CN110325646A - 制备(3e,7e)-高法尼酸或(3e,7e)-高法尼酸酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从相应的(E/Z)异构体的混合物中分离不饱和羧酸的3‑(E)‑异构体的改进方法。更具体地，本发明涉及生物催化制备(3E,7E)‑高法尼酸的改进方法；以及用于改进的制备高法尼醇的新型生物催化方法，特别是(3E,7E)‑高法尼醇和具有增加含量的(3E,7E)‑高法尼醇高法尼醇制剂。本发明还涉及通过应用根据本发明获得的(3E,7E)‑高法尼酸或(3E,7E)‑高法尼醇作为起始原料来制备(‑)‑降龙涎香醚的方法。

Description

制备(3E,7E)-高法尼酸或(3E,7E)-高法尼酸酯的方法
本发明提供了从相应的(E/Z)异构体混合物中分离不饱和羧酸的3-(E)-异构体的改进方法。更具体地，本发明涉及生物催化制备(3E,7E)-高法尼酸(homofarnesylic acid)的改进方法；以及用于改进的制备高法尼醇(homofarnesol)的新型生物催化方法，特别是(3E,7E)-高法尼醇和具有增加的(3E,7E)-高法尼醇(也称为“全-E-高法尼醇”)含量的高法尼醇制剂。本发明还涉及通过使用根据本发明获得的(3E,7E)-高法尼酸或(3E,7E)-高法尼醇作为起始原料制备(-)-降龙涎香醚(ambrox)的方法。
发明背景
是对映异构体纯的化合物(-)-降龙涎香醚(3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-四甲基十二氢萘并[2,1-b]呋喃)的商标名，其用作贵重香料。天然存在的(-)-降龙涎香醚是龙涎香的一种成分，它是大白鲸的消化产物。
(-)-降龙涎香醚可通过应用化学和/或酶促反应步骤合成(参见流程1)
流程1
(3E,7E)-高法尼酸或(3E,7E)-高法尼醇的立体化学纯形式是形成基于酶的合成路线的最优选的原料，因为它们允许具有正确的立体化学的(-)-降龙涎香醚的生物合成。
可以获得异构体(3E,7E)-和(3Z,7E)-高法尼酸的混合物。然而，鉴于所述两种异构体之间的高度相似性，很难分离这种异构体混合物。因此，通过诸如蒸馏和色谱法的经典方法进行分离是相当费力的。
因此，本发明的一个目的是提供方法，其允许更简便获得立体异构纯的(3E,7E)-高法尼酸和/或(3E,7E)-高法尼醇，或至少获得(3E,7E)-高法尼酸或(3E,7E)-高法尼醇含量增加的制剂。
发明简述
令人惊讶地，通过提供选择性制备不饱和羧酸的3E-异构体的酶促催化方法可解决上述问题，例如通过应用某些脂肪酶(EC 3.1.1.3)催化，制备高法尼酸的3E,7E异构体。
令人惊讶地，在本发明的第一个具体方面已经发现，通过应用脂肪酶的酶活性，例如来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶，游离高法尼酸的(3E,7E)-异构体在醇存在下比相应的(3Z,7E)-异构体更快速地酯化。根据本发明的第一方面，获得(3E,7E)-高法尼酸酯和游离的3Z,7E-高法尼酸的混合物。鉴于酸和酯之间显著的化学差异，现在可通过萃取或蒸馏进行非常有效和简单的分离。由此分离的(3E,7E)-高法尼酸酯的化学皂化产生所需的游离3E,7E)-高法尼酸。
令人惊讶地，在本发明的第二个具体方面也已经发现，通过应用脂肪酶的酶活性，例如来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶，高法尼酸酯的(3E,7E)-异构体在水的存在下比相应的(3Z,7E)-异构体更快速地皂化。根据本发明的第二方面，获得(3E,7E)-高法尼酸和3Z,7E-高法尼酸酯的混合物。鉴于酸和酯之间显著的化学差异，现在可通过萃取或蒸馏进行非常有效和简单的分离。
以下流程2说明了本发明的所述两个方面：
流程2
发明详述
1.一般定义：
在没有相反的信息时，应适用下列一般定义：
“高法尼酸(homofarnesylic acid)”或“高法尼酸(homofarnesoic acid)”是“(3E,7E)-4,8,12-三甲基十三-3,7,11-三烯酸”或“(3Z,7E)-4,8,12-三甲基十三-3,7,11-三烯酸”或所述E/Z异构体的混合物的同义词。
“香紫苏内酯(Sclareolide)”用作“(3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-四甲基-1,4,5,5a,7,8,9,9b-八氢苯并[e]苯并呋喃-2-酮”的同义词。
左香紫苏内酯显示以下结构式：
“降龙涎香醚(Ambrox)”、“降龙涎香醚(Ambroxan)”和“降龙涎香醚(Ambroxid)”用作同义词。它们包括所有立体异构形式，例如，特别是(+)降龙涎香醚、3a-表-(-)降龙涎香醚、9b-表-(-)降龙涎香醚和特别是(-)降龙涎香醚。
根据本发明，术语“脂肪酶”是指根据IUBMB酶命名法(http:// www.iubmb.unibe.ch；http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)的E.C.3.1.1.3类的酶。
根据本发明方法的一个特定实施方案，脂肪酶是脂肪酶B，来自南极假丝酵母(Candida antarctica)的CALB的基因产物。CALB基因先前已有描述(Uppenberg J.,Hansen,M.T.,Patkar,S.,Jones,A.,Structure 2:293–308(1994))，且其核苷酸或蛋白质序列保存在GenBank的检索号Z30645和CAA83122.1下。除非更精确地指明，否则此处CALB表示具有该检索号的核苷酸序列。三酰基甘油脂肪酶的另一个实例是来自Pseudozymatsukubaensis的脂肪酶B(Suen,W.C.,Zhang,N.,Xiao,L,Madison,V.,Zaks,A.ProteinEng.Des.Sel.17(2):133-40(2004))。
出于本发明的目的，“环化酶”通常是酶或酶突变体，其特别表现出高法尼酸环化酶和/或高法尼醇环化酶的活性。具有高法尼酸环化酶或高法尼醇环化酶活性的酶是来自异构酶的亚类的分子内转移酶；即，具有EC编号EC5.4的蛋白质是合适的。(依据Eur.J.Biochem.1999,264,610-650进行酶编码)。具体而言，这些是EC 5.4.99.17类的成员。具有高法尼酸环化酶或高法尼醇环化酶活性的合适的酶特别是那些也能实现高法尼酸环化为香紫苏内酯和/或角鲨烯环化为禾烯(因此有时也称为“SHC”或角鲨烯-禾烯环化酶)的酶，且其在国际专利申请WO2010139719中进行了广泛的描述，该专利申请通过引用并入本文。其突变体例如WO2012/066059中所描述，其通过引用明确并入本文。
术语“环化酶活性”描述了用“标准条件下的参考底物”测定的酶活性，其描述了由非环状底物向环状产物的形成。标准条件是例如底物浓度为10mM至0.2M，尤其是15至100mM，例如约20至25mM；在pH4至8，温度为例如15至30或20至25℃下。可以用表达重组环化酶的细胞、表达消化的环化酶的细胞、其片段或富集或纯化的环化酶进行测定。具体而言，参考底物是(3E,7E)-高法尼酸。
根据本发明反应的“产率”和/或“转化率”在限定的时期内测定，例如在4、6、8、10、12、16、20、24、36或48小时内，反应在此期间发生。具体而言，反应在精确限定的条件下进行，例如在25、30、40、50或60℃下进行。
“酶催化”或“生物催化”方法指所述方法在酶(包括酶突变体)的催化作用下进行，如本文所定义。因此，该方法可以在以分离的(纯化的、富集的)或粗制形式的所述酶的存在下或在细胞系统(特别是含有活性形式的所述酶的天然或重组微生物细胞)存在下进行，并且具有如本文所公开的催化转化反应的能力。
术语“选择性转化”或“增加选择性”通常指特定的立体异构形式，例如本发明所定义的不饱和羧酸的3E-形式，在所述反应的整个过程中(即在反应引发和终止之间)、在所述反应的某个时间点或在所述反应的“间隔”期间，以比相应的3Z-形式更高的比例或量(基于摩尔进行比较)转化。具体而言，可以在“间隔”期间观察到相应的1-99％、2-95％、3-90％、5-85％、10-80％、15-75％、20-70％、25-65％，30-60％或40-50％的底物初始量的转化的所述选择性。所述的更高比例或量可以例如以下列表示：
-在整个反应过程或其间隔期间观察到的3E-异构体的最大产率较高；
-在限定的底物转化值的％下3E-异构体的较高相对量；和/或
-在更高的转化值的％下3E-异构体的相等的相对量；
优选相对于参考方法来观察其中的每一种，所述参考方法在其它条件相同的条件下用化学方法进行，例如化学的酯化或化学的酯裂解。
术语“约”是指所述数值±25％、特别是±15％、±10％，优选±5％、±2％或±1％的潜在变化。
术语“基本上”描述的值范围为约80-100％，例如85-99.9％，特别是90-99.9％，优选95-99.9％，或98-99.9％，尤其是99-99.9％。
“主要”是指50％以上的比例，例如51-100％，优选75-99.9％；更特别是85-98.5％，如95-99％。
由于酶促反应的可逆性，本发明涉及以两个反应方向的本文所述的酶反应。
本文所述酶的“功能突变体”包括如下定义的此类酶的“功能等同物”。
术语“立体异构体”特别是包括构象异构体。
根据本发明，本文一般包括所述化合物的所有立体异构形式，例如构造异构体，特别是立体异构体及其混合物，例如光学异构体，或几何异构体，如E和Z异构体，以及它们的组合。如果在一个分子中存在几个不对称中心，则本发明包括这些不对称中心的不同构象的所有组合，例如对映异构体对。
“立体选择性”描述了以立体异构纯形式生产化合物的特定立体异构体的能力或从多种立体异构体中以本文所述的酶催化方法特异性转化特定立体异构体的能力。更具体地，这意味着本发明的产物富含特定的立体异构体。这可以通过根据下式计算的纯度％ee参数来定量：
％ee＝[XA-XB]/[XA+XB]*100,
其中XA和XB代表立体异构体A和B的摩尔比例(Molenbruch)。
“E-立体选择性”或“E-选择性”描述了在特定的C＝C-双键上以E-异构体纯或基本上纯的或富集形式产生至少一倍的不饱和的E-异构体的能力，或者特异性地或基本上特异性地在本文所述的酶催化方法中从多个其它异构体或E-和Z-异构体的混合物中转化在所述双键的特定位置上的E-异构体的能力。
立体选择性的上述定义及其计算也类似地应用于术语“对映选择性”。
根据本发明，可以获得至少90％ee，例如至少95％ee，或至少98％ee，或至少99％ee或更高的立体异构或对映异构体纯度。
除非另有说明，否则适用以下一般化学定义：
术语“羧酸”包括其游离酸和盐形式，例如，它们的碱金属或碱土金属盐。这适用于本文提到的所有羧酸，特别是高法尼酸。
本发明的直链或支链、饱和或非饱和的“烃基”基团具体是指直链或支链的烷基或链烯基基团。
“烷基”基团包含C1-C20烷基，其为具有1-20个碳原子的直链或支链基团或C1-C4-烷基或C4-C20-烷基。其实例是：
