JP2022539510A - テルペン化合物の制御された分解のための生体触媒法 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、例えばアンブロックスなどの香水成分の製造のための出発物質として有用なテルペン分解生成物を製造する生体触媒法が提供される。特に、線状または環状のテルペン基質の制御された段階的な変換および分解を可能にする新規なタイプの完全に酵素的な多段階分解経路に適用することができる、新規なテルペン分解ポリペプチド（エナール開裂ポリペプチド）およびテルペン化合物を酸素化誘導体に変換する新規なペプチド（オキシゲナーゼ）ならびにそれらに由来する変異体およびバリアントが提供される。前述の新規な生合成戦略により、例えばマノオールオキシまたはγアンブロールのような価値あるテルペン由来の化合物を完全に生化学的に合成することが可能になる。本発明はまた、酵素的な変換および分解のステップの組み合わせを触媒するのに必要な一連の酵素の機能的な発現のために必須の一連の遺伝情報を有する組換え宿主生物を提供する。

Description

本明細書では、例えばアンブロックス（ambrox）などの香水成分の製造のための出発物質として有用なテルペン分解生成物を製造する生体触媒法が提供される。特に、線状または環状のテルペン基質の制御された段階的な変換および分解を可能にする新規なタイプの完全に酵素的な多段階分解経路に適用することができる、新規なテルペン分解ポリペプチド（エナール開裂ポリペプチド）およびテルペン化合物を酸素化誘導体に変換する新規なペプチド（オキシゲナーゼ）ならびにそれらに由来する変異体およびバリアントが提供される。前述の新規な生合成戦略により、例えばマノオールオキシ（manooloxy）またはγアンブロール（gamma ambrol）のような価値あるテルペン由来の化合物を完全に生化学的に合成することが可能になる。本発明はまた、酵素的な変換および分解のステップの組み合わせを触媒するのに必要な一連の酵素の機能的な発現のために必須の一連の遺伝情報を有する組換え宿主生物を提供する。
発明の背景
テルペン類は、ほとんどの生物（微生物、動物および植物）に見出される。これらの化合物は、炭素数５の単位、いわゆるイソプレン単位で構成されており、イソプレン構造に存在するこれらの単位の数によって分類される。したがって、ヘミテルペン類、モノテルペン類、セスキテルペン類およびジテルペン類は、それぞれ５個、１０個、１５個および２０個の炭素原子（すなわち、１個、２個、３個および４個のイソプレン単位）を含有するテルペン類である。例えば、セスキテルペンは、植物界に広く存在する。多くのセスキテルペン分子は、それらのフレーバーおよびフレグランスの特性、ならびに化粧品、医薬品および抗菌性の作用で知られている。数多くのセスキテルペン炭化水素およびセスキテルペノイドが同定されている。
テルペン類の生合成による製造には、テルペン合成酵素と呼ばれる酵素が関与している。これらの酵素は、非環状テルペン前駆体を１種以上のテルペン生成物に変換する。特に、ジテルペン合成酵素は、前駆体であるゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を環化してジテルペン類を生成する。ＧＧＰＰの環化反応では、多くの場合、２つの酵素ポリペプチド、すなわちＩ型およびＩＩ型のジテルペン合成酵素が、２つの連続した酵素反応において組み合わせて機能する必要がある。ＩＩ型のジテルペン合成酵素は、ＧＧＰＰの末端二重結合のプロトン化によって開始されるＧＧＰＰの環化／転位を触媒し、環状のジテルペン二リン酸中間体をもたらす。次いで、この中間体は、イオン化開始環化を触媒するＩ型のジテルペン合成酵素によってさらに変換される。
ジテルペン合成酵素は、植物または他の生物に存在し、ＧＧＰＰなどの基質を使用するが、異なる生成物プロファイルを有する。ジテルペン合成酵素をコードする遺伝子およびｃＤＮＡがクローニングされ、対応する組換え酵素の特性が明らかにされている。
テルペン二リン酸中間体、特にジテルペン類のコパリル二リン酸（ＣＰＰ）またはラブダンジオール二リン酸（ＬＰＰ）のような環状テルペン二リン酸中間体からの二リン酸基の特異的もしくは優先的な開裂または除去を触媒する酵素は、最近になって、先の欧州特許出願に記載されている（ＥＰ出願番号１８１８２７８３．３）。前述の酵素によって、テルペン二リン酸の数または炭素原子は変化しない。
しかしながら、非環状もしくは環状のセスキテルペン類またはジテルペン類などのテルペン前駆体の分解生成物とみなされ得るテルペン由来の化合物が必要であり、これらの化合物はさらに化学的および／または酵素的に最終生成物に変換され得、例えば香料成分として適用される。
本発明が解決すべき課題は、酵素的なテルペン分解活性を示すポリペプチドまたはそのようなテルペン類を分解可能な誘導体に変換するポリペプチドを提供することである。
本発明が解決すべき別の課題は、定義されたテルペン分解生成物を生成するための新規な完全生体触媒分解経路を確立することである。
発明の概要
驚くべきことに、上述の課題は、炭素原子２個分が特異的に短縮されたカルボニル官能基化されたテルペン化合物とそれぞれの生体触媒プロセスとを初めて可能にするエナール開裂活性を有する新しいクラスのポリペプチドを提供することによって解決することができた。例えば、この新規なクラスの酵素により、ジテルペン炭素骨格を含みかつ末端のアルデヒド基を有するラブダン型化合物であるコパラール（copalal）を、炭素原子２個分が短縮された、すなわち炭素原子１８個で構成された炭素骨格を維持する、それぞれのジノル－ラブダン型化合物であるマノオールオキシに変換することが可能になる。
驚くべきことに、テルペン化合物のエステル類への特異的な酸化（バイヤー・ビリガー酸化）とそれぞれの生体触媒プロセスとを可能にするバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）活性を有する新しいクラスのポリペプチドを提供することによって、代替アプローチにおける上述の課題も解決することができた。例えば、新規なクラスのＢＶＭＯにより、ジテルペン炭素骨格を有しかつ末端のアルデヒド基を有するラブダン型化合物であるコパラールを、それぞれのノルラブダン型ホルメートエステルに変換することが可能になる。前述のバイヤー・ビリガー酸化によって、ラブダン型化合物は、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのノルラブダンに容易に変換され得る。このステップでは、結果的に炭素原子１個分が短縮される。末端のアルデヒド基が末端のケト基で置き換えられている場合、同じ手法での短縮ではあるが、今度は１つ以上のカーボナート分の短縮が可能である。ＢＶＭＯ触媒による酸素化ステップとエステラーゼ触媒による開裂ステップとの組み合わせの反復により、テルペン分子の炭化水素鎖を段階的に短縮することが可能になる。
上記のエナール開裂酵素およびＢＶＭＯ酵素によって触媒される分解ステップを組み合わせることにより、より多くの種類のカルボニル官能基化された化合物、特に環状もしくは非環状のテルペン類またはテルペノイド類に適用することができる、全く新しい生化学的分解経路の構築が可能になる。
前述の生体触媒ステップは、他のいくつかの先行する（上流の）または連続する（下流の）酵素ステップと結合してもよく、テルペン分子のそれぞれの前駆体から多数の価値ある複雑なテルペン分子を完全に酵素的に合成するための生体触媒多段階プロセスの提供が可能になる。
後続のスキームは、ラブダン型アルデヒドのコパラールをマノオールオキシに分解することを可能にする本発明の２つの代替経路（「エナール開裂ポリペプチド経路」および「ＢＭＶＯ経路」）の２つの特定の実施形態を示しており、これらの経路は、本明細書の後続のセクションでより詳細に説明されている。このスキームはまた、更なるＢＭＶＯベースの分解ステップを適用することによって、マノオールオキシをγ－アンブロールに分解することを示している。
Figure 2022539510000001
前述の例示された反応シーケンスと完全に類似して、この基本的な生合成戦略は、コパロールの他の任意の異性体または他の任意のラブダン型アルデヒドに適用され得、マノオールオキシ、γ－アンブリルアセテート、γ－アンブロールの構造的に関連した異性体を提供し得る。
また、以下でより詳述されるように、構造的に異なる単環式または非環式のカルボニル化合物に適用され得る。
メバロン酸経路酵素をコードする遺伝子の染色体への組込みと、２つの合成遺伝子オペロンの構成を概略的に示す図である（S. pneumoniae（肺炎レンサ球菌）由来のメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子「ｍｖａＫ１」；S. pneumoniae由来のホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子「ｍｖａＤ」；S. pneumoniae由来のホスホメバロン酸キナーゼをコードする遺伝子「ｍｖａＫ２」；S. pneumoniaeｅ由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子「ｆｎｉ」； S. aureus（黄色ブドウ球菌）由来のＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素をコードする遺伝子「ｍｖａＡ」；S. aureus由来のＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子「ｍｖａＳ」；大腸菌由来のアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼをコードする遺伝子「ａｔｏＢ」；S. cerevisiae（出芽酵母）由来のＦＰＰ合成酵素をコードする遺伝子「ＥＲＧ２０」）。 全細胞バイオコンバージョンアッセイにおけるＢＶＭＯを用いたマノオールオキシのγ－アンブリルアセテートへの変換であって、異なるＢＶＭＯ：ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１によるマノオールオキシのバイオコンバージョン中に形成された生成物のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、マノオールオキシのＧＣ－ＭＳ分析を示し、下段のクロマトグラムは、組換えＢＶＭＯを発現していないコントール細胞を用いたバイオコンバージョンのＧＣ－ＭＳ分析を示す。 全細胞バイオコンバージョンアッセイにおけるＢＶＭＯを用いたコパラールの変換であって、異なるＢＶＭＯ：ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１によるシス－コパラールおよびトランス－コパラールのバイオコンバージョン中に形成された生成物（実験部分に記載した化合物３ａ，３ｂ，４ａ，４ｂ）のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、組換えＢＶＭＯを発現していないコントロール細胞を用いたバイオコンバージョンのＧＣ－ＭＳ分析を示す。 全細胞バイオコンバージョンアッセイにおけるＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１を用いたコパラールの変換のキネティックであって、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１によるシス－コパラールおよびトランス－コパラールのバイオコンバージョン中に形成された生成物（実験部分に記載した化合物１ａ，１ｂ，３ａ，３ｂ，４ａ，４ｂ）の０、１８および４２時間のインキュベーション後のＧＣ－ＭＳ分析を示す図である。 ＢＶＭＯを用いたマノオールオキシのインビトロ変換を示す図であり、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１によるマノオールオキシの変換のＧＣ－ＭＳ分析では、γ－アンブロールアセテートの形成が示され、上段のクロマトグラムは、組換えＢＶＭＯを含まないコントロールタンパク質を用いた変換のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＢＶＭＯおよびエステラーゼを用いたマノオールオキシのインビトロ変換を示す図であり、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２３－ＥＳＴおよびＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１とＳＣＨ２３－ＥＳＴとの組み合わせによるマノオールオキシの変換のＧＣ－ＭＳ分析では、γ－アンブロールの形成が示され、上段のクロマトグラムは、組換え酵素を含まないコントロールタンパク質を用いた変換のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＢＶＭＯおよびエステラーゼを用いたマノオールオキシのインビトロ変換を示す図であり、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＥＳＴおよびＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１とＳＣＨ２４－ＥＳＴとの組み合わせによるマノオールオキシの変換のＧＣ－ＭＳ分析では、γ－アンブロールの形成が示され、上段のクロマトグラムは、組換え酵素を含まないコントロールタンパク質を用いた変換のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 エステラーゼを用いた化合物４ａおよび４ｂの化合物５ａおよび５ｂへのインビトロ変換を示す図であり、ＳＣＨ２３－ＥＳＴ１、ＳＣＨ２４－ＥＳＴ１およびＳＣＨ２５－ＥＳＴ１による化合物４ａおよび４ｂのインビトロ変換のＧＣ－ＭＳ分析では、化合物５ａおよび５ｂの形成が示される。 ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびエステラーゼを用いたコパラールの化合物５ａおよび５ｂへのインビトロ変換を示す図であり、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯと、ＳＣＨ２３－ＥＳＴ１、ＳＣＨ２４－ＥＳＴ１およびＳＣＨ２５－ＥＳＴ１との組み合わせによるシス－コパラールおよびトランス－コパラールのインビトロ変換のＧＣ－ＭＳ分析では、化合物５ａおよび５ｂの形成が示され、＊の印を付け、保持時間１１．９５分のピークは、γ－アンブリルアセテートに対応し、ＢＶＭＯ単独でインキュベートしたサンプルでこの化合物が観察されたのは、これらのアッセイで使用したコパラールの混合物に少量のマノオールオキシが存在していたためである。 ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびエステラーゼを用いたコパラールの化合物５ａおよび５ｂへのインビトロ変換を示す図であり、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯと、ＳＣＨ２３－ＥＳＴ１およびＳＣＨ２５－ＥＳＴ１との組み合わせによるシス－コパラールおよびトランス－コパラールのインビトロ変換のＧＣ－ＭＳ分析では、化合物５ａおよび５ｂの形成が示され、＊の印を付け、保持時間１１．９５分のピークは、γ－アンブリルアセテートに対応し、ＢＶＭＯ単独でインキュベートしたサンプルでこの化合物が観察されたのは、これらのアッセイで使用したコパラールの混合物に少量のマノオールオキシが存在していたためである。 ＢＶＭＯおよびエステラーゼを発現する人工細菌細胞における１４，１５－ジノル－ラブダン化合物５ａ、５ｂおよび生合成中間体の生化学的産生を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示し、後段のクロマトグラムは、ＢＶＭＯ酵素またはＢＶＭＯ酵素をエステラーゼと共にコードするヌクレオチド配列を有する第２のプラスミドでさらに形質転換された細胞のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 様々なアルコールデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌細胞による化合物５ａおよび５ｂのバイオトランスフォーメーションの産物のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、組換えアルコールデヒドロゲナーゼを発現しないコントロール細胞を用いたバイオコンバージョンのＧＣ－ＭＳ分析を示し、後段のクロマトグラムは、組換えＲｒｈＳｅｃＡＤＨ、ＳＣＨ８０－０００４３、ＳＣＨ８０－０４２５４、ＳＣＨ８０－０６１３５またはＳＣＨ８０－０６５８２タンパク質を発現する細胞を用いた変換のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＢＶＭＯ、エステラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼを発現する人工細菌細胞におけるγ－アンブリルアセテートおよび生合成中間体の生化学的産生を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示し、中段のクロマトグラムは、ＳＣＨ－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２４－ＥＳＴをコードする塩基配列を有する第２のプラスミドでさらに形質転換された細胞のＧＣ－ＭＳ分析を示し、下段のクロマトグラムは、ｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１と、ＲｒｈＳｅｃＡＤＨ、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２３－ＥＳＴを発現させるプラスミドｐＪ４２３－ｓｅｃＡＤＨ－２３ＢＶＭＯ－ＥＳＴとで形質転換された細胞のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 Ａ）ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ、ＣＰＰ合成酵素ＳｍＣＰＳ２、ＣＰＰホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ、ならびにＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２３－ＥＳＴ１およびＳＣＨ２３－ＡＤＨ２（ＹＳＴ１２０ ｗ／プラスミド）またはＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＥＳＴ１、ＳＣＨ２４－ＡＤＨ２ａ（ＹＳＴ１２１ ｗ／プラスミド）のいずれかを発現する改変出芽酵母株を用いて産生したテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析（コントロール株は、コパロール生合成経路のみを発現するＹＳＴ０７５とした）、Ｂ）ファルネサールが同定された領域のＧＣ－ＭＳ分析（ファルネサールのマススペクトルを示している）、Ｃ）マノオールオキシが同定された領域のＧＣ－ＭＳ分析（マノオールオキシのマススペクトルを示している）を示す図である。 ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ、ＣＰＰ合成酵素ＳｍＣＰＳ２、ＣＰＰホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ、ならびにＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２３－ＥＳＴ１（ＹＳＴ１７７）またはＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２４－ＥＳＴ１（ＹＳＴ１７８）のいずれかを発現する改変出芽酵母株を用いて産生したマノオールオキシのＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、コントロール株は、コパロール生合成経路のみを発現するＹＳＴ０７５とし、マノオールオキシのマススペクトルを示している。 ＣＰＰ合成酵素、ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび／またはＳＣＨ９４－３９４４を発現する大腸菌細胞を用いて産生したジテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパロール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４プラスミドで形質転換された大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析におけるジテルペン領域を示し、後段のクロマトグラムは、ＳＣＨ９４－３９４５、ＳＣＨ９４－３９４４、またはＳＣＨ９４－３９４４とＳＣＨ９４－３９４５との組み合わせを発現させるプラスミドｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４５、ｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４またはｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－３９４５でさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびＳＣＨ９４－３９４４を発現する大腸菌細胞を用いて産生したセスキテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、ファルネサール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＦＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示し、下段のクロマトグラムは、ＳＣＨ９４－３９４４タンパク質を発現させるプラスミドｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４でさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＳＣＨ９４－３９４４を発現する大腸菌細胞によるシトラール、シトロネラールおよび（Ｅ）－２－ドデカナールのバイオトランスフォーメーションの産物のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、各化合物について、コントロール大腸菌細胞およびＳＣＨ９４－３９４４タンパク質を発現するように形質転換された細胞を用いた形質転換のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＣＰＰ合成酵素，ホスファターゼ，アルコールデヒドロゲナーゼを発現する大腸菌細胞を用いて産生したセスキテルペン類およびジテルペン類のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、クロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＣＰＰ合成酵素、ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびＳＣＨ８０－０５２４１、ＳＣＨ９４－３９４４、ＰｄｉｇｉｔＤＵＦ４３３４、ＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１またはＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４を発現する大腸菌細胞を用いて産生したジテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌ＤＰ１２０５細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析におけるジテルペン領域を示し、後段のクロマトグラムは、ＳＣＨ８０－０５２４１、ＳＣＨ９４－３９４４、ＰｄｉｇｉｔＤＵＦ４３３４、ＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１またはＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４の組換えタンパク質を発現する第２のプラスミドでさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＣＰＰ合成酵素、ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４、Ｒｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４、ＣｇａｔＤＵＦ４３３４、ＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４、ＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４またはＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４を発現する大腸菌細胞を用いて産生したジテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌ＤＰ１２０５細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析のジテルペン領域を示し、後段のクロマトグラムは、ＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４、Ｒｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４、ＣｇａｔＤＵＦ４３３４、ＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４、ＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４またはＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４の組換えタンパク質を発現する第２のプラスミドでさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびＳＣＨ８０－０５２４１、ＳＣＨ９４－３９４４、ＰｄｉｇｉｔＤＵＦ４３３４、ＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１またはＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４を発現する大腸菌細胞を用いて産生したセスキテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌ＤＰ１２０５細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析におけるセスキテルペン領域を示し、後段のクロマトグラムは、ＳＣＨ８０－０５２４１、ＳＣＨ９４－３９４４、ＰｄｉｇｉｔＤＵＦ４３３４、ＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１またはＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４の組換えタンパク質を発現する第２プラスミドでさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、およびＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４、Ｒｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４、ＣｇａｔＤＵＦ４３３４、ＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４、ＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４またはＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４を発現する大腸菌細胞を用いて産生したセスキテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析のセスキテルペン領域を示し、後段のクロマトグラムは、ＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４、Ｒｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３、ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４、ＣｇａｔＤＵＦ４３３４、ＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４、ＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４またはＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４の組換えタンパク質を発現する第２のプラスミドでさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 酵素的なエナール開裂を触媒するＧＸＷＸＧおよびＤＵＦ４３３４ドメイン含有タンパク質のアラインメントおよび保存されたアミノ酸を示す図であり、枠内はそれぞれのタンパク質ファミリードメインの予測される局在を示す。 ＳＣＨ９４－３９４４の単一アミノ酸バリアントによるファルネサールおよびコパラール変換活性を示す図であり、これらの活性は、生成されたマノオールオキシおよびゲラニルアセトンの総量として、野生型酵素活性に対するパーセンテージで表している。 ＣＰＰ合成酵素、ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、エナール開裂酵素およびＢＶＭＯを発現する大腸菌細胞によるマノオールオキシおよびγ－アンブリルアセテートの生化学的産生のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、コパラール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１プラスミドで形質転換された大腸菌ＤＰ１２０５細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析のジテルペン領域を示し、後段のクロマトグラムは、ＡｓｐＷｅＢＶＭＯ、ＳＣＨ９４－３９４４、ＳＣＨ９４－３９４４とＡｓｐＷｅＢＶＭＯとの組み合わせ、ＳＣＨ９４－３９４４とＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１との組み合わせ、ＳＣＨ９４－３９４４とＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１との組み合わせ、およびＳＣＨ９４－３９４４とＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１との組み合わせを発現する第２のプラスミドでさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ、ＣＰＰ合成酵素ＳｍＣＰＳ２、ＣＰＰホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、およびＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４（ＹＳＴ１８４）、ＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４（ＹＳＴ１８５）、Ｐｄｉｇｉｔ７０３３（ＹＳＴ１８６）、ＳＣＨ９４－３９４４（ＹＳＴ１８７）またはＳＣＨ８０－０５２４１（ＹＳＴ１８８）のいずれかを発現する改変出芽酵母株を用いて産生したテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図である。 Ａ）ＹＳＴ１８４、ＹＳＴ１８５、ＹＳＴ１８６、ＹＳＴ１８７およびＹＳＴ１８８によって産生された同定されたテルペン類のパーセンテージ、Ｂ）コントロールにおける同定されたテルペン類の量（ＳｕｍＴ－Ｃ）に対する、ＹＳＴ１８４、ＹＳＴ１８５、ＹＳＴ１８６、ＹＳＴ１８７およびＹＳＴ１８８によって産生された同定されたテルペン類の総量（ＳｕｍＴ）を示す図であり、コントロール株は、コパロール生合成経路を発現するＹＳＴ０７５とした。 ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ、ＣＰＰ合成酵素ＳｍＣＰＳ２、ＣＰＰホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ、エナール開裂ポリペプチドＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４、およびＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（ＹＳＴ１９０）、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（ＹＳＴ１９１）またはＡｓｐＷｅＢＶＭＯ（ＹＳＴ１９２）のいずれかを発現する改変出芽酵母株を用いて産生したテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図である。 Ａ）ＹＳＴ１８４における同定されたテルペン類の量（ＳｕｍＴ－Ｃ）に対して、ＹＳＴ１９０、ＹＳＴ１９１およびＹＳＴ１９２によって産生された同定されたテルペン類の総量（ＳｕｍＴ）、Ｂ）ＹＳＴ１９０、ＹＳＴ１９１およびＹＳＴ１９２によって産生された同定されたテルペン類のパーセンテージを示す図である。 ＬＰＰ合成酵素、ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびエナール開裂ポリペプチドを発現する大腸菌細胞を用いて産生したジテルペンおよびジテルペン誘導体のＧＣ－ＭＳ分析を示す図であり、上段のクロマトグラムは、ラブダンジオール生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－ＬＯＨ－２ベクターで形質転換された大腸菌ＤＰ１２０５細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示し、後段のクロマトグラムは、ＡｚｅＴｏｌＡＤＨ１アルコールデヒドロゲナーゼまたはＳＣＨ９４－３９４５アルコールデヒドロゲナーゼをＳＣＨ９４－３９４４エナール開裂ポリペプチドと共に発現する第２のプラスミドでさらに形質転換された同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す。 ＢＶＭＯ活性を有するＦＭＯ様ドメイン含有タンパク質のアラインメントおよび保存されたアミノ酸を示す図であり、枠内はそれぞれのタンパク質ファミリードメインの予測される局在を示す。 二官能性ＰｖＣＰＳ、ＣＰＰホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ、エナール開裂ポリペプチドＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、およびエステラーゼＳＣＨ２３－ＥＳＴ（ＹＳＴ２５７）またはエステラーゼＳＣＨ２４－ＥＳＴ（ＹＳＴ２５８）のいずれかを発現する改変出芽酵母株を用いて産生したテルペン類および誘導体のＧＣ－ＭＳ／ＦＩＤ分析を示す図である。 ＣＰＰ合成酵素、ホスファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、エナール開裂酵素、ＢＶＭＯおよびエステラーゼを発現する大腸菌細胞によるγ－アンブロールの生化学的産生のＧＣ－ＭＳ分析であって、Ａ．マノオールオキシ生合成経路の酵素を発現させるｐＪ４０１－Ｍｎｏｘｙプラスミドで形質転換された大腸菌ＤＰ１２０５細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析、Ｂ．ＢＶＭＯ（ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ）をさらに発現する同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析、Ｃ．ＢＶＭＯ（ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ）およびエステラーゼ（ＳＣＨ２４－ＥＳＴ）をさらに発現する同じ大腸菌細胞によって産生された化合物のＧＣ－ＭＳ分析を示す図である。
使用した略語
ＡＤＨ アルコールデヒドロゲナーゼ
ＢＶＭＯ バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ
ｂｐ 塩基対
ｋｂ キロベース
ＣＰＰ コパリル二リン酸
ＣＰＳ コパリル二リン酸合成酵素
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ
ＤＭＡＰＰ ジメチルアリル二リン酸
ＤＴＴ ジチオスレイトール
ＦＭＯ フラビンモノオキシゲナーゼ
ＦＰＰ ファルネシル二リン酸
ＧＰＰ ゲラニル二リン酸
ＧＧＰＰ ゲラニルゲラニル二リン酸
ＧＧＰＳ ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素
ＧＣ ガスクロマトグラフ
ＩＰＰ イソペンテニル二リン酸
ＬＰＰ ラブダンジオール二リン酸
ＬＰＳ ラブダンジオール二リン酸合成酵素
ＭＳ 質量分析計／質量分析法
ＭＶＡ メバロン酸
ＰＰ 二リン酸、ピロリン酸
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ リボ核酸
ｍＲＮＡ メッセンジャーリボ核酸
ｍｉＲＮＡ マイクロＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ 低分子干渉ＲＮＡ
ｒＲＮＡ リボソームＲＮＡ
ｔＲＮＡ トランスファーＲＮＡ
ＴＰＰ テルペニル二リン酸
定義
ａ）一般的な用語
本明細書の記載および添付の特許請求の範囲において、「または」の使用は、別段の記載がない限り、「および／または」を意味する。同様に、「comprise」、「comprises」、「comprising」、「include」、「includes」、および「including」は互換性があり、限定することを意図していない。
さらに、様々な実施形態の説明で「～を含む（comprising）」という用語が使用されている場合、当業者であれば、いくつかの具体的な例では、実施形態を「～から本質的になる（consisting essentially of）」または「～からなる（consisting of）」という言い回しを用いて代替的に説明できることを理解するであろう。
本明細書で使用される「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」という用語は、本発明の化合物がその自然状態で通常関連している他の異種の化合物を含まない状態を指し、「精製された」、「実質的に精製された」、および「単離された」対象が、所定のサンプルの質量の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％、もしくは２０重量％、または少なくとも５０重量％もしくは７５重量％を構成するようになっている。一実施形態では、これらの用語は、本発明の化合物が、所定のサンプルの質量の少なくとも９５、９６、９７、９８、９９または１００重量％を構成することを指す。本明細書で使用される場合、核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質に言及する際の「精製された」、「実質的に精製された」、「単離された」という用語は、例えば原核生物もしくは真核生物の環境で、例えば細菌もしくは真菌の細胞、または哺乳類の生物、特に人体で、自然に存在するものとは異なる精製または濃縮の状態も指す。（１）他の関連する構造もしくは化合物からの精製、または（２）前述の原核生物もしくは真核生物の環境で通常は関連していない構造もしくは化合物との関連付けを含む、自然に存在するものよりも高い純度または濃度の度合いは、「単離された」の意味の範囲内である。本明細書に記載されている核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質のクラスは、当業者に知られている様々な方法およびプロセスに従って、単離されてもよいし、そうでなければ、自然界で通常は関連していない構造または化合物と関連付けられてもよい。
「約」という用語は、記載された値の±２５％、特に±１５％、±１０％、より詳細には±５％、±２％または±１％の潜在的な変動値を示す。
「実質的に」という用語は、約８０～１００％、例えば８５～９９．９％、特に９０～９９．９％、より詳細には９５～９９．９％、または９８～９９．９％、特に９９～９９．９％の範囲の値を表す。
「優勢的に」とは、例えば５１～１００％の範囲のように、５０％を超える範囲の割合を指し、特に７５～９９．９％、より詳細には８５～９８．５％、例えば９５～９９％のような範囲の割合を指す。
本発明の文脈における「主要生成物」とは、単一の化合物または少なくとも２つの化合物、例えば２、３、４、５つ以上、特に２もしくは３つの化合物の群を指し、この単一の化合物または化合物の群は、本明細書に記載されている反応によって「優勢的に」調製され、前述の反応によって形成された生成物の構成要素の総量に基づいて優勢な割合で前述の反応に含まれる。前述の割合は、モル比、重量比、または好ましくはクロマトグラフィー分析に基づいて、反応生成物の対応するクロマトグラムから計算される面積比であってもよい。
本発明の文脈における「副生成物」とは、単一の化合物または少なくとも２つの化合物、例えば２、３、４、５つ以上、特に２もしくは３つの化合物の群を指し、この単一の化合物または化合物の群は、本明細書に記載されている反応によって「優勢的に」調製されるものではない。
酵素反応には可逆性があるため、本発明は、特に明記しない限り、本明細書に記載されている酵素反応または生体触媒反応の両方向の反応に関する。
本明細書に記載されているポリペプチドの「機能的変異体」には、以下に定義される当該ポリペプチドの「機能的等価物」が含まれる。
「立体異性体」には、配座異性体、特に配置異性体が含まれる。
一般的に含まれるのは、本発明によれば、本明細書に記載されている化合物のすべての「立体異性体形態」、例えば「構造異性体」および「立体異性体」である。
「立体異性体形態」には、特に「立体異性体」およびその混合物、例えば、エナンチオマーなどの配置異性体（光学異性体）、またはＥ型およびＺ型異性体などの幾何異性体（ジアステレオマー）、およびそれらの組み合わせが包含される。１個の分子内に１つ以上の非対称中心が存在する場合、本発明は、これらの非対称中心の異なる配座のすべての組み合わせ、例えばエナンチオマー対を包含する。
「立体選択性」とは、化合物の特定の立体異性体を立体的に純粋な形態で生成する能力、または本明細書に記載されている酵素触媒法において、複数の立体異性体の中から特定の立体異性体を特異的に変換する能力を意味する。より具体的には、これは、本発明の生成物が特定の立体異性体に関して濃縮されていること、または出発物質（educt）が特定の立体異性体に関して枯渇している可能性があることを意味する。これは、以下の式に従って計算される純度％ｅｅパラメーターを介して定量化され得る：
％ｅｅ＝［ＸＡ－ＸＢ］／［ＸＡ＋ＸＢ］＊１００
式中、ＸＡおよびＸＢは、立体異性体ＡおよびＢのモル比（Molenbruch）を表す。
「選択的に変換する」または「選択性を高める」という用語は、一般的に、不飽和炭化水素の特定の立体異性体形態、例えばＥ体が、対応する他の立体異性体形態、例えばＺ体よりも、前述の反応の全過程（すなわち、反応の開始から終了までの間）、前述の反応のある時点、または前述の反応の「インターバル」のいずれかにおいて、（モルベースで比較して）高い割合または量で変換されることを意味する。特に、前述の選択性は、基質の初期量の１～９９％、２～９５％、３～９０％、５～８５％、１０～８０％、１５～７５％、２０～７０％、２５～６５％、３０～６０％、または４０～５０％の変換に対応する「インターバル」の間に観察され得る。前述のより高い割合または量は、例えば、以下の観点から表され得る：
－ 反応の全過程またはその前述のインターバルの間に観察される異性体のより高い最大収率；
－ 基質の定義された変換値の度合い（％）での異性体のより高い相対量；および／または
－ より高い変換値の度合い（％）での異性体の同一の相対量。
これらはいずれも、参照方法と比較して観察されることが好ましく、前述の参照方法は、既知の化学的または生化学的な手段を用いて、他の点では同一の条件下で実施される。
一般に、本発明に従って、本明細書に記載されている化合物のすべての「異性体形態」、例えば構造異性体、特に立体異性体、およびこれらの混合物、例えば、光学異性体または幾何異性体、例えばＥ型およびＺ型異性体、ならびにこれらの組み合わせなども含まれる。いくつかの非対称中心が分子内に存在する場合、本発明は、これらの非対称中心の異なる配座のすべての組み合わせ、例えば、エナンチオマー対、または立体異性体形態の任意の混合物を含む。
本発明による反応の「収率」および／または「変換率」は、反応が行われる、例えば４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、３６または４８時間の定義された期間にわたって決定される。特に、反応は、正確に定義された条件、例えば、本明細書で定義される「標準条件」で実施される。
異なる収率パラメーター（「収率」またはＹＰ／Ｓ、「比産生性収量（Specific Productivity Yield）」；または空時収量（ＳＴＹ））は、当該技術分野で周知であり、文献に記載されているように決定される。
本明細書では、「収率」および「ＹＰ／Ｓ」（それぞれ、産生された産物の質量／消費された材料の質量で表される）は同義語として使用される。
比産生性収量は、バイオマス１ｇあたりの１時間およびＬ発酵ブロスあたりに産生される産物の量を表す。ＷＣＷと表記される湿潤細胞重量は、生化学的反応における生物学的に活性な微生物の量を表す。この値は、１時間あたりのＷＣＷ１ｇあたりの産物１ｇ（すなわち、ｇ／ｇＷＣＷ－１ｈ－１）として与えられる。あるいはバイオマスの量は、ＤＣＷと表記される乾燥細胞重量として表すこともできる。さらに、バイオマス濃度は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）を測定し、実験的に決定された相関係数を用いて、対応する湿潤細胞重量または乾燥細胞重量をそれぞれ推定することで、より容易に決定することができる。
本開示が、異なる優先度の特徴、パラメーターおよびその範囲（一般的な、明示的には優先されない特徴、パラメーターおよびその範囲を含む）に言及する場合、特に明記しない限り、そのような特徴、パラメーターおよびその範囲の２つ以上の任意の組み合わせが、それぞれの優先度に関係なく、本明細書の開示に包含される。
ｂ）生化学用語
「ドメイン」という用語は、進化的に関連するタンパク質の配列のアラインメントに沿った特定の位置で保存されている一連のアミノ酸またはアミノ酸残基の部分的な配列を指す。他の位置のアミノ酸はタンパク質ホモログ間で異なる可能性があるが、ドメインの特定の位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性または機能に必須である可能性が高いアミノ酸を示す。タンパク質ホモログのファミリーのアラインメントされた配列にアミノ酸の高度な保存性があることから同定され、問題になっている任意のポリペプチドが予め同定されたポリペプチドファミリーに属するかどうかを判定するための識別子として使用することができる。
「モチーフ」または「コンセンサス配列」または「シグネチャー」という用語は、進化的に関連するタンパク質の配列において短く保存された領域を指す。モチーフは、ドメインの一部として高度に保存されていることが多いが、ドメインの一部のみを含むこともある。
「タンパク質ファミリー」は、それらの関連する機能、配列の類似性、または類似の一次構造、二次構造もしくは三次構造によって反映される、進化的に共通の起源を持つタンパク質の群と定義される。タンパク質ファミリー内のタンパク質は、通常、相同性があり、保存された機能的ドメインおよびモチーフの類似の構造を有する。
ドメインを同定するための専門的なデータベースが存在し、例えば、SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004))、またはPfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))に記載されている。ドメインまたはモチーフは、配列アラインメントなどによる常用技法を用いて同定してもよい。
「Ｐｆａｍ」という用語は、Pfam Consortiumによって維持され、http://pfam.xfam.org/ / (European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute (EMBL_EBI)などのいくつかのスポンサー付きワールド・ワイド・ウェブサイトで利用可能な、タンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの大規模なコレクションを指す。Ｐｆａｍの最新リリースはＰｆａｍ ３２．０（２０１８年９月）で、UniProt Reference Proteomes (El-Gebali S. et al, 2019, Nucleic Acids Res. 47, Database issue D427－D432)に基づいている。Ｐｆａｍドメインおよびファミリーは、複数の配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて同定される。Ｐｆａｍ－Ａファミリーまたはドメインの割り当ては、タンパク質ファミリーの代表的なメンバーを用いて精査されたシードアラインメントと、シードアラインメントに基づいたプロファイル隠れマルコフモデルとによって生成された高品質の割り当てである（別段の定めがない限り、クエリされたタンパク質とＰｆａｍドメインまたはファミリーのマッチは、Ｐｆａｍ－Ａマッチである）。次いで、ファミリーに属するすべての同定された配列を用いて、ファミリーのフルアラインメントを自動的に生成する(Sonnhammer (1998) Nucleic Acids Research 26, 320-322; Bateman (2000) Nucleic Acids Research 26, 263-266; Bateman (2004) Nucleic Acids Research 32, Database Issue, D138-D141; Finn (2006) Nucleic Acids Research Database Issue 34, D247-251; Finn (2010) Nucleic Acids Research Database Issue 38, D211-222)。例えば、上記の参照ウェブサイトのいずれかを使ってＰｆａｍデータベースにアクセスすると、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３、またはより上位のバージョン（hmmer.janelia.org/））を使って、ＨＭＭに対してタンパク質配列をクエリすることができる。クエリされたタンパク質がｐｆａｍファミリーに属する（または特定のＰｆａｍドメインを有する）ことを同定する有意なマッチは、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集閾値以上であるものである。期待値（ｅ値）もまた、クエリされたタンパク質をＰｆａｍに含めるための、またはクエリされたタンパク質が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを判定するための基準として使用することができ、ここで、低いｅ値とは、１．０よりもはるかに低い値、例えば０．１未満またはそれを下回る。
「Ｅ値」（期待値）は、全く偶然にこの値と同じかそれ以上のスコアを有する期待されるヒット数のことである。つまり、予測が信頼できる良好なＥ値は、１よりもはるかに低い値である。１前後のＥ値は、偶然に期待される値である。したがって、Ｅ値が低いほど、ドメインの検索はより具体的なものになる。正の数のみが認められる（定義はＰｆａｍによる））。
本明細書に記載されている目標化合物の「前駆体」分子は、好ましくは、前述の前駆体分子に少なくとも１つの構造変化を行う適切なポリペプチドの酵素作用により、前述の目標化合物に変換される。例えば、「二リン酸前駆体」（例えば「テルペニル二リン酸前駆体」など）は、二リン酸部分の酵素的除去を介して、例えばホスファターゼ酵素による一リン酸基または二リン酸基の除去によって、前述の目標化合物（例えばテルペンアルコールなど）に変換される。例えば、「非環状前駆体」（非環状テルペニル前駆体など）は、環状酵素または合成酵素の作用を介して、そのような酵素の特定の酵素機構に関係なく、１つまたは複数のステップで環状目標分子（環状テルペン化合物など）に変換され得る。
「タンパク質チロシンホスファターゼ」という用語は、タンパク質上のリン酸化されたチロシン残基からリン酸基を除去することが一般的に知られている酵素の群を表す。本明細書に記載されている前述のファミリーの特定のサブグループは、リン酸化されたテルペン分子を脱リン酸化するのに有用な酵素である。
「テルペン合成酵素」とは、テルペン前駆体分子をテルペン目標分子に変換するポリペプチドを指し、特に処理された目標テルペンアルコールまたはテルペン炭化水素などを指す。そのようなテルペン前駆体分子の非限定的な例は、例えば、ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロホスフェート（ＧＧＰＰ）、またはイソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）とジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）との混合物から選択される非環状化合物である。得られたテルペンが二リン酸部分を含む場合、合成酵素は「テルペニル二リン酸合成酵素」と呼ばれる。
「テルペニル二リン酸合成酵素」または「テルペニル二リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド」または「テルペニル二リン酸合成酵素タンパク質」または「テルペニル二リン酸を生成する能力を有する」という用語は、テルペニル二リン酸の合成を、非環状テルペンピロリン酸、特にＧＰＰ、ＦＰＰまたはＧＧＰＰまたはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの組み合わせから出発して、その立体異性体のいずれか、またはそれらの混合物の形態で触媒することができるポリペプチドに関する。テルペニル二リン酸は、唯一の生成物であってもよいし、テルペニルリン酸の混合物の一部であってもよい。前述の混合物は、テルペニルモノホスフェートおよび／またはテルペンアルコールを含んでいてもよい。上記の定義は、ＣＰＰまたはＬＰＰのような二環式テルペニル二リン酸を生成する「二環式テルペニル二リン酸合成酵素」の群にも適用される。そのような「テルペニル二リン酸合成酵素」の例として、コパリル二リン酸合成酵素（ＣＰＳ）を挙げることができる。コパリル二リン酸は、唯一の生成物であってもよいし、コパリルリン酸の混合物の一部であってもよい。前述の混合物は、コパリルモノホスフェートおよび／または他のテルペニル二リン酸を含んでいてもよい。そのような「テルペニル二リン酸合成酵素」の別の例として、ラブダンジオール二リン酸合成酵素（ＬＰＳ）を挙げることができる。ラブダンジオール二リン酸は、唯一の生成物であってもよいし、ラブダンジオールリン酸の混合物の一部であってもよい。前述の混合物は、ラブジオールモノホスフェートおよび／またはテルペニルジホスフェートを含んでいてもよい。
「テルペニル二リン酸ホスファターゼ」または「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド」または「テルペニル二リン酸ホスファターゼタンパク質」または「テルペンアルコールを生成する能力を有する」という用語は、二リン酸部分または一リン酸部分の除去を（特定の酵素機構に関係なく）触媒して、脱リン酸化された化合物、特に前述のテルペニル部分の対応するアルコール化合物を形成することができるポリペプチドに関する。テルペンアルコールは、その立体異性体のいずれかで、またはそれらの混合物として生成物中に存在してもよい。テルペンアルコールは唯一の生成物であってもよいし、他のテルペン化合物との混合物の一部であってもよく、例えば、前述のテルペニル二リン酸のそれぞれの（例えば非環状）前駆体の脱リン酸化されたアナログなどである。上記の定義は、コパロールまたはラブダンジオールのような二環式テルペンアルコールを生成する「二環式テルペニル二リン酸ホスファターゼ」の群にも適用される。
そのような「テルペニル二リン酸ホスファターゼ」酵素の例として、コパリル二リン酸ホスファターゼ（ＣＰＰホスファターゼ）を挙げることができる。コパロールは、唯一の生成物であってもよいし、例えばファルネソールおよび／またはゲラニルゲラニオールのような脱リン酸化された前駆体；および／または反応混合物中の酵素の副次的な活性から生じる副生成物、例えばそのようなアルコール類もしくは他の環状もしくは非環状のジテルペン類のエステル類もしくはアルデヒド類との混合物の一部であってもよい。そのような「テルペニル二リン酸ホスファターゼ」酵素の別の例として、ラブダンジオール二リン酸ホスファターゼ（ＬＰＰホスファターゼ）を挙げることができる。ラブダンジオールは唯一の生成物であってもよいし、例えばファルネソールおよび／またはゲラニルゲラニオールのような脱リン酸化された前駆体；および／または反応混合物中の酵素の副次的な活性から生じる副生成物、例えばそのようなアルコール類もしくは他の環状もしくは非環状のジテルペン類のエステル類もしくはアルデヒド類との混合物の一部であってもよい。
本発明の文脈における「エナール開裂酵素」または「エナール開裂タンパク質」または「エナール開裂ポリペプチド」とは、「α，β－不飽和アルデヒド炭素－炭素二重結合開裂酵素」を指し、これは「α，β－不飽和アルデヒドＣ＝Ｃ結合開裂酵素」または「α，β－不飽和アルデヒドＣ＝Ｃ開裂酵素」または「エナールＣ＝Ｃ開裂酵素」と呼ばれることもある。本発明のエナール開裂タンパク質は、タンパク質のドメイン構成に基づいて、「ＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリー」のメンバーとして、および／または「ＧＸＷＸＧタンパク質ファミリー」のメンバーとして表すこともできる。
より詳細には、本発明のエナール開裂酵素は、ラブダンアルデヒドのようなラブダン型カルボニル化合物、特にコパラールをそれぞれのジノルラブダンカルボニル化合物に開裂する能力を有する。「バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ」（ＢＶＭＯ）はフラビン酵素であり、酸化還元酵素活性を有するポリペプチド（ＥＣ１．１４．１３．Ｘ）を指すクラスに属する。それらの酵素は、線状、環状（芳香族または非芳香族）のアルデヒド類またはケトン類を、対応するエステル類またはラクトン類に酸化する触媒であり、化学的なバイヤー・ビリガー酸化と極めてよく似ている。酵素的酸化の際には、１個の分子酸素の原子が非活性のカルボニル化合物の炭素－炭素結合に取り込まれる。ＢＶＭＯは、補因子としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを必要とするか、その両方を受け入れる。ＢＶＭＯはまた、分子酸素を補基質として必要とする。より詳細には、本発明のＢＶＭＯは、例えばラブダン型カルボニル化合物のようなテルペン由来のアルデヒド類またはケトン類、例えばラブダンアルデヒド、特にコパラールおよび／またはマノオールオキシを、それぞれのカルボニルエステルに酸化する能力を有する。
