CN108865960B - 一种工程菌及其在丹参素和丙氨酸联产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种工程菌及其在丹参素和丙氨酸联产中的应用，属于生物工程技术领域。本发明构建了三酶共表达基因工程菌，实现了丹参素和丙氨酸的联产，进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。本发明的基因工程机可生产光学纯的D‑丹参素和L‑丹参素，同时联产丙酮酸，且该生产过程简单、原料易得、杂质少，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种工程菌及其在丹参素和丙氨酸联产中的应用
技术领域
本发明涉及一种工程菌及其在丹参素和丙氨酸联产中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
提取自丹参的丹参素，学名R-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、D-(+)-β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：Danshensu、D-DSS、R-DSS、(R)-(+)-3-(3，4-Dihydroxyphenyl)-lactic acid、(R)-(+)-3-(3，4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoic acid，是一种右旋酚酸类化合物。目前不存在天然的左旋丹参素。
丹参素是丹参水提液中的重要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，Ⅱ.D(+)β(3，4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。
当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利CN200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利CN201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程菌利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利CN201210190171.6提出了水解丹酚酸B生产丹参素的方法，丹酚酸B需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利CN201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。
早在1988年Roth等人提出了先以化学法处理左旋多巴得到对应的3，4-二羟基苯丙酮酸，再酶法合成S-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸(S-DSS，L-DSS)的方法(Enzymatic Synthesis of(S)-(-)-3-(3，4-Dihydroxyphenyl)lactic Acid，Arch.Pharm.(Weinheim)321，179-180(1988))。Z.Findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶将左旋多巴转化成3，4-二羟基苯丙酮酸，然后再用D-乳酸脱氢酶还原生成D-(3，4-二羟基苯基)乳酸(Modelling and Optimization of the(R)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllactic AcidProduction Catalyzed with D-lactateDehydrogenase from Lactobacillusleishmannii Using Genetic Algorithm，Chem.Biochem.Eng.Q.19(4)351–358(2005))。这两种方法制备3，4-二羟基苯丙酮酸中间体的成本较高，且操作复杂。
发明内容
基于目前各种方法的缺陷，本发明提了了一种基于转氨酶的光学纯的丹参素生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了丹参素的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能低成本生产丹参素的重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
本发明的第一个目的是提供能低成本生产光学纯丹参素的重组菌；所述重组菌同时表达3种酶，分别为L-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。
在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Enterococcus faecalis ATCC 35038或者Lactobacillus fermentum ATCC 14931。
在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为L型α-羟基羧酸脱氢酶，来自Bacillus coagulans DSM 1、Weissella confusa strain DSM 20196或者Lactobacillusfermentum ATCC 14931。
在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为D-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_003643296.1、WP_002335374.1、或EEI22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为L-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013858488.1、WP_003607654.1或WP_035430779.1的序列。
在一种实施方式中，D-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_GL379761 REGION:COMPLEMENT(533562..534560)、NZ_KB944641 REGION:161892..162830、ACGI01000078 REGION:20793..21791的序列；L-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO.为NZ_ATUM01000014 REGION:39316..40254、NZ_JQAY01000006 REGION:69708..70640、NZ_GG669901 REGION:45517..46470的序列。
在一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶来自Bacillus subtilis ATCC 13952。
在一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013351020.1序列。
在一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NZ_CP009748 REGION:386154..38693。
在一种实施方式中，所述L-α-氨基酸转氨酶来自Escherichia coli BL21、Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillus paracasei ATCC 334。