-C1-C4-烷基基团，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基或叔丁基，
-C1-C6-烷基基团，选自如上文所定义的C1-C4-烷基基团、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基；
-C7-C20-烷基基团，其是具有7-20个碳原子的直链或支链基团；其实例选自庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基及其构造异构体，例如4,8-二甲壬基。
“链烯基”基团包含C2-C20-链烯基，其为单或多不饱和的，特别是1-、2-、3-或4-倍，优选1-、2-或3-倍不饱和的具有2-20个碳原子的直链或支链烃基。
单不饱和C2-C20-链烯基基团的实例，在烃链中任何位置具有双键位置的是乙烯基、2-丙烯-1-基、1-甲基丙-2-烯-1-基、2-丁烯-1-基、3-丁烯-1-基、正戊烯基、正己烯基、正庚烯基、正辛烯基、正壬烯基、正癸烯基、正十一基、正十二烯基、正十三烯基、正十四烯基、正十五烯基、正十六烯基、正十七烯基、正十八烯基、油烯基、正十九烯基、二十烯基；
在烃链的任何位置具有两个或三个双键、优选非累积的和优选非共轭键的二-或三-不饱和的C4-C20-链烯基的实例是正丁二烯基、正戊二烯基、正己二烯基、正庚二烯基、正辛二烯基、正辛三烯基、正壬二烯基、正壬三烯基、正癸二烯基、正癸三烯基、正十一碳二烯基、正十一碳三烯基、正十二碳二烯基、正十二碳三烯基、正十三碳二烯基、正十三碳三烯基、正十四碳二烯基、正十四碳三烯基、正十五碳二烯基、正十五碳三烯基、正十六碳二烯基、正十六碳三烯基、正十七碳二烯基、正十七碳三烯基、正十八碳二烯基、正十八碳三烯基、正十九碳二烯基、正十九碳三烯基、正二十碳二烯基、正二十碳三烯基及其构造异构体，例如4,8-二甲基壬-3,7-二烯基。
除非另有说明，否则上述C2-C20-链烯基内的每个双键可以采用E-或Z-构型，并且在多不饱和的情况下可以独立地适用于其他双键。
如本文所定义的“任选取代的”基团的非限制性实例包括1、2、3、4、5或6个，优选1或2个相同或不同的取代基，如HO、SH、NH2、NO2、卤素，如F、Cl、Br、I；如上定义的低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基、低级链烯基、低级炔基或羟基-低级烷基。
“低级烷基”是指如上文所定义的C1-C4-烷基基团。
“低级烷氧基”优选地指上文提及的低级烷基基团的C1-C4-烷氧基类似物。
“低级烷硫基”优选地指上文提及的低级烷基基团的C1-C4-烷硫基类似物。实例是甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、仲丁硫基、异丁硫基和叔丁硫基。
“低级链烯基”包含如上文所定义的C2-C4-链烯基基团。
“低级炔基”包含上述“低级炔基”基团的炔基类似物。
术语“羟基低级烷基”是指C1-C4-羟基烷基，其为具有1-4个碳原子的直链或支链烷基，其中至少一个氢原子，例如1或2个氢原子被羟基取代。其实例为羟甲基、2-羟基-1-乙基、2-和3-羟基-1-丙基、2-、3-和4-羟基-1-丁基，及其构造异构体。
本文公开了具体参数的不同优选度的参数范围。在本文的范围内，还涵盖对于本文提及的两个或更多个参数的任何组合的不同优选度的参数范围的任何组合。
2.本发明的具体实施方案：
本发明提供以下具体实施方案：
1.从包含所述羧酸化合物的3-(E)-和3-(Z)-异构体的异构体混合物中分离通式(I)的不饱和羧酸化合物的3-(E)-异构体的方法，其中所述异构体混合物经受脂肪酶(EC3.1.1.3)催化的酶促转化反应，该脂肪酶优选，特别是立体选择性地转化所述3-(E)-异构体，并将所述3-(E)-异构体的转化产物从所述反应混合物中分离，
其中
R1是H或直链或支链、饱和或不饱和、任选取代的C1-C20烃基基团，优选饱和的、未取代的直链C1-C20烃基基团；
R3是H或C1-C4-烃基基团，优选H或甲基；
R2是直链或支链、饱和或不饱和、任选取代的C1-C20-烃基基团，优选不饱和的支链C2-C16-烃基基团；
条件是，如果R3是C1-C4-烃基基团，R2代表包含至少一个额外碳原子的烃基基团。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述脂肪酶催化3-(E)-立体选择性转化反应。
3.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶是以游离或固定形式应用。
4.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶是天然的或重组产生的任选地经遗传修饰的(突变的)酶。
5.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述脂肪酶来自假丝酵母属物种(Candida sp.)，特别是南极假丝酵母(Candida antarctica)。
6.如实施方案5所述的方法，其中所述脂肪酶是南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，其包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列或其突变体，所述突变体与SEQ ID NO:330具有至少60％的序列同一性并保留所述3-(E)-选择性。
7.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述转化反应包括式(Ia)的酸的酶促酯化反应，任选在不干扰或甚至抑制脂肪酶活性的有机溶剂存在下进行，
其中
R2和R3如上文所定义；
且其中主要形成3-(E)-酯；且其中脂肪族链烷醇R1OH，其中R1如上文所定义，优选直链或支链、饱和的C1-C20烷基，优选C1-C4烷基基团。
8.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述转化反应包括式(Ib)的酯的酶促酯裂解反应；
其中
R1是H或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-、特别是C4-C20-烃基基团；
且R2和R3如上文所定义；
且其中主要形成3-(E)-酸；且其中该反应是在水的存在下，任选在不干扰或甚至抑制脂肪酶活性的有机溶剂存在下进行
9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述转化反应在有机溶剂或水-有机溶剂中进行。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述有机溶剂选自脂肪族或脂环族烃，如具有至少5个碳原子的烃，特别是己烷、环己烷、庚烷、辛烷；芳烃，特别是单核芳香族化合物，如苯、二甲苯和甲苯；和脂肪族醚类，如MTBE、二异丙基醚。优选地，合适的有机溶剂应该能够与水形成两相体系。
11.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述羧酸化合物是式(II)的3-(E)/7-(E)-高法尼酸化合物，
其中R1如上文所定义。
12.制备通式(Ia)的不饱和3-(E)-羧酸的方法：
其中
R2和R3如上文所定义；
其中
a)包含所述式(Ia)的羧酸的3-(E)-和3-(Z)-异构体的异构体混合物在式R1OH的链烷醇存在下进行酶促酯化反应，其中R1是直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-烃基基团，优选直链或支链、饱和的C1-C20烷基，优选C1-C4烷基基团；且在如实施方案1-6之一所定义的脂肪酶存在下进行；
b)分离步骤a)中形成的所述3-(E)-羧酸酯，例如通过将未反应的酸异构体在水相中(作为酸式盐)转移并通过有机溶剂回收酯，所述有机溶剂是该转化期间存在的或在转化之后加入；且
c)将步骤b)的所述分离的酯皂化为相应的式(Ia)的3-(E)-羧酸。
13.制备通式(Ia)的不饱和3-(E)-羧酸的方法：
其中，
R2和R3如上文所定义；
其中
a)将异构体混合物，其包含式(Ib)的羧酸酯的3-(E)-和3-(Z)-异构体，在实施方案1-6中之一所定义的脂肪酶存在下，优选在水和任选的有机溶剂存在下，进行酶促酯裂解反应，
其中
R1是直链或支链、饱和或不饱和C1-C20-烃基基团，优选直链或支链、饱和C1-C20烷基，优选C1-C4烷基基团；且
R2和R3如上文所定义；
b)分离步骤a)中形成的所述3-(E)-羧酸，优选作为游离酸从反应混合物的水相中分离。
14.如实施方案12或13所述的方法，其中应用如实施方案9和10中任一项所定义的有机溶剂。
15.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述不饱和羧酸的3-(E)-异构体是3-(E)/7-(E)-高法尼酸。
16.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述异构体混合物包括3-(E)/7-(E)-高法尼酸和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸的混合物；或式R1OH的链烷醇的3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸酯的混合物，其中R1是直链或支链、饱和或不饱和C1-C20-烃基基团。
17.如实施方案16所述的制备3-(E)/7-(E)-高法尼酸的方法，
其中
a)包含3-(E)/7-(E)-高法尼酸和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸的异构体混合物在式R1OH的链烷醇存在下进行酶促酯化反应，其中R1为直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-烃基基团，优选为直链或支链、饱和的C1-C20烷基，优选为C1-C4烷基基团；且在实施方案1-6中任一项所定义的脂肪酶存在下，在实施方案9和10中之一所定义的溶剂中进行；
b)将步骤a)中形成的所述3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯与未反应的酸(即，3-(Z)/7-(E)-高法尼酸)分离，特别是通过蒸馏或优选萃取，且
c)将所述分离的3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯皂化为3-(E)/7-(E)-高法尼酸。
18.实施方案16中所述的制备3-(E)/7-(E)-高法尼酸的方法，
其中
a)将包含3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸酯的异构体混合物进行酶促酯裂解反应，在如实施方案1-6中之一所定义的脂肪酶存在下，在实施方案9和10中之一所定义的溶剂中，优选在水存在下进行；且
