MX2014010905A - Metodo para la produccion de nitrilos de terpeno a partir de terpeno-oximas utilizando un aldoxima deshidratasa. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos de un nuevo tipo para producir biocatalíticamente nitrilos a partir de oximas usando oxima deshidratasas y a mutaciones de un nuevo tipo que tiene actividad de oxima deshidratasa y uso de los mismos en un método para producir biocatalíticamente nitrilos, tales como en particular para producir citral nitirlo, neral nitrilo, geranial nitrilo, o citronelilnitirlo a partir de ciral oxima, neral oxima, geranial oxima, o citronelal oxima, y a oxima deshidratasas que pueden usarse para los mismos, secuencias de nucleótidos para lo mismo y construcciones de expresión de microorganismos que comprenden secuencias de nucleótidos.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE NITRILOS DE TERPENO A PARTIR DE TERPENO-OXIMAS UTILIZANDO UN ALDOXIMA DESHIDRATASA La presente invención se refiere a nuevos métodos para la producción biocatalitica de nitrilos a partir de oximas utilizando oxima deshidratasas y mutantes novedosas con actividad de oxima deshidratasas y uso de las mismas en un proceso para la producción biocatalitica de nitrilos, tales como, en particular, para la producción de citral nitrilo, neral nitrilo, geranil nitrilo o citronelil nitrilo a partir de citral oxima, neral oxima, geranial oxima o citronelal oxima; y oxima deshidratasas útiles para los mismos, secuencias de nucleótidos para los mismos y construcciones d expresión de microorganismos que los comprenden .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los terpenos invención son compuestos orgánicos que se derivan del esqueleto de isopreno y se producen en la naturaleza, en particular como sustancias secundarias presentes en los organismos, en particular como sustancias secundarias en las plantas. Con frecuencia los terpenos sustancias odoríferas o aromatizantes y por ejemplo, puede obtenerse a partir de aceites esenciales derivados de plantas. En consecuencia, los terpenos y derivados de terpenos se utilizan como ingredientes de productos en el área de cosméticos, cuidado del cuerpo o de los productos de limpieza, por ejemplo en forma de mezclas de sustancias odoríferas o aromas en perfumes, lociones para el cuerpo, geles de ducha, jabones, detergentes o productos de limpieza. Dependiendo del compuesto utilizado, una variedad de notas de olor pueden ser producidas, por ejemplo, fragancias de especies, frescas, cítricas similares o floridas de los productos correspondientes.

Los productos de partida correspondientes, que son ofrecidas por la industria química para la mezcla a los productos correspondientes, a menudo son nitrilos de terpenos o derivados de terpenos. Ejemplos de geranil nitrilo, que tienen un olor intenso fresco, cítrico, o nitrilo citronelilo, que tiene una fragancia a rosas.

Los nitrilos correspondientes están ya sea aislados como productos naturales o se sintetizan a partir de precursores adecuados químicamente. Por lo tanto, el documento WO 2006/106141 de los solicitantes, describe la producción de nitrilos saturados a partir de nitrilos insaturados como precursores. El documento EP 0 491 127 describe la adición de nitrilos insaturados en hexenoles, al obtener nitrilos modificados. En ambos casos se utilizan compuestos de partida que ya comprenden el grupo nitrilo. Por consiguiente, los métodos deseables son aquellos por los que también se pueden utilizar los precursores diferentes a nitrilos. El documento DE 3139358 describe un proceso de producción e odorantes por reacción química de oximas a nitrilos correspondientes. En el contexto de este proceso, la deshidratación necesaria requiere condiciones de reacción extremas, en particular agentes deshidratantes cáusticos y temperaturas de ebullición.

Por lo tanto, existe una demanda de métodos alternativos para la producción de nitrilos a partir de oximas, en métodos particulares que tienen lugar bajo condiciones de reacción más moderadas. Además, hay una demanda de reactivos adecuados para llevar a cabo dicho proceso .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN El primer problema mencionado anteriormente se resuelve mediante un proceso biocatalítico para la producción de nitrilos de fórmula general I, en donde R representa un residuo de hidrocarburo alifático lineal o de una sola o múltiples ramificaciones, saturado o de una o múltiples insaturaciones, opcionalmente de múltiples sustituciones con 4 a 19 átomos de carbono, n representa 1 ó 2; en donde a) una oxima de fórmula general II en la cual R y n tienen el significado dado anteriormente, en donde el compuesto de fórmula II está en forma de estereoisómeros puros o como una mezcla de estereoisómeros , se hacen reaccionar en presencia de una deshidratasa de aldoxima alifática (4.99.1.5), una fenilacetaldoxima deshidratasa, (PAOx) (EC 4.99.1.7) o un indolacetaldoxima deshidratasa (4.99.1.6) a un compuesto de la formula I, en donde el compuesto de fórmula I está en forma estereoisoméricamente pura o como una mezcla de estereoisómeros, y b) opcionalmente el producto de reacción se purifica más a continuación.

El segundo problema mencionado antes se resuelve proporcionando secuencias de ácidos nucleicos definidos en este documento, que codifican proteínas que se pueden utilizar en el contexto del proceso de acuerdo con la invención .

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra esquemáticamente la conversión de critronelal oxima a citronelil nitrilo.

La Figura 2A muestra el cromatograma de GC de oxima de E/Z citronelal antes de la reacción biocatalitica con PAOx (TA: 7.816 y 8.018 min) .

La Figura 2B muestra el cromatograma de GC de oxima de E/Z citronelal durante la reacción biocatalitica con PAOx (tiempo: 18 h) . El citronelil nitrilo se puede detectar como el producto de reacción (T: 6.765 min).

La Figura 2C muestra le cromatograma de GC de citronelil nitrilo o que se formó durante reacción biocatalitica con PAOx (tiempo: 90 h) . La oxima de E/Z citronelal se convirtió a nitrilo completamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Definiciones Generales Las "aldoxima deshidratasas" en el sentido de la presente invención son generalmente las enzimas mutantes o enzima que catalizan la eliminación de agua a partir de oximas de la fórmula general R1R2C=N-OH, en donde R1 significa cualquier residuo orgánico y R2 significa hidrógeno. El término aldoxima deshidratasas comprende otras aldoxima deshidratasas especificadas con mayor precisión, como aldoxima deshidratasas alifáticas (EC 4.99.1.5, según la nomenclatura EC del "Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular"), fenilacetaldoxima deshidratasa (PAOx) (EC 4.99.17) o indolacetaldoxima deshidratasa (EC 4.99.1.6).

Debido a que pertenece a la reversibilidad de las reacciones enzimáticas, la presente invención se refiere a las reacciones enzimáticas descritas en este documento en ambas direcciones de reacción.

Las "imitantes funcionales" de una aldoxima deshidratasa comprenden los "equivalentes funcionales" de dichas enzimas que se definen a continuación.

El término "proceso biocatalítico" se refiere a cualquier proceso llevado a cabo en presencia de la actividad catalítica de un "aldoxima deshidratasa", de acuerdo con la invención o de una enzima con " actividad aldoxima deshidratasa", es decir, los procesos en presencia de enzima en bruto o purificada, disuelta, dispersa o inmovilizado, o en presencia de células microbianas enteras, que tengan, o expresen dicha actividad enzimática. Por lo tanto, los procesos biocatalíticos comprenden procesos enzimáticos, así como microbianos.

El término "estereoisoméricamente puros" significa que uno de los varios posibles estereoisómeros de un compuesto mencionado en el contexto de la invención con al menos un centro asimétricos está presente en altos "exceso enantiomérico" o alta "pureza enantiomérica" , por ejemplo, al menos 90% ee, en particular por lo menos 95% ee, o al menos 98% ee, o al menos 99% ee. El valor lee se calcula a partir de la siguiente fórmula: ee% = [XA-XB]/[XA+XB]*100, en donde XA y XB representan la fracción molar de los enantiomeros A y B respectivamente.

Una "actividad aldoxima deshidratasas" que se determinó con un "sustrato referencia en condiciones normales", significa, por ejemplo una actividad enzimática que describe la formación de un producto de nitrilo a partir de un sustrato de oxima. Las condiciones estándar son, por ejemplo, concentraciones de sustrato de 10 mM a C.2 M, en particular de 15 a 100 mM, por ejemplo, aproximadamente 20 a 25 mm; a un pH de 4 a 8, y a temperaturas de, por ejemplo, 15 a 30 o 20 a 25°C. La determinación puede realizarse con células que expresan aldoxima deshidratasa recombinante, células que expresan aldoxima deshidratasa lisada, fracciones de los mismos o enzima aldoxima deshidratasa enriquecida o purificada. En particular, el substrato de referencia es una oxima de fórmula (II); en particular, citronelal oxima, o un racemato de citronelal oxima, como también se describe en más detalle en los ejemplos. Un ensayo estándar especifico para detectar la actividad de aldoxima deshidratasa se describe por ejemplo por Kato, Y. et al. en Biochemistry 2000, 39, 800-809. De acuerdo con esto, una preparación estándar contiene 50 µp??? de solución reguladora de fosfato de potasio. pH 7.0. 125 nmol FMN, 2.5 µp??? de enzima. La reacción se detuvo después de 10 min al agregar 500µ1 de 0.5 M H3PO4, y el sobrenadante obtenido por centrifugación (18 000 g, 10 min) se analizó entonces para el producto formado.

Los "terpenos" son hidrocarburos que se componen de unidades de isopreno (unidades C5) , en particular los terpenos cíclicos, por ejemplo, escualeno, con número de carbonos divisibles por 5.

Los "terpenoides" son sustancias que se derivan de los terpenos, en particular los terpenos cíclicos, por ejemplo, por inserción adicional de átomos y/o heteroátomos de carbono, por ejemplo citronela I.

Los compuestos "similares a terpenos" en el sentido de la presente invención comprenden, en particular, tales compuestos que entran en la fórmula estructural general (IV), según se define a continuación.

En general, de acuerdo con la invención se incluyen todas las formas isoméricas de los compuestos descritos en este documento, tales como isómeros constitucionales y en particular estereoisómeros y mezclas de los mismos, por ejemplo, los isómeros ópticos o isómeros geométricos, tales como isómeros E y Z, y sus combinaciones. Si varios centros asimétricos están presentes en una molécula, la invención comprende todas las combinaciones de diferentes conformaciones de estos centros asimétricos, por ejemplo, pares enantioméricos .

A menos que se indique lo contrario, las definiciones químicas generales siguientes se aplican en el presente documento: residuos hidrocarburos alifáticos comprenden residuos que se derivan de compuestos de carbono acíclicos o cíclicos, saturados o insaturados, con la excepción de los compuestos aromáticos.

Los residuos hidrocarburos alifáticos comprenden, en particular, los residuos alquenilo lineales o ramificados 0 residuos alquilo ramificados y lineales. A continuación se enumeran los ejemplos no limitantes: Alquilo y todas las porciones alquilo en los residuos derivados de los mismos, por ejemplo, residuos de hidrocarburo saturados, lineales o de una o múltiples ramificaciones, v.gr., de 1, 2, 3 ó 4 veces con 1 a 4, 1 a 6, 1 a 8, 1 a 10 o 4 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, - alquilo de C1 -C10 o alquilo de C1-C6 o alquilo de C4-C10 ; tales como metilo, etilo, propilo, 1-metiletilo, butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo y 1, 1-dimetiletilo como representantes típicos de alquilo de C1-C4 y pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo 2 , 2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, hexilo, 1 , 1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1, 1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1, 3-dimetilbutilo, 2 , 2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3 , 3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1, 1, 2-trimetilpropilo, 1,2,2 trimetilpropilo, 1-etil-l-metilpropilo y l-etil-2-metilpropilo, tal como en particular los significados de R indicados en la Tabla 4, por ejemplo, hexilo - hidroxi- alquilo de C1-C10 , por ejemplo, hidroxi-alquilo de Ci-C6, o hidroxi- alquilo de C1-C4, o hidroxi-alquilo de C4-C10 ; por ejemplo, hidroximetilo, 1 o 2-hidroxietilo, 1, 2 o 3-hidroxipropilo, 1-hidroximetiletilo, de 1-, 2-, 3- ó 4-hidroxibutilo, 1-hidroximetilpropilo y 2-hidroximetilpropilo; u otros análogos sustituidos con hidroxi de los residuos de alquilo anteriores, tales como, en particular, los significados de R dados en la Tabla 4, por ej emplo, 6-hidroxi-6-metilhept-l-ilo; - Alquenilo significa residuos de hidrocarburos de forma simple o múltiple, en particular, una o dos veces insaturado, lineal o de una o múltiples ramificaciones, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces ramificado con 2 a 4, 2 a 6, 2 a 8, 2 a 10, 4 a 10, 2 a 20 o de 4 a 20 átomos de carbono y un doble enlace en cualquier posición, o 2 dobles enlaces no acumulativos, conjugados o, en particular, no conjugados, por ejemplo, alquenilo de C2-C6, tal como etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1-metiletenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1-metil-l-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-metil-2-propenilo, 2-metil-2-propenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-metil-l-butenilo, 2-metil-l-butenilo, 3 metil-l-butenilo, l-metil-2-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 3-metil-2-butenilo, l-metil-3-butenilo, 2-metil-3-butenilo, 3-metil -3-butenilo, 1, 1 dimetil-2-propenilo, 1, 2-dimetil-l-propenilo, 1 , 2-dimetil-2-propenilo, 1- etil-1-propenilo, l-etil-2-propenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, 5 hexenilo, 1-metil-l-pentenilo, 2-metil-l-pentenilo, 3-metil-l-pentenilo, 4-metil-l-pentenilo, l-metil-2-pentenilo, 2-metil-2-pentenilo, 3-metil-2-pentenilo, 4-metil-2-pentenilo, l-metil-3-pentenilo , 2 metil-3-pentenilo, 3-metil-3-pentenilo, 4-metil-3-pentenilo, l-metil-4-pentenilo, 2-metil-4-pentenilo, 3-metil-4-pentenilo, 4-metil-4-pentenilo, 1, l-dimetil-2-butenilo, 1,1-dimetil-3-butenilo, 1 , 2-dimetil-l-butenilo, 1, 2-dimetil-2-butenilo, 1, 2 dimetil-3-butenilo, 1, 3-dimetil-l-butenilo, 1, 3-dimetil-2-butenilo, 1, 3-dimetil-3-butenilo, 2 , 2-dimetil-3- butenilo, 2,3 - dimetil-t-butenilo, 2 , 3-dimetil-2-butenilo, 2, 3-dimetil-3-butenilo, 3 , 3-dimetil-l-butenilo, 3, 3-dimetil-2-butenilo, 1-etil-l-butenilo, l-etil-2-butenilo, l-etil-3-butenilo, 2-etil-l-butenilo, 2-etil-2-butenilo, 2-etil-3-butenilo, 1, 1, 2-trimetil-2-propenilo, l-etil-l-metil-2-propenilo, l-etil-2-metil-l-propenilo y l-etil-2-metil-2-propenilo, tales como, en particular, los significados de R dados en la Tabla 4, tales como 2, 6-dimetilhepta-l, 5-dien-l-ilo, 2, 6-dimetilhept-5-en-l-ilo, 2 , 6-dimetilocta -1, 5-dien-1-ilo, octa-1, 5-dien-l-ilo, 1, 5-dimetilhexa-4-en-l-ilo, 1, 5, 9-trimetilnon-8 en-l-ilo.

