CN112813040B - 老黄酶oye1突变体蛋白及在酶催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了老黄酶OYE1突变体蛋白及在酶催化不对称还原2‑芳基丙烯酸衍生物中的应用，属于生物技术领域。通过将野生型老黄酶OYE1突变，获得具有高效S‑立体选择性的突变体酶，并利用突变体酶用于2‑芳基丙烯酸衍生物类底物的不对称还原，例如催化2‑苯基丙烯酸甲酯。本发明中的突变体相对于野生型，立体选择性得到了逆转，催化上述的底物可以高选择性得到S型的手性化合物。该酶具有立体专一性，反应条件温和，操作简便等优势，在含有手性药物中间体的生产中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及老黄酶OYE1突变体及其编码基因，含有所述老黄酶突变体基因的重组表达载体与转化体构建，重组酶的制备方法，以及以不同突变体为催化剂催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物获取相应的光学纯S构型手性产物的应用。
背景技术
生物催化是利用酶或者生物有机体作为催化剂进行化学转化的过程。生物催化是生物制造的重要科学基础，由于其反应条件温和，效率高、专一性强，绿色环保等特性逐渐成为制造化工品、药品及其中间体的关键技术。利用生物催化制备小分子手性药物不仅能够达到要求的光学纯度，还能实现绿色化学，减少对环境的影响。
光学纯的2-芳基丙酸衍生物，是一类重要的化学药物及其他精细化学品合成过程中的重要手性中间体。利用烯还原酶不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物制备2-芳基丙酸具有潜在的应用价值。目前已有些许利用烯还原酶不对称还原2-芳基丙烯酸的不对称还原的报道。然而，在已有的文献报道中，使用野生型烯还原酶(如YqjM、KYE2、XenA等)还原2-芳基丙烯酸衍生物得到的均为无抗炎活性的(R)-构型2-芳基丙酸衍生物((S)-构型布洛芬、萘普生等具有抗炎活性)，且使用突变型的烯还原酶也无法“翻转”野生型的(R)-立体选择性。
上述立体选择性瓶颈不仅限制了基于烯还原酶的(S)-2-芳基丙酸类药物的绿色制备，也限制了烯还原酶在相关不对称还原中的应用，因此构建针对2-芳基丙烯酸衍生物具有(S)-选择性的烯还原酶并揭示其与底物的识别机制具有重要意义。
发明内容
本发明通过对来自巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)的老黄酶OYE1进行理性设计以及定向进化，逆转其野生型的立体选择性，实现对2-芳基丙烯酸衍生物的立体选择性翻转，制备得到光学纯S构型的2-芳基丙酸衍生物，具有十分重要的应用价值。
本发明的目的在于解决现有的老黄酶(OYE1)针对2-芳基丙烯酸化合物立体选择性单一的问题，通过定点突变，获取该酶的突变体、编码突变体的核酸、含有该核酸的重组表达载体及重组表达转化体细胞，重组突变体酶催化2-芳基丙烯酸类化合物的不对称还原，制备光学纯的S-构型产物的应用。
为解决上述问题，本发明首先采取定点突变的技术，获取立体选择性改变的老黄酶OYE1突变体蛋白。
为了逆转野生型的立体选择性，对氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的老黄酶OYE1进行突变，将117位的色氨酸、75位苯丙氨酸、38位苏氨酸、119位亮氨酸突变为空间位阻较小的氨基酸，所述的空间位阻较小的氨基酸为：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸，优选为丙氨酸或甘氨酸，从而获得针对2-芳基丙烯酸类底物具有立体选择性翻转的老黄酶OYE1突变体蛋白、分别命名为OYE1-W117A-T38A(SEQ ID No.4)、OYE1-W117G-T38A-F75A(SEQ IDNo.6)、OYE1-W117A-T38A-F75A-L119A(SEQ ID No.8)、OYE1-W117G-T38A-F75A-L119A(SEQID No.10)和OYE1-W117A-T38A-F75A(SEQ ID No.12)。
本发明提供了一种老黄酶OYE1突变体蛋白，所述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列为：如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的117位和/或38位和/或75位和/或119位氨基酸残基突变为空间位阻较小的氨基酸残基。
进一步地，上述技术方案中，所述的空间位阻较小的氨基酸残基包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸。
进一步地，上述技术方案中，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的117位氨基酸残基突变为丙氨酸或甘氨酸；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的38位氨基酸残基突变为丙氨酸；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的117位和38位氨基酸残基突变为丙氨酸；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的117位氨基酸残基突变为甘氨酸、且38位和75位氨基酸残基突变为丙氨酸；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的117位和38位和75位和119位氨基酸残基突变为丙氨酸；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的117位氨基酸残基突变为甘氨酸、且38位和75位和119位氨基酸残基突变为丙氨酸；或如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的117位和38位和75位氨基酸残基突变为丙氨酸；
进一步地，上述技术方案中，所述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示或如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO.10所示或如SEQ IDNO.12所示。
一种核酸，其特征在于，能够编码上述任何一项所述的老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列。
