CN113388600B

CN113388600B - 一种醛肟脱水酶及其在催化合成芳香腈类化合物中的应用

Info

Publication number: CN113388600B
Application number: CN202110676578.9A
Authority: CN
Inventors: 裴晓林; 陈芝吉; 郑浩腾; 肖勤洁; 毛斐滢
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2021-06-16
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2041-06-16
Also published as: CN113388600A

Abstract

本发明公开了一种醛肟脱水酶及其在催化合成芳香腈类化合物中的应用，属于生物催化研究领域。本发明将来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida F1的醛肟脱水酶基因插入到表达载体中，构建重组表达质粒；再将其导入宿主细胞构建基因工程菌，可实现醛肟脱水酶的高效共表达。通过上述工程菌的催化作用，可实现从醛肟化合物到芳香腈高效生产的目的。该醛肟脱水酶表现出良好的催化稳定性、高催化活力等优点，有望成为生物法制备芳香腈的良好工业催化剂，促进腈化合物合成工艺的升级。

Description

一种醛肟脱水酶及其在催化合成芳香腈类化合物中的应用

技术领域

本发明涉及生物催化研究领域，具体涉及一种醛肟脱水酶基因工程菌及利用该菌在水相中无氰源催化合成芳香族腈化合物的方法。

背景技术

有机腈(R-C≡N)是一类重要的化工原料和中间体，在医药合成和高分子聚合等产业中被广泛地应用。例如，己二腈是制备尼龙66的原料，丙烯腈是生产聚丙烯酰胺和丁腈橡胶的原料，3-氰基吡啶是合成烟酰胺的中间体等。随着药物化学研究的深入研究，将氰基基团引入到小分子药物中是药物化学结构改造的重要策略之一。据统计，DrugBank数据库收录了50余种含氰基的小分子药物，尤其是芳香腈化合物，包括药物依他普伦、维拉帕米和利匹韦林等。迄今为止，化学家根据腈的结构和用途，已经开发出了多种腈化合物的合成方法，主要包括：烯烃的氢氰化法、烯烃的氨氧化法、卤代烃氰基取代法和酰胺脱水法。然而，这些化学合成方法都存在严重的弊端，如：需要使用剧毒化合物氰化氢或金属氰化物；高温、高压等苛刻条件；制备成本较高；产物的选择性较差；副产物较多等等问题。为避免上述缺点，醛肟脱水酶(aldoxime dehydratases,Oxds)催化醛肟脱水合成腈类化合物，是一种反应条件温和、环境友好的合成方法。

与化学法合成腈类化合物相比，生物催化具有明显的优势：(1)无氰源，避免使用剧毒化合物金属氰化物和氢氰酸；(2)底物为醛肟化合物，通过醛和羟胺制备得到，合成方法简单高效；(3)以水作为溶剂，在室温下反应，无需高毒性的金属催化剂，对环境相对友好。然而，醛肟脱水酶基因资源相对匮乏，目前仅报道了大约6种，如来源于绿假单胞菌B23(Pseudomonas chlororaphis B23)，禾谷镰刀菌MAFF305135(Fusarium graminearumMAFF305135)，红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)，球形红球菌A-4(Rhodococcusgloberulus A-4)和假单胞菌K-9(Pseudomonas sp.K-9)等微生物。这些醛肟脱水酶普遍对芳香族底物活力较低，而且稳定性较差。

目前，针对醛肟脱水酶的研究主要集中在日本和德国研究者。Asano Y.教授(FEMSMicrobiology Letters,158,1998,185-190)等报道了来源于Bacillus sp.的醛肟脱水酶OxB-1，在水相反应体系中，8.0mg/ml催化剂，1.5h内催化5mmol/L苯乙醛肟生成苯乙腈，转化率为100％。然而，醛肟脱水酶OxB-1对3-吡啶醛肟和苯甲醛肟等底物不具有催化活力。

H.教授(Angewandte Chemie International Edition,2017,56,12361-12366)等考察了五种醛肟脱水酶OxdA、OxdB、OxdFG、OxdRE和OxdRG催化合成芳香腈，底物浓度为5mmol/L，最高转化率仅为78％，大部转化率在7～30％之间。