b)将步骤a)中形成的3-(E)/7-(E)-高法尼酸与未反应的酯(即，3-(Z)/7-(E)-高法尼酸酯)分离，特别是通过蒸馏或优选萃取。
19.式(III)的(-)-降龙涎香醚的制备方法
包括以下步骤：
a)通过应用实施方案1-18中任一项所定义的方法获得所述3-(E)/7-(E)-高法尼酸；
b)将3-(E)/7-(E)-高法尼酸化学还原为3-(E)/7-(E)-高法尼醇，且
c)将3-(E)/7-(E)-高法尼醇酶促环化为(-)-降龙涎香醚。
20.式(III)的(-)-降龙涎香醚的制备方法
包括以下步骤：
a)通过应用实施方案1-18任一项所定义的方法获得所述3-(E)/7-(E)-高法尼酸；
b)将3-(E)/7-(E)-高法尼酸酶促环化为式(IV)的香紫苏内酯，
且
c)将所述香紫苏内酯化学转化为(-)-降龙涎香醚。
21.如实施方案19或20中所述的方法，其中该酶促环化是在分子内转移酶(E.C.5.4)，特别是高法尼酸环化酶(E.C.5.4.99.17)，特别是显示高法尼酸环化酶活性的角鲨烯-禾烯环化酶(E.C.5.4.99.17)的存在下进行。
22.如实施方案21所述的方法，其中所述环化酶是天然的或重组产生的任选地经遗传修饰的(突变的)角鲨烯-禾烯环化酶(SHC)。
23.如实施方案22所述的方法，其中所述环化酶是角鲨烯禾烯环化酶，其来自荚膜甲基球菌(Methylococcus capsalatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、弗兰克菌属物种(Frankiaspec.)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或，优选运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)。
24.如实施方案23所述的方法，其中所述环化酶来自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，其包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。
25.3-(E)/7-(E)-高法尼酸烷基酯，其中所述烷基选自C2-C10、特别是C3-C8-烷基，例如乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基或叔丁基；以及戊基、己基、庚基、辛基及其构造异构体；优选地，以基本上立体异构纯的3-(E)/7-(E)-形式，且特别是按照上文定义的方法制备的形式。
通常情况下，适用于本发明所述方面的环化酶是SHC，其在下文通过参考其野生型序列(SEQ ID NO和Genbank编号)和其微生物来源列出。
SEQ ID NO:2是也称为Zm-SHC-1的环化酶的氨基酸序列。
3.本发明的酶和酶突变体
本发明不限于具体公开的脂肪酶和环化酶的用途，还可以延伸至其功能等同物。
在本发明的范围内，具体公开的酶的“功能等同物”或类似物是其各种多肽，它们也具有所需的生物学功能或活性，例如酶活性。
例如，“功能等同物”是指酶，其在用于酶活性的测试中显示至少1-10％、或至少20％、或至少50％、或至少75％、或至少90％的更高或更低的如本文所定义的酶活性。
根据本发明，“功能等同物”还特别是指突变体，其在上述氨基酸序列的至少一个序列位置具有与具体陈述的氨基酸不同的氨基酸，但仍具有其中一种上述生物活性。因此，“功能等同物”包含可通过一个或多个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸添加、取代、插入、缺失和/或倒转所获得的突变体，其中所述变化可以在任何序列位置发生，条件是它们导致具有本发明的性质特征的突变体。如果反应性模式在突变体和未改变的多肽之间定性地重合，即，例如如果相同的底物以不同的速率转化，则特别地也提供了功能等同性。合适的氨基酸取代的实例显示在下表中：
上述意义上的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”，以及多肽的“功能衍生物”和“盐”。
在这种情况下，“前体”是具有或不具有所需生物活性的多肽的天然或合成前体。
表述“盐”是指本发明的蛋白质分子的羧基的盐以及氨基基团的酸加成盐。羧基的盐可以以已知的方式生成并且包含无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐，以及与有机碱形成的盐，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等。酸加成盐，例如与无机酸如盐酸或硫酸的盐和与有机酸如乙酸和草酸的盐，也包括在本发明中。
根据本发明的多肽的“功能衍生物”也可以使用已知技术在功能性氨基酸侧链基团上或在其N-末端或C-末端产生。这些衍生物包括例如羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺，可通过与氨或伯胺或仲胺反应得到；通过与酰基基团反应产生的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基基团反应产生的游离羟基的O-酰基衍生物。
“功能等同物”自然也包含可以从其它生物体获得的多肽，以及天然存在的变体。例如，可以通过序列比较建立同源序列区域的区域，并且可以基于本发明的具体参数确定等同的酶。
“功能等同物”还包含本发明的多肽的片段，优选单个结构域或序列基序，其例如显示所需的生物学功能。
此外，“功能等同物”是具有上述多肽序列之一或其衍生的功能等同物以及在功能性N-末端或C-末端缔合的至少一种其它的功能不同的异源序列(即，没有融合蛋白部分的实质性相互功能损害)的融合蛋白。这些异源序列的非限制性实例是例如信号肽、组氨酸锚或酶。
本发明也包括的“功能等同物”是具体公开的蛋白质的同源物。它们具有如上所述的百分比同一性值。所述值是指与具体公开的氨基酸序列的同一性，并且可以根据Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法计算。
％同一性值也可以从BLAST比对、算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或通过应用如下给出的Clustal设置来计算。
本发明的同源多肽的百分比同一性特别是指氨基酸残基相对于本文具体描述的氨基酸序列之一的总长度的百分比同一性。
在可能的蛋白质糖基化的情况下，本发明的“功能等同物”包括以去糖基化或糖基化形式的上述类型的蛋白质以及可以通过改变糖基化模式获得的修饰形式。
本发明的蛋白质或多肽的这些功能等同物或同源物可以通过诱变产生，例如通过点突变、延长或缩短蛋白质。
可以通过筛选突变体的组合数据库(例如缩短突变体)来鉴定本发明蛋白质的这些功能等同物或同源物。例如，蛋白质变体的多样化数据库可以通过核酸水平的组合诱变产生，例如，通过酶促连接合成寡核苷酸的混合物。有许多方法可用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在同源物的数据库。简并的基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后可以将合成基因连接在合适的表达载体中。使用简并的基因组使得可以提供混合物中的所有序列，其编码所需的潜在蛋白质序列组。合成简并的寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等,(1984)Science 198:1056；Ike等(1983)NucleicAcids Res.11:477)。
在现有技术中，已知几种技术用于筛选通过点突变或缩短产生的组合数据库的基因产物，并用于筛选具有所选性质的基因产物的cDNA文库。这些技术可以适用于快速筛选通过根据本发明的同源物的组合诱变产生的基因库。最常用于筛选大基因库的技术，其基于高通量分析，包括在可以复制的表达载体中克隆基因库，用所得载体数据库转化合适的细胞，且组合基因在检测所需活性有助于分离编码被检测其产物的基因的载体的条件下表达组合基因。递归整体诱变(Recursive Ensemble Mutagenesis，REM)是一种增加数据库中功能性突变体频率的技术，可与这些筛选试验结合使用以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89:7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。
4.编码核酸序列
本发明还涉及编码本文定义的酶和突变体的核酸序列。
本发明还涉及与本文具体公开的序列具有一定程度“同一性”的核酸。两个核酸之间的“同一性”指核苷酸的同一性，在每种情况下均在核酸的整个长度上。
例如，可以通过Informax(USA)公司的Vector NTI Suite 7.1程序使用具有以下设置的Clustal方法(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequencealignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989 Apr；5(2):151-1)计算：
多重比对参数：
成对比对参数：
或者，同一性可按Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.Multiple sequencealignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500，网页http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#所述方法和以下设定进行测定：
本文提到的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可以以已知的方式通过化学合成从核苷酸结构单元中产生，例如，通过双螺旋的各个重叠互补的核酸结构单元的片段缩合来产生。寡核苷酸的化学合成可以例如通过亚磷酰胺方法以已知方式进行(Voet,Voet,第2版,Wiley Press,New York,第896-897页)。通过DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应以及一般克隆技术来积累合成寡核苷酸和填充空位，其描述于Sambrook等(1989)，见下文。
本发明还涉及编码上述多肽之一及其功能等同物的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，其可以例如使用人工核苷酸类似物获得。
本发明不仅涉及分离的核酸分子，其编码本发明的多肽或蛋白质或其生物活性区段，还涉及核酸片段，其可用作例如用于鉴定或扩增编码本发明的核酸的杂交探针或引物。
