CN110592038B - 一种生产丹参素的工程菌及方法 - Google Patents

一种生产丹参素的工程菌及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110592038B
CN110592038B CN201910881280.4A CN201910881280A CN110592038B CN 110592038 B CN110592038 B CN 110592038B CN 201910881280 A CN201910881280 A CN 201910881280A CN 110592038 B CN110592038 B CN 110592038B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
gly
val
glu
tanshinol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910881280.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110592038A (zh
Inventor
蔡宇杰
熊天真
丁彦蕊
白亚军
郑晓晖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuohong Chaoyuan Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910881280.4A priority Critical patent/CN110592038B/zh
Publication of CN110592038A publication Critical patent/CN110592038A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110592038B publication Critical patent/CN110592038B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C12N9/0018—Phenylalanine dehydrogenase (1.4.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/0102—Phenylalanine dehydrogenase (1.4.1.20)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种生产丹参素的工程菌及方法，属于生物工程技术领域。本发明构建了一种新型的双酶共表达基因工程菌，该菌可应用于光学纯的丹参素的生产。本发明选择的(D/L)‑α‑羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的R‑丹参素和S‑丹参素。利用本发明的重组菌转化生产丹参素的方法，过程简单且原料易得，杂质少，具有重要的工业应用价值。

Description

一种生产丹参素的工程菌及方法
技术领域
本发明涉及一种生产丹参素的工程菌及方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
提取自丹参的丹参素，学名R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、D-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：Danshensu、D-DSS、R-DSS、(R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-lactic acid、(R)-(+)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoic acid，是一种右旋酚酸类化合物。目前不存在天然的左旋丹参素。
丹参素是丹参水提液中的重要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，Ⅱ.D(+)β(3,4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。
当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利CN200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利CN201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程菌利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利CN201210190171.6提出了水解丹酚酸B生产丹参素的方法，丹酚酸B需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利CN201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。
早在1988年Roth等人提出了先以化学法处理左旋多巴得到对应的3,4-二羟基苯丙酮酸，再酶法合成S-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸(S-DSS，L-DSS)的方法(Enzymatic Synthesis of(S)-(-)-3-(3,4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid，Arch.Pharm.321，179-180(1988))。Z.Findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶将左旋多巴转化成3,4-二羟基苯丙酮酸，然后再用D-乳酸脱氢酶还原生成D-(3,4-二羟基苯基)乳酸(Modelling and Optimization of the(R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllactic AcidProduction Catalyzed with D-lactate Dehydrogenase from Lactobacillusleishmannii Using Genetic Algorithm，Chem.Biochem.Eng.Q.19(4)351–358(2005))。这两种方法制备3,4-二羟基苯丙酮酸中间体的成本较高，且操作复杂，需要使用葡萄糖或其它供氢体，增加了工业应用的成本，提高了催化反应的复杂性。
发明内容
基于目前各种方法的缺陷，本发明提了了一种光学纯的丹参素的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了丹参素的生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能低成本生产丹参素的重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
本发明的第一个目的是提供能低成本生产光学纯丹参素的重组菌；所述重组菌同时表达2种酶，分别为α-羟基羧酸脱氢酶和L-苯丙氨基酸脱氢酶。
