CN104745649B - 一种福沙那韦中间体的生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种N‑保护(2S,3S)‑3‑氨基‑1‑氯‑4‑苯基‑2‑丁醇的制备方法，其以N‑保护(S)‑3‑氨基‑1‑氯‑4‑苯基‑2‑丁酮为底物，使其发生还原反应生成N‑保护(2S,3S)‑3‑氨基‑1‑氯‑4‑苯基‑2‑丁醇，其中，使还原反应在酮还原酶、辅因子及氢供体存在下、在pH 8~10的水相体系中以及温度30~50℃下进行，所述酮还原酶的DNA序列如SEQ ID No.1~20中任一项所示。本发明采用特定的酮还原酶来催化还原反应，具有酶用量小，反应条件温和，操作简单，反应时间短，收率高，绿色环保的优势。与现有技术的化学法相比，经济性高，污染小，具有重要的应用价值。

Description

一种福沙那韦中间体的生物制备方法
技术领域
本发明涉及一种福沙那韦中间体的制备方法，具体涉及酶法制备N-保护(2S,3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的方法。
背景技术
艾滋病是目前世界上最严重的传染性疾病，全球超过四千万人携带艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒，HIV)。现有抗病毒药物根据作用机理可分为核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂。临床一般选用一个或两个逆转录酶抑制剂加上一个蛋白酶抑制剂的治疗方案(又称鸡尾酒疗法)。蛋白酶抑制剂研发较逆转录酶抑制剂晚，但增长快。2011年蛋白酶抑制剂的销售额为23亿美元，增长率为22％，是各类药物中增长最快的。蛋白酶抑制剂中具有代表性的药物有两大类：阿扎那韦(atazanavir)及其类似药物利托那韦(Ritonavir)、洛匹那韦(Lopinavir)，和福沙那韦(fosamprenavir，化合物1)及其类似药物沙喹那韦(Saquinavir，化合物2)、安泼那韦(Amprenavir，化合物3)。
福沙那韦及其类似药物主要的两个手性中心可以由如I所示的N-保护的手性氯醇化合物N-保护(2S,3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇，其中R可以为R＝Boc,fmoc,TBS,Cbz,THP,Bn等(以下简称福沙那韦中间体)作为合成砌块经过组装获得。
目前该福沙那韦中间体的手性中心主要由化学法生产，反应方程式如下：
福沙那韦中间体多由硼氢化钠低温在有机溶剂中还原得到，由于该步骤催化剂的选择性不高，因此产物的光学纯度也较低。例如Org.Biomol.Chem.,2004,2,2061-2070报道，硼氢化钠还原后的产物de值只有68％((S,S)/(R,S)＝84:16)。若想获得高对映选择性的产品，则需要在低温下用硼烷化合物进行还原(中国医药工业杂志，2006，37，723-726)。利用酮还原酶合成手性醇的方法是一种环境友好，高效实用的路径。对于目标化合物的非对映异构体N-保护(2R,3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇(阿扎那韦中间体，构型为R,S)，已经有利用酮还原酶合成的报道。但是合成福沙那韦中间体(构型为S，S)的反应尚无生物法报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种经济高效环保的福沙那韦中间体的生物制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种N-保护(2S,3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其以N-保护(S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，使其发生还原反应生成N-保护(2S,3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇，其中，使还原反应在酮还原酶、辅因子及氢供体存在下、在pH 8～10的水相体系中以及温度30～50℃下进行，所述酮还原酶的DNA序列如SEQ ID No.1～20中任一项所示。
进一步地，所述N-保护(2S,3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇中的氨基保护基为Boc,fmoc,TBS,Cbz,THP,Bn中的一种。
根据本发明，所述酮还原酶与底物的重量投料比为0.05～0.15：1。优选为0.09～0.11：1
优选地，使还原反应在助溶剂存在下进行，助溶剂优选为甲苯、乙二醇或聚乙二醇中的一种或多种的组合。助溶剂的体积比浓度优选为15％～25％。
优选地，使还原反应在表面活性剂存在下进行。表面活性剂优选为吐温-60，Triton X-100或二者的组合。
优选地，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
优选地，所述氢供体为异丙醇。
SEQ ID No.1～20的酮还原酶为非天然序列，可通过商业化的全基因合成服务制得。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用特定的酮还原酶来催化还原反应，具有酶用量小，反应条件温和，操作简单，反应时间短，收率高，绿色环保的优势。与现有技术的化学法相比，经济性高，污染小，具有重要的应用价值。
附图说明
附图1为实施例6的核磁谱图。
具体实施方式
以下以结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例所用原料均为工业品。
实施例1
将含有酮还原酶基因(SEQ ID No.1-20)的基因片段(由苏州金唯智生物科技有限公司合成)，与pET28a质粒(购自Invitrogen)的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL21(DE3)菌株，筛选得到阳性克隆子，接种到4mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜(37℃，200rpm)。从过夜培养物以1/100接种量转接100mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10mL磷酸缓冲液(2mM，pH 7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，离心，上清液预冻过夜，冻干24h-48h，即得冻干粉状的重组酮还原酶KRED。