本发明的核酸分子可以另外含有来自编码遗传区域的3'和/或5'末端的非翻译序列。
本发明还涉及与具体描述的核苷酸序列或其片段互补的核酸分子。
本发明的核苷酸序列能够制备探针和引物，所述探针和引物可用于鉴定和/或克隆在其它细胞类型和生物中的同源序列。此类探针或引物通常包含在“严格”条件下(见下文)与本发明核酸序列的有义链或相应的反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
“分离的”核酸分子是与存在于该核酸天然来源中的其它核酸分子分离，并且可以基本上不含其它细胞物质或培养基(如果其通过重组技术产生)，或者可以不含化学前体或其它化学品(如果其通过化学合成)。
可以通过分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息分离本发明的核酸分子。例如，可以使用具体公开的完整序列之一或其片段作为杂交探针和标准杂交技术从合适的cDNA文库中分离cDNA(例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述)。另外，可以通过聚合酶链反应，使用基于该序列构建的寡核苷酸引物分离包含所公开序列之一或其片段的核酸分子。以这种方式扩增的核酸可以克隆到合适的载体中，并且可以通过DNA测序来表征。本发明的寡核苷酸也可以通过标准合成方法产生，例如使用自动DNA合成仪。
本发明的核酸序列或其衍生物、同源物或这些序列的部分，可以例如通过常规杂交技术或PCR技术从其它细菌中分离，例如通过基因组或cDNA文库分离。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。
“杂交”指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与几乎互补的序列结合的能力，而在这些条件下非互补的配偶体之间不发生非特异性结合。为此，该序列可以是90-100％互补。能够彼此特异性结合的互补序列的性质用于例如Northern印迹或Southern印迹或PCR或RT-PCR中的引物结合。
保守区的短寡核苷酸有利地用于杂交。然而，也可以使用本发明的核酸的较长片段或用于杂交的完整序列。这些标准条件根据所用的核酸(寡核苷酸、较长片段或完整序列)或根据使用哪种核酸类型(DNA或RNA)进行杂交而变化。例如，DNA:DNA杂交体的解链温度约比相同长度DNA:RNA杂交体的解链温度低10℃。
例如，根据具体的核酸，标准条件是指温度在42-58℃之间在浓度为0.1到5x SSC之间(1X SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)的缓冲水溶液中，或另外在50％甲酰胺存在下，例如在42℃下在5×SSC，50％甲酰胺中。有利地，DNA:DNA杂交体的杂交条件是0.1×SSC，温度在约20℃至45℃之间，优选在约30℃至45℃之间。对于DNA:RNA杂交体，杂交条件有利地为0.1×SSC，温度为约30℃至55℃，优选为约45℃至55℃。这些所述的杂交温度是计算出的长度约为100个核苷酸和50％的G+C含量的核酸在不存在甲酰胺情况下的解链温度值的实例。DNA杂交的实验条件在相关的遗传学教科书中描述，例如Sambrook等，1989，并且可以使用本领域技术人员已知的公式计算，例如取决于核酸的长度、杂交体类型或G+C含量。本领域技术人员可以从以下教科书获得关于杂交的进一步信息：Ausubel等(编辑),1985,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York；Hames和Higgins(编辑),1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRL Pressat Oxford University Press,Oxford；Brown(编辑),1991,Essential MolecularBiology:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。
“杂交”尤其可在严格条件下进行。这种杂交条件例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,in:Molecular Cloning(A Laboratory Manual),第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989,9.31-9.57页或Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中描述。
“严格”杂交条件具体表示：在由50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA组成的溶液中于42℃孵育过夜，然后在65℃下用0.1x SSC洗涤滤器。
本发明还涉及具体公开或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此，本发明的其它核酸序列可以衍生自本文具体公开的序列，并且可以通过单个或几个核苷酸的添加、取代、插入或缺失而与其不同，并且还编码具有所需特性谱的多肽。
根据特定原始或宿主生物的密码子使用，以及天然存在的变体，例如剪接变体或其等位基因变体，本发明还包括与具体陈述的序列相比包含所谓的沉默突变或已被改变的核酸序列。
它还涉及可通过保守核苷酸取代获得的序列(即所述氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸取代)。
本发明还涉及通过序列多态性从具体公开的核酸衍生的分子。由于天然变异，这些遗传多态性可以存在于群体内的个体之间。这些天然变异通常在基因的核苷酸序列中产生1至5％的变化。
本发明的核酸序列的衍生物指例如等位基因变体，其在整个序列范围内在衍生的氨基酸水平上具有至少60％的同源性，优选至少80％的同源性，非常特别优选至少90％的同源性(关于氨基酸水平的同源性，应参考上文给出的多肽的细节)。有利地，该同源性可以在序列的部分区域内更高。
此外，衍生物也应理解为本发明的核酸序列的同源物，例如动物、植物、真菌或细菌同源物、缩短的序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，同源物在DNA水平上具有在本文具体公开的序列的整个DNA区域中至少40％，优选至少60％，特别优选至少70％，非常特别优选至少80％的同源性。
此外，衍生物应理解为例如与启动子的融合。添加到所述核苷酸序列的启动子可以通过至少一个核苷酸交换、至少一个插入、倒位和/或缺失进行修饰，但不损害启动子的功能或功效。此外，启动子的功效可以通过改变它们的序列来增加，或者可以与更有效的、甚至是不同属的生物的启动子完全交换。
5.本发明的构建体
本发明还涉及表达构建体，包括在调节核苷酸序列的遗传控制下编码本发明多肽或融合蛋白的核苷酸序列；以及包含至少一种这些表达构建体的载体。
根据本发明，“表达单元”是指具有表达活性的核酸，其包含如本文所定义的启动子，并且在与待表达的核酸或基因功能性结合后调节表达，即该核酸或该基因的转录和翻译。因此，在这种情况下，它也称为“调节核酸序列”。除了启动子之外，还可以存在其它调节元件，例如，增强剂。
根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”是指表达单元，其在功能上与待表达的核酸或待表达的基因相关。与表达单元相反，表达盒因此不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，还包含应当表达为作为转录和翻译的结果的蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中，术语“表达”或“过表达”描述了微生物中一种或多种由相应的DNA编码的酶的细胞内活性的产生或增加。为此，例如可以在生物体中插入基因、用另一个基因替换现有基因、增加基因的拷贝数、使用强启动子或使用编码具有高活性的相应酶的基因，且任选地可以组合这些措施。
优选地，本发明的这种构建体包含在各编码序列5'-上游的启动子和3'-下游的终止子序列，以及任选地其它常规调节元件，在每种情况下与编码序列功能性相关。
根据本发明，“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”是指与待转录的核酸功能性相关的核酸，其调节该核酸的转录。
在本文中，“功能性”或“操作性”的结合指例如以下元件的顺序排列：具有启动子活性的核酸之一和待转录的核酸序列以及任选的其它调节元件、例如能够使核酸转录的核酸序列以及例如终止子，由此可使得每个调节元件在核酸序列的转录中发挥其功能。这不必需要化学意义上的直接结合。遗传控制序列，例如增强子序列，也可以从更远的位置或甚至从其它DNA分子上对靶序列发挥其功能。优选这样的排列，其中待转录的核酸序列位于启动子序列的后面(即3'-末端)，使得两个序列彼此共价结合。启动子序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离可小于200bp(碱基对)，或小于100bp或小于50bp。
除了启动子和终止子之外，可提及的其它调节元件的实例是靶向序列、增强子、多腺苷酸化信号、可选择标记、扩增信号、复制起点等。合适的调节序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,CA(1990)中。
本发明的核酸构建体特别包含选自本文具体提及的那些序列或其衍生物和同源物的序列，以及可以衍生自本文具体提及的氨基酸序列的核酸序列，其有利地以操作性或功能性地与用于控制、例如增加基因表达的一个或多个调节信号结合。
除了这些调节序列之外，这些序列的天然调节仍然可以存在于实际结构基因的前面并且任选地可以在遗传上被改变从而关闭天然调节并且已经增加基因的表达。该核酸构建体也可以是更简单的设计，即没有任何额外的调节信号被插入编码序列的前面并且没有通过其调节去除天然启动子。相反，天然调节序列被沉默，从而不再发生调节并且基因表达增加。
优选的核酸构建体还有利地含有一种或多种上述增强子序列，其与启动子功能性地结合，允许核酸序列的表达增加。其它有利的序列，例如其它调节元件或终止子，也可以插入DNA序列的3'末端。在构建体中可以包含本发明的核酸的一个或多个拷贝。该构建体还可以含有其它标记，例如抗生素抗性或营养缺陷型互补基因，任选地用于构建体的筛选。
合适的调节序列的实例包含在启动子中，例如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaPBAD)SP6-、λ-PR-或λ-PL启动子，其有利地应用于革兰氏阴性细菌中。其它有利的调节序列包含在例如革兰氏阳性启动子ace、amy和SPO2、酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人工启动子也可用于调节。
