基衍生物。

“功能等同物”自然还包括从其他生物可获得的多肽和天然存在的变体。例如，可以通过序列比较建立同源序列区域的范围，并且可以基于本发明的具体说明确定等同酶。

“功能性等同物”也包括本发明多肽的片段，优选地各个结构域或序列基序，它们例如具有所需的生物学功能。

“功能等同物”还是融合蛋白，所述融合蛋白具有前述多肽序列或从其衍生的功能等同物之一和处于功能性N端或C端连接(即对融合蛋白部分不造成彼此实质的功能损害的情况下)的功能上与之不同的至少一个其他异源序列。这个种类的异源序列的非限制性例子例如是信号肽、组氨酸锚或酶。

根据本发明，“功能等同物”包括是具体公开的蛋白质的同源物。这些同源物与具体公开的氨基酸序列之一具有至少60％、优选地至少75％，尤其至少85％，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性(或同一性)，所述同源性使用Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448算法计算。本发明的同源多肽的同源性或同一性百分数尤其意指氨基酸残基相对于本文中具体所述的氨基酸序列之一的总长度而言的同一性百分数。

也可以基于BLAST比对、blastp算法(蛋白质-蛋白质BLAST)或使用下文给出的Clustal设置确定同一性百分数值。

在蛋白质可能糖基化的情况下，本发明的“功能性等同物”包括本文所述类型的蛋白质，所述蛋白质处于去糖基化或糖基化形式及通过改变糖基化模式可获得的修饰形式。

本发明蛋白质或多肽的同源物可以通过诱变例如点突变、加长或缩短所述蛋白质来产生。

可以通过筛选突变体(例如，缩短的突变体)的组合库鉴定本发明蛋白质的同源物。例如，可以通过在核酸水平组合诱变(例如通过酶促连接合成的寡核苷酸混合物)产生蛋白质变体的多样化库。存在可以用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在同源物库的许多方法。可以在自动DNA合成仪上实施简并基因序列的化学合成，并且随后可以将合成的基因连接入合适的表达载体中。简并性基因集合的使用使以下成为可能：在一种混合物中提供编码所需潜在蛋白质序列集合的全部序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等人,(1984)Science 198:1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。

筛选已经通过点突变或缩短产生的组合库的基因产物和对cDNA库筛选具有所选择特性的基因产物的几项技术是现有技术中已知的。这些技术可以适应于快速筛选已经通过组合诱变本发明同源物所产生的基因库。构成高通量分析基础的最经常使用的用于筛选庞大基因库的技术包括将基因库克隆至复制型表达载体中，用所得到的载体库转化适宜细胞并且在下述条件下表达组合基因，在所述条件下，所需活性的检测促进分离编码其产物被检测的基因的载体。递归总体诱变(REM)，一种增加库中功能突变体频率的技术，可以与筛选试验组合使用，以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89:7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。

2.核酸和构建体

2.1核酸

本发明还涉及核酸序列，所述核酸序列编码如上文所述的酶或其在上文描述的具有醛肟脱水酶活性的突变体。

本发明还涉及与本文所述的具体序列具有指定程度同一性的核酸。

两个核酸之间的“同一性”意指在每种情况下总核酸长度范围内核苷酸的同一性，尤其通过设定以下参数后使用Clustal技术(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitivemultiple sequence alignments on a microcomputer(在微型计算机上的快速和灵敏多重序列比对).Comput Appl.Biosci.1989Apr；5(2):151-1)借助来自Informax(美国)公司的Vector NTI Suite7.1软件比较所计算的同一性：

多重比对参数：

两两比对参数：

作为备选，也可以根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs(采用Clustal系列程序的多重序列比对).(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500,根据互联网网址：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#并采用以下参数确定同一性：

本文中提到的全部核酸序列(单链和双链DNA序列和RNA序列，例如，cDNA和mRNA)可以通过化学合成从核苷酸结构单元以本身已知的方式产生，例如，通过各个重叠性互补性双螺旋核酸结构单元的片段缩合产生。寡核苷酸的化学合成可以例如通过亚磷酸酰胺法(Voet,Voet,第2版,Wiley Press,New York,第896-897页)按已知的方式进行。添加合成的寡核苷酸和借助DNA聚合酶Klenow片段补平缺口和连接反应及一般的克隆技术在Sambrook等人(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press中描述。

本发明也涉及编码以上多肽及其功能性等同物之一的核酸序列(单链和双链DNA序列和RNA序列，例如，cDNA和mRNA)，所述核酸序列例如通过使用人工核苷酸类似物可获得。

本发明既涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物学活性区段的分离的核酸分子，并还涉及可以用作例如鉴定或扩增本发明编码性核酸的杂交探针或引物的核酸片段。

本发明的核酸分子还可以含有来自编码基因区3'端和/或5'端的非翻译序列。

本发明还包括与具体所述核苷酸序列或其区段互补的核酸分子。

本发明的核苷酸序列使得产生可以用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中同源序列的探针和引物成为可能。所述探针或引物通常包含下述核苷酸序列区，所述核苷酸序列区在“严格”条件(见下文)与本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少约12个、优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸杂交。

“分离的”核酸分子与该核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分开，并且如果通过重组DNA技术产生该核酸分子，则还可以基本上不含其它细胞物质或培养基，或如果化学地合成该核酸分子，则可以不含化学前体或其它化学品。

可以借助分子生物学标准技术和根据本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子。例如，使用具体公开的完整序列之一或其区段作为杂交探针和(如在例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989中描述的)标准杂交技术，可以从合适的cDNA库分离cDNA。另外，包含所公的开序列之一或其区段的核酸分子可以使用基于这种序列所制备的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应进行分离。可以将如此扩增的核酸克隆入合适的载体中并且可以通过DNA序列分析表征。本发明的寡核苷酸还可以通过标准合成方法产生，例如采用自动DNA合成仪产生。

本发明的核酸序列或其衍生物、同源物或这些序列的部分可以例如采用常规杂交技术或PCR技术从其他细菌分离，例如通过基因组库或cDNA库分离。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。

“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补性序列结合，但在这些条件下非互补的配偶物之间不发生非特异性结合。为此，序列可以互补达90-100％。例如在RNA印迹或DNA印迹中或在PCR或RT-PCR中的引物结合期间利用互补序列能够相互特异性结合的特性。

有利地，保守区域的短寡核苷酸用于杂交。但是，本发明核酸的较长片段或完整序列也可以用于杂交。这些标准条件根据所用的核酸(寡核苷酸、较长的片段或完整序列)或根据何种类型的核酸(DNA或RNA)用于杂交而变化。例如，DNA:DNA杂交分子的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂交分子的解链温度低约10℃。

例如，取决于核酸，标准条件意指在浓度0.1至5 x SSC(1 x SSC＝0.15M NaCI,15mM柠檬酸钠，pH 7.2)或额外地在50％甲酰胺存在下的缓冲水溶液中42℃和58℃之间的温度，例如，42℃在5 x SSC，50％甲酰胺中。有利地，DNA:DNA杂交分子的杂交条件是0.1 xSSC和在约20℃至45℃之间、优选在约30℃至45℃之间的温度。对于DNA:RNA杂交分子，杂交条件有利地是0.1 x SSC和在约30℃至55℃之间、优选在约45℃至55℃之间的温度。所述的这些杂交温度是例如在甲酰胺不存在下对大约100个核苷酸长度及50％G+C含量的核酸的计算解链温度值。DNA杂交的实验条件在相关遗传学教材(例如Sambrook等人，"MolecularCloning",Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中描述，并且可以例如根据核酸的长度、杂交分子类型或G+C含量，使用本领域技术人员已知的公式计算。本领域技术人员可以从以下教材获得关于杂交的进一步信息：Ausubel等人(编著),1985,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York；Hames和Higgins(编著),1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford；Brown(编著),1991,Essential Molecular Biology:APractical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。

“杂交”可以尤其在严格条件下进行。所述杂交条件例如由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,于:Molecular Cloning(A Laboratory Manual),2nd edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989,第9.31-9.57页中或在Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6.描述。

“严格”杂交条件特别意指：在42℃于50％甲酰胺、5 x SSC(750mM NaCI，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5 x Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20g/ml变性剪切鲑精DNA组成的溶液中温育过夜，接着在65℃用0.1x SSC洗涤滤膜的步骤。

本发明还涉及具体公开或可衍生的核酸序列的衍生物。

因此，本发明的编码醛肟脱水酶的其他核酸序列可以例如衍生自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3并且因添加、置换、插入或缺失单个或几个核苷酸而与之不同，但是也编码具有所需特性谱的多肽。

本发明还包含下述核酸序列，它们包含所谓沉默突变或与从SEQ ID NO:2开始相对于大肠杆菌密码子选择而言被优化的具体所述序列如SEQ ID NO:3以及其天然存在变体例如剪接变体或等位基因变体相比受到改变，所述改变对应于特定的初始或宿主生物的密码子选择。

本发明也涉及通过保守性核苷酸替换(即所讨论的氨基酸被具有相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸置换)可获得的序列。

本发明还涉及因序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。这些遗传多态性可以因自然变异存在于群体内部的个体之间。这些天然的变异通常引起基因核苷酸序列的1至5％变异。

编码醛肟脱水酶的本发明核酸序列的从序列SEQ ID NO:3或从SEQ ID NO:1的编码序列之一衍生的衍生物例如意指在整个序列区域范围内在衍生的氨基酸水平具有至少60％同源性、优选地至少80％同源性、相当特别优选地至少90％同源性(关于氨基酸水平上的同源性，参见上文涉及多肽的描述)的等位基因变体。在所述序列的部分区域中，同源性可以有利地更高。