「エステラーゼ」とは、水との化学反応（加水分解）においてエステル類を酸とアルコールとに分解するヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドを指す。本発明の文脈におけるエステラーゼは、カルボン酸エステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．１．－）のクラスから選択され、アセチル基またはホルミル基のようなアシル基をそれぞれのエステル基質から分割する。より詳細には、本発明のエステラーゼは、γ－アンブリルアセテートのようなラブダン型エステル化合物を開裂して、γ－アンブロールのようなそれぞれのラブダン型アルコールを形成する能力を有する。
本発明の文脈における「アルコールデヒドロゲナーゼ」（ＡＤＨ）とは、補因子としてのＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、アルコールを対応するアルデヒドに酸化する能力を有するポリペプチドを指す。そのような酵素は、Ｅ．Ｃ．ファミリーの１．１．１．１（ＮＡＤ＋依存）または１．１．１．２（ＮＡＤＰ＋依存）のメンバーである。より詳細には、本発明のＡＤＨは、コパロールをコパールに、かつ／またはラブダンジオールをコパロール、ラブダンジオールのそれぞれのアルデヒドまたは他のラブダン型誘導体に、例えば、コパロールまたはラブダンジオールのそれぞれのノル－もしくはジノル－ラブダン型誘導体に酸化するように、ラブダン型アルコール類をそれぞれのラブダン型カルボニル化合物（アルデヒド類またはケトン類）に酸化する能力を有する。本明細書で使用されているようなＡＤＨは、それぞれの生体触媒プロセスに内因性に存在するものであってもよいし、外因性のものであってもよい。
「エナール開裂活性」は、本明細書に後で記載されている「標準条件」下で決定される。エナール開裂活性は、組換えエナール開裂ポリペプチドを発現する宿主細胞、破砕されたエナール開裂ポリペプチドを発現する細胞、これらの分画、または濃縮もしくは精製されたエナール開裂ポリペプチドを用いて、６～１１、好ましくは７～９の範囲のｐＨを有する、好ましくは緩衝された培養培地または反応培地中で、約２０～４５℃、例えば約２５～４０℃、好ましくは２５～３２℃の温度で、１～１００μＭ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５～５０μＭ、特に３０～４０μＭの初期濃度で添加するか、または宿主細胞によって内因的に産生した参照基質、ここでは特にコパラールの存在下で決定することができる。マノオールオキシのようなそれぞれの開裂生成物を形成するための変換反応は、１０分～５時間、好ましくは約１～２時間行われる。次いで、開裂生成物は、例えば酢酸エチルのような有機溶媒で抽出した後、慣例の方法で決定することができる。
「ＢＶＭＯ活性」は、本明細書に後で記載されている「標準条件」下で決定される。ＢＶＭＯ活性は、組換えＢＶＭＯを発現する宿主細胞、破砕されたＢＶＭＯを発現する細胞、これらの分画、または濃縮もしくは精製されたＢＶＭＯ酵素を用いて、６～１１、好ましくは７～９の範囲のｐＨを有する、好ましくは緩衝された培養培地または反応培地中で、約２０～４５℃、例えば約２５～４０℃、好ましくは２５～３２℃の温度で、１～１００μＭ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５～５０μＭ、特に３０～４０μＭの初期濃度で添加するか、または宿主細胞によって内因的に産生した参照基質、ここでは特にコパラールおよび／またはマノオールオキシの存在下および分子酸素の存在下で決定することができる。インビトロアッセイでは、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨから選択された補酵素を、決定が容易な適切な濃度範囲で添加しなければならない。コパラールの場合はホルミルエステル１ａおよび／または１ｂ、マノオールオキシの場合はγ－アンブリルアセテートのように、それぞれの開裂生成物を形成するための変換反応は、１０分～５時間、好ましくは約１～２時間行われる。次いで、酸化生成物は、例えば酢酸エチルのような有機溶媒で抽出した後、慣例の方法で決定することができる。
「テルペニル二リン酸合成酵素活性」（例えばＣＰＳまたはＬＰＳ活性）は、本明細書に後で記載されている「標準条件」下で決定される。テルペニル二リン酸合成酵素活性は、組換えテルペニル二リン酸合成酵素を発現する宿主細胞、破砕されたテルペニル二リン酸合成酵素を発現する細胞、これらの分画、または濃縮もしくは精製されたテルペニル二リン酸合成酵素を用いて、６～１１、好ましくは７～９の範囲のｐＨを有する、好ましくは緩衝された培養培地または反応培地中で、約２０～４５℃、例えば約２５～４０℃、好ましくは２５～３２℃の温度で、１～１００μＭ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５～５０μＭ、特に３０～４０μＭの初期濃度で添加するか、または宿主細胞によって内因的に産生した参照基質、ここでは特にＧＧＰＰの存在下で決定することができる。テルペニル二リン酸を形成するための変換反応は、１０分～５時間、好ましくは約１～２時間行われる。内因性ホスファターゼが存在しない場合は、１つ以上の外因性ホスファターゼ、例えばアルカリ性ホスファターゼを反応混合物に添加して、合成酵素によって形成されたテルペニル二リン酸をそれぞれのテルペンアルコールに変換する。次いで、テルペンアルコールは、例えば酢酸エチルのような有機溶媒で抽出した後、慣例の方法で決定することができる。
「テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性」（例えばＣＰＰまたはＬＰＰホスファターゼ活性）は、本明細書に後で記載されている「標準条件」下で決定される。テルペニル二リン酸ホスファターゼ活性は、組換えテルペニル二リン酸ホスファターゼを発現する宿主細胞、破砕されたテルペニル二リン酸ホスファターゼを発現する細胞、これらの分画、または濃縮もしくは精製されたテルペニル二リン酸ホスファターゼ酵素を用いて、６～１１、好ましくは７～９の範囲のｐＨを有する、好ましくは緩衝された培養培地または反応培地中で、１～１００μＭ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５～５０μＭ、特に３０～４０μＭの初期濃度で添加するか、または宿主細胞によって内因的に産生した参照基質、ここでは例えばＣＰＰまたはＬＰＰの存在下で決定することができる。テルペニル二リン酸を形成するための変換反応は、１０分～５時間、好ましくは約１～２時間行われる。次いで、テルペンアルコールは、酢酸エチルのような有機溶媒で抽出した後、慣例の方法で決定することができる。
上述の酵素活性のそれぞれに適した標準条件の特定の例は、後の「実験部分」から得ることができる。
テルペニル合成酵素の「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」という用語は、本明細書に記載されているテルペニル二リン酸合成酵素が、対応する前駆体テルペンから少なくとも１つのテルペニル二リン酸の形成を触媒する能力を指す。
テルペニル二リン酸ホスファターゼの「生物学的機能」、「機能」、「生物学的活性」または「活性」という用語は、本明細書に記載されているテルペニル二リン酸ホスファターゼが、前述のテルペニル化合物から二リン酸基を除去して、対応するテルペンアルコールを形成することを触媒する能力を指す。
「メバロン酸経路」は、「イソプレノイド経路」または「ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素経路」とも呼ばれ、真核生物、古細菌および一部の細菌に存在する必須の代謝経路である。メバロン酸経路は、アセチル－ＣｏＡから始まり、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）と呼ばれる２個の炭素数５のビルディングブロックを生成する。主な酵素は、アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼ（ａｔｏＢ）、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素（ｍｖａＳ）、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素（ｍｖａＡ）、メバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＭｖａＫ２）、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（ＭｖａＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）である。メバロン酸経路に、テルペン前駆体であるＧＰＰ、ＦＰＰまたはＧＧＰＰを生成する酵素活性、特にＦＰＰ合成酵素（ＥＲＧ２０）などを組み合わせることで、テルペン類の組換え細胞産生が可能になる。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」または「形質転換細胞」という用語は、少なくとも１個の核酸分子、例えば、所望のタンパク質をコードする組換え遺伝子または転写時に本発明の少なくとも１つの機能性ポリペプチド、特に本明細書の上で定義されているテルペニル二リン酸合成酵素タンパク質またはテルペニル二リン酸ホスファターゼ酵素をもたらす核酸配列を保持するように改変された細胞（または生物）を指す。宿主細胞は、特に、細菌細胞、真菌細胞または植物細胞もしくは植物である。宿主細胞は、宿主細胞の核またはオルガネラのゲノムに組み込まれた、例えばオペロンとして構成された組換え遺伝子または複数の遺伝子を含んでいてもよい。あるいは宿主は、組換え遺伝子を染色体外に含んでいてもよい。
「生物」とは、植物などの人間以外の任意の多細胞もしくは単細胞の生物、または微生物を指す。特に、微生物は、細菌、酵母、藻類または真菌である。
「植物」という用語は、植物プロトプラストを含む植物細胞、植物組織、再生植物を生じさせる植物細胞組織培養物、または植物の一部、または植物器官、例えば根、茎、葉、花、花粉、胚珠、胚、果実などを含むものとして互換的に使用される。本明細書の実施形態の方法を行うために、任意の植物を使用することができる。
特定の生物または細胞は、自然にＦＰＰを産生する場合、または自然にはＦＰＰを産生しないが、本明細書に記載されている核酸を用いてＦＰＰを産生するように形質転換されている場合に、「ＦＰＰを産生することができる」ことを意味する。自然に存在する生物または細胞よりも多量のＦＰＰを産生するように形質転換された生物または細胞も、「ＦＰＰを産生することができる生物または細胞」に包含される。
特定の生物または細胞は、自然にＧＧＰＰを産生する場合、または自然にはＧＧＰＰを産生しないが、本明細書に記載されている核酸を用いてＧＧＰＰを産生するように形質転換されている場合に、「ＧＧＰＰを産生することができる」ことを意味する。自然に存在する生物または細胞よりも多量のＧＧＰＰを産生するように形質転換された生物または細胞も、「ＧＧＰＰを産生することができる生物または細胞」に包含される。
特定の生物または細胞は、本明細書で定義されるテルペニル二リン酸を自然に産生する場合、または前述の二リン酸を自然には産生しないが、本明細書に記載されている核酸を用いて前述の二リン酸を産生するように形質転換されている場合に、「テルペニル二リン酸を産生することができる」ことを意味する。自然に存在する生物または細胞よりも多量のテルペニル二リン酸を産生するように形質転換された生物または細胞も、「テルペニル二リン酸を産生することができる生物または細胞」に包含される。
特定の生物または細胞は、本明細書で定義されるテルペンアルコールを自然に産生する場合、または前述のアルコールを自然には産生しないが、本明細書に記載されている核酸を用いて前述のアルコールを産生するように形質転換されている場合に、「テルペンアルコールを産生することができる」ことを意味する。自然に存在する生物または細胞よりも多量のテルペンアルコールを産生するように形質転換された生物または細胞も、「テルペンアルコールを産生することができる生物または細胞」に包含される。同じことが「ラブダン型アルコールを産生することができる」特定の生物にも当てはまる。
特定の生物または細胞は、本明細書で定義されるエステルを自然に産生する場合、または前述のエステルを自然には産生しないが、本明細書に記載されている核酸を用いて前述のエステルを産生するように形質転換されている場合に、「エステルを産生することができる」ことを意味する。自然に存在する生物または細胞よりも多量のエステルを産生するように形質転換された生物または細胞も、「エステルを産生することができる生物または細胞」に包含される。
特定の生物または細胞は、本明細書で定義される目的生成物（例えば、エステル、アルコール、またはカルボニル化合物、より詳細にはラブダン型化合物）を自然に産生する場合、または前述の目的生成物を自然には産生しないが、本明細書に記載されている核酸を用いて前述の目的生成物を産生するように形質転換されている場合に、「目的生成物を産生することができる」ことを意味する。自然に存在する生物または細胞よりも多量の目的生成物を産生するように形質転換された生物または細胞も、「目的生成物を産生することができる生物または細胞」に包含される。
「発酵産生」または「発酵」という用語は、インキュベーションに添加された少なくとも１つの炭素源を利用して細胞培養で化合物を産生する微生物の能力（前述の微生物に含まれるか、またはそれによって生成される酵素活性によって補助される）を意味する。
「発酵ブロス」という用語は、例えば本明細書に記載されているように、発酵プロセスに基づいており、加工されていないか、または加工されている液体、特に水性溶液または水性／有機溶液を意味すると理解される。
「酵素触媒」法または「生体触媒」法とは、本明細書で定義されるように、酵素（酵素の変異体を含む）の触媒作用の下で前述の方法が行われることを意味する。したがって、本方法は、単離された（精製された、濃縮された）もしくは粗製形態の前述の酵素の存在下で、または細胞系、特に、活性形態の前述の酵素を含有しかつ本明細書で開示されている変換反応を触媒する能力を有する天然もしくは組換え微生物細胞の存在下で行うことができる。
ｃ）化学用語：
「α，β－不飽和カルボニル」化合物という用語は、一般式ＲａＲｂＣ＝Ｃ（Ｒｃ）－Ｃ＝Ｏのアルデヒド基またはケト基を含む有機分子を表し、式中、Ｃ＝Ｃ結合は、任意の立体異性体配置であってもよく、残基Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは同一であっても異なっていてもよく、特定のα，β－不飽和カルボニル化合物について、以下に規定される意味を有していてもよい。
本発明の文脈における「ラブダン」化合物は、その炭素骨格が２０個の炭素原子からなる以下の基本構造を示す。描写された炭素原子の番号付けは、前述の炭素骨格内の特定の位置をさらに定義するために適用される。
Figure 2022539510000002
「ラブダン」という用語は、この基本的なＣ２０構造の任意の化合物を任意の立体異性体形態で包含し、炭素環式環および／または側鎖内の任意の位置に１つ以上の不飽和Ｃ－Ｃ結合、特に１つ以上のＣ＝Ｃ結合を含むこの構造のバリアントを包含するものである。１つ以上の置換基、例えば－ＯＨ、＝Ｏ、－Ｏ－ＣＯ＿Ｒ（式中、Ｒは、直鎖または分岐したアルキル、特に低級アルキル、より詳細には、メチル、エチル、ｎ－もしくはｉ－プロピル、またはｎ－、ｉ－もしくはｔ－ブチルのようなＣ１～Ｃ４アルキルであってもよく、示された一次、二次または三次のＣ原子のいずれかに－ＣＯＯＨが存在してもよい）の群から選択される置換基を含むそのバリアントも包含される。
そのような「ラブダン」の「ラブダン由来」の化合物は、基本的なＣ２０炭素骨格が１個以上の炭素原子を削除することによって変更されている化合物を包含する。例として、以下のものを挙げることができる：
ノルラブダン（Ｃ１９骨格）、ジノルラブダン（Ｃ１８骨格）、トリノルラブダン（Ｃ１７骨格）、テトラノルラブダン（Ｃ１６骨格）。削除された炭素原子の位置は、炭素数を記載することによって示される。例えば、１５位の炭素が欠落しているノルラブダンでは、「１５－ノルラブダン」と表記する。
そのような「ラブダン」の「ラブダン由来」の化合物には、ラブダン骨格の２個のＣ原子の間にヘテロ原子を挿入することによって、基本的なＣ２０炭素骨格が変更されている化合物も含まれる。例えば、１４位と１５位との間にエーテル架橋を挿入することで、ラブダンがノルラブダンに、特にノルラブダンエステルに変換される。
置換されたラブダンまたは置換されたラブダン由来構造の非限定的な例を以下に示す：
Figure 2022539510000003
本明細書で使用される「二リン酸」および「ピロリン酸」は同義語である。
「テルペン類」は、様々な植物、特に針葉樹、および一部の昆虫によって生成される、広範多岐にわたるクラスの有機化合物である。テルペン類は炭化水素である。「テルペン類」と同じ意味で使用されることもあるが、「テルペノイド類」または「イソプレノイド類」は、通常は酸素含有の追加の官能基を含んでいるため、修飾されたテルペン類である。
「テルペノイド類」（「イソプレノイド類」）は、テルペン由来の自然に存在する有機化学物質の広範多岐にわたるクラスである。「テルペン類」という用語と同じ意味で使用されることもあるが、「テルペノイド類」は、例えばヒドロキシル基、カルボニル基またはカルボキシル基のような、通常はＯを含む官能基をさらに含んでいる。ほとんどが酸素含有官能基を持つ多環式構造である。別段の記載がない限り、本明細書の文脈において、「テルペン」という用語と「テルペノイド」という用語とは、互換的に使用され得る。
テルペン類（およびテルペノイド類）は、分子内のイソプレン単位の数によって分類され得、名前の接頭辞は、分子を組み立てるのに必要なテルペン単位の数を示す。ヘミテルペン類は１個のイソプレン単位からなる。モノテルペン類は、２個のイソプレン単位からなり、分子式はＣ１０Ｈ１６である。セスキテルペン類は、３個のイソプレン単位からなり、分子式はＣ１５Ｈ２４である。ジテルペン類は、４個のイソプレン単位からなり、分子式はＣ２０Ｈ３２である。
「テルペニル類」は、Ｃ５ビルディングブロックのイソプレンから誘導される非環状および環状の化学ヒドロカルビル残基を指し、特に１個以上のそのようなビルディングブロックを含む。
「環状テルペン」または「環状テルペニル」または「環状ジテルペン」または「環状ジテルペニル」とは、その構造中に少なくとも１個、例えば１、２、３、４または５個の炭素環式縮合環および／または非縮合環、好ましくは２個の炭素環式縮合環を含むテルペン化合物またはテルペニル残基に関する。
「二環式テルペン」または「二環式テルペニル」または「二環式ジテルペン」または「二環式ビシクロジテルペニル」とは、その構造中に２個の炭素環式環、好ましくは２個の炭素環式の縮合環を含むテルペン化合物またはテルペニル残基に関する。
本発明の文脈における「テルペン類の誘導体」または「テルペノイド類の誘導体」とは、特に、化学的および／または酵素的な修飾によってテルペンまたはテルペノイドから得られる化合物を指す。より詳細には、そのような誘導体には、「炭化水素鎖が分解された」誘導体が包含される。
「炭化水素鎖が分解された」テルペンまたはテルペノイドは、分解されていない前駆体とは異なり、前駆体の炭素骨格の炭素数が減少している。
「ヒドロカルビル」残基は、本質的に炭素原子と水素原子とから構成される化学基であり、非環状の、線状もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和部分、または環状の飽和もしくは不飽和部分、芳香族もしくは非芳香族部分であってもよい。ヒドロカルビル残基は、非環状構造の場合は１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個または１～５個の炭素原子を含む。ヒドロカルビル残基は、環状構造の場合は４～３０個、４～２５個、４～２０個、４～１５個、４～１０個、または特に４、５、６または７個の炭素原子を含む。
前述のヒドロカルビル残基は、非置換であってもよいし、少なくとも１個、例えば１～５個、好ましくは０、１または２個の置換基を有していてもよい。
そのようなヒドロカルビル残基の特定の例は、以下に定義される非環状の線状もしくは分岐状のアルキル基もしくはアルケニル残基；または例えば、本明細書で定義される環状（例えば、二環式）または非環状のテルペン型化合物、およびラブダン型化合物に見られるような、単環式もしくは多環式、特に単環式もしくは二環式の、飽和もしくは不飽和の非芳香族部分である。
「アルキル」残基は、線状または分岐状の飽和炭化水素残基を表す。「アルキル」残基は、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個または１～１０個または１～７個、１～６個、１～５個、または１～４個の炭素原子を含む。
「アルケニル」残基は、線状または分岐状の、一価または多価の不飽和炭化水素残基を表す。「アルケニル」残基は、２～３０個、２～２５個、２～２０個、２～１５個または２～１０個または２～７個、２～６個、２～５個、または２～４個の炭素原子を含む。「アルケニル」残基は、最大１０個、例えば１、２、３、４または５個のＣ＝Ｃ二重結合を有していてもよい。
「低級アルキル」または「短鎖アルキル」という用語は、１～４個、１～５個、１～６個、または１～７個、特に１～４個の炭素原子を有する飽和の直鎖または分岐状の炭化水素ラジカルを表す。例として、以下のものを挙げることができる：メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル、ｎ－ブチル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、１，１－ジメチルエチル、ｎ－ペンチル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、２，２－ジメチルプロピル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、１，１－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１－メチルペンチル、２－メチルペンチル、３－メチルペンチル、４－メチルペンチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１－エチル－１－メチルプロピル、１－エチル－２－メチルプロピル；ならびにｎ－ヘプチル、それらの単分岐または多分岐のアナログも挙げられる。
「長鎖アルキル」は、例えば、８～３０個、例えば８～２０個または８～１５個の炭素原子を有する飽和の直鎖または分岐したヒドロカルビルラジカルを表し、例えば、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ヘンコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、スクアリル、構造異性体、特にそれらの単分岐または多分岐の異性体が挙げられる。
「長鎖アルケニル」は、上述の「長鎖アルキル」基のモノ－またはポリ不飽和アナログを表す。
「短鎖アルケニル」（または「低級アルケニル」）は、２～４個、２～６個、または２～７個の炭素原子および１個の二重結合を任意の位置に有する、モノ－またはポリ不飽和、特にモノ不飽和の直鎖または分岐した炭化水素ラジカルを表し、例として、Ｃ２～Ｃ６－アルケニル、例えばエテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－メチルエテニル、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－メチル－１－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－メチル－２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－メチル－１－ブテニル、２－メチル－１－ブテニル、３－メチル－１－ブテニル、１－メチル－２－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、３－メチル－２－ブテニル、１－メチル－３－ブテニル、２－メチル－３－ブテニル、３－メチル－３－ブテニル、１，１－ジメチル－２－プロペニル、１，２－ジメチル－１－プロペニル、１，２－ジメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－プロペニル、１－エチル－２－プロペニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニル、
１－メチル－１－ペンテニル、２－メチル－１－ペンテニル、３－メチル－１－ペンテニル、４－メチル－１－ペンテニル、
１－メチル－２－ペンテニル、２－メチル－２－ペンテニル、３－メチル－２－ペンテニル、４－メチル－２－ペンテニル、
１－メチル－３－ペンテニル、２－メチル－３－ペンテニル、３－メチル－３－ペンテニル、４－メチル－３－ペンテニル、
１－メチル－４－ペンテニル、２－メチル－４－ペンテニル、３－メチル－４－ペンテニル、４－メチル－４－ペンテニル、１，１－ジメチル－２－ブテニル、１，１－ジメチル－３－ブテニル、１，２－ジメチル－１－ブテニル、
１，２－ジメチル－２－ブテニル、１，２－ジメチル－３－ブテニル、１，３－ジメチル－１－ブテニル
１，３－ジメチル－２－ブテニル、１，３－ジメチル－３－ブテニル、２，２－ジメチル－３－ブテニル、
２，３－ジメチル－１－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－３－ブテニル、
３，３－ジメチル－１－ブテニル、３，３－ジメチル－２－ブテニル、１－エチル－１－ブテニル、１－エチル－２－ブテニル、
１－エチル－３－ブテニル、２－エチル－１－ブテニル、２－エチル－２－ブテニル、２－エチル－３－ブテニル、
１，１，２－トリメチル－２－プロペニル、１－エチル－１－メチル－２－プロペニル、１－エチル－２－メチル－１－プロペニルおよび１－エチル－２－メチル－２－プロペニルが挙げられる。
「アルキレン」は、１～１０個の炭素原子を有する直鎖または単分岐もしくは多分岐の炭化水素架橋基を表し、例えば、－ＣＨ２、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）２－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６、－（ＣＨ２）７－、－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－または－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－から選択されるＣ１～Ｃ７－アルキレン基、特に、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）２－ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２－から選択されるＣ１～Ｃ４－アルキレン基が挙げられる。
「アルキリデン」基は、分子本体に二重結合を介して結合された直鎖または分岐した炭化水素の置換基を表す。「アルキリデン」基は、１～６個の炭素原子を含む。そのような「Ｃ１～Ｃ６－アルキリデン」の例として、メチリデン（＝ＣＨ２）、エチリデン、（＝ＣＨ－ＣＨ２）、ｎ－プロピリデン、ｎ－ブチリデン、ｎ－ペンチリデン、ｎ－ヘキシリデン、およびその構造異性体、例えばイソプロピリデンを挙げることができる。
「アルケニリデン」は、２個超の炭素原子を有する上述のアルキリデンのモノ不飽和アナログを表し、「Ｃ３～Ｃ６－アルケニリデン」と呼ばれることもある。ｎ－プロペニリデン、ｎ－ブテニリデン、ｎ－ペンテンリデン、およびｎ－ヘキセニリデンを例として挙げることができる。
上述の残基の「置換基」は、ＯまたはＮのような１つのヘテロ原子を含む。好ましくは、置換基は、独立して、－ＯＨ、Ｃ＝Ｏ、または－ＣＯＯＨから選択される。最も好ましくは、前述の置換基は－ＯＨである。
「単環式または多環式のヒドロカルビル残基」は、１、２または３個の縮合（アネレート化）または非縮合の、任意に置換された、飽和または不飽和の炭化水素環基（または「炭素環式」基）を含む。各環は、互いに独立して、３～８個、特に５～７個、より詳細には６個の環炭素原子を含んでいてもよい。単環式残基の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどの３～７個の炭素環式原子を有する炭素環式ラジカルである「シクロアルキル」基；および対応する「シクロアルケニル」基を挙げることができる。「シクロアルケニル」（または「モノ－またはポリ不飽和シクロアルキル」）は、特に、５～８個、好ましくは最大６個の炭素環員を有する単環式、モノ－またはポリ不飽和の炭素環式基を表し、例えば、モノ不飽和のシクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルおよびシクロオクテニルラジカルが挙げられる。
多環式残基の例として、多環式のシクロアルキルまたはシクロアルケニル環を形成するために、そのようなシクロアルキルおよび／またはシクロアルケニルの１、２または３個が、例えばアネレート化のように一緒に結合されている基を挙げることができる。非限定的な例として、２個のアネレート化された６員の炭素環から構成される２環式のデカリニル残基を挙げることができる。
そのような単環式または多環式のヒドロカルビル残基の置換基の数は、１～１０、特に１～５の置換基で変動してもよい。そのような環式残基の適切な置換基は、低級アルキル、低級アルケニル、アルキリデン、アルケニリデン、またはＯもしくはＮのような１個のヘテロ原子を含む残基、例えば－ＯＨもしくは－ＣＯＯＨから選択される。特に、置換基は、独立して、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、メチルおよびメチリデンから選択される。
不飽和の環式基は、１個以上、例えば１、２または３個のＣ＝Ｃ結合を含んでいてもよく、芳香族、または特に非芳香族である。
上述の単環式または多環式の飽和または不飽和基は、少なくとも１個、例えば１、２、３または４個の、Ｏ、ＮまたはＳなどの環ヘテロ原子を含んでいてもよい。
Figure 2022539510000004
Figure 2022539510000005
Figure 2022539510000006
Figure 2022539510000007
Figure 2022539510000008
Figure 2022539510000009
Figure 2022539510000010
Figure 2022539510000011
Figure 2022539510000012
Figure 2022539510000013
Figure 2022539510000014
Figure 2022539510000015
Figure 2022539510000016
Figure 2022539510000017
詳細な説明
ａ．本発明の特定の実施形態
ｉ）本発明は、ＢＭＶＯ活性を有するポリペチドの使用を含む生体触媒法の以下の特定の実施形態に関する
１．エステル化合物を調製する生体触媒法であって、
（１）一般式Ｉ
Figure 2022539510000018
 ［式中、
「ａ」は、単結合または二重結合を表し、
「ａ」が二重結合を表す場合、「ｘ」は整数１であり、「ａ」が単結合を表す場合、「ｘ」は整数２であり、
Ｒ１は、互いに独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ４－アルキルのような低級アルキル、特にＨまたはメチルを表し、
Ｒ２は、Ｈ、線状または分岐状の、飽和または不飽和の、任意に置換されたヒドロカルビル残基、特に２～２０個、より詳細には５～１５個の炭素原子を有するもの、または基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、
ここで、
Ｃｙｃは、任意に置換された、飽和または不飽和の単環式または多環式のヒドロカルビル残基を表し、
Ａは、化学結合、または任意に置換された直鎖もしくは分岐したアルキレン架橋、特にメチレンを表し、
Ｒ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ３０、Ｃ１～Ｃ２０、特にＣ１～Ｃ１５のヒドロカルビル基、またはＣ１～Ｃ４－アルキルのような低級アルキル基、特にＨまたはメチルを表し、より詳細には、それぞれＨであり、
「ａ」が単結合を表す場合、Ｚは、カルボニル基を含むヒドロカルビル残基、特にアルデヒド基もしくはケト基を表すか、または
「ａ」が二重結合を表す場合、Ｚは、それが結合している炭素原子と一緒になって、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ、特にアルデヒド基もしくはケト基）、または末端カルボニル基、特にアルデヒド基またはケト基を有するアルキリデン残基、特にＣ１～Ｃ６－アルキリデン残基を形成し、
「ａ」が二重結合を表し、Ｚが、それが結合している炭素原子と一緒になってカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）を形成する場合、Ｒ２およびＲ１は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、環式、特に単環式の、飽和または不飽和の、任意に置換された炭素環式環基、特に５～７員環を形成してもよく、
ここで、前述の一般式Ｉのカルボニル化合物は、立体異性体的に純粋な形態で提供されるか、または立体異性体の混合物として提供される］のカルボニル前駆体化合物を、
バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）（ＥＣ１．１３．１４．－）活性を有する天然または組換えポリペプチドと接触させて、特にカルボニル基と前駆体のα－炭素原子との間に酸素原子を導入することによって、それぞれのカルボニルエステル生成物を形成するようにするステップと、
（２）ステップ（１）で形成されたカルボニルエステルを任意に分離するステップであって、前述のカルボニルエステル化合物は、立体異性体的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として得られる、ステップと
を含む、生体触媒法。
２．一般式Ｉのカルボニル化合物において、
「ａ」は化学的二重結合を表し、Ｚは＝Ｏ（マノオールオキシを参照）もしくは＝Ｃ（Ｒ４）－Ｃ（Ｒ５）＝Ｏ（コパラールを参照）を表すか、または
「ａ」は化学的単結合を表し、Ｚは－Ｃ（Ｒ５）＝Ｏ（ノルラブダン化合物３ａ，３ｂを参照）を表し、
ここで、
Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ４－アルキルのような低級アルキル、特にＨまたはメチルを表す、実施形態１記載の生体触媒法。
３．一般式Ｉのカルボニル化合物が、ラブダン型構造、特にラブダン構造、ノルラブダン構造またはジノルラブダン構造を有する、先行する実施形態までのいずれか１つ記載の生体触媒法。
４．形成されるカルボニルエステルが式ＩＩ
Figure 2022539510000019
 ［式中、
Ｒ２およびＲ３は、上記で定義したとおりであり、
Ｅは、前述のカルボニルエステル基を含むヒドロカルビル残基を表すか、またはＥおよびＲ２とは、それらが結合している炭素原子と一緒になって、環状エステル基を形成する］のものである、先行する実施形態までのいずれか１つ記載の生体触媒法。
５．カルボニルエステル基Ｅが、
－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｒ１、
－Ｃ（Ｒ１）２－Ｏ－Ｃ（Ｏ）Ｒ５、
－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ４）－Ｏ－Ｃ（Ｒ５）＝Ｏ；および
ＥおよびＲ２と、それらが結合している炭素原子とによって形成される環状エステル基であって、当該環状エステル環は、例えば式ＩＩａおよびＩＩｂ
Figure 2022539510000020
 ［式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、上記で定義したとおりである］のエステルのように、５～７員環、特に６員環を表す、環状エステル基
から選択される、実施形態４記載の生体触媒法。
６．Ｒ２が、基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、ここで、Ａは、直鎖または分岐したＣ１～Ｃ４－アルキレン架橋、特にメチレンを表し、Ｃｙｃは、単環式または多環式、特に二環式の飽和または不飽和ヒドロカルビル残基、特に、環１個あたり５～７個、特に６個の環原子を含む二環式のアネレート化されたヒドロカルビル残基を表し、ここで、Ｃｙｃは、１～１０個、特に１～５個の置換基で任意に置換されており、特に、前述の置換基は、Ｃ１～Ｃ４－アルキル、Ｃ１～Ｃ４－アルキリデン、Ｃ３～Ｃ６－アルケニリデン、Ｃ２～Ｃ４－アルケニル、オキソ（＝Ｏ）、ヒドロキシ、またはアミノ、特に、メチルのようなＣ１～Ｃ４－アルキル、およびメチリデンのようなＣ１～Ｃ４－アルキリデンから独立して選択され得る、先行する実施形態までのいずれか１つ記載の生体触媒法。
７．Ｒ２のＣｙｃ残基が、テルペン環化により得ることができる、特に二環式残基のような、任意に置換されたデカリニル残基を形成する、先行する実施形態までのいずれか１つ記載の方法。
８．Ｃｙｃ－Ａが、式ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃ
Figure 2022539510000021
 の１５個の炭素原子を有する二環式残基を表す、実施形態７記載の方法。
９．ＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドが、
（１）そのアミノ酸配列内にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ００７４３を有するフラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）タンパク質ファミリードメインを含むポリペプチドの群；またはＰＦ００７４３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を保持するドメイン；
特に、ＢＶＭＯ活性を有する本発明のポリペプチドは、それが１×１０－５未満、または１×１０－１０未満、または１×１０－１５以下、または１×１０－１８以下、特に１×１０－１０～１×１０－１８の範囲で、より詳細には１×１０－１４～１×１０－１７の範囲のｅ値で前述のドメインＰＦ００７４３とマッチする場合、前述のドメインを含むＦＭＯタンパク質ファミリーのメンバーであると同定される。クエリ配列として、ＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの配列が適用される。
例えば、以下のウェブサイトが、そのようなｅ値の検索および計算に利用され得る：
http://pfam.xfam.org/, http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscanもしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/
および／または
（２）以下から選択される配列モチーフ／ドメインの少なくとも１、２、３、４、５、６、７個またはすべてを含むポリペプチドの群から選択されたもの：
配列番号１９７に示されるＧＡＧｘＳＧＬ；
配列番号１９８に示されるＥＫＮｘｘｘｘＧＴＷｘＥＮＲＹＰＧＣＡＣＤＶＰｘＨｘＹＸＸＳＦＥ；
または例えば配列番号１９８の１～１０位、１１～２０位もしくは２１～３２位の残基に対応するような、最大１５個、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号１９９に示されるＬｘＮＡｘＧＩＬＮｘＷｘｘＰｘＩＰＧ
または例えば配列番号１９９の１～１０位もしくは１１～１８位の残基に対応するような、最大１５個、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２００に示されるＬｘｘＫｘＶｘｘＩＧｘＧＳＳＧＩＱＩｘＰｘＩ；
または例えば配列番号２００の１～１０位もしくは１１～１８位の残基に対応するような、最大１５個、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２０１に示されるＧＣＲＲｘＴＰＧｘｘＹＬＥｘＬ
または例えば配列番号２０１の第１～１０位もしくは第１１～１５位の残基に対応するような、最大１５個、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２０２に示されるＣＡＴＧＦＤｘｘｘｘＰＲＦｘｘｘＧ
または例えば配列番号２０２の１～１０位もしくは１１～１７位の残基に対応するような、最大１５個、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２０３に示されるＰＮｘＦｘｘｘＧＰＮｘＰｘｘＮＧｘＶ
または例えば配列番号２０３の１～１０位もしくは１１～１８位の残基に対応するような、最大１５個、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２０４に示されるＡｘＷＰＧＳｘＬＨＹｘＥＡｘｘｘＰＲｘＥＤ
または例えば配列番号２０４の１～１０位もしくは１１～２１位の残基に対応するような、最大１５個、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフであって、
ここで、
上記モチーフ残基ｘは、互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表し、任意に、上記モチーフ１～５のそれぞれにおいて、例えば、保存されたアミノ酸残基（すなわちｘ残基とは異なる）のうち１、２、３、４または５個が、例えばアミノ酸置換によって、特に保存的置換によって修飾されていてもよく、ただし、少なくとも分析的に検出可能な程度までＢＶＭＯ酵素活性を保持していることが条件である。
および／または
（３）以下からなるポリペプチドの群
（ａ）配列番号２に示されるＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号６に示されるＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１０に示されるＳＣＨ２５－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号１３に示されるＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号１６に示されるＡｓｐＷｅＢＶＭＯのアミノ酸配列を含むポリペプチド（優先的な基質であるマノオールオキシおよびその異性体）；
（ｆ）ａ）～ｅ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、先行する実施形態までのいずれか１つ記載の方法。
上記の５個の特定の参照ＢＶＭＯポリペプチドでは、Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ００７４３を有するタンパク質ファミリードメインは、以下の表に示されるアミノ酸残基位置に位置し得る（図３２に描写されたアラインメントおよびそこの枠内の配列部分も参照）。
Figure 2022539510000022
アミノ酸残基の番号付けとは、添付の配列表のそれぞれのタンパク質配列のそれぞれの配列番号における残基番号を指す。
別の特定の実施形態は、配列番号２、６、１０および１３の特定のアミノ酸配列のいずれかによって上記で同定されたＢＶＭＯ活性を有する本発明の新規なポリペプチドのポリペプチドバリアントを指し、ここで、ポリペプチドバリアントは、配列番号２、６、１０、１３および１６のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、非修飾の配列番号２、６、１０、１３および１６のいずれかに対して少なくとも１つの置換修飾を含む。
１０．インビトロまたはインビトロで行う、先行する実施形態までのいずれか１つ記載の方法。
１１．インビボで行われる実施形態１０記載の方法であって、ステップ（１）の前に、特に非ヒト宿主細胞において、ＢＶＭＯ触媒による酵素ステップを行うために必要な酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを組換え発現させることを含む、方法。
１２．非ヒト宿主細胞を、ＢＶＭＯ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸で形質転換する、実施形態１１記載の方法。
１３．前述の非ヒト宿主細胞が、真核細胞または原核細胞、特に植物細胞、細菌細胞または真菌細胞、特に酵母細胞である、実施形態１１または１２記載の方法。
１４．前述の非ヒト宿主細胞が、単細胞生物、多細胞生物に由来する培養細胞、多細胞生物に由来する培養組織中に存在する細胞、または生きた多細胞生物中に存在する細胞である、実施形態１１から１３までのいずれか１つ記載の方法。
１５．前述の非ヒト宿主細胞が、エシェリキア属の細菌、特に大腸菌であり、前述の酵母が、サッカロミセス属、またはピキア属の酵母、特に出芽酵母、または植物細胞である、実施形態１０から１３までのいずれか１つ記載の方法。
１６．一般式Ｉのカルボニル化合物が、
ａ）ラブダンアルデヒド、特にコパラール（またはその立体異性体的に異なる任意の形態であって、例えばシス型もしくはトランス型、またはシス型とトランス型との混合物を含む形態）であって、前述のＢＶＭＯによって変換して、それぞれのノルラブダンホルメート、特に（５Ｓ，９Ｓ，１０Ｓ）－１５－ノルラブダ－８（２０），１３－ジエン－１４－イル－ホルメートまたはその立体異性体的に異なる任意の形態に変換されるもの；
ｂ）ジノルラブダンケトン、特にマノオールオキシまたはその立体異性体的に異なる任意の形態であって、前述のＢＶＭＯによってγ－アンブリルアセテートまたはその立体異性体的に異なる任意の形態に変換されるもの；または
ｃ）ノルラブダンアルデヒド、特にコパールのＣ１分解アナログまたはその立体異性体的に異なる人の形態、特に式
Figure 2022539510000023
 またはその立体異性体的に異なる任意の形態であって、前述のＢＶＭＯによって、特に式
Figure 2022539510000024
 のそれぞれのジノルラブダンホルメートエステルまたはその立体異性体的に異なる任意の形態に変換されるもの
から選択されるラブダン型化合物であり、
ここで、任意に、得られた生成物を、立体異性体的に本質的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として単離する、先行する実施形態までのいずれか１つ記載の方法。
ＢＶＭＯ触媒によるカルボニル化合物のそれぞれのエステルへの変換の更なる特定の発明例を、以下の図式的概観にまとめている：
Figure 2022539510000025
 式中、パラメーター「ｎ」は、１～２０、１～１５、１～１０または１、２、３、４もしくは５の整数である。
１７．実施形態１６のａ）記載の方法であって、ステップ（１）の前に、
ラブダンアルコールのラブダンアルデヒドへの生体触媒的な酸化、特にコパロールのコパラールへの酸化を含み、
このラブダンアルコールは、任意に、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＦＰＰおよびＧＧＰＰから選択される少なくとも１つのテルペニル二リン酸前駆体の生体触媒変換によって形成され、特に、従来技術で知られている１つのステップまたは少なくとも２つのステップの組み合わせで形成される、方法。
前述のラブダンアルコールは、例えば、生体触媒を用いて、
ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から環化反応／脱リン酸化反応において１つのステップで生成され得、
ｂ）ＧＧＰＰから環化反応によって２つのステップで、ラブダン二リン酸、例えばコパリル二リン酸（ＣＰＰ）を形成し、次いで、これを脱リン酸化してラブダンアルコールを得ることで生成され得、
ｃ）ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから、２つの機能を持つＧＧＰＰ合成酵素／ＣＰＰ合成酵素の作用により直接、ラブダン二リン酸、例えばＣＰＰに変換し、次いで、これを脱リン酸化することで生成され得、
これらのステップで使用されるＧＧＰＰはまた、異なる生体触媒ステップによって提供され得：
ｄ）ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから直接ＧＧＰＰを生成するＧＧＰＰ合成酵素が入手可能であり；または
ｅ）ＦＰＰ合成酵素の作用によりＦＰＰを介してＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからＧＧＰＰが提供され得、続いてＧＧＰＰ合成酵素の作用によりＦＰＰがＧＧＰＰに変換される。
１８．ラブダンアルコール、特にコパロールのコパラールへの前述の生体触媒的な酸化を、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＣ１．１．１．－）活性を有する外因性または内因性のポリペプチドによって触媒し；かつ／または
ラブダンアルコールの前述の生体触媒的な形成は、
ｉ）テルペニル二リン酸（ＴＰＰ）ホスファターゼ活性を有するポリペプチドによって触媒される、ラブダン二リン酸のラブダンアルコールへの、特にコパリル二リン酸（ＣＰＰ）のコパロールへの生体触媒的な脱リン酸化、および／または
ｉｉ）ＳｍＣＰＳ２（配列番号１８５）のようなＣＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチドによって触媒される、テルペニル二リン酸前駆体、例えばゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のＣＰＰへの生体触媒的な環化；または例えば、ＰｖＣＰＳのようなプレニル基転移酵素とコパリル二リン酸合成酵素活性とを有する２つの機能を持つポリペプチドによって触媒される、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰのＣＰＰへの生体触媒的な環化、および／または
ｉｉｉ）ＦＰＰからのＧＧＰＰの生体触媒的な形成またはＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからの生体触媒的な形成であって、それぞれＧＧＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチドによって触媒されるもの
から選択される少なくとも１つのステップを含む、実施形態１７記載の方法。
１９．前述の生体触媒的な酸化、特にコパロールのコパラールへの酸化が、
ａ）配列番号１３４に示されるＳＣＨ２３－ＡＤＨ１＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）配列番号１４０に示されるＳＣＨ２４－ＡＤＨ１＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｃ）配列番号１６１に示されるＳＣＨ９４－３９４５＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｄ）配列番号１６４に示されるＳＣＨ８０－０５４０＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｅ）配列番号１６７に示されるＡｚＴｏｌＡＤＨ１＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｆ）配列番号１７９に示されるＣｄＧｅｏＡ＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｇ）ａ）～ｆ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＡＤＨ活性を有するポリペプチド
から選択されるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を有するポリペプチドによって触媒され、
かつ／または
前述の生体触媒的な脱リン酸化、特にコパリル二リン酸（ＣＰＰ）のコパロールへの脱リン酸化が、
ａ）配列番号１７０に示されるＡｓｐＷＥ ＴＰＰのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号１７６に示されるＴａｌＣｅＴＰＰのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および；
ｃ）配列番号１９４に示されるＴａｌＶｅＴＰＰのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
から選択されるテルペニル二リン酸（ＴＰＰ）ホスファターゼ活性を有するポリペプチドによって触媒され、
更なる適切なホスファターゼは、本出願人の先のＥＰ出願番号１８１８２７８３．３にも開示されており、これは参照により組み込まれ、
かつ／または
前述の生体触媒的な環化、特にゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のＣＰＰへの環化は、
配列番号１８５に示されるＳｍＣＰＳ２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むコパリル二リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
から選択されるポリペプチドによって触媒され、
前述の生体触媒的な環化、特にＩＰＰおよびＤＮＭＡＰＰのＣＰＰへの環化は、
配列番号１７３に示されるＰｖＣＰＳのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、プレニル基転移酵素活性およびコパリル二リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
から選択されるポリペプチドによって触媒され、
かつ／または
前述のＧＧＰＰの生体触媒的な形成は、ＧＧＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチドによって触媒され、
ａ）配列番号１８２に示されるｃａｒＧのアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号１９１に示されるＣｒｔＥのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号１７３に示されるＰｖＣＰＳのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、実施形態１８記載の方法。
２０．ステップ（３）として、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離されたカルボニルエステルを処理して、化学合成もしくは生体触媒合成、またはその両方の組み合わせを用いてその誘導体を得ることと、任意に、ステップ（３）の誘導体を単離することとをさらに含み、ここで、前述の誘導体は、特に、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルから選択され得る、先行する実施形態のいずれか記載の方法。
２１．ステップ（３）が、カルボニルエステル化合物をエステラーゼ活性ＥＣ３．１．１（カルボン酸エステルヒドラーゼ）で加水分解して、対応する脱エステル化生成物（アルコールまたはその異性化生成物であってもよい）を得ることと、任意に、ステップ（３）の誘導体を単離することとを含む、実施形態２０記載の方法。
２２．ステップ（３）の脱エステル化生成物を、更なるステップ（４）において、酵素的な酸化還元反応に供し、ここで、特に酸化還元反応は、外因性または内因性のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＣ１．１．１．－）の酵素作用により、ステップ（３）で形成されたアルコール基を対応するケト基に酸化することを含む、実施形態２１記載の方法。
２３．エステラーゼが、
ａ）配列番号２０に示されるＳＣＨ２３－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２４に示されるＳＣＨ２４－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号２８に示されるＳＣＨ２５－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号３１に示されるＳＣＨ４６－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
ｅ）ａ）～ｄ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつエステラーゼ活性を有するポリペプチド
からなる群から選択される、実施形態２１記載の方法。
２４．ａ）ノルラブダンエステル、特にノルラブダンホルメートを、前述のエステラーゼによって脱エステル化して、ノルラブダンカルボニル化合物、特に式
Figure 2022539510000026
 のカルボニル化合物
もしくは前述のカルボニル化合物への異性化を介して変換されるそれぞれのエノールを得ること；
または
ｂ）テトラノルラブダンエステル、特にγ－アンブリルアセテートを、前述のエステラーゼによって脱エステル化して、テトラノルラブダン、特にγ－アンブロールを得ること；または
ｃ）ジノルラブダンホルメートエステル、特に式
Figure 2022539510000027
 のホルメートエステル
もしくはその立体異性体的に異なる任意の形態を、前述のエステラーゼによって脱エステル化し、対応するジノルラブダンアルコール、特に式
Figure 2022539510000028
 のアルコール化合物
もしくはその立体異性体的に異なる任意の形態にし、
ここで、任意に、得られた生成物を、立体異性体的に本質的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として単離する、実施形態２３記載の方法。
２５．ＡＤＨが、
ａ）配列番号１３７に示されるＳＣＨ２３－ＡＤＨ２＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）配列番号１４３に示されるＳＣＨ２４－ＡＤＨ２＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｃ）配列番号１４６に示されるＲｒｈＳｅｃＡＤＨ＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｄ）配列番号１５５に示されるＳＣＨ８０－０６１３５＿ｗｔのアミノ酸配列を含んでいるポリペプチド
ｅ）ａ）～ｄ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＡＤＨ活性を有するポリペプチド
からなる群から選択される、実施形態２２記載の方法。
２６．得られたジノルラブダンアルコール、特に式
Figure 2022539510000029
 のアルコール
またはその立体異性体的に異なる形態を、前述のＡＤＨによって酸化して、対応するジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシにし、
ここで、任意に、得られた生成物を、立体異性体的に本質的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として単離する、実施形態２４記載の方法。
ｉｉ）本発明は、エナール解離活性を有するポリペチドの使用を含む生体触媒法の以下の特定の実施形態に関する：
２７．一般式ＩＶ
Figure 2022539510000030
 ［式中、
Ｒ１は、Ｈまたは低級アルキル、特にメチルを表し、
Ｒ２は、Ｈ、線状もしくは分岐状の、飽和もしくは不飽和の、任意に置換されたヒドロカルビル基、特にアルキル基もしくはアルケニル基、特に最大３０個、最大２０個、最大１５個もしくは最大１０個の炭素原子を有する基、または残基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、
ここで、
Ｃｙｃは、任意に置換された、飽和または不飽和の、特に非芳香族の、単環式または多環式の、特に単環式または二環式の、特に５～７個の環炭素原子を有するヒドロカルビル残基を表し、
Ａは、化学結合、または任意に置換された直鎖もしくは分岐したアルキレン架橋、特にメチレンを表し、
Ｒ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ４－アルキルのような低級アルキル、特にＨまたはメチルを表し、より詳細には、それぞれＨである］
の化合物を調製するための生体触媒法であって、当該方法は、
