CN111733195B

CN111733195B - 制备(1r，3s)-3-氨基环戊醇的方法、整合酶抑制剂、应用

Info

Publication number: CN111733195B
Application number: CN202010677514.6A
Authority: CN
Inventors: 石淑敏; 章兆琪; 陈承; 黄勇开; 陈海滨
Original assignee: Enzymaster Ningbo Bio Engineering Co Ltd
Current assignee: Enzymaster Ningbo Bio Engineering Co Ltd
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2020-07-14
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2040-07-14
Also published as: CN111733195A

Abstract

本发明具体公开了一种制备（1R，3S）‑3‑氨基环戊醇的方法、整合酶抑制剂、应用，所述制备（1R，3S）‑3‑氨基环戊醇的方法包括以下步骤：以R‑3‑羟基环戊酮为反应物，加入氨基供体、辅酶和转氨酶进行混合，并置于水相缓冲液中进行酶促反应，得到（1R，3S）‑3‑氨基环戊醇。同时本发明提供了催化R‑3‑羟基环戊酮生成（1R，3S）‑3‑氨基环戊醇的转氨酶的氨基酸序列，本公开内容还提供了编码转氨酶的核苷酸序列，制备方法及反应工艺，本发明公开的酶催化制备（1R，3S）‑3‑氨基环戊醇的反应条件温和，绿色环保，解决了常规化学法制备（1R，3S）‑3‑氨基环戊醇过程中存在的化学反应步骤多，操作繁琐，生产成本较高，且易造成环境污染严重的问题。

Description

制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法、整合酶抑制剂、应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法、整合酶抑制剂、应用。

背景技术

(1R，3S)-3-氨基环戊醇作为一种重要的医药中间体，具有非常广阔的市场前景。吉利德科学公司开发的抗艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS，获得性免疫缺陷综合征)新药Biktarvy的主要活性成分为整合酶抑制剂Bictegravir。而Bictegravir通过以(1R，3S)-3-氨基环戊醇盐酸盐为原料经构建桥环而得到，是构成手性分子的唯一手性源，因此，(1R，3S)-3-氨基环戊醇的制备也就成了合成Bictegravir的关键步骤之一。

目前，(1R，3S)-3-氨基环戊醇的制备方法通常是通过拆分法进行制备，部分也采用氧化剂(例如过氧化脲-三氟乙酸酐体系)或催化剂(例如铜催化剂)等并通过进行多步反应来制备，例如，以手性羧酸与羟胺形成的酰胺作为手性源，在铜催化的氧化反应体系中得到手性狄尔斯-阿尔德反应产物，之后经过还原反应和碱性脱保护反应，以及酸化反应后得到目标产物。

因此，上述的技术方案在实际操作时存在以下不足：现有制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法大多化学工艺操作复杂，生产成本较高，且存在环境污染大的问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法，以解决上述背景技术中提出的现有制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法大多操作复杂，生产成本较高，且存在环境污染大的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法，包括以下步骤：

以R-3-羟基环戊酮为反应物，加入氨基供体、辅酶、转氨酶进行混合，并置于水相缓冲液中进行酶促反应，得到所述的(1R，3S)-3-氨基环戊醇。

作为本发明进一步的方案：所述转氨酶是由转氨酶基因编码的酶，其中，所述转氨酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示。

具体的，所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列为：

进一步的，所述SEQ ID No.2所示氨基酸序列为：

作为本发明再进一步的方案，所述制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法包括：以R-3-羟基环戊酮制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法的具体合成路线如下：

优选的，所述的转氨酶为购自宁波酶赛生物工程有限公司的产品，其是通过在大肠杆菌重组表达出来的蛋白。

进一步地，所述酶促反应的反应温度为30-40℃，优选的是30℃。

进一步地，所述辅酶是5-磷酸吡哆醛。

进一步地，所述氨基供体为异丙胺或氨基酸等，优选的，所述氨基供体为异丙胺。

进一步地，所述的水相缓冲液为磷酸盐或三乙醇胺缓冲液。

进一步地，所述的水相缓冲液的pH范围为6-9，浓度是0.08-0.12mol/L。

优选的，所述的水相缓冲液的浓度为0.1mol/L，且水相缓冲液的pH为7。

进一步地，所述反应体系中所用的转氨酶为表达所述转氨酶的大肠杆菌湿菌体、细胞破碎上清或酶粉。

进一步地，所述制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法具体实施过程如下：将所述的底物R-3-羟基环戊酮、转氨酶、氨基供体和辅酶加入到反应器中，在pH为6-9、温度为30-40℃的水相缓冲液中混合构成反应体系并进行反应，用50％乙腈灭活后在HPLC(HighPerformance Liquid Chromatography，高效液相色谱法)检测反应结果。