另外，还将衍生物理解为本发明核酸序列的同源物，例如真菌或细菌同源物、编码性和非编码性DNA序列的缩短序列、单链DNA或RNA。

另外，衍生物例如意指与启动子的融合物。可以通过至少一个核苷酸交换、至少一个插入、倒位和/或缺失改变连接到所述核苷酸序列上的启动子，而不损害所述启动子的功能或有效性。另外，可以通过改变启动子的序列增加它们的有效性，或可以将它们完全交换为更有效的启动子，甚至外来生物的启动子。

2.2功能突变体的产生

另外，本领域技术人员已知产生本发明酶的功能突变体的方法。

取决于所用的技术，本领域技术人员可以将完全随机或另外更定向的突变引入基因或另外非编码核酸区(所述区域例如对调节表达重要)中并且随后制备基因库。所需要的分子生物学方法是本领域技术人员已知的并且例如是在Sambrook和Russell，MolecularCloning.第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001中描述。

用于改变基因并因此改变由它们编码的蛋白质的方法是本领域技术人员长久熟悉的，例如

-位点定向诱变，其中有意交换基因的单个或几个核苷酸(Trower MK(编著)1996；In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey)，

-饱和诱变，其中可以将任何所需氨基酸的密码子在基因的任何所需位点处交换或添加(Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res22:1593；Barettino D,Feigenbutz M,Valcárel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541；Barik S(1995)Mol Biotechnol 3:1)，

-易错聚合酶链反应(易错PCR)，其中通过以缺陷方式发挥作用的DNA聚合酶突变核苷酸序列(Eckert KA，Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res18:3739)；

-SeSaM法(序列饱和法)，其中通过聚合酶阻止优选的交换。Schenk等人，Biospektrum,第3卷,2006,277-279；

-基因在增变株中传代，其中存在核苷酸序列突变速率增加，例如因缺陷型DNA修复机制(Greener A,Callahan M,Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesistechnique using an E.coli mutator strain(利用大肠杆菌增变株的高效随机诱变技术).引自：Trower MK(编著)In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,NewJersey)，或

-DNA改组，其中形成并消化密切相关的基因汇集物并且利用片段作为聚合酶链反应的模板，在所述聚合酶链反应中，通过反复的链分离和装配，最终产生全长嵌合基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389；Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。

使用所谓定向进化(尤其在以下文献中描述：Reetz MT和Jaeger K-E(1999),Topics Curr Chem 200:31；Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods foroptimizing industrial enzymes by directed evolution(通过定向进化法优化工业酶的方法),引自：Demain AL,Davies JE(编著)Manual of industrial microbiology andbiotechnology.American Society for Microbiology)，本领域技术人员还可以按定向方式并以大规模产生功能突变体。在这种方法中，在第一步骤中，首先例如使用上文给出的方法，产生相应蛋白质的基因库。以合适的方式表达基因库，例如通过细菌或通过噬菌体展示系统表达。

可以使表达特性与所需特性大体对应的功能突变体的宿主生物的相关基因接受另一轮突变。可以迭代地重复突变步骤和选择或筛选步骤，直至存在的功能突变体显示所需特性至足够的程度。采用这种迭代流程，可以逐步进行有限数目的突变，例如1、2、3、4或5个突变，并且可以对所述突变评估并选择它们对所讨论酶特性的影响。随后可以将选择的突变体以相同方式经历另一个突变步骤。这可以显著地减少待研究的独立突变体的数目。

本发明的结果还提供关于相关酶的结构和序列的重要信息，这是定向产生具有所需的改良特性的其他酶必需的。具体而言，可以定义所谓“热点”，即潜在地适于通过导入定向突变调节酶特性的序列区段。

也可以推导涉及氨基酸序列位置的信息，在所述氨基酸序列位置的区域内可以实施突变，所述突变应当可能对酶活性具有少量影响并且可以称为潜在的“沉默突变”。

2.3构建体

本发明还特别地涉及重组表达构建体，其含有处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发明多肽的核酸序列；并且涉及包含这些表达构建体中至少之一的载体，尤其重组载体。

根据本发明，“表达单元”意指具有表达活性的核酸，如本文中所定义，所述核酸包含启动子，并且与待表达的核酸或基因功能性连接后，调节该核酸或该基因的表达，即其转录和翻译。因此，在这种情境下，我们还谈到“调节性核酸序列”。除启动子之外，也可以含有其他调节元件，例如增强子。

根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”意指与待表达核酸或待表达基因功能性连接的表达单元。与表达单元相反，表达盒因此不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，还包含应当因转录和翻译而表达为蛋白质的核酸序列。

在本发明的上下文中，术语“表达”或“过量表达”描述微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的胞内活性产生或增加。为此，例如可以将基因引入生物中、将现存基因替换为另一种基因、增加该基因或诸个基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，并且任选地，可以组合这些措施。

优选地，本发明的这些构建体包含在相应编码序列5'上游、启动子和3'下游、终止子序列以及任选地还包含常规调节元件，在每种情况下均与编码序列有效连接。

根据本发明，“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”意指与待转录核酸功能性连接时调节该核酸转录的核酸。

在本上下文中，“功能性”或“有效”连接意指例如具有启动子活性的核酸之一和待转录的核酸序列和任选地其他调节元件(例如确保转录核酸的核酸序列及例如终止子)如此依次排列，从而所述调节元件的每一个可以在该核酸序列的转录期间完成其功能。这并不实际上要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列可以从更远的位置或甚至从其它DNA分子上对靶序列发挥它们的作用。优选这样的排列，其中待转录的核酸序列位于启动子序列之后(即在3'端)，从而这两个序列彼此共价地连接在一起。另外，启动子序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离可以小于200碱基对、或小于100碱基对、或小于50碱基对。

除启动子和终止子之外，作为其他调节元件的例子，我们可以提到靶向序列、增强子、多聚腺苷化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列例如在Goeddel，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述。

本发明的核酸构建体尤其包含编码醛肟脱水酶突变体的序列、尤其从编码根据SEQ ID NO:1和根据大肠杆菌密码子选择SEQ ID NO:3的PAOx或其衍生物及同源物的核酸序列衍生的一个序列，和从其可衍生的核酸序列，其有利地与控制(例如增加)基因表达的一个或多个调节信号有效或功能性连接。

除这些调节序列之外，这些序列的天然调节作用仍可以在实际结构基因之前存在并且任选地可以按遗传方式如此改变，从而关闭天然调节作用并且基因的表达增加。然而，核酸构建体还可以具有更简单的构造，即在编码序列之前不插入任何额外的调节信号和不移除具有其调节作用的天然启动子。相反，如此突变天然调节序列，从而调节作用不再发生并且基因的表达增加。

优选的核酸构建体有利地还含有与启动子功能性连接的已经提到的一个或多个“增强子”序列，这使得增加核酸序列的表达成为可能。也可以在DNA序列的3'端插入额外的有利序列，如其他调节元件或终止子。可以在构建体中以一个或多个拷贝含有本发明的核酸。构建体也可以含有其他标记，如抗生素抗性或辅源营养弥补基因(auxotrophy-complementing gene)，任选地用于对构建体选择。

在有利地用于革兰氏阴性细菌中的启动子如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacI^q-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaP_BAD)SP6、λ-P_R或λ-P_L启动子中含有合适调节序列的例子。在例如革兰氏阳性细菌启动子amy和SPO2、在酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中含有有利的其他调节序列。人工启动子也可以用于调节。

为了在宿主生物中表达，将核酸构建体有利地插入使基因在该宿主中最佳表达成为可能的载体，例如质粒或噬菌体。除质粒和噬菌体外，载体也理解为本领域技术人员已知的全部其他载体，例如，病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或可以按染色体方式复制。这些载体代表本发明的又一实施方案。

合适的质粒例如是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11或pBdCI，链霉菌属(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1、pIL2或pBB116；酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHIac⁺、pBIN19、pAK2004或pDH51。提到的质粒代表可能质粒的少量选项。其他质粒当然是本领域技术人员已知的并且可以例如在书籍Cloning Vectors(编者Pouwels P.H.等人,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中找到。

在载体的另一个实施方案中，含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体也可以有利地以线性DNA形式引入微生物中并且通过异源或同源重组整合入宿主生物的基因组中。这种线性DNA由线性化载体如质粒或仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。

为了在生物中最佳表达异源基因，有利的是与该生物中所用的特定“密码子选择”相对应地改变核酸序列。该“密码子选择”可以基于计算机评价所讨论生物的其他已知基因来轻易确定。

通过将合适启动子与合适的编码性核苷酸序列和终止子信号或多聚腺苷酸化信号融合制备本发明的表达盒。为此使用常规重组和克隆技术，如在例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)以及在T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1984)和在Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)中描述的重组和克隆技术。

为了在合适的宿主生物中表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入使基因在该宿主中最佳表达成为可能的宿主特异性载体。载体当然是本领域技术人员已知并且可以例如在Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编著,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中找到。

3.微生物

取决于上下文，术语“微生物”可以意指野生型微生物或基因修饰的重组微生物或这两者。

借助本发明的载体，可以产生重组微生物，所述重组微生物用例如至少一种本发明载体转化并可以用于产生本发明的多肽。有利地，将以上所述的本发明重组构建体引入合适的宿主系统并表达。使用本领域技术人员熟悉的克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以在相应表达系统中表达所述核酸。合适的系统例如在Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人编著,WileyInterscience,New York 1997或Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,1989中描述。

原则上，可以考虑全部原核或真核生物作为本发明核酸或核酸构建体的重组宿主生物。有利地，使用微生物如细菌、真菌或酵母作为宿主生物。有利地，使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选地肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)细菌或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌，尤其优选地埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)、梭菌属(Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。非常特别优选大肠杆菌属和种。其他有利的细菌存在于α-变形菌门、β-变形菌门或γ-变形菌门的组中。