国内针对醛肟脱水酶的研究鲜有报道。因此，开发一种新型的对芳香族底物具有高催化活力的醛肟脱水酶将具有很高的科学研究价值和应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对芳香族底物具有高催化活力的醛肟脱水酶，将其应用于催化芳香族醛肟化合物脱水生成高附加值芳香腈类化合物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明采用基因探矿策略从GenBank数据库中筛选来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida F1的醛肟脱水酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并构建重组表达质粒。该基因可在大肠杆菌中高效表达，表达的醛肟脱水酶OxdF1具有较高的催化芳香族醛肟化合物脱水合成芳香腈的活力。

具体的，所述醛肟脱水酶催化醛肟化合物脱水，合成芳香族腈类化合物，其反应式为：

如上述反应式，在反应过程中，苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟、3-吡啶醛肟、2-吡啶醛肟、噻吩-2-甲醛肟或2-氯-6-氟苯甲醛肟在醛肟脱水酶的催化作用下，高效脱水合成相应的腈化合物。

因此，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛肟脱水酶在催化合成芳香腈类化合物中的应用。

优选的，催化的底物为苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟、噻吩-2-甲醛肟、2-氯-6-氟苯甲醛肟、3-吡啶醛肟或2-吡啶醛肟。

进一步的，本发明提供了一种基因重组工程菌在催化合成芳香腈类化合物中的应用，所述基因重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌，所述宿主菌内含有包含了核苷酸序列如SEQID NO.1所示的醛肟脱水酶编码基因的重组表达质粒。

所述基因重组工程菌的构建步骤为：通过基因克隆，获得醛肟脱水酶基因序列，将该序列连接到质粒载体上，获得重组表达质粒。将重组表达质粒转化到宿主细胞大肠杆菌中，获得基因重组工程菌。

优选的，所述重组表达质粒的原始载体为质粒载体pRSFDuet-1。具体地，醛肟脱水酶编码基因位于质粒载体pRSFDuet-1的多克隆位点BamH I和Not I之间。

优选的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

研究表明，所述基因重组工程菌经自动诱导培养基诱导，能够高效表达醛肟脱水酶，该醛肟脱水酶表现出良好的催化稳定性、高催化活力。

具体的，所述应用包括以下步骤：以所述基因重组工程菌经发酵培养获得的菌体为催化剂，以醛肟化合物为底物，以pH为5.0～8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，25～40℃，100～300rpm条件下进行反应，分离纯化后获得相应的腈类化合物。

所述基因重组工程菌发酵培养的方法包括：将所述基因重组工程菌接种于含抗生素的自动诱导培养基中，培养至OD₆₀₀值达到0.6～0.8，然后培养温度调至18～25℃，200rpm条件下继续培养10～12h，离心，收集菌体。

用磷酸盐缓冲液重悬基因工程菌细胞，获得静息细胞悬液；往静息细胞悬液中添加醛肟化合物进行反应，反应完成后，从反应液中分离得到芳香腈。

优选的，底物为苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟、噻吩-2-甲醛肟、2-氯-6-氟苯甲醛肟、3-吡啶醛肟或2-吡啶醛肟，反应体系中催化剂的用量以静息细胞重量计为10～20mg/mL，底物的添加量为100mmol/L。

当底物为苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟、噻吩-2-甲醛肟或2-氯-6-氟苯甲醛肟时，反应体系中添加20％二甲基亚砜(DMSO)作为助溶剂。

适宜的反应温度和反应溶液pH值有利于反应的进行，优选的，所述反应的温度为25～35℃，pH为5.5～7.5。若温度过高、pH值偏酸或偏碱，容易造成反应过程中催化剂的失活。更为优选，反应介质的pH值为7.0，催化反应条件为30℃，200rpm，此反应条件下酶类催化效果最佳，芳香腈的产率最高。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明将来源于恶臭假单胞菌Pseudomonas putida F1的醛肟脱水酶基因插入到表达载体中，构建重组表达质粒；再将其导入宿主细胞构建基因工程菌，可实现醛肟脱水酶的高效共表达。通过上述工程菌的催化作用，可实现从醛肟化合物到芳香腈高效生产的目的。该醛肟脱水酶表现出良好的催化稳定性、高催化活力等优点，有望成为生物法制备芳香腈的良好工业催化剂，促进腈化合物合成工艺的升级。

