JP7263244B2 - (3E,7E)-ホモファルネセン酸(homofarnesic acid)、または、(3E,7E)-ホモファルネセン酸エステルの製造のための方法 - Google Patents
(3E,7E)-ホモファルネセン酸(homofarnesic acid)、または、(3E,7E)-ホモファルネセン酸エステルの製造のための方法 Download PDFInfo
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Description
反対の情報がない場合、以下の一般的な定義を適用する。
- 反応の全過程もしくはそれらの前記合間の間に観察される3E-異性体のより高い最高収率、
- 基質の変換値の規定%での3E-異性体のより高い相対量、および/または
- 変換値のより高い%での3E-異性体の同一の相対量
に関して表現することができ、各々は、好ましくは、参照方法に対して観察され、前記参照方法は、化学的手段、例えば、化学的エステル化または化学的エステル開裂での別段の同一条件下で実施する。
%ee=[XA-XB]/[XA+XB]*100
(式中、XAおよびXBは、立体異性体AおよびBのモル比(モル分率(Molenbruch))を表す)
にしたがって算出した純粋な%eeパラメータを介して定量化し得る。
- メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、2-ブチル、イソブチル、またはtert-ブチルから選択されるC1-C4-アルキル基、
- 上記で定義されるC1-C4-アルキル基、ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロピルから選択されるC1-C6-アルキル基、
- 7~20個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状基であるC7-C20-アルキル基、その例は、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、およびこれらの構造異性体から選択され、例えば4,8-ジメチルノニルである。
本発明は、以下の特定の実施形態を提供する。
R1は、H、または直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和の、必要に応じて置換されているC1-C20ヒドロカルビル残基、好ましくは、飽和の非置換の直鎖状C1-C20ヒドロカルビル残基であり、
R3は、H、またはC1-C4-ヒドロカルビル残基、好ましくは、Hまたはメチルであり、
R2は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和の、必要に応じて置換されているC1-C20ヒドロカルビル残基、好ましくは不飽和の分枝鎖状C2-C16-ヒドロカルビル残基であるが、
但し、R3がC1-C4-ヒドロカルビル残基である場合、R2は少なくとも1つの追加の炭素原子を含有するヒドロカルビル残基を表す)、
の不飽和カルボン酸化合物の3-(E)-異性体を、前記カルボン酸化合物の3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体の混合物から単離するための方法であって、
異性体の前記混合物をリパーゼ(E.C. 3.1.1.3)で触媒された酵素変換反応にかけ、前記リパーゼは前記3-(E)-異性体を優先的に、特に立体選択的に変換し、前記3-(E)-異性体の変換生成物を前記反応混合物から単離する、方法。
R2およびR3は、上記で定義される通りである)
の酸の酵素エステル化反応を含み、
3-(E)-エステルが主に形成され、脂肪族アルカノールR1OH(式中、R1は上記で定義される通りであり、好ましくは直鎖状または分枝状の飽和C1-C20アルキル、好ましくはC1-C4アルキル残基である)が、必要に応じてリパーゼ活性を妨害または阻害さえしない有機溶媒の存在下である、
実施形態1から6のいずれか1つに記載の方法。
R1は、H、または直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和C1-C20-、特にC4-C20-ヒドロカルビル残基であり、
R2およびR3は、上記で定義される通りである)
のエステルの酵素エステル開裂反応を含み、
3-(E)-酸が主に形成され、反応が、水の存在下で、必要に応じてリパーゼ活性を妨害または阻害さえしない有機溶媒の存在下で、実施される、
実施形態1から6のいずれか1つに記載の方法。
R2およびR3は、上記で定義される通りである)
の不飽和3-(E)-カルボン酸を製造する方法であって、
a)式(Ia)の前記カルボン酸の3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体混合物を、式R1OH(式中、R1は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C1-C20ヒドロカルビル残基、好ましくは直鎖状または分枝状の飽和C1-C20アルキル、好ましくはC1-C4アルキル残基である)のアルカノールの存在下で、および実施形態1から6のいずれか1つに記載のリパーゼ酵素の存在下で、酵素エステル化反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)-カルボン酸エステルを、例えば、(酸塩として)未反応酸異性体を水相に移送することによって、および、変換の間に存在したか、またはその後添加したかのいずれかの有機溶媒を用いてエステルを回収することによって、単離し、ならびに
c)ステップb)の前記単離されたエステルを、式(Ia)の対応する3-(E)-カルボン酸にけん化する、
方法。
R2およびR3は、上記で定義される通りである)
の不飽和3-(E)-カルボン酸を製造する方法であって、
a)式(Ib)