本发明的宿主生物或诸宿主生物优选地含有本发明中所述的编码上文定义的具有苯乙醇脱氢酶活性的酶的核酸序列、核酸构建体或载体的至少之一。

取决于宿主生物，本发明方法中使用的生物由本领域技术人员以已知的方式生长或培养。原则上，将微生物在液体培养基中在0℃和100℃之间、优选在10℃和60℃之间的温度在氧曝气的情况下培育，其中所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源、通常为有机氮源(如酵母提取物)形式的氮源或盐如硫酸铵、微量元素如铁盐、锰盐和镁盐并且任选地含有维生素。在此期间，营养液的pH可以保持在固定值处，即在培养期间可以调节或可以不调节。培养可以是分批的、半分批的或连续的。养分可以在发酵伊始供应或可以半连续或连续地输入。

4.本发明酶的重组产生

本发明还涉及用于重组产生本发明的多肽或其有功能的、生物学活性片段的方法，其中培育产生多肽的微生物，任选地，诱导多肽的表达并且从培养物分离这些多肽。如果需要，也可以按这种方式以工业规模产生多肽。

根据本发明产生的微生物可以按分批法或按补料分批或重复补料分批法连续或不连续地培养。已知培养技术的综述可以在Chmiel教材(Bioprocess Technology1.Introduction to bioprocess engineering(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))中或在Storhas的教材(Bioreactors and Peripheral Equipment(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994)中找到。

待使用的培养基必须以合适的方式满足相应菌株的要求。对多种微生物的培养基的描述在美国细菌学学会的“普通细菌学方法手册”(Manual of Methods for GeneralBacteriology)(Washington D.C.,USA,1981)中给出。

用于本发明用途的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。

优选的碳源是糖类，如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源例如是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可以通过复杂化合物如糖蜜或糖精炼的其他副产品添加糖至培养基。也可以有利的是添加多种碳源的混合物。其他可能的碳源是油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸、醇如甘油、甲醇或乙醇和有机酸如乙酸或乳酸。

氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的例子包括氨气或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、脲、氨基酸或复杂氮源，如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉浸汁和其他等。氮源可以单独或作为混合物使用。

可以在培养基中含有的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷盐或硫酸盐。

使用的硫源可以是无机含硫化合物，例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，还可以是有机硫化合物如硫醇和硫羟。

磷酸、磷酸二氢钾盐或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。

可以添加螯合剂至培养基，以维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包含二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸酯或有机酸如柠檬酸。

根据本发明使用的发酵培养基通常还可以含有其他生长因子，如维生素或生长促进剂，包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸酯和吡哆醇。生长因子和盐经常源自培养基的复杂组分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。另外，可以将合适的前体添加至培养基。培养基中化合物的精确组成主要取决于具体实验并且针对每种具体情况单独决定。关于优化培养基的信息可以在教材"Applied Microbiol.Physiology,A PracticalApproach"(编者P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL Press(1997)第53-73页,ISBN 0 19963577 3)中找到。也可以从供应商处获得生长培养基，如标准1(Merck)或BHI(心脑浸液，DIFCO)等。

采用加热(在1.5巴和121℃，20分钟)或通过无菌过滤，将培养基的全部组分消毒。所述组分可以一起消毒或如果需要，分别消毒。培养基的全部组分可以在培养开始时存在，或任选地连续或分批添加。

培养温度通常是15℃和45℃之间，优选地是25℃至40℃并且在实验期间可以保持恒定或可以变动。培养基的pH应当在5至8.5范围内，优选地在7.0附近。可以在培养期间通过添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸，控制培养物的pH。消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，可以用于控制泡沫形成。为了维持质粒的稳定性，可以将具有选择作用的合适物质例如抗生素添加至培养基。为了维持有氧条件，将氧或含氧的气体混合物例如环境空气送入培养物。培养温度通常是20℃至45℃。持续培养直至最大量的所需产物已经形成。这个目标通常在10小时至160小时内达到。

然后进一步加工发酵液。取决于要求，生物量可以通过分离技术例如离心、过滤、滗析法或这些方法的组合从发酵液完全或部分取出，或可以完全留在发酵液中。

如果多肽未分泌至培养基中，也可以裂解细胞并且可以通过分离蛋白质的已知方法从裂解物获得产物。可以任选地通过高频超声、通过高压(如在法式细胞压碎器(Frenchpressure cell)中)、通过渗透裂解、通过去垢剂、裂解酶类或有机溶剂的作用、借助均化器或通过组合几种所列的方法，裂解细胞。

可以通过已知的层析技术如分子筛层析(凝胶过滤)如Q-琼脂糖凝胶层析、离子交换层析和疏水层析并采用其他常规方法如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳纯化多肽。合适的方法例如在Cooper,T.G.,Biochemical Procedures,Verlag Walter deGruyter,Berlin,New York或在Scopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。

对于分离重组蛋白，可以有利的是使用例如起到更简化纯化作用的载体系统或寡核苷酸，所述载体系统或寡核苷酸通过定义的核苷酸序列延伸cDNA并因此编码改变的多肽或融合蛋白。这类的合适修饰是例如所谓的“标签”功能，如锚，例如，已知为六组氨酸锚或表位的修饰，所述表位可以由抗体识别为抗原(例如在Harlow,E.和Lane,D.,1988,Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)。这些锚可以起到将蛋白质与可以例如填充于层析柱中的固态载体(例如聚合物基质)连接的作用或可以在微量滴定板上或在某种其他载体上使用。

与此同时，这些锚也可以用于蛋白质的识别。对于蛋白质的识别，还可以单独地或与锚组合地使用常规标志物，如荧光染料、与底物反应后形成可检测反应产物的酶标志物或放射性标记用于蛋白质的衍生化。

5.酶固定

本发明的酶在本文所述的方法中可以游离地或固定化地使用。固定化酶理解为固定至惰性载体的酶。合适的载体材料和其上所固定的酶从EP-A-1149849,EP-A-1 069 183和DE-OS 100193773和从其中引用的参考文献已知。参考这些文献的完整相关公开内容。合适载体材料例如包括粘土、粘土矿物质如高岭石、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换材料、合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨酯、聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。为了产生支持的酶，载体材料通常以精细分开的粒状形式使用，优选多孔形式。载体材料的粒度通常不大于5mm，尤其不大于2mm(粒度分布曲线)。类似地，当使用脱氢酶作为完整细胞催化剂时，可以选择游离形式或固定化形式。载体材料例如是藻酸钙和角叉菜胶。酶和细胞也可以用戊二醛直接交联(交联至CLEA)。相应的和其他的固定技术例如在J.Lalonde和A.Margolin"Immobilization of enzymes"引自K.Drauz和H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,第III卷,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim中描述。关于实施本发明方法的生物转化法和生物反应器的其他信息还例如在Rehm等人(编著)Biotechnology，第2版，第3卷，第17章，VCH，Weinheim中给出。

6.腈的生物催化产生

本发明用于从相应肟产生腈的生物催化方法在醛肟脱水酶、尤其脂族醛肟脱水酶(4.99.1.5)、苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)(EC4.99.1.7)或吲哚乙醛肟脱水酶(4.99.1.6)存在下实施。所述酶的例子包含根据SEQ ID NO:1或4至28的至少一个氨基酸序列或与这个序列至少60％同一的氨基酸序列，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一；或其中多达25％，例如多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的氨基酸残基相对于根据SEQ ID NO:1或4至28的序列之一因添加、缺失、插入、置换、倒位或它们的组合而改变，并且其仍具有SEQ IDNO:1的至少50％，例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％酶活性。

具体而言，本发明的方法在酶存在下实施，其中所述酶具有根据SEQ ID NO:1的蛋白质序列。具体而言，该酶由根据SEQ ID NO:2的核酸序列或其功能等同物、尤其根据SEQID NO:3的功能等同物编码，所述核酸序列代表为了在大肠杆菌微生物中表达而密码子优化的核酸序列。另外，该核酸序列尤其是基因构建体或载体的组件。这些基因构建体或载体在本文中明确提及的国际申请PCT/EP 2010/057696中第16至20页上详述。

还将含有基因构建体或载体(含有编码具有所需活性的酶的核酸序列)的宿主细胞称为转基因生物。所述转基因生物的产生原则上是已知的并且在本文中明确提及的国际申请PCT/EP2010/057696中第20页上讨论。

优选选自细菌、蓝细菌(Cyanobacteria)、真菌和酵母的细胞作为转基因生物。优选地，细胞选自毕赤酵母属(Pichia)的真菌或埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、红杆菌属(Rhodobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、乳杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)的细菌。特别优选地，细胞选自如下物种的细菌：大肠杆菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荚壳伯克霍尔德菌(Burkholderiaglumae)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。