（１）一般式Ｖ
Figure 2022539510000031
 ［式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義したとおりであり、
Ｒ４は、Ｈまたは低級アルキル、特にＨまたはメチルを表し、
Ｒ５は、Ｈまたは低級アルキル、特にＨを表す］
の対応する非分解前駆体を、
エナール開裂活性を有する天然または組換えポリペプチド、特にα，β－不飽和アルデヒドＣ＝Ｃ結合開裂活性を有するポリペプチドと接触させるステップであって、
ここで、前述の化合物は、立体異性体的に本質的に純粋な形態（例えばＥ型もしくはＺ型）で、または立体異性体の混合物として存在してもよい、ステップと、
（２）任意に、ステップ（１）で得られた式ＩＶの分解生成物を単離するステップであって、ここで、前述の一般式ＩＶの化合物は、立体異性体的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として得ることができる、ステップと
を含む、方法。
２８．前述のエナール開裂活性を有する前述のポリペプチドが、
ａ）Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１４２３２を有する少なくとも１つのＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリードメイン（特に、それらのアミノ酸配列のＣ末端領域内）；および／または
ｂ）Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１４２３１を有する少なくとも１つのＧＸＷＸＧタンパク質ファミリードメイン（特に、それらのアミノ酸配列のＮ末端領域内）；または
ｃ）ＰＦ１４２３２もしくはＰＦ１４２３１と少なくとも９０％の配列同一性を保持するドメイン
を含むポリペプチドの群から選択される、実施形態２７記載の方法。
特に、エナール開裂活性を有する本発明のポリペプチドは、それが１×１０－５未満、または１×１０－１０未満、または１×１０－１５未満、または１×１０－２０未満、または１×１０－２５未満、または１×１０－３０未満、または１×１０－３５以下のｅ値、特に１×１０－２０～１×１０－３２、より詳細には１×１０－２５～１×１０－３１の範囲のｅ値で前述のドメインとマッチする場合、前述のドメインＰＦ１４２３２を含むＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリーのメンバーであると同定される。
例えば、以下のウェブサイトが、そのようなｅ値の検索および計算に利用され得る：
http://pfam.xfam.org/,http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscanもしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/
特に、エナール開裂活性を有する本発明のポリペプチドは、それが１×１０－５未満、１×１０－１０未満、または１×１０－１５未満、または１×１０－２０未満、または１×１０－２５未満、または１×１０－３０未満、または１×１０－３５以下のｅ値、特に１×１０－２０～１×１０－３０の範囲のｅ値とマッチする場合、前述のドメインＰＦ１４２３２を含むＧＸＷＸＧタンパク質ファミリーのメンバーであると同定される。
クエリ配列として、エナール開裂活性を有するポリペプチドの配列が適用される。
例えば、以下のウェブサイトが、そのようなｅ値の検索および計算に利用され得る：
http://pfam.xfam.org/, http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscanもしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/
および／または
前述のエナール開裂活性を有する前述のポリペプチドが、
配列番号２０５に示されるＧ－［Ｙもしくは“－“］－ｘ－Ｗ－ｘ－Ｇ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＬもしくはＩ］－ｘ－［Ｔ，ＳもしくはＲ］－Ｇ－［ＨもしくはＤ］、
または例えば、配列番号２０５の１～８位もしくは９～１３位の残基に対応するような、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２０６に示されるＷ－［Ｙ，ＡもしくはＶ］－Ｇ－Ｋ－ｘ－［ＦもしくはＹ］－ｘ－［ＳもしくはＤ］、
または例えば、配列番号２０６の１～４位もしくは５～８位の残基に対応するような、最大４個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２０７に示される［ＧもしくはＳ］－ｘ－［ＡもしくはＧ］－ｘ－［ＬもしくはＶ］－ｘ－ｘ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＹもしくはＬ］－Ｒ－Ｇ－ｘ－Ｖ、
または例えば、配列番号２０７の１～８位もしくは９～１４位の残基に対応するような、最大１０個もしくは最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ；
配列番号２０８に示される［ＭもしくはＬ］－［ＶもしくはＩ］－Ｙ－Ｄ－ｘ－ｘ－Ｐ－［ＩもしくはＶ］－ｘ－Ｄ－［ＨもしくはＳ］－［ＦもしくはＬ］、
または例えば、配列番号２０８の１～６位もしくは７～１２位の残基に対応するような、最大１０個または最大５個の連続したアミノ酸残基を含むその任意の部分モチーフ
から選択される少なくとも１つの配列モチーフ／ドメインを含むポリペプチドの群から選択され、
ここで、
上記モチーフ残基ｘは、互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表し、任意に、上記モチーフ１～５のそれぞれにおいて、例えば、ｘ残基とは異なる１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が、例えばアミノ酸置換によって、特に保存的置換によって修飾されていてもよく、ただし、少なくとも分析的に検出可能な程度まで酵素を保持していることが条件である。
および／または
前述のエナール開裂活性を有する前述のポリペプチドが、それぞれのアミノ酸配列を含む以下のポリペプチドからなる群：
ａ）配列番号３４に示されるＳＣＨ９４－３９４４
ｂ）配列番号３８に示されるＳＣＨ８０－０５２４１
ｃ）配列番号４２に示されるＰｄｉｇｉｔ７０３３
ｄ）配列番号４６に示されるＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１
ｅ）配列番号４９に示されるＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４
ｆ）配列番号５３に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２
ｇ）配列番号５６に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３
ｈ）配列番号５９に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４
ｉ）配列番号６２に示されるＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４
ｊ）配列番号６９に示されるＲｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４
ｋ）配列番号７２に示されるＣｇａｔＤＵＦ４３３４
ｌ）配列番号７５に示されるＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４
ｍ）配列番号８１に示されるＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４
ｎ）配列番号８７に示されるＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４、および
ｏ）ａ）～ｎ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつ式（１）のテルペン前駆体を分解する前述の酵素活性を保持するポリペプチド
から選択される、実施形態２７記載の方法。
別の特定の実施形態は、配列番号３４、３８、４２、４６、４９、５３、５６、５９、６２、６９、７２、７５、８１および８７の特定のアミノ酸配列のいずれかによって上記で同定されたエナール解離活性を有する本発明の新規なポリペプチドのポリペプチドバリアントを指し、ここで、ポリペプチドバリアントは、配列番号３４、３８、４２、４６、４９、５３、５６、５９、６２、６９、７２、７５、８１および８７のいずれかと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有しかつ配列番号３４、３８、４２、４６、４９、５３、５６、５９、６２、６９、７２、７５、８１および８７のいずれかに対して少なくとも１つの置換修飾を含むアミノ酸配列から選択される。
上記の１４個の特定の参照エナール開裂ポリペプチドでは、Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１４２３２およびＰＦ１４２３１を有するタンパク質ファミリードメインは、以下の表に示されるアミノ酸残基位置に位置し得る（図３１に描写されたアラインメントおよびそこの枠内の配列部分も参照）。
Figure 2022539510000032
アミノ酸残基の番号付けとは、添付の配列表のそれぞれのタンパク質配列のそれぞれの配列番号における残基番号を指す。
２９．前述のエナール開裂ポリペプチドが、以下のポリペプチドからなりかつそれぞれのアミノ酸配列を含む変異体の以下の群：
ａ）配列番号９１に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｔ５１Ａ＿バリアント
ｂ）配列番号９３に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｈ５３Ａ＿バリアント
ｃ）配列番号９５に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｌ５９Ａ＿バリアント
ｄ）配列番号９７に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｗ６４Ａ＿バリアント
ｅ）配列番号１０１に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｓ７１Ａ＿バリアント
ｆ）配列番号１０３に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｒ１０６Ａ＿バリアント
ｇ）配列番号１０５に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｙ１１５Ａ＿バリアント
ｈ）配列番号１０７に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｄ１１６Ａ＿バリアント
ｉ）配列番号１１１に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｍ１３６Ａ＿バリアント
ｊ）配列番号１１３に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｋ１３９Ａ＿バリアント
ｋ）配列番号１１９に示されるＳＣＨ９４－３９４４－Ｒ１５６Ａ＿バリアント、および
ｌ）ａ）～ｌ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつ式（１）のテルペン前駆体を分解する前述の酵素活性を保持しかつ前述の変異したアミノ酸配列の位置を保持するポリペプチド
から選択される、実施形態２８記載の方法。
３０．式Ｖの化合物、例えばテルペン型化合物を適用し、ここで、
Ｒ１は、Ｈまたはメチルを表し、
Ｒ２は、Ｈまたは
ａ）１～２０個、特に１～１０個、１～１５個もしくは１～２０個の炭素原子を有する非環状の、線状もしくは分岐状の、飽和もしくは不飽和のヒドロカルビル残基；または
ｂ）基Ｃｙｃ－Ａ－であって、ここで、Ａは、直鎖もしくは分岐したＣ１～Ｃ４－アルキレン橋、特にメチレンを表し、Ｃｙｃは、単環式もしくは多環式、特に二環式の飽和もしくは不飽和のヒドロカルビル残基、特に、環１個あたり５～７個、特に６個の環原子を含む二環式の環状ヒドロカルビル残基であって、１～１０個、１～５個の置換基で任意に置換されており、当該置換基は、Ｃ１～Ｃ４－アルキル、Ｃ１～Ｃ４－アルキリデン、Ｃ２～Ｃ４－アルケニル、オキソ、ヒドロキシ、またはアミノ、特に、メチルのようなＣ１～Ｃ４－アルキル、およびメチリデンのようなＣ１～Ｃ４－アルキリデンから独立して選択される、ヒドロカルビル残基を表し、
各Ｒ３は、Ｈを表し
Ｒ４は、Ｈまたはメチルを表し、
Ｒ５は、Ｈまたはメチルを表す、
実施形態２７から２９のいずれか記載の方法。
３１．一般式Ｖの化合物がラブダン型構造を有し、かつ／またはＣｙｃ－Ａが、式ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃ
Figure 2022539510000033
 の残基を表す、実施形態３０記載の方法。
３２．式（Ｖ）の前駆体が、ファルネサール、ゲラニルゲラニアール、シトラール、ドデカナール、８－ヒドロキシ－ラブダ－１３－エン－１５－アールのようなラブダン型化合物、およびコパラールから選択され、
それぞれが、その立体異性体の混合物の形態で、またはその立体異性体的に純粋な形態である、実施形態２７から３１までのいずれか１つ記載の方法。
３３．式（ＩＶ）の分解生成物が、ゲラニルアセトン、ファルネシルアセトン、メチルヘプテノン、デカナール；またはマノオールオキシ、または８－ヒドロキシ－１４，１５－ジノルラブダン－１３－オンから選択され、それぞれが、その立体異性体の混合物の形態で、またはその立体異性体的に純粋な形態である、実施形態２７から３２までのいずれか１つ記載の方法。
エナール開裂酵素触媒によるカルボニル化合物のそれぞれの開裂生成物への変換の更なる特定の発明例を、以下の図式的概観にまとめている：
Figure 2022539510000034
 式中、パラメーター「ｎ」は、１～２０、１～１５、１～１０または１、２、３、４もしくは５の整数である。
３４．インビトロまたはインビトロで行う、実施形態２７から３３までのいずれか１つ記載の方法。
３５．ステップ（１）の前に、特に非ヒト宿主細胞において、鎖分解ステップを行うのに必要な酵素活性を有する１つまたは複数のポリペプチドを組換え発現させることを含む、インビボで行われる、実施形態３４記載の方法。
３６．非ヒト宿主細胞を、エナール開裂活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸で形質転換する、実施形態３５記載の方法。
３７．前述の非ヒト宿主細胞が、真核細胞または原核細胞、特に植物細胞、細菌細胞または真菌細胞、特に酵母細胞である、実施形態３５または３６記載の方法。
３８．非ヒト宿主細胞が、単細胞生物、多細胞生物に由来する培養細胞、多細胞生物に由来する培養組織中に存在する細胞、または生きた多細胞生物中に存在する細胞である、実施形態３５から３７までのいずれか１つ記載の方法。
３９．前述の非ヒト宿主細胞が、エシェリキア属の細菌、好ましくは大腸菌であり、前述の酵母が、サッカロミセス属、またはピキア属の酵母、好ましくは出芽酵母、または植物細胞である、実施形態３５から３８までのいずれか１つ記載の方法。
４０．ステップ（３）として、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された式ＩＶの化合物を処理して、化学合成もしくは生体触媒合成、またはその両方の組み合わせを用いてその誘導体を得ることと、任意に、ステップ（３）の誘導体を単離することとを含み、ここで、前述の誘導体は、特に、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルから選択され得る、実施形態２７から３９までのいずれか記載の方法。
４１．ステップ（３）が、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された式ＩＶの化合物を、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）活性を有するポリペプチドで処理して、それぞれのカルボニルエステルを形成するようにするステップを含む、実施形態４０記載の方法。
４２．カルボニルエステル化合物をエステラーゼで加水分解して、アルコールまたはその異性化生成物であってもよい対応する脱エステル化生成物を得ることと、任意に、ステップ（３）の誘導体を単離することとをさらに含む、実施形態４１記載の方法。
４３．ＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドが、実施形態９における上記で定義したとおりである、実施形態４１記載の方法。
４４．エステラーゼが、
ａ）配列番号２０に示されるＳＣＨ２３－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２４に示されるＳＣＨ２４－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号２８に示されるＳＣＨ２５－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号３１に示されるＳＣＨ４６－エステラーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
ｅ）ａ）～ｄ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつエステラーゼ活性を有するポリペプチド
からなる群から選択される、実施形態４２記載の方法。
４５．カルボニル化合物が、ジノルラブダンケトン、特にマノオールオキシであって、前述のＢＶＭＯによって、それぞれのテトラノルラブダニルアセテート、特にγ－アンブリルアセテートに変換されるものである、実施形態４１から４４までのいずれか１つ記載の方法。
４６．テトラノルラブダニルアセテート、特にγ－アンブリルアセテートを、前述のエステラーゼによって脱エステル化して、それぞれのテトラノルラブダン、特にγ－アンブロールを形成する、実施形態４５記載の方法。
４７．先行する実施形態２７から４６までのいずれか１つ記載の方法であって、ステップ（１）の前に、
ラブダンアルコールのラブダンアルデヒドへの生体触媒的な酸化、特にコパロールのコパラールへの酸化を含み、
このラブダンアルコールは、任意に、ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、ＦＰＰおよびＧＧＰＰから選択される少なくとも１つのテルペンリー二リン酸前駆体の生体触媒変換によって形成され、特に、従来技術で知られている１つのステップまたは少なくとも２つのステップの組み合わせで形成される、方法。
前述のラブダンアルコールは、例えば、生体触媒を用いて、
ａ）ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）から環化反応／脱リン酸化反応において１つのステップで生成され得、
ｂ）ＧＧＰＰから環化反応によって２つのステップで、ラブダン二リン酸、例えばコパリル二リン酸（ＣＰＰ）を形成し、次いで、これを脱リン酸化してラブダンアルコールを得ることで生成され得、
ｃ）ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから、２つの機能を持つＧＧＰＰ合成酵素／ＣＰＰ合成酵素の作用により直接、ラブダン二リン酸、例えばＣＰＰに変換し、次いで、これを脱リン酸化することで生成され得、
これらのステップで使用されるＧＧＰＰはまた、異なる生体触媒ステップによって提供され得：
ｄ）ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから直接ＧＧＰＰを生成するＧＧＰＰ合成酵素が入手可能であり；または
ｅ）ＦＰＰ合成酵素の作用によりＦＰＰを介してＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからＧＧＰＰが提供され得、続いてＧＧＰＰ合成酵素の作用によりＦＰＰがＧＧＰＰに変換される。
４８．ラブダンアルコール、特にコパロールのコパラールへの前述の生体触媒的な酸化を、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＣ１．１．１．－）活性を有する外因性または内因性のポリペプチドによって触媒し；かつ／または
ラブダンアルコールの前述の生体触媒的な形成は、
ｉ）テルペニル二リン酸（ＴＰＰ）ホスファターゼ活性を有するポリペプチドによって触媒される、ラブダン二リン酸のラブダンアルコールへの、特にコパリル二リン酸（ＣＰＰ）のコパロールへの生体触媒的な脱リン酸化、および／または
ｉｉ）ＳｍＣＰＳ２（配列番号１８５）のようなＣＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチドによって触媒される、テルペニル二リン酸前駆体、例えばゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のＣＰＰへの生体触媒的な環化；または例えば、ＰｖＣＰＳのようなプレニル基転移酵素とコパリル二リン酸合成酵素活性とを有する２つの機能を持つポリペプチドによって触媒される、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰのＣＰＰへの生体触媒的な環化、および／または
ｉｉｉ）ＦＰＰからのＧＧＰＰの生体触媒的な形成またはＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからの生体触媒的な形成であって、それぞれＧＧＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチドによって触媒されるもの
から選択される少なくとも１つのステップを含む、実施形態４７記載の方法。
４９．前述の生体触媒的な酸化、特にコパロールのコパラールへの酸化が、
ａ）配列番号１３４に示されるＳＣＨ２３－ＡＤＨ１＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）配列番号１４０に示されるＳＣＨ２４－ＡＤＨ１＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｃ）配列番号１６１に示されるＳＣＨ９４－３９４５＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｄ）配列番号１６４に示されるＳＣＨ８０－０５４０＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｅ）配列番号１６７に示されるＡｚＴｏｌＡＤＨ１＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｆ）配列番号１７９に示されるＣｄＧｅｏＡ＿ｗｔのアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｇ）ａ）～ｆ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつＡＤＨ活性を有するポリペプチド
から選択されるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を有するポリペプチドによって触媒され、
かつ／または
前述の生体触媒的な脱リン酸化、特にコパリル二リン酸（ＣＰＰ）のコパロールへの脱リン酸化が、
ｄ）配列番号１７０に示されるＡｓｐＷＥ ＴＰＰのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号１７６に示されるＴａｌＣｅＴＰＰのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および；
ｆ）配列番号１９４に示されるＴａｌＶｅＴＰＰのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
から選択されるテルペニル二リン酸（ＴＰＰ）ホスファターゼ活性を有するポリペプチドによって触媒され、
更なる適切なホスファターゼは、本出願人の先のＥＰ出願番号１８１８２７８３．３にも開示されており、これは参照により組み込まれ、
かつ／または
前述の生体触媒的な環化、特にゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）のＣＰＰへの環化は、
配列番号１８５に示されるＳｍＣＰＳ２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むコパリル二リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
から選択されるポリペプチドによって触媒され、
前述の生体触媒的な環化、特にＩＰＰおよびＤＮＭＡＰＰのＣＰＰへの環化は、
配列番号１７３に示されるＰｖＣＰＳのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、プレニル基転移酵素活性およびコパリル二リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
から選択されるポリペプチドによって触媒され、
かつ／または
前述のＧＧＰＰの生体触媒的な形成は、ＧＧＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチドによって触媒され、
ｄ）配列番号１８２に示されるｃａｒＧのアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号１９１に示されるＣｒｔＥのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ）配列番号１７３に示されるＰｖＣＰＳのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、実施形態４８記載の方法。
ｉｉｉ）本発明は、エナール解離酵素および対応するコーディング配列に関する以下の特定の実施形態に関する
５０．実施形態２８および２９のいずれかにおいて定義された、エナール開裂活性、特にα，β－不飽和アルデヒドＣ＝Ｃ結合開裂酵素の活性を有する、単離されたポリペプチド。
本発明のポリペプチドは、エナール開裂活性を有する酵素の活性部分配列、例えば触媒ドメインまたは活性部位を含む、すべての活性形態を含む。
５１．実施形態５０のポリペプチドをコードする核酸配列、特に配列番号３３、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６８、７０、７１、７３、７４、７６、８０、８２、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、および１２０から選択された核酸配列、ならびに配列番号３３、３５、３６、３７、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５７、５８、６０、６１、６３、６４、６８、７０、７１、７３、７４、７６、８０、８２、８６、８８、９２、９４、９６、９８、１０２、１０４、１０６、１０８、１１２、および１２０の前述の配列までのいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の度合いを有する核酸配列を含む、単離された核酸分子。
５２．実施形態５０の少なくとも１個の核酸分子のヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
５３．実施形態５１記載の少なくとも１個の核酸分子のヌクレオチド配列、または実施形態５２記載の少なくとも１個の発現カセットを含む発現ベクター。
５４．ベクターが、原核生物ベクター、ウイルスベクターまたは真核生物ベクターである、実施形態５３記載の発現ベクター。
５５．プラスミドまたは２個以上のプラスミドの組み合わせである、実施形態５３または５４記載の発現ベクター。
５６．実施形態５１において定義された少なくとも１個の核酸分子、または実施形態５２記載の少なくとも１個の発現カセット、または実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の発現ベクターを含む、組換え非ヒト宿主細胞。
５７．少なくとも１個の核酸分子または少なくとも１個の発現カセットが、細胞のゲノム内に安定的に組み込まれている、実施形態５６記載の宿主細胞。
５８．原核細胞または真核細胞、特に植物細胞、細菌または真菌細胞、特に酵母である、実施形態５６または５７記載の宿主細胞。
５９．単細胞生物、多細胞生物に由来する培養細胞、多細胞生物に由来する培養組織中に存在する細胞、または生きた多細胞生物中に存在する細胞である、実施形態５６から５８までのいずれか記載の宿主細胞。
６０．エシェリキア属の細菌、好ましくは大腸菌、またはサッカロミセス属の酵母細胞、好ましくは出芽酵母、またはピキア属の酵母細胞、好ましくはピキア酵母（P. pastoris）である、実施形態５９記載の宿主細胞。
６１．実施形態５１記載のエナール開裂活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを生成する方法であって、当該方法は、
（ｉ）実施形態５７から６０までのいずれか１つ記載の非ヒト宿主細胞において、前述の少なくとも１つのポリペプチドを発現させるステップと、
（ｉｉ）任意に、ステップ（ｉ）で使用された非ヒト宿主細胞から前述の少なくとも１つのポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
６２．ステップ（ｉ）の前に：実施形態５１において定義された少なくとも１個の核酸分子、または実施形態５２記載の少なくとも１個の発現カセット、または実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の少なくとも１個の発現ベクターを非ヒト細胞内に導入することによって、ステップ（ｉ）で使用された非ヒト宿主細胞を調製し、このようにして、実施形態５０に従ったエナール開裂活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを発現または過剰発現させることができる宿主細胞を得ることをさらに含む、実施形態６１記載の方法。
６３．エナール開裂活性を有する変異型ポリペプチドを調製するための方法であって、当該方法は、
（ｉ）実施形態５１に従った核酸分子を提供するステップと、
（ｉｉ）前述の核酸分子のヌクレオチド配列、特に実施形態５０記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、少なくとも１個の変異型核酸分子が得られるように修飾するステップと、
（ｉｉｉ）前述の変異型核酸分子を非ヒト宿主細胞内で組換え発現させるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた発現産物を、エナール開裂活性を有する少なくとも１つの変異型ポリペプチドについてスクリーニングするステップと、
（ｖ）任意に、発現産物が所望のエナール開裂活性を有する変異型ポリペプチドを含むまで、変異型核酸分子を用いてステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）を繰り返すステップと、
（ｖｉ）任意に、所望のエナール開裂活性を有する変異型ポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
ｉｖ）本発明は、ＢＶＭＯ酵素および対応するコーディング配列に関する以下の特定の実施形態に関する
６４．実施形態９において定義された、ＢＶＭＯ活性を有する単離されたポリペプチド。
本発明のポリペプチドは、ＢＶＭＯ活性を有する酵素の活性部分配列、例えば触媒ドメインまたは活性部位を含む、すべての活性形態を含む。
６５．実施形態６４記載のポリペプチドをコードする核酸配列、特に配列番号１、３、４、５、７、８、９、１１、１２、１４、１５、１７および１８から選択された核酸配列、ならびに配列番号１、３、４、５、７、８、９、１１、１２、１４、１５、１７および１８の前述の配列のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性の度合いを有する核酸配列を含む、単離された核酸分子。
６６．実施形態６５記載の少なくとも１個の核酸分子のヌクレオチド配列を含む発現カセット。
６７．実施形態６５記載の少なくとも１個の核酸分子のヌクレオチド配列、または実施形態６６記載の少なくとも１個の発現カセットを含む発現ベクター。
６８．ベクターが、原核生物ベクター、ウイルスベクターまたは真核生物ベクターである、実施形態６７記載の発現ベクター。
６９．プラスミドまたは２つ以上のプラスミドの組み合わせである、実施形態６７または６８記載の発現ベクター。
７０．実施形態６５において定義された少なくとも１個の核酸分子、または実施形態６６記載の少なくとも１個の発現カセット、または実施形態６７から６９までのいずれか１つ記載の少なくとも１個の発現ベクターを含む、組換え非ヒト宿主細胞。
７１．少なくとも１個の核酸分子または少なくとも１個の発現カセットが、細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、実施形態７０記載の宿主細胞。
７２．原核細胞または真核細胞、特に植物細胞、細菌または真菌細胞、特に酵母である、実施形態７０または７１記載の宿主細胞。
７３．単細胞生物、多細胞生物に由来する培養細胞、多細胞生物に由来する培養組織中に存在する細胞、または生きた多細胞生物中に存在する細胞である、実施形態７０から７２までのいずれか１つ記載の宿主細胞。
７４．エシェリキア属の細菌、好ましくは大腸菌、またはサッカロミセス属の酵母細胞、好ましくは出芽酵母、またはピキア属の酵母細胞、好ましくはピキア酵母である、実施形態７２記載の宿主細胞。
７５．実施形態６４に従ったＢＶＭＯ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを生成する方法であって、
（ｉ）実施形態７０から７４までのいずれか１つ記載の非ヒト宿主細胞において、前述の少なくとも１つのポリペプチドを発現させるステップと、
（ｉｉ）任意に、ステップ（ｉ）で使用された非ヒト宿主細胞から前述の少なくとも１つのポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
７６．ステップ（ｉ）の前に：実施形態６５において定義された少なくとも１個の核酸分子、または実施形態６６記載の少なくとも１個の発現カセット、または実施形態６７から６９までのいずれか１つ記載の少なくとも１個の発現ベクターを非ヒト細胞内に導入することによって、ステップ（ｉ）で使用された非ヒト宿主細胞を調製し、このようにして、実施形態６４に従ったＢＶＭＯ活性を有する少なくとも１つのポリペプチドを発現または過剰発現させることができる宿主細胞を得ることをさらに含む、実施形態７５記載の方法。
７７．ＢＶＭＯ活性を有する変異型ポリペプチドを調製するための方法であって、当該方法は、
（ｉ）実施形態６５に従った核酸分子を提供するステップと、
（ｉｉ）前述の核酸分子のヌクレオチド配列、特に実施形態６４記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、少なくとも１個の変異型核酸分子が得られるように修飾するステップと、
（ｉｉｉ）前述の変異型核酸分子を非ヒト宿主細胞内で組換え発現させるステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた発現産物を、ＢＶＭＯ活性を有する少なくとも１つの変異型ポリペプチドについてスクリーニングするステップと、
（ｖ）任意に、発現産物が所望のＢＶＭＯ活性を有する変異型ポリペプチドを含むまで、変異型核酸分子を用いてステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）を繰り返すステップと、
（ｖｉ）任意に、所望のＢＶＭＯ活性を有する変異型ポリペプチドを単離するステップと
を含む、方法。
ｖ）本発明は、エナール開裂活性および／またはＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドを適用することによってラブダン化合物を変換する生体触媒多段階インビボ法に関する以下の特定の実施形態に関する
７８．ラブダン型テルペン類を調製するためのインビボ法であって、
当該方法は、以下の一連の反応ステップ：
（１）任意に、外因性または内因性のＡＤＨポリペプチド、特に実施形態１９または４９のいずれかにおいて定義されたＡＤＨの酵素作用により、ラブダンアルコール、特にコパロールをそれぞれのラブダンアルデヒド、特にコパラールに変換するステップ；
（２）ステップ（１）の前述のラブダンアルデヒド、特にコパラールを、エナール開裂活性を有するポリペプチド、特に実施形態２８および２９のいずれかにおいて定義されたポリペプチドの作用により、それぞれのジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシに変換するステップ；
（３）任意に、ステップ（２）の前述のジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシを、ＢＶＭＯ活性を有するポリペプチド、特に実施形態９において定義されたＢＶＭＯの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアセテート、特にγ－アンブリルアセテートに変換するステップ；
（４）任意に、ステップ（３）の前述のテトラノルラブダニルアセテート、特にγ－アンブリルアセテートを、エステラーゼ活性を有するポリペプチド、特に実施形態２３および４４のいずれかにおいて定義されたエステラーゼの作用により、それぞれのテトラノルラブダンアルコール、特にγ－アンブロールに変換するステップ；ならびに任意に、
（５）ステップ（２）、（３）または（４）の生成物を単離するステップ
を触媒するのに必要な酵素活性を有する一連のポリペプチドを発現する組換え宿主を提供することを含む、方法。
７９．ラブダン型シクロテルペン類を調製するためのインビボ法であって、
当該方法は、以下の一連の反応ステップ：
（１）任意に、外因性または内因性のＡＤＨポリペプチド、特に実施形態１９または４９のいずれかにおいて定義されたＡＤＨの酵素作用により、ラブダンアルコール、特にコパロールをそれぞれのラブダンアルデヒド、特にコパラールに変換するステップ；
（２）ステップ（１）の前述のラブダンアルデヒド、特にコパラールを、ＢＶＭＯ活性を有するポリペプチド、特に実施形態９のいずれかにおいて定義されたＢＶＭＯの作用により、それぞれのノルラブダンエステル化合物、特に［４－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］－２－メチル－ブタ－１－エニル］ホルメート（化合物１ａ，１ｂ）に変換するステップ；
（３）ステップ（２）の前述のラブダンエステル化合物、特に［４－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］－２－メチル－ブタ－１－エニル］ホルメート（化合物１ａ，１ｂ）を、任意に、エステラーゼ活性を有するポリペプチド、特に実施形態２３または４４のいずれかにおいて定義されたエステラーゼの作用により、それぞれのノルラブダンアルデヒド、特に４－［（１Ｓ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］－２－メチル－ブタナール（化合物３ａ，３ｂ）に変換するステップ；
（４）ステップ（３）の前述のノルラブダンアルデヒド、特に４－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］－２－メチル－ブタナール（化合物３ａ，３ｂ）を、ＢＶＭＯ活性を有するポリペプチド、特に実施形態９のいずれかにおいて定義されたＢＶＭＯの作用により、それぞれのジノルラブダンエステル、特に［３－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］－１－メチル－プロピル］ホルメート（化合物４ａ，４ｂ）に変換するステップ；
（５）ステップ（４）の前述のジノルラブダンエステル、特に［３－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］－１－メチル－プロピル］ホルメート（化合物４ａ，４ｂ）を、エステラーゼ活性を有するポリペプチド、特に実施形態２３または４４のいずれかにおいて定義されたエステラーゼの作用により、それぞれのジノルラブダンアルコール、特に４－［（１Ｓ，４ａＳ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］ブタン－２－オール（化合物５ａ，５ｂ）に変換するステップ；
（６）任意に、ステップ（５）の前述のジノルラブダンアルコール、特に４－［（１Ｓ，８ａＳ）－５，５，８ａ－トリメチル－２－メチレン－デカリン－１－イル］ブタン－２－オール（化合物５ａ，５ｂ）を、ＡＤＨ活性を有する外因性または内因性のポリペプチド、特に実施形態１９または４９のいずれかにおいて定義されたＡＤＨの作用により、それぞれのジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシに変換するステップ；
（７）任意に、ステップ（６）の前述のジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシを、ＢＶＭＯ活性を有するポリペプチド、特に実施形態９のいずれかにおいて定義されたＢＶＭＯの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアセテート、特にγ－アンブリルアセテートに変換するステップ；
（８）ステップ（７）の前述のテトラノルラブダニルアセテート、特にγ－アンブリルアセテートを、エステラーゼ活性を有するポリペプチド、特に実施形態２３または４４のいずれかにおいて定義されたエステラーゼの作用により、それぞれのテトラノルラブダンアルコール、特にγ－アンブロールに変換するステップ；ならびに任意に、
（９）ステップ（５）、（６）、（７）または（８）の生成物を単離するステップ；
を触媒するのに必要な酵素活性を有する一連のポリペプチドを発現する組換え宿主を提供することを含む、方法。
８０．ステップ（１）および（６）で適用されるＡＤＨが同一もしくは異なり、外因性もしくは内因性であり、かつ／または
ステップ（２）、（４）および（７）で適用されるＢＶＭＯが同一もしくは異なり、かつ／または
ステップ（３）、（５）および（８）で適用されるエステラーゼが、同一もしくは異なる、
実施形態７９記載の方法。
８１．組換え宿主を、ステップ（１）の前に、以下の一連の反応ステップ：
（ｉ）ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を、ＧＧＰＰ合成酵素活性を有するポリペプチド、特に実施形態１９および４９のいずれかにおいて定義されたＧＧＰＰ合成酵素の作用により生体触媒的に形成するステップ；
（ｉｉ）ＧＧＰＰを前述のラブダン二リン酸、特にコパリル二リン酸（ＣＰＰ）に、ラブダン二リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド、特に実施形態１９および４９のいずれかにおいて定義されたＣＰＰ合成酵素活性を含むポリペプチドの作用により、生体触媒的に環化するステップ；
（ｉｉｉ）ラブダン二リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド、特に実施形態１９および４９のいずれかにおいて定義されたＴＰＰホスファターゼ活性を有するポリペプチドの作用により、前述のラブダン二リン酸を前述のラブダンアルコールに、特にＣＰＰをコパロールに生体触媒的に脱リン酸化するステップ；
を触媒するのに必要な酵素活性を有する一連のポリペプチドを追加的に発現させて適用する、実施形態７８から８０までのいずれか１つ記載の方法。
８２．組換え宿主を、メバロン酸経路またはＭＥＰ経路の酵素ステップを触媒するポリペプチドの少なくとも１つを追加的に発現させて適用する、実施形態７８から８１までのいずれか１つ記載の方法。
８３．それぞれの触媒活性ポリペプチドのコーディング配列を１個以上の発現ベクターに担持し、かつ／または宿主のゲノムに安定的に組み込まれた組換え宿主を適用する、実施形態７８から８２までのいずれか１つ記載の方法。
８４．インビボで行われる実施形態１から４９および７８から８３までのいずれか１つ記載の方法であって、当該方法は、ステップ（１）の前に、それぞれの生体触媒変換のステップまたは複数のステップを行うのに必要な酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする１個以上の核酸分子を、非ヒト宿主生物または細胞に導入し、任意に、それぞれのゲノムに安定的に組み込むことを含む、方法。
８５．ＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰ；またはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を内因的に産生する非ヒト宿主生物もしくは細胞；または増加した量のＦＰＰおよび／またはＧＧＰＰおよび／またはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を産生するように遺伝子改変された非ヒト宿主生物を適用することによって行われる、実施形態１から４９および７８から８３までのいずれか１つ記載の方法。
本発明において適用可能なこれらの宿主細胞または生物の中には、ＦＰＰもしくはＧＧＰＰ、またはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を自然に産生しないものがある。非環状テルペンピロリン酸前駆体、例えばＦＰＰもしくはＧＧＰＰ、またはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を自然には産生しないそのような生物または細胞は、前述の前駆体を産生するように遺伝的に改変されてもよい。そのような生物または細胞は、例えば、本明細書に記載されている核酸による修飾の前に、そのように形質転換することができる。非環状テルペンピロリン酸前駆体、例えばＦＰＰもしくはＧＧＰＰ、またはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を産生するように生物を形質転換するための方法は、当該技術分野で既に知られている。例えば、メバロン酸経路の酵素活性を導入することは、生物にＦＰＰもしくはＧＧＰＰ、またはＩＰＰとＤＭＡＰＰとの混合物を産生させるための適切な戦略である。
８６．実施形態７８から８５までのいずれかにおいて定義された組換え微生物。
ｖｉ）本発明は、本明細書に記載されている生体触媒法によって得られた化学的な中間化合物を、特に関心が持たれる更なる最終生成物にさらに変換することに関連する、以下の特定の実施形態に関する
８７．エポキシ－テトラノルラブダン化合物、特にアンブロックスを調製する方法であって、当該方法は、
（１）テトラノルラブダンアルコール、特にγ－アンブロール、またはテトラノルラブダンアセテート、特にγ－アンブリルアセテート、またはジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシを提供するステップであって、
請求項１から４９または７８から８３までのいずれかにおいて定義された１つ以上の方法ステップを含む生体触媒法を適用し、任意に、前述の生成物を単離することによって行うステップと、
（２）ステップ（１）の前述の生成物を、１つ以上の化学的および／または生化学的な変換ステップを適用することによって、エポキシ－テトラノルラブダン、特にアンブロックスに変換するステップと
を含む、方法。
８８．ジエポキシ－ジノルラブダン、特にＺ１１を調製する方法であって、当該方法は、
（１）前述のジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシの形成をもたらす方法であって、請求項１から４９または７８から８４までのいずれかにおいて定義された１つ以上の方法ステップを含む方法を適用することによって、ジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシを提供し、任意に、前述のジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシを単離するステップと、
（２）ステップ（１）の前述のジノルラブダンカルボニル化合物、特にマノオールオキシを、１つ以上の化学的および／または生化学的な変換ステップを適用することによって、前述のジエポキシ－ジノルラブダン、特にＺ－１１に変換するステップと
を含む、方法。
ｂ．本発明により適用可能なポリペプチド
これに関連して、以下の定義が適用される：
「ポリペプチド」または「ペプチド」という一般的な用語は、互換的に使用され得、天然または合成の連続した、ペプチド的に結合したアミノ酸残基の線状鎖または配列を指し、約１０残基～最大１，０００残基超を含んでいる。最大３０残基の短鎖ポリペプチドは「オリゴペプチド」とも称される。
「タンパク質」という用語は、１つ以上のポリペプチドからなる高分子構造体を指す。その（複数の）ポリペプチドのアミノ酸配列は、タンパク質の「一次構造」を表す。アミノ酸配列はまた、ポリペプチド鎖内に形成されるα－ヘリカル構造およびβ－シート構造などの特殊な構造要素の形成によって、タンパク質の「二次構造」を予め決定する。そのような複数の二次構造要素の配置が、タンパク質の「三次構造」または空間的配置を規定する。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、前述の鎖が空間的に配置されてタンパク質の「四次構造」が形成される。タンパク質が正しく空間的に配置されていること、すなわち「フォールディング」は、タンパク質が機能するための前提条件である。変性またはアンフォールディングにより、タンパク質の機能は破壊される。そのような破壊が可逆的であれば、リフォールディングによってタンパク質の機能が回復され得る。
本明細書で言及される典型的なタンパク質の機能とは、「酵素機能」であり、すなわち、基質、例えば化合物に対してタンパク質が生体触媒として働き、前述の基質の生成物への変換を触媒する。酵素は、基質および／または産物に対する特異性の度合いが高い場合もあれば低い場合もある。
したがって、本明細書で特定の「活性」を有すると言及される「ポリペプチド」は、指定された活性、例えば特定の酵素活性を示す正しくフォールディングされたタンパク質を暗黙的に指す。
したがって、特に断りのない限り、「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」および「酵素」という用語も包含する。
同様に、「ポリペプチド断片」という用語は、「タンパク質断片」および「酵素断片」という用語を包含する。
「単離されたポリペプチド」という用語は、組換え法、生化学的法および合成法を含む、当該技術分野で知られている任意の方法または方法の組み合わせによって自然環境から除去されたアミノ酸配列を指す。
「標的ペプチド」とは、タンパク質、またはポリペプチドを、細胞内オルガネラ、すなわちミトコンドリア、またはプラスチド、または細胞外空間に標的化するアミノ酸配列を指す（分泌シグナルペプチド）。標的ペプチドをコードする核酸配列は、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端、例えばＮ－末端をコードする核酸配列に融合してもよいし、ネイティブな標的化ポリペプチドを置き換えるために使用してもよい。
本発明はまた、本明細書に具体的に記載されているポリペプチドの「機能的等価物」（「アナログ」または「機能的変異」とも称される）に関する。
例えば、「機能的等価物」とは、酵素的なテルペニル二リン酸合成酵素活性、またはテルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を判定するために使用される試験において、本明細書に具体的に記載されているポリペプチドの活性と比較して、少なくとも１～１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％高いまたは低い活性を示すポリペプチドを指す。
本発明によれば、「機能的等価物」は、本明細書に記載されているアミノ酸配列の少なくとも１つの配列位置において、具体的に記載されているものとは異なるアミノ酸を有するが、それにもかかわらず、前述の生物学的活性のうちの１つ、例えば酵素活性を有する、特定の変異体も対象に含める。したがって、「機能的等価物」は、１個以上、例えば１～２０個、特に１～１５個または５～１０個のアミノ酸の付加、置換、特に保存的な置換、欠失および／または逆位によって得ることができる変異体であり、ここで、記載された変化は、本発明による特性のプロファイルを有する変異体をもたらすことを条件に、任意の配列位置で行われてよい。特に、変異体と未変化のポリペプチドとの間で活性パターンが定性的に一致している場合、すなわち、例えば、同じアゴニストまたはアンタゴニストまたは基質との相互作用であって、それが異なる速度で（すなわち、ＥＣ５０もしくはＩＣ５０値、または現在の技術分野で適切な他の任意のパラメーターで表される）観察される場合、機能的同等性も提供される。適切な（保存的な）アミノ酸置換の例を以下の表に示す。
Figure 2022539510000035
上記の意味における「機能的等価物」は、本明細書に記載されているポリペプチドの「前駆体」、ならびにポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
「前駆体」とは、その場合、所望の生物学的活性を有するか、または有しないポリペプチドの天然または合成前駆体である。
「塩」という表現は、本発明によるタンパク質分子のアミノ基の酸付加の塩だけでなく、カルボキシル基の塩も意味する。カルボキシル基の塩は、既知の方法で生成することができ、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛の塩、ならびに有機塩基との塩、例えば、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジンなどのアミン類を含む。酸付加の塩、例えば、塩酸または硫酸などの無機酸との塩、ならびに酢酸およびシュウ酸などの有機酸との塩も本発明の対象に含まれる。
本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」は、既知の技術を用いて、機能的なアミノ酸側基上、またはそのＮ－末端もしくはＣ－末端で生成することもできる。そのような誘導体は、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンとの反応によって得ることができるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応によって生成される遊離アミノ基のＮ－アシル誘導体；またはアシル基との反応によって生成される遊離ヒドロキシル基のＯ－アシル誘導体を含む。
「機能的等価物」には、当然ながら、自然に存在するバリアントだけでなく、他の生物から得ることができるポリペプチドも含まれる。例えば、相同性配列領域のエリアを配列比較によって確立し、本発明の具体的なパラメーターに基づいて等価なポリペプチドを決定することができる。
「機能的等価物」には、本発明によるポリペプチドの個々のドメインもしくは配列モチーフのような「断片」、またはＮ末端およびＣ末端が切断された形態も含まれ、これらは所望の生物学的機能を示しても示さなくてもよい。好ましくは、そのような「断片」は、所望の生物学的機能を少なくとも定性的に保持する。
「機能的等価物」とはさらに、本明細書に記載されているポリペプチド配列またはそれに由来する機能的等価物のうちの１つと、機能的に異なる少なくとも１つの更なる異種配列とを、機能的にＮ末端またはＣ末端で結合している（すなわち、融合タンパク質部分の実質的な相互機能障害がない）融合タンパク質である。これらの異種配列の非限定的な例は、例えば、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
本発明に従って同様に含まれる「機能的等価物」はまた、具体的に開示されているポリペプチドに対するホモログである。これらは、具体的に開示されているアミノ酸配列の１つと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０または８５％、例えば９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の相同性（または同一性）を有し、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448のアルゴリズムによって計算される。本発明による相同性ポリペプチドのパーセンテージで表される相同性または同一性とは、特に、本明細書に具体的に記載されているアミノ酸配列のうちの１つの全長に基づいて、アミノ酸残基のパーセンテージで表される同一性を意味する。
パーセンテージで表される同一性データは、ＢＬＡＳＴアラインメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（protein-protein BLAST）を用いるか、または本明細書に後で規定されるＣｌｕｓｔａｌ設定を適用することによって決定され得る。
タンパク質のグリコシル化の可能性がある場合、本発明による「機能的等価物」は、グリコシル化パターンを変更することによって得ることができる修飾形態だけでなく、脱グリコシル化またはグリコシル化された形態の本明細書に記載されているポリペプチドも含む。
本発明によるポリペプチドの機能的等価物またはホモログは、突然変異誘発によって、例えば点変異によって、タンパク質の延長もしくは短縮によって、または以下でより詳細に説明されるように生成することができる。
本発明によるポリペプチドの機能的等価物またはホモログは、変異体、例えば短縮変異体の変異体のコンビナトリアルデータベースをスクリーニングすることによって同定することができる。例えば、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発によって、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的ライゲーションによって、タンパク質バリアントの変化に富んだデータベースを作成することができる。縮退したオリゴヌクレオチド配列から潜在的な相同性のデータベースを作成するために使用することができる非常に多くの方法がある。縮退した遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機で行うことができ、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。縮退したゲノムを使用することで、所望される一連の潜在的なタンパク質配列をコードするすべての配列を混合して供給することが可能になる。縮退したオリゴヌクレオチドの合成法は、当業者に知られている。
先行技術では、点変異または短縮によって生成されたコンビナトリアルデータベースの遺伝子産物のスクリーニング、および選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのいくつかの技術が知られている。これらの技術は、本発明によるホモログのコンビナトリアル突然変異誘発によって産生された遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適応することができる。大規模な遺伝子バンクのスクリーニングに最も頻繁に使用される技術は、ハイスループット分析に基づいており、複製可能な発現ベクターにおける遺伝子バンクのクローニング、結果として得られたベクターデータベースを用いた適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出により、検出された産物の遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。データベースの機能的変異体の頻度を高める技術であるＲＥＭ（再帰的アンサンブル突然変異）は、相同性を同定するために、スクリーニング試験と組み合わせて使用することができる。