实施例2
于10ml反应器中，加入1.65mL 0.1M pH 7.0磷酸盐缓冲液中，依次溶解酮还原酶酶粉(SEQ ID No.1)20mg，NADP或NAD 2mg；底物(N-保护(S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮)0.1g溶于0.25mL异丙醇中，加入反应器中搅拌至完全溶解，1000rpm搅拌，于25℃下反应24小时，HPLC检测转化率，NAD样品转化率为13.6％，NADP样品转化率为61.3％。
实施例3
于10ml反应器中，加入1.65mL 0.1M pH 6.0-9.0的磷酸盐或三乙醇胺缓冲液中，依次溶解酮还原酶酶粉(SEQ ID No.1)20mg，NADP 2mg；底物(N-保护(S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮)0.1g溶于0.25mL异丙醇中，加入反应器中搅拌至完全溶解，1000rpm搅拌，于25℃下反应20小时，HPLC检测转化率，6.0(磷酸盐)样品转化率为44.2％，6.5(磷酸盐)样品转化率为52.8％，7.0(磷酸盐)样品转化率为47.9％，7.5(磷酸盐)样品转化率为56.3％，8.0(三乙醇胺)样品转化率为57.3％，8.5(三乙醇胺)样品转化率为62.1％，9.0(三乙醇胺)样品转化率为48.2％。
实施例4
于10ml反应器中，加入1.65mL 0.1M pH 8.5的三乙醇胺缓冲液中，依次溶解酮还原酶酶粉(SEQ ID No.1)20mg，NADP 2mg；底物(N-保护(S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮)0.1g溶于0.25mL异丙醇中，加入反应器中搅拌至完全溶解，1000rpm搅拌，于不同温度下反应20小时，HPLC检测转化率，25度样品转化率为76.8％，30度样品转化率为85.3％，35度样品转化率为97.6％，40度样品转化率为99.9％，45度样品转化率为99.9％，。
实施例5
于10ml反应器中，加入1.45mL 0.1M pH 8.5的三乙醇胺缓冲液中，依次溶解酮还原酶酶粉(SEQ ID No.1)20mg，NADP 2mg；底物(N-保护(S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮)0.1g溶于0.25mL异丙醇和0.2mL助溶剂的混合中，加入反应器中搅拌至完全溶解，1000rpm搅拌，于45度下反应16小时，HPLC检测转化率，加入助溶剂吐温60的样品转化率为91.4％，聚乙二醇的样品转化率为99.1％，乙二醇的样品转化率为99.1％，甲苯样品转化率为99.7％，Triton X-100样品的转化率为98.9％。
实施例6
于50ml圆底烧瓶中，加入13.5mL 0.1M pH 8.5三乙醇胺缓冲液中，依次溶解酮还原酶酶粉(SEQ ID No.1)100mg，NADP 10mg；底物(N-保护(S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮)1g溶于3mL甲苯和2.5mL异丙醇的混合液中，加入圆底烧瓶搅拌至完全溶解，加入1ml吐温-60，1000rpm搅拌，于45℃下反应24小时，HPLC检测转化率99％，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相浓缩得到产品固体0.95g，收率95％，纯度99％，光学纯度99.9％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. 一种N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其以N-保护(S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮为底物，使其发生还原反应生成N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇，其特征在于：使所述还原反应在酮还原酶、辅因子及氢供体存在下、在pH 8~10的水相体系中以及温度30~50℃下进行，所述酮还原酶的DNA序列如SEQ ID No.1~20中任一项所示；所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
2. 根据权利要求1所述的N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其特征在于：所述N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇中的氨基保护基为Boc,fmoc, TBS, Cbz, THP, Bn中的一种。
3. 根据权利要求1所述的N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其特征在于：所述酮还原酶与底物的重量投料比为0.09~0.11：1。
4. 根据权利要求1所述的N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其特征在于：使所述还原反应在助溶剂存在下进行，所述助溶剂为甲苯、乙二醇或聚乙二醇中的一种或多种的组合。
5. 根据权利要求4所述的N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其特征在于：所述助溶剂的体积比浓度为15%~25%。
6.根据权利要求1或4或5所述的N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其特征在于：使所述还原反应在表面活性剂存在下进行。
7. 根据权利要求6所述的N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其特征在于：所述表面活性剂为吐温-60，Triton X-100或二者的组合。
8. 根据权利要求1所述的N-保护(2S, 3S)-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇的制备方法，其特征在于：所述氢供体为异丙醇。
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