(2)利用工程菌用于催化合成芳香腈，与化学工艺比较，避免使用剧毒化合物和金属催化剂，避免高温高压等苛刻条件，提高生产安全水平，简化了生产工艺，降低了生产成本。

附图说明

图1为醛肟脱水酶基因OxdF1的核酸电泳图，其中M：核酸Marker；1：基因OxdF1样品。

图2为基因工程菌BL21-pROxdF1诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M：蛋白质Marker；W：静息细胞悬液；S：菌体破胞上清；I：菌体破胞沉淀；P：纯酶。

图3为反应温度对醛肟脱水酶OxdF1催化活力的影响。

图4为反应pH对醛肟脱水酶OxdF1催化活力的影响。

图5为醛肟脱水酶OxdF1的热稳定性。

图6为醛肟脱水酶OxdF1催化吡啶-3-醛肟生成3-氰基吡啶的高效液相色谱图。A：起始点(0h)；B：终止点(1小时)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1重组表达质粒pROxdF1的构建

采用引物Oxd_UP和Oxd_down克隆来自Pseudomonas putida F1菌(DSMZ 6899)的醛肟脱水酶Oxd基因(图1)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。引物Oxd_UP和Oxd_down的核酸序列分别为：

5’-CGCGGATCCGATGGAATCTGCAATCGATAAACA-3’；

5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTTGGAACTGACTTTTGC-3’。

采用Bam HI和Not I双酶切Oxd-F1基因，回收酶切后的基因片段；同时采用Bam HI和Not I双酶切表达质粒pRSFDuet-1，回收酶切后的质粒片段。采用T4连接酶进行连接，连接后产物转化克隆宿主E.coli DH5α。用含卡那霉素抗性的LB固体平板筛选，挑选阳性转化子，测序结果表明基因序列无误后的重组质粒，即为重组表达质粒pROxdF1，于-20℃保存备用。

实施例2基因工程菌BL21-pROxdF1的构建和催化剂制备

将实施例1中构建的重组表达质粒pROxdF1转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，即得基因工程菌BL21-pROxdF1。将BL21-pROxdF1接种于10mL试管装液体LB培养基(38μg/mL卡那霉素)中，在37℃，200rpm条件下振荡培养12～16h。将该培养液按1～5％的接种量接种于250mL三角锥形瓶装的液体50mL自动诱导培养基(38μg/mL卡那霉素)中，于37℃，200rpm条件下振荡培养2～3h，当菌种密度OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，调节培养温度18℃，200rpm条件下继续培养12h。

在5000～10000×g条件下离心5～10min收集细胞，即作为用于脱水合成芳香腈的催化剂。在冰浴中，采用超声破碎细胞，在12000～15000×g条件下离心20～40min，分别收细胞破碎上清液和破碎沉淀，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测醛肟脱水酶的表达水平，SDS-PAGE电泳图如图2所示。

实施例3醛肟脱水酶OxdF1性质表征

以5mM 3-吡啶醛肟为底物，在0.5mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)反应体系中，添加50μL基因工程菌BL21-pROxdF1静息细胞，在20～55℃范围内测定其催化活力，如图3所示，最适反应温度为35℃。

以5mM 3-吡啶醛肟为底物，在不同pH值的缓冲液体系中(pH4.0～9.5)，添加50μL基因工程菌BL21-pROxdF1静息细胞，在35℃范围内测定其催化活力，如图4所示，最适反应pH为7.0。

将基因工程菌BL21-pROxdF1静息细胞分别置于30，35℃水浴中，保持不同时间后测定其催化活力，如图5所示，在30℃条件下其半衰期达到约3.8小时。

实施例4基因工程菌BL21-pROxdF1催化合成芳香腈化合物

在0.5mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)反应体系中，添加10mg/mL基因工程菌BL21-pROxdF1静息细胞，添加100mmol/L底物，分别为苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟、噻吩-2-甲醛肟、2-氯-6-氟苯甲醛肟、3-吡啶醛肟和2-吡啶醛肟。除3-吡啶醛肟和2-吡啶醛肟外，其它反应体系中添加20％二甲基亚砜(DMSO)作为助溶剂。30℃和200rpm反应1h后，采用高效液相色谱法(HPLC)分析反应物和底物浓度，计算转化率，结果如表1所示。