R1は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C1-C20ヒドロカルビル残基、好ましくは直鎖状または分枝状の飽和C1-C20アルキル、好ましくはC1-C4アルキル残基であり、
R2およびR3は、上記で定義される通りである)
のカルボン酸エステルの3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体混合物を、実施形態1から6のいずれか1つに記載のリパーゼ酵素の存在下で、好ましくは水と必要に応じて有機溶媒の存在下で、酵素エステル開裂反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)-カルボン酸エステルを、好ましくは反応混合物の水相由来の遊離酸として、単離する
方法。
b)ステップa)で形成される前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを、未反応酸(特に、3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸)から、特に蒸留、または好ましくは抽出によって分離し、
c)単離された前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸にけん化する、
3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を製造するための、実施形態16に記載の方法。
b)ステップa)で形成される前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を、未反応エステル(特に、3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステル)から、特に蒸留、または好ましくは抽出によって分離する、
3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を製造するための、実施形態16に記載の方法。
a)実施形態1から18のいずれか一項に記載の方法を適用することによって、前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を得るステップ、
b)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を3-(E)/7-(E)-ホモファルネソールに化学還元するステップ、および
c)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソールを(-)-アンブロックスに酵素的に環化させるステップ
を含む、方法。
a)実施形態1から18のいずれか一項に記載の方法を適用することによって、前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を得るステップ、
b)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を式(IV)
および
c)前記スクラレオリドを(-)-アンブロックスに化学的に変換するステップ
を含む、方法。
本発明は、具体的に開示されたリパーゼおよびシクラーゼの使用に限定されないだけでなく、その機能的等価物にも拡張される。
本発明はまた、本明細書に記載の酵素および突然変異体をコードする核酸配列に関する。
複数のアラインメントパラメータ:
ギャップオープニングペナルティ 10
ギャップ伸長ペナルティ 10
ギャップ分離ペナルティ範囲 8
ギャップ分離ペナルティ オフ
アラインメント遅延のための同一性% 40
残基特異的ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
遷移加重 0
ペアワイズアラインメントパラメータ:
FASTアルゴリズム オン
K-タプルサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウィンドウサイズ 5
最良斜線数 5
DNAギャップオープンペナルティ 15.0
DNAギャップ伸長ペナルティ 6.66
DNAマトリックス 同一性
タンパク質ギャップオープンペナルティ 10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP -1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
本発明はまた、調節ヌクレオチド配列の遺伝子制御下で、本発明によるポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する発現構築物、ならびにこれらの発現構築物のうちの少なくとも1つを含むベクターに関する。
文脈に応じて、用語「微生物」とは、本発明による出発微生物(野生型)または遺伝的に改変された微生物、またはその両方を意味する。
本発明はまた、前記酵素を発現する微生物を培養し、培養物から所望の生成物を単離することによる、本発明による方法で使用される酵素の製造のための方法に関する。
本発明の方法の間に、または、上記の本明細書で定義される複数ステップの方法の個別のステップの間に存在する少なくとも1つの酵素は、天然もしくは組換えで1つまたは複数の酵素を生成する生細胞、収穫された細胞、死細胞、透過性化細胞、細胞粗抽出物、精製抽出物、または、本質的に純粋もしくは完全に純粋な形態において存在することができる。少なくとも1つの酵素は、溶液中に、または、担体上に固定された酵素として存在し得る。1つまたはいくつかの酵素は、同時に、可溶性および固定化形態で存在し得る。
好ましい実施形態において、特に(3E,7E)-および(3Z,7E)-ホモファルネシル酸のような3-不飽和カルボン酸の(3E/Z)異性体、脂肪族アルコール、必要に応じて有機溶媒の混合物を、エステル化反応を実施するためにリパーゼ酵素と処置する。