"Oxo" significa, por ejemplo, un residuo que forma, junto con el átomo de carbono al que está unido, un grupo ceto (C = O) . Consecuentemente, por ejemplo, derivados de residuos de los residuos de hidrocarburos antes mencionados son los que contienen uno o más grupos ceto.

"Metileno" (= CH2) significa, por ejemplo, un residuo que forma, junto con el átomo de carbono al que está unido, un residuo de vinilo (CH = CH2) .

B. Modalidades especiales de la invención La presente invención se refiere, en particular, a las siguientes modalidades especiales: 1. proceso biocatalitico para producir nitrilos de fórmula general I en donde R significa un residuo hidrocarburo alifático lineal o de una o múltiples ramificaciones, saturado o con una o múltiples instauraciones, opcionalmente sustituido una o múltiples veces con 4 a 19 átomos de carbono, tales como, en particular alquilo de C1-C10 lineal o ramificado, o hidroxi-alquilo de C1-C10 lineal o ramificado, o alquenilo de C2-C10 lineal o ramificado o alquenilo de C4-C10 lineal o ramificado, dos veces insaturado; y n significa 1 ó 2, en particular 1; en donde una oxima de la fórmula general II R-[~CH =N—OH]n (II) en donde R y n tienen los significados dados antes, en donde el compuesto de la formula II está en forma estereoisoméricamente pura o como una mezcla de estereoisómeros , se hace reaccionar en presencia de una aldoxima deshidratasa alifática (4.99.1.5), una fenilacetatdoxima deshidratasa (PAOx) (EC 4.99.1.7) o una indolacetaldoxima deshidratase (4.99.1.6), por ejemplo una enzima que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID NO: 1 y 4 a 28, o tiene una secuencia de aminoácido idéntica a una de estas secuencias en por lo menos 60%, por ejemplo al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%; en particular una fenilacetaldoxima deshidratasa (PAOx) (EC 4.99.1.7), en particular una enzima que comprende la SEC ID NO: 1 o tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a por lo menos 60%, por ejemplo al menos 65, 70, 75 , 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 96, 97, 98, o 99%; a un compuesto de fórmula I, en donde el compuesto de fórmula I está en forma estereoisoméricamente pura o como una mezcla de estereoisómeros, y b) opcionalmente el producto de reacción se purificó adicionalmente . 2. El proceso de acuerdo con la modalidad 1, en donde el PAOx es una enzima de Rflodococcus sp., Gtbberells zeae o en particular Bacillus sp. 3. El proceso de acuerdo con una de las modalidades mencionadas anteriormente, en donde el PAOx tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos idéntica a ésta en por lo menos 60%, por ejemplo al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90 91, 92, 93, 94 95, 96 97 98 o 99%, o en donde hasta 25%, por ejemplo hasta 20, 15, 10, 9. 8, 7, 6, 5, 4 3, 2 o 1% de los residuos de aminoácidos son alterados con respecto a SEC ID NO: 1 por adición, supresión, inserción, sustitución, inversión o una combinación de los mismos, y que todavía tiene al menos 0%, por ejemplo al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de la actividad enzimática de la SEC ID NO: 1. 4. El proceso de acuerdo con una de las modalidades mencionadas anteriormente, en donde se hace reaccionar una oxima de la fórmula II, en el que el residuo R, junto con el átomo de carbono al que está unido, se deriva de un residuo de terpeno cíclico, seleccionado de residuos de hemiterpeno (C5) , monoterpeno (Cío) , sesquiterpeno (C15) , diterpeno (C20) , sesterterpene (C25) , triterpenos (C30) o tetraterpeno (en particular por hidrogenacion parcial o completa (C, O) ) , o de los correspondientes residuos de terpeno que se acortan con 1 a 3 átomos de carbono. 5. El proceso de acuerdo con una de las modalidades mencionadas anteriormente, en donde una oxima de fórmula II se hace reaccionar, en donde n representa 1 y el resto R tiene uno de los significados indicados anteriormente. 6. El proceso de acuerdo con una de las modalidades mencionadas anteriormente, en donde un compuesto de fórmula II, seleccionado de citral oxima, neral oxima, geranial oxima, citronelal oxima y análogos de los mismos parcial o totalmente hidrogenados, tales como oxima de 6,7- dihidrocitronelilo, se convierte en el nitrilo correspondiente . 7. El proceso acuerdo con la modalidad 6, en donde la citronelal oxima la fórmula lia (Ha) se convierte en citronelil nitrilo de la fórmula la en donde el compuesto de fórmula lia se utiliza en forma de estereoisómeros puros o como mezcla de estereoisómeros, tales como, en particular, como mezcla de R/S y/o E/Z, en particular, una mezcla de R/S y E/Z. 8. El proceso de acuerdo con una de las modalidades mencionadas anteriormente, en donde la reacción se lleva a cabo enzimáticamente, en presencia de PAOx, una mezcla de proteínas que contiene PAOx, o en presencia de un microorganismo recombinante que expresa funcionalmente PAOx, un homogenado celular que contiene PAOx derivado del mismo o una fracción que contiene PAOx del mismo. 9. El proceso de acuerdo con una de las modalidades mencionadas anteriormente, en donde PAOx o el microorganismo que expresa funcionalmente PAOx está presente en la mezcla de reacción en forma libre o en forma inmovilizada. 10. El proceso de acuerdo con una de las modalidades 8 y 9, en donde el microorganismo recombinante es una cepa bacteriana expresa funcionalmente PAOx, en particular una cepa de E. coli. 11. El proceso de acuerdo con la modalidad 10, en donde el microorganismo recombinante lleva una construcción de expresión, que tiene la secuencia de nucleótidos que codifica para PAOx, opcionalmente adaptado al uso del codón del microorganismo. 12. El proceso según una de las modalidades 8 a 11, en donde el microorganismo expresa adicionalmente al menos un anexo que respalda la expresión funcional (en particular plegamiento correcto) de PAOx. 13. El proceso de acuerdo con la modalidad 12, en donde el microorganismo recombinante es una cepa bacteriana, que además de PAOx expresa uno o más seleccionados de anexos GroEL y GroES. 14. El proceso de acuerdo con una de las modalidades precedentes, en donde la reacción se lleva a cabo, en particular un sustrato puro, es decir sin más adición de aditivos habituales, tales como agua, o solución reguladora como medio de reacción, en donde en particular se utilizan células enteras que expresan la enzima deshidratasa . 15. La secuencia de nucleótidos según la SEC ID NO: 2 o 3, que codifican PAOx, en donde la secuencia de nucleótidos está adaptada al uso del codón del microorganismo Eschenchia coli. 16. La construcción de expresión de acuerdo con la definición en una de las modalidades 11 a 14, o que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la modalidad 15. 17. El microorganismo recombinante de acuerdo con la definición en una de las modalidades mencionadas anteriormente 8 a 14, o que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la modalidad 15 o una construcción de expresión de acuerdo con la modalidad 16.

C. Otras modalidades de la invención 1. Proteinas/mutantes de enzimas según la invención La presente invención no se limita a las enzimas con actividad de aldoxima deshidratasa concretamente descritas en este documento, sino más bien se extiende también a equivalentes funcionales de los mismos.

"Equivalentes funcionales" o análogos de las enzimas concretamente descritas y de las mutantes de la enzima son, en el contexto de la presente invención, varios polipéptidos del mismo, que además poseen la actividad biológica deseada, v.gr., actividad de aldoxima deshidratasa .

Asi, por ejemplo "equivalentes funcionales" significa enzimas y mutantes que tienen, en un ensayo para " actividad de aldoxima deshidratasa" que se utiliza en el sentido de la invención (es decir, con un sustrato de referencia en condiciones estándar) , una actividad de una enzima, que comprende una secuencia de aminoácidos definidos concretamente en la presente (por ejemplo, un mutante derivado de la SEC ID NO: 1 o derivada de una de las secuencias de acuerdo con SEC ID NO: 4 a 28), que es mayor o menor en por lo menos 1%, en particular por lo menos aproximadamente 5 a 10%, por ejemplo, al menos 10% o al menos 20%, por ejemplo al menos 50% o 75% o 90%.

Los datos sobre la actividad para equivalentes funcionales se refieren en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, a determinaciones de la actividad llevada a cabo por medio de un sustrato de referencia bajo condiciones estándar, tal como se define en la presente.

La "actividad de aldoxima deshidratasa" en el sentido de la invención se puede detectar por medio de diversos ensayos conocidos. Sin limitarse a esto, podemos mencionar un ensayo usando un sustrato de referencia, por ejemplo, citronelal oxima o racemano de citronelal oxima, en condiciones estándar como se describe anteriormente (cf. Kato et al., Biochemistry, 2000, 39, 800-809; descrito para PAOx, y de manera similar se puede aplicar o adaptar a otras aldoxima deshidratasas ) y se explica en la sección experimental .

Los equivalentes funcionales son además, por ejemplo, estables entre pH 4 a 11 y poseen ventajosamente un pH óptimo en el intervalo de pH de 5 a 10, tal como en particular 6.5 a 9.5 o 7 a 8 o a aproximadamente 7.5, y una temperatura óptima en el intervalo de 15°C a 80 °C o 20 °C a 70°C, por ejemplo, aproximadamente 30 a 60°C o de aproximadamente 35 a 45°C, tal como a 40°C.

Los "equivalentes funcionales" comprenden los mutantes obtenibles por uno o más, por ejemplo, 1 a 50, 2 a 30, 2 a 15, 4 a 12 o de 5 a 10 "mutaciones adicionales", tales como adiciones, sustituciones, supresiones y/o inversiones de aminoácidos, en donde pueden ocurrir los cambios indicados en cualquier posición de la secuencia, siempre y cuando que conduzca a un mutante con el perfil de propiedades de acuerdo con la invención. La equivalencia funcional, en particular, también se obtiene cuando los patrones de reactividad entre el polipéptido mutante e inalterado coinciden cualitativamente, es decir, por ejemplo, sustratos idénticos se convierten a un ritmo diferente.

"Mutaciones adicionales" de este tipo puede ocurrir en cualquier posición de la secuencia de aminoácidos correspondientes .

Los ejemplos no limitantes de sustituciones de aminoácidos apropiados se presentan en la siguiente tabla: Residuo original Ejemplos de Sustitución Ala Ser Arg Lys Asn Gln; His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn ; Gln He Leu; Val Leu lie; Val Lys Arg ; Gln ; Glu Met Leu ; lie Phe Met ; Leu ; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp ; Phe Val He; Leu Los "equivalentes funcionales" en el sentido anterior también son "precursores" de los polipéptidos descritos, asi como "derivados funcionales" y "sales" de los polipéptidos .

Los "precursores" son precursores sintéticos o naturales de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.

Las "sales" de expresión significan ambas sales de grupos carboxilo y sales de adición de ácido de grupos amino de las moléculas de proteina de acuerdo con la invención. Las sales de grupos carboxilo pueden ser producidos de una manera conocida por si misma y comprenden sales inorgánicas, por ejemplo sales de sodio, calcio, amonio, hierro y zinc, y sales con bases orgánicas, por ejemplo aminas, tales como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina y similares. Las sales de adición de ácido, por ejemplo sales con ácidos minerales, tales como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y sales con ácidos orgánicos, tales como ácido oxálico y ácido acético también" están cubiertos por la invención.

Los "derivados funcionales" de polipéptidos de acuerdo con la invención pueden también ser producido en grupos laterales de aminoácidos funcionales o en su extremo N- o C-terminal por técnicas conocidas. Tales derivados comprenden, por ejemplo, ésteres alifáticos de los grupos de ácido carboxilico, amidas de grupos de ácido carboxílico, obtenibles mediante reacción con amoniaco o con una aminaprimaria o secundaria; derivados de N-acilo de grupos amino libres, producidos por reacción con grupos acilo; o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres, producidos por reacción con grupos acilo.

Los "equivalentes funcionales" naturalmente también comprenden polipéptidos que son accesibles a partir de otros organismos y variantes presentes en la naturaleza. Por ejemplo, los rangos de regiones de secuencias homologas pueden ser establecidos por comparación de secuencias y las enzimas equivalentes pueden determinarse sobre la base de las especificaciones concretas de la invención.

Los "equivalentes funcionales" también comprenden fragmentos, preferiblemente dominios individuales o motivos de secuencia, de los polipéptidos según la invención, que, por ejemplo, tienen la función biológica deseada.

