CN1809642A - 微生物异构化α-羟基羧酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用α-羟基羧酸外消旋酶微生物异构化α-羟基羧酸的方法,还涉及用于该方法的酶和表达适当的外消旋酶活性的微生物、具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的微生物的筛选方法、编码该酶的核酸序列、表达载体、表达该外消旋酶的重组微生物,以及产生或分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法。
Description
技术领域
本发明涉及使用α-羟基羧酸外消旋酶微生物异构化α-羟基羧酸的方法、用于该方法的酶和表达适当的外消旋酶活性的微生物、具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的微生物的筛选方法、编码该酶的核酸序列、表达载体、表达该外消旋酶的重组微生物,和产生或分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法。
背景技术
现有技术公知被称作微生物扁桃酸外消旋酶的酶,其能够在体外和体内外消旋扁桃酸(G.L.Kenyon,J.A.Gerit,G.A.Petsko和J.W.Kozarich,″Mandelate Racemase:Structure-Function Studies of aPseudosymmetric Enzyme″,Accts.Chem.Res.,28,178-186(1995);R.Li,V.M.Powers,J.W.Kozarich和G.L.Kenyon,″Racemization ofVinylglycolate Catalyzed by Mandelate Racemase″,J.Org.Chem.,60,3347-3351(1995);S.S.Schafer,A.T.Kallarakal,J.W.Kozarich,J.A.Gerit,J.R.Clifton和G.L.Kenyon,″Mechanism of the ReactionCatalyzed by Mandelate Racemase:The Structure and MechanisticProperties of the D270N Mutant″,Biochemistry,35,5662-5669(1996))。
同时,制药工业上非常需要能够简单生产手性、非外消旋物质,例如活性成分的生产。酶催化的化合物立体异构形式的外消旋化导致所需的对映异构体,这将构成产生所需的手性、非外消旋物质的适宜途径。然而,目前公知的外消旋酶具有高底物特异性的特征。因此,扁桃酸外消旋酶仅适于β、γ-不饱和的α-羟酸的生物催化外消旋。不能接受饱和的α-羟基羧酸(参考Felfer,U.等,J.Mol.Catal.B:Enzymatic 15,213(2001))。
发明概述
因此,需要与已知的外消旋酶相比具有不同或更宽底物范围的外消旋酶活性的酶。
本发明的目的是提供具有新的外消旋酶活性的微生物和酶制品,以及使用这些酶或者微生物外消旋化立体异构化合物的方法。
令人惊奇的是,我们发现使用具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶的通过α-羟基羧酸微生物异构化方法已经实现了此目的。
本发明的一个方面涉及微生物异构化式I的α-羟基羧酸的方法
其中
R为直链和分支的低级烷基和低级链烯基,优选C2-C8烷基,或者-(CH2)n-Cyc,其中n为0到4的整数,优选1、2或3,Cyc是未取代的或者单或多取代的、单或二核碳环或杂环,例如未取代或取代的芳环或者杂芳环,优选未取代或者取代的单核芳环,
其中借助具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶异构化含有基本上为式(I)α-羟基羧酸的第一种立体异构形式((R)或(S))的底物,并且合适的话,分离得到的异构体混合物((R)/(S))或者得到的第二种立体异构体((R)或(S)型),或者从反应平衡取走得到的第二种立体异构体。
优选通过将底物与纯化的酶反应,例如与具有基于蛋白质纯度大于50%(如>80%或>90%或90到99%)的酶反应,还可以与含有酶的细胞提取物(如细胞破裂和除去细胞残渣后的粗提物)反应或者在表达具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的至少一种酶的完整细胞存在下反应,来实施酶促异构化。
可以优选从形成或者代谢乳酸的微生物(例如乳酸细菌或者丙酸细菌)分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶。尤其适当的来源是乳杆菌属(lactobacillus)和乳球菌属(lactococcus)的细菌。
根据优选的变通方案,在表达本发明的α-羟基羧酸外消旋酶活性的乳杆菌属微生物的完整细胞或者重组微生物的完整细胞存在下进行反应。
优选的微生物选自副干酪乳杆菌(L.paracasei)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、L.sakei和L.oris,尤其是副干酪乳杆菌DSM 20207和DSM 2649,德氏乳杆菌DSM 20074,L.sakei DSM 20017和L.oris DSM4864株系。
在进一步优选的方法变通方案中,酶为具有更宽的底物范围的乳酸外消旋酶(E.C.5.1.2.1),即除了(R)-或(S)-乳酸之外还外消旋上述式I的至少一种其他(R)-和(S)-α-羟基羧酸的酶。
可以根据本发明而使用的酶活性包括例如外消旋化选自苯基乳酸、4-氟苯基乳酸、2-羟基-4-苯基丁酸、2-羟基-4-甲基戊烷羧酸和2-羟基-3-甲基丁酸的(R)和/或(S)形式的至少一种的酶活性。
在上述方法的优选实施方案中,通过例如,层析、随后的化学或者酶立体选择性反应基本上取出了所需的立体异构体,适当的话,从形成的异构体混合物进一步分离下游产物,优选从反应介质分离(例如层析分离)混合物后进行,并再次异构化含有基本上是不需要的立体异构体的残余物。这可以重复任意次数,直到完全转化成所需的立体异构体或者得到所需的其下游产物。
在上述方法的另一优选变通方案中,形成的异构体混合物经受随后的化学或者酶立体选择反应,优选从反应介质分离(例如层析分离)混合物后进行,并且根据本发明再一次异构化所得还含有未反应的羟基羧酸异构体的反应混合物。这可以重复任意次数,直到完全转化成所需的立体异构体或者得到所需的其下游产物。