优选下述本发明的方法，其特征在于具有醛肟脱水酶活性、尤其脂族醛肟脱水酶(EC4.99.1.5)、苯基乙醛肟脱水酶(本文中也称为PAOx)(EC4.99.1.7)或吲哚乙醛肟脱水酶(EC4.99.1.6)活性的酶由分离自下述微生物的基因编码，所述微生物选自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弗兰克菌属物种(Frankia spec)、天蓝色链霉菌、巴斯德醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)和犁头霉属物种(Absidia sp.)，如伞枝犁头霉(A.corymbifera)；农杆菌属物种，如放射形农杆菌(A.radiobacter)；产碱杆菌物种(Alcaligenes sp.)，如粪产碱杆菌(A.faecalis)；节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)，如成晶节杆菌(A.crystallopoietes)或分枝节杆菌(A.ramosus)；曲霉属物种(Aspergillus sp.)，如阿姆斯特丹曲霉(A.amstelodami)、A.celluosae；亮白曲霉(A.candidus)或粉状曲霉(A.pulverulentus)；金杆菌属物种(Aureobacterium sp.)，如A.testaceum；短梗霉属(Aureobasidium sp.)，如茁芽短梗霉(A.pullulans)；芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)，如凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、芽孢杆菌属OxB-1或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；葡萄孢盘菌属物种(Botryotinia sp.)，如富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)；短杆菌物种(Brevibacterium sp.)，如B.butanicum；纤维单胞菌属物种(Cellulomonas sp.)，如粪碱纤维单胞菌(C.fimi)；鬼伞物种(Coprinus sp.)，如疣孢鬼伞(C.phlyctidosporus)；棒状杆菌属物种(Corynebacterium sp.)，如稍变棒状杆菌(C.paurometabolum)或C.rathavi；小克银汉霉属物种(Cunninghamella sp.)，如刺孢小克银汉霉雅致变种(C.echinulatavar.Elegans)；小火焰菌属物种(Flammulina sp.)，如小火焰菌属菌株TPU4675或绒柄金钱菇(F.velutipes)；黄杆菌属物种(Flavobacterium sp.)，如水生黄杆菌(F.aquatile)、浅滕黄黄杆菌(F.lutescens)、F.rigense或F.suaveolens；镰刀菌属物种(Fusarium sp.)，如黄色镰刀菌(F.culmorum)、尖孢镰刀菌烟草专化型(F.oxysporum f.sp.Nicotianae)或茄镰刀菌martii变种(F.solani var.martii)；赤霉属物种(Gibberella sp.)，如藤仓赤霉(Gibberella fujikuori)或玉蜀黍赤霉；嗜皮霉属(Keratinomyces sp.)物种，如K.ajelloi；克雷伯氏菌属物种(Klebsiella sp.)，如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；小球腔菌属物种(Leptosphaeria sp.)，如十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)；微球菌属物种(Micrococcus sp.)；如藤黄微球菌(M.luteus)或脲微球菌(M.ureae)；被孢霉属物种(Mortierella sp.)，如深黄被孢霉(M.isabellina)；拉曼被孢霉Angulispora变种(M.ramanniana var.Angulispora)或被孢霉属物种TPU4801；毛霉属物种(Mucor sp.)，如易脆毛霉(M.Fragilis)；新萨托菌属物种(Neosartorya sp.)如费希新萨托菌(N.fisheri)；诺卡氏菌属物种(Nocardia sp.)，如星形诺卡氏菌(N.asteroides)；须霉属(Phycomyces sp.)物种，如闪光须霉(P.nitens)；变形菌属(Proteus sp.)物种，如普通变形菌(P.vulgaris)；假单胞菌属物种，如绿针假单胞菌(Pseudomonas chloraphis)或荧光假单胞菌(P.fluorescens)；密孔菌物种(Pycnoporus sp.)，如血红密孔菌(P.coccineus)；丝核菌属物种(Rhizoctonia sp.)，如茄丝核菌(Rhizoctonia solani)；根霉属(Rhizopus)，如黑根霉(R.nigricans)或米根霉(R.oryzae)；红球菌属物种(Rhodococcussp.)，如红平红球菌(R.erythropolis)或玫瑰红红球菌(R.rhodochrous)；裂褶菌属物种(Schizophyllum sp.)，如裂褶菌(S.commune)或裂褶菌属物种菌株TPU4435；核盘菌属(Sclerotinia sp.)物种，如核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；蓝状菌属物种(Talaromyces sp.)，如黄蓝状菌(T.flavus)；沙雷菌属(Serratia sp.)物种，如粘质沙雷菌(S.marcescens)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)物种，如嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)；黄单胞菌属物种(Xanthomonas sp.)，如X.flavus。特别优选从红球菌属物种(Rhodococcus sp.)、玉蜀黍赤霉或尤其芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)分离的相关基因，尤其是PAOx基因。

下表1中显示适用于本发明方法情境下或其序列适合作为产生功能等同物的起点的脂肪族乙醛肟脱水酶的例子。登录号指专业数据库REFSEQ和UNIPROT，其中本领域技术人员可以轻易地通过基于互联网的服务以及其他数据库如GeneBank或SwissProt，访问由登录号确定的序列条目。

表1：

下表2中显示适用于本发明方法情境下或其序列适合作为产生功能等同物的起点的苯基乙醛肟脱水酶的例子：

表2：

下表3中显示适用于本发明方法情境下或其序列适合作为产生功能等同物的起点的吲哚乙醛肟脱水酶的例子：

表3：

根据另一个实施方案，该酶具有从表1至3中作为起始序列给出的醛肟脱水酶之一衍生的氨基酸序列并且具有与有关起始序列相比至少60％同一、例如至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。作为酶，所述方法的一个特别优选的实施方案构思了根据SEQ ID NO:1的PAOx(Kato,Y.等人，Biochemistry(2000),39,800-809和Xie,S-X.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2001),65(12),2666-2672)或具有与SEQ ID NO:1至少60％例如至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列的PAOx。

在本发明方法的一个实施方案中，使式II的肟反应，式II中残基R，连同与之结合的碳原子，衍生自非环状萜残基，选自半萜(C₅)、单萜(C₁₀)、倍半萜(C₁₅)、二萜(C₂₀)、二倍半萜(C₂₅)、三萜(C₃₀)或四萜(C₄₀)残基(特别地被部分或完全氢化)，或衍生自缩短1至3个碳原子的相应萜残基。

在所述方法的另一个优选实施方案中，使式II的肟反应，其中n代表1并且残基R代表直链或单次或多重分支的、饱和或单不饱和或多不饱和的、任选地单次或多重取代的具有4至19个碳原子的脂族烃残基。

在本发明方法的具体实施方案中，我们具有通式II的肟，即醛肟，其中n代表1并且肟是选自下表4中显示的化合物，其因与肟基团连接的不同残基R而不同：

表4：

残基R还可以选自表4中的化合物1–6、9和10的类似物，其中残基R氢化。在具体实施方案中，肟选自化合物1(柠檬醛肟)、化合物2(橙花醛肟)、化合物3(香叶醛肟)和化合物10(香茅醛肟)和它们的部分或完全氢化的类似物。具有氢化残基R的化合物的例子是化合物10(香茅醛肟)，其处于氢化形式(即6,7-二氢香茅肟，其在发明方法的情景下反应为6,7-二氢香茅腈)。

在本发明的方法中，在每种情况下具有不同残基R和/或不同指标n的两种或更多种式II肟可以同时存在，从而形成相应式I腈的产物混合物。优选地，然而，确切地使用一种具有相应式II的肟。

根据本发明方法的一个具体实施方案，使用处于立体异构纯形式或作为立体异构混合物，如特别地作为R/S-E/Z混合物的式IIa化合物，使式IIa的香茅醛肟反应为式Ia的香茅腈。

在肟脱水酶、尤其脂族醛肟脱水酶(EC 4.99.1.5)、苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)(EC4.99.1.7)或吲哚乙醛肟脱水酶(EC 4.99.1.6)存在下的本发明反应尤其可以如下发生：

a)在醛肟脱水酶存在下反应

b)在含有醛肟脱水酶的蛋白质混合物存在下反应

c)在功能性表达醛肟脱水酶的重组微生物、从其衍生的含有醛肟脱水酶的细胞匀浆或其含有醛肟脱水酶的级分存在下反应。

优选地，醛肟脱水酶是PAOx，任选地连同其他醛肟脱水酶一起。在重组微生物中表达时，相对于使用的底物，令人惊讶地实现高产率，例如，大于70％的产量和直至基本上定量的产率。尤其地，反应可以甚至在低温进行，例如在15℃-60℃，优选地25℃-45℃，例如在约30℃的温度。

在醛肟脱水酶存在下的反应可以例如涉及

i.游离的，任选地纯化或部分纯化的多肽

ii.固定化的多肽，和/或

iii.从细胞分离的多肽。

在功能性表达醛肟脱水酶的微生物存在下根据前述选项c)的反应中，它们是完整细胞，所述完整细胞可以处于细胞培养的任何阶段，例如休眠或正在生长，并且含有至少一种醛肟脱水酶多肽。

在优选的实施方案中，醛肟脱水酶是PAOx，或除了包含其他醛肟脱水酶之外，还包含PAOx的醛肟脱水酶的混合物。

在本发明方法的情境下，具有醛肟脱水酶活性的酶尤其可以由过量产生该酶的微生物产生。微生物尤其可以是选自如下属的微生物，所述属包括小球腔菌属(Leptosphaeria)，如十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)；丝核菌属(Rhizoctonia)，如茄丝核菌(Rhizoctonia solani)；核盘菌属(Sclerotinia),，如核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)；葡萄孢盘菌属(Botryotinia)，如富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)；假单胞菌属，如绿针假单胞菌(Pseudomonas chloraphis)；红球菌属；赤霉属(Gibberella)，如藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)或玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)；埃希氏菌属、毕赤酵母属、曲霉属、木霉属或芽孢杆菌属，如大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；和酵母属，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。表6含有其它合适微生物的名单，其中，作为所述物种基础的属代表合适的例子。备选地，醛肟脱水酶也可以从作为过量表达生物的植物分离并且可以在本发明方法的情景下以上文给出的选项i)或ii)的意义使用。例如，可以将芭蕉属(Musa)植物(尤其香蕉－尖苞片蕉(M.acuminate))和拟南芥属(Arabidopsis)植物(尤其拟南芥(A.thaliana))视为过量表达的植物。过量表达的微生物或植物可以由本领域技术人员以现有技术中已知的方式通过筛选过量表达的代表进行确定。备选地，过量表达可以通过基因修饰方式强化在表达醛肟脱水酶的微生物或植物中天然存在的基因的表达引起，例如通过插入增加转录的更强启动子。