本明細書で提供される実施形態は、本明細書で開示されているポリペプチドのオルソログおよびパラログならびにそのようなオルソログおよびパラログを同定および分離するための方法を提供する。「オルソログ」および「パラログ」という用語の定義を以下に示し、アミノ酸配列および核酸配列に適用する。
本発明のポリペプチドは、本発明の酵素の活性部分配列、例えば触媒ドメインまたは活性部位を含む、すべての活性形態を含む。一態様では、本発明は、以下に記載される触媒ドメインまたは活性部位を提供する。一態様では、本発明は、Ｐｆａｍ（http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml）などのデータベース（これは、多くの一般的なタンパク質ファミリーをカバーする多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデルの大規模なコレクションである、The Pfam protein families database, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S. R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K. L. Howe, M. Marshall, and E. L. L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30(1):276-280, 2002）または同等のデータベース、例えばＩｎｔｅｒＰｒｏおよびＳＭＡＲＴデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html, http://smart.embl-heidelberg.de/）の使用により予測される活性部位ドメインを含むか、もしくはそれからなるペプチドまたはポリペプチドを提供する。
本発明はまた、所望の活性を有する「ポリペプチドバリアント」を包含し、ここで、バリアントポリペプチドは、特定の配列番号で参照される特定の、特に天然のアミノ酸配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列から選択され、前述の配列番号に対する少なくとも１つの置換修飾を含む。
ｃ．本発明により適用可能なコーディング核酸配列
これに関連して、以下の定義が適用される：
「核酸配列」、「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの配列を意味するものとして互換的に使用される。核酸配列は、任意の長さの一本鎖もしくは二本鎖のデオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであってもよく、遺伝子のコーディング配列および非コーディング配列、エクソン、イントロン、センスおよびアンチセンスの相補的配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、組換え核酸配列、単離および精製された自然に存在するＤＮＡおよび／またはＲＮＡ配列、合成ＤＮＡおよびＲＮＡ配列、断片、プライマーおよび核酸プローブを含む。当業者であれば、ＲＮＡの核酸配列は、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換されているという違いはあるものの、ＤＮＡ配列と同一であることを認識している。「核酸配列」という用語はまた、ポリヌクレオチド分子もしくはオリゴヌクレオチド分子を、別個の断片の形態で、またはより大きな核酸の成分として含んでいると理解すべきである。
「単離された核酸」または「単離された核酸配列」とは、核酸または核酸配列が自然に存在する環境とは異なる環境にある核酸または核酸配列に関するものであり、汚染する内因性物質が実質的に存在しないものを含むことができる。
核酸に適用される本明細書で使用される「自然に存在する」という用語は、自然界の生物の細胞内に見出されかつ実験室で人間によって意図的に改変されていない核酸を指す。
ポリヌクレオチドまたは核酸配列の「断片」とは、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドの長さが、特に少なくとも１５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐおよび／または少なくとも６０ｂｐである連続したヌクレオチドを指す。特にポリヌクレオチドの断片は、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドの少なくとも２５個、より詳細には少なくとも５０個、より詳細には少なくとも７５個、より詳細には少なくとも１００個、より詳細には少なくとも１５０個、より詳細には少なくとも２００個、より詳細には少なくとも３００個、より詳細には少なくとも４００個、より詳細には少なくとも５００個、より詳細には少なくとも６００個、より詳細には少なくとも７００個、より詳細には少なくとも８００個、より詳細には少なくとも９００個、より詳細には少なくとも１０００個の連続したヌクレオチドを含む。限定されるものではないが、本明細書のポリヌクレオチドの断片は、ＰＣＲプライマーとして、および／またはプローブとして、またはアンチセンス遺伝子サイレンシングもしくはＲＮＡｉのために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」または特定の条件下でハイブリダイズするという用語は、互いに有意に同一または相同性のあるヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図している。この条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列が、互いに結合したままであるような条件であってもよい。低ストリンジェンシー、中程度、および高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義を本明細書に後で示す。適切なハイブリダイゼーション条件は、Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, sections 2, 4, and 6)に例示されているように、当業者が最小限の実験で選択することもできる。さらに、ストリンジェンシー条件は、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, chapters 7, 9, and 11)に記載されている。
「組換え核酸配列」とは、実験室的方法（例えば、分子クローニング）を用いて、複数の供給源からの遺伝物質をまとめて、自然には存在せず、他の方法では生物に見られないような核酸配列を作製または修飾した結果得られる核酸配列のことである。
「組換えＤＮＡ技術」とは、例えば、ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ編のLaboratory Manuals , 2002, Cold Spring Harbor Lab Press; and Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている、組換え核酸配列を調製するための分子生物学的手順を指す。
「遺伝子」という用語は、細胞内でｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子に転写される領域を含むＤＮＡ配列を意味し、適切な調節領域、例えばプロモーターに作動可能に連結されている。したがって、遺伝子は、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのコーディング領域、イントロン、エクソン、および／または例えば転写終結部位を含む３’非翻訳配列など、複数の作動可能に連結された配列を含み得る。
「多シストロン性」とは、同一の核酸分子内で２つ以上のポリペプチドを別々にコードすることができる核酸分子、特にｍＲＮＡを指す。
「キメラ遺伝子」とは、ある種の自然界では通常見られない任意の遺伝子、特に、自然界では互いに関連付けられていない核酸配列の１つ以上の部分が存在する遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、転写される領域の一部もしくは全部または別の調節領域と自然界では関連していない。「キメラ遺伝子」という用語は、プロモーターまたは転写調節配列が、１つ以上のコーディング配列またはアンチセンス、すなわちセンス鎖の逆相補鎖、または逆反復配列（センスおよびアンチセンス、それによってＲＮＡ転写物は転写時に二本鎖ＲＮＡを形成する）に作動可能に連結されている発現コンストラクトを含むと理解される。「キメラ遺伝子」という用語には、１つ以上のコーディング配列の一部を組み合わせて新しい遺伝子を生成することにより得られる遺伝子も含まれる。
「３’ＵＴＲ」または「３’非翻訳配列」（「３’非翻訳領域」または「３’末端」とも呼ばれる）とは、遺伝子のコード化配列の下流に見出される核酸配列を指し、この核酸配列は、例えば、転写終結部位および（すべてではないが、ほとんどの真核生物のｍＲＮＡでは）ＡＡＵＡＡＡまたはそのバリアントなどのポリアデニル化シグナルを含む。転写終了後、ｍＲＮＡ転写産物はポリアデニル化シグナルの下流で開裂され得、ポリ（Ａ）テールが付加され得、これはｍＲＮＡの翻訳部位、例えば細胞質への輸送に関与する。
「プライマー」という用語は、鋳型核酸配列にハイブリダイズされ、鋳型に相補的な核酸配列の重合に使用される短い核酸配列を指す。
「選択可能なマーカー」という用語は、発現時に、選択可能なマーカーを含む細胞を選択するために使用され得る任意の遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例を以下に示す。当業者であれば、異なる抗生物質、殺菌剤、補助栄養剤または除草剤の選択可能なマーカーが、異なる標的種に適用可能であることを知るであろう。
本発明はまた、本明細書で定義されるポリペプチドをコードする核酸配列に関する。
特に、本発明はまた、例えば人工ヌクレオチドアナログを用いて得ることができる、上記のポリペプチドの１つおよびその機能的等価物をコードする核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ）に関する。
本発明は、本発明によるポリペプチドまたはその生物学的に活性なセグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明によるコーディング核酸を同定もしくは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸断片との両方に関する。
本発明はまた、本明細書で具体的に開示されている配列に対してある程度の「同一性」を有する核酸に関する。２つの核酸間の「同一性」とは、それぞれの場合において、核酸の全長にわたってヌクレオチドの同一性を意味する。
２つのヌクレオチド配列間の「同一性」（同じことがペプチド配列またはアミノ酸配列にも当てはまる）とは、これら２つの配列のアラインメントが生成されたときに、２つの配列において同一であるヌクレオチド残基（もしくはアミノ酸残基）またはその数の関数のことである。同一の残基は、アラインメントの所定の位置にある２つの配列で同一である残基と定義される。本明細書で使用される場合、配列同一性のパーセンテージは、最適なアラインメントから、２つの配列間で同一の残基数を取り、それを最短の配列の残基数で割って１００を掛けることで計算される。最適なアラインメントとは、同一性のパーセンテージが最も高くなるアラインメントのことである。最適なアラインメントを得るために、アラインメントの１つ以上の位置で、一方または両方の配列にギャップを導入してもよい。これらのギャップは、配列同一性のパーセンテージの計算において、非同一の残基として考慮される。アミノ酸または核酸配列の同一性のパーセンテージを決定するためのアラインメントは、コンピュータプログラム、例えばワールド・ワイド・ウェブで利用可能な公開コンピュータプログラムを用いた様々な方法で達成することができる。
特に、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi）から入手可能なデフォルトパラメーターに設定されたＢＬＡＳＴプログラム（Tatiana et al, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174:247-250, 1999）を用いて、タンパク質または核酸配列の最適なアラインメントを得て、配列の同一性のパーセンテージを計算することができる。
別の例では、同一性は、Informax社（米国）のVector NTI Suite 7.1プログラムを用いて、Ｃｌｕｓｔａｌ法（Higgins DG, Sharp PM. ((1989))）を用いて、以下の設定ですることができる。
マルチプルアラインメントパラメーター：
Ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ １０
Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ １０
Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ｒａｎｇｅ ８
Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ｏｆｆ
％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｄｅｌａｙ ４０
Ｒｅｓｉｄｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐｓ ｏｆｆ
Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｏｆｆ
Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｉｎｇ ０
ペアワイズアラインメントパラメーター：
ＦＡＳＴ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｏｎ
Ｋ－ｔｕｐｌｅ ｓｉｚｅ １
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ３
Ｗｉｎｄｏｗ ｓｉｚｅ ５
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｅｓｔ ｄｉａｇｏｎａｌｓ ５
あるいは同一性は、Chenna, et al. (2003)のウェブページ：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#および以下の設定に従って判定してもよい。
ＤＮＡ Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ １５．０
ＤＮＡ Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｅｎａｌｔｙ ６．６６
ＤＮＡ Ｍａｔｒｉｘ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ １０．０
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．２
Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｔｒｉｘ Ｇｏｎｎｅｔ
Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ －１
Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ ４
本明細書に記載されているすべての核酸配列（一本鎖および二本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドビルディングブロックから化学合成によって、例えば二重らせんの個々の重なり合った相補的な核酸ビルディングブロックの断片縮合によって、既知の方法で生成することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホロアミダイト法（Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press, New York, pages 896-897）によって、既知の方法で行うことができる。合成オリゴヌクレオチドの蓄積と、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片によるギャップの充填およびライゲーション反応ならびに一般的なクローニング技術については、Sambrook et al. (1989)に記載されている（下記を参照）。
本発明による核酸分子は、さらに、コーディング遺伝子領域の３’および／または５’末端からの非翻訳配列を含むことができる。
本発明はさらに、具体的に記載されたヌクレオチド配列またはそのセグメントに相補的な核酸分子に関する。
本発明によるヌクレオチド配列は、他の細胞型および生物における相同配列の同定および／またはクローニングに用いることができるプローブおよびプライマーの生成を可能にする。そのようなプローブまたはプライマーは、一般的に、本発明による核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の少なくとも約１２個、好ましくは少なくとも約２５個、例えば約４０個、５０個または７５個の連続したヌクレオチド上で「ストリンジェント」な条件（本明細書で別に定義）下にハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
「相同」配列には、オルソログまたはパラログの配列が含まれる。系統解析法、配列類似性およびハイブリダイゼーション法を含む、オルソログまたはパラログを同定する方法は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
「パラログ」は、類似した配列と類似した機能とを持つ２つ以上の遺伝子を生み出す遺伝子重複から生じる。パラログは、典型的には、関連する植物種内の遺伝子の重複によって形成され、一緒にクラスター化している。パラログは、ペアワイズＢｌａｓｔ分析を用いた類似遺伝子の群で、またはＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを用いた遺伝子ファミリーの系統解析中に見出される。パラログでは、関連する遺伝子内の配列について特徴的でありかつ遺伝子の類似機能を有しているコンセンサス配列を同定することができる。
「オルソログ」、またはオルソロガスな配列とは、共通の祖先の子孫である種に見られることから、互いに類似した配列のことである。例えば、共通の祖先を持つ植物種には、類似した配列および機能を有する酵素が多く含まれていることが知られている。当業者であれば、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＢＬＡＳＴプログラムを用いて、ある種の遺伝子ファミリーの系統樹を構築することによって、オルソログ配列を同定し、オルソログの機能を予測することができる。相同性のある配列間で類似した機能を同定または確認する方法として、植物または微生物などの宿主細胞または生物において、関連するポリペプチドを過剰発現または欠失（ノックアウト／ノックダウン）させている転写プロファイルを比較することが挙げられる。当業者であれば、転写プロファイルが類似しており、５０％超の調節された転写産物が共通しているか、７０％超の調節された転写産物が共通しているか、９０％超の調節された転写産物が共通している遺伝子が、類似した機能を有することを理解するであろう。本明細書の配列のホモログ、パラログ、オルソログおよび他の任意のバリアントは、宿主細胞、植物または微生物などの生物にテルペン合成酵素タンパク質を産生させることによって、同様に機能することが期待される。
「選択可能なマーカー」という用語は、発現時に、選択可能なマーカーを含む細胞または複数の細胞を選択するために使用され得る任意の遺伝子を指す。選択可能なマーカーの例を以下に示す。当業者であれば、異なる抗生物質、殺菌剤、補助栄養剤または除草剤の選択可能なマーカーが、異なる標的種に適用可能であることを知るであろう。
本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的な技術および本発明により供給される配列情報によって回収することができる。例えば、具体的に開示された完全な配列のうちの１つまたはそのセグメントをハイブリダイゼーションプローブおよび標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、Sambrook, (1989)に記載されている）として用いて、適切なｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離することができる。
さらに、開示された配列のうちの１つまたはそのセグメントを含む核酸分子は、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。このようにして増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングすることができ、ＤＮＡ配列決定によって特徴づけることができる。本発明によるオリゴヌクレオチドはまた、標準的な合成法、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて生成することができる。
本発明による核酸配列またはその誘導体、ホモログまたはこれらの配列の一部を、例えば、通常のハイブリダイゼーション技術またはＰＣＲ技術によって、他の細菌から、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを介して単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、本発明による配列と標準条件でハイブリダイズする。
「ハイブリダイズ」とは、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが標準条件でほぼ相補的な配列に結合する能力を意味し、一方、非相補的なパートナー間ではこれらの条件で非特異的な結合は起こらない。このため、配列は９０～１００％相補的であり得る。相補的な配列が互いに特異的に結合できるという特性は、例えば、ノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティング、またはＰＣＲもしくはＲＴ－ＰＣＲにおけるプライマー結合に利用される。
ハイブリダイゼーションには、保存領域の短いオリゴヌクレオチドが有利には用いられる。しかしながら、本発明による核酸のより長い断片または完全な配列をハイブリダイゼーションに使用することも可能である。これらの「標準条件」は、使用される核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片もしくは完全な配列）に応じて、または核酸のどのタイプ－ＤＮＡもしくはＲＮＡ－がハイブリダイゼーションに使用されるかに応じて変化する。例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度よりも約１０℃低い。
例えば、特定の核酸に応じて、標準条件とは、０．１～５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度を有する水性緩衝液中で４２℃～５８℃の温度、またはさらに５０％ホルムアミドの存在下で、例えば５×ＳＳＣ中で４２℃、５０％ホルムアミドの存在下を意味する。有利には、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣおよび約２０℃～４５℃の温度、好ましくは約３０℃～４５℃の温度である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣおよび約３０℃～５５℃の温度、好ましくは約４５℃～５５℃の温度である。これらのハイブリダイゼーションの記載される温度は、ホルムアミドの不在で、長さが約１００ヌクレオチドおよびＧ＋Ｃ含有率が５０％の核酸について計算された融解温度の例である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、関連する遺伝学の教科書、例えばSambrook et al., 1989に記載されており、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの種類、またはＧ＋Ｃ含有率に応じて、当業者に知られている式を用いて計算することができる。当業者であれば、以下の教科書からハイブリダイゼーションに関する更なる情報を得ることができる：Ausubel et al. (編), (1985), Brown (編) (1991)。
「ハイブリダイゼーション」は、特にストリンジェントな条件下で行うことができる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook (1989)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
本明細書で使用される場合、特定の条件下でハイブリダイゼーションまたはハイブリダイズするという用語は、互いに有意に同一または相同であるヌクレオチド配列が互いに結合したままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記述することを意図している。この条件は、少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列が、互いに結合したままであるような条件であってもよい。低ストリンジェンシー、中程度、および高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の定義を本明細書に示す。
適切なハイブリダイゼーション条件は、Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, sections 2, 4, and 6)に例示されているように、当業者が最小限の実験で選択することもできる。さらに、ストリンジェンシー条件は、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, chapters 7, 9, and 11)に記載されている。
本明細書で使用される場合、低ストリンジェンシーの定義された条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４０℃にて６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液に以下の変更を加えて行う：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸塩、および５～２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ－標識プローブを用いる。フィルターを、ハイブリダイゼーション混合液中で４０℃にて１８～２０時間インキュベートし、次いで５５℃で１．５時間洗浄する。２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中で。洗浄液を新しい溶液に交換し、さらに６０℃で１．５時間インキュベートする。フィルターをブロッティングして乾燥させ、オートラジオグラフィーに供する。
本明細書で使用される場合、中程度のストリンジェンシーの定義された条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５０℃にて７時間前処理する。ハイブリダイゼーションは、同じ溶液に以下の変更を加えて行う。０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸塩、および５～２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ－標識プローブを用いる。フィルターを、ハイブリダイゼーション混合液中で５０℃にて３０時間インキュベートし、次いで５５℃で１．５時間洗浄する。２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中で。洗浄液を新しい溶液に交換し、さらに６０℃で１．５時間インキュベートする。フィルターをブロッティングして乾燥させ、オートラジオグラフィーに供する。
本明細書で使用される場合、高ストリンジェンシーの定義された条件は以下のとおりである。ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中で６５℃にて８時間から一晩中行う。フィルターを、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡおよび５～２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ－標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液中で、６５℃で４８時間ハイブリダイゼーションする。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、および０．０１％ＢＳＡを含む溶液中で、３７℃で１時間行う。続いて、０．１×ＳＳＣ中で５０℃にて４５分間の洗浄を行う。
上記の条件が不適切な場合には（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに採用されているような条件）、当該技術分野で周知である低、中程度、および高ストリンジェンシーの他の条件（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに採用されているような条件）を用いてもよい。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の検出キットは、ポリペプチドをコードする核酸配列に特異的なプライマーおよび／またはプローブと、当該プライマーおよび／またはプローブを用いてサンプル中のポリペプチドをコードする核酸配列を検出するための関連プロトコルとを含んでいてもよい。そのような検出キットは、植物、生物、微生物または細胞が、ポリペプチドをコードする配列で修飾されているかどうか、すなわち形質転換されているかどうかを判定するために使用され得る。
本明細書の実施形態によるバリアントＤＮＡ配列の機能を試験するために、目的の配列を選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に作動可能に連結し、前述のレポーター遺伝子の発現を、例えば、微生物を用いて、またはプロトプラストを用いて、または安定的に形質転換された植物を用いて、一過性の発現アッセイで試験する。
本発明はまた、具体的に開示された核酸配列の誘導体または誘導体化可能な核酸配列に関する。
したがって、本発明による更なる核酸配列は、本明細書に具体的に開示された配列から誘導することができ、それとは１個または複数（例えば１～１０個のような）のヌクレオチドの１個以上、例えば１～２０個、特に１～１５個もしくは５～１０個のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失によって異なり、さらに、所望のプロファイルの特性を有するポリペプチドをコードすることができる。
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含む核酸配列、または具体的に記載された配列と比較して、特別な一次または宿主生物のコドン使用頻度に従って変更された核酸配列を包含する。
本発明の特定の実施形態によれば、そのヌクレオチド配列を特定の発現系に適合させるために、バリアント核酸を調製してもよい。例えば、細菌の発現系では、アミノ酸が特定のコドンによってコードされている場合、より効率的にポリペプチドを発現することが知られている。遺伝コードの縮退により、複数のコドンが同じアミノ酸配列をコードし得、複数の核酸配列が同じタンパク質またはポリペプチドをコードすることができ、これらのＤＮＡ配列はすべて本明細書の実施形態に包含される。適切な場合、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主細胞での発現を高めるために最適化されてもよい。例えば、本明細書の実施形態の核酸は、発現を向上させるために、宿主に特有のコドンを用いて合成されてもよい。
本発明はまた、本明細書に記載されている配列の自然に存在するバリアント、例えばスプライシングバリアントまたは対立遺伝子バリアントを包含する。
対立遺伝子バリアントは、誘導されたアミノ酸のレベルで、全配列範囲にわたって少なくとも６０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、特に好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し得る（アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについて上述した詳細を参照されたい）。有利には、配列の部分的な領域にわたって相同性が高くなり得る。
本発明はまた、保存的なヌクレオチド置換（すなわち、その結果、問題になっているアミノ酸が、同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解性のアミノ酸で置き換えられる）によって得ることができる配列に関する。
本発明はまた、具体的に開示されている核酸から配列多型によって誘導される分子に関する。そのような遺伝子多型は、自然対立遺伝子変異により、異なる集団からの細胞または集団内に存在し得る。対立遺伝子バリアントには、機能的等価物も含まれ得る。これらの自然変異は、通常、遺伝子のヌクレオチド配列に１～５％の差異を生じさせる。前述の多型は、本明細書に開示されているポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらし得る。対立遺伝子バリアントには、機能的等価物も含まれ得る。
さらに、誘導体は、本発明による核酸配列のホモログ、例えば、動物、植物、真菌または細菌のホモログ、短縮された配列、コーディングおよび非コーディングＤＮＡ配列の一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであることも理解されるべきである。例えば、ホモログは、ＤＮＡレベルで、本明細書で具体的に開示されている配列で与えられるＤＮＡ領域全体にわたって、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
さらに、誘導体は、例えば、プロモーターとの融合体であると理解されるべきである。記載されたヌクレオチド配列に付加されたプロモーターは、プロモーターの機能性または有効性を損なうことなく、少なくとも１つのヌクレオチド交換、少なくとも１つの挿入、反転、および／または欠失によって変更することができる。さらに、プロモーターの有効性は、それらの配列を変更することによって高めることができるか、または異なる属の生物であっても、より有効なプロモーターと完全に交換することができる。
ｄ．機能性ポリペプチド変異体の生成
さらに、当業者であれば、機能的変異体、すなわち、本明細書で開示されているアミノ酸関連配列番号のいずれかと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドをコードし、かつ／または本明細書で開示されているアミノ酸関連配列番号のいずれかと少なくとも７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされているヌクレオチド配列を生成する方法に精通している。
使用される技術に応じて、当業者であれば、遺伝子またはその他の非コーディング核酸領域（例えば、発現を調節するのに重要である）に、完全にランダムな突然変異またはその他のより指向性の突然変異を導入し、その後、遺伝的ライブラリーを生成することができる。この目的のために必要な分子生物学の方法は、当業者に知られており、例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001に記載されている。
遺伝子を改変し、ひいては当該遺伝子によってコードされるポリペプチドを改変するための方法は、当業者には古くから知られており、例えば、以下のようなものがある。
－ 部位特異的変異導入であって、遺伝子の個々のまたはいくつかのヌクレオチドを指向的に置き換える方法（Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、
－ 飽和突然変異誘発であって、任意のアミノ酸のコドンを遺伝子の任意の位置で交換または追加することができる方法（Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valca’rel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1）、
－ 変異性ポリメラーゼ連鎖反応（error-prone polymerase chain reaction）であって、ヌクレオチド配列を変異性ＤＮＡポリメラーゼによって突然変異させる方法（Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739）、
－ ＳｅＳａＭ法（シーケンス飽和突然変異誘発）であって、ポリメラーゼによって優先的な交換を妨げる方法（Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279）、
－ 例えば、ＤＮＡ修復機構の欠陥により、ヌクレオチド配列の突然変異率が増加している突然変異株での遺伝子の継代（Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey）、または
－ ＤＮＡシャッフリングであって、近縁の遺伝子のプールを形成して消化し、その断片をポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用し、鎖の分離と再結合とを繰り返すことによって、最終的に完全長のモザイク遺伝子を生成する方法（Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747）。
いわゆる指向性進化を用いて（特に、Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial polypeptides by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiologyに記載されている）、当業者であれば、機能的変異体を指向的にかつ大規模に産生することができる。このために、第１のステップにおいて、それぞれのポリペプチドの遺伝子ライブラリーを、例えば上記に示される方法を用いて最初に作成する。遺伝子ライブラリーは、例えば細菌またはファージディスプレイシステムによって、適切な方法で発現させる。
所望の特性にほぼ対応する特性を持つ機能的変異体を発現する宿主生物の関連遺伝子は、別の変異サイクルに供することができる。変異と選択またはスクリーニングとのステップは、存在する機能的変異体が十分な程度に所望の特性を有するようになるまで、反復的に繰り返すことができる。この反復手順を用いて、制限された数の突然変異、例えば１、２、３、４または５個の突然変異を段階的に行い、問題となっている活性へのそれらの影響を評価し、選択することができる。次いで、選択された変異体は、同じ方法で更なる突然変異のステップに供することができる。このようにして、調査対象となる個々の変異体の数を大幅に減らすことができる。
本発明による結果はまた、関連するポリペプチドの構造および配列に関する重要な情報を提供し、これは、標的化された様式で、所望の変更された特性を有するポリペプチドをさらに生成するのに必要である。特に、いわゆる「ホットスポット」、すなわち、標的突然変異を導入することによって特性を変更するのに潜在的に適している配列セグメントを定義することが可能である。
アミノ酸配列の位置に関しても情報を得ることができ、その領域では、おそらく活性にほとんど影響を与えないはずの突然変異を行うことができ、潜在的な「サイレント突然変異」と称することができる。
ｅ．本発明のポリペプチドを発現させるためのコンストラクト
これに関連して、以下の定義が適用される：
「遺伝子の発現」には、「異種発現」および「過剰発現」が包含され、遺伝子の転写およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を含む。「過剰発現」とは、遺伝子導入された細胞または生物におけるｍＲＮＡ、ポリペプチドおよび／または酵素活性のレベルによって測定される遺伝子産物の産生が、同様の遺伝的背景を持つ非形質転換の細胞または生物における産生レベルを上回ることを指す。
本明細書で使用される「発現ベクター」とは、外来または外因性のＤＮＡを宿主細胞に送達するために、分子生物学的方法および組換えＤＮＡ技術を用いて設計された核酸分子を意味する。発現ベクターは、典型的には、ヌクレオチド配列の適切な転写に必要な配列を含む。コーディング領域は、通常、目的のタンパク質をコードするが、ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどをコードしてもよい。
本明細書で使用される「発現ベクター」には、ウイルスベクター、バクテリオファージおよびプラスミドを含むがこれらに限定されない任意の線状または環状の組換えベクターが含まれる。当業者であれば、発現系に応じて適切なベクターを選択することができる。一実施形態では、発現ベクターは、転写プロモーター、オペレーターもしくはエンハンサー、またはｍＲＮＡリボソーム結合部位などの、転写、翻訳、開始および終了を制御する少なくとも１つの「調節配列」に作動可能に連結された本明細書の実施形態の核酸を含み、任意に、少なくとも１つの選択マーカーを含む。調節配列が、本明細書の実施形態の核酸に機能的に関連する場合、ヌクレオチド配列は「作動可能に連結」される。
本明細書で使用される「発現系」には、所与の発現宿主のインビボ、またはインビトロのいずれかで、１つのポリペプチドの発現、または２つ以上のポリペプチドの共発現に必要な核酸分子の任意の組み合わせが包含される。それぞれのコーディング配列は、単一の核酸分子またはベクター、例えば、多重クローニングサイトを含むベクター上に配置されてもよいし、多シストロン性の核酸上に配置されてもよいし、２つ以上の物理的に異なるベクター上に分散されてもよい。特定の例として、プロモーター配列、１つ以上のオペレーター配列およびそれぞれが本明細書に記載されている酵素をコードする１つ以上の構造遺伝子を含むオペロンを挙げることができる。
本明細書で使用される「増幅する」および「増幅」という用語は、以下に詳細に説明するように、自然に発現した核酸の組換え体を生成または検出するための任意の適切な増幅法の使用を指す。例えば、本発明は、自然に発現した（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡ）または組換え（例えば、ｃＤＮＡ）の本発明の核酸を、インビボ、エクスビボまたはインビトロで増幅する（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲによって）ための方法および試薬（例えば、特定の縮退オリゴヌクレオチドプライマー対、オリゴｄＴプライマー）を提供する。
「調節配列」とは、本明細書の実施形態の核酸配列の発現レベルを決定し、調節配列に作動可能に連結された核酸配列の転写速度を調節することができる核酸配列を指す。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、転写因子、プロモーター要素などを含む。
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」とは、本発明に従って、転写されるべき核酸に機能的に連結されたときに、前述の核酸の転写を調節する核酸を意味すると理解される。特に、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、および転写因子結合部位、リプレッサーおよびアクチベータータンパク質の結合部位を含むがこれらに限定されない適切な転写に必要な他の因子とを提供することによって、コーディング配列の発現を制御する核酸配列を指す。プロモーターという用語の意味には、「プロモーター調節配列」という用語も含まれる。プロモーター調節配列は、関連するコーディング核酸配列の転写、ＲＮＡ処理または安定性に影響を及ぼす可能性のある上流および下流の要素を含み得る。プロモーターには、天然由来の配列と合成配列とが含まれる。コーディング核酸配列は、通常、転写開始部位から始まる転写の方向に関して、プロモーターの下流に位置する。
これに関連して、「機能的」または「作動的」な連結は、例えば、核酸の１つと調節配列との連続的な配置を意味すると理解される。例えば、プロモーター活性を有する配列、および転写されるべき核酸配列の配列、および任意に更なる調節要素、例えば核酸の転写を保証する核酸配列、および例えばターミネーターが、核酸配列の転写時に調節要素のそれぞれがその機能を果たすことができるように連結される。これは、必ずしも化学的な意味での直接的な連結を必要とするものではない。遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列は、より離れた位置から、または他のＤＮＡ分子からでも、標的配列にそれらの機能を発揮することさえ可能である。好ましい配置は、転写されるべき核酸配列がプロモーター配列の後ろ（すなわち、３’末端）に配置され、２つの配列が共有結合されるような配置である。プロモーター配列と組換え発現される核酸配列との間の距離は、２００塩基対よりも小さく、または１００塩基対よりも小さく、または５０塩基対よりも小さくすることができる。
プロモーターおよびターミネーターに加えて、他の調節要素の例として、以下のものを挙げることができる：標的配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製起点など。適切な調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。
「構成的プロモーター」という用語は、それが作動可能に連結されている核酸配列の継続的な転写を可能にする調節されていないプロモーターを指す。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結」という用語は、機能的な関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を意味する。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーター、またはむしろ転写調節配列は、それがコーディング配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続していることを意味する。プロモーター配列に関連するヌクレオチド配列は、形質転換すべき植物に関して相同な起源であっても異種起源であってもよい。この配列はまた、全体的または部分的に合成されたものであってもよい。起源にかかわらず、プロモーター配列に関連する核酸配列は、本明細書の実施形態のポリペプチドに結合した後、それが連結されているプロモーターの特性に従って、発現またはサイレンシングされる。関連する核酸は、生物全体で常に、あるいは特定の時間に、または特定の組織、細胞、もしくは細胞コンパートメントで発現または抑制されることが所望されるタンパク質をコードしてもよい。そのようなヌクレオチド配列は、特に、それを用いて変化もしくは形質転換された宿主細胞または生物に望ましい表現形質を与えるタンパク質をコードする。より詳細には、関連するヌクレオチド配列は、細胞または生物において、本明細書で定義される目的の産物または複数の産物の産生をもたらす。特に、このヌクレオチド配列は、本明細書で定義される酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
本明細書に記載されているヌクレオチド配列は、「発現カセット」の一部であってもよい。「発現カセット」および「発現コンストラクト」という用語は同義的に用いられる。（好ましくは組換え）発現コンストラクトは、本発明によるポリペプチドをコードしかつ調節核酸配列の遺伝的制御下にあるヌクレオチド配列を含む。
本発明に従って適用されるプロセスでは、発現カセットは、「発現ベクター」の一部、特に組換え発現ベクターの一部であってもよい。
「発現ユニット」とは、本発明に従って、本明細書で定義されるプロモーターを含みかつ発現すべき核酸または遺伝子と機能的に結合した後に前述の核酸または前述の遺伝子の発現、すなわち転写および翻訳を調節する発現活性を有する核酸を意味すると理解される。したがって、発現ユニットは、この文脈では「調節核酸配列」とも呼ばれる。プロモーターに加えて、他の調節要素、例えばエンハンサーも存在し得る。
「発現カセット」または「発現コンストラクト」とは、本発明に従って、発現すべき核酸または発現すべき遺伝子に機能的に連結された発現ユニットを意味すると理解される。したがって、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは、転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、転写および翻訳の結果としてタンパク質として発現されるべき核酸配列も含む。
「発現」または「過剰発現」という用語は、本発明の文脈では、対応するＤＮＡによってコードされている１つ以上のポリペプチドを微生物において産生したり、細胞内活性を高めたりすることを表す。このために、例えば、生物内に遺伝子を導入したり、既存の遺伝子を別の遺伝子で置き換えたり、遺伝子のコピー数を増やしたり、強力なプロモーターを使用したり、高い活性を有する対応するポリペプチドをコードする遺伝子を使用したりすることが可能であり、任意にこれらの手段を組み合わせることができる。
好ましくは、本発明によるそのようなコンストラクトは、それぞれのコーディング配列の５’上流にプロモーターと、３’下流にターミネーター配列と、任意に他の通常の調節要素とを含み、それぞれの場合においてコーディング配列と作動的に連結されている。
本発明による核酸コンストラクトは、特に、例えば本明細書に記載されているアミノ酸関連の配列番号に由来するポリペプチドをコードする配列、またはその逆相補体、またはその誘導体およびホモログを含み、有利には遺伝子発現を制御、例えば増加させるために、１つ以上の調節シグナルと作動的または機能的に連結されている。
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節が実際の構造遺伝子の前にまだ存在している可能性があり、任意に、自然調節がスイッチオフされ、遺伝子の発現が増強されるように遺伝的に変更され得る。しかしながら、核酸コンストラクトは、より単純な構造であってもよく、すなわち、コーディング配列の前に追加の調節シグナルが挿入されておらず、その調節を伴う自然のプロモーターが除去されていない場合である。代わりに、自然の調節配列を突然変異させて、制御が行われなくなり、遺伝子発現量が増加するようにする。
好ましい核酸コンストラクトは、有利には、プロモーターと機能的に連結している１つ以上の既述の「エンハンサー」配列も含み、これらの配列は、核酸配列の強化された発現を可能にする。ＤＮＡ配列の３’末端には、更なる調節要素またはターミネーターなどの有利な配列が挿入されていてもよい。本発明による核酸の１つ以上のコピーが、コンストラクト中に存在してもよい。コンストラクトには、栄養要求性または抗生物質耐性を補完する遺伝子などの他のマーカーが、コンストラクトを選択するために任意に存在してもよい。
適切な調節配列の例は、プロモーター、例えばｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ－ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ－ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ｌａｍｂｄａ－ＰＲ、またはｌａｍｂｄａ－ＰＬプロモーターに存在し、これらは有利にはグラム陰性菌で採用される。さらに有利な調節配列は、例えば、グラム陽性菌のプロモーターであるａｍｙおよびＳＰＯ２、酵母または真菌のプロモーターであるＡＤＣ１、ＭＦａｌｐｈａ、ＡＣ、Ｐ－６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨに存在する。人工プロモーターを用いて調節することもできる。
宿主生物での発現のために、核酸コンストラクトは、有利には、例えば、プラスミドまたはファージなどのベクターに挿入され、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする。ベクターとは、プラスミドおよびファージに加えて、当業者に知られている他のすべてのベクター、すなわち、ＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルスおよびアデノウイルスなどのウイルス、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミド、コスミドおよび線状もしくは環状のＤＮＡまたは人工染色体を意味すると理解される。これらのベクターは、宿主生物において自律的に複製することができ、それ以外に染色体上で複製することもできる。これらのベクターは、本発明をさらに発展させたものである。バイナリベクターまたはｃｐｏ組込み型ベクターも適用可能である。
適切なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１もしくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセス属（Streptomyces）のｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２もしくはｐＩＪ３６１、バシラス属のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４もしくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７もしくはｐＡＪ６６７、真菌のｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２もしくはｐＢＢ１１６、酵母の２ａｌｐｈａＭ、ｐＡＧ－１、ＹＥｐ６、ＹＥｐ１３もしくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、または植物のｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４もしくはｐＤＨ５１にある。上述したプラスミドは、可能なプラスミドのごく一部である。更なるプラスミドは、当業者に周知であり、例えば、書籍Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に見出すことができる。
ベクターの更なる発展として、本発明による核酸コンストラクトまたは本発明による核酸を含むベクターは、有利には、線状ＤＮＡの形態で微生物に導入され、異種または相同組換えを介して宿主生物のゲノムに組み込まれることもできる。この線状ＤＮＡは、プラスミドなどの線状化されたベクターからなり得るか、または本発明による核酸コンストラクトまたは核酸のみからなり得る。
生物における異種遺伝子の最適な発現のために、生物で使用される特定の「コドン使用頻度」にマッチするように核酸配列を変更することが有利である。この「コドン使用頻度」は、問題になっている生物の他の既知の遺伝子をコンピュータで評価することによって、容易に決定することができる。
本発明による発現カセットは、適切なプロモーターを、適切なコーディングヌクレオチド配列およびターミネーターまたはポリアデニル化シグナルに融合させることによって生成される。この目的のために、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)、Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)に記載されている慣習的な組換え技術およびクローニング技術が使用される。
適切な宿主生物で発現させるために、組換え核酸コンストラクトまたは遺伝子コンストラクトは、有利には、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする宿主特異的ベクターに挿入される。ベクターは当業者に周知であり、例えば、「cloning vectors」 (Pouwels P. H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)に見出すことができる。
本明細書の実施形態の代替的な実施形態は、宿主細胞において「遺伝子発現を変化させる」方法を提供する。例えば、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドは、宿主細胞または宿主生物において、特定の状況で（例えば、特定の温度または培養条件への曝露時に）増強または過剰発現または誘導されてもよい。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドの発現が変化すると、変化した生物と対照または野生型の生物とで異なる発現パターンである異所性発現が生じることもある。発現の変化は、本明細書の実施形態のポリペプチドと外因性もしくは内因性のモジュレーターとの相互作用から、またはポリペプチドの化学的修飾の結果として生じる。この用語はまた、本明細書の実施形態のポリヌクレオチドの発現パターンが、検出レベル未満に変化しているか、または活性が完全に抑制されていることを指す。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるポリペプチドまたはバリアントポリペプチドをコードする単離、組換えまたは合成ポリヌクレオチドでもある。
一実施形態では、核酸配列をコードするいくつかのポリペプチドは、特に異なるプロモーターの制御下で、単一の宿主において共発現される。別の実施形態では、核酸配列をコードするいくつかのポリペプチドは、単一の形質転換ベクター上に存在するか、または別個のベクターを使用し、両方のキメラ遺伝子を含む形質転換体を選択すると同時に共形質転換されることができる。同様に、遺伝子をコードする１つまたはポリペプチドは、他のキメラ遺伝子と一緒に、単一の植物、細胞、微生物または生物で発現させることができる。
ｆ．本発明に適用される宿主
文脈に応じて、「宿主」という用語は、野生型の宿主または遺伝子改変された組換え宿主、またはその両方を意味し得る。
原則として、すべての原核生物または真核生物は、本発明による核酸または核酸コンストラクトの宿主または組換え宿主生物とみなすことができる。
本発明によるベクターを用いて、例えば本発明による少なくとも１つのベクターで形質転換され、本発明によるポリペプチドを産生するために使用することができる組換え宿主を産生することができる。有利には、上記の本発明による組換えコンストラクトは、適切な宿主系に導入して発現される。好ましくは、当業者に知られている一般的なクローニング法およびトランスフェクション法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどを用いて、記載される核酸をそれぞれの発現系で発現させる。適切な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, New York 1997、またはSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている。
有利には、細菌、真菌または酵母などの微生物が宿主生物として使用される。有利には、グラム陽性またはグラム陰性の細菌が使用され、好ましくは、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）、リゾビウム科（Rhizobiaceae）、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）、レンサ球菌科（Streptococcaceae）またはノカルディア科（Nocardiaceae）の細菌、特に好ましくは、エシェリキア属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ノカルディア属（Nocardia）、バークホルデリア属（Burkholderia）、サルモネラ属（Salmonella）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）またはロドコッカス属（Rhodococcus）の細菌が使用される。大腸菌（Escherichia coli）の属種が非常に好ましい。さらに、他の有利な細菌は、アルファプロテオバクテリア綱、ベータプロテオバクテリア綱またはガンマプロテオバクテリア綱の群に見出すことができる。有利には、サッカロミセス科（Saccharomyces）またはピキア科（Pichia）のような酵母も適切な宿主である。