在上述方法的另一优选变通方案中,将异构化反应与随后的化学或者酶对映选择反应耦联,优选在称作“单罐反应”中耦联,其中从反应平衡逐步或者连续取出产生的所需α-羟基羧酸立体异构体。
优选的本发明的异构化步骤后的化学或酶对映选择反应选自α-羟基羧酸立体异构形式的酯化和酰胺化。尤其可以在羧基或者羟基上进行随后的对映选择反应。
本发明的另一方面涉及筛选表达具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶的微生物的方法,其中在含有基本上为上述式I α-羟基羧酸的立体异构形式的底物存在下培养猜测具有外消旋酶活性的微生物,并检查反应介质中底物的外消旋化(例如,一种立体异构形式的量的减小和/或另一种立体异构形式的量的增加)。
根据本发明的筛选方法不限于特定微生物。原则上,可以用所有已知的真核和原核微生物、动物细胞或者植物细胞进行本发明筛选方法。然而,优选形成或者代谢乳酸的那些微生物,例如乳酸细菌或者丙酸细菌。尤其适当的来源是乳杆菌属细菌。
优选筛选的微生物是将基本上的立体异构底物外消旋1到100%,优选20到100%,特别是50到100%或者80到100%(外消旋(%)=2R/(R+S)×100;R=R形式的浓度;S=S形式的浓度)。适当的转化率为1到50%,优选5到50%,特别是15到50%或者30到50%(转化率(%)=R/(R+S)×100)。
本发明的另一方面涉及外消旋/异构化上述式I的至少一种化合物的α-羟基羧酸外消旋酶。可以通过培养已经在上述定义的筛选方法中经测试对外消旋酶活性呈阳性的微生物并从培养基分离α-羟基羧酸外消旋酶而得到所述α-羟基羧酸外消旋酶。
特别优选的α-羟基羧酸外消旋酶是将上述式I的α-羟基羧酸外消旋1到100%,优选20到100%,特别是50到100%的α-羟基羧酸外消旋酶。
本发明的另一方面涉及编码至少一种上文定义的α-羟基羧酸外消旋酶的核酸序列。
本发明还涉及表达载体,其包含与至少一个调节核酸序列有效连接的至少一个编码α-羟基羧酸外消旋酶的核酸序列。
本发明还涉及重组原核或者真核微生物,其含有至少一种上文定义的核酸序列或者至少一种上文定义的表达载体。
本发明的另一方面涉及产生具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法,其中培养表达具有所需外消旋酶活性的酶的如上定义的重组微生物并从培养物分离所述蛋白质。
最后,本发明涉及分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法,其中破碎经过测试对外消旋酶活性层阳性的上文定义的非重组微生物(尤其乳杆菌属微生物),去除细胞壁碎片并分离具有所需的酶活性的蛋白质。
发明详述
A.一般术语和定义
如果没有另外指出,则应用下面的一般情况:
“外消旋物”表示光学活性化合物的两种对映异构体的等摩尔混合物。
根据本发明,“外消旋化”或“异构化”发生在羟基羧酸的α-碳原子。
“卤素”为氟、氯、溴或碘,特别是氟或氯。
“低级烷基”优选为具有2到8(特别是2到6)个碳原子的直链或者分支烷基,如乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或2-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基丁基。
“低级链烯基”为具有2到8(特别是2到6)个碳原子的上述烷基的单或多不饱和(优选单不饱和)类似物,双键可以在碳链的任何位置。
“芳基”为通过任意环位置结合的单核或二核、未取代或取代的芳香基团,特别是苯基或萘基,如1-或2-萘基。适当的话,这些芳基可附着1个或2个相同或不同的取代基,所述取代基选自上文定义的卤素、低级烷基、低级烷氧基或者三氟甲基。
B.能够经历外消旋化的α-羟基羧酸
根据本发明,可通过外消旋化转化的α-羟基羧酸为上述式(I)的α-羟基羧酸,其中R为直链或分支的低级烷基或者低级链烯基或者-(CH2)n-Cyc,其中n为0到4的整数,Cyc为未取代或单或多取代的、单或二核碳环或杂环。这些化合物可以根据本发明以对映异构纯的形式(即作为R或S对映异构体)或者作为两种对映异构体的非外消旋混合物外消旋化。
用于酶促合成的式I α-羟基羧酸为本身已知并且可以使用有机合成中公知的一般方法得到的化合物。
必须提及的碳环和杂环基团Cyc的实例具体为单或二核(优选单核)基团,其具有最多4个,如0、1或2个相同或不同的选自O、N和S的杂原子。
这些碳环或杂环具体包括3到12(优选4、5或6个)环碳原子。可以提及的实例为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、它们的单或多不饱和类似物,如环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基和苯基;和具有1到4个选自O、N和S的杂原子的5到7元饱和或单或多不饱和杂环基。必须特别提及的是衍生自吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、噁唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、哒嗪和吡嗪的杂环基。
将提及的其它基团是上述碳环或杂环之一与其他杂环或者碳环稠合的二核基团,例如,衍生自苯并呋喃、吲哚、喹啉和萘的基团。
在该上下文中,基团Cyc可以通过任意环位置(优选通过环碳原子)键合。
适当的Cyc基的实例为苯基、萘基、2-噻吩基、3-噻吩基;2-呋喃基、3-呋喃基;2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基;2-噻唑基、4-噻唑基或者5-噻唑基;4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基;3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基和4-氯-2-噻吩基。
基团Cys还可以是单取代或者多取代的,例如单取代或二取代的。优选地,取代基附着到环碳原子上。适当的取代基为卤素、低级烷基、低级链烯基、低级烷氧基、-OH、-SH、-NO2或者NR2R3,其中R2和R3相互独立地为H、甲基或乙基。优选的取代基为卤素。
Cyc基的另一优选基团为上文定义的芳基。