进一步地，所述反应体系的反应总体积为4-6mL，各原料的投入终浓度分别为：3-5g/L的R-3-羟基环戊酮底物，15-25g/L转氨酶，0.05-1.15mmol/L辅酶，0.4-0.6mol/L氨基供体，0.08-0.12mol/L水相缓冲液。

本发明在于提供一种采用上述的制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法制备得到的(1R，3S)-3-氨基环戊醇。

进一步地，所述(1R，3S)-3-氨基环戊醇可以作为医药中间体使用。

本发明在于提供一种整合酶抑制剂，由上述的(1R，3S)-3-氨基环戊醇制备得到。

本发明在于提供一种上述的整合酶抑制剂在制备用于治疗HIV(HumanImmunodeficiency Virus，人类免疫缺陷病毒，即艾滋病病毒)感染药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明实施例提供的制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法是以R-3-羟基环戊酮为反应物，利用氨基供体、辅酶、转氨酶等进行酶促反应得到(1R，3S)-3-氨基环戊醇，大大简化了合成步骤，转化率最高可达95％以上，手性值ee≥99％；而且，由于是采用转氨酶等原料，反应条件温和，绿色环保，解决了现有技术中采用化学法制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇过程中存在的化学反应步骤多，大多操作繁琐，生产成本较高，且使用大量有机试剂造成环境污染严重的问题。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细地说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

一种表达转氨酶的大肠杆菌，所述转氨酶是由转氨酶基因编码的酶，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述转氨酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

具体的，所述表达转氨酶的大肠杆菌的构建及培养方法如下：

1)将人工合成的所述转氨酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶Nco I和限制性内切酶EcoR I双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段；

2)将所述目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经过限制性内切酶Nco I和限制性内切酶EcoR I酶切后的质粒pET-28a在25℃下进行连接，过夜，得到连接产物；

需要说明的是，当转氨酶的氨基酸序列已知时，编码转氨酶蛋白的核苷酸可根据已知的合成方法通过标准的固相方法制备，例如，采用亚磷酰胺法，这里并不作赘述，上述转氨酶的核苷酸序列均可由本领域技术人员已知的方法合成；

3)分别将1微升的连接产物加入至含有50微升的大肠杆菌电感受态细胞的电转中，依次在电转仪上立即进行电击，然后立即转移到冰上，加入预热到37℃的肉汤琼脂培养基1毫升进行混匀；分别转移混匀后的培养基至2毫升的培养管，在37℃下200r/min培养一小时；再在含有100微升每毫升的卡那霉素的肉汤琼脂平板上进行划线培养，37℃培养箱过夜培养16小时；次日，在接种平板上挑取一个单克隆接种到含有卡那霉素的15毫升培养基的三角烧瓶中，37℃培养箱过夜培养；将过夜培养物以1∶100的接种量比例转接至含有200毫升新鲜的含有相同抗性的培养基中，37℃培养，250r/min振荡培养至菌液在600纳米波长处的吸光值达0.6-0.8，然后加入1毫升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在30℃继续培养过夜；离心，弃上清，收集重组大肠杆菌湿菌体，即为所述表达转氨酶的大肠杆菌。

实施例2

将实施例1中制备的重组大肠杆菌湿菌体用0.1mol/L的水相缓冲液(pH＝7.0)进行回溶菌体，均质破碎，离心收集酶液上清进行冷冻干燥，得到转氨酶(酶粉)，其中，所述水相缓冲液的加入量按照重量比是重组大肠杆菌湿菌体∶水相缓冲液＝1∶5的比例进行添加。

实施例3

一种制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法，具体包括以下步骤：以R-3-羟基环戊酮为底物，加入实施例2中制备的转氨酶(酶粉)，并加入氨基供体、辅酶、水相缓冲液进行混合构成反应体系，再置于反应瓶中进行酶促反应，分离，得到所述的(1R，3S)-3-氨基环戊醇；具体是将反应瓶中加入磁子后放置于事先预热至30℃的反应器上，将反应器转速调至400rpm进行搅拌反应(反应时间分别是1h、2h、4h、20h、24h)，得到反应液，取50μL的反应液加入1mL的体积浓度50％的乙腈终止反应，振荡灭活，离心后取上清，通过HPLC检测转化率，具体的检测结果如表1所示。