Los "equivalentes funcionales" son, además, las proteínas de fusión, que tienen una de las secuencias de polipéptidos antes mencionadas o equivalentes funcionales derivados de los mismos y por lo menos otra secuencia heteróloga adicional, funcionalmente diferente de ésta, en la ligadura N-funcional o C-terminal (es decir, sin deterioro sustancial funcional mutuo de las porciones de proteína de fusión) . Ejemplos no limitantes de secuencias heterólogas de este tipo son, por ejemplo péptidos de señal, anclas de histidina o enzimas.

Los "equivalentes funcionales" incluidos de acuerdo con la invención son homólogos de las proteínas concretamente reveladas. Estos tienen, al menos 60%, preferiblemente al menos 75%, en particular al menos 85%, por ejemplo 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de homología (o identidad) con una de las secuencias de aminoácidos descritas concretamente, calculadas mediante el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. (EE.UU.) 85 (8), 1988, 2444-2448. Un porcentaje de homología o identidad de un polipéptido homólogo de acuerdo con la invención significa, en particular, el porcentaje de identidad de los residuos de aminoácidos con relación a la longitud total de una de las secuencias de aminoácidos concretamente descritos en este documento.

Los valores de identidad porcentual también pueden determinarse sobre la base de alineaciones BLAST, el algoritmo blastp (BLAST proteína-proteína) , o el uso de los ajustes de Clustal dados a continuación.

En el caso de una posible glicosilación de proteínas, "equivalentes funcionales" de acuerdo con la invención comprenden proteínas del tipo indicado anteriormente en forma desglicosilada o glicosilada y formas modificadas que se pueden obtener mediante la alteración del patrón de glicosilación .

Los homólogos de las proteínas o polipéptidos según la invención pueden ser producidos por mutagénesis, por ejemplo, por mutación puntual, alargamiento o acortamiento de la proteína.

Los homólogos de las proteínas de acuerdo con la invención se pueden identificar mediante el cribado de bancos combinatorios de imitantes, por ejemplo, mutantes acortados. Por ejemplo, un banco abigarrado de variantes de proteína puede ser producida por mutagénesis combinatoria a nivel del ácido nucleico, por ejemplo, por ligadura enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Hay un gran número de métodos que se puede utilizar para la producción de bancos de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador automático de DNA y el gen sintético puede entonces ser ligado en un vector de expresión adecuado. El uso de un conjunto degenerado de genes hace posible proporcionar todas las secuencias, en una mezcla, que codifica para el conjunto deseado de secuencias de proteínas potenciales. Los métodos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados son conocidos por una persona experta en la técnica (por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984), Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477) .

Varias técnicas para seleccionar productos génicos de bancos combinatorios, que han sido producidas por mutaciones puntuales o acortamiento y para el cribado de bancos de cDNA para productos génicos con una propiedad seleccionada, son conocidas en la técnica anterior. Estas técnicas se pueden adaptar al tamizado rápido de bancos de genes que han sido producidos por mutagénesis combinatoria de homólogos de acuerdo con la invención. Las técnicas que se utilizan con mayor frecuencia para la selección de bancos de genes grandes, que forman la base del análisis de alto rendimiento, comprenden la clonación del banco de genes en vectores de expresión replicables, transformando las células adecuadas con el banco vector resultante y expresando los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de la actividad deseada facilita el aislamiento del gen que codifica el vector cuyo producto fue detectado. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM) , una tecnología que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en los bancos, puede usarse en combinación con las pruebas de detección. Con el fin de identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering (3) : 327-331) . 2. Ácidos nucleicos y construcciones 2.1 Ácidos nucleicos La invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican una enzima como se describe anteriormente o un mutante de la misma descritos anteriormente con actividad de aldoxima deshidratase.

La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos con un grado especifico de identidad con las secuencias concretas descritas en el presente documento.

"Identidad" entre dos ácidos nucleicos significa la identidad de los nucleótidos sobre la longitud total de ácidos nucleicos en cada caso, en particular, la identidad que se calcula por comparación mediante el software Vector NTI suite 7.1 de la empresa Informax (EE.UU.) mediante la técnica Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive múltiple sequence alignments on a microcomputer. Comput. Appl Biosci. 1989 abril, 5 (2) : 151-1) después de establecer los siguiente parámetros: Parámetros de alineación múltiple: Falta de apertura de espacio 10 Falta de extensión de espacio 10 Rango de falta de separación de espacio 8 Falta de separación de espacio apagado % identidad de retardo de alineación 40 Espacios específicos residuales apagado Espacio residual hidrofílico apagado Peso de transición 0 Parámetros de alineación por pares Algoritmo FAST encendido Tamaño de K-tuple 1 Falta de espacio 3 Tamaño de ventana 5 Número de mejores diagonales 5 Como una alternativa, la identidad también se peud edeterminar de acuerdo conChenna, Ramu, Sugawuara, hedeaki, Koike, Tadashi, López, Rodrigo, Gibson, Toby J. Higgins, Desmond G. Thompson, Lulie D. Múltiple sequence alignment with the Clustalseries of programs. (2003) Nucleic Acids Res. 3' ( 13) : 3497-500, de acuerdo con la dirección de internet: http: //www . ebi . ac. uk/Tools/elustalw/índex .html# y con los siguientes parámetros: Falta de apertura de espacio DNA 15.0 Falta de extensón de espacio DNA 6.66 Matriz DNA identidad Falta de apertura de espacio proteína 10.0 Falta de extensión de espacio proteína 0.2 Matriz de proteína Gonnet ENDGAP Proteina/DNA -1 GAPDIST Proteina/DNA 4 Todas las secuencias de ácidos nucleicos mencionados en este documento (las secuencias de DNA y ARN de cadena sencilla y de cadena doble, por ejemplo, cDNA y mRNA) se puede producir de una manera conocida per se por síntesis química a partir de los bloques de construcción de nucleótidos, por ejemplo, por condensación de fragmentos de superposición individual, bloques de construcción de ácido nucleico complementarias de la doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos, puede tener lugar por ejemplo, de una manera conocida, por el método de fosforamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press de Nueva York, páginas 896-897).

Además de baldosas de oligonucleótidos sintéticos y llenado de vacíos por medio del fragmento de DNA polimerasa Klenow y reacciones de ligadura y técnicas generales de clonación se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press .

La invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico (DNA de una sola hebra y de doble hebra y secuencias de ARN, por ejemplo, cDNA y mRNA) , que codifican uno de los polipéptidos anteriores y equivalentes funcionales de los mismos, que son por ejemplo accesibles mediante el uso de análogos de nucleótidos artificiales.

La invención se refiere tanto a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para polipéptidos o proteínas de acuerdo con la invención o segmentos biológicamente activos de los mismos, y para fragmentos de ácidos nucleicos, que se pueden utilizar, por ejemplo, como sondas de hibridación o cebadores para la identificación o amplificación de codificación de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.

Las moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden contener además secuencias no traducidas a partir de los extremos 3' y/o 5' de la región del gen de codificación .

La invención además comprende las moléculas de ácido nucleico complementarias a las secuencias de nucleótidos descritas concretamente o un segmento del mismo.

Las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención hacen posible la producción de sondas y cebadores que pueden ser utilizados para la identificación y/o clonación de secuencias homologas en otros tipos de células y organismos. Dichas sondas o cebadores comprenden normalmente una región de secuencia de nucleótidos que se hibridiza en condiciones "estrictas" (ver a continuación) para al menos aproximadamente 12, preferiblemente al menos aproximadamente 25, por ejemplo, aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos sucesivos de una cadena sentido de una secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o una cadena antisentido correspondiente.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico y, además, pueden ser esencialmente libres de otro material celular o medio de cultivo, cuando se produce por técnicas recombinantes , o libres de precursores químicos u otros productos químicos, cuando se sintetizan químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede aislar por medio de técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencia proporcionada de acuerdo con la invención. Por ejemplo, puede ser aislado cDNA de un banco de cDNA adecuado, usando una de las secuencias completas descritas concretamente o un segmento de las mismas como sonda de hibridización y técnicas de hibridización estándar (como se describió por ejemplo en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. y Maniat's, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Sprng Harbor, NY, 1989) . Además, una molécula de ácido nucleico, que comprende una de las secuencias descritas o un segmento de la misma, puede ser aislada por la reacción de cadena de polimerasa, utilizando los cebadores de oligonucleótidos que se prepararon sobre la base de esta secuencia. El ácido nucleico asi amplificado puede ser clonado en un vector adecuado y puede caracterizarse por análisis de secuencia de DNA. Los oligonucleótidos según la invención, además, se pueden producir por métodos estándar de síntesis, por ejemplo, con un sintetizador de DNA automatizado .

Las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención o sus derivados, homólogos o partes de estas secuencias, se pueden aislar, por ejemplo, con técnicas de hibridación habituales o tecnología de PCR procedentes de otra bacterias, por ejemplo, a través de bancos genómicos o de cDNA. Estas secuencias de DNA se hibridan a las secuencias de acuerdo con la invención bajo condiciones estándar.

"Hibridizar" significa la capacidad de un poli u oligonucleótido que se une a una secuencia casi complementaria bajo condiciones estándar. Mientras que la unión no específica entre los socios no complementarios no se produce en estas condiciones. Para esto, las secuencias pueden ser complementarias de 90-100%. Se utiliza la propiedad de secuencias complementarias que es capaz de unirse específicamente una a la otra, por ejemplo, en Northern o Southern Blotting o durante la unión de cebador en PCR o RT-PCR.

Ventajosamente, los oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas se utilizan para hibridización . Sin embargo, los fragmentos más largos de los ácidos nucleicos según la invención o las secuencias completas también pueden ser utilizados para la hibridación. Estas condiciones estándar varían dependiendo del ácido nucleico utilizado (oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa) o dependiendo del tipo en el cual se usa el DNA o ARN para la hibridación. Por ejemplo, las temperaturas de fusión de DNA. Los híbridos de DNA son aprox. 10°C inferiores a los de híbridos de DNA: ARN de la misma longitud.

Las condiciones estándar significan, por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico, temperaturas entre 42 y 58°C en una solución reguladora acuosa con una concentración entre 0.1 a 5 x SSC (1 X SSC = NaCl 0.15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7.2) o adicionalmente en la presencia de 0% de formamida tal como por ejemplo 20 °C en 5 x SSC 50% de formamida. Ventajosamente, las condiciones de hibridizacion para híbridos de DNA: DNA son de 0.1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20°C a 45°C, preferiblemente entre aproximadamente 30°C a 45°C. Para híbridos de DNA : RNA las condiciones de hibridización son ventajosamente de 0.1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30 °C a 55 °C, preferiblemente entre aproximadamente 45 °C a 55°C. Estas temperaturas establecidas para hibridización son, por ejemplo, valores calculados de temperatura de fusión par aun ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y contenido de G x C de 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para hibridización de DNA se describen en textos de genética relevantes, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y se puede calcular utilizando fórmulas conocidas por una persona experta en la técnica, por ejemplo, dependiendo de la longitud de los ácidos nucleicos, el tipo de híbridos o el contenido de G + C. Una persona experta en la técnica puede obtener más información sobre hibridación en los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds) , 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York; Hames y Higgins (eds.), 1985, Nucleic Acids Hibridization: A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press, Oxford.

La "hibridación", en particular, puede tener lugar bajo condiciones rigurosas. Dichas condiciones de hibridización se describen por ejemplo por Sambrook, J. , Fritsch, EF, Maniatis, T., en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-n.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Las condiciones de hibridación estrictas significan en particular: incubación a 42 °C durante toda la noche en una solución que consiste en 50% formamida, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM citrato trisódico) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5x solución Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 g/ml de DNA de esperma de salmón esquilado, seguido por un paso de lavado de filtro con 0.1 x SSC a 65 °C.

La invención también se refiere a derivados de la las secuencias de ácidos nucleicos descritas en concreto o derivables .

Por lo tanto, otras secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, que codifican para aldoxima deshidratasa, pueden derivarse, por ejemplo, de SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 y difieren de ellos por adición, sustitución, inserción o supresión de uno o varios nucleótidos, pero además codifican polipéptidos con el perfil de propiedad deseado .

La invención también comprende secuencias de ácidos nucleicos que comprenden mutaciones silenciosas asi llamadas o se alteran correspondiendo al uso de codones de un organismo original o huésped especial, comparado con una secuencia establecida concretamente, tal como SEC ID NO: 3, que se optimiza con respecto al uso de codón de E. coli partiendo de SEC ID NO: 2, así como variantes que se presentan naturalmente, v.g . , variantes de escisión o variantes de alelos, de los mismos.

La invención también se refiere a secuencias obtenibles mediante sustituciones de nucleótidos conservativas (es decir, el aminoácido en cuestión se sustituye con un aminoácido de la carga misma, tamaño, polaridad y/o solubilidad) .

La invención también se refiere a moléculas de los derivados de los ácidos nucleicos descritos concretamente por los polimorfismos de secuencia. Pueden existir polimorfismos genéticos entre los individuos dentro de una población debido a la variación natural. Estas variaciones naturales suelen producir una varianza de 1 a 5% en la secuencia de nucleótidos de un gen.

Los derivados de las secuencias de ácidos nucleicos según la invención, que codifican para aldoxima deshidratasa, derivados de la secuencia SEC ID NO: 3 o de una de las secuencias codificantes de SEC ID NO: 1, significan por ejemplo, variantes alélicas que tienen al menos 60 % de homología a nivel de aminoácidos derivada, preferiblemente al menos 80% de homología, muy especialmente preferiblemente al menos 90% de homología en toda la región de la secuencia (con respecto a la homología a nivel de aminoácidos, debe hacerse referencia tomando en cuenta los polipéptidos concernientes anteriores) . En las regiones parciales de las secuencias, las homologías pueden ser ventajosamente superiores.

Además, también debe entenderse que los derivados son homólogos de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo hongos u homólogos bacterianos, secuencias acortadas, DNA o RNA de una sola hebra de la secuencia codificada y no codificadora de DNA.