在一种实施方式中，L-α-氨基酸转氨酶的氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_000462687.1、WP_000486988.1、WP_003643296.1、YP_806114.1的序列。
在一种实施方式中，L-α-氨基酸转氨酶的核苷酸序列是NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:COMPLEMENT(989603..990793)、NC_012892 REGION:4174517..4175710、NZ_GL379768 REGION:complement(121900..123087)、NC_008526REGION:complement(840419..841594)的序列。
在一种实施方式中，所述重组菌，是将编码L-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因，都连接到质粒上，构建得到三基因共表达重组质粒，然后将重组质粒转化相应菌株，得到重组工程菌。
在一种实施方式中，所述重组菌是以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主构建得到的。
在一种实施方式中，所述酚类化合物分解相关的基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合。
在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是NCBI上,NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。
在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了丙酮酸转运基因、NAD合成基因、磷酸吡哆醛合成基因一种或者多种。
在一种实施方式中，所述强化表达是通过将Escherichia coli BL21(DE3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
在一种实施方式中，所述强化表达的基因为btsT和ybdD(丙酮酸向胞内转运基因)、nadA(NAD合成基因)、pdxJ(磷酸吡多醛合成基因)中的任意一种或多种。
在一种实施方式中，所述btsT和ybdD在NCBI上accession NO为：；nadA为NC_012892 REGION:740487..741530；pdxJ为NC_012892 REGION:complement(2567591..2568322)。
本发明的第二个目的是提供一种生产丹参素的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。
在一种实施方式中，所述生产丹参素，是进行全细胞转化生产。
在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括细胞湿重为1-200g/L，左旋多巴浓度为1-200g/L，丙酮酸浓度为1-200g/L，葡萄糖浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种新型的三酶共表达基因工程菌，实现了丹参素和丙氨酸的联产，进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。本发明选择的(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的D-丹参素和L-丹参素，同时联产丙氨酸。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。
具体实施方案
本发明的工程菌的功能核心在于可以同时表达3种酶，分别为L-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，葡萄糖脱氢酶以菌体内的NAD为辅酶将葡萄糖脱氢生成葡萄糖酸和NADH；左旋多巴被L-α-氨基酸转氨酶脱氨生成3,4-二羟基苯丙酮酸，丙酮酸获得氨转化成丙氨酸；α-羟基羧酸脱氢酶利用葡萄糖脱氢过程生成的NADH将3,4-二羟基苯丙酮酸还原成丹参素、同时实现了辅酶NAD的再生。进一步地，同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
1.本发明所涉及的菌株及质粒
购自美国菌种保藏中心ATCC的Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Enterococcus faecalis ATCC 35038、Lactobacillus fermentum ATCC 14931、Lactobacillus paracasei ATCC 334、Bacillus subtilis ATCC 13952、Escherichiacoli BL21(DE3)、Lactococcus lactis ATCC 19257。购自德国微生物菌种保藏中心DSMZ的Bacillus coagulans DSM 1、Weissella confusa strain DSM 20196。购自Novagen公司的pETDuet-1、pACYCDue-1、pCOLADuet-1、pRSFDuet-1质粒和Escherichia coli BL21(DE3)。
2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达
(1)大肠杆菌酚类化合物分解相关的基因的敲除
本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(Biodegradationof Aromatic Compounds by Escherichia coli，Microbiol Mol Biol Rev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpaD和mhpB,NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(4505585..4506436)和NC_012892REGION:339806..340750。
(2)大肠杆菌丙酮酸转运基因的组成型强化表达
在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强丙酮酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择丙酮酸转运相关的基因是btsT和ybdD，NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(4496239..4498389)和NC_012892 REGION:592652..592849。多巴与芳香族氨基酸类似，细胞培养过程中需要吸收氨基酸等，因此菌体本身会表达大量的氨基酸转运蛋白，无须再强化表达。
(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达
在α-羟基羧酸脱氢酶还原过程中需要以NADH为辅酶，强化表达大肠杆菌NAD合成途径的关键酶，可以提高菌体内的NAD水平，从而有利于丹参素的生成。选择的基因有nadA。NCBI上accessionNO为：NC_012892 REGION:740487..741530。
磷酸吡多醛(胺)是L-α-氨基酸转氨酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxJ，有利于左旋多巴的合成。NCBI上accession NO为：NC_012892 REGION:complement(2567591..2568322)。
3.酶的选择
(1)L-α-氨基酸转氨酶的选择