C.具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶
尤其可以从乳杆菌属微生物获得具有根据本发明的α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶。
优选的酶可以分离自乳杆菌属的副干酪乳杆菌DSM 20207(DSM15755)和DSM 2649(DSM 15751)、德氏乳杆菌DSM 20074(DSM 15754),L.sakei DSM 20017(DSM 15753)和L.oris DSM 4864(DSM 15752)株系。这些株系可以从DSM(德意志微生物保藏中心)获得。
使用常规制备级生物化学方法可以从细胞培养物中分离酶。然后,可以以常规方法(例如通过肽片段化和N-末端测序)可以从分离的酶推导出以以一级氨基酸序列信息。
本发明还包括可以从上述微生物分离的具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的天然酶的“功能等价物”。
就本发明而言,天然外消旋酶的“功能等价物”或者类似物为与天然外消旋酶不同但是保留所需的生物活性(例如底物特异性)的多肽。从而,例如,“功能等价物”理解为指这样的酶,其外消旋化选自苯基乳酸、4-氟苯基乳酸、2-羟基-4-苯基丁酸、2-羟基-4-甲基戊烷羧酸和2-羟基-3-甲基丁酸的至少一种化合物并且具有来自上述乳杆菌属株系的天然外消旋酶活性的至少20%,优选至少50%,特别优选至少75%,非常优选至少90%,或者高于天然外消旋酶的活性的活性。此外,功能等价物优选在约pH4到10是稳定的并且有利地具有pH5到8的最适pH,和20℃到80℃的最适温度。
根据本发明,“功能等价物”尤其还理解为指突变体,其在天然氨基酸序列的至少一个序列位置上具有不是天然氨基酸的氨基酸并且仍然保留至少一种上述生物活性。从而,“功能等价物”包括通过一个或多个氨基酸加入、替代、缺失和/或倒位得到的突变体,上述修饰可以发生在任意序列位置,只要它们导致具有根据本发明的性质谱的突变体。具体地,当突变体和未修饰的多肽之间的反应性模式就质量而言一致(即例如当以不同速率转化相同底物)时,也是功能等价物。
在上述的意义中“功能等价物”还包括所述多肽的“前体”和所述多肽的“功能衍生物”和“盐”。
在该上下文中,“前体”为多肽具有或不具有所需生物活性的天然或合成前体。
术语“盐”理解为不仅指本发明蛋白质分子的羧酸基的盐,而且指氨基的加成盐。羧基的盐可以以本身已知的方式制备并且包括无机盐,如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐,还包括有机碱(例如胺,如三乙胺,精氨酸、赖氨酸、哌啶等)的盐。酸加成盐,如与无机酸(如盐酸或硫酸)和有机酸(如乙酸和草酸)形成的盐也是本发明的主旨。
使用公知的技术,还可以基于官能酸性侧基或它们的N-或C-末端制备本发明的酶的“功能衍生物”。此类衍生物包括例如可以通过与氨或者与伯胺或仲胺反应得到的羧基的脂族酯、羧基的酰胺;通过与酰基反应制备的游离氨基的N-酰基衍生物;或者通过与酰基反应制备的游离羟基的O-酰基衍生物。
自然,“功能等价物”还包括可以从其他生物体得到的多肽,和天然发生的变体。例如,可以通过序列比对确定同源序列区,并可以基于本发明的特定要求建立等价酶。
“功能等价物”还包括融合蛋白质,其具有一条天然外消旋酶序列或者从其衍生的功能等价物,并在功能N-或C-末端连接至少一条与其功能不同的其他异源序列(即融合蛋白各部分彼此基本上不具有功能损害)。此类异源序列的非限制性实例为例如信号肽或酶。
本发明还包括的“功能等价物”为天然蛋白质的同源物。这些同源物与天然氨基酸序列之一具有至少60%,优选至少75%,特别是至少85%、90%、95%或99%的同源性,所述同源性通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法计算。本发明同源多肽的同源性百分数具体指基于本发明酶或者酶亚基的一条氨基酸序列的总长度的氨基酸残基同源性百分数。
对于蛋白质糖基化而言,本发明的“功能等价物”包括上述类型的脱糖基化或者糖基化形式和通过改变糖基化模式得到的修饰形式的蛋白质。
通过诱变,例如通过蛋白质的点突变或者截短可以产生本发明蛋白质或者多肽的同源物。
通过筛选突变体(如截短突变体)的组合文库可以鉴定本发明外消旋酶的同源物。例如,可以通过核酸水平的组合诱变(例如通过酶连接合成寡核苷酸的混合物)产生蛋白质变体的多样化文库(variegated library)。有许多方法可用于产生简并寡核苷酸序列的潜在同源物的文库。可以用自动DNA合成仪实施简并基因序列的化学合成,并且可以随后将合成基因连接到适当的表达载体中。使用简并基因集的可以在一个混合物中提供编码潜在蛋白质序列的所需集的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是技术人员已知的(例如,Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等(1984)Science 198:1056;Ike等(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。
本领域已知多种技术可用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物,以及从cDNA文库筛选具有所选特征的基因产物。这些技术可经改变而适于迅速筛选通过组合诱变本发明同源物产生的基因文库。用于筛选经历高通量分析的大基因文库的最常用的技术包括将基因文库克隆到可复制的表达载体,用所得载体文库转化适当的细胞并在一定条件下表达组合基因,在所述条件下,所需活性的检测便于分离编码已经检测其产物的基因的载体。可以与筛选试验组合使用增加文库中功能突变体频率的循环组合诱变(Recursive ensemble mutagenesis,REM)技术,以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89:7811-7815;Delgrave等(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。
D.编码核酸序列
本发明还涉及编码具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶的核酸序列。优选的核酸序列含有来自可以从上述微生物分离的外消旋酶的天然氨基酸序列的核酸序列。