为了表达，将核酸构建体有利地插入宿主生物的载体中，例如质粒或噬菌体，其允许基因在宿主中的最佳表达。除了质粒和噬菌体之外，载体还应理解为是指本领域技术人员已知的所有其它载体，例如病毒，如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌体、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制，或者可以经染色体复制。这些载体代表本发明的另一个实施方案。
适合的质粒是，例如在大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；在诺卡菌型放线菌中的pJAM2；在链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361；在杆菌中的pUB110、pC194或pBD214；在棒状杆菌中的pSA77或pAJ667；在真菌中的pALS1、pIL2或pBB116；在酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或在植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述质粒代表可能的质粒的少数选择。其它质粒是本领域技术人员公知的，并且可见于例如Cloning Vectors(编辑Pouwels P.H.等Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)。
在载体的另一个实施方案中，含有本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体可以有利地以线性DNA的形式通过异源或同源重组插入微生物中并整合到宿主生物的基因组中。该线性DNA可包含线性化载体，例如质粒，或仅包含核酸构建体或本发明的核酸。
为了在生物体中最佳表达异源基因，有利地是在生物体中使用的特定密码子应用来改变核酸序列。可以基于对所述生物的其它已知基因的计算机评估来容易地确定密码子使用。
本发明的表达盒的产生基于合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子信号或多腺苷酸化信号的融合。普通的重组和克隆技术用于此，例如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)以及T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1984)和Ausubel,F.M.等,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所述。
将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入宿主特异性载体中，用于在合适的宿主生物中表达，以允许基因在宿主中的最佳表达。载体是本领域技术人员公知的，并且可以在例如“Cloning Vectors”中找到(Pouwels P.H.等,Publ.Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)。
6.可根据本发明使用的宿主
根据上下文，术语“微生物”是指根据本发明的起始微生物(野生型)或遗传修饰的微生物，或两者。
根据本发明，术语“野生型”是指相应的起始微生物，并且不一定需要对应于天然存在的生物体。
借助于本发明的载体，可以产生重组微生物，其已经例如用至少一种本发明的载体转化，并且可以用于产生本发明的多肽。有利地，将上述本发明的重组构建体插入合适的宿主系统中并表达。优选地，使用本领域技术人员熟悉的常用克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以确保所述核酸在各自表达系统中的表达。合适的系统例如在Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等,Publ.WileyInterscience,New York 1997,或Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989中所述。
通常，所有原核生物都可以被认为是本发明的核酸或核酸构建体的重组宿主生物。细菌有利地用作宿主生物。优选地，它们选自有能力产生PHA-、TAG-或WE-型包涵体的天然或重组细菌，特别是产生TAG的以下菌属：诺卡菌放线菌(nocardioformactinomycetes)，特别是红球菌属(Rhodococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、戈多尼亚属(Gordonia)、Skermania和Tsukamurella；以及产生TAG的链霉菌书(Streptomycetes)；产生WE的不动杆菌属(Acinetobacter)和Alcanivorax；以及埃希氏菌属(Escherichia)的重组菌株，尤其是大肠杆菌、棒杆菌属(Corynebacterium)，特别是谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)和芽孢杆菌(Bacillus)，尤其是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
然后，本发明的宿主生物优选含有至少一种本发明中描述的核酸序列、核酸构建体或载体，其编码根据上述定义的酶活性。
本发明的方法中使用的生物体以本领域技术人员熟悉的方式生长或培养，这取决于宿主生物。通常，微生物在液体培养基中生长，所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源，通常为有机氮源的氮源，例如酵母提取物或盐例如硫酸铵，微量元素如铁、锰和镁盐以及任选的维生素，温度在0℃至100℃之间，优选在10℃至60℃之间，并进行氧气通气。液体营养培养基的pH可以保持在固定值，即在生长期间调节或不调节。生长可以分批进行、半分批进行或连续进行。营养素可以在发酵开始时提供，或者可以随后半连续或连续提供。
7.本发明的酶的重组产生
本发明还涉及通过培养表达所述酶的微生物并从培养物中分离所需产物来生产用于本发明方法的酶的方法。
本发明使用的微生物可以在分批过程中或在补料分批或重复补料分批过程中连续或不连续地培养。在Chmiel的教科书(Bioprocesstechnik 1.Einführung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中可以找到已知培养方法的综述。
要使用的培养基必须以适当的方式满足特定菌株的要求。用于各种微生物的培养基的描述在美国细菌学会的手册“通用细菌学方法手册”(Washington D.C.,USA,1981)中给出。
本发明可使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖也可以通过复杂的化合物添加到培养基中，例如糖蜜或来自糖精制的其它副产物。添加各种碳源的混合物也可能是有利的。其它可能的碳源是油和脂肪，如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇类，如甘油、甲醇或乙醇，有机酸，如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。氮源的实例包括氨气或铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或复杂的氮源，例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
可存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
无机含硫化合物，例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，以及有机硫化合物，例如硫醇和硫醇，可用作硫源。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可用作磷源。
可以将螯合剂添加到培养基中，以使金属离子保持在溶液中。特别合适的螯合剂包括二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸，或有机酸，如柠檬酸。
本发明使用的发酵培养基还可以含有其它生长因子，例如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆辛。生长因子和盐通常来自培养基的复合组分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。另外，可以将合适的前体添加到培养基中。培养基中化合物的精确组成强烈依赖于特定的实验，并且必须针对每种具体情况单独确定。关于培养基优化的信息可以在教科书"Applied Microbiol.Physiology,APractical Approach"(Publ.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL Press(1997)p.53-73,ISBN0 19 963577 3)中找到。生长培养基也可以从商业供应商处获得，例如标准1(Merck)或BHI(脑心浸液,DIFCO)等。
通过加热(在1.5巴和121℃下20分钟)或通过无菌过滤对培养基的所有组分进行灭菌。组分可以一起灭菌，或者如果需要的话单独灭菌。培养基的所有组分可以在生长开始时存在，或任选地可以连续添加或通过分批进料添加。
培养物的温度通常在15℃至45℃之间，优选在25℃至40℃之间，并且可以保持恒定或可以在实验期间变化。培养基的pH值应在5至8.5的范围内，优选约7.0。通过添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸，可以在生长期间控制生长的pH值。消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制发泡。为了保持质粒的稳定性，可将具有选择性作用的合适物质(例如抗生素)添加到培养基中。将氧气或含氧气体混合物，例如环境空气送入培养物中以维持有氧条件。培养物温度通常为20℃至45℃。继续培养直至形成最大量的所需产物。这通常在10小时至160小时内完成。
可以经高频超声、经高压(例如在弗氏压碎器中)、经渗透、经洗涤剂、裂解酶或有机溶剂的作用、经匀化器或通过所列出的几种方法的组合将细胞破碎。
8.本发明的生物催化方法的反应条件
在本发明的方法或如上文定义的多步骤方法的单个步骤期间存在的所述至少一种酶可以存在于天然地或重组地产生一种或多种酶的活细胞中、收获的细胞中、死细胞中、透化细胞中、粗细胞提取物中、纯化的提取物中，或以基本上纯的或完全纯的形式存在。所述至少一种酶可以存在于溶液中或作为固定在载体上的酶存在。可以以可溶和固定的形式同时存在一种或几种酶。