在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Clostridium sporogenes DSM 795或者Lactobacillus fermentum ATCC14931。
在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为L型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Bacillus coagulans DSM 1、Trypanosoma cruzi ATCC 30013或者Lactobacillusfermentum ATCC 14931。
在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_003643296.1、AKJ91234.1、或EEI22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为L-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013858488.1、AAF36775.1或WP_035430779.1的序列。
在一种实施方式中，D-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_GL379761REGION:COMPLEMENT(533562..534560)、CP011663REGION:complement(3702744..3703739)、ACGI01000078REGION:20793..21791的序列；L-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_ATUM01000014REGION:39316..40254、AF112259.1、NZ_GG669901REGION:45517..46470的序列。
在一种实施方式中，所述L-苯丙氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
本发明的第二个目的是提供一种生产丹参素的方法，所述方法是利用本发明的重组菌进行全细胞转化生产。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括细胞湿重为1-200g/L，左旋多巴1-200g/L，NAD 0-1g/L，pH 6.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。
本发明的第三个目的是提供一种L-苯丙氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。
本发明还要求保护编码所述L-苯丙氨酸脱氢酶的基因，携带所述基因的载体，及表达所述L-苯丙氨酸脱氢酶的细胞。
有益效果：
本发明构建了一种新型的双酶共表达基因工程菌，该菌可应用于光学纯的丹参素的生产。本发明选择的(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的R-丹参素和S-丹参素，e.e％>99.9。利用本发明的重组菌转化生产丹参素的方法，过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
附图说明
图1为pH对丹参素产量的影响图。
具体实施方式
本发明的工程菌的功能核心在于可以同时表达2种酶，分别为L-苯丙氨基酸脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，L-苯丙氨脱氢酶以NAD为辅酶将左旋多巴脱氢生成3,4-二羟基苯丙酮酸和NADH；α-羟基羧酸脱氢酶利用脱氢过程生成的NADH将3,4-二羟基苯丙酮酸还原成丹参素、同时实现了辅酶NAD的再生。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
1.本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus fermentum ATCC 14931、Escherichia coli BL21(DE3)、Trypanosomacruzi ATCC 30013。购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ的Bacillus coagulans DSM 1、Clostridium sporogenes DSM795。购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。
2.酶的选择
(1)α-羟基羧酸脱氢酶的选择
根据最适底物的情况，α-羟基羧酸脱氢酶包含有乳酸脱氢酶、α-羟酸异己酸脱氢酶、扁桃酸脱氢酶、乙醛酸还原酶等，这些酶能广泛作用于多种底物生成α-羟基羧酸，通常根据其最适作用的底物来命名。本发明从中选择光学性强且对3,4-二羟基苯丙酮酸具有较强活性的酶，用于D或L丹参素的生产。从Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Clostridium sporogenes DSM 795、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到D型α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、csldhd、lfldhd，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为WP_003643296.1、AKJ91234.1、EEI22188.1的序列。从Bacillus coagulans DSM 1、Trypanosoma cruzi ATCC 30013、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到L型α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、tcldhl、lfldhl，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013858488.1、AAF36775.1、WP_035430779.1的序列。
(2)L-苯丙氨酸脱氢酶的选择
含有L-苯丙氨酸脱氢酶基因的菌株不多，并且报道均不能以左旋多巴为底物脱氢，本发明以来源于Bacillus sphaericus的L-苯丙氨酸脱氢酶(NCBI上氨基酸序列的accession NO为BAA08816.1，Phenylalanine dehydrogenase of Bacillus badiusPurification,characterization and gene cloning，Eur.J.Biochem.168,153-159(1987))为基础，其DNA进行根据大肠杆菌宿主优化并全合成获得基因bspde，并进行随机突变。
3.酶的随机突变高通量筛选