本发明的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,如cDNA和mRNA)可以从核苷酸单位以本身已知的方式通过化学合成产生,例如通过双螺旋的单独重叠互补核酸单位的片段缩合产生。例如,可以以本身已知的方式使用亚磷酰胺方法进行寡核苷酸的化学合成(Voet,Voet,第二版,Wiley Press New York,896-897页)。合成寡核苷酸的退火和通过DNA聚合酶Klenow片段填补缺口,和连接反应以及一般的克隆方法描述于Sambrook等(1989),《Molecular Cloning:A laboratory manual》,ColdSpring Harbor Laboratory Press。
具体地,本发明涉及编码本发明酶之一的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,如cDNA和mRNA)和可例如通过使用人工核苷酸类似物得到的所述核酸序列的功能等价物。
本发明涉及编码本发明多肽或蛋白质或其生物活性片段的分离的核酸分子和可用作例如鉴定本发明编码核酸的杂交探针或扩增本发明编码核酸的引物的核酸片段。
本发明的核酸分子可以还含有来自基因编码区的3’和/或5’末端的非翻译序列。
本发明还包括与描述的核苷酸序列单独互补的核酸分子,或者这种核酸分子的片段。
本发明的核酸序列为产生可以用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物的同源序列的探针和引物提供可能。此类探针和引物通常包含这样的核苷酸序列区,其在严格条件(见下文)下与本发明核酸序列的有义链或者相应反义链的至少约12个,优选至少约25个,如约40、50或75个连续核苷酸杂交。
“分离的核酸分子”与存在于该核酸的天然来源的其他核酸分子分离,并且如果通过重组技术产生则基本上无其他细胞材料或者培养基,或者如果通过化学合成则无化学前体或者其他化学品。
使用分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息可以分离本发明的核酸分子。例如,通过使用具体公开的完整序列之一或者其片段作为杂交探针和标准重组技术(如,描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.《《Molecular Cloning:A Laboratory Manual.》》第二版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989)可以从适当的cDNA文库分离cDNA。此外,使用基于所述序列产生的寡核苷酸引物,可以通过使用聚合酶链式反应分离含有所公开的序列之一的核酸分子,或者这种分子的片段。以这种方法扩增的核酸可以克隆到适当的载体中并通过DNA序列分析鉴定。通过标准合成方法(例如使用自动化DNA合成仪)可以产生本发明的寡核苷酸。
原则上,可以从所有生物体鉴定并分离本发明的核酸序列。可以有利地从上述类型的细菌分离本发明的核酸序列。
例如,使用常规杂交方法或者PCR技术,通过例如基因组文库或者cDNA文库,可以从其他微生物分离本发明的核酸序列或者这些序列的衍生物、同源物或者部分。这些DNA序列与本发明的序列在标准条件下杂交。有利的是使用保守区(例如活性中心)的短寡核苷酸用于杂交,可以通过以本身已知的方式与α-羟基羧酸外消旋酶比较鉴定所述保守区。备选地,本发明的核酸的更长片段,或者完整序列可以用于杂交。这些标准条件依赖于所用的核酸(寡核苷酸、更长片段或者完整序列)或者用于杂交的核酸类型(DNA或RNA)而变化。从而,例如DNA:DNA杂合体的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂合体的解链温度低约10℃。
例如,取决于核酸,标准条件理解为水性缓冲液中42到58℃,浓度为0.1到5×SSC(1×SSC=0.15M NaCl、15mM柠檬酸钠,pH7.2)或者还存在50%甲酰胺,如42℃ 5×SSC、50%甲酰胺中。对于DNA:DNA杂合体,杂交条件有利地为0.1×SSC和约20℃到45℃的温度,优选约30℃到45℃。对于DNA:RNA杂合体,杂交条件有利地为0.1×SSC和约30℃到55℃的温度,优选约45℃到55℃。已经陈述的这些关于杂交的温度是解链温度,其是根据例如长度约100个核苷酸并且G+C含量为50%,在不存在甲酰胺的条件下计算得到的。DNA杂交的实验条件描述于相关遗传学教科书中,例如Sambrook等,《Molecular Cloning》,Cold SpringHarbor Laboratory,1989,并且可以使用技术人员公知的公式计算,例如作为核酸长度、杂合体类型或者G+C含量的函数计算。关于杂交的其他信息,技术人员可见于以下教科书:Ausubel等编,1985,《Current Protocolsin Molecular Biology》,John Wiley & Sons,New York;Hames和Higgins编,1985,《Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach》,IRL Pressat Oxford University Press,Oxford;Brown编,1991,《Essential MolecularBiology:A Practical Approach》,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。
本发明还涉及具体公开的衍生物或可衍生的核酸序列。
从而,本发明的其他核酸序列可以从天然序列衍生并且通过加入、替换、插入或者缺失一个或多个核苷酸而与天然序列不同,但是仍然编码具有所需特性谱的多肽。
本发明还包括这样的核酸序列,其作为天然发生的变体(如剪接变体或者等位基因变体),与具体提到的序列相比含有沉默突变或者根据特定来源或者宿主生物的密码子选择而经修饰。
通过保守核苷酸替换得到的序列(即所述氨基酸由具有相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸替换)也是主旨。
本发明还涉及通过序列多态性衍生自具体公开的核酸的分子。这些遗传多态性可以由于天然变异存在于群体的个体内。这些天然变异通常引起基因的核苷酸序列中1到5%的变化。