本发明的方法可以在本领域技术人员已知的常用反应器中进行，并且可以在不同的规模范围内进行，例如从实验室规模(几毫升到几十升反应体积)到工业规模(几升到几千立方米的反应体积)。如果脂肪酶以由非活的，任选透化的细胞包封的形式，以或多或少纯化的细胞提取物的形式或以纯化形式使用，则可以使用化学反应器。化学反应器通常允许控制所述至少一种酶的量、至少一种底物的量、pH、温度和反应介质的循环。当所述至少一种酶存在于活细胞中时，该过程将是发酵。在这种情况下，生物催化生产将在生物反应器(发酵罐)中进行，其中活细胞的合适生存条件所必需的参数(例如含有营养物的培养基、温度、通气、存在或不存在氧气或其它气体、抗生素等)可以被控制。本领域技术人员熟悉化学反应器或生物反应器，例如，从实验室规模到工业规模的化学或生物技术方法，或优化工艺参数的方法，其也在文献中广泛描述(生物技术方法参见例如Crueger und Crueger,Biotechnologie–Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie,2.Ed.,R.OldenbourgVerlag,München,Wien,1984)。
含有所述至少一种酶的细胞可以通过物理或机械方式透化，例如超声波或射频脉冲、弗氏压碎或化学方法，例如低渗介质、介质中存在的裂解酶和去污剂，或这些方法的组合。洗涤剂的实例是洋地黄皂苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛基糖苷、X-100、20、脱氧胆酸盐、CHAPS(3-[(3-氯乙酰基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)、P40(乙基苯酚聚(乙二醇醚)等。
如果所述至少一种酶被固定，则将其连接到惰性载体上。合适的载体材料是本领域已知的，并且例如在EP-A-1149849、EP-A-1 069 183和DE-OS 100193773以及其中引用的参考文献中公开(所有这些都被具体地包括在有关载体材料的内容内)。合适的载体材料的实例是粘土、粘土矿物如高岭石、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉末、阴离子交换材料、合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨酯和聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。为了制备载体结合的酶，载体材料通常以细粉末的形式使用，其中多孔形式是优选的。载体材料的粒度通常不超过5mm，特别是2mm。在所述至少一种酶存在于全细胞制剂中的情况下，所述全细胞制剂可以以游离或固定形式存在。合适的载体材料是例如海藻酸钙或卡拉胶。酶和细胞可以直接通过戊二醛连接。本领域已知多种固定方法(例如J.Lalonde和A.Margolin，，Immobilization of Enzymes“in K.Drauz und H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,Vol.III,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim)。
转化反应可以分批、半分批或连续进行。反应物(和任选的营养素)可以在反应开始时提供，或者可以随后半连续或连续提供。
根据具体的反应类型，本发明的反应可以在水性或非水性反应介质中进行。酯裂解反应优选在水存在下进行，特别是在水-有机溶剂体系，优选两相体系存在下进行。酯化反应可预先在不存在水的情况下进行，更特别是在不含或基本上不含水的有机溶剂存在下进行。
含水介质可含有合适的缓冲液，以将pH调节至5至9的值，如6至8。
非水介质可基本上不含水，即含有少于约1重量％或0.5重量％的水。
特别地，生物催化方法在有机非水介质中进行。作为合适的有机溶剂，可提到的有例如5-8个碳原子的脂族烃，如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷；芳香族碳水化合物，如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯、脂肪族非环状化合物和醚类，如乙醚、甲基-叔丁基醚、乙基-叔丁基醚、二丙基醚、二异丙基醚、二丁基醚；或其混合物。优选使用具有与水形成双相溶剂体系的能力的有机溶剂。
反应物/底物的浓度可以调节到最佳反应条件，这可取决于所用的特定酶。例如，初始底物浓度可以是0.1至0.5M，例如10至100mM。
反应温度可以调节到最佳反应条件，这可取决于所用的特定酶。例如，反应可以在0至70℃的温度下进行，例如20至50或25至40℃。反应温度的实例为约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃和约60℃。
该过程可以进行直到实现底物与产物之间的平衡，但可以更早地停止。通常的处理时间为1分钟至25小时，特别是10分钟至6小时，例如1小时至4小时，特别是1.5小时至3.5小时。
8.1对3-不饱和羧酸例如高法尼酸的选择性酶促酯化
在一个优选的实施方案中，将3-不饱和羧酸的(3E/Z)异构体的混合物，特别是(3E,7E)-和(3Z,7E)-高法尼酸、脂肪族醇和任选的有机溶剂用脂肪酶处理以进行酯化反应。
合适的脂肪酶的非限制性实例是南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶(CALB)，及其固定的类似物，如Novozym
合适的醇的非限制性实例是脂族C1-C20-醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、正戊醇、正己醇、正庚醇和正辛醇。
合适溶剂的非限制性实例特别是脂族烃，例如己烷、环己烷、庚烷、辛烷；芳烃，例如甲苯、二甲苯；二烷基醚，例如MTBE和二异丙基醚。
在一个优选的实施方案中，每当量的(3E)-羧酸，特别是高法尼酸的(3E,7E)-异构体使用一当量的醇，以获得基本上完全的转化。使用较少量的醇会限制酯的产率。
该反应适合在约0℃至+80℃的温度范围内进行。可以通过GC或HPLC分析来控制反应进程。
获得了所述羧酸异构体的可分离的酸/酯混合物。
8.2对3-不饱和羧酸酯例如高法尼酸酯的选择性酶促皂化
在另一个实施方案中，通过应用3-不饱和羧酸的3E/Z-异构体混合物、特别是高法尼酸烷基酯的(3E,7E)-和(3Z,7E)-异构体的混合物的酶催化的酯裂解，获得了异构体的可分离的混合物。在反应中，得到游离的3E-酸、特别是(3E,7E)-高法尼酸异构体和未反应的3Z酯、特别是未反应的(3Z,7E)-高法尼酸酯。
在一个优选的实施方案中，将任选地溶解在有机溶剂中的羧酸烷基酯的异构体混合物通过在水存在下应用脂肪酶进行转化。
合适的脂肪酶的非限制性实例是南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶(CALB)，及其固定的类似物，如Novozym
酯的合适的烷基基团的非限制性实例是：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和仲丁基。
合适溶剂的非限制性实例是脂族烃，例如己烷、环己烷、庚烷；芳烃，如甲苯和二甲苯；醚类，例如，MTBE和二异丙基醚、THF。
8.3制备(-)-降龙涎香醚
可以通过应用如上述流程1中所述的已知方法，从本发明获得的立体异构纯(3E/7E)高法尼酸开始进行制备。
如流程1中所述的EP16156410和WO2010/139719以及WO2012/066059的公开物描述了通过应用不同来源的环化酶来对不饱和底物进行生物催化转化，其通过引用并入本文。
香紫苏内酯，例如通过环化酶催化转化本发明的(3E/7E)-高法尼酸而获得，然后通过化学还原(例如通过LiAlH4或NaBH4)以形成降龙涎香醚-1,4-二醇[Mookherjee等；Perfumer and Flavourist(1990),15:27]。然后可通过不同的方法将降龙涎香醚-1,4-二醇化学转化为(-)-降龙涎香醚(参见例如US 5,274,134)。
化合物(-)-降龙涎香醚的生物催化合成也在文献中描述[Neumann等；Biol ChemHoppe Seyler(1986),367:723]。该分子是从高法尼醇((3Z,7E)-4,8,12-三甲基十三-3,7,11-三烯-1-醇获得，来自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)(以前的酸热芽胞杆菌(Bacillus acidocaldarius))的角鲨烯-禾烯环化酶(SHC)作为催化剂。
9.产物分离
本发明的方法可以进一步包括回收终产物或中间产物的步骤，任选地以立体异构体或对映异构体基本上纯的形式。术语“回收”包括从培养物或反应介质中提取、收获、分离或纯化化合物。可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法进行化合物的回收，包括但不限于用常规树脂(例如阴离子或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等)处理，使用常规吸附剂(例如活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、氧化铝等)处理，改变pH，溶剂萃取(例如用常规溶剂如乙醇、乙酸乙酯、己烷等)，蒸馏，透析，过滤，浓缩，结晶，重结晶，pH调节，冻干等。
所分离产物的特性和纯度可通过已知技术确定，如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、波谱技术(如IR、UV、NMR)、着色方法、TLC、NIRS、酶或微生物测定。(参见例如：Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya1127-32；und Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.19:67-70.Ullmann'sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)Bd.A27,VCH:Weinheim,S.89-90,S.521-540,S.540-547,S.559-566,575-581und S.581-587；Michal,G(1999)BiochemicalPathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology,John Wiley and Sons；Fallon,A.等(1987)Applications of HPLC in Biochemistry in:LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology,Bd.17.)