按照生产商提供的使用说明书，用GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒对目标片段进行易错PCR随机突变。扩增体系为：10×Mutazyme II reaction buffer 5μl、模板DNA 1μL、sample primers(125ng/μl of each primer)1μL、40mM dNTP mix(200μM eachfinal)1μL、Mutazyme II DNA polymerase(2.5U/μl)1μL、ddH2O 41μL。扩增程序为：95℃，2min；95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30个循环；72℃，10min。
将产生的PCR产物和质粒pET28a质粒进行双酶切。酶切体系为：10×cut buffer 5μL,DNA10μL，限性内切酶1和限制性内切酶2各1μL，无菌水33μL。将pET28a质粒和PCR产物于37℃水浴下双酶切1h。
然后分别回收酶切产物，并于16℃水浴下连接12h-16h，连接体系为：10×DNAligase buffer 2.5μL，DNA片段8μL，载体DNA 2μL，T4 DNA ligase 1μL，无菌水11.5μL共25μL。随后在连接体系中加入100μL大肠杆菌BL21感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。立即冰浴2min。加入1mL不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。最后将菌体均匀涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，培养24h。
将平板上所有转化子挑到每孔含1ml LB液体培养基(100μg/ml氨苄青霉和0.2mmol/L IPTG)的96深孔板中，放置于多孔板震荡培养箱中，37℃，900r/min培养10小时，从而完成整个突变库的构建。
诱导表达结束后，在96孔板中加入20mg/mL蜗牛酶10μL，37℃保温1h。然后取0.5mL破壁液重新放于96孔板中，添加50μl 28g/L的3,4-二羟基苯丙酮酸，辅酶NADH 0.8mM，检测还原型辅酶NAD在340nm下的数值降低斜率，斜率越大酶活越高。整个过程在Enspire多标记检测系统酶标仪中自动完成。
经过粗筛后将活性高的酶表达并纯化，采用纯酶测定其活性。苯丙氨酸脱氢酶活力测定：3ml反应体积中左旋多巴1mM、NAD 0.12mM、pH8、温度35℃，340nm测定NADH的增加速率。比酶活(U mg-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位，一个酶活力单位(U)定义为1min生成1μmol NADH所需的酶量。
4.共表达体系的构建及细胞的培养
目前大肠杆菌多基因共表达有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含两个基因，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
5.全细胞转化生产光学纯丹参素
细胞转化生产的体系为：细胞湿重为1-200g/L，左旋多巴浓度为1-200g/L，0-1g/LNAD,pH 4.0-9.0，于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。左旋多巴溶解度较低，高浓度情况下是含有不溶物的混悬液。
6.样品的检测分析
丹参素定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配紫外检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、280nm。
手性分析：PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配示紫外检测器，Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，进样量20μL，检测波长280nm。
丹参素溶解度较低，转化过程如有结晶析出，则稀释后测定。
丹参素的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。
当生产R-丹参素时，
对映体过量值％e.e＝[(SR-SS)/(SR+SS)×100％]
当生产S-丹参素时，
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SR+SS)×100％]
式中SS为转化液中S-丹参素的峰面积，SR为转化液中R-丹参素的液相色谱峰面积。
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
L-苯丙氨酸脱氢酶的筛选：按照前述酶的随机突变高通量筛选方法，采用易错PCR及高通量筛选平台得到三个多巴脱氢的最佳的突变体bspde1、bspde2、bspde3，并进行测序。bspde1、bspde2、bspde3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示，编码这3个突变体的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5所示。测得L-苯丙氨脱氢酶三个突变体对左旋多巴脱氢的比酶活(即以左旋多巴为底物、NAD为辅酶，脱氢生成3,4-二羟基苯丙酮酸)分别为20.2、18.9、6.4U/mg。以NCBI上氨基酸序列的accession NO为BAA08816.1的L-苯丙氨酸脱氢酶为对照，在相同条件下测定，对照酶对左旋多巴脱氢的比酶活为0。
实施例2
重组大肠杆菌构建：首先将编码α-羟基羧酸脱氢酶和L-苯丙氨酸脱氢酶的基因，连接到质粒上。得到双基因共表达重组质粒，将质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，利用抗生素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞终浓度为80g/L，反应体系中含有1g/L NAD、20g/L左旋多巴，pH 8.0，于35℃反应，摇床转速50转/分钟，时间12小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。
分别将表1的重组菌用于上述转化体系中，结果如表1所示。
表1各种重组菌的丹参素产量比较
Figure GDA0002882648730000061
Figure GDA0002882648730000071
实施例3
根据实施例1所述诱导表达方法，将Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-csldhd-bspde2诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞终浓度100g/L，左旋多巴1g/L，pH 9.0，温度为40℃，摇床转速50转/分钟；转化时间1小时。测定结果，S-丹参素浓度为821mg/L，e.e％>99.9。
实施例4
根据实施例1所述诱导表达方法，将Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-csldhd-bspde2菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞终浓度200g/L，左旋多巴200g/L，pH 8.5，温度为25℃，NAD 1g/L，摇床转速50转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解，测定结果，R-丹参素浓度为188.3g/L，e.e％>99.9。