あるいは植物全体または植物細胞を天然または組換え宿主として利用することもできる。非限定的な例として、以下の植物またはそれに由来する細胞を挙げることができる：タバコ属（Nicotiana）、特にベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）およびタバコ（Nicotiana tabacum）ならびにシロイヌナズナ属（Arabidopsis）、特にアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）。
宿主生物に応じて、本発明による方法で使用される生物は、当業者に知られている方法で成長または培養される。培養は、バッチ式、半バッチ式または連続的であってもよい。栄養素は、発酵の開始時に存在させてもよいし、後から半連続的または連続的に供給してもよい。これについても以下で詳しく説明する。
ｇ．本発明によるポリペプチドの組換え産生
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドまたはその機能的、生物学的に活性な断片を組換え産生するための方法に関し、ここで、ポリペプチドを産生する微生物を培養し、任意に、遺伝子発現を誘導する少なくとも１つのインデューサーを適用することによってポリペプチドの発現を誘導し、発現したポリペプチドを培養物から単離する。ポリペプチドは、必要に応じて、このようにして工業的規模で産生することもできる。
本発明により産生された微生物は、バッチ法またはフェッドバッチ法または反復フェッドバッチ法で、連続的または不連続的に培養することができる。公知の培養法の概要は、Chmiel著の教科書(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))またはStorhas著の教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))に見出すことができる。
使用すべき培養培地は、それぞれの株の要件を適切に満たすものでなければならない。アメリカ微生物学会のマニュアル「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D. C., USA, 1981)には、様々な微生物の培養培地が記載されている。
本発明により使用可能なこれらの培地は、通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類および／または微量元素を含む。
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。非常に優れた炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖類は、糖蜜などの複合化合物、または砂糖精製の副生成物を介して培地に添加することもできる。異なる炭素源の混合物を添加することも有利である。他の可能な炭素源は、油脂類、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸、アルコール類、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノール、および有機酸、例えば酢酸または乳酸である。
窒素源は、通常、有機もしくは無機の窒素化合物、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例として、アンモニアガスまたはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、酵母エキス、肉エキスなどが含まれる。窒素源は、単独または混合して使用することができる。
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩を含む。
硫黄源として、硫黄含有無機化合物、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物、ならびに有機硫黄化合物、例えばメルカプタンおよびチオールを用いることができる。
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、またはこれらに対応するナトリウム含有塩を用いることができる。
金属イオンを溶液中に保持するために、培地にキレート剤を添加することができる。特に適切なキレート剤には、カテコールもしくはプロトカテキュエートなどのジヒドロキシフェノール類、またはクエン酸などの有機酸が含まれる。
本発明に従って使用される発酵培地は、通常、他の成長因子、例えばビタミン類または成長促進剤も含み、これらには、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが挙げられる。成長因子および塩類は、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地の成分に由来することが多い。さらに、適切な前駆体を培養培地に添加することもできる。培地中の化合物の正確な組成は、それぞれの実験に強く依存し、特定のケースごとに個別に決定される。培地の最適化に関する情報は、教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(Ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に見出すことができる。成長培地は、Ｓｔａｎｄａｒｄ １（Ｍｅｒｃｋ社）またはＢＨＩ（ブレインハートフュージョン培地、ＤＩＦＣＯ社）などの市販の業者から入手することができる。
培地のすべての成分は、熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分）または無菌ろ過によって滅菌される。各成分は、一緒に滅菌することも、必要に応じて別々に滅菌することもできる。培地の全成分は、培養開始時に存在してもよいし、連続的またはバッチ式に添加してもよい。
培養温度は、通常１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃で、実験中に変化させることも、一定に保つこともできる。培地のｐＨは、５～８．５の範囲、好ましくは７．０程度とする。成長時のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加することによって制御することができる。起泡性を制御するために、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることができる。プラスミドの安定性を維持するために、適切な選択性物質、例えば抗生物質を培地に添加することができる。好気的な条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲の空気を培養物に供給する。培養物の温度は、通常、２０℃～４５℃の範囲である。培養は、所望の産物が最大限に形成されるまで続ける。通常、この目標は１０時間～１６０時間以内に達成される。
次いで、発酵ブロスをさらに処理する。要件に応じて、分離技術、例えば遠心分離、ろ過、デカンテーションまたはこれらの方法の組み合わせによって、バイオマスを発酵ブロスから完全にまたは部分的に除去したり、完全に発酵ブロス中に残したりすることができる。
ポリペプチドが培養培地中に分泌されていない場合は、細胞を溶解することもでき、タンパク質を単離するための既知の方法によって、ライセートから産物を得ることもできる。任意に、細胞は、高周波超音波により、高圧、例えばフレンチプレスにおける高圧によって、浸透圧溶解によって、洗剤、溶解酵素もしくは有機溶媒の作用によって、ホモジナイザーによって、または前述の方法のいくつかの組み合わせによって破砕することができる。
ポリペプチドは、公知のクロマトグラフィー技術、例えばモレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、例えばＱ－セファロースクロマトグラフィー（Q-sepharose chromatography）、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーによって、ならびに他の通常の技術、例えば限外ろ過、結晶化、塩析、透析およびネイティブゲル電気泳動で精製することができる。適切な方法は、例えば、Cooper, T. G., BiochemischeArbeitsmethoden [Biochemical processes], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York、またはScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
組換えタンパク質を単離するために、ベクター系またはオリゴヌクレオチドを使用することが有利であり得、これらのオリゴヌクレオチドは、定義されたヌクレオチド配列によってｃＤＮＡを延長し、ひいては改変されたポリペプチドまたは融合タンパク質をコードし、これにより、例えば、より簡単に精製することができる。このタイプの適切な修飾は、例えば、アンカーとして機能するいわゆる「タグ」であり、例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られる修飾または抗体の抗原として認識され得るエピトープがある（例えば、Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Pressに記載されている）。これらのアンカーは、タンパク質を固体担体、例えばポリマーマトリックスに付着させる役割を果たすことができ、この担体は、例えば、クロマトグラフィーカラムの充填物として使用することができたり、マイクロタイタープレート上または他の担体上で使用することができたりする。
同時に、これらのアンカーは、タンパク質の認識にも使用することができる。さらに、タンパク質の認識には、通常のマーカー、例えば蛍光色素、基質との反応後に検出可能な反応産物を形成する酵素マーカー、または放射性マーカーを単独で使用したり、タンパク質の誘導体化のためのアンカーと組み合わせて使用したりすることも可能である。
ｈ．ポリペプチドの固定化
本発明による酵素またはポリペプチドは、本明細書に記載されている方法において、遊離状態でまたは固定化して使用することができる。固定化された酵素とは、不活性担体に固定された酵素のことである。適切な担体材料およびその上に固定化された酵素は、欧州特許出願公開第１１４９８４９号明細書、欧州特許出願公開第１０６９１８３号明細書、独国特許出願公開（ＤＥ－ＯＳ）第１００１９３７７３号明細書およびそれらに引用されている文献から知られている。この点では、これらの文献の開示を全体的に参照する。適切な担体材料として、例えば、粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、シリカ、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、アニオン交換体材料、合成ポリマー、例えばポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリオレフィン、例えばポリエチレンおよびポリプロピレンが挙げられる。担持酵素の生成のために、通常、担体材料は細かく分割された粒子状の形態が採用され、多孔質の形態が好ましい。担体材料の粒径は、通常、５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下である（粒度分布曲線）。同様に、デヒドロゲナーゼを細胞全体の触媒として使用する場合、遊離型または固定化型を選択することができる。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素も細胞もグルタルアルデヒドで直接架橋することもできる（ＣＬＥＡへの架橋）。対応するその他の固定化技術は、例えば、J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheimに記載されている。本発明による方法を実施するためのバイオトランスフォーメーションおよびバイオリアクターに関する更なる情報は、例えば、Rehm et al. (編) Biotechnology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17, VCH, Weinheimにも記載されている。
ｉ．本発明の生体触媒産生方法の反応条件
本発明の反応は、インビボまたはインビトロの条件下で行うことができる。
本発明の方法または本明細書の上で定義される多段階法の個々のステップの間に存在する少なくとも１つのポリペプチド／酵素は、酵素または複数の酵素を自然にまたは組換えにより産生する生きた細胞内に、収穫された細胞内に、すなわちインビボ条件下で、または死んだ細胞内に、透過処理された細胞内に、粗細胞抽出物中に、精製された抽出物中に、または本質的に純粋もしくは完全に純粋な形態で、すなわちインビトロ条件下で存在し得る。少なくとも１つの酵素は、溶液中に存在してもよいし、担体に固定化された酵素として存在してもよい。１つまたは複数の酵素が、可溶性および／または固定化された形態で同時に存在してもよい。
本発明による方法は、当業者に知られている一般的な反応器中で、異なる規模の範囲、例えば実験室規模（数ミリリットルから数十リットルの反応容積）から工業規模（数リットルから数千立方メートルの反応容積）で行うことができる。ポリペプチドが、非生物の、任意に透過処理された細胞によってカプセル化された形態、多少なりとも精製された細胞抽出物の形態、または精製された形態で使用される場合、化学反応器を使用することができる。化学反応器により、通常、少なくとも１つの酵素の量、少なくとも１つの基質の量、ｐＨ、温度、および反応培地の循環の制御が可能になる。少なくとも１つのポリペプチド／酵素が生きた細胞内に存在する場合、プロセスは発酵となる。この場合、バイオ触媒産生はバイオリアクター（発酵槽）で行われ、生きた細胞の適切な生存条件に必要なパラメーター（例えば、栄養分を含む培養培地、温度、通気、酸素または他のガスの有無、抗生物質など）を制御することができる。当業者であれば、化学反応器またはバイオリアクターに精通しており、例えば、化学的もしくはバイオテクノロジーの方法を実験室規模から工業規模に拡大するための手順、またはプロセスパラメーターを最適化するための手順についても文献に詳しく記載されている（バイオテクノロジーの方法については、例えば、Crueger und Crueger, Biotechnologie‐Lehrbuch der angewandtenMikrobiologie, 2. Ed., R. Oldenbourg Verlag, Muenchen, Wien, 1984を参照）。
少なくとも１つの酵素を含む細胞は、超音波もしくは高周波パルス、フレンチプレスなどの物理的もしくは機械的手段、または低張液、溶解酵素および培地中に存在する洗剤などの化学的手段、またはそれらの組み合わせによって透過処理することができる。洗剤の例は、ジギトニン、ｎ－ドデシルマルトシド、オクチルグリコシド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、デオキシコラート、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０（エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル））などである。
本発明の生体変換反応には、生きた細胞の代わりに、必要な生体触媒を含む非生存細胞のバイオマスを適用してもよい。
少なくとも１つの酵素が固定化されている場合は、上述のように不活性担体に取り付けられている。
変換反応は、バッチ式、半バッチ式または連続的に行うことができる。反応物（および任意に栄養分）は、反応開始時に供給してもよいし、または半連続的もしくは連続的にその後供給してもよい。
本発明の反応は、特定の反応タイプに応じて、水性、水性有機または非水性の反応培地で行うことができる。
水性または水性有機培地は、ｐＨを５～１１、例えば６～１０の範囲の値に調整するために、適切な緩衝剤を含んでいてもよい。
水性有機培地には、水と混和する、一部混和する、または混和しない有機溶媒が適用され得る。適切な有機溶媒の非限定的な例を以下に示す。更なる例は、一価または多価の、芳香族または脂肪族アルコール、特にグリセロールのような多価の脂肪族アルコールである。
非水性培地は、実質的に水を含まず、すなわち、約１重量％または０．５重量％未満の水を含む。
生体触媒法は、有機非水性培地中で行ってもよい。適切な有機溶媒として、ペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタンもしくはシクロオクタンのような、例えば５～８個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンもしくはジクロロベンゼンのような芳香族炭水化物；ジエチルエーテル、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテルのような脂肪族非環式エーテル類；またはそれらの混合物を挙げることができる。
反応物／基質の濃度は、最適な反応条件に合わせることができるが、これは適用される特定の酵素に依存する。例えば、初期の基質濃度は０．１～０．５Ｍであり、例えば１０～１００ｍＭである。
反応温度は、適用される特定の酵素に依存し得る最適な反応条件に合わせてもよい。例えば、反応は、０～７０℃、例えば２０～５０℃または２５～４０℃の範囲の温度で行ってもよい。反応温度の例は、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃および約６０℃である。
プロセスは、基質と産物との間の平衡が達成されるまで進行してもよいが、それ以前に停止してもよい。通常のプロセス時間は、１分～２５時間の範囲、特に１０分～６時間の範囲、例えば１時間～４時間の範囲、特に１．５時間～３．５時間の範囲である。これらのパラメーターは、適切なプロセス条件の非限定的な例である。
宿主がトランスジェニック植物である場合、最適な成長条件、例えば、最適な光、水および栄養条件を提供することができる。
ｋ．産物の単離
本発明の方法はさらに、最終産物または中間産物を、任意に、立体異性体的またはエナンチオマー的に実質的に純粋な形態で回収するステップをさらに含むことができる。「回収」という用語は、培養物または反応培地から化合物を抽出、収穫、単離または精製することを含む。化合物の回収は、従来の樹脂（例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの通常の溶媒による処理）、蒸留、透析、ろ過、濃縮、晶析、再結晶、ｐＨ調整、凍結乾燥などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の従来の単離または精製方法に従って行うことができる。
単離された産物の同一性および純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、分光法（ＩＲ、ＵＶ、ＮＭＲなど）、着色法、ＴＬＣ、ＮＩＲＳ、酵素または微生物のアッセイなどの既知の技術によって決定することができる（例えば、以下を参照。Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32;ならびにSchmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, P. 89-90, P. 521-540, P. 540-547, P. 559-566, 575-581およびP. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.）。
本明細書に記載されている任意の方法で生成された環状テルペン化合物は、炭化水素、エステル類、アミド類、グリコシド類、エーテル類、エポキシド類、アルデヒド類、ケトン類、アルコール類、ジオール類、アセタール類またはケタール類などを含むがこれらに限定されない誘導体に変換することができる。テルペン化合物の誘導体は、酸化、還元、アルキル化、アシル化および／または転位を含むがこれらに限定されない化学的な方法によって得ることができる。あるいはテルペン化合物誘導体は、テルペン化合物を、酸化還元酵素、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、トランスフェラーゼを含むがこれらに限定さない酵素と接触させることによる生化学的な方法を用いて得ることができる。生化学的な変換は、単離された酵素、溶解した細胞からの酵素を用いてインビトロで、または全細胞を用いてインビボで行うことができる。
ｌ．テルペン／テルペノイド化合物、例えばラブダン型化合物の発酵産生
本発明はまた、テルペン／テルペノイド化合物、例えばラブダン型化合物の発酵産生のための方法にも関する。
本発明に従って使用される発酵は、例えば、撹拌式発酵槽、バブルカラムおよびループ型反応器で行うことができる。撹拌機のタイプおよび幾何学的デザインを含む可能な方法のタイプの包括的な概要は、「Chmiel: Bioprozesstechnik: Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1」に記載されている。本発明のプロセスにおいて、利用可能な典型的なバリアントは、当業者に知られているか、または例えば「Chmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineering」で説明されている以下のバリアントであり、例えばバイオマスのリサイクルを伴うおよび伴わないバッチ、フェドバッチ、反復フェドバッチまたはその他の連続発酵である。産生株に応じて、良好な収率（ＹＰ／Ｓ）を達成するために、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素または適切な混合ガスによるスパージングを行うことができる。
使用すべき培地は、適切な方法で特定の株の要件を満たすものでなければならない。アメリカ微生物学会のハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D. C., USA, 1981)には、様々な微生物の培養培地が記載されている。
本発明により使用することができるこれらの培地は、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類および／または微量元素を含んでいてもよい。
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類などの糖類である。非常に優れた炭素源は、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖類は、糖蜜などの複合化合物、または砂糖精製の副生成物を介して培地に添加することもできる。異なる炭素源の混合物を添加することも有利である。他の可能な炭素源は、油脂類、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸、アルコール類、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノール、および有機酸、例えば酢酸または乳酸である。
窒素源は、通常、有機もしくは無機の窒素化合物、またはこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例として、アンモニアガスまたはアンモニウム塩、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、酵母エキス、肉エキスなどが含まれる。窒素源は、単独または混合して使用することができる。
培地中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩を含む。
硫黄源として、硫黄含有無機化合物、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物、それに有機硫黄化合物、例えばメルカプタンおよびチオールも用いることができる。
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、またはこれらに対応するナトリウム含有塩を用いることができる。
金属イオンを溶液中に保持するために、培地にキレート剤を添加することができる。特に適切なキレート剤には、カテコールもしくはプロトカテキュエートなどのジヒドロキシフェノール類、またはクエン酸などの有機酸が含まれる。
本発明に従って使用される発酵培地は、他の成長因子、例えばビタミン類または成長促進剤も含み得、これらには、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸およびピリドキシンが挙げられる。成長因子および塩類は、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地の成分に由来することが多い。さらに、適切な前駆体を培養培地に添加することもできる。培地中の化合物の正確な組成は、それぞれの実験に強く依存し、特定のケースごとに個別に決定されなければならない。培地の最適化に関する情報は、教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(1997)に見出すことができる。成長培地は、Ｓｔａｎｄａｒｄ １（Ｍｅｒｃｋ社）またはＢＨＩ（ブレインハートフュージョン培地、ＤＩＦＣＯ社）などの市販の業者から入手することができる。
培地のすべての成分は、熱（１．５ｂａｒおよび１２１℃で２０分）または無菌ろ過によって滅菌される。各成分は、一緒に滅菌することも、必要に応じて別々に滅菌することもできる。培地の全成分は、培養開始時に存在してもよいし、任意に連続的またはバッチ式に添加してもよい。
培養温度は、通常１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃で、実験中に変化させることも、一定に保つこともできる。培地のｐＨは、５～８．５、好ましくは７．０程度とする。成長時のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水などの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加することによって制御することができる。起泡性を制御するために、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることができる。プラスミドの安定性を維持するために、適切な選択性物質、例えば抗生物質を培地に添加することができる。好気的な条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲の空気を培養物に供給する。培養物の温度は、通常、２０℃～４５℃の範囲である。培養は、所望の産物が最大限に形成されるまで続ける。通常、この目標は１時間～１６０時間以内に達成される。
本発明の方法はさらに、前述のテルペンアルコールを回収するステップをさらに含むことができる。
「回収」という用語は、培養培地から化合物を抽出、収穫、単離または精製することを含む。化合物の回収は、従来の樹脂（例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、ｐＨの変更、溶媒抽出（例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒による処理）、蒸留、透析、ろ過、濃縮、晶析、再結晶、ｐＨ調整、凍結乾燥などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の従来の単離または精製方法に従って行うことができる。
目的とする単離の前に、ブロスのバイオマスを除去することができる。バイオマスを除去するプロセスは、当業者に知られており、例えば、ろ過、沈降および浮遊が挙げられる。結果として、バイオマスは、例えば、遠心分離機、セパレーター、デカンター、フィルターまたは浮遊装置を用いて除去することができる。価値のある産物を最大限に回収するために、多くの場合、例えばダイアフィルトレーションの形態でバイオマスを洗浄することが望ましい。方法の選択は、発酵ブロス内のバイオマスの含有量およびバイオマスの特性、ならびにバイオマスと価値のある産物との相互作用に依存する。
一実施形態では、発酵ブロスは、殺菌または低温殺菌することができる。更なる実施形態では、発酵ブロスを濃縮する。要件に応じて、この濃縮はバッチ式に行うことも、連続的に行うこともできる。圧力および温度の範囲は、第一に産物の損傷が起こらず、第二に装置およびエネルギーの使用が最小限で済むように選択されるべきである。特に多段式蒸発の場合、圧力および温度のレベルを巧みに選択することで、エネルギーの節約が可能になる。
以下の例は単に例示であり、本明細書に記載されている実施形態の範囲を限定することを意図していない。
本明細書で提供される開示を検討した後に当業者に直ちに明らかになるであろう多数の可能な変形も、本発明の範囲に含まれる。
実験部分
次いで、以下の実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明する。
ａ）材料：
別段の定めがない限り、本明細書で用いられる化学物質および生化学物質ならびに微生物または細胞はすべて市販品である。
組換えタンパク質は、特に明記しない限り、標準的な方法、例えば、Ｓambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されているようにクローニングされ、発現される。
ｂ）一般的な方法
細胞遊離タンパク質分画の調製
発現ベクターを大腸菌ＫＲＸ細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）に形質転換し、適切な抗生物質を加えたＬＢ培地プレートで形質転換細胞を選択した。次いで、適切な抗生物質を加えた２５ｍＬの液体ＬＢ培地中で、３７℃でＯＤが１になるまで培養した。１ｍＭのイソプロピル－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシドと０．１％（ｗ／ｖ）のＬ－ラムノース一水和物とを用いて組換えタンパク質の発現を誘導し、２５℃で２４時間，適度に振とうしながらインキュベートした。
遠心分離（５０００ｇ，１２分）によって細菌細胞を収穫し、１５％グリセロールを含有する５０ｍＭのＭＯＰＳＯ緩衝液ｐＨ７．４の１．８ｍＬ中で、氷上での超音波処理（Sonics社，直径６ｍｍのチップマイクロプローブを備えたＶｉｂｒａ ｃｅｌｌ Ｘ １３０ソニケーター；最大出力の８０％で２０秒の２０ｋＨｚパルスを３回）によって破砕した。ライセートは遠心分離（３５００ｇ、８分、４℃）によって取り除き、得られた上清は凍結保存し、インビトロアッセイの酵素源として使用した。
インビトロ酵素アッセイ
組換えタンパク質の１つを含むタンパク質分画を、無細胞抽出液２０μｌ、１６０～３２０ｍｇ／Ｌの基質（ＤＭＳＯ中の４０ｇ／Ｌ基質ストック溶液を使用）、必要に応じて１ｍＭの補酵素、および最終容量０．５～１ｍＬにおける５０ｍＭのＭＯＰＳＯ（ｐＨ７．４）からなるアッセイで、ホウケイ酸ガラスおよびＰＴＦＥで密閉されたスクリューキャップ式チューブ（容量１１ｍＬ）（Wheaton社、アメリカ合衆国ニュージャージー州08332ミルビル市）において、２３０ｒｐｍで振とうしながら２４℃で４時間インキュベートした。アッセイを１容量のメチル－ｔｅｒｔ－ブチル－エーテル（ＭＴＢＥ）で抽出し、後述のＧＣ－ＭＳで分析した。
全細胞バイオコンバージョンアッセイ
化合物のバイオコンバージョンを、組換え酵素を発現する大腸菌細胞を用いて行った。発現ベクターを大腸菌ＫＲＸ細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）に形質転換し、形質転換した細胞を適切な抗生物質を加えたＬＢ培地プレートで選択した。まず、１％のグルコースおよび適切な抗生物質を加えた５ｍＬのＬＢ培地で、３０℃で一晩培養した。翌日、適切な抗生物質を加えたＴＢ培地（Terrific Broth）２０ｍＬを、初期光学濃度が０．２～０．７５になるように接種した。この培養物を振とうフラスコに入れて３７℃で光学濃度が１～４に達するまで培養し、０．１ｍＭのイソプロピル－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシドＩＰＴＧおよび０．１％ラムノースを添加することによって組換えタンパク質の発現を誘導した。次いで、培養物を１２ｍＬのガラス管に０．５～１ｍＬずつ分注し、２０℃で適度に振とうしながらインキュベートした。
組換えタンパク質の発現を誘導してから９０分後に、各チューブに基質を添加した。基質は、ＤＭＳＯに溶解した４０ｇ／Ｌのストック溶液を用いて、最終濃度が０．２５～１ｇ／Ｌになるように添加した。あるいは１５０ｍｇ／ｍＬのＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（Sigma-Aldrich社）および３００ｍｇ／ｍＬの基質を水に溶かしてエマルジョンを調製し、基質の最終濃度が１２ｍｇ／ｍＬに達するようにアッセイに加えた。
８～４８時間のインキュベーション後、培養物を１容量のＭＴＢＥで抽出し、後述のＧＣ－ＭＳで分析した。
テルペン化合物の産生を可能にする条件下での人工細菌細胞の培養
テルペン生合成遺伝子および／またはテルペン修飾酵素を有する１つまたは２つの発現プラスミドでＤＰ１２０５大腸菌細胞を形質転換し、形質転換細胞を適切な抗生物質（カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）および／またはクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ））を用いてＬＢ－アガロースプレートで培養した。単一のコロニーを用いて、同じ抗生物質、４ｇ／Ｌのグルコース、１０％（ｖ／ｖ）のドデカンを加えた５ｍＬの液体ＬＢ培地を接種した。翌日、同じ抗生物質および１０％（ｖ／ｖ）ドデカンを加えたＴＢ培地２ｍＬに、一晩培養した培養物０．２ｍＬを接種した。培養物は３７℃で光学濃度が３に達するまでインキュベートした。次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを添加して組換えタンパク質の発現を誘導し、培養物を２０℃で７２時間インキュベートした。
次いで、培養物を１容量の（ＭＴＢＥ）で抽出し、有機相の組成を後述のＧＣ－ＭＳで分析した。定量化のために，内部標準物質（α－ロンギピネン（Aldrich社））をＧＣ－ＭＳ分析の前に抽出液に加え、ピーク面積の比較に基づき成分の濃度を推定した。
ＧＣ－ＭＳ分析法
全細胞バイオコンバージョンアッセイのサンプルを、５９７５Ｃシリーズ質量選択検出器（ＭＳＤ）と結合しかつスプリット／スプリットレスインジェクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣシステム（Agilent Technologies社、カリフォルニア州）を用いて分析した。
ＧＣの入口温度を２３０℃に設定し、スプリットモード（スプリット比２０：１）で１．０μＬのサンプルを注入し、ＤＢ－５ｍｓキャピラリーカラム（３０ｍ×内径０．２５ｍｍ×膜厚０．２５μｍ、Agilent J&W社）により、ヘリウムをキャリアガスとして用いて１ｍＬ／分の一定流量で分析した。オーブンの初期温度は８０℃に設定し、２４０℃（１０℃／分；ホールド１分）、次いで３００℃（２０℃／分；ホールド１分）にプログラムした。
インビトロアッセイのサンプルを、５９７５シリーズ質量選択検出器（ＭＳＤ）と結合しかつスプリット／スプリットレスインジェクター（Agilent Technologies社、カリフォルニア州）およびＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラー（CTC Analytics社、スイス国ツヴィンゲン）注入システムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎ ＧＣシステムを用いて分析した。ＧＣの入口温度を２５０℃に設定し、パルスドスプリットレスモード（パルス圧１．５６ｂａｒ、パルス時間０．６分）で１．０μＬのサンプルを注入し、ＤＢ－１ｍｓキャピラリーカラム（３０ｍ×内径０．２５ｍｍ×膜厚０．２５μｍ、Agilent J&W社）により、ヘリウムをキャリアガスとして用いて１．２ｍＬ／分の一定流量で分析した。オーブンの初期温度は１００℃（ホールド１分）とし、２６０℃（１０～２０℃／分）、次いで３００℃（３０℃／分；ホールド１分）とプログラムした。分子量の小さい化合物については、オーブンの初期温度を８０℃に下げた以外は同じ条件で分析した。
テルペン化合物を分解する組換え株の操作
以下のタンパク質のうちの１つ以上をコードするヌクレオチド配列を導入することによって、化合物を産生または変換することができる組換え株を操作した：
－ 以下から選択されるバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）
Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号２）、
Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号６）、
Papiliotrema laurentii由来のＳＣＨ２５－ＢＶＭＯ１（配列番号１０）および
Bensingtonia ciliata由来のＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１（配列番号１３）；
－ 以下から選択されるエステラーゼ
Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＥＳＴ（配列番号２０）、
Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＥＳＴ（配列番号２４）、
Papiliotrema laurentii由来のＳＣＨ２５－ＥＳＴ（配列番号２８）；ならびに
－ 以下から選択から選択されるエナール開裂酵素（リアーゼ）
ＳＣＨ９４－３９４４ Rhodococcus erythropolis（配列番号３４）、
ＳＣＨ８０－０５２４１ Rhodococcus rhodochrous（配列番号３８）、
Ｐｄｉｇｉｔ７０３３ Penicillium digitatum（配列番号４２）、
ＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１ Penicillium italicum（配列番号４６）、
ＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４ Aspergillus wentii（配列番号４９）、
ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２ Rhodococcus hoagii株ＰＡＭ２２８８（配列番号５３）、
ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３ Rhodococcus hoagii株Ｎ１２８（配列番号５６）、
ＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４ Rhodococcus hoagii ＮＢＲＣ１０１２５（配列番号５９）、
ＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４ Cupriavidus necator（配列番号６２）、
Ｒｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４ Ralstonia insidiosa（配列番号６９）、
ＣｇａｔＤＵＦ４３３４ Cryptococcus gattii ＥＪＢ２（配列番号７２）、
ＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４ Grosmannia clavigera ｋｗ１４０７（配列番号７５）、
ＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４ Thermomonospora curvata（配列番号８１）、
ＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４ Pseudomonas protegens（配列番号８７）。
インビトロ酵素アッセイまたは全細胞バイオコンバージョンアッセイのための細菌宿主細胞は、大腸菌ＫＲＸ細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）および大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）細胞（ThermoFisher社）から選択した。
上記の酵素から選択された１つ以上の酵素を用いてテルペン化合物を生化学的に産生するために、メバロン酸酵素経路を用いてファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を増産するように宿主細胞を操作し、さらにセスキテルペンまたはジテルペン生合成酵素を発現するように形質転換した。
メバロン酸経路酵素をコードする遺伝子の染色体組込みによる、ＦＰＰ産生のための組換え大腸菌株の操作
メバロン酸経路酵素をコードする組換え遺伝子の染色体組込みにより、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を産生するように大腸菌株を操作した。図１に描写した構造スキームおよび組換えイベントも参照。
大腸菌由来のアセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼをコードするａｔｏＢ遺伝子と、黄色ブドウ球菌由来のＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素およびＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素をコードするｍｂａＡおよびｍｂａＳ遺伝子とからなる上部経路オペロン（アセチル－ＣｏＡからメバロン酸までのオペロン１）を設計した。
下部メバロン酸経路のオペロン（メバロン酸からファルネシルピロリン酸までのオペロン２）として、メバロン酸キナーゼ（ｍｖａＫ１）、リンホメバロン酸キナーゼ（ｍｖａＫ２）、リンホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ｍｖａＤ）、およびイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｆｎｉ）をコードする、グラム陰性菌である肺炎レンサ球菌由来の天然オペロンを選択した。
イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をＦＰＰに変換するために、コドン最適化された出芽酵母ＦＰＰ合成酵素コーディング遺伝子（ＥＲＧ２０）を上部経路オペロンの３’末端に導入した。
上記のオペロンをＤＮＡ２．０で合成し、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）のａｒａＡ遺伝子に組み込んだ。異種経路の導入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを用いて、２回に分けて組換えステップを行った。組み込まれる第１のオペロン（下部経路；オペロン２）は、スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）マーカーを持ち、これをＳｐｅｃ耐性候補の組込み体のスクリーニングに用いた。第２のオペロンは、先に組み込まれたオペロンのＳｐｅｃマーカーを置き換えるように設計されており、２回目の組換えイベントの後、Ｓｐｅｃ候補の組込み体をスクリーニングした（図１参照）。ａｒａＡ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ発現ベクターを設計し、ＤＮＡ２．０で合成した。ＰＣＲを用いてオペロンの組込みを検証するために、ａｒａＡ遺伝子の組込みターゲットと組込み体の組換え結合部とを横断して増幅するＰＣＲプライマーを設計した。次いで、正しいＰＣＲ結果をもたらす１つのクローンを完全に配列決定し、ＤＰ１２０５株として保存した。
コパロールを産生するための組換え細菌細胞の操作
以下のものをコードする２つのｃＤＮＡを含むオペロンを構築した：
－ コパリルＰＰのようなテルペニル二リン酸化合物を脱リン酸化する能力を有する、Aspergillus wentii由来のテルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であるＡｓｐＷｅＴＰＰ（配列番号１７０）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＯＪＪ３４５８５．１）；および
－ Talaromycesverruculosus由来のプレニル基転移酵素およびコパリル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質であるＰｖＣＰＳ（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢＦ８８１２８．１）。ＰｖＣＰＳは、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからコパリルＰＰの生成を触媒する。
ＡｓｐＷｅＴＰＰおよびＰｖＣＰＳをコードするｃＤＮＡを、コドン最適化した（配列番号１７１および１７４）。この２つのｃＤＮＡと、ｃＤＮＡの上流に置かれたＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ）（配列番号１９６）とを含むオペロンを設計した。このオペロンを合成し、ｐＪ４０１発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４を得た。
このプラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４を用いてＤＰ１２０５大腸菌などの大腸菌細胞を形質転換することにより、テルペン化合物の産生が可能な条件下で培養した場合に、コパロールを産生することができる組換え細胞が得られる。
コパラールの産生のための組換え細菌細胞の操作
以下のものをコードする３つのｃＤＮＡを含むオペロンを構築した：
－ コパリルＰＰのようなテルペニル二リン酸化合物を脱リン酸化する能力を有する、Aspergillus wentii（配列番号１７０）由来のテルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であるＡｓｐＷｅＴＰＰ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＯＪＪ３４５８５．１）；
－ コパロールのようなテルペンアルコール類をコパラールのようなそれぞれのカルボニル化合物に酸化する能力を有する、Azoarcustoluclasticus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を有するタンパク質であるＡｚＴｏｌＡＤＨ１（配列番号１６７）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０１８９９０７１３．１）；ならびに
－ ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからコパリル二リン酸のような環状テルペニル二リン酸化合物を生成する能力を有する、Talaromycesverruculosus由来のプレニル基転移酵素およびコパリル二リン酸合成酵素活性を有するタンパク質であるＰｖＣＰＳ（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢＦ８８１２８．１）。
ＡｓｐＷｅＴＰＰ、ＡｚＴｏｌＡＤＨ１およびＰｖＣＰＳをコードするｃＤＮＡをコドン最適化した（配列番号１７１、１６８および１７４）。この３つのｃＤＮＡと、それぞれのｃＤＮＡの上流に置かれたＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ）（配列番号１９６）とを連続して含むオペロンを設計した。このオペロンを合成し、ｐＪ４０１発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１を得た。
このプラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４を用いてＤＰ１２０５大腸菌などの大腸菌細胞を形質転換することにより、テルペン化合物の産生が可能な条件下で培養した場合に、コパロールを産生することができる組換え細胞が得られる。
ファルネサールを産生するための組換え細菌細胞の操作
以下のものをコードする２つのｃＤＮＡを含むオペロンを構築した：
－ ファルネシル二リン酸のようなテルペニル二リン酸化合物を脱リン酸化する能力を有する、Talaromycescellulolyticus由来のテルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であるＴａｌＣｅＴＰＰ（配列番号１７６）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＡＭ４２０００．１）；および
－ ファルネソールのようなテルペンアルコール類をファルネサールのようなそれぞれのカルボニル化合物に酸化する能力を有するCastellanielladefragrans由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を有するタンパク質であるＣｄＧｅｏＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号ＷＰ＿０４３６８３９１５．１）（配列番号１７９）。
ＴａｌＣｅＴＰＰおよびＣｄＧｅｏＡをコードするｃＤＮＡをコドン最適化した（配列番号１７７および１８０）。２つのｃＤＮＡと、それぞれのｃＤＮＡの上流に置かれたＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ）（配列番号１９６）とを連続して含むオペロンを設計した。このオペロンを合成し、ｐＪ４０１発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４０１－ＦＡＬ－１を得た。
このプラスミドｐＪ４０１－ＦＡＬ－１を用いてＤＰ１２０５大腸菌などの大腸菌細胞を形質転換することにより、テルペン化合物の産生が可能な条件下で培養した場合に、ファルネサールを産生することができる組換え細胞が得られる。
ラブダンジオールを産生するための組換え細菌細胞の操作
以下のものをコードする３つのｃＤＮＡを含むオペロンを構築した：
－ ラブダンジオールＰＰのようなテルペニル二リン酸化合物を脱リン酸化する能力を有する、Talaromycesverruculosus由来のテルペニル二リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質であるＴａｌＶｅＴＰＰ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＵＬ８９３３４．１）（配列番号１９４）、
－ ラブダンジオール二リン酸のような環状テルペン二リン酸化合物をＧＧＰＰから生成する能力を有する、Salvia sclarea由来のラブダンジオール－フィロリン酸（ＬＰＰ）合成酵素活性を有するタンパク質であるＳｓＬＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥＴ２１２４７．１）（配列番号１８８）；ならびに
－ ＧＧＰＰをＦＰＰから生成する能力を有する、Pantoeaagglomerans由来のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素であるＣｒｔＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２４８１９．１）（配列番号１９１）。
ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＳｓＬＰＳ、ＣｒｔＥをコードするｃＤＮＡをコドン最適化した（配列番号１９５、１８９および１９２）。これら３つのｃＤＮＡと、それぞれのｃＤＮＡの上流に置かれたＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ）（配列番号１９６）とを連続して含むオペロンを設計した。このオペロンを合成し、ｐＪ４０１発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４０１－ＬＯＨ－２を得た。
このプラスミドｐＪ４０１－ＬＯＨ－２を用いてＤＰ１２０５大腸菌などの大腸菌細胞を形質転換することにより、テルペン化合物の産生が可能な条件下で培養した場合に、ラブデンジオールを産生することができる組換え細胞が得られる。
酵母細胞の形質転換、選択および培養
すべての酵母細胞の形質転換は、Gietz and Woods, Methods Enzymol., 2002, 350:87－96に記載されている酢酸リチウムプロトコルで行った。形質転換混合物を、アミノ酸を含まない６．７ｇ／Ｌの酵母ニトロゲンベース（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ社、アメリカ合衆国ニュージャージー州）、ウラシルを含まない１．９２ｇ／Ｌのドロップアウトサプリメント（Sigma Aldrich社、アメリカ合衆国ミズーリ州）またはロイシンを含まない１．６ｇ／Ｌのドロップアウトサプリメント（Sigma Aldrich社、アメリカ合衆国ミズーリ州）、２０ｇ／Ｌのグルコースおよび２０ｇ／Ｌの寒天を含むＳｍＵｒａ－またはＳｍＬｅｕ－培地プレート上にプレーティングした。プレートは３０℃で３～４日間インキュベートした。
内在性ファルネシル二リン酸のレベルを高めるための酵母細胞の操作
出芽酵母細胞内の内在性ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）プールを増加させるために、出芽酵母株ＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｃ（Euroscarf社、ドイツ国フランクフルト）のゲノムに、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼをコードするＥＲＧ１０からＦＰＰ合成酵素をコードするＥＲＧ２０までの、メバロン酸経路に関与する酵母内在性遺伝子の余分なコピーを、Paddon et al., Nature, 2013, 496:528-532に記載されているのと同様に、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でゲノムに組み込んだ。簡単に言うと、３つのカセットをＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３遺伝子座にそれぞれ組み込んだ。第１のカセットは、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向プロモーターの制御下にある遺伝子ＥＲＧ２０および切断されたＨＭＧ１（Donald et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 109:E111-8に記載されているｔＨＭＧ１）と、同じくＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある遺伝子ＥＲＧ１９およびＥＲＧ１３とを含んでいた。このカセットは、ＬＥＵ２の上流部と下流部とに対応する２つの１００ヌクレオチド領域で挟まれていた。第２のカセットは、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある遺伝子ＩＤＩ１およびｔＨＭＧ１と、ＧＡＬ７のプロモーター領域の制御下にある遺伝子ＥＲＧ１３とを含んでいた。このカセットは、ＴＲＰ１の上流部と下流部とに対応する２つの１００ヌクレオチド領域で挟まれていた。第３のカセットは、すべてＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある遺伝子ＥＲＧ１０、ＥＲＧ１２、ｔＨＭＧ１およびＥＲＧ８を含んでいた。このカセットは、ＵＲＡ３の上流部と下流部とに対応する２つの１００ヌクレオチド領域で挟まれていた。３つのカセットのすべての遺伝子は、それら自身のターミネーター領域の２００ヌクレオチドを含んでいた。また、Griggs and Johnston, Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:8597-8601に記載されているように、それ自身のプロモーターの変異バージョンの制御下にあるＧＡＬ４の余分なコピーを、ＥＲＧ９プロモーター領域の上流に組み込んだ。さらに、プロモーター交換によってＥＲＧ９の発現を改変した。ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０およびＧＡＬ１遺伝子を、それ自身のプロモーターおよびターミネーターを持つＨＩＳ３遺伝子を含むカセットを用いて削除した。得られた株を、Solis-Escalante et al., FEMS Yeast Res, 2015, 15:2に従って、胞子形成のために誘導されたＹＳＴ０４５と命名した２倍体の株を得る株ＣＥＮ．ＰＫ２－１Ｄ（Euroscarf社、ドイツ国フランクフルト）と交配した。胞子分離は、２μＬのザイモリアーゼ（１０００ＵｍＬ－１、Zymo research社、カリフォルニア州アーバイン）を加えた２００μＬの０．５Ｍソルビトールにａｓｃｉを再懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートすることによって達成した。次いで、２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキスおよび２０ｇ／Ｌ寒天を含む培地にプレーティングし、発芽した胞子１個を分離し、ＹＳＴ０７５と命名した。
コパロールの産生のための組換え酵母細胞の操作
コパロール産生のために、異なる人工酵母細胞におけるＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ（Blakesleatrispora由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＪＱ２８９９９５．１）（配列番号１８２）、コパリル－ピロリン酸合成酵素ＳｍＣＰＳ２（Salvia miltiorrhiza由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１）（配列番号１８５）およびコパリル－ピロリン酸ホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ（Talaromycesverruculosus由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＬ８９３３４．１）（配列番号１９４）の発現を、Kuijpers et al., Microb Cell Fact., 2013, 12:47で先に記載されていたように、酵母の内因性相同組換えを用いてインビボで構築されたプラスミド系を用いて達成した。このプラスミドは、出芽酵母の共形質転換に使用された６つのＤＮＡ断片から構成されている。断片は以下のとおりであった：
ａ）プラスミドｐＥＳＣ－ＬＥＵ（Agilent Technologies社、アメリカ合衆国カリフォルニア州）を鋳型とする、プライマー
Figure 2022539510000036
 （配列番号１２４）および
Figure 2022539510000037
 （配列番号１２５）
を用いたＰＣＲによって構築された、ＬＵＥ２酵母マーカー；
ｂ）プラスミドｐＥＳＣ－ＵＲＡを鋳型とする、プライマー