以下实施例仅用于说明本发明。对于本领域技术人员来说显而易见的许多可能的变化也落入本发明的范围内。
实施例部分：
A.材料
(1)酶类
脂肪酶：Novozym 435；Novozymes的商品；
固定化的南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B
氨基酸序列：
环化酶：Zm-SHC-1见下文
除非另有说明，否则重组蛋白质通过标准方法克隆和表达，例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989中所述。
(2)化学物
高法尼酸的异构体混合物例如通过2017年2月24日提交的欧洲专利申请号EP17157950.1中描述的方法获得。
已经从高法尼酸的异构体混合物制备了高法尼酸酯的异构体混合物(例如，根据通常已知的酸催化的羧酸与醇的酯化(所谓的Fischer酯化-Chemische Berichte 28,1895,3252-3258)。
所用的所有其它化学品均为实验室级。
A.方法：
1.用于分析高法尼酸化合物的HPLC参数
设备:Agilent Series 1100
柱:Chiralpak AD-RH 5μm 150*4,6mm von
洗脱剂：-A:水，含有0.1体积％H3PO4
-B:乙腈，含有0.1体积％H3PO4
时间(分钟) ％B 流速
0,0 30 1,2
25,0 70 1,2
30,0 100 1,2
30,1 30 1,2
检测器:UV-检测器λ＝205nm,BW＝5nm
流速:1,2ml/min
注射:5μL
温度:40℃
持续时间:35min
压力:约70bar
高法尼酸 酯 保留时间[min]
3Z,7E - 10,31
3E,7E - 11,73
3Z,7E 甲基酯 17,33
3E,7E 甲基酯 19,37
3Z,7E 乙基酯 18,87
3E,7E 乙基酯 21,28
3Z,7E 异丙基酯 20,06
3E,7E 异丙基酯 21,73
3Z,7E 丁基酯 23,25
3E,7E 丁基酯 26,24
3Z,7E 辛基酯 29,77
3E,7E 辛基酯 30,88
2.香紫苏内酯分析的GC参数
高法尼酸向香紫苏内酯的转化可通过以下GC系统确定：
柱:10m Optima 1
温度曲线:
0min:100℃
5℃/min至200℃
5min后
30℃/min至320℃
然后恒定
该方法的持续时间:30min
注射器温度:280℃
保留时间(RT):
高法尼酸:峰1在11.7min，峰2在12.1min；
香紫苏内酯:约13.5min
使用可靠材料(Sigma，目录号：358002)建立校准系列，借助于该校准系列确定未知样品的浓度。
2.脂肪酶活性检测
按照Beisson,F.等Eur.J.Lipid Sci.Technol.2000,133–153进行三丁酸甘油酯试验。
B.实施例:
参考实施例1:Zm-SHC-1的克隆和在大肠杆菌中的表达
可以借助寡核苷酸Zm-SHC_fw和Zm-SHC_rev从运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)扩增所述环化酶的基因。
在每种情况下，将100ng引物Zm-SHC_fw和Zm-SHC_rev以等摩尔比混合。使用来自运动发酵单胞菌(ATCC31821)的基因组DNA进行PCR，遵循生产商的说明，使用Pwo-聚合酶(Roche Applied Science)和以下温度梯度程序：95℃下3分钟；进行30个循环：在95℃下30秒，在50℃下30秒，在72℃下3分钟；72℃下10分钟；4℃下直到使用。通过琼脂糖凝胶电泳(1.2％电泳凝胶，Invitrogen)和柱色谱(GFX试剂盒，Amersham Pharmacia)分离PCR产物(～2.2kb)，随后测序(测序引物：Zm-SHC_fw和Zm-SHC_rev)。获得的序列与公布的序列匹配。
用限制性内切核酸酶NdeI和BamHI消化PCR产物，并连接到适当消化的载体pDHE19.2中[9]。对得到的质粒进行测序，得到SEQ ID NO:1所示的核酸序列。相应的氨基酸序列如下文所示/(SEQ ID NO:2):
将质粒pDHE-Zm-SHC-1转化到大肠杆菌TG10 pAgro4 pHSG575菌株中[Takeshita等,Gene 1987,61:63-74；Tomoyasu等,Mol Microbiol 2001,40:397-413]。该重组大肠杆菌命名为大肠杆菌LU15568。
参考实施例2:从运动发酵单胞菌提供重组的高法尼醇环化酶
从合适的2ml预培养物接种，大肠杆菌LU15568在37℃下在20ml LB-Amp/Spec/Cm(100μg/l氨苄青霉素；100μg/l壮观霉素；20μg/l氯霉素)、0.1mM IPTG、0.5g/l鼠李糖在100ml锥形瓶(带挡板)中生长16小时，在5000*g/10min下离心并在4℃下储存。通过将细胞沉淀物悬浮于15ml破碎缓冲液(0.2M Tris/HCl,0.5M EDTA,pH 8.0)、375U benzonase(例如Novagen，25U/μL)、40μL PMSF(100mM，溶于异丙醇)、0.8g蔗糖和约0.5毫克溶菌酶中来制备蛋白质提取物。将反应混合物混合并在冰上孵育30分钟。此后，将混合物在-20℃下冷冻。
在反应混合物解冻后，将其用蒸馏水补足至约40ml，再在冰上孵育30分钟。
此后，使用超声(HTU-Soni 130,来自G.Heinemann,振幅80％，15"脉冲/15"暂停)将细胞破坏3次，持续3分钟。破碎后，通过在4℃和26 900*g离心60分钟取出细胞碎片。弃去上清液，将沉淀重悬于100ml增溶缓冲液(50mM Tris/HCl,10mMMgCl2x6H2O,1％Triton X-100,pH 8.0)中，并在Potter中粉碎约5分钟。此后，将悬浮液在冰上保持30分钟。
将匀化的提取物在4℃和26900*g下再离心1小时，弃去沉淀。该提取物用于酶测定，并且可以在-20℃下储存数周而不会遭受活性损失。蛋白质含量在1mg/ml的范围内。
参考实施例3:来自大肠杆菌LU15568的重组环化酶的活性测定
将高法尼酸((3E,7E)-4,8,12-三甲基十三-3,7,11-三烯酸)与参考实施例2中所述的蛋白质制剂一起孵育。具体地，将0.0412g高法尼酸称重(反应混合物中20mM；纯度85.1％，由Z,Z 0.44％、E,Z 10.13％、E,E 74.93％组成)，移取2.913ml水；0.350ml柠檬酸钠缓冲液(1M柠檬酸钠pH 5.4)，0.560ml MgCl2(0.5M溶液)，并在37℃下搅拌混合物30分钟。加入大肠杆菌LU15568匀浆(蛋白质含量35mg/ml)以开始反应，温热至37℃。将反应混合物在磁力搅拌器上在油浴中在pH5.0下在37℃以最大搅拌速度搅拌24小时。在反应过程中使用0.5M HCl调节pH。孵育24小时后，通过用1000ml正庚烷/正丙醇3：2涡旋振荡30秒，从反应混合物中提取0.500ml。相分离后的有机上清液用于GC分析(参见图1)。
使用下文中更详细描述的分析，测定了来自E,E异构体的总共82.7％中74.5％的转化率。
实施例1:制备(3E,7E)-高法尼酸丁酯
将71g(283mmol)(3E,7E)-高法尼酸和(3Z,7E)-高法尼酸的摩尔比为56:44的混合物溶于360ml正庚烷中。加入21g(283mmol)正丁醇和470mg Novozym 435。将该混合物在23℃下搅拌48小时。通过过滤分离酶。在0℃的温度下，加入115ml甲醇和5ml水。通过在<10℃的温度下在搅拌中加入氢氧化钠水溶液(25％)将混合物的pH调节至pH＝12。
停止搅拌器，分离出下层相。除去溶剂后，得到43.5g(119mmol)高法尼酸丁酯，其(3E,7E)-含量>97％。
实施例2:在不存在溶剂的情况下，不同醇对高法尼酸的酶促酯化选择性的影响：
将2g(8mmol)(3E,7E)-高法尼酸和(3Z,7E)-高法尼酸的57:43混合物溶于15ml不同的醇中，并在23℃下在20mg Novozym 435存在下搅拌。在特定的时间间隔，通过HPLC分析反应混合物的组成。结果总结在随后的表1中。
表1：
实施例3：不同的醇和溶剂庚烷的组合对高法尼酸的酶促酯化选择性的影响
将2g(8mmol)(3E,7E)-高法尼酸和(3Z,7E)-高法尼酸的57:43混合物溶于15ml庚烷中。加入8mmol不同的醇和20mg Novozym 435，并将混合物在23℃下搅拌。在预定的时间间隔，通过HPLC分析反应混合物的组成。结果如表2所示。
表2:
实施例4：丁醇和不同溶剂的组合对高法尼酸的酶促酯化选择性的影响