L-α-氨基酸转氨酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞中。通常活力最高的是以α-酮戊二酸或草酰乙酸为受氨体的转氨酶，在这过程中α-酮戊二酸或草酰乙酸价格昂贵，而对应生成的谷氨酸或天冬氨酸价值均远低于对应的前体，综合考查20种天然L-氨基酸对应的α-酮酸发现，丙酮酸与丙氨酸的价格相当，因此本申请选择以丙酮酸为氨的受体，从而实现丙氨酸与丹参素的联产。从Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Lactobacillusparacasei ATCC 334中分别克隆得到L-α-氨基酸转氨酶基因lpt、lct，其氨基酸序列是NCBI上accession NO.为WP_003643296.1、YP_806114.1的序列。从Escherichia coli BL1(DE3)中克隆得到两个L-α-氨基酸转氨酶基因ect1、ect2，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_000462687.1、WP_000486988.1。
(2)α-羟基羧酸脱氢酶的选择
根据最适底物的情况，α-羟基羧酸脱氢酶包含有乳酸脱氢酶、α-羟酸异己酸脱氢酶、扁桃酸脱氢酶、乙醛酸还原酶等，这些酶能广泛作用于多种底物生成α-羟基羧酸，通常根据其最适作用的底物来命名。本发明从中选择光学性强且对3，4-二羟基苯丙酮酸具有较强活性的酶，用于D或L丹参素的生产。从Lactobacillus plantarum ATCC 14917、Enterococcus faecalis ATCC 35038、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到D型α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其氨基酸序列是NCBI上accessionNO.为WP_003643296.1、WP_002335374.1、EEI22188.1的序列。从Bacillus coagulans DSM1、Weissella confusa strain DSM 20196、Lactobacillus fermentum ATCC 14931中分别克隆得到L型α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其氨基酸序列是NCBI上accession NO为WP_013858488.1、WP_003607654.1、WP_035430779.1的序列。
(3)葡萄糖脱氢酶的选择
在生物转化反应中，α-羟基羧酸脱氢酶需要以NADH和/或NADPH为辅酶，采常有甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、亚磷酸酸脱氢酶等，葡萄糖脱氢酶相对于其它来酶来说活力最高，因此本发明从Bacillus subtilis ATCC 13952得到葡萄糖脱氢酶基因bsgdh(氨基酸序列是WP_013351020.1)。
4.三酶共表达体系的构建及细胞的培养
目前大肠杆菌多基因共表达有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含T7启动子和RBS结合点，每个基因后有一个T7终止子。理论上来讲因为每个基因前都有T7和RBS，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含三个基因(L-α-氨基酸转氨酶、(D/L)-α-羟基羧酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶对应的基因)，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
5.全细胞转化生产纯丹参素
细胞转化生产的体系为：细胞湿重为1-200g/L，左旋多巴浓度为1-200g/L，丙酮酸浓度为1-200g/L，葡萄糖浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0，于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。左旋多巴溶解度较低，高浓度情况下是含有不溶物的混悬液。
6.样品的检测分析
丹参素和丙氨酸的定量分析：转化液采用PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦Megres C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl。
手性分析：PerkinElmer Series 200高效液相色谱仪检测分析，配示紫外检测器，Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，进样量20μL，检测波长280nm。
丹参素溶解度较低，转化过程如有结晶析出，则稀释后测定。
丹参素的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。
当生产R-丹参素时，
对映体过量值％e.e＝[(SR-SS)/(SR+SS)×100％]
当生产S-丹参素时，
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SR+SS)×100％]
式中SS为转化液中S-丹参素的峰面积，SR为转化液中R-丹参素的液相色谱峰面积。
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
根据文献Large scale validation ofan efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法将Escherichia coli BL21(DE3)上的hpaD和mhpB进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pCasRed与pCRISPR-gDNA(hpaD sgRNA)与同源臂(hpaDdonor)一起导入Escherichia coli BL21(DE3)上，Cas9/sgRNA诱发宿主在hpaD基因位点发生双链断裂，重组酶Red将hpaD donor整合到hpaD基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpaD sgRNA、hpaD donor、mhpB sgRNA、mhpB donor分别如序列表SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。mhpB以同样的方式敲除。
配置pH为7的溶液，左旋多巴或D-丹参素4g/L，湿菌体量200g/L，35℃放置10小时后测定浓度，表1中显示了反应体系中，左旋多巴和D-丹参素的剩余量。
表1不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度
左旋多巴g/L D-丹参素g/L
Escherichiacoli BL21(DE3) 1.6 1.4
Escherichiacoli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3) 3.7 3.5
Escherichiacoli BL21(ΔhpaD,DE3) 2.0 2.8
Escherichiacoli BL21(ΔmhpB,DE3) 1.7 1.5
很显然Escherichia coli BL21(ΔhpaDΔmhpB,DE3)效果最好，将之命名为Escherichia coli HM。
实施例2