Por otra parte, derivados significan fusiones con promotores ilustrativas. Los promotores que se unen a las secuencias de nucleótidos declarados pueden ser alterados por al menos un intercambio de nucleótidos, al menos una inversión de inserción y/o supresión, pero sin perjudicar la funcionalidad o eficacia de los promotores. Por otra parte, los promotores pueden tener eficacia incrementada mediante la alteración de su secuencia, o pueden intercambiarse completamente por promotores más eficaces incluso de organismos exóticos. 2.2 Generación de m tantes funcionales Además, los métodos de producción de mutantes funcionales de las enzimas de acuerdo con la invención son conocidos por una persona experta en la técnica.

En función de la tecnología utilizada, un experto en la materia puede introducir mutaciones completamente aleatorias o también más dirigidas en genes o también regiones de ácidos nucleicos no codificantes (que por ejemplo, son importantes para la regulación de la expresión) y luego preparar bancos de genes. Los métodos requeridos de biología molecular son conocidos por un experto en la materia y por ejemplo, se describen en Sambrook y Russell, Molecular Cloning, 3a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.

Los métodos para alterar genes y por tanto, para alterar la proteína codificada por ellos han sido conocidos por largo tiempo para una persona experta en la técnica, por e emplo - Mutagénesis dirigida al sitio, en la cual los nucleótidos individuales o varios de un gen se intercambian intencionalmente (Trower MK (ed) 1996; In vitro mutagénesis protocols. Humana Press, Nueva Jersey) .

- Mutagénesis de saturación, en donde un codón para cualquier aminoácido deseado puede ser intercambiado o añadido en cualquier sitio deseado de un gen (Kegler-Ebo DM, Dockter CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22: 1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22: 541; Barik S (199E>) Mel Biotechnol 3: 1), - La reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores (PCR propensa a error) , en donde secuencias de nucleótidos están mutadas por polimerasas de DNA de trabajo defectuoso (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18: 3139) ; El método de SeSa (Método de saturación de secuencia) , en el cual los intercambios preferentes se impiden por la polimerasa. Schenk et al., Biospektrum, vol . 3, 2006, 277-279; - El paso de los genes en cepas mutantes, en donde hay un aumento de la tasa de mutación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo debido a los mecanismos de reparación de DNA defectuosa (Greener A. Callaran M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique usasing an E. coli mutator strain. In: Trower MK (ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, Nueva Jersey), o La mezcla de ADN, en la cual se forma una combinación de genes estrechamente relacionados y se digiere y se usan los fragmentos como modelos para una reacción en cadena de polimerasa, en la cual, por separación y reensamble de hebras repetidas, se producen los genes de mosaico final de longitud completa (Stemmer WPC (1994) Nature 370: 389; Stemmer WPC (1994) Proc. Nati Acad Sci EE.UU. 91: 10747).

Mediante el uso de evolución dirigida asi llamada (descrita entre otras cosas en Reetz MT y Jaeger KE (1999), Topics Curr Chem 200: 31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (ed. ) Manual of industrial microbiology and biotechnology . American Society for Microbiology) , una persona experta en la técnica también puede producir mutantes funcionales en una manera dirigida y en gran escala. En esto, en una primera etapa, en primer lugar se producen bancos de genes de las respectivas proteínas, por ejemplo usando los métodos dados anteriormente. Los bancos de genes se expresan de una manera adecuada, por ejemplo, por bacterias o por sistemas de visualización de fagos.

El genes relevantes de organismos huéspedes, que expresan mutantes funcionales con propiedades que corresponden en gran medida corresponden a las propiedades deseadas, puede ser sometidos a una nueva ronda de mutación. Los pasos de mutación y de selección o cribado pueden repetirse de forma iterativa, hasta que los mutantes funcionales que están presentes visualizan las propiedades deseadas en un grado suficiente. Con este el proceso iterativo, un número limitado de mutaciones, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones, se pueden realizar por etapas y pueden ser evaluados y seleccionados por su influencia en la propiedad de la enzima en cuestión. La mutante seleccionada puede entonces ser sometida a otra etapa de mutación de la misma manera. Esto puede reducir significativamente el número de mutantes individuales para ser investigadas.

Los resultados de acuerdo con la invención también proporcionan información importante sobre la estructura y la secuencia de las enzimas relevantes, que es necesaria para la generación de nuevas enzimas dirigidas con propiedades modificadas deseadas. En particular, los llamados "puntos calientes" pueden ser definidos, es decir, segmentos de secuencia que son potencialmente adecuados para modificar una propiedad de la enzima a través de la introducción de mutaciones dirigidas.

También se puede derivar información en relación a las posiciones de secuencia de aminoácidos, en la región de la que las mutaciones se pueden llevar a cabo, lo que probablemente debería tener poca influencia sobre la actividad enzimática, y puede ser designada como "mutaciones silenciosas" potenciales. 2.3 Construcciones La invención además se refiere, en particular, a las construcciones de expresión recombinante, que contiene, bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención; y, en particular, vectores recombinantes , que comprenden al menos uno de estas construcciones de expresión.

Una "unidad de expresión" significa, de acuerdo con la invención, un ácido nucleico con la actividad de expresión, que comprende un promotor, como se define aquí, y después el acoplamiento funcional con un ácido nucleico que se expresa o un gen, regula la expresión, es decir la transcripción y la traducción de este ácido nucleico o de este gen. Por lo tanto, en este contexto, también hablamos de una "secuencia de ácido nucleico regulador". Además del promotor, también están contenidos otros elementos reguladores, por ejemplo, mejoradores.

Un "cásete de expresión" o; "construcción de expresión" significa, de acuerdo con la invención, una unidad de expresión que está vinculada funcionalmente al ácido nucleico a expresar o para el gen a ser expresado. En contraste con una unidad de expresión, un cásete de expresión comprende, por lo tanto, no sólo el ácido nucleico que regulas las secuencias de transcripción y traducción, sino también las secuencias de ácidos nucleicos que deben ser expresadas como la proteina como resultado de la transcripción y traducción.

Los términos "expresión" o "sobreexpresión" describen, en el contexto de la invención, la producción o aumento de la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el DNA correspondiente. Para ello es posible, por ejemplo introducir un gen en un organismo, reemplazar un gen existente con otro gen, aumentar el número de copias del gen o genes, usar un promotor fuerte o usar un gen que codifica para una enzima correspondiente con una elevada actividad y estas medidas pueden combinarse opcionalmente .

Preferiblemente, estas construcciones de acuerdo con la invención comprenden, 5' corriente arriba de la secuencia de codificación respectiva, el promotor y 3' corriente debajo de una secuencia terminadora y, opcionalmente, elementos reguladores más habituales, en cada caso acoplado operativamente a la secuencia codificante.

Un "promotor", un "promotor de la actividad con ácido nucleico" o una "secuencia promotora" significa, de acuerdo con la invención, un ácido nucleico que, funcionalmente se acopla a un ácido nucleico que se transcribe, regula la transcripción del ácido nucleico.

Los medios de acoplamiento "funcionales" u "operativos" en este contexto, por ejemplo, la disposición secuencial de uno de los ácidos nucleicos con la actividad del promotor y una secuencia de ácido nucleico que se transcribe y opcionalmente otros elementos reguladores, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos que aseguran la transcripción de ácidos nucleicos y por ejemplo, un terminador, por lo que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función durante la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Esto no requiere necesariamente el acoplamiento directo en el sentido químico. Las secuencias de control genético, para ejemplo secuencias potenciadoras, puede ejercer su función en la secuencia diana incluso desde posiciones más alejadas o incluso desde otras moléculas de DNA. Se prefieren las disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico que se transcribe se coloca detrás (es decir en el extremo 3' de la secuencia del promotor, de modo que las dos secuencias se unen de forma covalente. Por otra parte, la distancia entre la secuencia del promotor y la secuencia de ácido nucleico a expresarse transgénicamente puede ser menor que 200 pares de bases, o menor que 100 pares de bases o menor que 50 pares de bases.

Además de los promotores y terminadores, como ejemplos de otros elementos reguladores podemos mencionar secuencias de dirección, potenciadores, señales de poliadenilación, marcadores seleccionables , señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. Las secuencias reguladoras adecuadas se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) .

Las construcciones de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprenden en particular una secuencia que codifica para un mutante de deshidratasa aldoxima, en particular uno derivado de la secuencia de ácido nucleico que codifica para un PAOx según la SEC ID NO: 1 y al uso del codón de SEC ID NO: 3 de E. coli o derivados de los mismos y los homólogos y las secuencias de ácidos nucleicos derivables de los mismos, que están acopladas operativamente o funcionalmente con una o más señales de regulación ventajosamente para controlar, v.gr., la expresión de genes creciente .

Además de estas secuencias reguladoras, la regulación natural de estas secuencias aún puede estar presente antes de los genes estructurales reales y opcionalmente puede ser alterado genéticamente, de manera que la regulación natural se desconecta y se incrementa la expresión de los genes. La construcción de ácido nucleico puede, sin embargo, también ser de construcción más simple, es decir, sin la inserción de ninguna señal reguladora adicional antes de la secuencia de codificación y sin remover el promotor natural con su regulación. En su lugar, la secuencia reguladora natural es mutada de manera que la regulación ya no toma lugar y se incrementa la expresión de genes actual.

Una construcción de ácido nucleico preferida ventajosamente también contiene una o más de las secuencias de "mejoradores" ya mencionados, funcionalmente acoplados al promotor, que hacen posible que se incremente la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. Las secuencias ventajosas adicionales, tales como otros elementos reguladores o terminadores, también pueden insertarse en el extremo 3' de las secuencias de DNA. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden estar contenidos en una o más copias en la construcción. La construcción puede contener aún otros marcadores, como la resistencia a los antibióticos o genes complementarios auxótrofos, opcionalmente para la selección en la construcción.

Los ejemplos de secuencias reguladoras adecuadas se encuentran en promotores como eos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacl¾", T7, T5, T3, gal, tre, ara, rhaP (rhaPeAD) SP6, lambda-PR o en el promotor lambda-PL, que encuentra aplicación ventajosamente en bacterias Gram-negativas. Las secuencias reguladoras ventajosas adicionales están contenidas por ejemplo en los promotores amy Gram positivos y SPO2, en los promotores ADC1. MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, RP28, ADH de levaduras u hongos. Los promotores artificiales también pueden utilizarse para la regulación .

Para la expresión en un organismo huésped, de manera ventajosa se inserta la construcción de ácido nucleico en un vector, por ejemplo un plásmido o un fago, lo que hace que sea posible la expresión óptima de los genes en el huésped. Aparte de plásmidos y fagos, los vectores también deben ser entendidos como todos los otros vectores conocidos por expertos en la técnica, por ejemplo, virus, tales como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmidos, y DNA lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse de manera autónoma en el organismo huésped o pueden ser replicados cromosómicamente . Estos vectores representan una modalidad adicional de la invención.

Los plásmidos adecuados están por ejemplo pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, plJC19, pKC30, pHep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, p BL24, pLG200, pUH290, PIN-III 113-B1, Agtll o pBdCI en E. coli, pIJIOl, piJ364, pIJ702 o piJ361 en Streptomyces, pUI3110, pC194 o pBD214 en Bacillus, pSA77 o pAJ667 en Corynebacterium, pALSl, piL2 o pBB116 en hongos, 2alphaM, PAG-1, YEp6, YEpl3 o pEMBLYe23 en levaduras o pLGV23, pGHiac+, pBIN~9, pAK2004 o pDH51 en plantas. Los plásmidos mencionados representan una pequeña selección de los posibles plásmidos. Otros plásmidos son ciertamente conocidos por una persona experta en la técnica y puede por ejemplo encontrarse en el libro Cloning Vectors (Eds. Pauwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1185, ISBN 0 444 904018) .

En otra modalidad del vector, el vector que contiene la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la invención o el ácido nucleico de acuerdo con la invención puede también ventajosamente ser introducido en forma de un DNA lineal en los microorganismos y se integra por recombinación heteróloga u homologa en el genoma del organismo huésped. Este DNA lineal puede consistir en una vector linearizado tal como un plásmido o sólo de la construcción de ácido nucleico o el ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Para la expresión óptima de los genes en organismos heterólogos, es ventajoso alterar las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes a la "uso de codón" especifico utilizado en el organismo. El "uso de codones" fácilmente se puede determinar sobre la base de evaluaciones de computadoras de otros genes conocidos del organismo en cuestión. T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook. Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, · NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology" Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) .

Para la expresión en un organismo huésped adecuado, la construcción de ácido nucleico o construcción génica recombinante se inserta ventajosamente en un vector-huésped especifico, lo que hace que sea posible la expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son ciertamente conocidos por una persona experta en la técnica y se pueden encontrar por ejemplo en "vectores de clonación" (PH Pauwels et al., Ed. , Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). 3. Microorganismos Dependiendo del contexto, el término "microorganismo" puede significar el microorganismo de tipo salvaje o un microorganismo recombinante modificado genéticamente, o ambos.

Por medio de los vectores de acuerdo con la invención, los microorganismos recombinantes se pueden producir, por ejemplo, que se transforman con al menos un vector de acuerdo con la invención y se puede utilizar para la producción de los polipéptidos según la invención. Ventajosamente, las construcciones recombinantes de acuerdo con la invención, descritas anteriormente, se introducen en un sistema huésped adecuado y capaz de ser expresado. Los métodos de clonación y transfección se utilizan que son familiares para una persona experta en la técnica, por ejemplo co-precipitación, fusión de protoplastos, electroporación, transfection retroviral y similares, para la expresión de los ácidos nucleicos indicados en el sistema de expresión respectivo. Los sistemas adecuados se describen por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., iley Interscience . New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, H189.

En principio, todos los organismos procariotes o eucariotes pueden ser considerados como organismos huésped recombinantes para el ácido nucleico de acuerdo con la invención o la construcción de ácido nucleico. Ventajosamente, los microorganismos tales como bacterias, hongos o levaduras se emplean como organismos huésped. Ventajosamente, se utilizan bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, preferiblemente bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae o Nocardiaceae, especialmente de preferencia bacterias de los géneros Escherichia. Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium o Rhodococcus . Son muy especialmente preferidos el género y la especie Escherichia coli. Se encuentran, por otra parte, otras bacterias ventajosas en el grupo de alfa-proteobacterias, beta-proteobacterias o gamma - proteobacterias .