根据一个具体实施方案，式II肟的反应在功能性表达醛肟脱水酶、优选地PAOx的微生物存在下发生，其中所述微生物是细菌菌株细菌菌株可以例如选自大肠杆菌、恶臭假单胞菌、荚壳伯克霍尔德菌(Burkholderia glumae)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)。根据具体实施方案，细菌菌株是大肠杆菌菌株。微生物特别是已经向其中插入肟脱水酶的异源基因、尤其PAOx基因的重组微生物。

在又一个具体实施方案中，微生物携带表达构建体，所述表达构建体具有编码醛肟脱水酶的核酸序列。该核酸序列可以针对此微生物的密码子选择部分或完全地改造。除非最佳密码子已经存在，否则如此改变全部氨基酸的全部密码子，从而最佳翻译在构思的微生物中发生时，改造是完全的。如果仅所选择的氨基酸的密码子优化，而未优化全部氨基酸的那些密码子，或如果在每种情况下核酸序列内部存在的一个氨基酸的并非全部密码子优化，则认定改造是部分的。

根据本发明方法的另一个优选实施方案，该微生物表达至少一种伴侣蛋白，所述伴侣蛋白支持醛肟脱水酶(它尤其可以是PAOx)的功能性表达。功能性表达可以尤其得到支持表达的肟脱水酶正确折叠、尤其在翻译期间或之后支持其正确折叠的伴侣蛋白支持。通过表达伴侣蛋白，可以有利地增加微生物中有功能的醛肟脱水酶的比例并且可以增加肟至腈的转化。

在本发明方法的情境下，尤其可以构思微生物表达一种或多种选自GroEL和GroES的伴侣蛋白。本领域技术人员还知道其他伴侣蛋白，它们分成5个宽的家族，即Hsp100/Clp家族、Hsp90家族、Hsp70家族(以例如DnaK、DNAJ、Hsc62、Hsc56和GrpE作为大肠杆菌中的代表)、Hsp60/GroEL家族(具有已经提到的GroEL)和小热休克蛋白家族(Hsp20)。伴侣蛋白也可以选自这些蛋白质家族。也可以形成组合，例如从Dank/DnaJ/GrpE复合体、GroEL/ES复合体和触发因子形成，如在例如O'Donnell和Lis,MIT 7.88研究论文,2006中所述那样。伴侣蛋白或伴侣蛋白类可以在使用的微生物中内源地表达，或部分地或完全地由额外引入微生物中的核酸序列表达。可以将这些核酸序列引入微生物的基因组中，例如引入细菌染色体中，或可以在表达构建体上以染色体外方式存在。如果醛肟脱水酶由染色体外的表达构建体表达，例如因为异源肟脱水酶基因待在微生物中表达或因为染色体基因的表达待由染色体外醛肟脱水酶基因的额外表达弥补，则醛肟脱水酶基因和伴侣蛋白基因可以在共同的表达构建体上或在分别的表达构建体上存在。

本发明方法的一个优选实施方案至少包括以下步骤a)、b)和d)：

a)从天然来源分离产生具有醛肟脱水酶活性的酶的微生物或通过重组技术产生它，

b)增殖所述微生物，

c)任选地从微生物分离具有醛肟脱水酶活性的酶或制备含有这种酶的蛋白质级分，和

d)将根据步骤b)的微生物或根据步骤c)的酶转移至含有通式II的肟的介质。

在本发明方法中，使底物(例如香茅醛肟)与培养基中拥有醛肟脱水酶活性的酶接触和/或以如此方式温育，从而底物例如香茅醛肟向香茅腈的反应在该酶存在下发生。优选地，培养基是含水反应介质。

其中优选实施本发明方法的含水反应介质的pH有利地维持在pH 4和12之间，优选地在pH 4.5和9之间，特别优选地在pH 5和8之间。

含水反应介质优选地是缓冲的溶液，其原则上具有优选地从5至8的pH。使用的缓冲剂可以是柠檬酸盐、磷酸盐、TRIS(三(羟甲基)-氨基甲烷)或MES(2-(N-吗啉代)-乙磺酸)缓冲剂。另外，反应介质可以含有其他添加物，例如去垢剂(例如牛磺脱氧胆酸盐)、FMN、离子如金属离子(例如Fe²⁺和Sn²⁺)或阴离子如SO₃ ^2-和叠氮钠。合适反应混合物的详细组成还在如下文献来源中给出：Kato,Y.等人,Biochemistry(2000),39,800-809和Xie,S.-X.等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.(2001),65(12),2666-2672。

底物(例如香茅醛肟)优选地在酶促反应中以2-200mM、特别优选地5-25mM的浓度使用并且可以连续或非连续地补充。但是，反应也可以用纯醛肟(例如香茅醛肟)仅在表达酶如表达PAOx的宿主生物(例如大肠杆菌)存在下实施，如实施例2中所述。

肟至腈的酶促反应原则上在低于所用酶的失活温度和高于-10℃的反应温度进行。优选地，本发明的方法在0℃和95℃之间的温度实施，特别优选地在15℃和60℃之间、尤其在20℃和40℃之间、例如在约25℃至30℃的温度实施。

特别优选如下的本发明方法，其中肟至腈的反应在20℃至40℃的温度范围内和/或在4至10范围内的pH、优选地在pH 8进行。

除这些单相含水体系之外，在本发明的另一个变体中，还使用双相体系。除水相之外，使用有机、非水可溶混性反应介质作为第二相。结果是，反应产物在有机相中积累。在反应后，有机相中的产物，例如柠檬醛腈、橙花醛腈、香叶醛腈或香茅腈，可以从含有生物催化剂的水相容易地分离。

优选这样的本发明方法，其特征在于腈、尤其柠檬醛腈、橙花醛腈、香叶醛腈或香茅腈的产生在单相含水体系中或在双相体系中发生。

反应产物，例如柠檬醛腈、橙花醛腈、香叶醛腈或香茅腈，可以用有机溶剂提取并且可以任选地蒸馏以便纯化。

合适的有机溶剂是例如脂族烃、优选地具有5至8个碳原子的脂族烃，如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷、卤代脂肪族烃、优选地具有一个或两个碳原子的卤代脂肪族烃，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷或四氯乙烷、芳烃，如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯、脂族非环和环状醚或醇、优选地具有4至8个碳原子的脂族非环和环状醚或醇，如乙醇、异丙醇、二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、四氢呋喃或酯类如乙酸乙酯或乙酸正丁酯或酮类如甲基异丁酮或二烷或它们的混合物。特别优选地，使用前述庚烷、甲基叔丁基醚、二异丙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯。

根据本发明使用的醛肟脱水酶可以在本发明方法中作为游离酶或固定化酶使用，如上文已经描述。

对于本发明方法，可以使用静息或正在生长的游离或固定化的细胞，所述细胞含有编码醛肟脱水酶的核酸、核酸构建体或载体。也可以使用裂解的细胞，如细胞裂解物或细胞匀浆。裂解的细胞例如是已经通过例如用溶剂处理变得可透过的细胞，或已经通过酶处理、通过机械处理(例如法式压碎器或超声法)或通过其他方法被破坏的细胞。所得到的粗提取物有利地适用于本发明的方法。纯化或部分纯化的酶也可以用于该方法。

如果游离的生物或酶用于本发明的方法，优选地在提取之前分离它们，例如通过过滤或离心。

本发明的方法可以分批、半分批或连续地运行。

实验部分

如果在以下实施例中未提供具体信息，则适用以下一般信息。

A.一般信息：

使用的全部材料和微生物均是可商业获得的或从种质培养物保藏中心可获得的产品。

除非另外声明，否则通过标准方法实施重组蛋白的克隆和表达，如在例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989中所述那样。

a)细菌菌株、质粒和生长条件

全部实验均用大肠杆菌实施。大肠杆菌TG10是无鼠李糖异构酶的TG1衍生物，用于PAOx的表达。

b)气相色谱

测量仪器：Agilent 6890N

柱：Optima 5 Accent，长度＝30m，内径＝0.25mm，外径＝0.4mm，膜厚度0.25μm

来自Macherey&Nagel#725820.30

流速：以13.5 PSI 1.0ml/分钟(炉温度80℃)

分流比：1:50，分流流速：50ml/分钟，隔膜清洗3ml/分钟(炉温度80℃)

载气：氦气

进样器：分流/不分流，Split Liner siltec失活(Restec #20713-214.5)

进样器温度：280℃

进样量：1μl

检测器：FID，300ml/分钟空气，30ml/分钟氢和30ml/分钟补足气体(氦)

检测器温度：320℃

温度程序：

开始： 60℃

停留时间1： 0分钟

温度斜度1： 15℃/分钟

最终温度1： 320℃

停留时间2： 5分钟

总运行时间： 22.3分钟

评价：Empower-2-软件，根据面积-％

B.实施例

实施例1：PAOx在大肠杆菌中的表达

在本实施例中，来自芽孢杆菌属菌株OxB-1的苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)基因的密码子选择为在大肠杆菌中表达而优化。合成了新DNA序列并将其克隆到鼠李糖诱导型表达载体pDHE中。将产生可溶性PAOx所需要的GroEL/S伴侣蛋白克隆至IPTG可诱导的pAgro或pHSG载体中。PAOx的表达在大肠杆菌TG10(无鼠李糖异构酶的TG1衍生物)中进行。将含有pAgro和pHSG(TG10+)的TG10细胞用pDHE-PAOx转化并且在2xYT中在37℃在氨苄青霉素(pDHE)、壮观霉素(pAgro)和氯霉素(pHSG)存在下培育5小时。将5mL这种培养物转移至含有100μM IPTG和0.5g/L鼠李糖的500mL相同培养基中。在30℃进行诱导约18小时。通过离心收获细胞并使用它们作为香茅醛肟转化成香茅腈的催化剂。任选地，细胞贮存在-20℃直至使用。