实施例5
根据实施例1所述诱导表达方法，将Escherichia coli BL21(DE3)/pETDuet-1-csldhd-bspde2菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞终浓度100g/L，左旋多巴10g/L，pH 7，温度为15℃，NAD 0g/L，摇床转速50转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解，测定结果，R-丹参素浓度为9.2g/L，e.e％>99.9。
实施例6
根据实施例1所述诱导表达方法，将Escherichia coli BL21(DE3)/pRSFDuet-1-tcldhl-bspde2菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml不同pH的反应体系中，细胞终浓度10g/L，左旋多巴20g/L，NAD 0.5g/L，温度为15℃，摇床转速50转/分钟；转化时间12小时。pH的影响如图1所示。在pH为6～8.5时，产量大于17g/L，最高可达19.2g/L。不同pH下S-丹参素的e.e％>99.9。
实施例7
实验过程中发现bspde的突变体具有对其它氨基酸进行脱氢的能力，因此测试了几种工程菌对部分天然氨基酸的转化，结果如表2所示，表中所有氨基酸均为L型。
如实施例1构建重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为200g/L，1g/L NAD、底物浓度为30g/L(相关底物如表2所示，酪氨酸溶解度很小，可以边溶解边反转化)，pH 8.5，于35℃反应，摇床转速50转/分钟，时间48小时。转化结束后液相色谱测定产物产量及构型。
表2其它底物的转化结果
Figure GDA0002882648730000091
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高效生产丹参素的工程菌及方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgtccctgg ttgaaaaaac cagcatcatt aaagacttca ctctgttcga gaaaatgtcc 60
gaacacgaac aggtcgtttt ctgcaatgat ccggctaccg gtctgcgtgc tatcattgca 120
attcacgata ccacgctggg cccggcgctg gccgcctgcc gtatgcaacc atataactcc 180
gttgaagaag cgctggaaga tgcactgcgc ctgagcaaag gtatgaccta catatgtgct 240
gcatccgacg tcgatttcgg tggcggcaat gctgttatta tcggtgaccc acagaaagac 300
aaatctccgg aactgttccg cgctttcggc cagttcgtag actctctggg tggtcgtttc 360
tacaccggca ccgatatggg caccaacatg gaagatttca tccacgcgat gaaagagact 420
aactgtatcg ttggcgttcc ggaagcttac ggtggtggtg gtgactcttc cattccgacc 480
gctatgggcg tcctgtacgg tatcaaagct accaataaaa tgctgttcgg taaagacgat 540
ctgggcggcg tgacgtacgc tattcagggc ctgggcaaag ttggttataa ggtagcggag 600
ggcctgctgg aagagggcgc gcacctgttt gtaaccgata tcaacgagca gactctggaa 660
gcgatccagg aaaaggcaaa aaccacttct ggcagcgtta ccgttgtggc gtctgatgaa 720
atttactctc aggaagccga cgtgtttgtg ccttgcgcat tcggcggtgt ggtaaacgac 780
gagactatga aacagttcaa agtaaaagcc atcgcaggtt ctgctaacaa ccagctgctg 840
accgaagacc acggtcgtca cctggccgac aaaggcattc tgtatgcgcc ggattatatt 900
gttaactctg gcggtctgat ccaagtggcg gacgaactgt acgaggtaaa caaagaacgt 960
gttctggcga aaaccaaaca catctatgac gcgatcctgg aagtttacca gcaggctgaa 1020
ctggatcaaa tcaccaccat ggaggctgcg aaccgtatgt gtgaacagcg catggcagca 1080
cgcggtcgcc gcaactcttt cttcacctct tctgtaaaac cgaaatggga tatccgcaac 1140
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ser Leu Val Glu Lys Thr Ser Ile Ile Lys Asp Phe Thr Leu Phe
1 5 10 15
Glu Lys Met Ser Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Asn Asp Pro Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Ala Ala Cys Arg Met Gln Pro Tyr Asn Ser Val Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ile Cys Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Asn Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Gln Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Asp Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Asn Met Glu Asp Phe Ile His Ala Met Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Ser Ser Ile Pro Thr
145 150 155 160
Ala Met Gly Val Leu Tyr Gly Ile Lys Ala Thr Asn Lys Met Leu Phe
165 170 175
Gly Lys Asp Asp Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ala Ile Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Tyr Lys Val Ala Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Ala His