El organismo huésped o los organismos huéspedes de acuerdo con la invención contienen preferiblemente al menos una de las secuencias de ácidos nucleicos, construcciones de ácido nucleico o vectores descritos en esta invención, que codifican para una enzima con actividad de deshidrogenasa feniletanol según la definición anterior.

Los organismos utilizados en el proceso según la invención son, dependiendo del organismo huésped desarrollado o cultivado de una manera conocida por una persona experta en la técnica. Los microorganismos son como una desarrollados en un medio liquido que contiene una fuente de carbono generalmente en la forma de fuentes de nitrógeno generalmente en forma de fuentes de nitrógeno orgánicas tales como extracto de levadura o sales tales como sulfato de amonio, elementos traza tales como el hierro, manganeso, sales de magnesio y opcionalmente vitaminas, a temperaturas entre 10°C y 100°C, preferiblemente entre 10°C y 60°C con aireación por oxígeno. Durante este, el pH del liquido nutriente puede mantenerse a un valor fijo, es decir, puede o no ser regulada durante el cultivo. El cultivo puede ser en forma de lotes, en forma de semilotes o continua. Los nutrientes pueden ser suministrados en el inicio de la fermentación o pueden ser alimentados en semilotes o de forma continua.

. La producción recombinante de las enzimas según la invención La invención se refiere además a métodos para la producción recombinante de polipéptidos de acuerdo con la invención o fragmentos funcionales, biológicamente activos de los mismos, en donde un se cultiva un microorganismo productor de polipéptidos, opcionalmente se induce la expresión de la polipéptidos y éstos se aislan a partir del cultivo. Los polipéptidos también se pueden producir en esta forma sobre una escala industrial, si se desea.

Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en un movimiento de proceso por lotes o en un lote alimentado o el proceso por lotes alimentado repetido. Una revisión de técnicas de cultivo conocidas se pueden encontrar en Chmiel's textbook (Bioprocess Technology 1. Introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el texto Storhas (Bioreactors and Peripheral Equipment (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesibaden, 1994).

El medio de cultivo a utilizar debe satisfacer los requisitos de las respectivas cepas en una manera adecuada. Las descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos se dan en "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Estos medios para usarse de acuerdo con la invención generalmente comprenden una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o elementos traza.

Las fuentes de carbono preferidas son azúcares, tales como mono-, di- o poli-sacáridos . Las fuentes de carbono muy buenas son, por ejemplo glucosa, fructosa, mañosa, galactosa, ribosa, sorbosa, ribulosa, lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, almidón o celulosa. Los azúcares también se pueden añadir a los medios de comunicación a través de los compuestos complejos, tales como melaza, u otros subproductos de refinado de azúcar. También pueden ser mezclas ventajosas ácidas de diversas fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son por ejemplo, aceites y grasas por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico o ácido linoleico, alcoholes tales como glicerol, metanol o etanol, y ácidos orgánicos tales ácido acético o ácido láctico.

Las fuentes de nitrógeno suelen ser compuestos o materiales orgánicos o inorgánicos de nitrógeno, que contienen estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno comprenden sales de gas amoniaco o amonio, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio o nitrato de amonio, nitratos, urea, aminoácidos o fuentes de nitrógeno complejas, tales como licor de maíz escalonado, harina de soya, proteina de soya, extracto de levadura, extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o como una mezcla.

Los compuestos de sal inorgánicos que pueden contaminarse pueden estar contenidos en los medios de comunicación comprenden sales de cloruro, fósforo o sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro. La fuente de azufre usada pueden ser compuestos inorgánicos que contienen azufre, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionita, tetrationato, tiosulfatos, sulfuros, además también compuestos de azufre orgánico, tales como mercaptanos y tioles.

El ácido fosfórico, fosfato de dihidrógeno de potasio o fosfato de hidrógeno de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes que pueden ser como la fuente de fósforo.

Los agentes quelantes se pueden añadir al medio a fin de mantener los iones metálicos en solución. Los agentes quelantes especialmente adecuados comprenden dihidroxifenoles, tales como catecol o protocatecuate, o ácidos orgánicos ales como ácido cítrico.

Los medios de fermentación utilizados de acuerdo con la invención normalmente también contienen otros factores de crecimiento, tales como vitaminas o promotores de crecimiento, incluyendo, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y sales a menudo se originan a partir de componentes complejos de los medios de comunicación, tales como extracto de levadura, melazas, licor de maceración de maíz ~ y similares. Además, precursores adecuados se pueden añadir al medio de cultivo. La composición precisa de los compuestos en los medios de comunicación depende en gran medida el experimento particular y se decide individualmente para cada caso especifico. La información sobre la optimización de los medios de comunicación se puede encontrar en el libro de texto "Applied icrobiol. Physiology, A Practical Approach" (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963:577 3). Los medios de cultivo también se pueden obtener a partir de proveedores comerciales tales como Standard 1 (Merck) o BHI (infusión de cerebro y corazón, DIFCO) y similares .

Todos los componentes del medio se esterilizan, ya sea con calor (20 min a 1.5 bar y 121°C) o por filtración estéril. Los componentes se pueden esterilizar, ya sea juntos o por separado si es necesario. Todos los componentes de los medios de comunicación pueden estar presentes en el inicio de la cultura u opcionalmente se añade de forma continua o discontinua .

La temperatura del cultivo está normalmente entre 15°C y 45°C, preferiblemente 25°C a 40°C y puede mantenerse constante o puede ser variable durante el experimento. El pH del medio debe estar en el intervalo de 5 a 8.5. Preferiblemente aproximadamente 7.0. El pH del cultivo puede ser controlado durante el cultivo por la adición de compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco o agua amoniacal o compuestos de ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Agentes antiespumantes, tales como ésteres poliglicólidos de ácido graso, se pueden usar para controlar la formación de espuma. Para mantener la estabilidad de plásmidos, las sustancias adecuadas con acción selectiva, por ejemplo, antibióticos, pueden ser añadidos al medio. Para mantener condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, v.gr., aire ambiente, se introducen en el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente 20°C a 45°C. El cultivo continúa hasta que se ha formado un máximo del producto deseado. Este objetivo se alcanza normalmente dentro de 10 horas a 160 horas.

El caldo de fermentación se procesa adicionalmente . Dependiendo de los requisitos, la biomasa se puede eliminar del caldo de fermentación completa o parcialmente mediante técnicas de separación, por ejemplo, centrifugación, filtración, decantación o una combinación de estos métodos, o se puede dejar en ella completamente.

Si los polipéptidos no se secretan en el medio de cultivo, las células también pueden ser lisadas y el producto se puede obtener a partir del lisado mediante métodos conocidos para el aislamiento de proteínas. Las células opcionalmente pueden ser lisadas por ultrasonido de alta frecuencia, por la alta presión, tal como en una celda de presión francesa, por osmólisis, por la acción de detergentes, enzimas liticas o disolventes orgánicos, por medio de homogeneizadores o por la combinación de varios de los métodos enumerados.

Los polipéptidos se pueden purificar por técnicas cromatográficas conocidas, tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel) , tales como la cromatografía de Q-sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, y con otros métodos habituales, tales como ultrafiltración, cristalización, salinizacion, diálisis y electroforesis en gel nativo. Los métodos adecuados se describen por ejemplo en Cooper, T. G., Biochemical Procedures, Verlag Walter de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes, R. , Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlín.

Para aislar la proteína recombinante, puede ser ventajoso utilizar sistemas de vectores u oligonucleótidos , que extienden el cDNA por secuencias de nucleótidos definidas y por lo tanto código para polipéptidos alterados o proteínas de fusión, que sirven por ejemplo para la purificación más simple. Las modificaciones adecuadas de esta clase son por ejemplo las llamadas "etiquetas" que funcionan como anclas, por ejemplo, la modificación conocida como anclas de hexa-histidina o epítopes, que pueden ser reconocidas como antígenos por anticuerpos (descrito por ejemplo en Harlow, E. y Lañe, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor (NY) Press) . Estas anclas pueden servir para la fijación de las proteínas a un portador sólido, por ejemplo, una matriz de polímero, que puede por ejemplo ser llenado en una columna de cromatografía, o puede ser utilizado en una placa de microtitulación o en algún otro soporte.

Al mismo tiempo, estas anclas también se pueden utilizar para el reconocimiento de las proteínas. Para el reconocimiento de las proteínas, es además posible utilizar marcadores usuales, tales como colorantes fluorescentes, marcadores enzimáticos, que después de la reacción con un sustrato forman un producto de reacción detectable, o marcadores radioactivos, o solo en combinación con las anclas para derivatlzation del proteínas. 5. Inmovilización de enzimas Las enzimas de acuerdo con la invención se pueden usar libres o inmovilizadas en el proceso descrito en el presente documento. Una enzima inmovilizada se debe entender como una enzima que se fija a un soporte inerte. Los materiales portadores adecuados y las enzimas inmovilizadas sobre el mismo se conocen por el documento EP-A-1149849, EP-A-l 069 183 y DE-OS 100 193 773 y en las referencias bibliográficas citadas en el mismo. Se hace referencia a la divulgación relevante de estos documentos en su totalidad.

Los materiales portadores adecuados incluyen, por ejemplo, arcillas, minerales de arcilla, tales como caolinita, tierra diatomácea, perlita, dióxido de silicio, óxido de aluminio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, polvo de celulosa, materiales intercambiadores de aniones, polímeros sintéticos, tales como de poliestireno, resinas acrílicas, resinas de fenol-fformaldehído, poliuretanos y poliolefinas, tales como polietileno y polipropileno. Para la producción de las enzimas compatibles, los materiales de soporte que son por lo general empleados finamente se dividen en forma de partículas, se prefieren las formas porosas. El tamaño de las partículas del material de soporte por lo general no es mayor de 5 mm, en particular, no mayor de 2 mm (curva de distribución tamaño de partícula) . Del mismo modo, cuando se utiliza deshidrogenasa como catalizador de célula entera, se puede seleccionar una forma libre o inmovilizada. Los materiales de soporte son, por ejemplo Ca-alginato, y carragenina. Las enzimas así como células también se pueden entrelazar directamente con glutaraldehído (entrelazamiento a CLEAs) correspondiente y otras técnicas de inmovilización se describe por ejemplo en J Lalonde and A. Margolin "Immobilization of enzymes" in K. Drauz and H. aldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol . III. 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim. Más información sobre biotransformacioness y biorreactores para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención también se dan por ejemplo en Rehm et al. (Ed) Biotechnology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17. VCH, Weinheim. 6. Producción biocatalitica de nitritos El proceso biocatalitico según la invención para la producción de nitritos de oximas correspondientes se lleva a cabo en presencia de un deshidratasa aldoxima, en particular, una deshidratasa aldoxima alifática '4.99.1.5), una deshidratasa fenilacetaldoxima (PAOx) (EC 4.99.1.7) o una deshidratasa indolacetaldoxima (4.99.1.6). Los ejemplos de dichas enzimas comprenden al menos una secuencia de aminoácidos según la SEC ID NO: 1 o 4 a 28, o una secuencia de aminoácidos idéntica a ésta para al menos 60%, por ejemplo, al menos 65, 70, 75, 80 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% o en donde hasta 25%, por ejemplo hasta 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% de los residuos de aminoácidos son alteradas en relación a una de las secuencias de acuerdo con SEC ID NO: 1 o 4 a 28 por adición, eliminación, inserción, sustitución, inversión o una combinación de los mismos y que todavía tiene al menos 50%, por ejemplo 60, al menos 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de la actividad enzimática de la SEC ID NO: 1.

En particular, el proceso de acuerdo con la invención se lleva a cabo en presencia de una enzima, en donde la enzima tiene la secuencia de proteína de acuerdo con SEC ID NO: 1. En particular, la enzima es codificada por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEC ID NO: 2 o un equivalente funcional de la misma, en particular, un equivalente funcional de acuerdo con SEC ID NO: 3, que representa una secuencia de ácido nucleico de codones optimizados para la expresión en el microorganismo E. coli. Por otra parte, la secuencia de ácido nucleico es, en particular, un componente de una construcción génica o vector. Estas construcciones génicas o vectores se describen en detalle en la solicitud internacional PCT/EP2010/057696 en las páginas 16 a 20, que se mencionan expresamente en el presente documento.

La célula huésped, que contiene una construcción génica o un vector, que contiene la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima con la actividad deseada, también se designa como organismo transgénico. La producción de organismos transgénicos es conocida en principio y se describe por ejemplo en la solicitud internacional PCT/EP2010/057696 en la página 20, a la que se refiere expresamente en el presente documento.

Las células seleccionadas del grupo que consiste de bacterias, cianobacterias, hongos y levaduras se prefieren como organismos transgénicos. Preferiblemente la célula se selecciona a partir de hongos del género Pichia o bacterias del género Escherrchia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridtum, Pseudomonas, Bacillus, Zyrnornonas , Rhodobacter, Streptomyces, Burkholderia, Lactobacillus o Lactococcus.

Especialmente de manera preferida se selecciona la célula a partir de bacterias de la especie Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholceria glumae, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor o Zymomonas mobilis.