实施例2：香茅醛肟由PAOx转化成香茅腈

如下实施酶促香茅醛肟转化成相应腈：将50mL外消旋R/S-E/Z香茅醛肟与12.5g表达苯基乙醛肟脱水酶(PAOx)的大肠杆菌TG10混合。将反应混合物在30℃温育，伴以搅拌。在18小时和90小时后取得反应混合物的样品(0.1mL)并与0.5mL正庚烷混合。通过气相色谱(GC)分析有机相。在Agilent 6890N上进行GC分析(柱：Optima 5 Accent，Macherey &Nagel；流速：以13.5 PSI 1mL/分钟，上样温度：280℃；检测温度：320℃；检测器：FID；香茅醛肟保留时间：7.816分钟与8.018分钟；香茅腈保留时间：6.765分钟)。在90小时后，外消旋R/S-E/Z香茅醛肟已经定量地转化成相应的腈。图1中显示发生的反应。图2A、图2B和图2C中显示在转化之前、期间和之后相应的气体色谱图。表5中显示反应的粗略时程，给出气体色谱图的峰面积百分数。

表5

时间[小时]

香茅醛肟

香茅腈

0	100.00	0.00
			18	50.03	49.97
90	0.03	99.97

表6-序列数据：

NA：核酸；AA：氨基酸

以下是根据表6的一系列可用序列，所述序列可以直接用于本发明的方法或可以用作起始序列，任选地，还处于用于产生功能等同物的编码性核酸序列形式，所述功能等同物随后可以用于本发明的方法中。登录号指专业数据库，例如NCBI(国家生物技术信息中心)、GeneBank或SwissProt。

SEQ ID NO:1；登录号：BAA90461；P82604(UniProtKB/Swiss-Prot)

MKNMPENHNPQANAWTAEFPPEMSYVVFAQIGIQSKSLDHAAEHLGMMKKSFDLRTGPKHVDRALHQGADGYQDSIFLAYWDEPETFKSWVADPEVQKWWSGKKIDENSPIGYWSEVTTIPIDHFETLHSGENYDNGVSHFVPIKHTEVHEYWGAMRDRMPVSASSDLESPLGLQLPEPIVRESFGKRLKVTAPDNICLIRTAQNWSKCGSGERETYIGLVEPTLIKANTFLRENASETGCISSKLVYEQTHDGEIVDKSCVIGYYLSMGHLERWTHDHPTHKAIYGTFYEMLKRHDFKTELALWHEVSVLQSKDIELIYVNCHPSTGFLPFFEVTEIQEPLLKSPSVRIQ

SEQ ID NO:2；登录号：AB028892(NCBI)

ttgaaaaatatgccggaaaatcacaatccacaagcgaatgcctggactgccgaatttcctcctgaaatgagctatgtagtatttgcgcagattgggattcaaagcaagtctttggatcacgcagcggaacatttgggaatgatgaaaaagagtttcgatttgcggacaggccccaaacatgtggatcgagccttgcatcaaggagccgatggataccaagattccatctttttagcctactgggatgagcctgaaacatttaaatcatgggttgcggatcctgaagtacaaaagtggtggtcgggtaaaaaaatcgatgaaaatagtccaatcgggtattggagtgaggtaacgaccattccgattgatcactttgagactcttcattccggagaaaattacgataatggggtttcacactttgtaccgatcaagcatacagaagtccatgaatattggggagcaatgcgcgaccgcatgccggtgtctgccagtagtgatttggaaagcccccttggccttcaattaccggaacccattgtccgggagtctttcggaaaacggctaaaagtcacggcgccggataatatttgcttgattcgaaccgctcaaaattggtctaaatgtggtagcggggaaagggaaacgtatataggactagtggaaccgaccctcataaaagcgaatacgtttcttcgtgaaaatgctagtgaaacaggctgtattagttcaaaattagtctatgaacagacccatgacggcgaaatagtagataaatcatgtgtcatcggatattatctctccatggggcatcttgaacgctggacgcatgatcatccaacacataaagcgatctacggaaccttttatgagatgttgaaaaggcatgattttaagaccgaacttgctttatggcacgaggtttcggtgcttcaatccaaagatatcgagcttatctatgtcaactgccatccgagtactggatttcttccattctttgaagtgacagaaattcaagagcctttactgaaaagccctagcgtcaggatccagtga

SEQ ID NO:3；

atgaaaaacatgccagaaaaccacaacccgcaggctaacgcctggactgcagaattcccgccagagatgtcttacgttgtcttcgcgcagattggcatccagtctaaaagcctggatcatgcagccgaacatctgggcatgatgaaaaaatctttcgacctccgtactggtccaaaacacgttgatcgcgcactgcaccagggtgctgatggctatcaggactctatcttcctggcctactgggacgaaccagaaaccttcaaaagctgggttgcagacccagaagtgcagaaatggtggagcggtaaaaaaatcgatgaaaacagcccgatcggctattggtctgaggttaccactatcccgattgaccacttcgagaccctgcactctggtgagaactatgacaacggcgtttcccacttcgtgccgatcaaacataccgaagtgcacgaatactggggtgctatgcgtgatcgtatgccggtgtctgcttcttccgatctggaaagcccgctgggtctccagctgccagaaccgatcgtacgtgagagctttggtaaacgcctgaaagttaccgctccagacaacatctgcctgattcgtaccgcacagaactggtccaaatgtggttctggtgaacgcgaaacctacattggcctggtcgaaccgactctgatcaaagcgaacaccttcctgcgtgaaaacgcgtctgagaccggttgcattagctctaaactggtttacgagcagacccatgatggcgaaatcgtagataaatcctgtgtaatcggctactatctgtccatgggtcatctggaacgctggactcacgaccacccaactcacaaagcgatttacggcacgttctacgaaatgctgaaacgtcacgactttaaaacggaactggcgctgtggcacgaagtaagcgttctgcagtctaaagacatcgagctgatctatgtcaactgccacccatccacgggttttctgccgttctttgaagtgaccgaaatccaggaaccactgctgaaatccccatccgtgcgtattcagtga

SEQ ID NO:4，登录号s:NCBI:YP_947647.1，GenBank：ABM07831.1

MAPDPSRQDPAIESSIPRHFTVKRTRPKRAGAGYAPPYPSYSVRFAEGVSNLVCAFLGVQSRAPLSHEAKVASAGMWELCANEDGPMSREHAVHTDEQGFDNQVIIAYWDDVDAYGRWFKKHRDALIGAGLEPSDYGRWIEAVTPEARGFETLYSSNTFPEGAARMATGGFTGEIQEHGYWGSMRDRLPIAQTDALEPVGDPVVPRNPGIVRVEPHDNLAVIRSGQDWSLCDDAERASYFSHVEPQLKAGMDFLTTEGASIGCYANRYMTSSDGNGNVLEQSFGLSFWHSLEDMERWAESHPTHVAIFRSAMTFLQANAGARLRLSHEVAVVSRDQQYYEYNNCHAGTGMLGARRPLGTATPGTRI

SEQ ID NO:5；登录号：NCBI:YP_046290.1；GenBank：CAG68468.1

MESAIDKHLKCPRTLSRRIHDEYEPPFAMWVARADESLQQVVMAYFGVQFKSEQKAIALKAMQHIVQSFSLDNGPQNHDITHHTDNQGYENYIVVGYWRDPGAYCRWFRSTEVSHWWDSDERLNDGIGYFREIVIPRADQFETLYAFKEDLPGVGAVMDDISDDIQEHGYWGSARERFPISQTDRMLANGELHIISGDPEKGGRVLVQGHDNITLIRSGQDWVNADEKERELYFNEMLPSLQAGMDFLRDEGQALGCYSNRFVRNVDIDGNLLDIAYDIGYWRSLDKLERWAESHPTHLRIFTTFFKVVTGLQNLRLYHEVSVSDAKNQVFEYINCHPQTGMMRDAQMT

SEQ ID NO:6；登录号：F0QD95_ACIAP(UniProtKB/TrEMBL)

MESAIPPRLQCPRSLSRRVADDYQPPFPMWVARPQADLQQVVMAYFGIQYQGEAQKPRALAVLREWVAAFGAPDGPLRHDLTHHIDAQGYDNLIAVGYWRDPEAHRRWMQAPAQAGWWNAPERLQEGLGYFREVSAPRAEQFETLYAFQDALPGVGGVMESTSGDIQEHGYWGSMRDRFPASQVDRMQARGTLLIAEGDPAHGGRVVVRGHDNIALIRSGQDWMEAEAEERRLYLEDIEPTLHAGMDFLRDQGAAVGCYSNRYVHNIDLDGRRLDQSYNIGHWRSVDLLERWAESHPTHLRIFGTFFKVAAGLSKLRLYHEVSVSDAASQHFEYIQCHPATGMMRDARLQAPA

SEQ ID NO:7，登录号：YP_003097901.1(NCBI)

MSSLPLDDRATAHRPEGYDPRGGPGHEVRWSDDVTHLVVARFGVQTDDSAAGVKAIARVLELAAGESGPALVERVSDDDSEMAVCYWPDPEAHRAWWASGPVRDWWASLPVDGPIGHWHETSVTPVEQFETLYSAEFAAGPSRFAGTGPTNLHDYDNSTLDRMPATAHRDLRQERAEEPTTDLPPGESPRGRRVRLAEPSPSGLCWIRTAQEWSIAPDDQLASYRDGVEPAYRTAIAHLQDNPHDTGCLSARLVGNLDANGARAAGAEAVVWWRGIGDLLRWAHDHKTHQDILNGFWEHVIAKFGPGTRVRLWHEVHVLPEGALTAEYVNCHPGTGLLQTWPG