将2g(8mmol)(3E,7E)-高法尼酸和(3Z,7E)-高法尼酸的57:43混合物溶于15ml不同溶剂中。加入8mmol丁醇和20mg Novozym 435，并将混合物在23℃下搅拌。在预定的时间间隔，通过HPLC分析反应混合物的组成。结果如表3所示。
表3:
实施例5：经酶促的酯裂解制备游离(3E,7E)-高法尼酸
将2g(7.56mmol)(3E,7E)-和(3Z,7E)-高法尼酸甲酯((3E,7E):(3Z,7E)＝51:49的比例)溶于50ml甲苯。加入10ml水和50mg Novozym 435。将该混合物在23℃下搅拌。6小时后，分析反应混合物的组成如下：
36％(3E,7E)-高法尼酸甲酯，
49％(3Z,7E)-高法尼酸甲酯，
15％(3E,7E)-高法尼酸，和
<0.1％(3Z,7E)-高法尼酸。
通过过滤除去酶，并用碳酸钠将反应混合物调节至pH>9。分离含水下层相。用酸(10％盐酸)将水相的pH调节至<4的值。然后用甲苯萃取该相。得到的甲苯相含有95％以上的纯(3E,7E)-高法尼酸。
序列:
SEQ ID NO:1-326多种SHC基因的核酸/氨基酸序列
SEQ ID NO:327-328PCR引物
SEQ ID NO:329,330脂肪酶CALB的核酸/氨基酸序列
此处明确地参考本文引用的参考文献。

Claims (19)

1.从包含所述羧酸化合物的3-(E)-和3-(Z)-异构体的异构体混合物中分离通式(I)的不饱和羧酸化合物的3-(E)-异构体的方法，其中所述异构体混合物经受脂肪酶(EC3.1.1.3)催化的酶促转化反应，该脂肪酶优选转化所述3-(E)-异构体，并将所述3-(E)-异构体的转化产物从所述反应混合物中分离，
其中
R1是H或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20烃基基团；
R3是H或C1-C4-烃基基团；
R2是直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-烃基基团；
条件是，如果R3是C1-C4-烃基基团，R2代表包含至少一个额外碳原子的烃基基团。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述脂肪酶来自假丝酵母属物种(Candida sp.)，特别是南极假丝酵母(Candida antarctica)。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述脂肪酶是南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)，其包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列或其突变体，所述突变体与SEQ ID NO:330具有至少60％的序列同一性并保留所述3-(E)-选择性。
4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转化反应包括式(Ia)的酸的酶促酯化反应；
其中
R2和R3如上文所定义；
且其中主要形成3-(E)-酯。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述转化反应包括式(Ib)的酯的酶促酯裂解反应；
其中
R1是H或直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-、特别是C4-C20-烃基基团；
且R2和R3如上文所定义；
且其中主要形成3-(E)-酸。
6.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转化反应在有机溶剂或水-有机溶剂中进行。
7.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述羧酸化合物是式(II)的3-(E)/7-(E)-高法尼酸化合物
其中R1如上文所定义。
8.制备通式(Ia)的不饱和3-(E)-羧酸的方法：
其中
R2和R3如上文所定义；
其中
a)将包含所述式(Ia)的羧酸的3-(E)-和3-(Z)-异构体的异构体混合物在式R1OH的链烷醇存在下进行酶促酯化反应，其中R1是直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-烃基基团；且在如权利要求1和2中之一所定义的脂肪酶存在下进行；
b)分离步骤a)中形成的所述3-(E)-羧酸酯，且
c)将步骤b)的所述分离的酯皂化为相应的式(Ia)的3-(E)-羧酸。
9.制备通式(Ia)的不饱和3-(E)-羧酸的方法：
其中
R2和R3如上文所定义；
其中
a)将异构体混合物，其包含式(Ib)的羧酸酯的3-(E)-和3-(Z)-异构体，在权利要求1和2中之一所定义的脂肪酶存在下进行酶促酯裂解反应，
其中
R1是直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-烃基基团；且
R2和R3如上文所定义；
b)分离步骤a)中形成的所述3-(E)-羧酸。
10.如权利要求8或9中所述的方法，其中应用如权利要求6中所定义的有机溶剂。
11.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不饱和羧酸的3-(E)-异构体是3-(E)/7-(E)-高法尼酸。
12.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述异构体混合物包括3-(E)/7-(E)-高法尼酸和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸的混合物；或式R1OH的链烷醇的3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸酯的混合物，其中R1是直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-烃基基团。
13.如权利要求12所述的制备3-(E)/7-(E)-高法尼酸的方法，
其中
a)将包含3-(E)/7-(E)-高法尼酸和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸的异构体混合物在式R1OH的链烷醇存在下进行酶促酯化反应，其中R1为直链或支链、饱和或不饱和的C1-C20-烃基基团；且在权利要求1和2中任一项所定义的脂肪酶存在下，在权利要求6中所定义的溶剂中进行；
b)将步骤a)中形成的所述3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯与未反应的酸分离，特别是通过蒸馏或优选萃取，且
c)将所述分离的3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯皂化为3-(E)/7-(E)-高法尼酸。
14.权利要求12中所述的制备3-(E)/7-(E)-高法尼酸的方法，
其中
a)将包含3-(E)/7-(E)-高法尼酸酯和3-(Z)/7-(E)-高法尼酸酯的异构体混合物进行酶促酯裂解反应，在如权利要求1和2中之一所定义的脂肪酶存在下，在权利要求6中所定义的溶剂中，且特别是在水存在下进行；且
b)将步骤a)中形成的3-(E)/7-(E)-高法尼酸与未反应的酯分离，特别是通过蒸馏或优选萃取。
15.式(III)的(-)-降龙涎香醚的制备方法
包括以下步骤：
a)通过应用权利要求1-14中任一项所定义的方法获得所述3-(E)/7-(E)-高法尼酸；
b)将3-(E)/7-(E)-高法尼酸化学还原为3-(E)/7-(E)-高法尼醇，且
c)将3-(E)/7-(E)-高法尼醇经酶促环化为(-)-降龙涎香醚。
16.式(III)的(-)-降龙涎香醚的制备方法
包括以下步骤：
a)通过应用权利要求1-14中任一项所定义的方法获得所述3-(E)/7-(E)-高法尼酸；
b)将3-(E)/7-(E)-高法尼酸经酶促环化为式(IV)的香紫苏内酯，
且
c)将所述香紫苏内酯化学转化为(-)-降龙涎香醚。
17.如权利要求15或16中所述的方法，其中该酶促环化是在分子内转移酶(E.C.5.4)，特别是高法尼酸环化酶(E.C.5.4.99.17)的存在下进行。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述环化酶来自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少60％序列同一性的氨基酸序列。
19.3-(E)/7-(E)-高法尼酸烷基酯，其中所述烷基选自C2-C10、特别是C3-C8-烷基。
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