Se prefiere un proceso acuerdo con la invención que se caracteriza en que la enzima con la actividad de una deshidratasa aldoxima, en particular de una deshidratasa aldoxima alifática (EC 4.99.1.5), una deshidratasa fenilacetaldoxima (también designada como PAOx en el presente documento) (EC 4.99.1.7) o una indolacetaldoxima deshidratasa (EC 4.99.1.6), está codificada por un gen que fue aislado de un microorganismo seleccionado de Zymomonas mobilis, Methylococcus capsulatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec, Streptomyces coelicolor, Acetobacter pasteurianus y Absidia sp., tales como A. corymbifera; Agrobacterium sp., como A. radiobacter ; Alcaligenes sp., tal como A. faecalis; Arthrobacter sp., tal como A. crystallopoietes o A. ramosus; Aspergillus sp., tal como A. amstelodami, A. celluosae; A. candidus o A. pulverulentus ; Auerobacterium sp., tal como A. testaceum; Aureobasidium sp., tal como A. pululans; Bacillus sp., tal como B. coagulans, B. megaterium, B. sp. OxB-1 o B. subtilis; Botryotinia sp., tal como Botryotinia luckeliana; Brevibacterium sp., tal como B. butanicum; Cellulomnas sp., tal como C. fimi; Coprinus sp. , tal como C. phlyctidosporus ; Corynebacterium sp., tal como C. paurometabulum o C. rathavi; Cunninghamella sp., tal como C. echinulata var. Elegans; Flammulina sp., tal como F. sp. cepa TPU 47675 o F. velutipes; Flavobacterium sp., tal como F. aquetile, F. lutescens, F. rigense o F. suaveolens; Fusarium sp., tal como F. culmurum, F. oxysporum f. sp. Nicotianae o F. solani var. Martii; Gibberella sp., tal como Gibberella fujikuori o Gibberella zeae; Keratinomyces sp., tal como K. ajelloi; Klebsiella sp., tal como K. pneumoniae; Leptosphaeria sp., tal como Leptosphaeria maculans; icrococcus sp., tal como M. luteus o M. ureae; Mortierella sp., tal como M. isabellna; M. ramanniana var. Angulispora o M. sp. TPU 4801; Mucor sp., tal como M. fragilis; Neosartorya sp. Tal como N. lisheri; Nocardia sp., tal como N. asteroides; Phycomyces sp., tal como P. nitens; proteus sp., tal como P. vulgaris; pseudomonas sp., tal como Pseudomonas chloraphis o P. fluorescens; Pychoporos sp., tal como P. coccineus; Rhizoctonia sp., tal como Rhizoctonia solani; Rhizopus, tal como R. nigricans o R. oryzae; Rhodococcus sp., tal como R. erythropolis o R. rhodochrous; Schizophyllum sp., tal como S. commune o S. sp . cepa TPU 4435; Solerotinia sp., tal como Sclerotinia sclerotiorum; Talaromyces sp., tal como T. flavus; Serratia sp., tal como S. marcescens; Stenotrophomonas sp., tal como S. maltophilia; Xanthomonas sp., tal como X. flavus. Los genes relevantes, en particular el gen para PAOx, aislado de Rhodococcus sp., Gibberella zeae o en particular Bacillus sp., son especialmente preferidos.

Ejemplos de acetaldoxima deshidratasas alifáticas que son adecuadas para su uso en el contexto de un proceso de acuerdo con la invención o cuyas secuencias son adecuados como punto de partida para la producción de equivalentes funcionales se muestran en la Tabla 1 a continuación. Los números de acceso se refieren a bases de datos especializadas REFSEQ y UNIPROT, en donde una persona experta en la materia puede acceder fácilmente las entradas de secuencias identificadas por números de acceso a través de servicios basados en Internet, asi como otras bases de datos como GenBank o SwissProt.

Tabla 1: Ejemplos de fenilacetaldoxima deshidratasas que son adecuados para su uso en el contexto de un proceso de acuerdo con la invención o cuyas secuencias son adecuadas como punto de partida para la producción de equivalentes funcionales se muestran en la Tabla 2 a continuación: Tabla 2: Un ejemplo de una indolacetaldoxima deshidratasa que es adecuad apara usarse en el contexto de un proceso de acuerdo con la invención o cuya secuencia es adecuada como el punto de partida para la producción de equivalentes funcionales como se muestra en la siguiente Tabla 3: De acuerdo con otra modalidad, la enzima tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de una de las deshidratasas de aldoxima dadas en las Tablas 1 a 3 como secuencia de partida y tiene compartido a la secuencia de partida, una secuencia de aminoácidos que es idéntica a por lo menos el 60%, por ejemplo por lo menos el 75%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99%. Una modalidad especialmente preferida del proceso prevé, como enzima, un PAOx de acuerdo con SEC ID NO: 1 (kato, Y. y otros, Biochemistry (2000), 39, 800-809 y Xie, S-X, y otros, Bosci. Biotechnol. Biochem. (2001), 65 (12), 2666-2672), o un PAOx con una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID NO. 1 a por lo menos el 60%, por ejemplo, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, o por lo menos 99%.

En una modalidad del proceso de acuerdo con la invención, se hace reaccionar una oxima de la fórmula II, en la cual el residuo R junto con el átomo de carbono al cual está unido se deriva de un residuo de terpeno no cíclico, seleccionado de residuos de hemiterpeno (C5) , monoterpeno (CIO), sesquiterpeno (C15), diterpeno (C20), sesterterpeno (C25) , triterpeno (C30) , o tetraterpeno (C40) (en particular por hidrogenación parcial o completa) , o se deriva de residuos de terpeno correspondientes que se acortan por 11 a 3 átomos de carbono.

En otra modalidad preferida del proceso, una oxima de la fórmula II se hace reaccionar, en la cual n significa 1 y el residuo R significa un residuo de hidrocarburo alifático lineal o de una sola múltiples ramificaciones, saturado o con insaturado una vez o múltiples veces, opcionalmente sustituido una vez o múltiples veces con 4 a 19 átomos de carbono.

En modalidades especiales de un proceso de acuerdo con la invención, tenemos una oxima de la fórmula general II, es decir, una aldoxima, en donde n significa 1 y la oxima se selecciona de compuestos mostrados en la siguiente Tabla 4, que difieren por diferentes residuos R ligados al grupo oxima .

Tabla 4 El residuo R puede además seleccionarse de análogos de compuestos 1-6, 9 y 10 en la Tabla 4, en donde el residuo R se hidrogena. En las modalidades especiales, la oxima se selecciona del compuesto 1 (citraloxima) , compuesto 2 (neraloxima) , compuesto 3 (geranial oxima) y compuesto 10 (citronelaloxima) y parcial o completamente análogos hidrogenados de los mismos. Un ejemplo de un compuesto con residuo R hidrogenado es el compuesto 10 (citronelal oxima) en forma hidrogenada (es decir, 6, 7-dihidrocitronelil oxima, que se hace reaccionar en el contexto del proceso de acuerdo con la invención a 6, 7-dihidrocitronelil nitrilo).

En el proceso de acuerdo con la invención, dos o más oximas de la fórmula II en cada caso con diferentes residuos R y/o diferentes índices n pueden estar presentes simultáneamente, de manera que se forma una mezcla de producto de nitrilos correspondientes de la formula I. Sin embargo, preferiblemente, exactamente se forma una oxima de una fórmula II correspondiente.

Consecuentemente a una modalidad especial del proceso de acuerdo con la invención, citronelaloxima de la fórmula lía Se hace reaccionar con citronelil nitrilo de la fórmula la usando el compuesto de fórmula lia, en forma estereoisomérica pura o como mezcla de estereoisómeros, como en particular la mezcla R/SE/Z.

Una reacción de acuerdo con la invención en la presencia de un oxima deshidratasas, en particular una deshidratasa aldoxima alifática (EC 4.99.1.5), una deshidratase fenilacetaldoxima (PAOx) (EC 4.99.1.7) o un indoleacetaldoxima deshidratasa (EC 4.99.1.6) pueden, en particular, tener lugar los siguientes: a) Reacción en presencia de la aldoxima deshidratasa b) Reacción en presencia de una mezcla de proteínas que contiene la aldoxima deshidratasa c) Reacción en presencia de un microorganismo recombinante funcionalmente expresar la aldoxima deshidratasa, un homogenado de células que contienen aldoxima deshidratasa derivados de los mismos o una fracción que contiene aldoxima deshidratasa de los mismos.

Preferiblemente, la aldoxima deshidratasa es PAOx, opcionalmente junto con otras aldoxima deshidratasas. Una expresión en microorganismos recombinantes, sorprendentemente se logran altos rendimientos, por ejemplo, rendimientos de más del 70% y hasta rendimientos esencialmente cuantitativos, en relación con el sustrato usado. Las reacciones, entre otras cosas, pueden, tomar lugar aún a bajas temperaturas, por ejemplo, a 15°C-60°C, preferiblemente de 25°C a 45°C, por ejemplo, a temperaturas de aproximadamente 30 °C.

La reacción en la presencia de aldoxima deshidratasa por ejemplo se puede referir a: i. polipéptido opcionalmente purificado o parcialmente purificado, libre ii. polipéptido inmovilizado, y/o iii. polipéptido aislado de células.

En una reacción de acuerdo con la opción c) mencionada antes en presencia de microorganismos que expresan funcionalidad una aldoxima deshidratasa, son células completas, que pueden estar en cualquier fase de cultivos celulares, por ejemplo, inactivos o en crecimiento, y contienen por lo menos un polipéptido de aldoxima deshidratasa.

En las modalidades preferidas, la aldoxima deshidratasa es un PAOx, o una mezcla de aldoxima deshidrataza comprende, además de otras aldoxima deshidratasas, un PAOx.

En el contexto de un proceso de acuerdo con la invención, la enzima con actividad de aldoxima deshidratasa puede ser generada en particular por un microorganismo que produce en exceso la enzima. El microorganismo puede en particular ser seleccionado entre el grupo que consta de microorganismos de los géneros Leptosphaeria, tales como Leptosphaeria maculans; Rhizoctonia, tales como Rhizoctonia solani; Sclerotinia, como por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum; Botryotinia, tales como Botryotinia fuckeliana: Pseudomonas, tales como Pseudomonas chloraphis; Rhodococcus; Gibberella, tales como Gibberella fujikuroi o Gibberella zeae; Escherichia, Pichia, Aspergillus, Trichoderma o Bacillus, tales como Escherichia coli o Pichia pastoris; y Saccharomyces, tales como Saccharomyces cerevisiae. La Tabla 6 contiene una lista con los microorganismos más adecuados, en donde los géneros subyacentes de las especies establecidas se representan por ejemplos adecuados. Alternativamente, una deshidratasa aldoxima también puede ser aislada a partir de plantas de sobreexpresión de microorganismos y se puede utilizar en el sentido de opciones i) o ii) dada anteriormente en el contexto de un proceso de acuerdo con la invención. Por ejemplo Musa (en particular, M. acuminata plátano) y Arabidopsis (en particular A. thaliana) pueden entrar en consideración como plantas de sobreexpresión. Los microorganismos o plantas de sobreexpresión se pueden determinar por una persona experta en la técnica de una manera conocida en la técnica anterior por la detección de la sobreexpresión representantes. Alternativamente, la sobreexpresión puede ser inducida por la intensificación de ingeniería genética de la expresión de un gen de origen natural en los microorganismos o plantas, que expresan una aldoxima deshidratasa, por ejemplo mediante la inserción de más fuerte de promover para aumentar la transcripción.

De acuerdo con una modalidad especial, una reacción de una oxima de fórmula II se lleva a cabo en presencia de un microorganismo, en donde el microorganismo es una cepa bacterial, que expresa funcionalmente aldoxima deshidratasa, preferentemente PAOx. La cepa bacteriana puede, por ejemplo ser seleccionada a partir de Escherichia coli. Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis o Zymomonas mobilis. De acuerdo con modalidades especiales, la cepa bacteriana es una cepa de E. coli. El microorganismo es en particular un microorganismo recombinante, en donde un gen heterólogo de una oxima deshidratasa, en particular, un gen para PAOx, se ha insertado En una modalidad especial adicional del microorganismo lleva una construcción de expresión que tiene una secuencia de codificación de ácido nucleico para aldoxima deshidratasa. La secuencia de ácido nucleico puede ser parcial o totalmente adaptada al uso del codón del microorganismo. La adaptación es completa cuando todos los codones de todos los aminoácidos son alterados de modo que la traducción óptima tiene lugar en el microorganismo previsto, a menos que un codón óptimo ya estaba presente. La adaptación se supone que es parcial si sólo se han optimizado los codones de aminoácidos seleccionados, no los de todos los aminoácidos, o si no todos los codones de en cada caso un aminoácido que ocurre dentro de la secuencia de ácido nucleico son optimizados.

Según otra modalidad preferida del el proceso según la invención, el microorganismo expresa en por lo menos un anexo que soporta la expresión funcional de aldoxima deshidratase, que puede ser en particular PAOx. La expresión funcional puede, en particular, soportar el anexo del correcto plegamiento de la oxima deshidratasa expresada, en particular durante o después de la traslación. A través de la expresión de anexos, ventajosamente la proporción de la proporción de aldoxima deshidratasa funcional en el microorganismo se puede aumentar y puede ser aumentada la conversión de oxima a nitrilo.

En el contexto del proceso de acuerdo con la invención, puede, en particular, prever que el microorganismo expresa uno o más anexos, que se seleccionan a partir de GroEL y GroES. Una persona experta en la técnica conoce otros anexos, que se dividen en cinco grandes familias, a saber, la familia HsplOO/Clp, la familia Hsp90, la familia Hsp70 (por ejemplo DnaK, DNAJ, Hsc62, Hsc56, y GrpE como representantes en E. coli), la familia Hsp60/GroEL (con el GroEL ya mencionado) y la familia de proteínas pequeñas de choque térmico (HSP20) . Los anexos también se pueden seleccionar a partir de estas familias de proteínas. Las combinaciones también pueden denominarse, por ejemplo a partir del complejo Dank/DnaJ/GrpE, el complejo GroEL/ES y factor desencadenante, tal como se describe por ejemplo en O'Donnell y Lis, MIT 7.88 Research Paper, 2006. El anexo o los anexos se pueden expresar endógenamente en el microorganismo utilizado, o expresarse parcial o completamente por secuencias de ácidos nucleicos introducidos adicionalmente en el microorganismo. Estas secuencias de ácido nucleico pueden introducirse en el genoma del microorganismo, por ejemplo en un cromosoma bacteriano, o pueden estar presentes en construcciones expresadas extracromosómicamente . Si una aldoxima deshidratasa se expresa por una construcción de expresión extracromosómica, por ejemplo, porque un gen de oxima deshidratasa heteróloga será expresada en un microorganismos o debido a la expresión de un gen cromosomal serán suplementados por la expresión adicional de un gen de aldoxima deshidratasa extracromosomal, el gen de aldoxima deshidratas a y el gen anexo pueden estar presentes en una construcción de expresión común o una construcción de expresión separada.