L-α-氨基酸转氨酶的筛选，分别从大肠杆菌和乳杆菌中克隆多种L-α-氨基酸转氨酶基因，并在Escherichia coli BL21(DE3)中得到表达，破胞测定粗酶液活性，以丙酮酸为受体时比较各种酶的活性，根据文献(转氨酶催化不对称合成芳香族L-氨基酸.生物工程学报，2012，28(11):1346-1358.)所述的方法测定L-α-氨基酸转氨酶的活性，结果如表2所示。因此选择来源于大肠杆菌的L-α-氨基酸转氨酶ect1用于左旋多巴的转氨脱氨是最佳的。
诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到LB发酵培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中，当细胞OD600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mM的IPTG，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。
表2不同L-α-氨基酸转氨酶的活性比较
重组菌 活性U/ml
Escherichiacoli BL21(DE3)/pETDuet-1-ect1 2
Escherichiacoli BL21(DE3)/pETDuet-1-ect2 0.01
Escherichiacoli BL21(DE3)/pETDuet-1-lpt 1.2
Escherichiacoli BL21(DE3)/pETDuet-1-lct 0.6
实施例3
重组大肠杆菌构建：首先将编码L-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因，连接到质粒上。得到三基因共表达重组质粒，将质粒转化大肠杆菌Escherichia coli HM，利用抗生素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。
将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重40g/L，左旋多巴40g/L，丙酮酸30g/L，葡萄糖30g/L，pH 8.0，于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。
表3各种重组菌的比较
Figure BDA0001633803590000081
Figure BDA0001633803590000091
实施例4
采用文献Large scale validation ofan efficient CRISPR/Cas-based multigene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories,2017,16(1):68所述的方法，将Escherichia coli HM基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:8所示。
强化基因btsT表达时，以Escherichia coli HM基因组为模板，以引物btsT-FF/btsT-FR、btsT-gpdA-F/btsT-gpdA-R、btsT-RF/btsT-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以btsT-FF和btsT-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含btsT sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在btsT基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到btsT基因之前，并测序验证。
强化基因ybdD表达时，以Escherichia coli HM基因组为模板，以引物ybdD-FF/ybdD-FR、ybdD-gpdA-F/ybdD-gpdA-R、ybdD-RF/ybdD-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以ybdD-FF和ybdD-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含ybdD sgRNA)一起转入Escherichia coli HM后，Cas9/sgRNA诱发宿主在ybdD基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到ybdD基因之前，并测序验证。
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表4引物名称与序列表序号对照
Figure BDA0001633803590000092
Figure BDA0001633803590000101
根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重5g/L，丙酮酸50g/L，左旋多巴20g/L，葡萄糖50g/L，pH 8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。
表5转化结果比较
Figure BDA0001633803590000102
将效果最好的Escherichia coli HM(PG-btsT,PG-ybdD)命名为Escherichiacoli HMBY。
实施例5
根据实例4的方法将Escherichia coli HMBY中nadA、pdxJ基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpdA)前的中等表达强度组成型启动子(PG)，序列如SEQ ID NO:8所示。然后再将质粒导入。
强化基因nadA表达时，以Escherichia coli HMBY基因组为模板，以引物nadA-FF/nadA-FR、nadA-gpdA-F/nadA-gpdA-R、nadA-RF/nadA-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以nadA-FF和nadA-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含nadA sgRNA)一起转入Escherichia coli HMBY后，Cas9/sgRNA诱发宿主在nadA基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到nadA基因之前，并测序验证。
强化基因pdxJ表达时，以Escherichia coli HMBY基因组为模板，以引物pdxJ-FF/pdxJ-FR、pdxJ-gpdA-F/pdxJ-gpdA-R、pdxJ-RF/pdxJ-RR,扩增出上游、启动子、下游序列，并以pdxJ-FF和pdxJ-RR为引物融合为含有gpdA启动子的表达框。然后与质粒pCasRed、pCRISPR-gDNA(含pdxJ sgRNA)一起转入Escherichia coli HMBY后，Cas9/sgRNA诱发宿主在pdxJ基因位点发生双链断裂，重组酶Red将gpdA启动子整合到pdxJ基因之前，并测序验证。
下表为引物名称与序列表序号的对应索引。
表6引物名称与序列表序号对照
名称 序列表中编号
pdxJ sgRNA SEQ ID NO:13
nadA sgRNA SEQ ID NO:1
pdxJ-FF SEQ ID NO:14
pdxJ-FR SEQ ID NO:15
pdxJ-gpdA-F SEQ ID NO:16
pdxJ-gpdA-R SEQ ID NO:17
pdxJ-RF SEQ ID NO:18
pdxJ-RR SEQ ID NO:19
nadA-FF SEQ ID NO:2
nadA-FR SEQ ID NO:3
nadA-gpdA-F SEQ ID NO:4
nadA-gpdA-R SEQ ID NO:5
nadA-RF SEQ ID NO:6
nadA-RR SEQ ID NO:7