195 200 205
Leu Phe Val Thr Asp Ile Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Lys Thr Thr Ser Gly Ser Val Thr Val Val Ala Ser Asp Glu
225 230 235 240
Ile Tyr Ser Gln Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Val Asn Asp Glu Thr Met Lys Gln Phe Lys Val Lys Ala Ile Ala
260 265 270
Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Thr Glu Asp His Gly Arg His Leu
275 280 285
Ala Asp Lys Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Glu Val Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys His Ile Tyr Asp Ala Ile Leu Glu Val Tyr
325 330 335
Gln Gln Ala Glu Leu Asp Gln Ile Thr Thr Met Glu Ala Ala Asn Arg
340 345 350
Met Cys Glu Gln Arg Met Ala Ala Arg Gly Arg Arg Asn Ser Phe Phe
355 360 365
Thr Ser Ser Val Lys Pro Lys Trp Asp Ile Arg Asn
370 375 380
<210> 3
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtccctgg ttgaaaaaac cagcatcatt aaagacttca ctctgttcga gaaaatgtcc 60
gaacacgaac aggtcgtttt ctgcaatgat ccggctaccg gtctgcgtgc tatcattgca 120
attcacgata ccacgctggg cccggcgctg gccgcctgcc gtatgcaacc atataactcc 180
gttgaagaag cgctggaaga tgcactgcgc ctgagcaaag gtatgaccta caaatgtgct 240
gcatccgacg tcgatttcgg tggcggcaaa gctgttatta tcggtgaccc acagaaagac 300
aaatctccgg aactgttccg cgctttcggc cagttcgtag actctctggg tggtcgtttc 360
tacaccggca ccgatatggg caccaacatg gaagatttca tccacgcgat gaaagagact 420
aactgtatcg ttggcgttcc ggaagcttac ggtggtggtg gtgactatgc cattccgacc 480
gctatgggcg tcctgtacgg tatcaaagct accaataaaa tgctgttcgg taaagacgat 540
ctgggcggcg tgacgtacgc tattcagggc ctgggcaaag ttggttataa ggtagcggag 600
ggcctgctgg aagagggcgc gcacctgttt gtaaccgata tcaacgagca gactctggaa 660
gcgatccagg aaaaggcaaa aaccacttct ggcagcgtta ccgttgtggc gtctgatgaa 720
atttactctc aggaagccga cgtgtttgtg ccttgcgcat tcggcggtgt ggtaaacgac 780
gagactatga aacagttcaa agtaaaagcc atcgcaggtt ctgctaacaa ccagctgctg 840
accgaagacc acggtcgtca cctggccgac aaaggcattc tgtatgcgcc ggattatatt 900
gttaactctg gcggtctgat ccaagtggcg gacgaactgt acgaggtaaa caaagaacgt 960
gttctggcga aaaccaaaca catctatgac gcgatcctgg aagtttacca gcaggctgaa 1020
ctggatcaaa tcaccaccat ggaggctgcg aaccgtatgt gtgaacagcg catggcagca 1080
cgcggtcgcc gcaactcttt cttcacctct tctgtaaaac cgaaatggga tatccgcaac 1140
<210> 4
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ser Leu Val Glu Lys Thr Ser Ile Ile Lys Asp Phe Thr Leu Phe
1 5 10 15
Glu Lys Met Ser Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Asn Asp Pro Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Ala Ala Cys Arg Met Gln Pro Tyr Asn Ser Val Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys Cys Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Gln Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Asp Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Asn Met Glu Asp Phe Ile His Ala Met Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Ala Ile Pro Thr
145 150 155 160
Ala Met Gly Val Leu Tyr Gly Ile Lys Ala Thr Asn Lys Met Leu Phe
165 170 175
Gly Lys Asp Asp Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ala Ile Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Tyr Lys Val Ala Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Ala His
195 200 205