Figure 2022539510000038
 （配列番号１２６）および
Figure 2022539510000039
 （配列番号１２７）
を用いたＰＣＲによって構築された、Ａｍｐ大腸菌マーカー；
ｃ）ｐＥＳＣ－ＵＲＡを鋳型とする、プライマー
Figure 2022539510000040
 （配列番号１２８）および
Figure 2022539510000041
 （配列番号１２９）
を用いたＰＣＲによって得られた、酵母の複製起点；
ｄ）ｐＥＳＣ－ＵＲＡを鋳型とする、プライマー
Figure 2022539510000042
 （配列番号１３０）および
Figure 2022539510000043
 （配列番号１３１）
を用いたＰＣＲによって得られた、大腸菌の複製起点；
ｅ）断片「ｄ」の最後の６０ヌクレオチド、酵母遺伝子ＰＧＫ１の停止コドンの下流２００ヌクレオチド、ＧＧＰＰ合成酵素コーディング配列ｃａｒＧ、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向酵母プロモーター、ＴａｌＶｅＴＰＰのコーディング配列、酵母遺伝子ＣＹＣ１の停止コドンの下流２００ヌクレオチドおよび配列
Figure 2022539510000044
 （配列番号１３２）によって構成される断片であって、この断片はＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである；ならびに
ｆ）断片「ｅ」の最後の６０ヌクレオチド、酵母遺伝子ＣＹＣ１の停止コドンの下流２００ヌクレオチド、ＳｍＣＰＳ２コパリル－ピロリン酸合成酵素コーディング配列、ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１の双方向酵母プロモーター、および断片「ａ」の開始部に対応する６０ヌクレオチドによって構成される断片であって、この断片はＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである。
任意に、ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧとコパリルピロリン酸合成酵素とを、２つの機能を持つＰｖＣＰＳに置き換えた。
マノオールオキシの産生のための組換え酵母細胞の操作
コパロールをマノオールオキシに分解するために、異なるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）およびエステラーゼ（ＥＳＴ）を用いてＹＳＴ０７５株のゲノム組込みを行った。各組込みカセットは４つの断片で形成された：
１）ＮＤＴ８０遺伝子の上流部に対応する６５８ｂｐおよび配列
Figure 2022539510000045
 （配列番号１２１）を含む断片であって、この断片はＹＳＴ０７５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得られたものである；
２）配列
Figure 2022539510000046
 （配列番号１２１）、ＣＹＣ１ターミネーター領域、ＢＶＭＯをコードする遺伝子のうちの１つ、ＧＡＬ１遺伝子とＧＡＬ１０遺伝子との間の遺伝子間領域、エステラーゼをコードする遺伝子のうちの１つ、ＡＤＨ１遺伝子のターミネーター領域および配列
Figure 2022539510000047
 （配列番号１２２）を含む断片であって、この断片はＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである；
３）配列
Figure 2022539510000048
 （配列番号１２２）、ＰＧＫ１ターミネーター領域、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうちの１つ、ＧＡＬ１遺伝子およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター領域、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうちの１つ、ＣＹＣ１ターミネーター領域および配列
Figure 2022539510000049
 （配列番号１２３）を含む断片。この断片には、行った実験に応じて１つまたは２つのアルコールデヒドロゲナーゼが含まれている可能性がある。それらは、ＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである；ならびに
４）配列
Figure 2022539510000050
 （配列番号１２３）、およびＮＤＴ８０遺伝子に対応する４０５ｂｐを含む断片であって、この断片はＹＳＴ０７５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得られたものである。
コパロールをマノオールオキシに分解するための組換え酵母細胞の操作
コパロールをマノオールオキシに分解するために、アルコールデヒドロゲナーゼおよび異なるエナール開裂ポリペプチドを用いてＹＳＴ０７５株のゲノム組込みを行い、各組込みカセットは３つの断片で形成された：
１）ＮＤＴ８０遺伝子の上流部に対応する６５８ｂｐおよび配列
Figure 2022539510000051
 （配列番号１２１）を含む断片であって、この断片はＹＳＴ０７５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得られたものである；
２）配列
Figure 2022539510000052
 （配列番号１２１）、ＧＡＬ１遺伝子とＧＡＬ１０遺伝子との間の遺伝子間領域、エナール開裂ポリペプチドをコードする遺伝子のうちの１つ、ＡＤＨ１遺伝子のターミネーター領域および配列
Figure 2022539510000053
 （配列番号１２２）を含む断片であって、この断片はＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである；ならびに
３）配列
Figure 2022539510000054
 （配列番号１２２）、ＰＧＫ１ターミネーター領域、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ＧＡＬ１遺伝子およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター領域、配列
Figure 2022539510000055
 （配列番号１２３）およびＮＤＴ８０遺伝子に対応する４０５ｂｐを含む断片。この断片はＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである。
いずれの場合も、コパロール産生は、上述のように生合成経路をプラスミド系で発現させることによって達成された。
γ－アンブリルアセテートの産生のための組換え酵母細胞の操作
コパロールをγ－アンブリルアセテートに分解するために、アルコールデヒドロゲナーゼ、エナール開裂ポリペプチドおよび異なるバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）を用いてＹＳＴ０７５株のゲノム組込みを行い、各組込みカセットは３つの断片で形成された：
１）ＮＤＴ８０遺伝子の上流部に対応する６５８ｂｐおよび配列
Figure 2022539510000056
 （配列番号１２１）を含む断片であって、この断片はＹＳＴ０７５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得られたものである；
２）配列
Figure 2022539510000057
 （配列番号１２１）、ＣＹＣ１遺伝子のターミネーター領域、試験済みＢＶＭＯをコードする遺伝子のうちの１つ、ＧＡＬ１遺伝子とＧＡＬ１０遺伝子との間の遺伝子間領域、エナール開裂ポリペプチドをコードする遺伝子、ＡＤＨ１遺伝子のターミネーター領域および配列
Figure 2022539510000058
 （配列番号１２２）を含む断片であって、この断片はＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである；ならびに
３）配列
Figure 2022539510000059
 （配列番号１２２）、ＰＧＫ１ターミネーター領域、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ＧＡＬ１遺伝子およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター領域、配列
Figure 2022539510000060
 （配列番号１２３）およびＮＤＴ８０遺伝子に対応する４０５ｂｐを含む断片。この断片はＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである。
いずれの場合も、コパロール産生は、上述のように生合成経路をプラスミド系で発現させることによって達成された。
γ－アンブロール産生のための組換え酵母細胞の操作
コパロールをγ－アンブロールに分解するために、アルコールデヒドロゲナーゼ、エナール開裂ポリペプチド、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）および異なるエステラーゼ（ＥＳＴ）を用いてＹＳＴ０７５株のゲノム組込みを行い、各組込みカセットは４つのオーバーラップする断片によって形成された：
１）ＢＵＤ９遺伝子の上流部に対応する少なくとも３００ｂｐおよびインビボアセンブリのための少なくとも６０ｂｐのオーバーラップ配列を含む断片。この断片は、ＹＳＴ０７５株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られたものである；
２）ＡＤＨ１遺伝子のターミネーター領域、試験済みエステラーゼをコードする遺伝子のうちの１つ、およびＧＡＬ１遺伝子とＧＡＬ１０遺伝子との間の遺伝子間領域を含む断片。この断片は、インビボアセンブリを可能にする配列で挟まれていた。この断片は、ＤＮＡ合成（ATUM社、カリフォルニア州９４０２５メンロパーク市）によって得られたものである；
３）相同組換えを可能にする配列で挟まれた、それ自身のプロモーターおよびターミネーターを持つＵＲＡ３酵母マーカーを含む断片。この断片はＰＣＲによって得られたものである；ならびに
４）ＢＵＤ９遺伝子の下流部に対応する少なくとも３００ｂｐおよびインビボアセンブリを可能にする少なくとも６０ｂｐのオーバーラップ配列を含む断片。この断片は、ＹＳＴ０７５株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって得られた。
いずれの場合も、コパロール産生は、上述のように生合成経路をプラスミド系で発現させることによって達成された。
テルペン化合物の産生を可能にする条件下での人工酵母細胞の培養およびＧＣ－ＭＳ分析法
Westfall et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:E111-118に記載されているのと同様の条件下で細胞を培養し、有機物のオーバーレイとして１０％ドデカンまたは１０％ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）を用いて、人工酵母細胞からテルペンおよびその誘導体を産生することを評価した。次いで、培養物を２容量のＭＴＢＥで抽出し、有機相の組成を、５９７５Ｃシリーズ質量選択検出器（ＭＳＤ）と結合しかつスプリット／スプリットレスインジェクターおよびＧＣインジェクター８０注入システム（Agilent Technologies社、カリフォルニア州）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣシステムを用いて、ＧＣ－ＭＳにより分析した。ＧＣ入口温度を２６０℃に設定し、スプリットレスモードで１．０μｌのサンプルを注入し、ＨＰ－５ ＧＣカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ；Agilent J&W社）により、ヘリウムをキャリアガスとして用いて１．２ｍＬ／分の一定流量で分析した。オーブンの初期温度は１００℃に設定し、３００℃までプログラムした（１０℃／分）。
ｃ）実施例
実施例１：ＢＶＭＯを用いたマノオールオキシのγ－アンブリルアセテートへのインビボ変換
Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号２）、Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号６）およびBensingtonia ciliata由来のＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１（配列番号１３）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ｐＪ４１４発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４１４－ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ｐＪ４１４－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、およびｐＪ４１４－ＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１を得た。これらの発現プラスミドでＫＲＸ大腸菌細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）を形質転換した。形質転換した細胞を増殖させ、マノオールオキシを基質として用いる上述の全細胞バイオコンバージョンアッセイに使用した。空のプラスミドで形質転換された細胞からなるネガティブコントロールも含めた。ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１またはＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１組換えタンパク質の存在下で、マノオールオキシのγ－アンブリルアセテートへの変換が観察された（図２）。ネガティブコントロールでは変換は観察されなかった。この経験は、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１またはＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１が以下の変換を触媒できることを示している：
Figure 2022539510000061
これらの結果は、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、およびＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１がマノオールオキシのバイヤー・ビリガー型酸化を触媒することを示している。
実施例２：ＢＶＭＯを用いたコパラールの化合物４へのインビボ変換
Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号３）、Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号７）およびBensingtonia ciliata由来のＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１（配列番号１４）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ｐＪ４１４発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４１４－ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ｐＪ４１４－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびｐＪ４１４－ＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１を得た。これらの発現プラスミドでＫＲＸ大腸菌細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）を形質転換した。この細胞を培養し、シス－コパラールとトランス－コパラールとの混合物を基質として用いる上述の全細胞バイオコンバージョンアッセイに使用した。空のプラスミドで形質転換された細胞からなるネガティブコントロールも含めた。ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１またはＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１の組換えタンパク質の存在下で、シス－コパラールおよびトランス－コパラールの変換が観察された。４２時間インキュベートした後のバイオコンバージョンの産物をＧＣ－ＭＳ分析（図３）は、２つの立体異性体３ａおよび３ｂと２つの立体異性体４ａおよび４ｂとの４つの主要産物の形成を示している。
バイオコンバージョンのタイムポイント測定では、中間産物として化合物１ａおよび１ｂが形成されることが示されている。図４は、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１によるシス－コパラールおよびトランス－コパラールの変換のＧＣ－ＭＳ分析を異なる時間で比較したものである。産物プロファイルの同様の進化が、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１で観察される。これらの化合物の連続的な形成は、トランス－コパラールおよびシス－コパラールが、いくつかのステップで化合物４ａおよび４ｂに変換されることを示している。化合物１ａおよび１ｂならびに化合物４ａおよび４ｂはホルメートエステルである。そのような官能基は、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼによってアルデヒド化合物から形成することができる。したがって、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１またはＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１によるトランス－コパラールの変換を説明するために、酵素的および非酵素的（化学反応）を含む以下の反応スキームを描写することができる。
Figure 2022539510000062
このスキームでは、組換え酵素が２つの異なるアルデヒドに対して２つのバイヤー・ビリガー型酸化を触媒する。まず、トランス－コパラールのα，β－不飽和アルデヒド基が組換え酵素による最初のバイヤー・ビリガー型酸化で酸化され，化合物１ａを形成する。化合物１ａのエノールホルメート官能基は、実験条件下では不安定であり、部分的に加水分解されて化合物２ａを形成する。この後者の化合物は、ケト－エノール互変異性を経て速やかに化合物３（３ａおよび３ｂ）に変換されるため、ＧＣ－ＭＳ分析では検出されない。化合物３（３ａおよび３ｂ）は、同じ酵素の基質となり、２回目のバイヤー・ビリガー酸化を触媒して化合物４（４ａおよび４ｂ）を形成する。
下記の反応スキームは、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１またはＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１によるシス－コパラールの変換における同様の反応を描写したものである。
Figure 2022539510000063
これらの結果は、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１がラブダンアルデヒド化合物のバイヤー・ビリガー型酸化を触媒することを示している。
実施例３：ＢＶＭＯおよびエステラーゼを用いたマノオールオキシのインビトロ変換
この実験のために、以下の組換えタンパク質を使用した：Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号２）、Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号６）、Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＥＳＴ（配列番号２０）およびFilobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＥＳＴ（配列番号２４）。ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号３）およびＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号７）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ｐＪ４１４発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４１４－ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびｐＪ４１４－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１を得た。ＳＣＨ２３－ＥＳＴ（配列番号２１）およびＳＣＨ２４－ＥＳＴ（配列番号２５）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ｐＪ４３１発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４１４－ＳＣＨ２３－ＥＳＴ、ｐＪ４１４－ＳＣＨ２４－ＥＳＴを得た。
ＫＲＸ大腸菌細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）をこれらの各発現プラスミドで形質転換した。形質転換した細胞を増殖させ、記載したように細胞不含のライセートを調製した。これらのタンパク質分画のいずれか、またはこれらのタンパク質分画の２つの組み合わせを用いて、インビトロ酵素アッセイを行った。インビトロアッセイの条件は、１６０ｍｇ／Ｌのマノオールオキシ、６０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）および５００μＭの還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を添加した上記のとおりであった。
組換えＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１タンパク質を含む粗分画を用いて、マノオールオキシのγ－アンブロールアセテートへの変換が観察された。空のプラスミドで形質転換された大腸菌細胞から得られたコントロールライセートを用いた場合、変換は検出されなかった（図５）。これらの実験から、以下の酵素反応を導き出すことができる。
Figure 2022539510000064
組換えエステラーゼ酵素を含むタンパク質分画と、組換えＢＶＭＯおよび組換えエステラーゼ酵素を含むタンパク質分画の組み合わせとを用いて、インビトロ酵素アッセイも行った。これらのアッセイは、基質としてマノオールオキシを用いて上述のように行った。形成された産物のＧＣ－ＭＳ分析（図６および７）は、ＢＶＭＯ酵素（ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１またはＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１）の存在下でのマノオールオキシのγ－アンブリルアセテートへの変換、およびアッセイにエステラーゼ酵素（ＳＣＨ２３－ＥＳＴまたはＳＣＨ２４－ＥＳＴ）が存在する場合のγ－アンブリルアセテートのγ－アンブロールへの更なる変換を示している。ＢＶＭＯの不在下でエステラーゼを使用した場合、基質の変換は観察されない（図６および７）。
この実験は、ＢＶＭＯおよびエステラーゼの存在下で、マノオールオキシが以下に描写される反応スキームに従ってγ－アンブロールに変換されることを示している。
Figure 2022539510000065
実施例４：エステラーゼを用いた化合物４ａおよび４ｂの化合物５ａおよび５ｂへのインビトロ変換
Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＥＳＴ（配列番号２１）、Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＥＳＴ（配列番号２５）およびBensingtonia ciliata由来のＳＣＨ４６－ＥＳＴ（配列番号３２）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ｐＪ４１４発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４１４－ＳＣＨ２３－ＥＳＴ１、ｐＪ４１４－ＳＣＨ２４－ＥＳＴ１およびｐＪ４１４－ＳＣＨ４６－ＥＳＴ１を得た。これらの発現プラスミドでＫＲＸ大腸菌細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）を形質転換した。形質転換された細胞を成長させ、記載したように細胞不含のライセートを調製した。これらのタンパク質分画を用いて、上記の条件に従ってインビトロ酵素アッセイを行った。
図８に示すように、組換えＳＣＨ２３－ＥＳＴ１、ＳＣＨ２４－ＥＳＴ１およびＳＣＨ２５－ＥＳＴ１タンパク質を含む粗分画を用いて、２つの立体異性体４ａおよび４ｂの化合物５ａおよび５ｂへの変換が観察された。それと比較して、組換えＢＶＭＯ酵素を含むライセートを用いた場合には、変換は検出されなかった（したがって、これらのタンパク質は、この実験シリーズのコントロール反応に用いられた）。これらの条件下では、ＳＣＨ２３－ＥＳＴ１およびＳＣＨ２５－ＥＳＴ１の酵素活性は、ＳＣＨ２４－ＥＳＴの酵素活性よりも高かった。
これらの実験から、以下の酵素反応を導き出すことができる：
Figure 2022539510000066
実施例５：ＢＶＭＯおよびエステラーゼを用いたコパラールのインビトロ変換
この実験のために、以下の組換えタンパク質を使用した：Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号２）、Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号６）、Papiliotrema laurentii由来のＳＣＨ２５－ＢＶＭＯ１（配列番号１０）、Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＥＳＴ（配列番号２０）、Filobasidium magnum由来のＳＣＨ２４－ＥＳＴ（配列番号２４）、Papiliotrema laurentii由来のＳＣＨ２５－ＥＳＴ（配列番号２８）。
ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号３）、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号７）およびＳＣＨ２５－ＢＶＭＯ１（配列番号１１）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ｐＪ４１４発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４１４－ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ｐＪ４１４－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびｐＪ４１４－ＳＣＨ２５－ＢＶＭＯ１を得た。ＳＣＨ２３－ＥＳＴ（配列番号２１）、ＳＣＨ２４－ＥＳＴ（配列番号２５）およびＳＣＨ２５－ＥＳＴ（配列番号２９）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ｐＪ４３１発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングし、プラスミドｐＪ４１４－ＳＣＨ２３－ＥＳＴ、ｐＪ４１４－ＳＣＨ２５－ＥＳＴを得た。
ＫＲＸ大腸菌細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）をこれらの発現プラスミドで形質転換した。形質転換した細胞を増殖させ、記載したように細胞不含のライセートを調製した。組換えＢＶＭＯ酵素もしくは組換えエステラーゼ酵素を含むタンパク質分画を用いて、または組換えＢＶＭＯ酵素およびエステラーゼ酵素を含むタンパク質分画を組み合わせることによって、インビトロ酵素アッセイを行った。アッセイは、基質として３２０ｍｇ／Ｌのシス－コパラールとトランス－コパラールとの混合物、６０μＭのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）および５００μＭの還元型β－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を添加して上記のとおり行った。
図９は、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１のみの存在下と、異なるエステラーゼ酵素との併用下でのコパラールの変換による産物を比較したものである。ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１の存在下では、主要産物はホルメート化合物１ａ，１ｂおよび４ａ，４ｂである。ＳＣＨ２３－ＥＳＴまたはＳＣＨ２５－ＥＳＴの追加存在下でアッセイを行った場合、変換の主要産物は化合物５ａおよび５ｂであり、これらの２つのエステラーゼ酵素がＢＶＭＯ酵素によって産生されたホルメート中間体を効率的に加水分解できることを示している。ＳＣＨ２４－ＥＳＴの追加存在下では、同じ中間体（１ａ，１ｂおよび４ａ，４ｂ）の加水分解が観察されたが、この酵素を用いると、ＳＣＨ２４－ＥＳＴによる中間体１ａおよび１ｂの加水分解が中間体４ａおよび４ｂの加水分解よりも効率的であるように思われた。
ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１をエステラーゼＳＣＨ２３－ＥＳＴまたはＳＣＨ２４－ＥＳＴと組み合わせた場合、シスおよびトランス－コパラールの同様の変換が観察された（図１０）。コントロール実験では、コパラールをエステラーゼのみとインキュベートした場合、変換は観察されなかった。
これらの実験から、以下の酵素経路を推測することができる。
Figure 2022539510000067
実施例６：ＢＶＭＯおよびエステラーゼを発現する人工細菌細胞における１４，１５－ジノル－ラブダン化合物５ａおよび５ｂならびに生合成中間体のインビボ産生
この実験では、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１（既述）を用いて大腸菌細胞を形質転換し、実験の項で述べたようにコパラールを産生した。ＤＰ１２０５大腸菌を形質転換し、実験の項で述べた条件下で培養した場合、トランス－コパラールおよびシス－コパラールの形成が確認された（図１１、上段のクロマトグラム）。コパラールの２つの二重結合異性体が検出されたのは、（Ｅ）－α，β－不飽和アルデヒドの異性化が比較的容易であるためである（Konning et al, Org. Lett., 2012, 14 (20), pp 5258－5261）。ラブダ－８（２０）－エン－１５－オールが追加で検出されたのは、大腸菌の内因性エノエートレダクターゼ活性によるものである。
次いで、Filobasidium magnum（ＡＴＣＣ（登録商標）２０９１８（商標））由来のＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号７）またはBensingtonia ciliata由来のＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１（配列番号１４）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを持つ第２の発現プラスミドで細菌細胞を形質転換した。これらのプラスミドは、最適化されたｃＤＮＡをｐＪ４２３発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングすることによって調製され、それぞれプラスミドｐＪ４２３－ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯおよびｐＪ４２３－ＳＣＨ４６－ＢＶＭＯを得た。２つのプラスミドで形質転換された細胞を培養し、実験の項に記載した条件を用いてテルペン化合物およびテルペン誘導体の産生量を分析した。この条件下では、培養ブロスの溶媒抽出液に、化合物１ａおよび１ｂ、３ａおよび３ｂ、ならびに４ａおよび４ｂが検出された（図１１）。これらの結果は、これらの酵素の組み合わせを用いて、コパロールのようなラブダンジテルペンの生合成と、側鎖の２個の炭素－炭素結合の逐次的な酵素開裂とを、組換え細胞に導入できることを示している。
同様に、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１と、ＢＶＭＯをコードする遺伝子およびエステラーゼをコードする遺伝子を持つ第２のプラスミドとを用いて細菌細胞を共形質転換した：ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（配列番号７）とＳＣＨ２４－ＥＳＴをコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（配列番号２５）とから構成される合成オペロンをｐＪ４２３発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）に挿入することによって調製されるｐＪ４２３－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ－ＳＣＨ２４－ＥＳＴ、またはＳＣＨ４６－ＢＶＭＯをコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（配列番号１４）とＳＣＨ４６－ＥＳＴをコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（配列番号３２）とから構成される合成オペロンをｐＪ４２３発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）に挿入することによって調製されるプラスミドであるｐＪ４２３－ＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ－ＳＣＨ４６－ＥＳＴ。この細胞を培養し、実験の項に記載した条件でテルペン化合物およびテルペン誘導体の産生量を分析した。この条件下では、化合物５ａおよび５ｂが検出され、経路中間体（化合物１ａ、１ｂ、３ａ、３ｂ、４ａおよび４ｂ）の量が減少していることが確認された。
この一連の実験は、ジテルペン生合成酵素をＢＶＭＯおよびエステラーゼと組み合わせて発現するように形質転換した宿主細胞に以下の生合成経路を導入できることを示している。
Figure 2022539510000068
実施例７：アルコールデヒドロゲナーゼを用いた化合物５ａおよび５ｂのマノオールオキシへのインビボ変換。
この実験のために、以下のアルコールデヒドロゲナーゼを、化合物５ａおよび５ｂのマノオールオキシへの酸化について評価した：
Rhodococcus rhodochrous由来のＲｒｈＳｅｃＡＤＨ（配列番号１４６）、
Rhodococcus rhodochrous由来のＳＣＨ８０－０００４３（配列番号１４９）、
Rhodococcus rhodochrous由来のＳＣＨ８０－０４２５４（配列番号１５２）、
Rhodococcus rhodochrous由来のＳＣＨ８０－０６１３５（配列番号１５５）、
Rhodococcus rhodochrous由来のＳＣＨ８０－０６５８２（配列番号１５８）。
（国際公開第２００５／０２６３３８号も参照）；上記のＡＤＨは単なる非限定的な例であり、他の既知のＡＤＨに置き換えてもよい）。
これらのタンパク質のそれぞれをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを合成し、ベクターｐＪ４０１にクローニングし、プラスミドｐＪ４０１－ＲｒｈＳｅｃＡＤＨ、ｐＪ４０１－ＳＣＨ８０－０００４３、ｐＪ４０１－ＳＣＨ８０－０４２５４、ｐＪ４０１－ＳＣＨ８０－０６１３５およびｐＪ４０１－ＳＣＨ８０－０６５８２（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）を得た。
これらの発現プラスミドでＫＲＸ大腸菌細胞（Promega Corporation社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市）を形質転換した。形質転換した細胞を培養し、化合物５ａと５ｂとの混合物を基質として用いる上述の全細胞バイオコンバージョンアッセイに使用した。組換えタンパク質の発現を誘導してから５時間後、水に５０ｍｇ／ｍＬのｔｗｅｅｎ８０と２５ｍｇ／ｍＬの基質とを含むエマルジョンを用いて、最終濃度０．５５ｍｇ／ｍＬになるように基質を添加した。また、空のプラスミドで形質転換された細胞からなるネガティブコントロールを含めた。酸化反応は、ＳＣＨ８０－０６１３５およびＲｒｈＳｅｃＡＤＨの組換えタンパク質の存在下でのみ観察され（図１２）、これらの酵素が以下の反応を触媒できることが示された。
Figure 2022539510000069
実施例８：ＢＶＭＯ、エステラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを発現する人工細菌細胞におけるテトラノル－ラブダン化合物であるγ－アンブロールおよび生合成中間体のインビボ産生。
この実験では、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１（既述）を用いて、前項で述べたようにコパラール（シスおよびトランス－異性体）を産生するバックグラウンド株を作製するＤＰ１２０５大腸菌細胞を形質転換した。
次いで、この株をプラスミドｐＪ４２３－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ－ＳＣＨ２４－ＥＳＴ（既述）で共形質転換し、同じ細胞でＢＶＭＯおよびエステラーゼをさらに発現させた。この組換え生物は、前項で行った観察結果と同様に、１４，１５－ジノル－ラブダン化合物を産生する。
側鎖の分解をテトラノル－ラブダン誘導体の形成まで継続させるために、化合物５ａおよび５ｂの第２級アルコール基を対応するケトンに酸化しなければならない。したがって、ＢＶＭＯ、エステラーゼおよび適切なアルコールデヒドロゲナーゼ（実施例７で特定）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを構築した。アルコールデヒドロゲナーゼについては、ロドコッカス種由来のＲｒｈＳｅｃＡＤＨをコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（アクセッション番号ＷＰ＿０４３８０１４１２．１）（配列番号１４７）を合成し、ＲｒｈＳｅｃＡＤＨ ｃＤＮＡと、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯおよびＳＣＨ２４－ＥＳＴをコードするｃＤＮＡとを組み合わせた合成オペロンを設計した。このオペロンをｐＪ４２３発現プラスミドにクローニングし、ｐＪ４２３－ｓｅｃＡＤＨ－２３ＢＶＭＯ－ＥＳＴプラスミドを得た。ベクターｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１とベクターｐＪ４２３－ｓｅｃＡＤＨ－２３ＢＶＭＯ－ＥＳＴとで共形質転換したＤＰ１２０５大腸菌を上記の条件下で培養した場合、培養ブロスのＧＣ－ＭＳ分析でγ－アンブロールが検出された（図１３）。これらのデータは、適切なＡＤＨの存在下で化合物５（５ａおよび５ｂ）がマノオールオキシに酸化されると、ＢＶＭＯが以下の経路ステップを触媒し、γ－アンブロールを提供できることを示している。
この実験シリーズは、以下の生合成経路を組換え宿主細胞に導入できることを示している。
Figure 2022539510000070
実施例９：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）およびHyphozyma roseonigraまたはCryptococcus albidus由来のエステラーゼ（ＥＳＴ）を用いた出芽酵母細胞におけるインビボでのマノオールオキシ産生
マノオールオキシの産生のために、ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧをコードする遺伝子（Blakesleatrispora由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＪＱ２８９９９５．１）（配列番号１８２）、コパリル－ピロリン酸合成酵素ＳｍＣＰＳ２（Salvia miltiorrhiza由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１）（配列番号１８５）、コパリル－ピロリン酸ホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ（Talaromycesverruculosus由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＬ８９３３４．１）（配列番号１９４）と、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ１（配列番号１３４）、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号２）、エステラーゼＳＣＨ２３－ＥＳＴ（配列番号２０）およびアルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ２（Hyphozyma roseonigra由来）（配列番号１３７）またはアルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２４－ＡＤＨ１（配列番号１４０）、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号６）、エステラーゼＳＣＨ２４－ＥＳＴ１（配列番号２４）およびアルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２４－ＡＤＨ２（Filobasidium magnum由来）（配列番号１４３）のいずれかとコードする遺伝子を、上記の一般的な方法の項に記載しているように、人工的な出芽酵母株ＹＳＴ０７５で発現させた。すべての遺伝子は、出芽酵母でのそれらの発現に合わせてコドン最適化されていた（ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、配列番号１３５；ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、配列番号４；ＳＣＨ２３－ＥＳＴ、配列番号２２；ＳＣＨ２３－ＡＤＨ２、配列番号１３８；ＳＣＨ２４－ＡＤＨ１、配列番号１４１；ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、配列番号８；ＳＣＨ２４－ＥＳＴ、配列番号２６；ＳＣＨ２４－ＡＤＨ２、配列番号１４４；ｃａｒＧ、配列番号１８３；ＳｍＣＰＳ２、配列番号１８６；およびＴａｌＶｅＴＰＰ、配列番号１９５）。
コパロール生合成のプラスミド系も保有するＹＳＴ１２０（ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２３－ＥＳＴおよびＳＣＨ２３－ＡＤＨ２を含む）およびＹＳＴ１２１（ＳＣＨ２４－ＡＤＨ１ａ、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、ＳＣＨ２４－ＥＳＴおよびＳＣＨ２４－ＡＤＨ２を含む）を入手し、上記の一般的な方法の項に記載した条件下で培養した。
この条件下では、すべての培養物でコパロールが同定された。ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１またはＳＣＨ２４－ＡＤＨ１を含む株のみがコパロールをコパラールに変換することができた（図１４Ａ）。さらに、アルコールデヒドロゲナーゼを発現させた培養物では、ファルネサールが検出された（図１４Ｂ）。すべての培養物において、ネロリドールとファルネソールとの蓄積が同定された（図１４Ａ）。
さらに、コパロール生合成遺伝子を持つプラスミドを保有するＹＳＴ１２０株およびＹＳＴ１２１株を含む培養物では、マノオールオキシが同定された（図１４Ｃ）。γ－アンブリルアセテートもγ－アンブロールも同定されなかった。しかしながら、マノオールオキシの存在は、ＢＶＭＯ、ＥＳＴおよびＡＤＨが人工酵母細胞で機能的に発現していることを示唆している。本発明者らは、ＢＶＭＯがγ－アンブリルアセテートへの変換を触媒するには、マノオールオキシの得られる量が制限されていたのではないかと推測している。
実施例１０：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）およびHyphozyma roseonigraまたはCryptococcus albidus由来のエステラーゼ（ＥＳＴ）を用いた出芽酵母細胞におけるインビボでのマノオールオキシ産生
マノオールオキシの産生のために、ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ（Blakesleatrispora由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＪＱ２８９９９５．１）、コパリル－ピロリン酸合成酵素ＳｍＣＰＳ２（Salvia miltiorrhiza由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１）、コパリル－ピロリン酸ホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ（Talaromycesverruculosus由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＬ８９３３４．１）、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ１と、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびエステラーゼＳＣＨ２３－ＥＳＴ（Hyphozyma roseonigra由来）またはバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびエステラーゼＳＣＨ２４－ＥＳＴ（Cryptococcus albidus由来）のいずれかをコードする遺伝子を、一般的な方法の項に記載しているように、人工的な出芽酵母株ＹＳＴ０７５で発現させた。
得られた株を、ＹＳＴ１７７（ｃａｒＧ、ＳｍＣＰＳ２、ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２３－ＥＳＴを含む）およびＹＳＴ１７８（ｃａｒＧ、ＳｍＣＰＳ２、ＴａｌＶｅＴＰＰ、ＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１およびＳＣＨ２４－ＥＳＴを含む）と命名し、上記の一般的な方法の項に記載しているように培養した。培養物は上述のようにＧＣ－ＭＳで分析した。
抽出後の培養物では、コパロール、コパラール、ネロリドール、ファルネソールおよびファルネサールが同定された。アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ２またはＳＣＨ２４－ＡＤＨ２を含まない人工細胞は、中間体５ａ（または５ｂ）を蓄積し、マノオールオキシを生成できないことが予想された。興味深いことに、マノオールオキシは同定され（図１５）、分子５ａ（または５ｂ）は検出されなかった。これらの結果は、ＳＣＨ２３－ＡＤＨ２およびＳＣＨ２４－ＡＤＨ２が酵母細胞でのマノオールオキシの産生に寄与している可能性を示唆しているが、試験した条件下ではマノオールオキシの産生に必須ではない。本発明者らは、酵母の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性がこの変換に関与していると推測している。
実施例１１：炭素－炭素結合の開裂活性を有するRhodococcuserytheropolis由来の酵素ＳＣＨ９４－３９４４の特性評価
この実験では、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４（既述）を用いて、コパロールを産生するバックグラウンド株を作製するＤＰ１２０５大腸菌細胞を形質転換した。この形質転換株は、チューブアッセイにおいて、培養培地中に最大５００ｍｇ／Ｌの濃度のコパロールを主要産物として産生した（図１６）。
次いで、この株を、R. erytheropolis由来の１つ以上の大腸菌コドン最適化ｃＤＮＡを持つ第２のプラスミドでさらに形質転換した。２つのｃＤＮＡを選択した：
－ 推定アルコールデヒドロゲナーゼをコードするＳＣＨ９４－３９４５（配列番号１６１）、
－ ２つのタンパク質ファミリードメイン：「ＧＸＷＸＧ」タンパク質ドメイン（ｐｆａｍ１４２３１、http://pfam.xfam.org/）および機能不明のドメイン「ＤＵＦ４３３４」（ｐｆａｍ１４２３２、http://pfam.xfam.org/）を含む１５７アミノ酸タンパク質をコードするＳＣＨ９４－３９４４（配列番号３４）。
発現ベクターは、ｐＪ４２３をバックグラウンドとして用いて、ＳＣＨ９４－３９４５をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（ｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４５）またはＳＣＨ９４－３９４４をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ（ｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４）またはＳＣＨ９４－３９４５およびＳＣＨ９４－３９４４をコードする最適化ｃＤＮＡから構成されるバイシストロニックなオペロン（ｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－３９４５）のいずれかを含むものを調製した。
ベクターｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４とベクターｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４とで細胞を形質転換した場合、ｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４のみで形質転換された細胞と比較して差が観察されず、ＳＣＨ９４－３９４４組換えタンパク質はコパロールを変換しないことがわかった。ベクターｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４とベクターｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４５とで細胞を形質転換した場合、シス－コパラールおよびトランス－コパラールの形成が観察され、ＳＣＨ９４－３９４５がコパロールをコパラールに酸化することができるアルコールデヒドロゲナーゼであることがわかった（図１６）。
ベクターｐＪ４０１－ＣＰＯＬ－４とベクターｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－３９４５とで細胞を形質転換した場合、チューブアッセイでは、培養物中に１ｇ／Ｌまでの濃度でマノオールオキシの形成が主要産物として観察された。このアッセイ条件下では、シスおよびトランス－コパラールの変換はほぼ完全に行われた（図１６）。
この実験は、ＳＣＨ９４－３９４４の酵素がコパラールのα－β炭素－炭素の二重結合を開裂し、以下のスキームに示すように、シス－コパラールおよびトランス－コパラールの１４，１５－ジノル－ラブダン化合物であるマノオールオキシへの直接変換を触媒できることを示している。
Figure 2022539510000071
実施例１２：Rhodococcus erythropolis由来のエナール開裂ポリペプチドを用いたシスおよびトランス－ファルネサールのインビボ変換
この実験では、プラスミドｐＪ４０１－ＦＡＬ－１（既述）を用いてＤＰ１２０５大腸菌細胞を形質転換し、チューブアッセイ条件で培養物中に最大５００ｍｇ／Ｌの濃度で主要産物としてシス－ファルネサールおよびトランス－ファルネサールを産生するバックグラウンド株を生成した（図１７）。
次いで、この株を、R. erytheropolis由来のＳＣＨ９４－３９４４をコードするｃＤＮＡを持つプラスミドｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４でさらに形質転換した。この細胞が産生した化合物をＧＣ－ＭＳで分析したところ、ゲラニルアセトンの形成が示された（図１７）。したがって、この実験は、ＳＣＨ９４－３９４４酵素は、非環状化合物であるファルネサールのα－β炭素－炭素二重結合を開裂し、以下のスキームに示すように、シス－ファルネサールおよびトランス－ファルネサールのゲラニルアセトンへの直接変換を触媒できることを示している。
Figure 2022539510000072
適用した試験条件では、ファルネソールとの変換は観察されなかった。
実施例１３．Rhodococcus erythropolis由来のエナール開裂ポリペプチドを用いたシトラールのインビボ変換
プラスミドｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４で形質転換された大腸菌ＫＲＸ（Promega社）細胞を用いて化合物の生化学的変換を行い、そうすることでＳＣＨ９４－３９４４の組換えタンパク質を過剰発現させた。２：１の基質：Ｔｗｅｅｎ ８０エマルジョンを用いて、最終濃度が１２ｇ／Ｌになるように基質を細胞培養物に添加した。バイオコンバージョンは、実験の項に記載したように行った。ネガティブコントロールは、インサートのないｐＪ４２３発現プラスミドで形質転換された細胞を用いて行った。いくつかの基質を試験した：シトラール（ゲラニアールとネラールとから構成される混合物）、シトロネラール（２，３－ジヒドロシトラール）および（Ｅ）－２－ドデカナール。細胞を様々な化合物の存在下で２４時間インキュベートし、実験の項で述べたように、変換の産物を分析した。
ＳＣＨ９４－３９４４組換えタンパク質の存在下で、ゲラニアールとネラールとは共にメチルヘプテノンに変換され（図１８）、この酵素は、以下のスキームに示すように、非環状モノテルペンアルデヒドのα－β炭素－炭素の二重結合を開裂できることを示している。
Figure 2022539510000073
式
Figure 2022539510000074
 のシトロネラールでは、ＳＣＨ９４－３９４４組換えタンパク質の存在下では変換が得られず（図１８）、触媒作用にはα，β－炭素結合の不飽和が必要であることがわかった。
（Ｅ）－２－ドデカナール
Figure 2022539510000075
 を用いた場合、デカナールへの変換が観察された。しかしながら、シトラールと比較すると、変換収率は著しく低かった（図１８）。この観察結果は、３－メチル基の不在が、ＳＣＨ９４－３９４４タンパク質による酵素変換に不利な影響を与えることを示唆している。
実施例１４：他の生物由来のＧＸＷＸＧおよびＤＵＦ４３３４ドメイン含有タンパク質を用いたコパラールおよびファルネサールのインビボ変換
ＳＣＨ９４－３９４４タンパク質配列は、ＧＸＷＸＧタンパク質ファミリードメインおよびＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリードメインを含む。類似のドメイン構造を有するタンパク質を他の生物で検索し、ＳＣＨ９４－３９４４に関連する酵素活性がこれらの相同酵素にも関連し得るどうかを試験した。
この実験では、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１（既述）を用いてＤＰ１２０５大腸菌細胞を形質転換し、前項で述べたようにコパラール（シスおよびトランス異性体）を産生するバックグラウンド株を生成した。この株では、ＦＰＰ合成酵素がゲノム組込み型オペロンから発現されている。テルペニルホスファターゼＡｓｐＷｅＴＰＰはＧＧＰＰに加えてＦＰＰも脱リン酸化することができ、ＡｚｅＴｏｌＡＤＨ１はファルネソールも酸化できることから、ｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１を用いてＤＰ１２０５細胞を形質転換した場合、コパラールに加えて大量のトランスファルネソールが検出された（図１９）。
次いで、この株を、ＧＸＷＸＧタンパク質ファミリードメインおよびＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリードメインを含むタンパク質をコードする遺伝子を持つ第２のプラスミドで共形質転換した。いくつかのタンパク質を選択した：
－ Rhodococcus rhodochrous（（登録商標）ＡＴＣＣ １２６７４（商標）由来のＳＣＨ８０－０５２４１（配列番号３８）、
－ Penicillium digitatum由来のＰｄｉｇｉｔ７０３３（配列番号４２）、
－ Penicillium italicum由来のＰｉｔａｌＤＵＦ３４４３－１（配列番号４６）、
－ Aspergillus wentii由来のＡｓｐＷｅＤＵＦ３４４３（配列番号４９）、
－ Rhodococcus hoagii株ＰＡＭ２２８８由来のＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２（配列番号５３）、
－ Rhodococcus hoagii株Ｎ１２８由来のＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３（配列番号５６）、
－ Rhodococcus hoagiiＮＢＲＣ １０１２５由来のＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４（配列番号５９）、
－ Cupriavidus necator由来のＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４（配列番号６２）、
－ Ralstonia insidiosa由来のＲｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４（配列番号６９）、
－ Cryptococcus gattii ＥＪＢ２由来のＣｇａｔＤＵＦ４３３４（配列番号７２）、
－ Grosmannia clavigera ｋｗ１４０７由来のＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４（配列番号７５）、
－ Thermomonospora curvata由来のＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４（配列番号８１）、
および
－ Pseudomonas protegens由来のＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４（配列番号８７）。
これらのタンパク質のそれぞれをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを設計し、ｐＪ４２３発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングした。ＤＰ１２０５大腸菌細胞を、これらのプラスミドのうちの１つと、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１とで共形質転換した。図２０および図２１は、ＧＸＷＸＧドメインおよびＤＵＦ４３３４ドメインを含む組換えタンパク質のそれぞれの存在下での、シス－コパラールおよびトランス－コパラールのマノオールオキシへの変換を示している。このアッセイ条件下では、コパラールの変換は、わずかな変換しか観察されなかったＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４酵素を除く各組換え酵素でほぼ完全に行われた。図２２および図２３は、シス－ファルネサールおよびトランス－ファルネサールのゲラニルアセトンへの変換を示している。ファルネサールの変換も、ファルネサールの約５０％しか変換されなかったＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４を除く各酵素で完全に行われた。
