CN111041008B

CN111041008B - 短链脱氢酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN111041008B
Application number: CN201811182380.XA
Authority: CN
Inventors: 游松; 秦斌; 郭继阳; 张飞霆; 刘贵高; 秦凤玉; 张文鹤; 祝天慧; 唐军; 闫平泽; 张瑞; 李衡宇; 于召惠
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2038-10-11
Also published as: CN111041008A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及短链脱氢酶及其突变体和应用，具体涉及立体选择性互补短链脱氢酶突变体，所述的突变体是从发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)中挖掘到的野生型的短链脱氢酶(LfSDR1)突变得到的，具体涉及短链脱氢酶突变体和其制备方法以及其作为催化剂催化4R/S‑香芹酮的不对称还原制备立体多样性香芹醇。该方法与现有的化学方法相比，具有操作简单、反应条件温和、对环境友好等优点。

Description

短链脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及短链脱氢酶LfSDR1突变体及其编码基因，含有所述短链脱氢酶突变体基因的重组表达载体与转化体构建，重组酶的制备方法，以及以突变体为催化剂催化4R/S-香芹酮不对称还原获取立体多样性的香芹醇中的应用。

背景技术

香芹醇是一种天然的、不饱和的、单环的单贴醇，其以(-)-顺式存在于留兰香油中。香芹醇为无色液体，不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂，有类似于绿薄荷或香菜的味道，所以香芹醇作为一种香料应用于化妆品或食品工业。在医药领域，香芹醇已经被证明能够化学预防乳腺癌(Carcinogenesis,1992,13(7),1261-1624.)，以及其衍生物(1R,2R,6S)-3-methyl-6-(prop-1-en-2-yl)cyclohex-3-ene-1,2-diol在动物模型中展示了抗帕金森的活性(Journal of Medicinal Chemistry,2011，54(11),3866-3874)。

香芹醇拥有两个手性中心(C-2位和C-4位)，存在4种立体异构体:(2R,4R)/(2R,4S)/(2S,4R)/(2S,4S)-香芹醇，但是现阶段商业可获得的香芹醇依旧为几种异构体的混合物，而光学纯的4R/S-香芹酮能够从相应的挥发油中提取出来，因此可以以4R/S-香芹酮为底物，通过高立体选择性的催化剂催化不对称还原羰基，分别得到光学纯度高的4种立体异构的香芹醇。

科研人员已经通过手性金属配体作为催化剂，开发出合成光学纯的手性醇的化学合成方法，并部分应用于工业生产，然而，由于其条件苛刻且存在重金属残留问题，在药物等合成中的应用受到了限制。生物催化以其环境友好、反应条件温和、区域及立体选择性高等优势，在手性醇的合成中受到了越来越多的关注。

自然界中存在的酮还原酶或醇脱氢酶大多是以符合Prelog规则的立体选择性来催化不对称还原产生一种构型的手性醇，然而在药物及化工合成中，两种构型的醇均是重要的合成中间体，因而限制了酮还原酶或醇脱氢酶在工业中的应用。例如符合Prelog规则的R-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇是合成胆固醇吸收抑制剂的手性中间体；符合反Prelog规则的R-1-(3,5-双三氟甲基苯基)乙醇是合成抗肿瘤辅助用药阿瑞匹坦的手性中间体。近期，游松等通过蛋白质结构及计算机模拟辅助的方法将一些野生型的短链脱氢酶改造成能够针对卤代苯乙酮的非对称还原的、具有立体选择性互补的一些突变体(ACS Catalysis，2018，doi：10.1021/acscatal.8b00807)。

本实验室通过基因挖掘获取的来源于发酵乳酸杆菌的短链脱氢酶LfSDR1，野生状态下对4R-香芹酮表现出反Prelog立体选择性(还原产物为2S,4R-香芹醇，非对映体过量值(de)为>99％)，而对4S-香芹酮立体选择性较差。所以通过理性设计及蛋白质定向进化提高及逆转该酶的立体选择性，实现不同构型的光学纯的香芹醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。

发明内容：

本发明目的在于解决现有发酵乳酸杆菌短链脱氢酶(LfSDR1)立体选择性低及立体选择性单一的问题，通过定点突变，获取该酶突变体、编码突变体的核酸、含有该核酸的重组表达载体及重组表达转化体，重组突变体酶催化4R/S-香芹酮不对称还原，制备立体多样性的香芹醇中的应用。

为解决上述问题，本发明首先采取定点突变的技术，获取立体选择性改变的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白。

所述的短链脱氢酶LfSDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

编码所述短链脱氢酶的基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述的短链脱氢酶LfSDR1的突变体是在SEQ ID No.2的基础上将其92位、141位、146位、186位或206位中的一个位点单独突变或几个位点同时突变。