別の実施形態において、異性体の分離型混合物は、3-不飽和カルボン酸の3E/Z-異性体混合物、特にホモファルネシル酸アルキルエステルの(3E,7E)-および(3Z,7E)-異性体の混合物の酵素触媒されるエステル開裂を適用することによって得られる。反応において、遊離3E-酸、特に(3E,7E)-ホモファルネシル酸異性体、および未反応3Zエステル、特に未反応(3Z,7E)-ホモファルネシル酸エステルを得られる。
調製は、上記のスキーム1に図示されている公知の方法を適用することによって、本発明にしたがって得られる立体異性的に純粋な(3E/7E)ホモファルネシル酸から出発して実施し得る。
本発明の方法は、最終または中間体生成物を、必要に応じて立体異性的または鏡像体的に実質的に純粋な形態において、回収するステップをさらに含むことができる。用語「回収すること」は、培養物または反応媒体から化合物を抽出すること、収獲すること、単離すること、または精製することを含む。化合物の回収を、限定されるものではないが、従来の樹脂(例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など)による処理、従来の吸着剤(例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど)による処理、pHの変化、溶媒抽出(例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒を用いる)、蒸留、透析、濾過、濃縮、結晶化、再結晶化、pH調整、凍結乾燥などの当業界で公知の任意の従来の単離または精製方法にしたがって実施することができる。
ホモファルネシル酸の異性体混合物を、例えば、2017年2月24日出願の欧州特許出願、出願番号EP 17157950.1に記載される方法によって得る。
1. ホモファルネシル酸化合物の分析のためのHPLCパラメータ
装置:Agilent Series 1100
カラム:Daicel(登録商標)のキラルパックAD-RH 5μm 150*4、6mm
溶出:-A:0.1Vol%のH3PO4を含む水
-B:0.1Vol%のH3PO4を含むアセトニトリル
ホモファルネシル酸のスクラレオリドへの変換を、以下のGC系で決定することができる。
カラム:10M Optima 1
温度プロファイル:0分:100℃
5℃/分で200℃まで
5分後
30℃/分で320℃まで
その後、一定
方法の期間:30分
インジェクター温度:280℃
保持時間(RT):ホモファルネシル酸:11.7分でピーク1、12.1分でピーク2
スクラレオリド:およそ13.5分
Beisson, F.ら、Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000, 133-153によるトリブチリンアッセイ
参照例1:Zm-SHC-1のクローン化および大腸菌の発現
シクラーゼの遺伝子を、オリゴヌクレオチドZm-SHC_fwおよびZm-SHC_revによって、ザイモモナス・モビリスから増幅し得る。
好適な2mlの前培養物から接種して、大腸菌LU15568を、100mlの(バッフルを伴う)エルレンマイヤーフラスコ内の20mlのLB-Amp/Spec/Cm(100μg/lのアンピシリン、100μg/lのスペクチノマイシン、20μg/lのクロラムフェニコール)、0.1mMのIPTG、0.5 g/lのラムノース中で、37℃で16時間増殖し、5000*g/10分で遠心分離し、4℃で保管した。タンパク質抽出物を、15 mlの破壊バッファー(0.2MのTris/HCl、0.5MのEDTA、pH8.0)、375Uのベンゾナーゼ(例えばNovagen、25U/μL)、40μLのPMSF(100mM、i-PropOH中に溶解)、0.8gのスクロース、および、およそ0.5mgのリゾチーム中に細胞ペレットを縣濁することによって調製した。反応混合物を混合して、氷で30分間インキュベートした。その後、混合物を-20℃で凍結した。
ホモファルネシル酸((3E,7E)-4,8,12-トリメチルトリデカ-3,7,11-トリエン酸を、参照例2に記載のタンパク質調製法でインキュベートした。具体的には、0.0412gのホモファルネシル酸を計量し(反応混合物中に20mM、Z,Z 0.44%、E,Z 10.13%、E,E 74.93%から構成される純度85.1%)、2.913mlの水、0.350mlのクエン酸ナトリウムバッファー(1Mのクエン酸ナトリウム、pH5.4)、0.560mlのMgCl2(0.5M溶液)をピペットで入れ、混合物を撹拌しながら37℃で30分間加温した。反応を、大腸菌LU15568ホモジネート(タンパク質含有量35mg/ml)を添加することで開始し、37℃まで加温した。反応混合物を、油浴中の磁気撹拌器上で、pH5.0で24時間、37℃での最高撹拌速度で撹拌した。0.5MのHClを使用して反応の間、pHを調節した。24時間のインキュベーションの後、反応混合物からの0.500mlを、1000mlのn-ヘプタン/n-プロパノール3:2で30分間ボルテックスすることによって抽出した。相分離の後の有機上清をGC分析で使用した(図1を参照のこと)。
56:44のモル比での71g(283mmol)の(3E,7E)-ホモファルネシル酸および(3Z,7E)-ホモファルネシル酸の混合物を、360mlのn-ヘプタンに溶解した。21g(283mmol)のn-ブタノールおよび470mgのNovozym435を添加した。混合物を23℃で48時間撹拌した。酵素を濾過で分離した。0℃の温度で、115mlのメタノールおよび5mlの水を添加した。水酸化ナトリウム水溶液(25%)を、10℃未満の温度で撹拌しながら添加することによって、混合物のpHをpH=12に調節した。
2g(8mmol)の(3E,7E)-ホモファルネシル酸および(3Z,7E)-ホモファルネシル酸の57:43混合物を、15mlの異なるアルコールに溶解し、20mgのNovozym435の存在下で、23℃で撹拌した。特定の時間間隔で、反応混合物の組成物を、HPLCで分析した。結果を以下の表1にまとめる。