本发明还提供了一种核酸，能够编码上述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列；编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明还提供了一种表达载体，含有所述的核酸。
本发明还提供了一种包含所述表达载体的重组表达转化体细胞，所述细胞为大肠杆菌。
所述老黄酶OYE1突变体蛋白获得方法具体过程如下：
为获取立体选择性逆转的突变体，以野生型老黄酶OYE1基因(SEQ ID No.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取突变点上下游各15-20bp的碱基，将突变点的碱基替换成突变后氨基酸的密码子作为PCR正向引物，其反向互补序列作为反向引物)，通过PCR扩增获得突变体的OYE1-W117A-T38A基因(SEQ ID NO.3)、OYE1-W117G-T38A-F75A基因(SEQID NO.5)、OYE1-W117A-T38A-F75A-L119A基因(SEQ ID NO.7)、OYE1-W117G-T38A-F75A-L119A基因(SEQ ID NO.9)、OYE1-W117A-T38A-F75A基因(SEQ ID NO.11)。
进一步，将突变体基因及载体质粒pET-28b以内切酶EcoRI与XhoI进行双酶切(37℃反应4-8h)，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4 DNA连接酶将经过双酶切的突变基因片段及载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET-28b-MBP-W117A-T38A、pET-28b-MBP-W117G-T38A-F75A、pET-28b-MBP-W117A-T38A-F75A-L119A、pET-28b-MBP-OYE1-W117G-T38A-F75A-L119A、pET-28b-MBP-W117A-T38A-F75A；将重组质粒转化入E.coliRosseta(DE3)感受态细胞中，采用的转化方法为热激法：具体过程为45℃热激90S。将构建的重组转化体细胞经过培养表达突变体老黄酶。
本发明还提供了老黄酶OYE1突变体蛋白在作为生物催化剂催化不对称还原前体2-芳基丙烯酸化合物，制备光学纯的S-构型产物中的应用。
本发明中所述的野生型老黄酶与其突变体，或者是含有野生型或突变体酶的细胞可以作为催化剂催化不对称还原2-芳基丙烯酸类化合物获取具有不同构型(S和R构型)的相应的光学纯手性2-芳基丙酸类产物。
所述不对称还原前体2-芳基丙烯酸化合物的结构式如Ⅰ,Ⅱ或Ⅲ所示：
本发明中的突变体相对于野生型，立体选择性得到了逆转，催化上述的底物可以高选择性得到S型的手性化合物。该酶具有立体专一性，反应条件温和，操作简便等优势，在含有手性药物中间体的生产中具有很好的应用前景。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下面结合具体实例对本发明进行具体说明。
某些术语的定义
对映体过量值(ee)定义为对映体混合物中一个异构体A比另一个异构体B多出来的量占总量的百分数，缩写为ee，公式为(A-B)/(A+B)*100％，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。ee值越高，光学纯度也越高。
20种氨基酸的缩写如下：
Asp D 天冬氨酸 Ile I 异亮氨酸
Thr T 苏氨酸 Leu L 亮氨酸
Ser S 丝氨酸 Tyr Y 酪氨酸
Glu E 谷氨酸 Phe F 苯丙氨酸
Pro P 脯氨酸 His H 组氨酸
Gly G 甘氨酸 Lys K 赖氨酸
Ala A 丙氨酸 Arg R 精氨酸
Cys C 半胱氨酸 Trp W 色氨酸
Val V 缬氨酸 Gln Q 谷氨酰胺
Met M 甲硫氨酸 Asn N 天冬酰胺
实施例涉及的培养基配方。
a).LB液体培养基：称取10gNaCl，10g胰蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(YeastExtract)溶于900mL蒸馏水，定溶至1000mL后用NaOH调pH至7.5，分装后，115℃高压灭菌30min。
b).LB固体培养基：LB培养基+1.5％琼脂(g/L)。
实施例1定点突变构建在野生型老黄酶OYE1基础上立体选择性翻转的突变体基因
构建含有野生型老黄酶OYE1基因(SEQ ID No.1)的质粒pET-28b-MBP-OYE1，并以此为模板，通过重叠延伸PCR方法获取突变体基因。
首先OYE1基因上下游引物如下:
SEQ ID NO.13：OYE1-EcoRI-F:CCGGAATTCGATGTCTTTCGTTAAAGACTTCAA
SEQ ID NO.14：OYE1-XhoI-R：CCGCTCGAGTTTTTTGTCCCAACCCAGT
然后设计突变位点引物分别如下：
突变体OYE1-W117A：
SEQ ID NO.15：OYE1-W117A-F:GTTCAGCTGGCTGTTCTGGGT
SEQ ID NO.16：OYE1-W117A-R:ACCCAGAACAGCCAGCTGAAC
突变体OYE1-T38A：
SEQ ID NO.17：OYE1-T38A-F：CCGCCGCTGGCGCGTATGCGT
SEQ ID NO.18：OYE1-T38A-R：ACGCATACGCGCCAGCGGCGG
以构建突变体OYE1-W117A-T38A为例：
第一步PCR反应体系如下：
PCR-a
PCR-b
PCR-c
扩增程序：94℃：10min，(94℃：30s，48℃：30s，72℃：30s)35个循环，72℃，10min。三组PCR分别得到PCR片段a、PCR片段b与PCR片段c，以普通DNA产物胶回收试剂盒回收三种片段，作为第二步PCR的模板。
第二步PCR反应体系如下：
PCR-d
扩增程序与第一步PCR相同，所得PCR片段d即为OYE1-W117A-T38A突变体基因，经普通DNA产物纯化试剂盒纯化后用于后续操作。
实施例2构建突变体基因重组质粒
将重叠延伸PCR获得的突变体基因与载体质粒进行双酶切，反应体系如下
37℃反应4-8h后，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4 DNA连接酶将经过双酶切，具有粘性末端的OYE1-W117A-T38A突变体基因片段及pET-28b-MBP载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET28b-MBP-OYE1-W117A-T38A。
实施例3E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞的制备及转化
a)从种子培养基中取1mL E.coli Rosseta(DE3)接种于100mL LB液体培养基中，38℃，200r/min振荡培养3h；