反应体系中底物和产物的浓度采用HPLC法测定，以底物3-吡啶醛肟为例。安捷伦1260高效液相色谱仪，C18反相色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18,4.6×250mm)，流速为0.5mL/min，柱温为30℃，检测波长为230nm，流动相A为0.029％TFA水溶液；B为乙腈，A:B＝92:8。以外标法计算底物和产物浓度，转化率计算公式如下：

转化率(％)＝产物浓度/起始底物浓度×100％；

当底物为3-吡啶醛肟时，反应起始和反应终止时HPLC图谱如图6所示。由HPLC图可知，100mmol/L 3-吡啶醛肟全部转化为3-氰基吡啶，转化率达到100％。

表1醛肟脱水酶OxdF1催化合成不同的芳香腈

由上表可知，本发明中的基因工程菌BL21-pROxdF1作为催化剂，10mg/mL的静息细胞，1h内完全转化100mmol/L苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟和3-吡啶醛肟。其对底物芳香醛肟的选择以及催化效率优于FEMS Microbiology Letters,158,1998,185-190中报道的来源于Bacillus sp.的醛肟脱水酶OxB-1和Angewandte Chemie International Edition,2017,56,12361-12366中报道的醛肟脱水酶OxdA、OxdB、OxdFG、OxdRE和OxdRG。

本发明报道的醛肟脱水酶OxdF1对芳香醛肟显示出较高的催化活力，在高附加值芳香腈合成中具有很高的应用潜力。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种醛肟脱水酶及其在催化合成芳香腈类化合物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida F1)

<400> 1

atggaatctg caatcgataa acacctcgtg tgcccgcgca cgttatcgcg ccgggtgcct 60

gatgattacc agccgccctt cccgatgtgg gtcggccgcg ctgatgagca gctgacgcaa 120

gtagtgatgg cctatctggg tgtgcagtac cggggagatg gtcagcgtga gcgggccttg 180

caagcgatgc gcgagattct cggcagcttt agcttaaccg acggcccgct gactcacgac 240

ctgacgcacc acaccgacag cagtggctac gacaacctga tgatcgtcgg ctactggaaa 300

gatgccggcg cttactgccg ctggttacgc tcgcctgagg tggatggctg gtggagttcg 360

ccgcaacgct tgaatgatgg ccttggttac taccgcgaaa tcaccgcgcc gcgggccgag 420

cagttcgaga cgctgtatgc gttccagaac gatttgcccg gggtcggggc gatcatggac 480

aacaccagtg gcgaaatcga ggaacacggt tactggggct cgatgcgcga ccgtttcccg 540

gtatcgcaaa cggactggat gaacccgaac ggcgaactgc gagtcgtggc tggcgacccg 600

gccaaaggcg gtcgcgtggt ggtgctcggc catgacaata tcgccttgat tcgctcgggc 660

caggactggg caacggcaga agcggctgag cgctcgctgt acctggatga aatcttgccg 720

accttgcagg atggtatgga ttttctgcgc gataacggcc agccgctggg ctgttacagc 780

aatcgctttg tacgcaatat cgacgctgac ggcaatctac tcgacatgag ttacaacatc 840

ggccactggc gttcactgga gaaactcgaa cgctgggcgg aatcgcaccc cacccatctg 900

cgtattttcg tcaccttctt tcgggtagcg gcagggctcg agaagttgcg gctctatcac 960

gaagtctccg tgtcggatgc aagcagccag gtgttcgaat acatcaactg ccacccacac 1020

accggcatgt tgcgcgacgc aaaagtcagt tccaactag 1059

<210> 2

<211> 352

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida F1)