2g(8mmol)の(3E,7E)-ホモファルネシル酸および(3Z,7E)-ホモファルネシル酸の57:43混合物を、15mlのヘプタンに溶解した。8mmolの異なるアルコールおよび20mgのNovozym435を添加し、混合物を23℃で撹拌した。所定時間間隔で、反応混合物の組成物を、HPLCにより分析した。結果を表2に示す。
2g(8mmol)の(3E,7E)-ホモファルネシル酸および(3Z,7E)-ホモファルネシル酸の57:43混合物を、15mlの異なる溶媒に溶解した。8mmolのブタノールおよび20mgのNovozym435を添加し、混合物を23℃で撹拌した。所定時間間隔で、反応混合物の組成物を、HPLCにより分析した。結果を表3に示す。
2g(7.56mmol)の(3E,7E)-および(3Z,7E)-ホモファルネシル酸メチルエステル((3E,7E):(3Z,7E)=51:49の比)を、50mlのトルエンに溶解した。10mlの水および50mgのNovozym435を添加した。混合物を23℃で撹拌した。6時間後、反応混合物の組成物を分析して、以下の通りであった:
36% (3E,7E)-ホモファルネシル酸メチルエステル
49% (3Z,7E)-ホモファルネシル酸メチルエステル
15% (3E,7E)-ホモファルネシル酸、および
0.1%未満 (3Z,7E)-ホモファルネシル酸。
配列番号1~326 様々なSHC遺伝子の核酸/アミノ酸配列
配列番号327~328 PCRプライマー
配列番号329、330 リパーゼCALBの核酸/アミノ酸配列
本発明は、以下の実施形態を包含する。
(実施形態1)
一般式(I)
R 1 は、H、または直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和C 1 -C 20 ヒドロカルビル残基であり、
R 3 は、H、またはC 1 -C 4 -ヒドロカルビル残基であり、
R 2 は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C 1 -C 20 ヒドロカルビル残基であるが、
但し、R 3 がC 1 -C 4 -ヒドロカルビル残基である場合、R 2 は少なくとも1つの追加の炭素原子を含有するヒドロカルビル残基を表す)、
の不飽和カルボン酸化合物の3-(E)-異性体を、前記カルボン酸化合物の3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体の混合物から単離するための方法であって、
異性体の前記混合物をリパーゼ(E.C. 3.1.1.3)で触媒された酵素変換反応にかけ、前記リパーゼは前記3-(E)-異性体を優先的に変換し、前記3-(E)-異性体の変換生成物を前記反応混合物から単離する、方法。
(実施形態2)
前記リパーゼが、カンジダ属の種、特にカンジダ・アンタークチカに由来する、実施形態1に記載の方法。
(実施形態3)
前記リパーゼが、配列番号330のアミノ酸配列を含むカンジダ・アンタークチカ リパーゼB(CALB)、または配列番号330に対する少なくとも60%の配列同一性を有し、前記3-(E)-選択性を保持するその突然変異体である、実施形態2に記載の方法。
(実施形態4)
前記変換反応が、式(Ia):
R 2 およびR 3 は、上記で定義される通りである)
の酸の酵素エステル化反応を含み、
3-(E)-エステルが主に形成される、実施形態1から3のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態5)
前記変換反応が、式(Ib)
R 1 は、H、または直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和のC 1 -C 20 -、特にC 4 -C 20 -ヒドロカルビル残基であり、
R 2 およびR 3 は、上記で定義される通りである)
のエステルの酵素エステル開裂反応を含み、
3-(E)-酸が主に形成される、実施形態1から3のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態6)
前記変換反応が、有機溶媒または水性有機溶媒において実施される、実施形態1から5のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態7)
前記カルボン酸化合物が、式(II)
の3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸化合物である、実施形態1から6のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態8)
一般式(Ia):
R 2 およびR 3 は、上記で定義される通りである)
の不飽和3-(E)-カルボン酸を製造する方法であって、
a)式(Ia)の前記カルボン酸の3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体混合物を、式R 1 OH(式中、R 1 は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C 1 -C 20 ヒドロカルビル残基である)のアルカノールの存在下で、および実施形態1または2に記載のリパーゼ酵素の存在下で、酵素エステル化反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)-カルボン酸エステルを単離し、
c)ステップb)の前記単離されたエステルを、式(Ia)の対応する3-(E)-カルボン酸にけん化する、方法。
(実施形態9)
一般式(Ia):
R 2 およびR 3 は、上記で定義される通りである)
の不飽和3-(E)-カルボン酸を製造する方法であって、
a)式(Ib)
R 1 は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C 1 -C 20 -ヒドロカルビル残基であり、
R 2 およびR 3 は、上記で定義される通りである)