本发明的核酸的衍生物理解为指例如在所推导的氨基酸水平上,在整个序列区具有40%同源性,优选60%同源性,非常特别优选至少80%同源性的等位基因变体(对于氨基酸水平的同一性,可以参考上述关于多肽的解释)。有利地,在序列的部分区域同源性水平可以更高。
衍生物也可以理解为指本发明核酸序列的同源物,例如,编码和非编码序列的真菌或细菌同源物、截短的序列、单链DNA或RNA。从而,例如,SEQ ID NO:1的同源物在DNA水平上与SEQ ID NO:1中所述的完整DNA区域具有至少40%的同源性,优选至少60%的同源性,特别优选至少70%的同源性,极其优选至少80%同源性。
此外,衍生物理解为指例如与启动子的融合物。上述核苷酸序列前的启动子可以通过一个或多个核苷酸替换、插入、倒位和/或缺失而被修饰,但是所述修饰对启动子的功能性或效力没有不利的影响。此外,可以通过修饰启动子的序列或者通过更有效的启动子(包括来自异源生物的启动子)的完全替换来增加启动子的效力。
衍生物还理解为指以改变(优选增加)基因表达和/或蛋白质的方式修饰核苷酸序列起始密码子上游-1到-1000碱基或者终止密码子下游0到1000个碱基的区域的变体。
本发明还涉及在“严格条件”下与上述编码序列杂交的核酸序列。当筛选基因组文库或者cDNA文库时,可以鉴定这些多核苷酸,并且(如果适当的话)可以使用适当的引物通过PCR扩增所述多核苷酸,并例如使用适当的探针随后将其分离。此外,还可以化学合成本发明的多核苷酸。该特征理解为指在严格条件下多或寡核苷酸结合几乎互补的序列的能力,而在这些条件下在非互补配偶体之间没有非特异性结合。为此,序列应该具有70-100%,优选90-100%的互补性。互补序列能够特异相互结合的特性被用于例如RNA印迹或DNA印迹技术或者就引物结合而言用于PCR或者RT-PCR中。通常,具有30个碱基对或更长的寡核苷酸用于该目的。例如,在RNA印迹技术中,严格条件理解为指使用温度为50-70℃,优选60-65℃的洗涤溶液,例如具有0.1%SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC:3M NaCl、0.3M柠檬酸钠,pH7.0)用于洗脱非特异杂交的cDNA探针或者寡核苷酸。在该情况中,如上述提到的,仅具有高度互补性的核酸保持相互结合。严格条件的建立为技术人员已知并且描述于例如Ausubel等,《Current Protocols in Molecular Biology》,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。
E.本发明的构建体
本发明还涉及表达构建体,其含有处于调节性核酸序列遗传控制下的编码本发明酶的核酸序列,还涉及含有至少一种这些表达构建体的载体。
本发明的此类构建体优选包含特定编码序列的5’上游的启动子和3’下游的终止子序列,并且适当时还包含在每种情况下与编码序列有效连接的常规调节元件。
“有效连接”理解为指启动子、编码序列、终止子和适当的其他调节元件顺序排列使得每个调节元件能够在编码序列的表达中服从计划的功能。能够有效连接的序列的实例为靶向序列,以及启动子、多腺苷酸化位点等。其他调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等等。适当的调节序列描述于例如Goeddel,《Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185》,Academic Press,San Diego,CA(1990)。
本发明的核酸构建体理解为具体指天然α-羟基羧酸外消旋酶基因和其衍生物和同源物,它们与一种或多种调节信号有效或功能性连接,所述调节信号有利地用于控制基因表达,例如增加基因表达。
除了这些调节序列,这些序列的天然调节仍然可以存在于实际结构基因之前,适当的话,可以经遗传修饰,从而关闭天然调节被并增加基因的表达。然而,在构建中核酸构建体可以更简单,也就是说在编码序列之前没有插入额外的调节信号并且没有除去天然启动子以及其调节。相反的是,以不再发生调节并增加基因表达的方式突变天然调节序列。
优选的核酸构建体还有利地含有与启动子有效连接的一个或多个上述增强子序列,其使得核酸序列的表达可能增强。在DNA序列的3’末端,也可以插入额外的有利序列,如其他调节元件或者终止子。构建体中可以存在本发明核酸的一个或多个拷贝。适当的话,可以存在用于构建体选择的其他标记,如抗生素抗性或者营养缺陷型互补基因。
本发明方法的有利的调节序列存在于例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR或λ-PL启动子之类的启动子中,这些序列优选用于革兰氏阴性细菌中。其他有利的调节序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中,以及酵母或者真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。人工启动子也可以用于调节。
为了在宿主生物中表达,有利地将核酸构建体插入载体(例如质粒或者噬菌体)中,这使得基因在宿主中可以最佳表达。载体被理解为指除了质粒和噬菌体外还包括技术人员公知的所有其他载体,也就是说,例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体能够在宿主生物中自主复制或随染色体复制。这些载体组成了本发明的另一实施方案。适当的质粒为例如在大肠杆菌中为pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI、在链霉菌中为plJ101、plJ364、plJ702或pIJ361、在芽孢杆菌(Bacillus)中为pUB110、pC194或pBD214、在棒杆菌(Corynebacterium)中为pSA77或pAJ667、在真菌中为pALS1、plL2或pBB116、在酵母中为2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或在植物中为pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。上述提到的质粒是可能质粒的一小部分。其他质粒是技术人员熟知的并且可见于例如书籍《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等编,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)。