Leu Phe Val Thr Asp Ile Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Lys Thr Thr Ser Gly Ser Val Thr Val Val Ala Ser Asp Glu
225 230 235 240
Ile Tyr Ser Gln Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Val Asn Asp Glu Thr Met Lys Gln Phe Lys Val Lys Ala Ile Ala
260 265 270
Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Thr Glu Asp His Gly Arg His Leu
275 280 285
Ala Asp Lys Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Glu Val Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys His Ile Tyr Asp Ala Ile Leu Glu Val Tyr
325 330 335
Gln Gln Ala Glu Leu Asp Gln Ile Thr Thr Met Glu Ala Ala Asn Arg
340 345 350
Met Cys Glu Gln Arg Met Ala Ala Arg Gly Arg Arg Asn Ser Phe Phe
355 360 365
Thr Ser Ser Val Lys Pro Lys Trp Asp Ile Arg Asn
370 375 380
<210> 5
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgtccctgg ttgaaaaaac cagcatcatt aaagacttca ctctgttcga gaaaatgtcc 60
gaacacgaac aggtcgtttt ctgcaatgat ccggctaccg gtctgcgtgc tatcattgca 120
attcacgata ccacgctggg cccggcgctg gccgcctgcc gtatgcaacc atataactcc 180
gttgaagaag cgctggaaga tgcactgcgc ctgagcaaag gtatgaccta catatgtgct 240
gcatccgacg tcgatttcgg tggcggcaaa gctgttatta tcggtgaccc acagaaagac 300
aaatctccgg aactgttccg cgctttcggc cagttcgtag actctctggg tggtcgtttc 360
tacaccggca ccgatatggg ctccaacatg gaagatttca tccacgcgat gaaagagact 420
aactgtatcg ttggcgttcc ggaagcttac ggtggtggtg gtgactatgc cattccgacc 480
gctatgggcg tcctgtacgg tatcaaagct accaataaaa tgctgttcgg taaagacgat 540
ctgggcggcg tgacgtacgc tattcagggc ctgggcaaag ttggttataa ggtagcggag 600
ggcctgctgg aagagggcgc gcacctgttt gtaaccgata tcaacgagca gactctggaa 660
gcgatccagg aaaaggcaaa aaccacttct ggcagcgtta ccgttgtggc gtctgatgaa 720
atttactctc aggaagccga cgtgtttgtg ccttgcgcat tcggcggtgt ggtaaacgac 780
gagactatga aacagttcaa agtaaaagcc atcgcaggtt ctgctaacaa ccagctgctg 840
accgaagacc acggtcgtca cctggccgac aaaggcattc tgtatgcgcc ggattatatt 900
gttaactctg gcggtctgat ccaagtggcg gacgaactgt acgaggtaaa caaagaacgt 960
gttctggcga aaaccaaaca catctatgac gcgatcctgg aagtttacca gcaggctgaa 1020
ctggatcaaa tcaccaccat ggaggctgcg aaccgtatgt gtgaacagcg catggcagca 1080
cgcggtcgcc gcaactcttt cttcacctct tctgtaaaac cgaaatggga tatccgcaac 1140
<210> 6
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Ser Leu Val Glu Lys Thr Ser Ile Ile Lys Asp Phe Thr Leu Phe
1 5 10 15
Glu Lys Met Ser Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Asn Asp Pro Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Ala Ala Cys Arg Met Gln Pro Tyr Asn Ser Val Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ile Cys Ala
65 70 75 80
Ala Ser Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Gln Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Asp Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Ser
115 120 125
Asn Met Glu Asp Phe Ile His Ala Met Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Ala Ile Pro Thr
145 150 155 160
Ala Met Gly Val Leu Tyr Gly Ile Lys Ala Thr Asn Lys Met Leu Phe
165 170 175
Gly Lys Asp Asp Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ala Ile Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Tyr Lys Val Ala Glu Gly Leu Leu Glu Glu Gly Ala His
195 200 205
Leu Phe Val Thr Asp Ile Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ile Gln Glu
210 215 220