其中，所述HPLC检测的条件是：仪器型号为Agilent 1100，色谱柱为ZORBAX SB-C18(规格4.6×150mm，粒径5μm)，柱温40℃，检测波长230nm，流动相H₂O：ACN＝90％：10％(比值为体积比)，流速2mL/min。

表1 HPLC检测分析结果表

反应时间	转化率
		1h	13.9％
2h	17.4％
		4h	29.0％
20h	70.3％
		24h	74.7％(ee≥99％)

在本发明实施例中，所述反应体系的反应总体积为5mL，各原料的投入终浓度分别为：4g/L的R-3-羟基环戊酮，20g/L转氨酶，0.1mmol/L辅酶，0.5mol/L氨基供体，0.1mol/L水相缓冲液。其中，所述氨基供体为异丙胺；所述水相缓冲液为磷酸盐缓冲液，其pH值为8。

实施例4

与实施例3相比，除了所述反应体系的反应总体积为4mL，以及各原料的投入终浓度分别为：3g/L的R-3-羟基环戊酮，15g/L转氨酶，0.05mmol/L辅酶，0.4mol/L氨基供体，0.08mol/L水相缓冲液外，其他与实施例3相同。

实施例5

与实施例3相比，除了所述反应体系的反应总体积为6mL，以及各原料的投入终浓度分别为：5g/L的R-3-羟基环戊酮，25g/L转氨酶，1.15mmol/L辅酶，0.6mol/L氨基供体，0.12mol/L水相缓冲液外，其他与实施例3相同。

实施例6

为了单独验证转氨酶反应的可行性，本发明实施例中提供了一种制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法，其包括以下步骤：

以所述R-3-羟基环戊酮为反应物，加入实施例2中制备的转氨酶(酶粉)，并加入氨基供体、辅酶、水相缓冲液进行混合构成反应体系，再置于反应瓶中进行酶促反应，分离，得到所述的(1R，3S)-3-氨基环戊醇；具体的，是将反应瓶中加入磁子后放置于事先预热至40℃的反应器上，将反应器转速调至400rpm进行搅拌反应(反应时间分别是1h、2h、4h、20h、24h)，得到反应液，取50μL的反应液加入1mL的体积浓度50％的乙腈终止反应，振荡灭活，离心后取上清，通过HPLC检测转化率，具体的检测结果如表2所示。

表2 HPLC检测分析结果表

反应时间	转化率
		1h	28.3％
2h	41.6％
		4h	69.2％
20h	86.5％
		24h	95.9％(ee≥99％)

在本发明实施例中，所述反应体系的反应总体积为5mL，各原料的投入终浓度分别为：4g/L的R-3-羟基环戊酮，20g/L转氨酶，0.1mmol/L辅酶，0.5mol/L氨基供体，0.1mol/L水相缓冲液。其中，所述氨基供体为异丙胺；所述水相缓冲液为三乙醇胺缓冲液，其pH值为9。

根据表1-2中的数据可以看出，采用本发明实施例中制备的转氨酶进行酶促反应制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇，转化率最高可达95％以上，ee≥99％，整个方法的步骤少，所用试剂少，大大的简化了现有(1R，3S)-3-氨基环戊醇制备方法的繁琐步骤，是一种更为经济环保的合成方法。

对比例

公开号为CN110092726A的发明专利，公开了一种利用起始原料3-羰基环戊羧酸在羰基还原酶和辅酶的条件下，发生不对称还原反应，生成(3R)-3-羟基环戊烷羧酸；与叠氮磷酸二苯酯(DPPA)发生重排合环反应，生成(1R，5S)-2-氧-4-氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-酮；在盐酸中水解，直接得到(1R，3S)-3-氨基环戊醇盐酸盐，该方法ee值≥97％，收率64.8％。

由上述结果可知，本发明实施例提供的制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法是以R-3-羟基环戊酮为反应物，利用氨基供体、辅酶、转氨酶等进行酶促反应得到(1R，3S)-3-氨基环戊醇，大大简化了合成步骤，转化率最高可达95％以上，ee值≥99％，是未来极具竞争力的一种制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇的方法；而且，由于是采用转氨酶等原料，反应条件温和，绿色环保，解决了现有技术中采用化学法制备(1R，3S)-3-氨基环戊醇过程中存在的化学反应步骤多，操作繁琐，使用大量有机试剂造成环境污染严重等问题。

上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 宁波酶赛生物工程有限公司

<120> 制备（1R，3S）-3-氨基环戊醇的方法、整合酶抑制剂、应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 975