のカルボン酸エステルの3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体混合物を、実施形態1または2に記載のリパーゼ酵素の存在下で、酵素エステル開裂反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)-カルボン酸を単離する、方法。
(実施形態10)
実施形態6に記載の有機溶媒が適用される、実施形態8または9に記載の方法。
(実施形態11)
不飽和カルボン酸の前記3-(E)-異性体が、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸である、実施形態1から10のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態12)
前記異性体混合物が、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸および3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸の混合物、または式R 1 OH(式中、R 1 は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C 1 -C 20 ヒドロカルビル残基である)のアルカノールの3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルおよび3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルの混合物を含む、実施形態1から11のいずれか一項に記載の方法。
(実施形態13)
a)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸および3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を含む異性体混合物を、式R 1 OH(式中、R 1 は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C 1 -C 20 ヒドロカルビル残基である)のアルカノールの存在下で、および実施形態6に記載の溶媒中の実施形態1または2に記載のリパーゼ酵素の存在下で、酵素エステル化反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを、未反応酸から、特に蒸留、または好ましくは抽出によって分離し、
c)単離された前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸にけん化する、
3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を製造するための、実施形態12に記載の方法。
(実施形態14)
a)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルおよび3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを含む異性体混合物を、実施形態6に記載の溶媒中の実施形態1または2に記載のリパーゼ酵素の存在下で、および特に水の存在下で、酵素エステル開裂反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を、未反応エステルから、特に蒸留、または、好ましくは抽出によって分離する、
3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を製造するための、実施形態12に記載の方法。
(実施形態15)
式(III)
a)実施形態1から14のいずれか一項に記載の方法を適用することによって、前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を得るステップ、
b)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を3-(E)/7-(E)-ホモファルネソールに化学還元するステップ、および
c)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソールを(-)-アンブロックスに酵素的に環化させるステップを含む、方法。
(実施形態16)
式(III)
a)実施形態1から14のいずれか一項に記載の方法を適用することによって、前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を得るステップ、
b)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を式(IV)
および
c)前記スクラレオリドを(-)-アンブロックスに化学的に変換するステップ
を含む、方法。
(実施形態17)
酵素環化が、分子内トランスフェラーゼ(E.C. 5.4)、特にホモファルネソイン酸シクラーゼ(E.C. 5.4.99.17)の存在下で実施される、実施形態15または16に記載の方法。
(実施形態18)
前記シクラーゼが、ザイモモナス・モビリス由来であって、配列番号2によるアミノ酸配列または配列番号2に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態17に記載の方法。
(実施形態19)
アルキル基が、C 2 -C 10 、特にC 3 -C 8 -アルキルから選択される、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸アルキルエステル。
Claims (18)
- 一般式(I)
R1は、H、または直鎖状もしくは分枝状の飽和もしくは不飽和C1-C20ヒドロカルビル残基であり、
R3は、H、またはC1-C4-ヒドロカルビル残基であり、