为了表达存在的其他基因,核酸构建体有利地还含有用于增强表达的3’-和/或5’-末端调节序列,并且根据所选的宿主生物和一种或多种基因,选择此类序列用于最佳表达。
这些调节序列旨在使基因的特异表达和蛋白质表达成为可能。取决于宿主生物,这可以指例如基因仅在诱导后表达或过表达,或者基因直接表达和/或过表达。
调节序列或者因子可以优选对所导入基因的基因表达具有正效应,从而增强基因表达。因此,通过使用强转录信号(如启动子和/或增强子)可以在转录水平上有利地发生调节元件的增强。然而,例如通过提高mRNA的稳定性也可以增强翻译。
在载体的另一实施方案中,还可以有利地将含有本发明的核酸构建体或者本发明的核酸的载体以线性DNA的形式导入微生物和通过异源或者同源重组整合到宿主生物的基因组。该线性DNA可以由线性化的载体(如质粒组成),或者仅由本发明的核酸构建体或者核酸组成。
对于异源基因在生物体中的最优表达,有利地根据生物体中使用的特定密码子选择修饰核酸序列。用计算机评估有关生物的其他公知基因可以容易地确定密码子选择。
通过将适当的启动子与适当的密码子核苷酸序列和终止子信号或者多腺苷酸化信号融合可以制备本发明的表达盒。描述于例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)和T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,《Experiments with Gene Fusions》,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)和Ausubel,F.M.等,《Current Protocols in Molecular Biology》,GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中的常规重组和克隆技术用于该目的。
为了在适当的宿主生物中表达,将重组核酸构建体或者基因构建体有利地插入宿主特异的载体,这使得基因在宿主中的最佳表达成为可能。载体是技术人员公知的并且可以见于例如,《Cloning Vectors》(Pouwels P.H.等编,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)。
F.可以根据本发明使用的宿主
本发明的载体提供重组微生物的产生,所述重组微生物由例如本发明的至少一种载体转化,并且可以用于产生本发明的酶。将上述本发明的重组构建体有利地导入适当的宿主系统,所述重组构建体在该宿主系统中表达。在该上下文中,使用技术人员熟悉的克隆和转染方法,如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等,以便在有关表达系统中表达上述核酸。适当的系统描述于例如《Current Protocols in Molecular Biology》,F.Ausubel等编,Wilev Interscience,New York 1997或Sambrook等《Molecular Cloning:A Laboratory Manual.》第二版,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989。
可以根据本发明制备已经经历同源重组的微生物。为此,制备含有本发明基因或者编码序列的至少一个片段的载体,适当的话,向所述片段引入至少一个氨基酸缺失、添加或者替换以修饰(例如功能性破坏)本发明的序列(“敲除”载体)。所导入的序列可以例如是相关微生物的同源物或者来源于哺乳动物、酵母或者昆虫来源。然而,还可以如此设计用于同源重组的载体使得同源重组时内源基因受到突变或者被修饰,而仍然编码功能蛋白质(例如,可以以改变内源蛋白质表达的方式修饰上游调节区)。本发明基因的修饰片段存在于同源重组载体中。用于同源重组的适当载体的构建描述于例如Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.(1987)Cell 51:503。
原则上为所有原核或者真核生物都适合为本发明核酸或者核酸构建体的重组宿主生物。微生物(如细菌、真菌或者酵母)用作宿主生物是有利的。有利地使用革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌。特别优选大肠杆菌属和种。
本发明的一种或多种宿主生物优选含有至少一种描述于本发明并且编码具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶的核酸序列、核酸构建体或者载体。
取决于宿主生物,以技术人员熟悉的方式培养或生长用于本发明方法的生物。通常,微生物生长在温度为0℃到100℃(优选10℃到60℃)并且通以氧的液体培养基中,所述培养基含有碳源(通常为糖的形式)、还含有氮源(通常为有机氮源,如酵母提取物,或者盐,如硫酸铵的形式),还含有微量元素(如铁盐、锰盐、镁盐),适当的话,还含有维生素。液体营养培养基的pH可以保持恒定,即在培养期可以调节,或不调节。可以分批、半分批或者连续培养微生物。可以在发酵开始提供营养物或者半连续或连续补加营养物。可以在培养期期间或者有利地在之后直接加入酮。可以通过实施例中描述的方法从生物体分离酶或者以粗提物形式用于反应。
G.本发明酶的重组产生
本发明还涉及重组产生本发明多肽或者其功能性生物活性片段的方法,在所述方法中,培养产生多肽的微生物,并诱导多肽的表达,适当的话,还从培养物分离多肽。如果需要,还可以以该方式在工业规模上生产多肽。
可以通过公知的方法培养和发酵重组微生物。可以在例如TB或者LB培养基中,20到40℃温度下和6到9的pH值下繁殖细菌。适当的个别培养条件描述于例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,《MolecularCloning:A Laboratory Manual》,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1989)。
除非多肽被分泌到培养基,否则破坏细胞并通过公知的蛋白质分离方法从裂解物得到产物。可以通过高频超声、高压(如在弗氏压碎器中),通过渗透裂解、通过允许的去污剂、裂解酶或者有机溶剂作用于细胞,通过匀浆器或者通过上述几种方法的组合来破坏细胞。