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggcatcaa tggacaaagt gttcgcaggc tacgcagcac gccaagcaat tctggaaagc 60

acggaaacca ccaatccgtt cgccaaaggc attgcatggg tcgaaggtga actggtgccg 120

ctggcagaag cacgtatccc gctgctggac cagggtttta tgcatagcga tctgacctat 180

gacgttccgt ctgtctggga tggccgtttc tttcgcctgg atgaccacat tacccgtctg 240

gaagctagtt gcacgaaact gcgtctgcgt ctgccgctgc cgcgtgacca ggtgaaacaa 300

atcctggtgg aaatggttgc gaaatccggt attcgtgatg cctttgttga actgatcgtc 360

acccgcggcc tgaaaggtgt tcgtggcacg cgcccggaag atatcgttaa caacctgtac 420

atgttcgtcc agccgtacgt ctgggtgatg gaaccggata tgcaacgtgt gggcggttct 480

gcagtggttg ctcgtaccgt ccgtcgcgtg ccgccgggtg caatcgatcc gacggtgaaa 540

aacctgcagt ggggtgacct ggttcgtggc atgtttgaag cggccgatcg cggtgcaacc 600

tatccgttcc tgacggatgg cgacgctcat ctgaccgaag gctcaggttt taacattgtt 660

ctggtcaaag atggtgtgct gtacaccccg gaccgtggtg tgctgcaagg cgttacgcgc 720

aaatcggtta ttaatgcagc tgaagcgttt ggcatcgaag tgcgtgttga attcgtcccg 780

gtggaactgg cgtaccgctg cgacgaaatt ttcatgtgta ccacggccgg cggtattatg 840

ccgatcacca cgctggatgg tatgccggtg aatggcggtc agattggccc gatcaccaag 900

aaaatttggg atggttattg ggcgatgcac tacgacgcag cctacagctt tgaaattgac 960

tacaacgaac gcaac 975

<210> 2

<211> 325

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ala Gly Tyr Ala Ala Arg Gln Ala

1 5 10 15

Ile Leu Glu Ser Thr Glu Thr Thr Asn Pro Phe Ala Lys Gly Ile Ala

20 25 30

Trp Val Glu Gly Glu Leu Val Pro Leu Ala Glu Ala Arg Ile Pro Leu

35 40 45

Leu Asp Gln Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser

50 55 60

Val Trp Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Ile Thr Arg Leu

65 70 75 80

Glu Ala Ser Cys Thr Lys Leu Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Arg Asp

85 90 95

Gln Val Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg

100 105 110

Asp Ala Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg

115 120 125

Gly Thr Arg Pro Glu Asp Ile Val Asn Asn Leu Tyr Met Phe Val Gln

130 135 140

Pro Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Asp Met Gln Arg Val Gly Gly Ser

145 150 155 160

Ala Val Val Ala Arg Thr Val Arg Arg Val Pro Pro Gly Ala Ile Asp

165 170 175

Pro Thr Val Lys Asn Leu Gln Trp Gly Asp Leu Val Arg Gly Met Phe

180 185 190

Glu Ala Ala Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Leu Thr Asp Gly Asp

195 200 205

Ala His Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp

210 215 220

Gly Val Leu Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Arg

225 230 235 240

Lys Ser Val Ile Asn Ala Ala Glu Ala Phe Gly Ile Glu Val Arg Val

245 250 255

Glu Phe Val Pro Val Glu Leu Ala Tyr Arg Cys Asp Glu Ile Phe Met

260 265 270

Cys Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Thr Leu Asp Gly Met

275 280 285

Pro Val Asn Gly Gly Gln Ile Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp

290 295 300

Gly Tyr Trp Ala Met His Tyr Asp Ala Ala Tyr Ser Phe Glu Ile Asp

305 310 315 320

Tyr Asn Glu Arg Asn

325

Claims

1.一种制备（1R，3S）-3-氨基环戊醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：以R-3-羟基环戊酮为反应物，加入氨基供体、辅酶和转氨酶进行混合，并置于水相缓冲液中进行酶促反应，得到（1R，3S）-3-氨基环戊醇;其中所述转氨酶是由转氨酶基因编码的酶；

其中，所述转氨酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示;其中所述酶促反应的反应温度为30-40℃; 其中所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液; 其中所述的水相缓冲液的pH范围为6-9; 其中所述辅酶为5-磷酸吡哆醛，所述氨基供体为异丙胺或氨基酸，所述转氨酶在反应体系中以大肠杆菌湿菌体、细胞破碎上清或酶粉至少一种方式进行反应。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述酶促反应的温度为30℃。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的水相缓冲液的pH为7。