进一步地，

本发明所述的短链脱氢酶LfSDR1的突变体是在SEQ ID No.2的基础上将其186位突变；

或在SEQ ID NO.2的基础上将其92位、141位、146位、186位、206位同时突变。

进一步地，

为了提高野生型对4S-香芹酮的反Prelog立体选择性，对序列表中具有如SEQ IDNO.2所示氨基酸序列进行突变，将186位的缬氨酸(V)突变为具有较大空间位阻的色氨酸(W)，从而获取具有羰基还原活性的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白LfSDR1-V186W并命名为LfSDR1-M1(SEQ ID No.4)，其催化4S-香芹酮的立体选择性为92.8％(de，2S,4S)。并且LfSDR1-M1催化4R-香芹酮的立体选择性相对于野生型无改变>99％(de，2S,4R)。

为了逆转野生型对4R/S-香芹酮的立体选择性，对序列表中具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行突变，将92位甘氨酸(G)突变成具有较大空间位阻的丙氨酸(A)，将141位谷氨酸(E)突变成非极性的苯丙氨酸(F)，将146位天冬氨酸(D)突变成非极性的缬氨酸(V)，将186位的缬氨酸(V)突变成空间位阻较小的丙氨酸(G)，将206位赖氨酸(K)突变成非极性的亮氨酸(L)，获取突变体LfSDR1-G92A-E141F-D146V-V186G-K206L并命名为LfSDR1-M2(SEQ ID No.6)，其催化4R/S-香芹酮不对称还原的立体选择性分别为90.0％(de，2R,4R)和40.7％(de，2R,4S)。

所述突变体获得方法具体过程如下：

为获取LfSDR1-M1和M2的突变体，以野生型短链脱氢酶LfSDR1基因(SEQ ID NO.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取突变点上下游各15-20bp的碱基，将突变点的碱基替换成突变后氨基酸的密码子作为PCR正向引物，其反向互补序列作为反向引物)，通过PCR扩增获得突变体LfSDR1-M1与M2基因。

进一步，将突变体基因及载体质粒pET22b以内切酶NdeⅠ与XhoⅠ进行双酶切(37℃反应4-8h)，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4DNA连接酶将经过双酶切的突变基因片段及载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET22b-LfSDR1-M1与pET22b-LfSDR1-M2；将重组质粒转化入E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞中，较佳的转化方法为热激法：具体过程为45℃热激90S。将构建的重组转化体细胞经过培养表达突变体短链脱氢酶。

具体实施方式：

下面结合具体实例对本发明进行具体说明。

某些术语的定义

非对映体过量值(de)定义为对映体混合物中一个非对映异构体A比另一个非对映异构体B多出来的量占总量的百分数，缩写为de，公式为(A-B)/(A+B)*100％，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。de值越高，光学纯度也越高。

20种氨基酸缩写如下：

实施例涉及的培养基配方。

a).LB液体培养基：称取10gNaCl，10g胰蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(YeastExtract)溶于900mL蒸馏水，定溶至1000mL后用NaOH调pH至7.5，分装后，115℃高压灭菌30min。

b).LB固体培养基：LB培养基+1.5％琼脂(g/l)。

实施例1定点突变构建LfSDR1-M1突变体基因

以含有短链脱氢酶LfSDR1基因的质粒pET22b-LfSDR1为模板，通过重叠延伸PCR方法获取突变体基因。

首先LfSDR1基因上下游引物如下：

LfSDR1-NdeI-F：GGAATTCCATATGGGACAGTTTG

LfSDR1-XhoI-R：CCGCTCGAGTTGTGCCGTGTAGC

然后设计突变位点引物分别如下：

突变体LfSDR1-M1

LfSDR1-V186W-F：TACCCTGGGTGGATTGCCACG

LfSDR1-V186W-R：CGTGGCAATCCACCCAGGGTA

第一步PCR反应体系如下：

PCR-a

PCR-b

扩增程序：94℃：10Min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)30个循环，72℃，10min。两组PCR分别得到PCR片段a与PCR片段b，以普通DNA产物胶回收试剂盒回收两种片段，作为第二步PCR的模板。