Una modalidad preferida del proceso de acuerdo con la invención comprende por lo menos los siguientes pasos a) , b) y d) : a) aislar un microorganismo que produce una enzima con aldoxima deshidratasa de una fuente natural o la produce por técnicas recombinantes , b) multiplicar el microorganismo, c) aislar opcionalmente la enzima con actividad de aldoxima deshidratasa del microorganismo o preparar una fracción de proteina que contiene esta enzima, y d) transferir el microorganismo de acuerdo con el paso b) o la enzima de acuerdo con el paso c) a un medio que contiene una oxima de la fórmula general (II).

En el proceso de acuerdo con la invención, sustrato, v.gr., oxima citronelal, se pone en contacto con la enzima que tiene la actividad de una aldoxima deshidratasa en un medio y/o se incuba de tal manera que la reacción del sustrato toma lugar, v.gr., de citronelal oxima a citronelal nitrilo, en presencia de la enzima. Preferiblemente el medio es un medio de reacción acuoso.

El pH del medio de reacción acuoso en el cual el proceso de acuerdo con la invención preferiblemente se lleva a cabo es ventajosamente mantenido entre pH 4 y 12, preferiblemente entre pH 4.5 y 9, especialmente de preferencia pH 5 y 8.

El medio de reacción acuoso preferiblemente son soluciones reguladas, que tiene una regla tiene un pH, preferiblemente de 5 a 8. La solución reguladora usada puede ser citrato, fosfato, solución reguladora de TRIS ácido (tris (hidroxiraetil) -aminometano) o MES (2-(N-morfolino) etansulfónico) . Además, el medio de reacción puede contener además aditivos, v.gr., detergentes (por ejemplo, taurodesoxicolato) , FMN, iones, tales como iones metálicos (v.gr., Fe2+ y Sn2+) o aniones tales como SO32 y azida de sodio. Las composiciones detalladas de las mezclas de reacción adecuadas también se dan en las siguientes fuentes de literatura: Kato, Y. et al, Biochemistry {2000), 39, 800-809 y Xie, S.-X. et al., Biosci. Blotechnol. Biochem. (2001), 65(12), 2666-2672.

El sustrato, por ejemplo citronelal oxima, preferiblemente se usa en una concentración de 2-200 mM, especialmente de preferencia 5-25 mM en la reacción enzimática y puede suplementarse continuamente o discontinuamente. Sin embargo, la reacción también puede llevarse a cabo con aldoxima pura (por ejemplo, citronelal oxima) en presencia de la expresión de enzima, tal como PAOx que expresa organismo huésped (v.gr., E. coli) como se describió en el Ejemplo 2.

La reacción enzimática de oxima a nitrilo toma lugar como una regla a una temperatura de reacción por debajo de la temperatura de desactivación de la enzima usada y por arriba de -10 °C. preferiblemente, el proceso de acuerdo con la invención se lleva a cabo a una temperatura entre 0°C y 95°C, especialmente de preferencia a una temperatura entre 15°C y 60°C, en particular entre 20°C y 40°C, v.gr., de aproximadamente 25 °C a 30 °C.

Un proceso de acuerdo con la invención en el cual la reacción de oxima a nitrilo toma lugar a una temperatura en el rango de 20 a 40°C y/o un pH en el rango de 4 a 10, preferiblemente a pH 8, se prefiere especialmente.

Además de estos sistemas acuosos de una sola fase, en otra variante de la invención también se usan sistemas de dos fases. Además de una fase acuosa, los medios de reacción no miscibles en agua se usan como segunda fase. Como resultado, los productos de reacción se acumulan en la fase orgánica. Después de la reacción, el producto, v.gr., citral nitrilo, neral nitrilo, geranaial nitrilo o citronelal nitrilo, en la fase orgánica, puede separarse fácilmente de la fase acuosa que contiene el biocatalizador .

Un proceso de acuerdo con la invención, caracterizado porque la producción de nitrilos, en particular se prefiere citralnitirli, neral nitrilo, geranial nitrilo o citronelal nitrilo, que toma lugar en sistemas acuosos de una sola fase o en sistemas de dos fases.

El producto de reacción, v.gr., cital nitrilo, neral nitrilo, geranial nitrilo o citronelal nitrilo, puede extraerse con solventes orgánicos y pueden opcionalmente ser destilados para purificación.

Los solventes orgánicos adecuados son, por ejemplo, hidrocarburos alifáticos, preferiblemente con 5 a 8 átomos de carbono, tales como pentano, ciclopentan, hexano, ciclohexano, heptano, octano o ciclooctano, hidrocarburos alifáticos halogenados, preferiblemente con uno o dos átomos de carbono, tales como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano o tetracloroetano, hidrocarburos aromáticos, tales como benceno, tolueno, los xilenos, clorobenceno o diclorobenceno, éteres o alcoholes acriclicos y cíclicos alifáticos, preferiblemente con 4 a 8 átomos de carbono, tales como etanol, isopropanol, éter dietílico, éter metil terbutílico, éter etil terbutílico, éter dipropílico, éter diisopropílico, éter dibutílico, tetrahidrofurano o ésteres ales como acetato de etilo o acetato de n-butilo o cetonas tales como metil isobutilcetona o dioxano o mezclas de los mismos. Especialmente de preferencia, se usan el heptano mencionado antes, éter metil ter-butílico, éter diisopropilo, tetrahidrofurano, acetato de etilo .

Las aldoxima deshidratasas usadas de acuerdo con la invención se pueden usar en el proceso de acuerdo con la invención como enzima libre o inmovilizada, como se describió antes .

Para el proceso de acuerdo con la invención, en reposo o en crecimiento, se pueden usar las células libres o inmovilizadas que contienen ácidos nucleicos, construcciones de ácidos nucleicos o vectores que codifican la aldoxima deshidratasa . Las células Usadas, tales como lisatos de células u homogenados de células, también se pueden usar. Las células Usadas son por ejemplo, células que se han hecho permeables por un tratamiento, por ejemplo, con solventes, o células que se han alterado por un tratamiento de enzimas, por un tratamiento mecánico (v.gr., prensa francesa o ultrasonido) o por algún otro proceso. Los extractos crudos resultantes son ventajosamente adecuados para el proceso de acuerdo con la invención. Las enzimas purificadas o parcialmente purificadas también se pueden usar para el proceso.

Si los organismos libres o enzimas se usan para el proceso de acuerdo con la invención, estos se separan preferiblemente antes de la extracción, por ejemplo, por filtración o centrifugación.

El proceso de acuerdo con la invención se pueden operar por lotes, semi lotes o continuamente.

Sección experimental Si no se provee información especial en los siguientes ejemplos, se aplica la siguiente información general .

A. Información general Todos los materiales y microorganismos usados son productos que están comercialmente disponibles o se pueden obtener de las recolecciones de cultivos de materia prima.

A menos que se establezca de otra manera, la clonación y expresión de proteínas recombinantes se lleva a cabo por métodos normales, como se describe por ejemplo en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. a) Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones crecimiento Todos los experimentos se llevaron a cabo con coli. La E. coli TG10, derivada sin ramnosa isomerasa, se u para la expresión de PAOx. b) Cromatografía de gases Instrumento de medición: Agilent 6890 N Columna: Optima 5 Accent, longitud = 30 m, I.D. = 0.25 mm, O.D. = 0.4 mm, grosor de película 0.25 µt? De Macherey & Nagel # 725820.30 Flujo: 1.0 ml/min a 0.949 kg/cm2 (a temperatura de horno de 80°C) División: 1:50, flujo de división: 50 ml/min, purga del septo 3 ml/min (a temperatura de horno de 80°C) Gas portador: helio Inyector: división/sin división con Linea Divisoria siltec desactivada (Restec # 207.13-214.5) Temperatura de inyector: 280°C Volumen de inyección: 1 µ? Detector: FID con 300 ml/min de aire, 30 ml/min hidrógeno y 30 ml/min gas conformador (helio) Temperatura de detector: 320°C Programa de temperatura: Inicio: 60°C Tiempo de residencia 1: 0 min Rampa de temperatura 1: 15°C/min Temperatura final 1: 320 °C Tiempo de residencia 2: 5 min Tiempo de operación total: 22.3 min Evaluación: Software Empower-2 de acuerdo con % de área B. Ejemplos Ejemplo 1: Expresión de PAOx en E. coli En el ejemplo presente, el uso de codón del gen de fenilacetaldoxima deshidratase (PAOx) de Bacillus sp. Cepa OxB-1 se optimizó para expresión en E. coli. La nueva secuencia de DNA se sintetizó y clonó en pDHE, un vector de expresión inducible por ramnosa. Los anexos CroEL/S que se requieren para la producción de PAOx soluble se clonaron en vectores pAgro o pHSG inducibles por IPTG. La expresión de PAOx toma lugar en E. coli TG10, una derivada de TG1 sin ramnosa isomerasa. La células de TG10 que contuvieron pAgro y pHSG (TG10+) se transformaron con pDHE-PAOx y se cultivaron en 2xYT durante 5 h a 37 °C en presencia de ampicilina (pDHE) , espectinomicina (pAgro) y cloranfenicol (pHSG) . 5 mi de este cultivo se transfirió a 500 mi del mismo medio que contuvo 100 µ? de IPTG y 0.5 g/1 de ramnosa. La inducción tuvo lugar a 30 °C durante un periodo de aproximadamente 18 h. Las células se cosecharon por centrifugación y se usaron como catalizadores en la transformación de citronelal oxima a citronelil nitrilo. Opcionalmente las células se almacenaron a -20°C hasta que se usaron.

Ejemplo 2 : Transformación de citronelaloxima a citronelil nitrilo por PAOx La transformación enzimática de citronelal oxima al nitrilo correspondiente se llevó a cabo como sigue: 50 mi de citronelal oxima R/S-E/Z racémico se mezclaron con 12.5 g de E. coli TG10 que fenilacetaldoxima deshidratasa expresada (PAOx). La mezcla de reacción se incubó a 30 |C con agitación.

Las muestras de la mezcla de reacción (0.1 mi) se tomaron después de 18 hr y 90 h y se mezclaron con 0.5 mi de n- heptano. La fase orgánica se analizó por cromatografía de gases (-GC) . El análisis de GC se llevó a cabo en un Agilent 6890 N (columna: Optime 5 Accent, Macherey & Nagel; flujo: 1 ml/min a 0.949 kg/cm2. Temperatura de inyección 280°C, temperatura de detección 320 °C; detector: FID; tiempo de retención de citronelal oxima: 7.816 min y 8.018 min; tiempo de retención de citronelil nitrilo: 6.765). Después de 90 h, la citronelal oxima racémica de R/S-W/Z se ha transformado cuantitativamente al nitrilo correspondiente. La reacción que toma lugar se muestra en la Figura 1. Los cromatogramas de gas correspondientes antes, durante y después de la conversión se muestran en la Figura 1A, Figura IB y Figura 2C. Un transcurso temporal aproximado de la reacción, dando el porcentaje de las áreas pico de los cromatogramas de gases, se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5 Tabla 6: Datos de secuencia: NA: Acido nucleico; AA: aminoácido La siguiente es una lista de secuencias útiles de acuerdo con la Tabla 6, que se puede usar directamente para un proceso de acuerdo con la invención o se puede usar como secuencias de partida, opcionalmente también en la forma de codificación de secuencias de ácido nucleico que sirven para la producción de equivalentes funcionales que pueden usarse en un proceso de acuerdo con la invención. Los números de acceso se refieren a bases de datos de especialistas, v.gr., NCBI (National Center for Biotechnology Information) , GeneBank o SwissProte.