R2は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C1-C20ヒドロカルビル残基であるが、
但し、R3がC1-C4-ヒドロカルビル残基である場合、R2 の炭素数はR 3 の炭素数よりも少なくとも1つ多い)、
の不飽和カルボン酸化合物の3-(E)-異性体を、前記カルボン酸化合物の3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体の混合物から単離するための方法であって、
異性体の前記混合物をリパーゼ(E.C. 3.1.1.3)で触媒された酵素変換反応にかけ、前記リパーゼは前記3-(E)-異性体を優先的に変換し、前記3-(E)-異性体の変換生成物を前記反応混合物から単離し、
前記リパーゼが、配列番号330のアミノ酸配列を含むカンジダ・アンタークチカ リパーゼB(CALB)、または配列番号330に対する少なくとも90%の配列同一性を有し、前記3-(E)-選択性を保持するその突然変異体である、方法。 - 前記リパーゼが、カンジダ属の種、特にカンジダ・アンタークチカに由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記リパーゼが、配列番号330のアミノ酸配列を含むカンジダ・アンタークチカ リパーゼB(CALB)である、請求項2に記載の方法。
- 前記変換反応が、有機溶媒または水性有機溶媒において実施される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 一般式(Ia):
R2およびR3は、上記で定義される通りである)
の不飽和3-(E)-カルボン酸を製造する方法であって、
a)式(Ia)の前記カルボン酸の3-(E)-および3-(Z)-異性体を含む異性体混合物を、式R1OH(式中、R1は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C1-C20ヒドロカルビル残基である)のアルカノールの存在下で、および請求項1または2に記載のリパーゼ酵素の存在下で、酵素エステル化反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)-カルボン酸エステルを単離し、
c)ステップb)の前記単離されたエステルを、式(Ia)の対応する3-(E)-カルボン酸にけん化する、方法。 - 請求項6に記載の有機溶媒が適用される、請求項8または9に記載の方法。
- 不飽和カルボン酸の前記3-(E)-異性体が、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異性体混合物が、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸および3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸の混合物、または式R1OH(式中、R1は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C1-C20ヒドロカルビル残基である)のアルカノールの3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルおよび3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルの混合物を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- a)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸および3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を含む異性体混合物を、式R1OH(式中、R1は、直鎖状または分枝状の飽和または不飽和C1-C20ヒドロカルビル残基である)のアルカノールの存在下で、および請求項6に記載の溶媒中の請求項1または2に記載のリパーゼ酵素の存在下で、酵素エステル化反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを、未反応酸から、特に蒸留、または好ましくは抽出によって分離し、
c)単離された前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを、3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸にけん化する、
3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を製造するための、請求項12に記載の方法。 - a)3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルおよび3-(Z)/7-(E)-ホモファルネソイン酸エステルを含む異性体混合物を、請求項6に記載の溶媒中の請求項1または2に記載のリパーゼ酵素の存在下で、および特に水の存在下で、酵素エステル開裂反応にかけ、
b)ステップa)で形成される前記3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を、未反応エステルから、特に蒸留、または、好ましくは抽出によって分離する、
3-(E)/7-(E)-ホモファルネソイン酸を製造するための、請求項12に記載の方法。 - 酵素環化が、分子内トランスフェラーゼ(E.C. 5.4)、特にホモファルネソイン酸シクラーゼ活性を示すスクアレン-ホペンシクラーゼ(E.C. 5.4.99.17)の存在下で実施される、請求項15または16に記載の方法。
- 前記シクラーゼが、ザイモモナス・モビリス由来であって、配列番号2によるアミノ酸配列または配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の方法。
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