第二步PCR反应体系如下：

PCR-c

扩增程序与第一步PCR相同，所得PCR片段c即为LfSDR1-M1突变体基因，经普通DNA产物纯化试剂盒纯化后用于后续操作。

实施例2定点突变构建LfSDR1-M2突变体基因

LfSDR1基因上下游引物与实施例1中相同。LfSDR1 V186A/G92F/E141L/D146V/K206L

设计突变位点引物分别如下：

LfSDR1-G92F-F：GCCGGAATTTTTACTCCGCTG

LfSDR1-G92F-R：CAGCGGAGTAAAAATTCCGGC

LfSDR1-E141L-F：AGTTCGATCCTGGGGATGATC

LfSDR1-E141L-R：GATCATCCCCAGGATCGAACT

LfSDR1-D146V-F：ATGATCGGTGTGCCAACCGTT

LfSDR1-D146V-R：AACGGTTGGCACACCGATCAT

LfSDR1-V186A-F：TACCCTGGGGCAATTGCCACG

LfSDR1-V186A-R：CGTGGCAATTGCCCCAGGGTA

LfSDR1-K206L-F：TACATCGACCTGCACCCAATG

LfSDR1-K206L-R：CATTGGGTGCAGGTCGATGTA

构建LfSDR1-M2突变体：

第一步PCR如下：

PCR-d

PCR-e

PCR-f

PCR-g

PCR-h

PCR-i

扩增程序与实施例1中第一步PCR相同，六组PCR分别得到PCR片段d、e、f、g、h和i，以普通DNA产物胶回收试剂盒回收四种片段，作为第二步PCR模板。

第二步PCR如下：

PCR-j

扩增程序与实施例1中第一步PCR相同，所得PCR片段j即为LfSDR1-M2突变体基因，经普通DNA产物纯化试剂盒纯化后用于后续操作。

实施例3构建突变体基因重组质粒

将重叠延伸PCR获得的突变体基因与载体质粒进行双酶切，反应体系如下：

37℃反应4-8h后，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4DNA连接酶将经过双酶切，具有粘性末端的突变基因片段及载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET22b-LfSDR1-M1和pET22b-LfSDR1-M2。

实施例4 E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞的制备及转化

a)从种子培养基中取1mL E.coli Rosseta(DE3)接种于100mL LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养3h；

b)3000r/min，5min富集菌体，弃上清；

c)加入400μl预冷0.1M CaCl2溶液，重新悬浮菌体，等分分装到4个EP管中，冰浴30min获得E.coli Rosseta(DE3)感受态细胞悬浮液；

d)向感受态细胞悬浮液中加入20μL重组质粒连接液轻轻混匀，冰浴30min；

e)42℃热休克90s，冰水浴3min，加入800μL LB液体培养基，37℃，150r/min振荡培养1-2h；

f)分别取150μL培养液涂布于带有氨苄西林抗性的LB固体培养基，37℃培养10-20h后挑去阳性转化子，获得突变体重组转化子。

实施例5突变体的表达

a)取突变体转化子接种于4ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后得到种子液；

b)取1ml种子液接种于100ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液OD600达到0.8-1.0时加入终浓度0.1mM IPTG，并将温度降至20℃诱导表达20h；

c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1M pH6.0磷酸钠缓冲液重新悬浮菌体(菌体湿重浓度为0.1g/ml)，冰水浴环境下超声破碎菌体，4℃环境下，10000rpm离心收集上清获得突变体粗酶液。

实施例6葡萄糖脱氢酶(GDH)的表达

将含有pET22b-GDH质粒的E.coli Rosetta(DE3)按照实施例5所述表达获得葡萄糖脱氢酶(GDH)粗酶液。

实施例6粗酶液催化还原：

反应体系：如实施例5、6中所述的上清各450μl混匀，终浓度0.1mM NADP+，8mg葡萄糖，1mg底物(100μl乙醇助溶)，30℃反应6-12h；用等体积乙酸乙酯萃取三次，萃取液经无水硫酸钠干燥后旋蒸出去乙酸乙酯留用。

实施例7气相色谱法分析底物和产物

使用非手性气相色谱(SCION 456-GC)，色谱柱

-1701 capillary column(0.25mm×30m,0.25μm film thickness；Restek)，进样器温度为70℃，检测器温度为240℃，程序升温如下表

野生型短链脱氢酶及其突变体催化4R/S-香芹酮非对称还原的检测结果如表1所示：

表1：短链脱氢酶LfSDR1野生型及其突变体催化4R/S-香芹酮非对称还原的检测结果

a)de值[％]；b)还原产物绝对构型；c)无活性。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> 短链脱氢酶突变体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 744