SEC ID NO: 1: Números de Acceso: BAA90461; P82604 (UniProtKB/Swiss-Prot) MKNMPENHNPQANAWTAEFPPEMSYWFAQIGIQSKSLDHAAEHLG MKKSFDLRTGP HVD RALHQGADGYQDSIFLAYWDEPETFKSWVADPEVQK SGKKIDENSPIGY SEVTTIPID HFETLHSGENYDNGVSHFVPIKHTEVHEYWGA RDRMPVSASSDLESPLGLQLPEPIVRE SFGKRLKVTAPDNICLIRTAQNWSKCGSGERETYIGLVEPTLIKANTFLRENASETGCISS KLVYEQTHDGEIVDKSCVIGYYLSMGHLERWTHDHPTH AIYGTFYEMLKRHDFKTELALW HEVSVLQS DIELIYVNCHPSTGFLPFFEVTEIQEPLL SPSVRIQ SEC ID NO: 2; Número de acceso: AB028892 (NCBI) Ttgaaaaatatgccggaaaatcacaatccacaagcgaatgcctggactgccgaatttcctc ctgaaatgagctatgtagtatttgcgcagattgggattcaaagcaagtctttggatcacgc agcggaacatttgggaatgatgaaaaagagtttcgatttgcggacaggccccaaacatgtg gatcgagccttgcatcaaggagccgatggataccaagattccatctttttagcctactggg atgagcctgaaacatttaaatcatgggttgcggatcctgaagtacaaaagtggtggtcggg taaaaaaatcgatgaaaatagtccaatcgggtattggagtgaggtaacgaccattccgatt gatcactttgagactcttcattccggagaaaattacgataatggggtttcacactttgtac cgatcaagcatacagaagtccatgaatattggggagcaatgcgcgaccgcatgccggtgtc tgccagtagtgatttggaaagcccccttggccttcaattaccggaacccattgtccgggag tctttcggaaaacggctaaaagtcacggcgccggataatatttgcttgattcgaaccgctc aaaattggtctaaatgtggtagcggggaaagggaaacgtatataggactagtggaaccgac cctcataaaagcgaatacgtttcttcgtgaaaatgctagtgaaacaggctgtattagttca aaattagtctatgaacagacccatgacggcgaaatagtagataaatcatgtgtcatcggat attatctctccatggggcatcttgaacgctggacgcatgatcatccaacacataaagcgat ctacggaaccttttatgagatgttgaaaaggcatgattttaagaccgaacttgctttatgg cacgaggtttcggtgcttcaatccaaagatatcgagcttatctatgtcaactgccatccga gtactggatttcttccattctttgaagtgacagaaattcaagagcctttactgaaaagccc tagcgtcaggatccagtga SEC ID NO: 3; atgaaaaacatgccagaaaaccacaacccgcaggctaacgcctggactgcagaattcccgc cagagatgtcttacgttgtcttcgcgcagattggcatccagtctaaaagcctggatcatgc agccgaacatctgggcatgatgaaaaaatctttcgacctccgtactggtccaaaacacgtt gatcgcgcactgcaccagggtgctgatggctatcaggactctatcttcctggcctactggg acgaaccagaaaccttcaaaagctgggttgcagacccagaagtgcagaaatggtggagcgg taaaaaaatcgatgaaaacagcccgatcggctattggtctgaggttaccactatcccgatt gaccacttcgagaccctgcactctggtgagaactatgacaacggcgtttcccacttcgtgc cgatcaaacataccgaagtgcacgaatactggggtgctatgcgtgatcgtatgccggtgtc tgcttcttccgatctggaaagcccgctgggtctccagctgccagaaccgatcgtacgtga gagctttggtaaacgcctgaaagttaccgctccagacaacatctgcctgattcgtaccgca cagaactggtccaaatgtggttctggtgaacgcgaaacctacattggcctggtcgaaccga ctctgatcaaagcgaacaccttcctgcgtgaaaacgcgtctgagaccggttgcattagctc taaactggtttacgagcagacccatgatggcgaaatcgtagataaatcctgtgtaatcggc tactatctgtccatgggtcatctggaacgctggactcacgaccacccaactcacaaagcga tttacggcacgttctacgaaatgctgaaacgtcacgactttaaaacggaactggcgctgtg gcacgaagtaagcgttctgcagtctaaagacatcgagctgatctatgtcaactgccaccca tccacgggttttctgccgttctttgaagtgaccgaaatccaggaaccactgctgaaatccc catccgtgcgtattcagtga SEC ID NO: 4, Números de acceso: NCBI : YP 947647.1, GenBank: ABM07831.1 MAPOPSRQOPAIESSIPRHFTVKRTRPKRAGAGYAPPYPSYSVRFAEGVSNLVCAFLGVQS RAPLSHEAKVASAGMWELCANEOGPMSREHAVHTOEQGFONQVIIAYWOOVOAYGR F KH ROALIGAGLEPSOYGR IEAVTPEARGFETLYSSNTFPEGAARMATGGFTGEIQEHGYWGS MRORLPIAQTOALEPVGOPWPRNPGIVRVEPHONLAVIRSGQOWSLCOOAERASYFSHVEP QLKAGMOFLTTEGASIGCYANRYMTSSOGNGNVLEQSFGLSFWHSLEOMERWAESHPTHVA IFRSAMTFLQANAGARLRLSHEVA SROQQYYEYNNCHAGTGMLGARRPLGTATPGTRI SEC 10 NO: 5; Números de acceso: NCBI: YP _046290.1; GenBank: CAG68468.1 MESAIOKHLKCPRTLSRRIHOEYEPPFAM VARAOESLQQVV AYFGVQFKSEQKAIALKA MQHIVQSFSLONGPQNHOITHHTONQGYENYIVVGY ROPGAYCR FRSTEVSHWWOSO20 ERLNOGIGYFREIVIPRAOQFETLYAFKEOLPGVGAVMOOISOOIQEHGY GSARERFPIS QTORMLANGELHIISGOPEKGGRVLVQGHONITLIRSGQOWVNAOEKERELYFNEMLPSLQ AGMOFLROEGQALGCYSNRFVRNVOIOGNLLOIAYOIGYWRSLOKLERWAESHPTHLRI T TFFKWTGLQNLRLYHEVSVSOAKNQVFEYINCHPQTGM ROAQMT SEC ID NO: 6; Números de acceso: FOQ095_ACIAP (UniProtKB/TrE BL) MESAIPPRLQCPRSLSRRVAOOYQPPFPM VARPQAOLQQVV AYFGIQYQGEAQKPRALA VLREWVAAFGAPOGPLRHOLTHHIOAQGYONLIAVGY ROPEAHRRWMQAPAQAGW NAPE RLQEGLGYFREVSAPRAEQFETLYAFQOALPGVGGV ESTSGOIQEHGYWGSMRORFPASQ VORMQARGTLLIAEGOPAHGGR VRGHONIALIRSGQOWMEAEAEERRLYLEOIEPTLHAG MOFLROQGAAVGCYSNRYVHNIOLOGRRLOQSYNIGHWRSVOLLER AESHPTHLRIFGTF FKVAAGLSKLRLYHEVSVSOAASQHFEYIQCHPATGMMROARLQAPA SEC ID NO: 7, Números de acceso: YP 003097901.1 (NCBI) MSSLPLOORATAHRPEGYOPRGGPGHEVRWSOOVTHLVVARFGVQTOOSAAGVKAIARVLE LAAGESGPALVERVSOOOSEMAVCY POPEAHRAW ASGPVROWWASLPVOGPIGH HETS VTPVEQFETLYSAEFAAGPSRFAGTGPTNLHOYONSTLORMPATAHROLRQERAEEPTTOL PPGESPRGRRVRLAEPSPSGLCWIRTAQEWSIAPOOQLASYROGVEPAYRTAIAHLQONPH OTGCLSARLVGNLOANGARAAGAEAWWWRGIGOLLR AHOHKTHQOILNGF EHVIAKFGP GTRVRLWHEVHVLPEGALTAEYVNCHPGTGLLQT PG SEC ID NO: 8, Números de acceso: YP 001240697 (NCBI) ESAIPPHLITTRCRHRRVOOOYKPPYPSFVARHGAOVSRVVMAYFGVQYRAETPAAASTA OFMVLVSRAOGPSHWOLAHYVOQAGFANOVFVAYWOOVVRFOSWFEPARAAWTGPGAEGGG RFIEVLRPAVERYETLFSSLGRPEGIAVIAEGMSGEVLEHAYWGG RORIPLSQTSEMRSL GKPTLVQOGPRLRVIAQONLC IRSGQOWSOTOAAERRMYLOOVEPVLREGMOFLROQGLS IGCYANRYMRLRGAOGALTEKSYGQSWWQSLSALERWAESHPTHVRI FGAAMKYLSSLGPA ARLRLYHEVTVAAAOEQFFEYRGCHAKTGMLAAAG SEC ID NO: 9, Números de acceso: ZP 02891657 (NCBI) MESAIOKHLVCPRTLSRRVAOOYQPPFPMYVARASEOLSQVVMGYFGVQYRGAOQRSAALA ALRRIVAOFOAPOGPGNHOLTQHTONQGYONLIAVGYWROPOAYAR IASPAVAEW TSOA RLAOGIGYFREIVAPRAEQFETLYAFTAOFPGVGAIMOGVSGEIEEHGYWGSMRORFPISQ TO MHAOGELRIVAGOPARGGRWVLAHONIALIRSGQOWRAAQOOERRLYLOEIEPTLRSG MEFLRONGVOVGCYSNRYVRSIOLOGNLLOESYNIGHWRSLORLERWAESHPTHLRIFVTF FRVVTGLSKLRLYHEVSVFOAKHQVYEYVNCHPNTGM ROAVAR SEC ID NO: 10; Números de acceso: ACB68693 (GenBank), YP_001816246 (NCBI) MESAIOKHLVCPRTLSRRVAOOYQPPFPMYVARAAEOLSQVVMGYFGVQYRGAOKRSVALA ALRRIVAOFOAPOGPGNHOLTQHTONQGYONLIAVGYWROPOAYARWIASPAVAEWWASOA RLAOGIGYFREIVAPRAEQFETLYAFTNOFPGVGSIMOGVSGEIEEHGY GSMRORFPISQ TOWMHAOGELRIVAGOPARGGR VLAHONIALIRSGQO RAAEOOERRLYLOEIEPTLRSG EFLRONGVOVGCYSNRYVRSIOLOGNLLOESYNIGH RSLORLERWAESHPTHLRIFVTF FRWTGLSKLRLYHEVSVFOAKHQVYEYVNCHPTTG MROAAAR SEC ID NO: 11, Números de acceso: YP 001776877 (NCBI) MESAIOKHLICPRTLSRRVAOOYQPPFPMYVARAAEOLSQVV GYFGVQYSGAOKRAAAMA ALRRIVAOFGGQOGPNNFOLTQHTOOEGYENLIAVGYWROPAAYARWIASPALVEW ASOA RLAOGIGYFREIVAPRAEQFETLYAFTSOFPGVGAIMOGVSGEIEEHGYWGSMRORFPISQ TOWMNANGELRIVOGOPARGGRVWLAHONIALIRSGQOWRAAESOERRLYLEEIEPTLRSG MEFLRONGKOVGCYSNRYVRSIOLOGNVLOESYNIGH RSLORLER AESHPTHLRIFVTF FRWTGLSKLRLYHEVSVFOAKHQVYEYVNCHPRTGL ROAVAIAR SEC ID NO: 12, Números de acceso: YP 004119277 (NCBI) MESAIOTHLKCPRTLSRRVHOOYQPPFPMFAGRAOASLTQVVMAYLGVQFREEQRAAAITA MQHIVRSFSLONGPGNHOVTFHTONQGFGNFIVVGYWROPAAYCRWLHQPAITGWWSSOOR LROGLGYFREIIAPRAEQFETLYAFKEALPGVGAVMONLSGEIQEHGY GSVRORIPASQT OWLQPOGELRIISGOPAAGGRVWQGHONITLIRSGQOWMOAOEQERALYFTEMLPPLQAGM OFLROEGQTLGCYSNRFVRNVOIOGNVLOIAYOIGF RSLORLER AESHPTHLRIFTTFF R AGLQKLRLYHEVSVSOARFQTFEYINCHPQTG LROAVR SEC ID NO: 13, Números de acceso: ZP 07774756 (NCBI) MKPTTELQVVAGOPAKGGRVWMGHONLTLIRSGQOWAOAEAOERSLYLOEILPTLQOGMOF LRONGQPLGCYSNRFVRNIOLOGNFLOVSYNIGHWRSVEKLER AESHPTHLRIFVTFFR1 VAAGLKKLRLYHEVSVSOAKSQLFEYINCHPHTGMLROAQAATA SEC ID NO: 14: Números de acceso: ZP 07774757 (NCBI) MESAIOTHLKCPRTLSRRVPOEYQPPFPMWVARAOEQLEQVV AYLGVQYRGEAQREAALQ AMRHIVGSFSLAOGPQTHOLTHHTOSSGFONLIWGYWKOPGAHCR LRSAPVNOWWASQOR LSOGLGYFREISAPRAEQFETLYAFQONLPGVGAVMOATSGEIENTVTGARCATASPSPRQ TG SEC ID NO: 15; 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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. - Un proceso biocatalítico para producir nitrilos en donde a) una oxima, seleccionada de la citral oxima, neral oxima, geranial oxima, citronelal oxima y análogos parcial o completamente hidrogenados de los mismos, en donde el compuesto está en forma estereoisoméricamente pura o como una mezcla de estereoisómeros , se convierte al nitrilo en presencia de una aldoxima deshidratasa (EC 4.99.1.5) o una fenilacetaldoxima deshidratasa (PAOX) (EC 4.99.1.7), en donde el nitrilo está en forma estereoisoméricamente pura o como una mezcla de estereoisómeros, y b) opcionalmente el producto de reacción se purifica entones además.

2. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde PAOx es una enzima de Thodococcus sp., Gibberella zeae o en particular Baillus sp.

3. - El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el PAOx tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC ID NO: l o una secuencia de aminoácidos idéntica a ésta en por lo menos el 60%.

4. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la citronelal oxima de la fórmula lia convierte a citronelil nitrilo de la fórmul en donde el compuesto de la fórmula lia se usa en forma estereoisoméricamente pura o como una mezcla estereoisomérica .

5. - El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la reacción toma lugar enzimáticamente , en presencia de PAOx, una mezcla de proteínas que contiene PAOx, o en presencia del microorganismo que expresa funcionalmente PAOx, un homogenado celular que contiene PAOx derivado del mismo o una fracción que contiene PAOx del mismo.

6. - El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde PAOx o el microorganismo que expresa funcionalmente PAOx está presente en la mezcla de reacción en forma libre o inmovilizada.

7. - El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en donde el microrganismo recombinante es una cepa bacteriana que expresa funcionalmente PAOx.

8. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el microorganismo recombinante porta una construcción de expresión, que tiene la secuencia de ácido nucleico que codifica PAOx, opcionalmente adaptada al uso del codón del microorganismo

9. - El proceso de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el microorganismo expresa adicionalmente por lo menos un anexo que soporta la expresión funcional de PAOx.

10. - El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el microorganismo recombinante es una cepa bacteriana, que además de PAOx expresa uno o más anexos seleccionados de GroEL y GroES.

11. - El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la reacción se lleva a cabo en sustrato como medio de reacción. RESUMEN La presente invención se refiere a métodos de un nuevo tipo para producir biocatalíticamente nitrilos a partir de oximas usando oxima deshidratasas y a mutaciones de un nuevo tipo que tiene actividad de oxima deshidratasa y uso de los mismos en un método para producir biocatalíticamente nitrilos, tales como en particular para producir citral nitirlo, neral nitrilo, geranial nitrilo, o citronelilnitirlo a partir de ciral oxima, neral oxima, geranial oxima, o citronelal oxima, y a oxima deshidratasas que pueden usarse para los mismos, secuencias de nucleótidos para lo mismo y construcciones de expresión de microorganismos que comprenden secuencias de nucleótidos.