Lys Ala Lys Thr Thr Ser Gly Ser Val Thr Val Val Ala Ser Asp Glu
225 230 235 240
Ile Tyr Ser Gln Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Val Asn Asp Glu Thr Met Lys Gln Phe Lys Val Lys Ala Ile Ala
260 265 270
Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Thr Glu Asp His Gly Arg His Leu
275 280 285
Ala Asp Lys Gly Ile Leu Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Glu Val Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys His Ile Tyr Asp Ala Ile Leu Glu Val Tyr
325 330 335
Gln Gln Ala Glu Leu Asp Gln Ile Thr Thr Met Glu Ala Ala Asn Arg
340 345 350
Met Cys Glu Gln Arg Met Ala Ala Arg Gly Arg Arg Asn Ser Phe Phe
355 360 365
Thr Ser Ser Val Lys Pro Lys Trp Asp Ile Arg Asn
370 375 380

Claims (10)

1.一种L-苯丙氨酸脱氢酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示。
2.编码权利要求1所述L-苯丙氨酸脱氢酶的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或表达权利要求1所述L-苯丙氨酸脱氢酶的细胞。
4.一种基因工程菌，其特征在于，表达α-羟基羧酸脱氢酶和权利要求1所述的L-苯丙氨基酸脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Clostridium sporogenesDSM 795或者Lactobacillus fermentum ATCC 14931。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述α-羟基羧酸脱氢酶为L型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Bacillus coagulans DSM 1、Trypanosoma cruzi ATCC 30013或者Lactobacillus fermentum ATCC 14931。
7.一种生产丹参素的方法，其特征在于，以权利要求4～6任一所述的基因工程菌为细胞催化剂，全细胞转化生产丹参素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化体系中含有1-200g/L细胞，1-200g/L左旋多巴，0-1g/L NAD。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述转化是在15-40℃反应1-48小时。
10.权利要求1所述的L-苯丙氨酸脱氢酶或权利要求4～6任一所述的基因工程菌在生物法制备含丹参素的产品中的应用。
CN201910881280.4A 2019-09-18 2019-09-18 一种生产丹参素的工程菌及方法 Active CN110592038B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910881280.4A CN110592038B (zh) 2019-09-18 2019-09-18 一种生产丹参素的工程菌及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910881280.4A CN110592038B (zh) 2019-09-18 2019-09-18 一种生产丹参素的工程菌及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110592038A CN110592038A (zh) 2019-12-20
CN110592038B true CN110592038B (zh) 2021-03-26

Family

ID=68860599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910881280.4A Active CN110592038B (zh) 2019-09-18 2019-09-18 一种生产丹参素的工程菌及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110592038B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110616180B (zh) * 2019-09-18 2021-01-29 江南大学 一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001218579A (ja) * 2000-02-08 2001-08-14 Unitika Ltd Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその製造法
CN101041860A (zh) * 2007-04-20 2007-09-26 天津中医药大学 丹参素相关基因的检测芯片、制备及检测方法
CN103667371A (zh) * 2013-11-11 2014-03-26 天津大学 一种丹参素的生物生产方法
CN108949653A (zh) * 2018-04-19 2018-12-07 江南大学 一种工程菌及其在丹参素生产中的应用
CN108949650A (zh) * 2018-04-19 2018-12-07 江南大学 一种丹参素的生产方法及工程菌

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851810A (en) * 1995-06-05 1998-12-22 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University Nucleic acid encoding rhodococcus phenylalanine dehydrogenase
ITRM20030556A1 (it) * 2003-11-28 2005-05-29 Uni Degli Studi Di Roma To R Vergata Metodo per la determinazione quantitativa e semiquantitativa di l-fenilalanina, l-tirosina, l-3,4-diidrossifenilalanina e dei loro corrispondenti chetoacidi nei fluidi biologici e relativo kit diagnostico.