可以用已知的层析方法纯化多肽,所述方法为诸如分子筛层析(凝胶过滤),Q-sepharose层析、离子交换层析和疏水层析,或者通过其他常规方法,如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳等方法纯化。适当的方法描述于例如,Cooper,F.G.,Biochemische Arbeitsmethoden《methodsin Biochemistry》,Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York或Scopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin。
为了分离重组蛋白质,可以有利地使用载体系统或者寡核苷酸,其通过特异核苷酸序列延长cDNA,从而编码可用于例如简化纯化的修饰的多肽或者融合蛋白质。此类适当的修饰为例如以已知作为锚的“标签”,例如,称为6组氨酸锚的修饰或者作为抗原可以被抗体识别的表位的修饰(描述于例如Harlow,E.和Lane,D.,1988,《Antibodies:A Laboratory Manual.》,Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)中。这些锚可以用于将蛋白质附着到固相支持物(如可用于例如填充层析柱的聚合物基质),或者附着到微量滴定板或者任何其他支持物。
这些锚同时可用于鉴定蛋白质。此外,与底物反应后形成可检测的反应产物的常规标签(如荧光染料、酶标签)或者放射性标记单独或与锚组合可以用于鉴定蛋白质,以便衍生蛋白质。
H.本发明酶的非重组分离
可以从上述天然来源(乳杆菌属株系)或者从表达α-羟基羧酸外消旋酶活性并且已经借助于本发明筛选方法鉴定的另一微生物方便地分离本发明的酶。
可以通过已知方法培养和发酵微生物。除非多肽被分泌到培养基,否则破坏细胞并通过公知的蛋白质分离方法从裂解物得到产物。可以通过高频超声、高压(如在弗氏压碎器中),通过渗透裂解、通过允许的去污剂、裂解酶或者有机溶剂作用于细胞,通过匀浆器或者通过上述几种方法的组合来破坏细胞。
可以用已知的层析方法纯化多肽,所述方法为诸如分子筛层析(凝胶过滤),Q-sepharose层析、离子交换层析和疏水层析,或者通过其他常规方法,如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳等方法纯化。适当的方法描述于例如,Cooper,F.G.,Biochemische Arbeitsmethoden《methodsin Biochemistry》,Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York或Scopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin。
I.实施本发明的方法以异构化α-羟基羧酸
具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶可以作为游离酶或者固定化酶用于本发明的方法中。
有利地在0℃到95℃,优选10℃到85℃,特别优选15℃到75℃,特别是25到40℃温度下实施本发明的方法。
本发明方法的pH值有利地保持在pH4到12,优选pH4.5到9,特别优选pH5到8。
本发明的方法可以利用包含本发明的核酸、核酸构建体或者载体的生长的细胞。备选地,可以使用休眠或者破碎的细胞。破碎的细胞理解为指例如通过用溶剂处理使得已可以渗透的细胞,或者通过酶处理、机械处理(例如弗氏压碎或者超声)或者通过任何其他方法破碎的细胞。这样得到的粗提物有利地适于本发明的方法。完全或部分纯化的酶也可以用于所述方法。固定化微生物或者酶同样适宜,并且它们可以有利地用于反应。
如果本发明方法使用自由生物体或者固定化酶,在提取步骤前方便地分离它们,例如通过过滤或者离心分离。
以本发明的方法制备的产物可以有利地通过提取或者过滤从水性反应溶液回收。可以重复提取步骤数次以便增加得率。适当的提取剂的实例为技术人员熟悉的常规溶剂,如甲苯、二氯甲烷、二异丙基醚、苯、MTBE或乙酸乙酯,它们不具有限制性。
浓缩有机相后,通常可以以良好的化学纯度,即大于80%的化学纯度回收产物。然而,提取后,含有产物的有机相还可以部分浓缩并且结晶出产物。为此,有利地将溶液冷却到0℃到10℃的温度。然而,还可以直接从有机溶液或者从水性溶液实现结晶。结晶出的产物可以再次以相同或不同的用于重结晶的溶剂吸收和重结晶。
本发明的方法可以分批式、半分批式或者连续操作。
可以有利地在生物反应器中实施所述方法,如Rehm等编(1993)《Biotechnology》,第二版,第3卷(特别是第二章)描述的生物反应器。
K.本发明的进一步纯化
本发明打开了本发明异构化反应的多种其他可能的应用。可以提及以下不具有任何限制性的实例:
a)取出所需的产物后外消旋化α-羟基羧酸,以便循环常规外消旋物分离中不需要的立体异构体。优点是纯粹的酶外消旋反应;相比,化学催化的外消旋反应通常在激烈反应条件下反应,所述激烈反应条件导致分解、形成次级产物和副反应(消去等等)。(也比较:Kontrollierte Racemisierung von organischenVerbindungen[有机化合物的受控外消旋化]:E.J.Ebbers,G.J.A.Arians,J.P.M.Houbiers,A.Bruggink,B.Zwanenburg,Tetra-hedron,1997,53,9417-9476)。
b)α-羟基羧酸的逐步去外消旋。如果在(化学和酶催化的)对映选择步骤中以“单罐方法”不能直接使用外消旋酶(例如由于所需的反应条件),那么可以在对映选择步骤后实施酶促外消旋化而不分离对映异构体产物(参考:使用扁桃酸外消旋酶的类似实例:U.T.Strauss,K.Faber,Tetrahedron:Asymmetry,1999,10,4079-4081)。
c)相应于在“单罐方法”中直接组合外消旋酶与化学和生物催化步骤的应用的理想例子,所述“单罐方法”称作“动态外消旋物分离”。这些方法复杂并且非常有效。
以下提及的是可以作为与本发明的外消旋化组合的对映选择步骤的实例:
(i)脂肪酶催化的酯化,例如,酰基转移反应(U.T.Strauss,K.Faber,Tetrahedron:Asymmetry,1999,10,4079-4081)。
(ii)脂肪酶或蛋白酶催化的酰胺形成(F.van Rantwijk,M.A.P.J.Hacking,R.A.Sheldon,Monats.Chem./Chem.Monthly,2000,131,549-569.)