基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/L，丙酮酸100g/L，左旋多巴120g/L，葡萄糖200g/L，pH 9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。
表7转化结果比较
Figure BDA0001633803590000111
Figure BDA0001633803590000121
将最好的Escherichia coli HMBY(PG-nadA,PG-pdxJ)命名为Escherichia coliNP。
实施例6
根据实施例2所述诱导表达方法，将Escherichia coli NP/pCOLADuet-1-lfldhd-ect1-bsgdh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/L，丙酮酸1g/L，左旋多巴1g/L，葡萄糖1g/L，pH 6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，R-丹参素浓度为77mg/L，e.e％>99.9。
实施例7
根据实施例2所述诱导表达方法，将表8中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/L，丙酮酸200g/L，左旋多巴200g/L，葡萄糖200g/L，pH 8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果。
表8转化结果比较
Figure BDA0001633803590000122
以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种工程菌及其在丹参素和丙氨酸联产中的应用
<130> 2018.3.15
<160> 33
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttaacggcgt cggcttcggg 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgaatcctg cacgacccac cacta 25
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcggccactc atcaacatga ttcatcgaca ttagcgtaat attcgctgtt 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagcgaat attacgctaa tgtcgatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtctggatc aaacattacg ctcatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgag cgtaatgttt gatccagaca 50
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
catccacgga caatgcgcgc agctg 25
<210> 8
<211> 1100
<212> DNA
<213> Escherichia coli BL21(DE3)
<400> 8
atgaatcatg ttgatgagtg gccgatcgct acgtgggaag aaaccacgaa actccattgc 60
gcaatacgct gcgataacca gtaaaaagac cagccagtga atgctgattt gtaaccttga 120
atatttattt tccataacat ttcctgcttt aacataattt tccgttaaca taacgggctt 180
ttctcaaaat ttcattaaat attgttcacc cgttttcagg taatgactcc aacttattga 240
tagtgtttta tgttcagata atgcccgatg actttgtcat gcagctccac cgattttgag 300
aacgacagcg acttccgtcc cagccgtgcc aggtgctgcc tcagattcag gttatgccgc 360
tcaattcgct gcgtatatcg cttgctgatt acgtgcagct ttcccttcag gcgggattca 420
tacagcggcc agccatccgt catccatatc accacgtcaa agggtgacag caggctcata 480
agacgcccca gcgtcgccat agtgcgttca ccgaatacgt gcgcaacaac cgtcttccgg 540
agcctgtcat acgcgtaaaa cagccagcgc tggcgcgatt tagccccgac atagccccac 600
tgttcgtcca tttccgcgca gacgatgacg tcactgcccg gctgtatgcg cgaggttacc 660
gactgcggcc tgagtttttt aagtgacgta aaatcgtgtt gaggccaacg cccataatgc 720
gggcagttgc ccggcatcca acgccattca tggccatatc aatgattttc tggtgcgtac 780
cgggttgaga agcggtgtaa gtgaactgca gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga 840
gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac 900
aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac 960
taaatcagta agttggcagc atcaccccgt tttcagtacg ttacgtttca ctgtgagaat 1020
ggagattgcc catcccgcca tcctggtcta agcctggaaa ggatcaattt tcatccgaac 1080
gttcctgaca ggagaaaacc 1100
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tatgcccgtc gatcgcgccc 20
<210> 10
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccaagatcac gcacgtaccg tcgatgtatc tctctgaact gccagggaaa aaccacggtt 60
agatcagcaa gcgttgccgg gaaatgggcg tcgataccat tatcgttttc gacacccact 120
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tcatcgagta cctcttgcgc 20
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tagcctgata tgcacgctta tcttcactgt ctttcccact cgccgctggt gggatatgtc 60
aatggcgtga ttgccagcgc ccgcgagcgt attgcggctt tctcccctga actggtggtg 120
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgtcgcggtc agtaatgtga 20
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gcagaagaag atggtcattg gcaac 25