CN107586752B (zh) * 2017-08-04 2019-12-24 江南大学 一种工程菌及其应用
CN108949648B (zh) * 2018-04-19 2019-10-25 江南大学 一种工程菌及其以廉价底物生产丹参素的应用
CN108424937B (zh) * 2018-04-27 2022-06-21 鲁东大学 一种酶法合成丹参素的方法
CN110616180B (zh) * 2019-09-18 2021-01-29 江南大学 一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001218579A (ja) * 2000-02-08 2001-08-14 Unitika Ltd Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその製造法
CN101041860A (zh) * 2007-04-20 2007-09-26 天津中医药大学 丹参素相关基因的检测芯片、制备及检测方法
CN103667371A (zh) * 2013-11-11 2014-03-26 天津大学 一种丹参素的生物生产方法
CN108949653A (zh) * 2018-04-19 2018-12-07 江南大学 一种工程菌及其在丹参素生产中的应用
CN108949650A (zh) * 2018-04-19 2018-12-07 江南大学 一种丹参素的生产方法及工程菌

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enzymatic determination of L-phenylalanine and phenylpyruvate with L-phenylalanine dehydrogenase;W Hummel等;《Anal Biochem》;19880501;第170卷(第2期);第397-401页 *
手性多巴在代谢网络中与手性丹参素转化关系的研究;王静;《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑（电子期刊）》;20170315(第03期);A006-192 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110592038A (zh) 2019-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110616180B (zh) 一种生产羟基酪醇的工程菌及其应用
CN110396513B (zh) 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
CN109266595B (zh) 一种转化l-苏氨酸生产l-2-氨基丁酸的重组菌的构建及应用
CN112877307B (zh) 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用
CN112143764B (zh) 一种生物酶催化制备布瓦西坦中间体化合物的方法
CN113717910B (zh) 一种三酶共表达重组菌及其在(s)-香茅醇合成中的应用
CN113151201B (zh) 高热稳定性高活性异丁香酚单加氧酶突变体及其应用
CN111996176B (zh) 羰基还原酶突变体及其应用
CN111690624A (zh) 一种利用微生物合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法
CN110592038B (zh) 一种生产丹参素的工程菌及方法
CN108410831B (zh) 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN110396507A (zh) 源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶
CN109929822A (zh) 一种米曲霉脂肪酶突变体及其应用
CN112442518B (zh) 一种以廉价底物生产亚精胺的方法及工程菌
CN112080479A (zh) 一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用
CN108949648B (zh) 一种工程菌及其以廉价底物生产丹参素的应用
CN114350630B (zh) L-泛解酸内酯脱氢酶、突变体及其应用
KR102616750B1 (ko) 유전자 조작 박테리아 및 단삼소 생산에서 이의 응용
CN108949653B (zh) 一种工程菌及其在丹参素生产中的应用
CN113930457A (zh) 一种双酶偶联合成(s)-香茅醇的方法
CN113061593A (zh) 一种l-苹果酸脱氢酶突变体及其应用
CN108949646B (zh) 一种可联产丹参素和丙氨酸的工程菌及其应用
CN108865960B (zh) 一种工程菌及其在丹参素和丙氨酸联产中的应用
CN112813040B (zh) 老黄酶oye1突变体蛋白及在酶催化不对称还原2-芳基丙烯酸衍生物中的应用
CN114410599B (zh) 羰基还原酶突变体及其制备瑞舒伐他汀手性中间体的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230223

Address after: Floor 20, Unit 2, Building 1, Jinlan West Jingyuan, No. 56, Shinan Road, Science Avenue, High-tech Industrial Development Zone, Zhengzhou City, Henan Province, 450000

Patentee after: Zhuohong Chaoyuan Biotechnology (Zhengzhou) Co.,Ltd.

Address before: 214000 1800 Lihu Avenue, Binhu District, Wuxi, Jiangsu

Patentee before: Jiangnan University

TR01 Transfer of patent right