<400> 2

Met Glu Ser Ala Ile Asp Lys His Leu Val Cys Pro Arg Thr Leu Ser

1 5 10 15

Arg Arg Val Pro Asp Asp Tyr Gln Pro Pro Phe Pro Met Trp Val Gly

20 25 30

Arg Ala Asp Glu Gln Leu Thr Gln Val Val Met Ala Tyr Leu Gly Val

35 40 45

Gln Tyr Arg Gly Asp Gly Gln Arg Glu Arg Ala Leu Gln Ala Met Arg

50 55 60

Glu Ile Leu Gly Ser Phe Ser Leu Thr Asp Gly Pro Leu Thr His Asp

65 70 75 80

Leu Thr His His Thr Asp Ser Ser Gly Tyr Asp Asn Leu Met Ile Val

85 90 95

Gly Tyr Trp Lys Asp Ala Gly Ala Tyr Cys Arg Trp Leu Arg Ser Pro

100 105 110

Glu Val Asp Gly Trp Trp Ser Ser Pro Gln Arg Leu Asn Asp Gly Leu

115 120 125

Gly Tyr Tyr Arg Glu Ile Thr Ala Pro Arg Ala Glu Gln Phe Glu Thr

130 135 140

Leu Tyr Ala Phe Gln Asn Asp Leu Pro Gly Val Gly Ala Ile Met Asp

145 150 155 160

Asn Thr Ser Gly Glu Ile Glu Glu His Gly Tyr Trp Gly Ser Met Arg

165 170 175

Asp Arg Phe Pro Val Ser Gln Thr Asp Trp Met Asn Pro Asn Gly Glu

180 185 190

Leu Arg Val Val Ala Gly Asp Pro Ala Lys Gly Gly Arg Val Val Val

195 200 205

Leu Gly His Asp Asn Ile Ala Leu Ile Arg Ser Gly Gln Asp Trp Ala

210 215 220

Thr Ala Glu Ala Ala Glu Arg Ser Leu Tyr Leu Asp Glu Ile Leu Pro

225 230 235 240

Thr Leu Gln Asp Gly Met Asp Phe Leu Arg Asp Asn Gly Gln Pro Leu

245 250 255

Gly Cys Tyr Ser Asn Arg Phe Val Arg Asn Ile Asp Ala Asp Gly Asn

260 265 270

Leu Leu Asp Met Ser Tyr Asn Ile Gly His Trp Arg Ser Leu Glu Lys

275 280 285

Leu Glu Arg Trp Ala Glu Ser His Pro Thr His Leu Arg Ile Phe Val

290 295 300

Thr Phe Phe Arg Val Ala Ala Gly Leu Glu Lys Leu Arg Leu Tyr His

305 310 315 320

Glu Val Ser Val Ser Asp Ala Ser Ser Gln Val Phe Glu Tyr Ile Asn

325 330 335

Cys His Pro His Thr Gly Met Leu Arg Asp Ala Lys Val Ser Ser Asn

340 345 350

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的醛肟脱水酶在催化合成芳香腈类化合物中的应用，其特征在于，催化的底物为苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟、噻吩-2-甲醛肟、2-氯-6-氟苯甲醛肟、3-吡啶醛肟或2-吡啶醛肟。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述醛肟脱水酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种基因重组工程菌在催化合成芳香腈类化合物中的应用，其特征在于，所述基因重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌，所述宿主菌内含有包含了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的醛肟脱水酶编码基因的重组表达质粒，催化的底物为苯甲醛肟、2-溴苯甲醛肟、噻吩-2-甲醛肟、2-氯-6-氟苯甲醛肟、3-吡啶醛肟或2-吡啶醛肟。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组表达质粒的原始载体为质粒载体pRSFDuet-1。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，醛肟脱水酶编码基因位于质粒载体pRSFDuet-1的多克隆位点BamH I和NotI之间。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：以所述基因重组工程菌经发酵培养获得的菌体为催化剂，以醛肟化合物为底物，以pH为5.0～8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，在25～40℃，100～300rpm条件下进行反应，分离纯化后获得相应的腈类化合物。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因重组工程菌发酵培养的方法包括：将所述基因重组工程菌接种于含抗生素的自动诱导培养基中，培养至OD₆₀₀值达到0.6～0.8，然后培养温度调节至18～25℃，200rpm条件下继续培养10～12h，离心，收集菌体。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应体系中催化剂的用量以静息细胞重量计为10～20mg/mL，底物的添加量为100mmol/L。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，反应介质的pH值为7.0，催化反应条件为30℃，200rpm。