b)3000r/min，5min富集菌体，弃上清；
c)加入400μl预冷0.1M CaCl2溶液，重新悬浮菌体，等分分装到4个EP管中，冰浴30min获得E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞悬浮液；
d)向E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞悬浮液中加入20μL重组质粒pET28b-MBP-OYE1-W117A-T38A轻轻混匀，冰浴30min；
e)42℃热休克90s，冰水浴3min，加入800μL LB液体培养基，37℃，150r/min振荡培养1-2h；
f)分别取150μL培养液涂布于带有卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养10-20h后挑去阳性转化子，获得突变体重组转化子。
实施例4突变体的表达
a)取实施例3所得突变体重组转化子接种于4ml卡那霉素抗性LB液体培养基中，38℃，200rpm培养6h后得到种子液；
b)取1ml种子液接种于100ml卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液OD600达到0.8-1.0时加入终浓度0.1mM IPTG，并将温度降至20℃诱导表达20h；
c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1M pH7.0磷酸钠缓冲液重新悬浮菌体(菌体湿重浓度为0.1g/ml)，冰水浴环境下超声破碎菌体，4℃环境下，10000rpm离心收集上清获得OYE1-W117A-T38A突变体粗酶液。
实施例5葡萄糖脱氢酶(GDH)的表达
a)取含有pET-22b-GDH质粒的E.coli Rosetta接种于4ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后得到种子液；
b)取1ml种子液接种于1000ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液OD600达到0.8-1.0时加入终浓度0.1mM IPTG，并将温度降至20℃诱导表达20h；
c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1M pH7.0磷酸钠缓冲液重新悬浮菌体(菌体湿重浓度为0.1g/ml)，冰水浴环境下超声破碎菌体，4℃环境下，10000rpm离心收集上清获得GDH突变体粗酶液。
实施例6粗酶液催化还原
本实施例中涉及的典型底物如下所示：
反应体系：如实施例4、5中所述的上清分别800μl、200μl混匀(实施例5的GDH突变体粗酶液为辅酶)，终浓度0.1mM NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)，6mg葡萄糖，1mg底物(50μl乙醇助溶)，30℃反应24h；用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，旋蒸干燥后分析底物转化率和产物的ee值。结果见表1所示。
实施例7高效液相色谱法分析底物和产物
检测Sub 1a/1e/1f/1g及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃,。
检测Sub 1b及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝99.5:0.5，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
检测Sub 1c及其还原产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝99:1，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃。
检测Sub 1d及其还原产物的条件为：色谱柱：OB-H，流动相：正己烷：异丙醇＝99:1，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
检测Sub 1h及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝80:20，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：254nm，柱温：25℃。
检测Sub 1i及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝99:1，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
检测Sub 1j及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
检测Sub 1k及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
检测Sub 1l及其还原产物的条件为：色谱柱：OB-H，流动相：正己烷：异丙醇＝99:1，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
检测Sub 1m及其还原产物的条件为：色谱柱：OJ-H，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
检测Sub 1n及其还原产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝99:1，流速：0.8ml/min，检测器：UV检测器，波长：230nm，柱温：25℃。
表1.OYE1催化2-芳基丙烯酸类化合物不对称还原反应的结果
表1：老黄酶OYE1野生型及其突变体催化还原2-芳基丙烯酸类化合物检测结果；a)转化率[％]；b)还原产物2-芳基丙酸类对映体过量值(ee％)。
SEQUENCE LISTING
<110> 沈阳药科大学
<120> 老黄酶OYE1突变体蛋白及在酶催化不对称还原前体2-芳基丙烯酸衍生物中的应用
<141> 2021
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 巴斯德酵母菌（Saccharomyces pastorianus）
<400> 1
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<212> PRT
<213> 巴斯德酵母菌（Saccharomyces pastorianus）
<400> 2