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 1

atgggacagt ttgacaataa ggttgccttg gttaccgggg gaacgaaggg gattggctta 60

gccatcgccg agctgttttt gaaggaaggc gccaaggggg tggccttcac cggtcgtcac 120

gaagacgaag gaaaagcggt tcaagaacgc ctcggtgaac ggtctttgtt catcacccaa 180

gacgtttcca aggaagaaga ttggcaaaac gccaccaaag ccgttgttga aaaatttggg 240

cagcttgatg cgattgtcaa caacgccgga attgggactc cgctggggat cgaggaaatg 300

acgctcgatc actggaaccg cgaaatcgcc atcgatttaa cagggacgat gttaggttgc 360

aagtacgggg ttaaagcgat gaaggaacat ggtggcgcga tcgtcaacat tagttcgatc 420

gaagggatga tcggtgaccc aaccgttccg gcctacaacg ctgctaaggg gggcgtccgt 480

ctcctcacca agtcggtagc gcttgagtgt gccgaaaagg gttacgccat ccgcgtaaac 540

tcgatttacc ctggggtaat tgccacgccg ctgatcgatc acctcgatga tgcgaccaag 600

caattctaca tcgacaaaca cccaatgggc cggctgggaa agccggaaga agtggctaag 660

atggctgtct ttgttgcttc cgatggggcc tcctttagca ccggctccga gtttgttgtc 720

gatgggggct acacggcaca ataa 744

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 2

Met Gly Gln Phe Asp Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Thr Lys

1 5 10 15

Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Glu Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Gly Val Ala Phe Thr Gly Arg His Glu Asp Glu Gly Lys Ala Val Gln

35 40 45

Glu Arg Leu Gly Glu Arg Ser Leu Phe Ile Thr Gln Asp Val Ser Lys

50 55 60

Glu Glu Asp Trp Gln Asn Ala Thr Lys Ala Val Val Glu Lys Phe Gly

65 70 75 80

Gln Leu Asp Ala Ile Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Thr Pro Leu Gly

85 90 95

Ile Glu Glu Met Thr Leu Asp His Trp Asn Arg Glu Ile Ala Ile Asp

100 105 110

Leu Thr Gly Thr Met Leu Gly Cys Lys Tyr Gly Val Lys Ala Met Lys

115 120 125

Glu His Gly Gly Ala Ile Val Asn Ile Ser Ser Ile Glu Gly Met Ile

130 135 140

Gly Asp Pro Thr Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Lys Gly Gly Val Arg

145 150 155 160

Leu Leu Thr Lys Ser Val Ala Leu Glu Cys Ala Glu Lys Gly Tyr Ala

165 170 175

Ile Arg Val Asn Ser Ile Tyr Pro Gly Val Ile Ala Thr Pro Leu Ile

180 185 190

Asp His Leu Asp Asp Ala Thr Lys Gln Phe Tyr Ile Asp Lys His Pro

195 200 205

Met Gly Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Val Ala Lys Met Ala Val Phe

210 215 220

Val Ala Ser Asp Gly Ala Ser Phe Ser Thr Gly Ser Glu Phe Val Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245

<210> 3

<211> 744

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 3

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<210> 4

<211> 247

<212> PRT

<213> Lactobacillus fermentum

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Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Glu Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Lys

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Gly Val Ala Phe Thr Gly Arg His Glu Asp Glu Gly Lys Ala Val Gln

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Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

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<210> 5

<211> 744

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 5

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<210> 6

<211> 247

<212> PRT

<213> Lactobacillus fermentum

<400> 6

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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Gly Val Pro Thr Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Lys Gly Gly Val Arg

145 150 155 160

Leu Leu Thr Lys Ser Val Ala Leu Glu Cys Ala Glu Lys Gly Tyr Ala

165 170 175

Ile Arg Val Asn Ser Ile Tyr Pro Gly Gly Ile Ala Thr Pro Leu Ile

180 185 190

Asp His Leu Asp Asp Ala Thr Lys Gln Phe Tyr Ile Asp Leu His Pro

195 200 205

Met Gly Arg Leu Gly Lys Pro Glu Glu Val Ala Lys Met Ala Val Phe

210 215 220

Val Ala Ser Asp Gly Ala Ser Phe Ser Thr Gly Ser Glu Phe Val Val

225 230 235 240

Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245

Claims

1.短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQ ID No.2基础上将92位甘氨酸突变成丙氨酸，将141位谷氨酸突变成苯丙氨酸，将146位天冬氨酸突变成缬氨酸，将186位的缬氨酸突变成丙氨酸，将206位赖氨酸突变成亮氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示。

2. 编码权利要求1所述的短链脱氢酶突变体的核酸，其核酸序列如SEQ ID No. 5所示。

3.一种表达载体，该载体含有权利要求2所述的核酸且能在宿主细胞中进行表达。

4.一种宿主细胞，其含有权利要求2的核酸或权利要求3所述的表达载体，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

5.权利要求1所述的短链脱氢酶突变体在催化4R/S-香芹酮非对称还原反应中的应用。

6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述还原4R/S-香芹酮的方法为：在pH 5-9的磷酸盐缓冲液溶液中，在所述的短链脱氢酶突变体的催化下，对4R/S-香芹酮进行还原，生成立体多样性的香芹醇。