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tcggccactc atcaacatga ttcattcgct taggcataaa ttgccggaac 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gttccggcaa tttatgccta agcgaatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgacgcctaa cagtaattca gccatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatggc tgaattactg ttaggcgtca 50
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcacagcaaa acgcttcgcc agaaa 25
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcggtagttg cattacgtcg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cggaaaatat ttaggtcagg 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gcaggaggtt aagatgcaat tagat 25
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tcggccactc atcaacatga ttcatacctg taagccaaaa gacgacgagt 50
<210> 24
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
actcgtcgtc ttttggctta caggtatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gcttgaatag ttttttcgta tccatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 26
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgga tacgaaaaaa ctattcaagc 50
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gatacccagc gccaggccga cgata 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggtggggatg gcttacatcc tgcac 25
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tcggccactc atcaacatga ttcatcggat gcggcgtgaa cgctttatcc 50
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ggataaagcg ttcacgccgc atccgatgaa tcatgttgat gagtggccga 50
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
cggcttttgc cagtgaatca aacatggttt tctcctgtca ggaacgttcg 50
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cgaacgttcc tgacaggaga aaaccatgtt tgattcactg gcaaaagccg 50
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tataacgatg ccggacaggc gctgc 25

Claims (8)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达了葡萄糖脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶和L-α-氨基酸转氨酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因；
α-羟基羧酸脱氢酶为D-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上登录号为WP_002335374.1或EEI22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为L-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是NCBI上登录号为WP_013858488.1、WP_003607654.1或WP_035430779.1的序列；所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上登录号为WP_013351020.1的序列；所述L-α-氨基酸转氨酶的氨基酸序列是NCBI上登录号为WP_000462687.1、WP_000486988.1、WP_003643296.1或YP_806114.1的序列；所述酚类分解基因为hpaD、mhpB中的任意一种或者两种组合；所述hpaD的核苷酸序列如NCBI上登录号为NC_012892第4505585~4506436位所示；所述mhpB的核苷酸序列如NCBI上登录号为NC_012892第339806~340750位所示。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌还强化表达了丙酮酸转运基因、NAD合成基因、磷酸吡哆醛合成基因一种或者多种；所述强化表达的基因为btsT和ybdD、nadA、pdxJ中的任意一种或多种；所述btsT的核苷酸序列如NCBI上登录号为NC_012892第4496239~4498389位所示，所述ybdD的核苷酸序列如NCBI上登录号为NC_012892第592652~592849位所示；所述nadA的核苷酸序列如NCBI上登录号为NC_012892第740487~741530位所示；所述pdxJ的核苷酸序列如NCBI上登录号为NC_012892第2567591~2568322位所示。
3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述强化表达是通过将宿主大肠杆菌基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶、L-α-氨基酸转氨酶是通过pCOLADuet共表达的。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述宿主菌为Escherichia coliBL21(DE3)。
6.一种生产丹参素的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-5任一所述的重组大肠杆菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是进行全细胞转化生产。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/L，左旋多巴浓度为1-200g/L，丙酮酸浓度为1-200g/L，葡萄糖浓度为1-200g/L，pH 6.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。
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