この実験は、Ｎ末端領域にＧＸＷＸＧタンパク質ファミリードメインを、Ｃ末端領域にＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリードメインを含むタンパク質が、以下のスキームに示すように、コパラールおよびファルネサールに対してエナール開裂活性を触媒できることを示している。
Figure 2022539510000076
実施例１５：単一のアミノ酸修飾を有するＳＣＨ９４－３９４４のバリアント
エナール開裂活性を有するＧＸＷＸＧおよびＤＵＦ４３３４ドメイン含有タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントは、アミノ酸配列に沿ったかつ前述の２つのタンパク質ドメイン内に保存されたアミノ酸を示した（図２４）。タンパク質ファミリーの保存された残基は、多くの場合、酵素活性に重要である。
ＧＸＷＸＧドメインおよびＤＵＦ４３３４ドメインを含む酵素の保存残基の酵素活性への関与を評価するために、保存残基を個別にアラニン残基で置換したＳＣＨ９４－３９４４タンパク質の人工的な変異体を設計した。以下の残基を変異させた：Ｗ４４、Ｔ５１、Ｈ５３、Ｌ５９、Ｗ６４、Ｋ６７、Ｓ７１、Ｒ１０６、Ｙ１１５、Ｄ１１６、Ｄ１２２、Ｍ１３６、Ｋ１３９、Ｆ１５２、Ｌ１５４、およびＲ１５６。修飾されたタンパク質は、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｗ４４Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｔ５１Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｈ５３Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｌ５９Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｗ６４Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｋ６７Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｓ７１Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｒ１０６Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｙ１１５Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｄ１１６Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｄ１２２Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｍ１３６Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｋ１３９Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｆ１５２Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｌ１５４Ａ、およびＳＣＨ９４－３９４４－Ｒ１５６Ａと称した。
これらのタンパク質のそれぞれをコードするコドン最適化ｃＤＮＡを設計し、ｐＪ４２３発現プラスミド（ATUM社、カリフォルニア州ニューアーク）にクローニングした。これらのプラスミドのうちの１つと、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１とを用いてＤＰ１２０５大腸菌細胞を共形質転換した。ＳＣＨ９４－３９４４－Ｗ４４Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｋ６７Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｄ１２２Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｆ１５２ＡまたはＳＣＨ９４－３９４４－Ｌ１５４Ａの組換えタンパク質の存在下では、コパラールおよびファルネサールの変換は観察されなかった。ＳＣＨ９４－３９４４－Ｔ５１Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｈ５３Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｌ５９Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｗ６４Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｓ７１、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｒ１０６Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｙ１１５Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｄ１１６Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｍ１３６Ａ、ＳＣＨ９４－３９４４－Ｋ１３９ＡおよびＳＣＨ９４－３９４４－Ｒ１５６Ａの酵素では、コパラールおよびファルネサールの変換が観察されたが、野生型ＳＣＨ９４－３９４４タンパク質よりも低い効率であった。図２５は、野生型ＳＣＨ９４－３９４４に対するそれぞれの単一アミノ酸バリアント酵素の活性を示している。
実施例１６：大腸菌細胞におけるエナール開裂活性とＢＶＭＯ活性との組み合わせによるγ－アンブリルアセテートのインビボ産生
この実験では、プラスミドｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１（既述）を用いてＤＰ１２０５大腸菌細胞を形質転換し、上述のようにコパール（シスおよびトランス－異性体）を産生するバックグラウンド株を生成した。
次いで、この株を、エナール開裂活性を有する酵素もしくはＢＶＭＯ活性を有する酵素のいずれかをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を持つ第２のプラスミド、またはエナール開裂ポリペプチドをコードするコドン最適化ｃＤＮＡと、ＢＶＭＯをコードするコドン最適化ｃＤＮＡとから構成されるオペロンを持つ第２のベクターで共形質転換した：
－ ＡｓｐＷｅＢＶＭＯ（配列番号１７）をコードする最適化されたＤＮＡ配列を含むｐＪ４２３－ＡｓｐＷｅＢＶＭＯ；
－ ＳＣＨ９４－３９４４（配列番号３５）をコードする最適化されたＤＮＡ配列を含むｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４；
－ ＳＣＨ９４－３９４４およびＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号３５および３）をコードする最適化されたＤＮＡ配列を含むｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ；
－ ＳＣＨ９４－３９４４およびＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（配列番号３５および７）をコードする最適化されたＤＮＡ配列を含むｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ；
－ ＳＣＨ９４－３９４４およびＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１（配列番号３５および１４）をコードする最適化されたＤＮＡ配列を含むｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－ＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ。
形質転換した細胞を培養し、テルペン誘導体の形成を上述のようにＧＣ－ＭＳで分析した。
ベクターｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１と、空のｐＪ４２３ベクターまたはｐＪ４２３－ＡｓｐＷｅＢＶＭＯとで細胞を形質転換した場合、シス－コパラールおよびトランス－コパラールのみの形成が観察された。（図２６）。
ベクターｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１とｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４とで細胞を形質転換した場合、コパラールの完全変換を伴うマノオールオキシの形成が観察された（図２６）。ベクターｐＪ４０１－ＣＰＡＬ－１と、エナール開裂ポリペプチドおよびＢＶＭＯを共発現させるベクターｐＪ４２３とで細胞を形質転換した場合、マノオールオキシに加えてγ－アンブリルアセテートの形成が観察された。ＢＶＭＯ酵素に応じて、マノオールオキシとγ－アンブリルアセテートとの比率が異なることが観察された。
この実験は、以下の経路を宿主細胞に導入することで、γ－アンブリルアセテートを産生できることを示している。
Figure 2022539510000077
実施例１７：Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＡＤＨ１および異なるエナール開裂ポリペプチドを用いた出芽酵母細胞におけるインビボでのマノオールオキシ産生
マノオールオキシの産生のために、ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ（Blakeslea trispora由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＪＱ２８９９９５．１）、コパリル－ピロリン酸合成酵素ＳｍＣＰＳ２（Salvia miltiorrhiza由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１）、コパリル－ピロリン酸ホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ（Talaromyces verruculosus由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＬ８９３３４．１）、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ１（Hyphozyma roseonigra由来）、および試験済みエナール開裂ポリペプチドのうちの１つをコードする遺伝子を、一般的な方法の項に記載されているように、人工的な出芽酵母株ＹＳＴ０７５で発現させた。
５つのエナール開裂ポリペプチドを評価した：
－ ＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４（Aspergillus wentii由来；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＯＪＪ３４５９１．１）（配列番号４９）。
－ ＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４（Cupriavidus necator由来；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０４９８００７０８．１）（配列番号６２）。
－ Ｐｄｉｇｉｔ７０３３（Penicillium digitatum由来）（配列番号４２）。
－ ＳＣＨ９４－３９４４（Rhodococcuserytheropolis由来）（配列番号３４）。
－ ＳＣＨ８０－０５２４１（Rhodococcus rhodochrous由来）。
すべての遺伝子は、出芽酵母でのそれらの発現に合わせてコドン最適化されていた（ＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４、配列番号５１；ＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４、配列番号６４；Ｐｄｉｇｉｔ７０３３、配列番号４４；ＳＣＨ９４－０３９４４、配列番号３６；およびＳＣＨ８０－０５２４１、配列番号４０）。
構築した株を、ＹＳＴ１８４（ＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４を含む）、ＹＳＴ１８５（ＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４を含む）、ＹＳＴ１８６（Ｐｄｉｇｉｔ７０３３を含む）、ＹＳＴ１８７（ＳＣＨ９４－０３９４４を含む）およびＹＳＴ１８８（ＳＣＨ８０－０５２４１を含む）と命名した。これらの株を、上記の一般的な方法の項に記載されているように培養した。マノオールオキシおよび他の化合物の産生量は、ＧＣ－ＭＳ分析を用いて同定した。
試験された条件下で、コパラール、ネロリドール、ファルネサール、ゲラニルアセトンおよびマノオールオキシが、エナール開裂ポリペプチドが発現されたすべての培養物において同定された（図２７）。予想どおり、すべての試験済みエナール開裂ポリペプチドは、ファルネサールまたはコパラールを基質として用いて、それぞれゲラニルアセトンとマノオールオキシとを産生することができた。ＹＳＴ１８４、ＹＳＴ１８５、ＹＳＴ１８６、ＹＳＴ１８７およびＹＳＴ１８８の培養物では、マノオールオキシは、同定されたテルペン類の総量のうち、それぞれ３７％、１％、５４％、２２％および５２％を占めていた（図２８Ａ）。
興味深いことに、アルコールデヒドロゲナーゼおよび異なるエナール開裂ポリペプチドを含む株の培養物では、同定されたテルペン類の総量がコントロール培養物に比べて２～４倍高かった（図２８Ｂ）。
実施例１８：Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、Aspergillus wentii由来のＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４、および異なるバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）を用いた、出芽酵母細胞におけるインビボでのγ－アンブリルアセテートの産生
γ－アンブリルアセテートの産生のために、ＧＧＰＰ合成酵素ｃａｒＧ（Blakesleatrispora由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＪＱ２８９９９５．１）、コパリル－ピロリン酸合成酵素ＳｍＣＰＳ２（Salvia miltiorrhiza由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢＶ５７８３５．１）、コパリル－ピロリン酸ホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ（Talaromycesverruculosus由来、ＮＣＢＩアクセッション番号ＫＵＬ８９３３４．１）、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ１（Hyphozyma roseonigra由来）、エナール開裂ポリペプチドＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４（Aspergillus wentii由来、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＯＪＪ３４５９１．１）、および試験済みバイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）のうちの１つ、をコードする遺伝子を、一般的な方法に記載されているように、人工的な出芽酵母株ＹＳＴ０７５で発現させた。
３つのＢＶＭＯを評価した：
－ ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（Hyphozyma roseonigra由来）（配列番号２）。
－ ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（Filobasidum magnum由来）（配列番号６）。
－ ＡｓｐＷｅＢＶＭＯ（Aspergillus wentii由来；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＯＪＪ３４５８７．１）（配列番号１６）。
すべての遺伝子は、出芽酵母でのそれらの発現に合わせてコドン最適化されていた（ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１、配列番号４；ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１、配列番号８；およびＡｓｐＷｅＢＶＭＯ、配列番号１８）。
得られた株を、ＹＳＴ１９０（ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１を含む）、ＹＳＴ１９１（ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１を含む）およびＹＳＴ１９２（ＡｓｐＷｅＢＶＭＯを含む）と命名した。これらの株を、上記の一般的な方法の項に記載されているように培養し、マノオールオキシおよび他の化合物の産生量をＧＣ－ＭＳ分析で同定した。
試験した条件下で、すべての培養物において、コパロール、ネロリドール、ファルネソール、ゲラニルアセトン、マノオールオキシおよびγ－アンブリルアセテートが同定された（図２９）。興味深いことに、先ほどまでの実験とは異なり、コパロールのコパラールへの変換は完全ではなかった。さらに、ＢＶＭＯを保有していない株と比較すると、産生されたテルペン類の総量が少なかった（図３０Ａ）。ＹＳＴ１９０、ＹＳＴ１９１およびＹＳＴ１９２の培養物では、同定されたテルペン類の総量のうち、γ－アンブリルアセテートがそれぞれ３７％、２７％および２０％を占めていた（図３０Ｂ）。
実施例１９：ラブダンジオール生合成経路および炭素－炭素結合エナール開裂ポリペプチドを用いたスクラレオールオキシドのインビボ産生
この実験では、プラスミドｐＪ４０１－ＬＯＨ－２（既述）を用いてＤＰ１２０５大腸菌細胞を形質転換し、上述のようにラブダンジオール（（１３Ｅ）－１３－ラブダン－８，１５－ジオール）を産生するバックグラウンド株を生成した。
次いで、この株を、アルコールデヒドロゲナーゼおよびエナール開裂ポリペプチド活性を有する酵素をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を持つ第２のプラスミドで共形質転換した：
－ アルコールデヒドロゲナーゼＡｚｅｔｏｌＡＤＨ１をコードする最適化されたＤＮＡ配列を含むｐＪ４２３－ＡｚｅｔｏｌＡＤＨ１；および
－ アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ９４－３９４４およびエナール開裂ポリペプチドＳＣＨ９４－３９４５をコードする最適化されたＤＮＡ配列を含むｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－３９４５。
形質転換した細胞を培養し、テルペン誘導体の形成を上述のようにＧＣ－ＭＳで分析した。
ｐＪ４０１－ＬＯＨ－２ベクターと、空のｐＪ４２３ベクターとで細胞を形質転換した場合、ラブダンジオールの形成が観察された（図３１）。
ｐＪ４０１－ＬＯＨ－２ベクターと、アルコールデヒドロゲナーゼを共発現するｐＪ４２３－ＡｚｅｔｏｌＡＤＨ１とで細胞を形質転換した場合、２つの新たな産物の形成が確認された（図３１）。ＮＭＲ分析の結果、この２つの化合物は、以下のスキームに示すように、（＋）－８，１３－エポキシ－ラブダン－１５－アールの２つの異性体（化合物７ａおよび７ｂ）であることがわかった。この２つの化合物は、ラブダンジオールの酸化によって生成された８－ヒドロキシ－ラブダ－１３－エン－１５－アール（６）が不安定になることで生じる。化合物６から化合物７ａおよび７ｂへの脱水および転位の推定メカニズムを以下のスキームに示す。
ｐＪ４０１－ＬＯＨ－２ベクターとｐＪ４２３－ＳＣＨ９４－３９４４－３９４５とで細胞を形質転換し、アルコールデヒドロゲナーゼとエナール開裂ポリペプチドとを共発現させた場合、化合物７ａおよび７ｂに加えて、スクラレオールオキシドの形成が観察された。エナール開裂ポリペプチドの存在下でのスクラレオールオキシドの生成は、以下のスキームに示す変換ステップによって説明することができる。ＳＣＨ９４－３９４４のエナール開裂ポリペプチドは、化合物６のＣ－Ｃ二重結合の開裂を触媒して、８－ヒドロキシ－１４，１５－ビスノルラブダン－１３－オン（８）をもたらす。化合物８は不安定であり、穏やかな条件下でスクラレオールオキシドに変換される（Barrero et al., Tetrahedron 49, (45) 1993, 10405-10412; Hua et al., Tetrahedron 67 (6) 2011, 1142-1144）。化合物７ａおよび７ｂに比べてスクラレオールオキシドの最終量が相対的に少ないのは、ＳＣＨ９４－３９４４の酵素活性と化合物６の化学的脱水反応との競合によるものである。
Figure 2022539510000078
実施例２０．Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＡＤＨ１、Aspergillus wentii由来のＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４、Hyphozyma roseonigra由来のＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１および異なるエステラーゼを用いた出芽酵母細胞におけるインビボでのγ－アンブロールの産生
γアンブロールの産生のために、２つの機能を持つ酵素ＰｖＣＰＳ（Talaromycesverruculosus由来）、コパリル－ピロリン酸ホスファターゼＴａｌＶｅＴＰＰ（Talaromycesveruculosum由来）、アルコールデヒドロゲナーゼＳＣＨ２３－ＡＤＨ１（Hyphozyma roseonigra由来）、エナール開裂ＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４（Aspergillus wentii由来）、ＢＶＭＯ ＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１（Hyphozyma roseonigra由来）、および試験済みエステラーゼ（ＥＳＴ）のうちの１つ、をコードする遺伝子を、一般的な方法に記載されているように、人工的な出芽酵母株ＹＳＴ０７５で発現させた。
２つのエステラーゼを評価した：
－ ＳＣＨ２３－ＥＳＴ１（Hyphozyma roseonigra由来）。
－ ＳＣＨ２４－ＥＳＴ１（Cryptococcus albidus由来）。
すべての遺伝子は、出芽酵母でのそれらの発現に合わせてコドン最適化されていた（ＳＣＨ２３－ＥＳＴ、配列番号２２；ＳＣＨ２４－ＥＳＴ、配列番号２６）。
得られた株を、ＹＳＴ２５７（ＳＣＨ２３－ＥＳＴを含む）およびＹＳＴ２５８（ＳＣＨ２４－ＥＳＴを含む）と命名した。これらの株を、一般的な方法に記載されているように培養した。試験条件下では、ＧＣ－ＭＳ／ＦＩＤ分析を用いて、すべての培養物において、ネロリドール、コパロール、コパラール、マノオールオキシ、γ－アンブリルアセテートおよびγ－アンブロールが同定された（図３３）。ＹＳＴ２５７およびＹＳＴ２５８の培養物では、同定されたテルペン類の合計のうち、γ－アンブロールがそれぞれ１６％および２９％を占めていた。
実施例２１：大腸菌細胞における、エナール開裂活性、ＢＶＭＯ活性およびエステラーゼ活性の組み合わせによるγ－アンブロールのインビボ産生
Ｔ５プロモーターの制御下にある２つのオペロンをそれぞれ含む第１のベクターを設計した。第１のオペロンには、以下のものをコードする２つのｃＤＮＡが含まれる：
－ Aspergillus wentii由来のＡｓｐＷｅＴＰＰホスファターゼ（配列番号１７０）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＯＪＪ３４５８５．１）；および
－ Talaromycesverruculosus由来のコパリル二リン酸合成酵素であるＰｖＣＰＳ（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢＦ８８１２８．１）。ＰｖＣＰＳは、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからコパリルＰＰの産生を触媒する。
ＡｓｐＷｅＴＰＰおよびＰｖＣＰＳをコードするｃＤＮＡをコドン最適化し（配列番号１７１および１７４）、２つのｃＤＮＡと、ｃＤＮＡのそれぞれの上流に置かれたＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ）（配列番号１９６）とを含むオペロンを設計した。
第２のオペロンには、以下をコードする２つのｃＤＮＡが含まれる：
－ ＳＣＨ９４－３９４４、Rhodococcus由来のエナール開裂ポリペプチド（配列番号３４）。
－ ＳＣＨ９４－３９４５、Rhodococcus由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（配列番号１６１）。
ＳＣＨ９４－３９４５およびＳＣＨ９４－３９４４をコードするｃＤＮＡをコドン最適化し（配列番号１６２および３５）、２つのｃＤＮＡと、ｃＤＮＡのそれぞれの上流に置かれたＲＢＳ配列（ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ）（配列番号１９６）とを含むオペロンを設計した。
この２つのオペロンを１つのベクターにまとめ、ＦＰＰからマノオールオキシまでの生合成経路の全遺伝子を発現させるｐＪ４０１－Ｍｎｏｘｙを得た。
細菌細胞（ＤＰ１２０５）を、プラスミドｐＪ４０１－Ｍａｎｏｘｙと第２のプラスミドとで共形質転換した：
－ ＢＶＭＯであるＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ（配列番号７）をコードする遺伝子を単独で持つｐＪ４２３－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ、
－ ＢＶＭＯであるＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１（配列番号７）をコードするｃＤＮＡと、エステラーゼであるＳＣＨ２４－ＥＳＴ（配列番号２５）をコードするｃＤＮＡから構成されるオペロンを含むｐＪ４２３－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ－ＳＣＨ２４－ＥＳＴ、
－ またはコントロールプラスミドｐＪ４２３。
形質転換した細胞を培養し、実験の項で述べた条件下で上述のようにテルペン類の産生量を分析した。
ベクターｐＪ４０１－Ｍｎｏｘｙと、空のｐＪ４２３ベクターとで細胞を形質転換した場合、マノオールオキシのみの形成が観察された。（図３４－Ａ）。
ベクターｐＪ４０１－ＭｎｏｘｙとｐＪ４２３－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯとで細胞を形質転換した場合、γ－アンブリルアセテートの形成が観察された（図３４－Ｂ）。
ベクターｐＪ４０１－ＭｎｏｘｙとｐＪ４２３－ＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ－ＳＣＨ２４－ＥＳＴとで細胞を形質転換した場合、γ－アンブロールの形成が観察された（図３４－Ｂ）。
この実験は、以下の経路を宿主細胞に導入することで、γ－アンブロールを生成できることを示している。
Figure 2022539510000079
本明細書で相互参照されているすべての文書の内容は、参照により組み込まれる。
Figure 2022539510000080
Figure 2022539510000081
Figure 2022539510000082
Figure 2022539510000083
Figure 2022539510000084
Figure 2022539510000085
Figure 2022539510000086
配列番号１：Hyphozyma roseonigra_SCH23-BVMO1_wt
Figure 2022539510000087
配列番号２：Hyphozyma roseonigra_SCH23-BVMO1_wt
Figure 2022539510000088
配列番号３：Hyphozyma roseonigra_SCH23-BVMO1_大腸菌最適化
Figure 2022539510000089
配列番号４：Hyphozyma roseonigra_SCH23-BVMO1_酵母最適化
Figure 2022539510000090
配列番号５：Filobasidium magnum_SCH24-BVMO1_wt
Figure 2022539510000091
 配列番号６：Filobasidium magnum_SCH24-BVMO1_wt
Figure 2022539510000092
配列番号７：Filobasidium magnum_SCH24-BVMO1_大腸菌最適化
Figure 2022539510000093
配列番号８：Filobasidium magnum_SCH24-BVMO1_酵母最適化
Figure 2022539510000094
配列番号９：Papiliotrema laurentii_SCH25-BVMO1_wt
Figure 2022539510000095
配列番号１０：Papiliotrema laurentii_SCH25-BVMO1_wt
Figure 2022539510000096
配列番号１１：Papiliotrema laurentii_SCH25-BVMO1_大腸菌最適化
Figure 2022539510000097
配列番号１２：Bensingtonia ciliata_SCH46-BVMO1_wt
Figure 2022539510000098
配列番号１３：Bensingtonia ciliata (ATCC 20919)_SCH46-BVMO1_wt
Figure 2022539510000099
配列番号１４：Bensingtonia ciliata_SCH46-BVMO1_大腸菌最適化
Figure 2022539510000100
配列番号１５：Aspergillus wentii_AspWeBVMO_wt
Figure 2022539510000101
配列番号１６：Aspergillus wentii_AspWeBVMO_wt (OJJ34587.1)
Figure 2022539510000102
配列番号１７：Aspergillus wentii_AspWeBVMO_大腸菌最適化
Figure 2022539510000103
配列番号１８：Aspergillus wentii_AspWeBVMO_酵母最適化
Figure 2022539510000104
配列番号１９：Hyphozyma roseonigra_SCH23-EST_wt
Figure 2022539510000105
配列番号２０：Hyphozyma roseonigra_SCH23- EST_wt
Figure 2022539510000106
配列番号２１：Hyphozyma roseonigra_SCH23- EST_大腸菌最適化
Figure 2022539510000107
配列番号２２：Hyphozyma roseonigra_SCH23- EST_酵母最適化
Figure 2022539510000108
配列番号２３：Filobasidium magnum_SCH24- EST_wt
Figure 2022539510000109
配列番号２４：Filobasidium magnum_SCH24- EST_wt
Figure 2022539510000110
配列番号２５：Filobasidium magnum_SCH24- EST_大腸菌最適化
Figure 2022539510000111
配列番号２６：Filobasidium magnum_SCH24- EST_酵母最適化
Figure 2022539510000112
配列番号２７：Papiliotrema laurentii_SCH25- EST_wt
Figure 2022539510000113
配列番号２８：Papiliotrema laurentii_SCH25- EST_wt
Figure 2022539510000114
配列番号２９：Papiliotrema laurentii_SCH25- EST_大腸菌最適化
Figure 2022539510000115
配列番号３０：Bensingtonia ciliata_SCH46- EST_wt
Figure 2022539510000116
配列番号３１：Bensingtonia ciliata_SCH46- EST_wt
Figure 2022539510000117
配列番号３２：Bensingtonia ciliata_SCH46- EST_大腸菌最適化
Figure 2022539510000118
配列番号３３：Rhodococcus erythropolis_SCH94-3944_wt
Figure 2022539510000119
配列番号３４：Rhodococcus erythropolis_SCH94-3944_wt (WP_042451379)
Figure 2022539510000120
配列番号３５：Rhodococcus erythropolis_SCH94-3944_大腸菌最適化
Figure 2022539510000121
配列番号３６：Rhodococcus erythropolis_SCH94-3944_酵母最適化
Figure 2022539510000122
配列番号３７：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-05241_wt
Figure 2022539510000123
配列番号３８：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-05241_wt
Figure 2022539510000124
配列番号３９：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-05241_大腸菌最適化
Figure 2022539510000125
配列番号４０：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-05241_酵母最適化
Figure 2022539510000126
配列番号４１：Penicillium digitatum_Pdigit7033_wt
Figure 2022539510000127
配列番号４２：Penicillium digitatum_Pdigit7033_wt
Figure 2022539510000128
配列番号４３：Penicillium digitatum_Pdigit7033_大腸菌最適化
Figure 2022539510000129
配列番号４４：Penicillium digitatum_Pdigit7033_酵母最適化
Figure 2022539510000130
配列番号４５：Penicillium italicum_PitalDUF4334-1_wt (JQGA01001114.1 71518-72084 (+))
Figure 2022539510000131
配列番号４６：Penicillium italicum_PitalDUF4334-1_wt (KGO69886.1)
Figure 2022539510000132
配列番号４７：Penicillium italicum_PitalDUF4334-1_大腸菌最適化
Figure 2022539510000133
配列番号４８：Aspergillus wentii_AspWe DUF4334_wt (LJSE01000065.1 (263404 to 263924))
Figure 2022539510000134
配列番号４９：Aspergillus wentii_AspWe DUF4334_wt (OJJ43591)
Figure 2022539510000135
配列番号５０：Aspergillus wentii_AspWe DUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000136
配列番号５１：Aspergillus wentii_AspWe DUF4334_酵母最適化
Figure 2022539510000137
配列番号５２：Rhodococcus hoagii strain PAM2288_RhoagDUF4334-2_wt (NZ_LWTW01000167.1 18658-19134 (-))
Figure 2022539510000138
配列番号５３：Rhodococcus hoagii strain PAM2288_RhoagDUF4334-2_wt (WP_005516054)
Figure 2022539510000139
配列番号５４：Rhodococcus hoagii strain PAM2288_RhoagDUF4334-2_大腸菌最適化
Figure 2022539510000140
配列番号５５：Rhodococcus hoagii strain N128_RhoagDUF4334-3_wt (NZ_LRQY01000021.1 163210-163686 (-))
Figure 2022539510000141
配列番号５６：Rhodococcus hoagii strain N128_RhoagDUF4334-3_wt (WP_013414658)
Figure 2022539510000142
配列番号５７：Rhodococcus hoagii strain N128_RhoagDUF4334-3_大腸菌最適化
Figure 2022539510000143
配列番号５８：Rhodococcus hoagii_RhoagDUF4334-4_wt (NZ_BCRL01000037.1 133790-134266 (+))
Figure 2022539510000144
配列番号５９：Rhodococcus hoagii_RhoagDUF4334-4_wt (WP_022593671)
Figure 2022539510000145
配列番号６０：Rhodococcus hoagii_RhoagDUF4334-4_大腸菌最適化
Figure 2022539510000146
配列番号６１：Cupriavidus necator_CnecaDUF4334_wt (CP002879.1: 512553-513138)
Figure 2022539510000147
配列番号６２：Cupriavidus necator_CnecaDUF4334_wt (WP_049800708)
Figure 2022539510000148
配列番号６３：Cupriavidus necator_CnecaDUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000149
配列番号６４：Cupriavidus necator_CnecaDUF4334_酵母最適化
Figure 2022539510000150
配列番号６５：Penicillium italicum_PitalDUF4334-2_wt (JQGA01000120.1 65652-66635 (+))
Figure 2022539510000151
配列番号６６：Penicillium italicum_PitalDUF4334-2_wt (KGO77618.1)
Figure 2022539510000152
配列番号６７：Penicillium italicum_PitalDUF4334-2_大腸菌最適化
Figure 2022539510000153
配列番号６８：Ralstonia insidiosa_Rins-DUF4334_wt (NZ_PKPC01000002.1 18273-18773 (-))
Figure 2022539510000154
配列番号６９：Ralstonia insidiosa_Rins-DUF4334_wt (WP_104654734)
Figure 2022539510000155
配列番号７０：Ralstonia insidiosa_Rins-DUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000156
配列番号７１：Cryptococcus gattii EJB2_CgatDUF4334_wt (KN848661.1 262486-263032 (-))
Figure 2022539510000157
配列番号７２：Cryptococcus gattii EJB2_CgatDUF4334_wt (KIR80015)
Figure 2022539510000158
配列番号７３：Cryptococcus gattii EJB2_CgatDUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000159
配列番号７４：Grosmannia clavigera kw1407_GclavDUF4334_wt (XM_014316402.1)
Figure 2022539510000160
配列番号７５：Grosmannia clavigera kw1407_GclavDUF4334_wt (XP_014171877.1)
Figure 2022539510000161
配列番号７６：Grosmannia clavigera kw1407_GclavDUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000162
配列番号７７：Oidiodendronmaius Zn_OmaiusDUF4334_wt (KN832882.1 673187-675938 (-))
Figure 2022539510000163
配列番号７８：Oidiodendronmaius Zn_OmaiusDUF4334_wt (KIM97275)
Figure 2022539510000164
配列番号７９：Oidiodendronmaius Zn_OmaiusDUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000165
配列番号８０：Thermomonospora curvata_TcurvaDUF4334_wt (NC_013510.1)
Figure 2022539510000166
配列番号８１：Thermomonospora curvata_TcurvaDUF4334_wt (WP_012851400.1)
Figure 2022539510000167
配列番号８２：Thermomonospora curvata_TcurvaDUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000168
配列番号８３：Pseudomonas litoralis_DlitoDUF4334_wt (NZ_LT629748.1 3096922-3097413 (+))
Figure 2022539510000169
配列番号８４：Pseudomonas litoralis_DlitoDUF4334_wt (WP_090274689)
Figure 2022539510000170
配列番号８５：Pseudomonas litoralis_DlitoDUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000171
配列番号８６：Pseudomonas protegens_PprotDUF4334_wt (NC_021237.1 5528027-5528524 (-))
Figure 2022539510000172
配列番号８７：Pseudomonas protegens_PprotDUF4334_wt (WP_015636872.1)
Figure 2022539510000173
配列番号８８：Pseudomonas protegens_PprotDUF4334_大腸菌最適化
Figure 2022539510000174
配列番号８９：人工_SCH91-3944-W44A_バリアント
Figure 2022539510000175
配列番号９０：人工_SCH91-3944-W44A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000176
配列番号９１：人工_SCH91-3944-T51A_バリアント
Figure 2022539510000177
配列番号９２：人工_SCH91-3944-T51A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000178
配列番号９３：人工_SCH91-3944-H53A_バリアント
Figure 2022539510000179
配列番号９４：人工_SCH91-3944-H53A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000180
配列番号９５：人工_SCH91-3944-L59A_バリアント
Figure 2022539510000181
配列番号９６：人工_SCH91-3944-L59A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000182
配列番号９７：人工_SCH91-3944-W64A_バリアント
Figure 2022539510000183
配列番号９８：人工_SCH91-3944-W64A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000184
配列番号９９：人工_SCH91-3944-K67A_バリアント
Figure 2022539510000185
配列番号１００：人工_SCH91-3944-K67A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000186
配列番号１０１：人工_SCH91-3944-S71A_バリアント
Figure 2022539510000187
配列番号１０２：人工_SCH91-3944-S71A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000188
配列番号１０３：人工_SCH91-3944-R106A_バリアント
Figure 2022539510000189
配列番号１０４：人工_SCH91-3944-R106A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000190
配列番号１０５：人工_SCH91-3944-Y115A_バリアント
Figure 2022539510000191
配列番号１０６：人工_SCH91-3944-Y115A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000192
配列番号１０７：人工_SCH91-3944-D116A_バリアント
Figure 2022539510000193
配列番号１０８：人工_SCH91-3944-D116A_ 大腸菌最適化
Figure 2022539510000194
配列番号１０９：人工_SCH91-3944-D122A_バリアント
Figure 2022539510000195
配列番号１１０：人工_SCH91-3944-D122A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000196
配列番号１１１：人工_SCH91-3944-M136A_バリアント
Figure 2022539510000197
配列番号１１２：人工_SCH91-3944-M136A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000198
配列番号１１３：人工_SCH91-3944-K139A_バリアント
Figure 2022539510000199
配列番号１１４：人工_SCH91-3944-K139A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000200
配列番号１１５：人工_SCH91-3944-F152A_バリアント
Figure 2022539510000201
配列番号１１６：人工_SCH91-3944-F152A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000202
配列番号１１７：人工_SCH91-3944-L154A_バリアント
Figure 2022539510000203
配列番号１１８：人工_SCH91-3944-L154A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000204
配列番号１１９：人工_SCH91-3944-R156A_バリアント
Figure 2022539510000205
配列番号１２０：人工_SCH91-3944-R156A_大腸菌最適化
Figure 2022539510000206
配列番号１２１：組込みカセット断片１
Figure 2022539510000207
配列番号１２２：組込みカセット断片２
Figure 2022539510000208
配列番号１２３：組込みカセット断片３
Figure 2022539510000209
配列番号１２４：ＬＥＵ２酵母マーカー＿プライマー１
Figure 2022539510000210
配列番号１２５：ＬＥＵ２酵母マーカー＿プライマー２
Figure 2022539510000211
配列番号１２６：ＡｍｐＲ大腸菌マーカー＿プライマー１
Figure 2022539510000212
配列番号１２７：ＡｍｐＲ大腸菌マーカー＿プライマー２
Figure 2022539510000213
配列番号１２８：酵母複製起点＿プライマー１
Figure 2022539510000214
配列番号１２９：酵母複製起点＿プライマー２
Figure 2022539510000215
配列番号１３０：大腸菌複製起点＿プライマー１
Figure 2022539510000216
配列番号１３１：大腸菌複製起点＿プライマー２
Figure 2022539510000217
配列番号１３２：出芽酵母共形質転換のためのＤＮＡ断片
Figure 2022539510000218
配列番号１３３：Hyphozyma roseonigra_SCH23-ADH1_wt
Figure 2022539510000219
配列番号１３４：Hyphozyma roseonigra_SCH23-ADH1_wt
Figure 2022539510000220
配列番号１３５：Hyphozyma roseonigra_SCH23-ADH1_酵母最適化
Figure 2022539510000221
配列番号１３６：Hyphozyma roseonigra_SCH23-ADH2_wt
Figure 2022539510000222
配列番号１３７：Hyphozyma roseonigra_SCH23-ADH2_wt
Figure 2022539510000223
配列番号１３８：Hyphozyma roseonigra_SCH23-ADH2_酵母最適化
Figure 2022539510000224
配列番号１３９：Filobasidium magnum_SCH24-ADH1_wt
Figure 2022539510000225
配列番号１４０：Filobasidium magnum_SCH24-ADH1_wt
Figure 2022539510000226
配列番号１４１：Filobasidium magnum_SCH24-ADH1_酵母最適化
Figure 2022539510000227
配列番号１４２：Filobasidium magnum_SCH24-ADH2_wt
Figure 2022539510000228
配列番号１４３：Filobasidium magnum_SCH24-ADH2_wt
Figure 2022539510000229
配列番号１４４：Filobasidium magnum_SCH24-ADH2_酵母最適化
Figure 2022539510000230
配列番号１４５：Rhodococcussp._RrhSecADH_wt (NZ_AZHI01000124.1 6627-7664 (+))
Figure 2022539510000231
配列番号１４６：Rhodococcussp._RrhSecADH_wt (WP_043801412.1)
Figure 2022539510000232
配列番号１４７：Rhodococcussp._RrhSecADH_大腸菌最適化
Figure 2022539510000233
配列番号１４８：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-00043_wt
Figure 2022539510000234
配列番号１４９：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-00043_wt
Figure 2022539510000235
配列番号１５０：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-00043_大腸菌最適化
Figure 2022539510000236
配列番号１５１：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-04254_wt
Figure 2022539510000237
配列番号１５２：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-04254_wt
Figure 2022539510000238
配列番号１５３：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-04254_大腸菌最適化
Figure 2022539510000239
配列番号１５４：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-06135_wt
Figure 2022539510000240
配列番号１５５：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-06135_wt
Figure 2022539510000241
配列番号１５６：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-06135_大腸菌最適化
Figure 2022539510000242
配列番号１５７：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-06582_wt
Figure 2022539510000243
配列番号１５８：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-06582_wt
Figure 2022539510000244
配列番号１５９：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-06582_大腸菌最適化
Figure 2022539510000245
配列番号１６０：Rhodococcus erythropolis_SCH94-03945_wt
Figure 2022539510000246
配列番号１６１：Rhodococcus erythropolis_SCH94-03945_wt
Figure 2022539510000247
配列番号１６２：Rhodococcus erythropolis_SCH94-03945_大腸菌最適化
Figure 2022539510000248
配列番号１６３：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-05240_wt
Figure 2022539510000249
配列番号１６４：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-05240_wt
Figure 2022539510000250
配列番号１６５：Rhodococcus rhodochrous_SCH80-05240_大腸菌最適化
Figure 2022539510000251
配列番号１６６：Azoarcus toluclasticus_AzTolADH1_wt (NZ_KB899498.1: 215502-216629 (+))
Figure 2022539510000252
配列番号１６７：Azoarcus toluclasticus_AzTolADH1_wt (WP_018990713.1)
Figure 2022539510000253
配列番号１６８：Azoarcus toluclasticus_AzTolADH1_大腸菌最適化
Figure 2022539510000254
配列番号１６９：Aspergillus wentii_AspWeTPP_wt (KV878213.1:2482776-2483627)
Figure 2022539510000255
配列番号１７０：Aspergillus wentii_AspWeTPP_wt (OJJ34585.1)
Figure 2022539510000256
配列番号１７１：Aspergillus wentii_AspWeTPP_大腸菌最適化
Figure 2022539510000257
配列番号１７２：Talaromycesverruculosus_PvCPS (LC316181.1)
Figure 2022539510000258
配列番号１７３：Talaromycesverruculosus_PvCPS (BBF88128.1)
Figure 2022539510000259
配列番号１７４：Talaromycesverruculosus_PvCPS_大腸菌最適化
Figure 2022539510000260
配列番号１７５：Talaromycescellulolyticus_TalCeTPP_wt
Figure 2022539510000261
配列番号１７６：Talaromycescellulolyticus_TalCeTPP_wt (GAM42000.1)
Figure 2022539510000262
配列番号１７７：Talaromycescellulolyticus_TalCeTPP_大腸菌最適化
Figure 2022539510000263
配列番号１７８：Castellanielladefragrans_CdGeoA_wt (NZ_HG916765.1 3061533-3062654 (+))
Figure 2022539510000264
配列番号１７９：Castellanielladefragrans_CdGeoA_wt (WP_043683915.1)
Figure 2022539510000265
配列番号１８０：Castellanielladefragrans_CdGeoA_大腸菌最適化
Figure 2022539510000266
配列番号１８１：Blakesleatrispora_GGPP synthase carG_wt (JQ289995.1)
Figure 2022539510000267
配列番号１８２：Blakesleatrispora_GGPP synthase carG_wt (AFC92798.1)
Figure 2022539510000268
配列番号１８３：Blakesleatrispora_GGPP synthase carG_酵母最適化
Figure 2022539510000269
配列番号１８４：Salvia miltiorrhiza_SmCPS2_wt (EU003997.1 73-2454 (+))
Figure 2022539510000270
配列番号１８５：Salvia miltiorrhiza_SmCPS2_
Figure 2022539510000271
配列番号１８６：Salvia miltiorrhiza_SmCPS2_酵母最適化