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Leu Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Leu His Arg Ala
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Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Trp Ala Ala Phe Pro Asp Asn Leu
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180 185 190
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195 200 205
Thr Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe
210 215 220
Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Leu Val Glu Ala Ile Gly His Glu Lys
225 230 235 240
Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Val Phe Asn Ser Met Ser Gly
245 250 255
Gly Ala Glu Thr Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Ala Gly Glu
260 265 270
Leu Glu Lys Arg Ala Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Val His Leu
275 280 285
Val Glu Pro Arg Val Thr Asn Pro Phe Leu Thr Glu Gly Glu Gly Glu
290 295 300
Tyr Glu Gly Gly Ser Asn Asp Phe Val Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro
305 310 315 320
Val Ile Arg Ala Gly Asn Phe Ala Leu His Pro Glu Val Val Arg Glu
325 330 335
Glu Val Lys Asp Lys Arg Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Phe Phe Ile
340 345 350
Ser Asn Pro Asp Leu Val Asp Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn
355 360 365
Lys Tyr Asp Arg Asp Thr Phe Tyr Gln Met Ser Ala His Gly Tyr Ile
370 375 380
Asp Tyr Pro Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Leu Gly Trp Asp Lys Lys
385 390 395 400
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 13
ccggaattcg atgtctttcg ttaaagactt caa 33
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 14
ccgctcgagt tttttgtccc aacccagt 28
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 15
gttcagctgg ctgttctggg t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 16
acccagaaca gccagctgaa c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 17
ccgccgctgg cgcgtatgcg t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artifical Sequence）
<400> 18
acgcatacgc gccagcggcg g 21
Claims (1)
1.一种老黄酶OYE1突变体蛋白的应用，其特征在于，在作为生物催化剂催化不对称还原前体2-芳基丙烯酸衍生物，制备光学纯的S-构型的2-芳基丙酸产物中的应用；所述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO.4所示或如SEQ ID NO.6所示或如SEQ IDNO.8所示或如SEQ ID NO.10所示；
所述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4时，用于催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物的结构式为
所述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.6时，用于催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物的结构式为
所述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.8时，用于催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物的结构式为
所述老黄酶OYE1突变体蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.10时，用于催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物的结构式为
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110163985.XA CN112813040B (zh) | 2021-02-05 | 2021-02-05 | 老黄酶oye1突变体蛋白及在酶催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物中的应用 |
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