SEQ ID NO:8，登录号：YP_001240697(NCBI)

MESAIPPHLITTRCRHRRVDDDYKPPYPSFVARHGADVSRVVMAYFGVQYRAETPAAASTADFMVLVSRADGPSHWDLAHYVDQAGFANDVFVAYWDDVVRFDSWFEPARAAWTGPGAEGGGRFIEVLRPAVERYETLFSSLGRPEGIAVIAEGMSGEVLEHAYWGGMRDRIPLSQTSEMRSLGKPTLVQDGPRLRVIAQDNLCMIRSGQDWSDTDAAERRMYLDDVEPVLREGMDFLRDQGLSIGCYANRYMRLRGADGALTEKSYGQSWWQSLSALERWAESHPTHVRIFGAAMKYLSSLGPAARLRLYHEVTVAAADEQFFEYRGCHAKTGMLAAAG

SEQ ID NO:9，登录号：ZP_02891657(NCBI)

MESAIDKHLVCPRTLSRRVADDYQPPFPMYVARASEDLSQVVMGYFGVQYRGADQRSAALAALRRIVADFDAPDGPGNHDLTQHTDNQGYDNLIAVGYWRDPDAYARWIASPAVAEWWTSDARLADGIGYFREIVAPRAEQFETLYAFTADFPGVGAIMDGVSGEIEEHGYWGSMRDRFPISQTDWMHADGELRIVAGDPARGGRVVVLAHDNIALIRSGQDWRAAQDDERRLYLDEIEPTLRSGMEFLRDNGVDVGCYSNRYVRSIDLDGNLLDESYNIGHWRSLDRLERWAESHPTHLRIFVTFFRVVTGLSKLRLYHEVSVFDAKHQVYEYVNCHPNTGMMRDAVAR

SEQ ID NO:10；登录号：ACB68693(GenBank)，YP_001816246(NCBI)

MESAIDKHLVCPRTLSRRVADDYQPPFPMYVARAAEDLSQVVMGYFGVQYRGADKRSVALAALRRIVADFDAPDGPGNHDLTQHTDNQGYDNLIAVGYWRDPDAYARWIASPAVAEWWASDARLADGIGYFREIVAPRAEQFETLYAFTNDFPGVGSIMDGVSGEIEEHGYWGSMRDRFPISQTDWMHADGELRIVAGDPARGGRVVVLAHDNIALIRSGQDWRAAEDDERRLYLDEIEPTLRSGMEFLRDNGVDVGCYSNRYVRSIDLDGNLLDESYNIGHWRSLDRLERWAESHPTHLRIFVTFFRVVTGLSKLRLYHEVSVFDAKHQVYEYVNCHPTTGMMRDAAAR

SEQ ID NO:11，登录号：YP_001776877(NCBI)

MESAIDKHLICPRTLSRRVADDYQPPFPMYVARAAEDLSQVVMGYFGVQYSGADKRAAAMAALRRIVADFGGQDGPNNFDLTQHTDDEGYENLIAVGYWRDPAAYARWIASPALVEWWASDARLADGIGYFREIVAPRAEQFETLYAFTSDFPGVGAIMDGVSGEIEEHGYWGSMRDRFPISQTDWMNANGELRIVDGDPARGGRVVVLAHDNIALIRSGQDWRAAESDERRLYLEEIEPTLRSGMEFLRDNGKDVGCYSNRYVRSIDLDGNVLDESYNIGHWRSLDRLERWAESHPTHLRIFVTFFRVVTGLSKLRLYHEVSVFDAKHQVYEYVNCHPRTGLMRDAVAIAR

SEQ ID NO:12，登录号：YP_004119277(NCBI)

MESAIDTHLKCPRTLSRRVHDDYQPPFPMFAGRADASLTQVVMAYLGVQFREEQRAAAITAMQHIVRSFSLDNGPGNHDVTFHTDNQGFGNFIVVGYWRDPAAYCRWLHQPAITGWWSSDDRLRDGLGYFREIIAPRAEQFETLYAFKEALPGVGAVMDNLSGEIQEHGYWGSVRDRIPASQTDWLQPDGELRIISGDPAAGGRVVVQGHDNITLIRSGQDWMDADEQERALYFTEMLPPLQAGMDFLRDEGQTLGCYSNRFVRNVDIDGNVLDIAYDIGFWRSLDRLERWAESHPTHLRIFTTFFRVVAGLQKLRLYHEVSVSDARFQTFEYINCHPQTGMLRDAVR

SEQ ID NO:13，登录号：ZP_07774756(NCBI)

MKPTTELQVVAGDPAKGGRVVVMGHDNLTLIRSGQDWADAEADERSLYLDEILPTLQDGMDFLRDNGQPLGCYSNRFVRNIDLDGNFLDVSYNIGHWRSVEKLERWAESHPTHLRIFVTFFRVAAGLKKLRLYHEVSVSDAKSQLFEYINCHPHTGMLRDAQAATA

SEQ ID NO:14:，登录号：ZP_07774757(NCBI)

MESAIDTHLKCPRTLSRRVPDEYQPPFPMWVARADEQLEQVVMAYLGVQYRGEAQREAALQAMRHIVGSFSLADGPQTHDLTHHTDSSGFDNLIVVGYWKDPGAHCRWLRSAPVNDWWASQDRLSDGLGYFREISAPRAEQFETLYAFQDNLPGVGAVMDATSGEIENTVTGARCATASPSPRQTG

SEQ ID NO:15；登录号：YP_001268042(NCBI)

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SEQ ID NO.16，登录号：E4RFH2_PSEPB(UniProtKB/TrEMBL)

MESAIDKHLMCPRTLSRRVPDDYQPPFPMWVGRADEQLTQVVMAYLGVQYRGDSQRERALQAMREILGSFSLSDGPLTHDLTHHTDSSGYDNLMIVGYWKDTGAYCRWSRSPEVDGWWSSPQRLNDGLGYYREITAPRAEQFETLYAFQSDLPGVGAIMDNTSGEIEEHGYWGSMRDRFPVSQTDWMNPNGELRVVAGDPAKGGRVVVIGHDNIALIRSGQDWAAAEAAERSLYLDEILPTLQDGMDFLRDNGQPLGCYSNRFVRNIDADGNVLDMSYNIGHWRSLEKLERWAESHPTHLRIFVTFFRVAAGLEKLRLYHEVSVSDASSQVFEYINCHPHTGMLRDAKVSSN

SEQ ID NO:17，登录号：YP_001758607(NCBI)

MMNNMPKNWTPPAPAWTSLWKTDEENLVCGLFAIQGQHSAPLDDWAKKAFTGEFSPKLLEQGMFTDKAGITNYLYIAYWFASDYKTWWQQSAANSWWASPLLDEGDISVWREVFTMPHQRFETLHSSENAHGAARLSPSLEGPMMEHGYSGAARDRIPCSSSQDIKNDNSIWEHLQVNVENKSNRIKLSPPKNMCVIRSGQDWTHCEEDEKEYYLTNVHTVLKKGMDYLSNNPVKTHCASMRFITKTDGNWCSVEQTFGLGYGNDIYAFENWAKSHPTHIAIFDRFMGMVEKYNVDLKLQLWHEVTLIPEQDCEFEYINCHGQTGLLCYINI

SEQ ID NO:18，登录号：YP_001261493(NCBI)

MDSSITPHLACPRSRPRRIADDYAPPYPAWSARIDPAIGQVVMASYGVQGRESGDVAAALAHVRALRATLDADVRHVDLARYVDEAGYDTLVLQPYWTDPEAFRRWEARADVAALLAAETGLGHFREILTPTVERLETLYSTEDEMEGLGRALERRSPPVQEHAYWGSARDRFPIAQTDALEPAGQLGFAADGAGRVTVRGHDNIAIIRSGQDWGPTGGEERRLYLAEIEPVLRAGMDFLRDRGGECGCYLNRYMRIVDMDGAPQEKSFGWSYWRSLGDMENWSEAHPSHLAIFGTFMRIVQQLNFDLKLRLWHEVYVVTPDQQLYDYRNCHPDTGFLKQMPR

SEQ ID NO:19，登录号：YP_004155682(NCIB)

MESAIAEHLKCPRTRHRRVEDDYTPPYPVWSARAPTSVTQVTMGYFGVQSRGPEMQGRACAALMKIARDFALPDGPGHHDLAHYVDADGFDNMVAIAYWHDAAAFARWSATPAIDAWWRSDERLNEGLGYFREIASPRVEHFETMFNTPDRFEGIGVVMGELSGELQEHGYWGSMRDRIPLSQTDALSPSGTRAVVAGTPAPGQRVRIAGHENIAMIRSGQEWADTTGQERTLYLEDMEPVLREGMDFLRDQGLGIGCYSNRYMHHLDAKGAPLQKSFGLSYWRSLADMERWAESHPTHVAIFGSFMRYVQALNFQLQLRVYHEVSVLKADEQSYEYINCRARSGLMNGLAVT

SEQ ID NO:20，登录号YP_002942593(NCBI)

MESRDADARALLARVANTFAGVGGPASLGRGVATGAGGERSDIFYAYWNSSAEYASWLTTPRVASLWTDDALLRGPIGLWRESMIIPVERNETNYSNDAAYDGIAQIDKEMRKTDVHGYWGSARERIPASAHDTMPSAAPDFMGRPAASMETLGRRFRITLPGNTCVIRSFQDWSQAQAAEVDWYLGNVEPVLRVGLDYLNGNRTEAKCYGMRYIREYDISGAIDLNRTSTFGYFESLQTLERWTHTHPTHLDIFRAAISMVQRFQGEVAVKLGHEVSVLPEGMLSAEYVNCARSTGFLPWFHED