Figure 2022539510000272
配列番号１８７：Salvia sclarea_SsLPS_wt (JN133923.1)
Figure 2022539510000273
配列番号１８８：Salvia sclarea_SsLPS_大腸菌最適化
Figure 2022539510000274
配列番号１８９：Salvia sclarea_SsLPS_大腸菌最適化
Figure 2022539510000275
配列番号１９０：Pantoeaagglomerans_CrtE_wt (M38424.1 40-963 (+))
Figure 2022539510000276
配列番号１９１：Pantoeaagglomerans_CrtE_wt (AAA24819.1)
Figure 2022539510000277
配列番号１９２：Pantoeaagglomerans_CrtE_ 酵母最適化
Figure 2022539510000278
配列番号１９３：Talaromycesverruculosus_TalVeTPP_wt (LHCL01000010.1 150095-151030 (+))
Figure 2022539510000279
配列番号１９４：Talaromycesverruculosus_TalVeTPP_wt (KUL89334.1)
Figure 2022539510000280
配列番号１９５：Talaromycesverruculosus_TalVeTPP_酵母最適化
Figure 2022539510000281
配列番号１９６：人工＿ＲＢＳ配列
ＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡ
配列番号１９７：人工＿ＢＶＭＯ配列モチーフ８
ＧＡＧｘＳＧＬ
Ｘ４は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＩであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号１９８：人工＿ＢＶＭＯ配列モチーフ１
ＥＫＮｘｘｘｘＧＴＷｘＥＮＲＹＰＧＣＡＣＤＶＰｘＨｘＹｘｘＳＦＥ
Ｘ４は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＨまたはＰであり得る。
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡ、Ｄ、またはＥであり得る。
Ｘ６は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＬまたはＶであり得る。
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＧまたはＳであり得る。
Ｘ１１は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＦ、Ｌ、またはＹであり得る。
Ｘ２４は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＳであり得る。
Ｘ２６は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡ、Ｃ、またはＮであり得る。
Ｘ２８は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＴであり得る。
Ｘ２９は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＷまたはＹであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号１９９：人工ＢＶＭＯ配列モチーフ２
ＬｘＮＡｘＧＩＬＮｘＷｘｘＰｘＩＰＧ
Ｘ２は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＩ、Ｌ、またはＶであり得る。
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＧ、Ｓ、またはＴであり得る。
Ｘ１０は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＱであり得る。
Ｘ１２は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＫまたはＲであり得る。
Ｘ１３は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＷまたはＹであり得る。
Ｘ１５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＧ、Ｐ、またはＳであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２００：人工ＢＶＭＯ配列モチーフ３
ＬｘｘＫｘＶｘｘＩＧｘＧＳＳＧＩＱＩｘＰｘＩ
Ｘ２は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＥ、Ｋ、またはＮであり得る。
Ｘ３は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＤまたはＧであり得る。
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＫ、Ｔ、またはＶであり得る。
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＧであり得る。
Ｘ８は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＬまたはＶであり得る。
Ｘ１１は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＮまたはＳであり得る。
Ｘ１９は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＬまたはＶであり得る。
Ｘ２１は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＮであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０１：人工ＢＶＭＯ配列モチーフ４
ＧＣＲＲｘＴＰＧｘｘＹＬＥｘＬ
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＬまたはＰであり得る。
Ｘ９は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＰまたはＴであり得る。
Ｘ１０は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＧ、Ｈ、またはＮであり得る。
Ｘ１４は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＳであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０２：人工ＢＶＭＯ配列モチーフ５
ＣＡＴＧＦＤｘｘｘｘＰＲＦｘｘｘＧ
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＴまたはＶであり得る。
Ｘ８は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＳまたはＴであり得る。
Ｘ９は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＦまたはＹであり得る。
Ｘ１０は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＫまたはＲであり得る。
Ｘ１４は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＫまたはＰであり得る。
Ｘ１５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＦまたはＬであり得る。
Ｘ１６は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＩまたはＶであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０３：人工ＢＶＭＯ配列モチーフ６
ＰＮｘＦｘｘｘＧＰＮｘＰｘｘＮＧｘＶ
Ｘ３は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＳまたはＹであり得る。
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＦ、Ｉ、またはＳであり得る。
Ｘ６は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＦ、Ｉ、またはＴであり得る。
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＬまたはＭであり得る。
Ｘ１１は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＣまたはＧであり得る。
Ｘ１３は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＩまたはＶであり得る。
Ｘ１４は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＧであり得る。
Ｘ１７は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＰまたはＳであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０４：人工ＢＶＭＯ配列モチーフ７
ＡｘＷＰＧＳｘＬＨＹｘＥＡｘｘｘＰＲｘＥＤ
Ｘ２は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＬまたはＶであり得る。
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡまたはＴであり得る。
Ｘ１１は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＬまたはＭであり得る。
Ｘ１４は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＩまたはＬであり得る。
Ｘ１５は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＡ、Ｋ、またはＱであり得る。
Ｘ１６は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＤ、Ｈ、またはＳであり得る。
Ｘ１９は、自然に存在する任意のアミノ酸、特にＷまたはＹであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０５：人工＿エナール開裂ポリペプチド配列モチーフ１
Ｇ－［Ｙまたは－］－ｘ－Ｗ－ｘ－Ｇ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＬまたはＩ］－ｘ－［Ｔ，ＳまたはＲ］－Ｇ－［ＨまたはＤ］
ＧｘｘＷｘＧｘｘｘｘｘＧｘ
Ｘ２は、Ｙであるか、または削除されていてよい。
Ｘ３は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ８は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ９は、Ｆ、Ｌ、またはＩであり得る。
Ｘ１０は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ１１は、Ｒ、Ｓ、またはＴであり得る。
Ｘ１３は、ＨまたはＤであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０６：人工＿エナール開裂ポリペプチド配列モチーフ２
Ｗ－［Ｙ，ＡまたはＶ］－Ｇ－Ｋ－ｘ－［ＦまたはＹ］－ｘ－［ＳまたはＤ］
ＷｘＧＫｘｘｘｘ
Ｘ２は、Ａ、Ｖ、またはＹであり得る。
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ６は、ＦまたはＹであり得る。
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ８は、ＤまたはＳであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０７：人工＿エナール開裂ポリペプチド配列モチーフ３
［ＧまたはＳ］－ｘ－［ＡまたはＧ］－ｘ－［ＬまたはＶ］－ｘ－ｘ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＹまたはＬ］－Ｒ－Ｇ－ｘ－Ｖ
ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＲＧｘＶ
Ｘ１は、ＧまたはＳであり得る。
Ｘ２は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ３は、ＡまたはＧであり得る。
Ｘ４は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ５は、ＬまたはＶであり得る。
Ｘ６は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ７は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ８は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ９は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ１０は、Ｆ、Ｌ、またはＹであり得る。
Ｘ１３は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
配列番号２０８：人工＿エナール開裂ポリペプチド配列モチーフ４
［ＭまたはＬ］－［ＶまたはＩ］－Ｙ－Ｄ－ｘ－ｘ－Ｐ－［ＩまたはＶ］－ｘ－Ｄ－［ＨまたはＳ］－［ＦまたはＬ］
ｘｘＹＤｘｘＰｘｘＤｘｘ
Ｘ１は、ＬまたはＭであり得る。
Ｘ２は、ＩまたはＶであり得る。
Ｘ５は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ６は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ８は、ＩまたはＶであり得る。
Ｘ９は、自然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
Ｘ１１は、ＨまたはＳであり得る。
Ｘ１２は、ＦまたはＬであり得る。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
Ｘの番号は、配列中でのその位置に対応している。
さらに、本発明の好適な態様を以下に示す。
項目１：
エナール開裂活性を有する単離されたポリペプチドであって、
（１）以下のものを含むポリペプチドの群：
ａ）Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１４２３２を有する少なくとも１つのＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリードメイン；および／または
ｂ）Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１４２３１を有する少なくとも１つのＧＸＷＸＧタンパク質ファミリードメイン；または
ｃ）ＰＦ１４２３２もしくはＰＦ１４２３１と少なくとも９０％の配列同一性を保持する少なくとも１つのドメイン
および／または
（２）それぞれのポリペプチドが、以下のものから選択される少なくとも１つの配列モチーフ／ドメインを含む、ポリペプチドの群：
配列番号２０５に示されるＧ－［Ｙもしくは－］－ｘ－Ｗ－ｘ－Ｇ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＬもしくはＩ］－ｘ－［Ｔ，ＳもしくはＲ］－Ｇ－［ＨもしくはＤ］；
配列番号２０６に示されるＷ－［Ｙ，ＡもしくはＶ］－Ｇ－Ｋ－ｘ－［ＦもしくはＹ］－ｘ－［ＳもしくはＤ］；
配列番号２０７に示される［ＧもしくはＳ］－ｘ－［ＡもしくはＧ］－ｘ－［ＬもしくはＶ］－ｘ－ｘ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＹもしくはＬ］－Ｒ－Ｇ－ｘ－Ｖ；
配列番号２０８に示される［ＭもしくはＬ］－［ＶもしくはＩ］－Ｙ－Ｄ－ｘ－ｘ－Ｐ－［ＩもしくはＶ］－ｘ－Ｄ－［ＨもしくはＳ］－［ＦもしくはＬ］；
（ここで、残基ｘは、互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す）
および／または
（３）以下のものから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの群：
ａ）配列番号３４に示されるＳＣＨ９４－３９４４；
ｂ）配列番号３８に示されるＳＣＨ８０－０５２４１；
ｃ）配列番号４２に示されるＰｄｉｇｉｔ７０３３；
ｄ）配列番号４６に示されるＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１；
ｅ）配列番号４９に示されるＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４；
ｆ）配列番号５３に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２；
ｇ）配列番号５６に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３；
ｈ）配列番号５９に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４；
ｉ）配列番号６２に示されるＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４；
ｊ）配列番号６９に示されるＲｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４；
ｋ）配列番号７２に示されるＣｇａｔＤＵＦ４３３４；
ｌ）配列番号７５に示されるＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４；
ｍ）配列番号８１に示されるＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４；
ｎ）配列番号８７に示されるＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４；および
ｏ）ａ）～ｎ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつ下記の式（Ｖ）のテルペン前駆体を分解する前記酵素活性を保持するポリペプチド
から選択される、単離されたポリペプチド。
項目２：
項目１記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
項目３：
一般式ＩＶ
［化１］
Figure 2022539510000339
 ［式中、
Ｒ １ は、Ｈまたは低級アルキルを表し、
Ｒ ２ は、Ｈ、線状もしくは分岐状の、飽和もしくは不飽和の、任意に置換されたヒドロカルビル残基、または残基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、
ここで、
Ｃｙｃは、任意に置換された、飽和または不飽和の、単環式または多環式のヒドロカルビル残基を表し、
Ａは、化学結合、または任意に置換された直鎖もしくは分岐したアルキレン架橋を表し、
Ｒ ３ は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキルを表す］の化合物を調製する生体触媒法であって、当該方法は、
（１）一般式Ｖ
［化２］
Figure 2022539510000340
 ［式中、
Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ は、上記で定義したとおりであり、
Ｒ ４ は、Ｈまたは低級アルキルを表し、
Ｒ ５ は、Ｈまたは低級アルキルを表す］
の対応する非分解前駆体を、
エナール開裂活性を有するポリペプチドと接触させるステップであって、
ここで、式Ｖの前記化合物は、立体異性体的に本質的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として存在してもよい、ステップと、
（２）任意に、ステップ（１）で得られた式ＩＶの前記分解生成物を単離するステップであって、ここで、式ＩＶの前記化合物が、立体異性体的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として得られる、ステップと
を含む、方法。
項目４：
式Ｖのテルペン前駆体を適用し、
ここで、
Ｒ １ は、Ｈまたはメチルを表し、
Ｒ ２ は、Ｈまたは
１～２０個の炭素原子を有する非環状の、線状もしくは分岐状の、飽和もしくは不飽和のヒドロカルビル残基；または
環状基Ｃｙｃ－Ａ－であって、
ここで、
Ａは、直鎖もしくは分岐したＣ １ ～Ｃ ４ －アルキレン橋を表し、Ｃｙｃは、単環式もしくは多環式の、飽和もしくは不飽和のヒドロカルビル残基であって、１～１０個の置換基で任意に置換されており、当該置換基は、Ｃ １ ～Ｃ ４ －アルキル、Ｃ １ ～Ｃ ４ －アルキリデン、Ｃ ２ ～Ｃ ４ －アルケニル、オキソ、ヒドロキシ、またはアミノから独立して選択される、ヒドロカルビル残基を表し、
各Ｒ ３ は、Ｈを表し
Ｒ ４ は、Ｈまたはメチルを表し、
Ｒ ５ は、Ｈまたはメチルを表す、
項目３．記載の方法。
項目５：
一般式Ｖの前記化合物がラブダン型構造を有し、かつ／またはＣｙｃ－Ａが、式ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃ
［化３］
Figure 2022539510000341
 のうちの１つの残基を表す、項目３または４記載の方法。
項目６：
エナール開裂活性を有する前記ポリペプチドが、項目１で定義したポリペプチドから選択される、項目３から５までのいずれか１つ記載の方法。
項目７：
ステップ（３）として、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された式ＩＶの前記化合物を処理して、化学合成もしくは生体触媒合成、またはその両方の組み合わせを用いてその誘導体を得ることと、任意に、ステップ（４）として、ステップ（３）の前記誘導体を単離することとをさらに含み、ここで、前記誘導体は、特に、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルから選択され得る、項目３から６までのいずれか１つ記載の方法。
項目８：
ステップ（３）が、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された式ＩＶの前記化合物を、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）活性を有するポリペプチドで処理して、それぞれのカルボニルエステル（ＥＣ．１．１３．１４．－）を形成するようにし、任意に、前記カルボニルエステル化合物をエステラーゼ（ＥＣ３．１．１）で加水分解して対応する脱エステル化生成物を得ることと、任意に、ステップ（３）の前記誘導体を単離することとをさらに含む、項目７記載の方法。
項目９：
エステル化合物を調製する生体触媒法であって、
（１）一般式Ｉ
［化４］
Figure 2022539510000342
 ［式中、
「ａ」は、単結合または二重結合を表し、
「ａ」が二重結合を表す場合、「ｘ」は１であるか、「ａ」が単結合を表す場合、「ｘ」は２であり、
Ｒ １ は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキルを表し、
Ｒ ２ は、Ｈ、線状または分岐状の、飽和または不飽和の、任意に置換されたヒドロカルビル残基、または基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、
ここで、
Ｃｙｃは、任意に置換された、飽和または不飽和の単環式または多環式のヒドロカルビル残基を表し、
Ａは、化学結合、または任意に置換された直鎖もしくは分岐したアルキレン架橋を表し、
Ｒ ３ は、互いに独立して、ＨまたはＣ １ ～Ｃ １５ のヒドロカルビル基、または低級アルキル基を表し、
「ａ」が単結合を表す場合、Ｚは、カルボニル基を含むヒドロカルビル残基を表し、
「ａ」が二重結合を表す場合、Ｚは、それが結合している炭素原子と一緒になって、カルボニル基、もしくは末端カルボニル基を有するアルキリデン残基を形成するか、または
「ａ」が二重結合を表し、Ｚが、それが結合している炭素原子と一緒になってカルボニル基を形成する場合、Ｒ ２ およびＲ １ は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、環式の、飽和もしくは不飽和の、任意に置換された炭素環式環基を形成してもよく、
ここで、一般式Ｉの前記カルボニル化合物は、立体異性体的に純粋な形態で提供されるか、または立体異性体の混合物として提供される］のカルボニル前駆体化合物を、
バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）（ＥＣ１．１３．１４．－）活性を有するポリペプチドと接触させて、それぞれのカルボニルエステルを形成するようにするステップと、
（２）ステップ（１）で形成された前記カルボニルエステルを任意に単離するステップであって、前記カルボニルエステル化合物は、立体異性体的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として得られる、ステップと
を含む、方法。
項目１０：
一般式Ｉの前記カルボニル化合物において、
「ａ」は化学的二重結合を表し、Ｚは＝Ｏもしくは＝Ｃ（Ｒ ４ ）－Ｃ（Ｒ ５ ）＝Ｏを表すか、または
「ａ」は化学的単結合を表し、Ｚは－Ｃ（Ｒ ５ ）＝Ｏを表し、
ここで、
Ｒ ４ およびＲ ５ は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキルを表す、項目９記載の方法。
項目１１
一般式Ｉの前記カルボニル化合物がラブダン型構造を有する、項目９または１０記載の方法。
項目１２：
Ｒ ２ が、基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、ここで、Ａは、直鎖または分岐したＣ １ ～Ｃ ４ －アルキレン架橋を表し、Ｃｙｃは、単環式または多環式の、飽和または不飽和ヒドロカルビル残基を表し、ここで、Ｃｙｃは、１～１０個の置換基で任意に置換されており、前記置換基は、Ｃ １ ～Ｃ ４ －アルキル、Ｃ １ ～Ｃ ４ －アルキリデン、Ｃ ２ ～Ｃ ４ －アルケニル、オキソ、ヒドロキシ、またはアミノから独立して選択される、項目９から１１までのいずれか１つ記載の方法。
項目１３：
Ｃｙｃ－Ａが、前記式ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃ
［化５］
Figure 2022539510000343
 のうちの１つの二環式残基を表す、項目１２記載の方法。
項目１４：
ＢＶＭＯ活性を有する前記ポリペプチドが、
（１）そのアミノ酸配列内にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ００７４３を有するフラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）タンパク質ファミリードメインを含むポリペプチドの群またはＰＦ００７４３と少なくとも９０％の配列同一性を保持するドメイン；
および／または
（２）以下から選択される少なくとも１個の配列モチーフ／ドメインを含むポリペプチドの群：
配列番号１９７に示されるＧＡＧｘＳＧＬ；
配列番号１９８に示されるＥＫＮｘｘｘｘＧＴＷｘＥＮＲＹＰＧＣＡＣＤＶＰｘＨｘＹＸＸＳＦＥ；
配列番号１９９に示されるＬｘＮＡｘＧＩＬＮｘＷｘｘＰｘＩＰＧ；
配列番号２００に示されるＬｘｘＫｘＶｘｘＩＧｘＧＳＳＧＩＱＩｘＰｘＩ；
配列番号２０１に示されるＧＣＲＲｘＴＰＧｘｘＹＬＥｘＬ；
配列番号２０２に示されるＣＡＴＧＦＤｘｘｘｘＰＲＦｘｘｘＧ；
配列番号２０３に示されるＰＮｘＦｘｘｘＧＰＮｘＰｘｘＮＧｘＶ；
配列番号２０４に示されるＡｘＷＰＧＳｘＬＨＹｘＥＡｘｘｘＰＲｘＥＤ；
（ここで、残基ｘは、互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す）
および／または
（３）以下からなるポリペプチドの群：
（ａ）配列番号２に示されるＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号６に示されるＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１０に示されるＳＣＨ２５－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号１３に示されるＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号１６に示されるＡｓｐＷｅＢＶＭＯのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）ａ）～ｅ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、項目９から１３までのいずれか１つ記載の方法。
項目１５：
ステップ（３）として、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された前記カルボニルエステルを処理して、化学合成もしくは生体触媒合成、またはその両方の組み合わせを用いてその誘導体を得ることと、任意に、ステップ（３）の前記誘導体を単離することとをさらに含み、ここで、前記誘導体は、特に、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルから選択され得る、項目９から１４までのいずれか１つ記載の方法。
項目１６：
ステップ（３）が、前記カルボニルエステル化合物を、エステラーゼ活性（ＥＣ３．１．１．）を有するポリペプチドで加水分解して対応する脱エステル化生成物を得ることと、任意に、ステップ（３）の前記誘導体を単離することと、任意に、更なるステップ（４）でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＣ１．１．１．－）活性を有するポリペプチドの酵素作用により、脱エステル化生成物を酵素的な酸化還元反応に供することとを含む、項目１５記載の方法。
項目１７：
項目１４で定義したＢＶＭＯ活性を有する、単離されたポリペプチド。
項目１８：
項目１７記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
項目１９：
ラブダン型テルペン類を調製するためのインビボ法であって、
当該方法は、以下の一連の反応ステップ：
（１）任意に、ＡＤＨポリペプチドの酵素作用により、ラブダンアルコールをそれぞれのラブダンアルデヒドに変換するステップ；
（２）ステップ（１）の前記ラブダンアルデヒドを、項目１で定義したエナール開裂活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのジノルラブダンカルボニル化合物に変換するステップ；
（３）任意に、ステップ（２）の前記ジノルラブダンカルボニル化合物を、項目１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアセテートに変換するステップ；
（４）任意に、ステップ（３）の前記テトラノルラブダニルアセテートを、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアルコールに変換するステップ；ならびに任意に、
（５）ステップ（２）、（３）または（４）の生成物を単離するステップ
を触媒するのに必要な酵素活性を有する一連のポリペプチドを発現する組換え宿主を提供することを含む、方法。
項目２０：
ラブダン型シクロテルペン類を調製するためのインビボ法であって、
当該方法は、以下の一連の反応ステップ：
（１）任意に、ＡＤＨポリペプチドの酵素作用により、ラブダンアルコールをそれぞれのラブダンアルデヒドに変換するステップ；
（２）ステップ（１）の前記ラブダンアルデヒドを、項目１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのラブダンエステル化合物に変換するステップ；
（３）ステップ（２）の前記ラブダンエステル化合物を、任意に、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのノルラブダンアルデヒドに変換するステップ；
（４）ステップ（３）の前記ノルラブダンアルデヒドを、項目１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのノルラブダンエステルに変換するステップ；
（５）ステップ（４）の前記ノルラブダンエステルを、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのジノルラブダンアルコールに変換するステップ；
（６）任意に、ステップ（５）の前記ジノルラブダンアルコールを、ＡＤＨ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのジノルラブダンカルボニル化合物に変換するステップ；
（７）任意に、ステップ（６）の前記ジノルラブダンカルボニル化合物を、項目１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアセテートに変換するステップ；
（８）ステップ（７）の前記テトラノルラブダニルアセテートを、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダンアルコールに変換するステップ；ならびに任意に、
（９）ステップ（５）、（６）、（７）または（８）の生成物を単離するステップ；
を触媒するのに必要な酵素活性を有する一連のポリペプチドを発現する組換え宿主を提供することを含む、方法。
項目２１：
エポキシ－テトラノルラブダン化合物を調製する方法であって、当該方法は、
（１）テトラノルラブダンアルコールもしくはテトラノルラブダンアセテート、またはジノルラブダンカルボニル化合物を、項目３から１６、１９または２０のいずれか１つにおいて定義した１つ以上の方法ステップを含む生体触媒法を適用することによって提供し、任意に、前記生成物を単離するステップと、
（２）ステップ（１）の前記生成物を、１つ以上の化学的および／または生化学的な変換ステップを適用することによって、エポキシ－テトラノルラブダンに変換するステップとを含む、方法。
項目２２：
ジエポキシ－ジノルラブダンを調製する方法であって、当該方法は、
（１）ジノルラブダンカルボニル化合物を、項目３から１６、１９または２０のいずれか１つにおいて定義した１つ以上の方法ステップを含む方法を適用することによって提供し、任意に、前記ジノルラブダンカルボニル化合物を単離するステップと、
（２）前記ジノルラブダンカルボニル化合物を、１つ以上の化学的および／または生化学的な変換ステップを適用することによって、前記ジエポキシ－ジノルラブダンに変換するステップとを含む、方法。

Claims (22)

  1. エナール開裂活性を有する単離されたポリペプチドであって、
    （１）以下のものを含むポリペプチドの群：
    ａ）Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１４２３２を有する少なくとも１つのＤＵＦ４３３４タンパク質ファミリードメイン；および／または
    ｂ）Ｐｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ１４２３１を有する少なくとも１つのＧＸＷＸＧタンパク質ファミリードメイン；または
    ｃ）ＰＦ１４２３２もしくはＰＦ１４２３１と少なくとも９０％の配列同一性を保持する少なくとも１つのドメイン
    および／または
    （２）それぞれのポリペプチドが、以下のものから選択される少なくとも１つの配列モチーフ／ドメインを含む、ポリペプチドの群：
    配列番号２０５に示されるＧ－［Ｙもしくは－］－ｘ－Ｗ－ｘ－Ｇ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＬもしくはＩ］－ｘ－［Ｔ，ＳもしくはＲ］－Ｇ－［ＨもしくはＤ］；
    配列番号２０６に示されるＷ－［Ｙ，ＡもしくはＶ］－Ｇ－Ｋ－ｘ－［ＦもしくはＹ］－ｘ－［ＳもしくはＤ］；
    配列番号２０７に示される［ＧもしくはＳ］－ｘ－［ＡもしくはＧ］－ｘ－［ＬもしくはＶ］－ｘ－ｘ－ｘ－ｘ－［Ｆ，ＹもしくはＬ］－Ｒ－Ｇ－ｘ－Ｖ；
    配列番号２０８に示される［ＭもしくはＬ］－［ＶもしくはＩ］－Ｙ－Ｄ－ｘ－ｘ－Ｐ－［ＩもしくはＶ］－ｘ－Ｄ－［ＨもしくはＳ］－［ＦもしくはＬ］；
    （ここで、残基ｘは、互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す）
    および／または
    （３）以下のものから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの群：
    ａ）配列番号３４に示されるＳＣＨ９４－３９４４；
    ｂ）配列番号３８に示されるＳＣＨ８０－０５２４１；
    ｃ）配列番号４２に示されるＰｄｉｇｉｔ７０３３；
    ｄ）配列番号４６に示されるＰｉｔａｌＤＵＦ４３３４－１；
    ｅ）配列番号４９に示されるＡｓｐＷｅＤＵＦ４３３４；
    ｆ）配列番号５３に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－２；
    ｇ）配列番号５６に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－３；
    ｈ）配列番号５９に示されるＲｈｏａｇＤＵＦ４３３４－４；
    ｉ）配列番号６２に示されるＣｎｅｃａＤＵＦ４３３４；
    ｊ）配列番号６９に示されるＲｉｎｓ－ＤＵＦ４３３４；
    ｋ）配列番号７２に示されるＣｇａｔＤＵＦ４３３４；
    ｌ）配列番号７５に示されるＧｃｌａｖＤＵＦ４３３４；
    ｍ）配列番号８１に示されるＴｃｕｒｖａＤＵＦ４３３４；
    ｎ）配列番号８７に示されるＰｐｒｏｔＤＵＦ４３３４；および
    ｏ）ａ）～ｎ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みかつ下記の式（Ｖ）のテルペン前駆体を分解する前記酵素活性を保持するポリペプチド
    から選択される、単離されたポリペプチド。
  2. 請求項１記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  3. 一般式ＩＶ
    Figure 2022539510000282
     ［式中、
    Ｒ１は、Ｈまたは低級アルキルを表し、
    Ｒ２は、Ｈ、線状もしくは分岐状の、飽和もしくは不飽和の、任意に置換されたヒドロカルビル残基、または残基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、
    ここで、
    Ｃｙｃは、任意に置換された、飽和または不飽和の、単環式または多環式のヒドロカルビル残基を表し、
    Ａは、化学結合、または任意に置換された直鎖もしくは分岐したアルキレン架橋を表し、
    Ｒ３は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキルを表す］の化合物を調製する生体触媒法であって、当該方法は、
    （１）一般式Ｖ
    Figure 2022539510000283
     ［式中、
    Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義したとおりであり、
    Ｒ４は、Ｈまたは低級アルキルを表し、
    Ｒ５は、Ｈまたは低級アルキルを表す］
    の対応する非分解前駆体を、
    エナール開裂活性を有するポリペプチドと接触させるステップであって、
    ここで、式Ｖの前記化合物は、立体異性体的に本質的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として存在してもよい、ステップと、
    （２）任意に、ステップ（１）で得られた式ＩＶの前記分解生成物を単離するステップであって、ここで、式ＩＶの前記化合物が、立体異性体的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として得られる、ステップと
    を含む、方法。
  4. 式Ｖのテルペン前駆体を適用し、
    ここで、
    Ｒ１は、Ｈまたはメチルを表し、
    Ｒ２は、Ｈまたは
    １～２０個の炭素原子を有する非環状の、線状もしくは分岐状の、飽和もしくは不飽和のヒドロカルビル残基；または
    環状基Ｃｙｃ－Ａ－であって、
    ここで、
    Ａは、直鎖もしくは分岐したＣ１～Ｃ４－アルキレン橋を表し、Ｃｙｃは、単環式もしくは多環式の、飽和もしくは不飽和のヒドロカルビル残基であって、１～１０個の置換基で任意に置換されており、当該置換基は、Ｃ１～Ｃ４－アルキル、Ｃ１～Ｃ４－アルキリデン、Ｃ２～Ｃ４－アルケニル、オキソ、ヒドロキシ、またはアミノから独立して選択される、ヒドロカルビル残基を表し、
    各Ｒ３は、Ｈを表し
    Ｒ４は、Ｈまたはメチルを表し、
    Ｒ５は、Ｈまたはメチルを表す、
    請求項３記載の方法。
  5. 一般式Ｖの前記化合物がラブダン型構造を有し、かつ／またはＣｙｃ－Ａが、式ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃ
    Figure 2022539510000284
     のうちの１つの残基を表す、請求項３または４記載の方法。
  6. エナール開裂活性を有する前記ポリペプチドが、請求項１で定義したポリペプチドから選択される、請求項３から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. ステップ（３）として、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された式ＩＶの前記化合物を処理して、化学合成もしくは生体触媒合成、またはその両方の組み合わせを用いてその誘導体を得ることと、任意に、ステップ（４）として、ステップ（３）の前記誘導体を単離することとをさらに含み、ここで、前記誘導体は、特に、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルから選択され得る、請求項３から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. ステップ（３）が、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された式ＩＶの前記化合物を、バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）活性を有するポリペプチドで処理して、それぞれのカルボニルエステル（ＥＣ．１．１３．１４．－）を形成するようにし、任意に、前記カルボニルエステル化合物をエステラーゼ（ＥＣ３．１．１）で加水分解して対応する脱エステル化生成物を得ることと、任意に、ステップ（３）の前記誘導体を単離することとをさらに含む、請求項７記載の方法。
  9. エステル化合物を調製する生体触媒法であって、
    （１）一般式Ｉ
    Figure 2022539510000285
     ［式中、
    「ａ」は、単結合または二重結合を表し、
    「ａ」が二重結合を表す場合、「ｘ」は１であるか、「ａ」が単結合を表す場合、「ｘ」は２であり、
    Ｒ１は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキルを表し、
    Ｒ２は、Ｈ、線状または分岐状の、飽和または不飽和の、任意に置換されたヒドロカルビル残基、または基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、
    ここで、
    Ｃｙｃは、任意に置換された、飽和または不飽和の単環式または多環式のヒドロカルビル残基を表し、
    Ａは、化学結合、または任意に置換された直鎖もしくは分岐したアルキレン架橋を表し、
    Ｒ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１～Ｃ１５のヒドロカルビル基、または低級アルキル基を表し、
    「ａ」が単結合を表す場合、Ｚは、カルボニル基を含むヒドロカルビル残基を表し、
    「ａ」が二重結合を表す場合、Ｚは、それが結合している炭素原子と一緒になって、カルボニル基、もしくは末端カルボニル基を有するアルキリデン残基を形成するか、または
    「ａ」が二重結合を表し、Ｚが、それが結合している炭素原子と一緒になってカルボニル基を形成する場合、Ｒ２およびＲ１は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、環式の、飽和もしくは不飽和の、任意に置換された炭素環式環基を形成してもよく、
    ここで、一般式Ｉの前記カルボニル化合物は、立体異性体的に純粋な形態で提供されるか、または立体異性体の混合物として提供される］のカルボニル前駆体化合物を、
    バイヤー・ビリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）（ＥＣ１．１３．１４．－）活性を有するポリペプチドと接触させて、それぞれのカルボニルエステルを形成するようにするステップと、
    （２）ステップ（１）で形成された前記カルボニルエステルを任意に単離するステップであって、前記カルボニルエステル化合物は、立体異性体的に純粋な形態で、または立体異性体の混合物として得られる、ステップと
    を含む、方法。
  10. 一般式Ｉの前記カルボニル化合物において、
    「ａ」は化学的二重結合を表し、Ｚは＝Ｏもしくは＝Ｃ（Ｒ４）－Ｃ（Ｒ５）＝Ｏを表すか、または
    「ａ」は化学的単結合を表し、Ｚは－Ｃ（Ｒ５）＝Ｏを表し、
    ここで、
    Ｒ４およびＲ５は、互いに独立して、Ｈまたは低級アルキルを表す、請求項９記載の方法。
  11. 一般式Ｉの前記カルボニル化合物がラブダン型構造を有する、請求項９または１０記載の方法。
  12. Ｒ２が、基Ｃｙｃ－Ａ－を表し、ここで、Ａは、直鎖または分岐したＣ１～Ｃ４－アルキレン架橋を表し、Ｃｙｃは、単環式または多環式の、飽和または不飽和ヒドロカルビル残基を表し、ここで、Ｃｙｃは、１～１０個の置換基で任意に置換されており、前記置換基は、Ｃ１～Ｃ４－アルキル、Ｃ１～Ｃ４－アルキリデン、Ｃ２～Ｃ４－アルケニル、オキソ、ヒドロキシ、またはアミノから独立して選択される、請求項９から１１までのいずれか１項記載の方法。
  13. Ｃｙｃ－Ａが、前記式ＩＩＩａ、ＩＩＩｂまたはＩＩＩｃ
    Figure 2022539510000286
     のうちの１つの二環式残基を表す、請求項１２記載の方法。
  14. ＢＶＭＯ活性を有する前記ポリペプチドが、
    （１）そのアミノ酸配列内にＰｆａｍ ＩＤ番号ＰＦ００７４３を有するフラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）タンパク質ファミリードメインを含むポリペプチドの群またはＰＦ００７４３と少なくとも９０％の配列同一性を保持するドメイン；
    および／または
    （２）以下から選択される少なくとも１個の配列モチーフ／ドメインを含むポリペプチドの群：
    配列番号１９７に示されるＧＡＧｘＳＧＬ；
    配列番号１９８に示されるＥＫＮｘｘｘｘＧＴＷｘＥＮＲＹＰＧＣＡＣＤＶＰｘＨｘＹＸＸＳＦＥ；
    配列番号１９９に示されるＬｘＮＡｘＧＩＬＮｘＷｘｘＰｘＩＰＧ；
    配列番号２００に示されるＬｘｘＫｘＶｘｘＩＧｘＧＳＳＧＩＱＩｘＰｘＩ；
    配列番号２０１に示されるＧＣＲＲｘＴＰＧｘｘＹＬＥｘＬ；
    配列番号２０２に示されるＣＡＴＧＦＤｘｘｘｘＰＲＦｘｘｘＧ；
    配列番号２０３に示されるＰＮｘＦｘｘｘＧＰＮｘＰｘｘＮＧｘＶ；
    配列番号２０４に示されるＡｘＷＰＧＳｘＬＨＹｘＥＡｘｘｘＰＲｘＥＤ；
    （ここで、残基ｘは、互いに独立して、任意の天然アミノ酸残基を表す）
    および／または
    （３）以下からなるポリペプチドの群：
    （ａ）配列番号２に示されるＳＣＨ２３－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｂ）配列番号６に示されるＳＣＨ２４－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｃ）配列番号１０に示されるＳＣＨ２５－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｄ）配列番号１３に示されるＳＣＨ４６－ＢＶＭＯ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｅ）配列番号１６に示されるＡｓｐＷｅＢＶＭＯのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｆ）ａ）～ｅ）までのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
    から選択される、請求項９から１３までのいずれか１項記載の方法。
  15. ステップ（３）として、ステップ（１）で形成された、またはステップ（２）で単離された前記カルボニルエステルを処理して、化学合成もしくは生体触媒合成、またはその両方の組み合わせを用いてその誘導体を得ることと、任意に、ステップ（３）の前記誘導体を単離することとをさらに含み、ここで、前記誘導体は、特に、炭化水素、アルコール、ジオール、トリオール、アセタール、ケタール、アルデヒド、酸、エーテル、アミド、ケトン、ラクトン、エポキシド、アセテート、グリコシドおよび／またはエステルから選択され得る、請求項９から１４までのいずれか１項記載の方法。
  16. ステップ（３）が、前記カルボニルエステル化合物を、エステラーゼ活性（ＥＣ３．１．１．）を有するポリペプチドで加水分解して対応する脱エステル化生成物を得ることと、任意に、ステップ（３）の前記誘導体を単離することと、任意に、更なるステップ（４）でアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＣ１．１．１．－）活性を有するポリペプチドの酵素作用により、脱エステル化生成物を酵素的な酸化還元反応に供することとを含む、請求項１５記載の方法。
  17. 請求項１４で定義したＢＶＭＯ活性を有する、単離されたポリペプチド。
  18. 請求項１７記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  19. ラブダン型テルペン類を調製するためのインビボ法であって、
    当該方法は、以下の一連の反応ステップ：
    （１）任意に、ＡＤＨポリペプチドの酵素作用により、ラブダンアルコールをそれぞれのラブダンアルデヒドに変換するステップ；
    （２）ステップ（１）の前記ラブダンアルデヒドを、請求項１で定義したエナール開裂活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのジノルラブダンカルボニル化合物に変換するステップ；
    （３）任意に、ステップ（２）の前記ジノルラブダンカルボニル化合物を、請求項１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアセテートに変換するステップ；
    （４）任意に、ステップ（３）の前記テトラノルラブダニルアセテートを、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアルコールに変換するステップ；ならびに任意に、
    （５）ステップ（２）、（３）または（４）の生成物を単離するステップ
    を触媒するのに必要な酵素活性を有する一連のポリペプチドを発現する組換え宿主を提供することを含む、方法。
  20. ラブダン型シクロテルペン類を調製するためのインビボ法であって、
    当該方法は、以下の一連の反応ステップ：
    （１）任意に、ＡＤＨポリペプチドの酵素作用により、ラブダンアルコールをそれぞれのラブダンアルデヒドに変換するステップ；
    （２）ステップ（１）の前記ラブダンアルデヒドを、請求項１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのラブダンエステル化合物に変換するステップ；
    （３）ステップ（２）の前記ラブダンエステル化合物を、任意に、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのノルラブダンアルデヒドに変換するステップ；
    （４）ステップ（３）の前記ノルラブダンアルデヒドを、請求項１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのノルラブダンエステルに変換するステップ；
    （５）ステップ（４）の前記ノルラブダンエステルを、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのジノルラブダンアルコールに変換するステップ；
    （６）任意に、ステップ（５）の前記ジノルラブダンアルコールを、ＡＤＨ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのジノルラブダンカルボニル化合物に変換するステップ；
    （７）任意に、ステップ（６）の前記ジノルラブダンカルボニル化合物を、請求項１７で定義したＢＶＭＯ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダニルアセテートに変換するステップ；
    （８）ステップ（７）の前記テトラノルラブダニルアセテートを、エステラーゼ活性を有するポリペプチドの作用により、それぞれのテトラノルラブダンアルコールに変換するステップ；ならびに任意に、
    （９）ステップ（５）、（６）、（７）または（８）の生成物を単離するステップ；
    を触媒するのに必要な酵素活性を有する一連のポリペプチドを発現する組換え宿主を提供することを含む、方法。
  21. エポキシ－テトラノルラブダン化合物を調製する方法であって、当該方法は、
    （１）テトラノルラブダンアルコールもしくはテトラノルラブダンアセテート、またはジノルラブダンカルボニル化合物を、請求項３から１６、１９または２０のいずれか１項において定義した１つ以上の方法ステップを含む生体触媒法を適用することによって提供し、任意に、前記生成物を単離するステップと、
    （２）ステップ（１）の前記生成物を、１つ以上の化学的および／または生化学的な変換ステップを適用することによって、エポキシ－テトラノルラブダンに変換するステップと
    を含む、方法。
  22. ジエポキシ－ジノルラブダンを調製する方法であって、当該方法は、
    （１）ジノルラブダンカルボニル化合物を、請求項３から１６、１９または２０のいずれか１項において定義した１つ以上の方法ステップを含む方法を適用することによって提供し、任意に、前記ジノルラブダンカルボニル化合物を単離するステップと、
    （２）前記ジノルラブダンカルボニル化合物を、１つ以上の化学的および／または生化学的な変換ステップを適用することによって、前記ジエポキシ－ジノルラブダンに変換するステップと
    を含む、方法。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113293106B (zh) * 2021-07-12 2022-09-09 江南大学 一种子囊菌纲Filobasidium属的真菌及其应用
EP4370684A2 (en) * 2021-07-16 2024-05-22 Amyris, Inc. Novel enzymes for the production of gamma-ambryl acetate
WO2023244843A1 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Amyris, Inc. HIGH pH METHODS AND COMPOSITIONS FOR CULTURING GENETICALLY MODIFIED HOST CELLS

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5441385A (en) * 1977-09-06 1979-04-02 Yoshio Tsujisaka Ester synthesis of terpene alcohol by lypase
EP0892608B1 (en) * 1996-04-12 2001-09-12 Board of Trustees of the University of Kentucky Host-derived signals for inducing isoprenoid gene expression and uses thereof
US6071955A (en) * 1999-02-25 2000-06-06 The Regents Of The University Of California FXR, PPARA and LXRA activators to treat acne/acneiform conditions
DE19931847A1 (de) 1999-07-09 2001-01-11 Basf Ag Immobilisierte Lipase
DE10019373A1 (de) 2000-04-18 2001-10-31 Pfreundt Gmbh & Co Kg Vorrichtung und Verfahren zur Steuerung eines Maschinenbauteils
DE10019380A1 (de) 2000-04-19 2001-10-25 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von kovalent gebundenen biologisch aktiven Stoffen an Polyurethanschaumstoffen sowie Verwendung der geträgerten Polyurethanschaumstoffe für chirale Synthesen
JP2005503163A (ja) * 2001-09-17 2005-02-03 プラント リサーチ インターナショナル ビー． ブイ． 生物的転化のための植物酵素
CA2535710A1 (en) 2003-09-18 2005-03-24 Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. Alcohol dehydrogenases with increased solvent and temperature stability
JP5236233B2 (ja) * 2007-09-04 2013-07-17 花王株式会社 （−）−アンブロキサンの製造方法
CN105579585B (zh) * 2013-09-05 2019-03-15 国立大学法人新潟大学 龙涎香醇的制造方法
GB201601249D0 (en) * 2016-01-22 2016-03-09 Firmenich & Cie Production of manool
DE102015217657A1 (de) * 2015-09-15 2017-03-16 Zf Friedrichshafen Ag Verfahren zum Betreiben eines Automatgetriebes
BR112019013014A2 (pt) * 2016-12-22 2020-01-14 Firmenich & Cie produção de manool
EP4370684A2 (en) * 2021-07-16 2024-05-22 Amyris, Inc. Novel enzymes for the production of gamma-ambryl acetate

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