SEQ ID NO:21，登录号：YP_002944432

MESAIAEHLKCPRTRHRRVEDDYAPPYPAWSARAPGAVRQVVMGYFGVQSRGAGMQGRACAALMKIAAGFALPDGPGHHDFAHHVDAAGCDNMVAIAYWNDPAAHARWCTAPEVDAWWRSDERLADGLGYFREIVAPRAEHFETMFNTPDRLEGVGVVMGGVSGELQEHGYWGSMRDRIPLSQTDAMAPSGTRAVIAGAPAPGQRVRIAGHENIAMIRSGQEWADTTGQERALYLGEMEPVLREGMDFLRDQGLHIGCYSNRYMQHLDAKGAPLEKSFGLSFWHSLADMERWAESHPTHVAIFGSFMRYVQALNFQLQLRVYHEVSVLKADEQSYEYINCHAGSGLMNGLGEV

SEQ ID NO:22，登录号：YP_001416464

MVFHVEYPRIVPERRPPGHEPAAPRFSLRWEQPVGLVVCAYFGLQGQDLAWDEQKAFFDRLQTSFGTDGPVAHEIMRMHDETGAVNAILVAYWLDATAHARWERNSPFMAWFRDPARLEGTRGVWRETMHVPYDRHETIYSTPSYVIGLARTPGATRVPITTNGYFGAMRDRMPVSAIDTLESPLGAMPPRRAPDSHGRRLTAAFPLNLISIRSGQYWEGAGNEQTADYIDNLQPKLMRGMAHLSSHPEQTGTLTLRIMTNLDAEGRPRAETSVHGYFLSMAHLEEWSRSHETHLDIYRHAIAMNRLYKEKREVFTWHEVFALLPGAHAEYANCHGGTGLLPYFADA

SEQ ID NO:23；登录号：Q2WG72(NCBI，SwissProt)

MLRSRFPASHHFTVSVFGCQYHSEAPSVEKTELIGRFDKLIDSAAIHVEHLEQNDVPSKIWMSYWESPQKFKQWWEKDDTASFWASLPDDAGFWRETFSLPATRAMYEGTGKDAYGFGHCGSLIPLTTKTGYWGAYRSRMTPDFEGDTFSSPIPTYADQSVPADKIRPGRVRITDFPDNLCMVVEGQHYADMGEREREYWNENFDGLTKQWVTNVVTAGHEQGMVIARACHGFAGEKKLGATNGPVNGIFPGLDYVHQAQILIWQDISKMEHIGRYDQTHVKLRRDFMKAYGPGGEMEGGDLLLWVDLGILKKDEIDAEYVGCYESTGFLKLDKGQFFKVESTAGSKLPSFFDEPIESKPIEW

SEQ ID NO:24，登录号：Q7WSJ4(NCBI，SwissProt)

MESAIDTHLKCPRTLSRRVPEEYQPPFPMWVARADEQLQQVVMGYLGVQYRGEAQREAALQAMRHIVSSFSLPDGPQTHDLTHHTDSSGFDNLMVVGYWKDPAAHCRWLRSAEVNDWWTSQDRLGEGLGYFREISAPRAEQFETLYAFQDNLPGVGAVMDSTSGEIEEHGYWGSMRDRFPISQTDWMKPTNELQVVAGDPAKGGRVVIMGHDNIALIRSGQDWADAEAEERSLYLDEILPTLQDGMDFLRDNGQPLGCYSNRFVRNIDLDGNFLDVSYNIGHWRSLEKLERWAESHPTHLRIFVTFFRVAAGLKKLRLYHEVSVSDAKSQVFEYINCHPHTGMLRDAVVAPT

SEQ ID NO:25，登录号：Q4W7T3(NCBI，SwissProt)

MESAIDTHLKCPRTLSRRVPDEYQPPFAMWMARADEHLEQVVMAYFGVQYRGEAQRAAALQAMRHIVESFSLADGPQTHDLTHHTDNSGFDNLIVVGYWKDPAAHCRWLRSAPVNAWWASEDRLNDGLGYFREISAPRAEQFETLYAFQDNLPGVGAVMDRISGEIEEHGYWGSMRDRFPISQTDWMKPTSELQVIAGDPAKGGRVVVLGHGNLTLIRSGQDWADAEAEERSLYLDEILPTLQDGMDFLRDNGQPLGCYSNRFVRNIDLDGNFLDVSYNIGHWRSVEKLERWTESHPTHLRIFVTFFRVAAGLKKLRLYHEVSVSDAKSQIFGYINCHPQTGMLRDAQVSPA

SEQ ID NO:26，登录号：Q76K71(NCBI，SwissProt)

MESAIGEHLQCPRTLTRRVPDTYTPPFPMWVGRADDALQQVVMGYLGVQFRDEDQRPAALQAMRDIVAGFDLPDGPAHHDLTHHIDNQGYENLIVVGYWKDVSSQHRWSTSTPIASWWESEDRLSDGLGFFREIVAPRAEQFETLYAFQEDLPGVGAVMDGISGEINEHGYWGSMRERFPISQTDWMQASGELRVIAGDPAVGGRVVVRGHDNIALIRSGQDWADAEADERSLYLDEILPTLQSGMDFLRDNGPAVGCYSNRFVRNIDIDGNFLDLSYNIGHWASLDQLERWSESHPTHLRIFTTFFRVAAGLSKLRLYHEVSVFDAADQLYEYINCHPGTGMLRDAVTIAEH

SEQ ID NO:27，登录号：Q76EV4(NCBI，SwissProt)

MESAIGEHLQCPRTLTRRVPDTYTPPFPMWVGRADDTLHQVVMGYLGVQFRGEDQRPAALRAMRDIVAGFDLPDGPAHHDLTHHIDNQGYENLIVVGYWKDVSSQHRWSTSPPVSSWWESEDRLSDGLGFFREIVAPRAEQFETLYAFQDDLPGVGAVMDGVSGEINEHGYWGSMRERFPISQTDWMQASGELRVVAGDPAVGGRVVVRGHDNIALIRSGQDWADAEADERSLYLDEILPTLQSGMDFLRDNGPAVGCYSNRFVRNIDIDGNFLDLSYNIGHWASLDQLERWSESHPTHLRIFTTFFRVAEGLSKLRLYHEVSVFDAADQLYEYINCHPGTGMLRDAVITAEH

SEQ ID NO:28，登录号：O49342(NCBI，SwissProt)

MEMILSISLCLTTLITLLLLRRFLKRTATKVNLPPSPWRLPVIGNLHQLSLHPHRSLRSLSLRYGPLMLLHFGRVPILVVSSGEAAQEVLKTHDHKFANRPRSKAVHGLMNGGRDVVFAPYGEYWRQMKSVCILNLLTNKMVESFEKVREDEVNAMIEKLEKASSSSSSENLSELFITLPSDVTSRVALGRKHSEDETARDLKKRVRQIMELLGEFPIGEYVPILAWIDGIRGFNNKIKEVSRGFSDLMDKVVQEHLEASNDKADFVDILLSIEKDKNSGFQVQRNDIKFMILDMFIGGTSTTSTLLEWTMTELIRSPKSMKKLQDEIRSTIRPHGSYIKEKEVENMKYLKAVIKEVLRLHPSLPMILPRLLSEDVKVKGYNIAAGTEVIINAWAIQRDTAIWGPDAEEFKPERHLDSGLDYHGKNLNYIPFGSGRRICPGINLALGLAEVTVANLVGRFDWRVEAGPNGDQPDLTEAIGIDVCRKFPLIAFPSSVV

明确引用本文中提到的出版物的公开内容。

Claims (12)

1.用于产生腈的生物催化方法

其中

a)将肟在EC4.99.1.5的脂族醛肟脱水酶或EC4.99.1.7的苯基乙醛肟脱水酶存在下转化成腈，其中苯基乙醛肟脱水酶的缩写是PAOx，

其中肟选自柠檬醛肟、橙花醛肟、香叶醛肟、香茅醛肟、和它们的部分或完全氢化的类似物，其中所述肟处于立体异构纯形式或作为立体异构体的混合物，

其中腈处于立体异构纯形式或作为立体异构体的混合物，和

b)任选地，然后进一步纯化反应产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中PAOx是来自红球菌属物种(Rhodococcus sp.)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)或芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中PAOx是SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与这个序列至少90％同一的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其中PAOx是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中式IIa的香茅醛肟

转化成式Ia的香茅腈

其中式IIa的化合物以立体异构纯形式或作为立体异构混合物使用。

6.根据权利要求1所述的方法，其中反应在PAOx、含有PAOx的蛋白质混合物存在下或在功能性表达PAOx的重组微生物、从其衍生的含有PAOx的细胞匀浆或其含有PAOx的级分存在下酶促地进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其中PAOx或功能性表达PAOx的微生物在反应混合物中以游离形式或以固定化形式存在。

8.根据权利要求6所述的方法，其中重组微生物是功能性表达PAOx的细菌菌株。

9.根据权利要求8所述的方法，其中重组微生物携带具有编码PAOx的核酸序列的表达构建体，所述核酸序列任选地适应于所述微生物的密码子选择。

10.根据权利要求6所述的方法，其中微生物额外地表达至少一种支持PAOx功能性表达的伴侣蛋白。

11.根据权利要求10所述的方法，其中重组微生物是除了表达PAOx之外还表达一种或多种选自GroEL和GroES的伴侣蛋白的细菌菌株。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在作为反应介质的底物中实施反应。