上述的描述和下面的实施例仅仅意在阐明本发明。技术人员显而易见的许多可能的修改也在本发明的范围内。
实施例
A.一般信息
1.所用设备和方法
薄层层析
通过薄层层析监测反应和检查产物的纯度。来自Merck的铝箔上的硅胶60F254用于该目的。通过紫外线(254mm)并通过喷洒钼酸盐溶液[H2SO4(10%)中的(NH4)6Mo7O24×4H2O(100g/l)和Ce(SO4)2×4H2O(4g/l)],然后加热来检测。
柱层析
通过柱层析纯化外消旋产物。来自Merck的颗粒大小为43-64μm的硅胶用作该目的的固定相。石油醚(PE)和乙酸乙酯(EA)的混合物用作洗脱剂,调节组成以适于有关的分离问题。在高压下实施分离。
气相色谱
使用Varian气相色谱3800-分裂/不分裂注射器(FID)实施外消旋产物的气相色谱分离。所用的柱子是Chirasil-DEX,Chrompack,聚异丁烯-β-环糊精,化学结合的,25m×0.32mm×0.25μm,H2。适当的分离条件在下面的表1中显示。
表1:使用手性GC分离对映异构体
化合物 | 入口压力[psi] | 温度程序[℃] | 保留时间[分钟] |
乳酸 | 12 | 45℃ | 4.6(R)6.0(S) |
苯基乳酸 | 12 | 125℃ | 7.5(R)8.5(S) |
4-氟苯基乳酸 | 12 | 80℃/0-5℃/分钟170℃ | 12.0(R)12.5(S) |
NMR
使用Bruker 360和500MHz记录1H-和13C NMR光谱;化学位移以ppm(δ刻度)显示;四甲基硅烷(TMS)用作内标。
HPLC
通过JASO HPLC系统PU-980型泵和MD 910UV检测器测定e.e值。DAICEL Chiralpack AD(0.46cm×25cm)柱用于分离。
熔点
使用MPD 350.BML.5(GALLENKAMP)测定熔点。
2.微生物学方法和材料
2.1生长和培养
细菌株系
表2包含所研究的株系、它们的培养条件和它们的保藏号的列表。
表2:所研究的细菌株系的生长条件
株系 | DSM号 | 培养基 | 温度 |
L.haloferaxvolcanii | 5176 | 372 | 37℃ |
L.haloarculavallismortis | 3756 | 372 | 37℃ |
副干酪乳杆菌 | 20008 | 11 | 37℃ |
副干酪乳杆菌 | 20207 | 11 | 30℃ |
副干酪乳杆菌 | 2649 | 11 | 30℃ |
嗜酸性乳酸菌(L.acidophilus) | 20079 | 11 | 30℃ |
短乳杆菌(L.brevis) | 20054 | 11 | 30℃ |
L.piscicola | 20722 | 92 | 30℃ |
L.halotolerans | 20190 | 11 | 30℃ |
L.confusus | 20196 | 11 | 30℃ |
L.acetotolerans | 20749 | 231 | 30℃ |
L.delbrueckiissp.delbrueckii | 20074 | 11 | 37℃ |
L.kandleri | 20593 | 11 | 30℃ |
L.fructosus | 20349 | 11 | 30℃ |
L.farciminis | 20184 | 11 | 30℃ |
格氏乳杆菌(L.gasseri) | 20243 | 11 | 37℃ |
L.alimentarius | 20249 | 11 | 30℃ |
詹氏乳杆菌(L.jensenii) | 20557 | 11 | 37℃ |
弯曲乳杆菌(L.curvatus) | 20010 | 11 | 30℃ |
L.sakei ssp.sakei | 20017 | 11 | 30℃ |
L.oris | 4864 | 11 | 37℃ |
株系保持
通过将细胞在特定冷冻溶液中冷冻保持株系。为此,将培养物转移到无菌离心管中并以8000转/分钟在4℃离心30分钟,倒出上清液。之后,将细胞悬浮在冷冻溶液中,转移到无菌瓶中并在-70℃保持。所用的冷冻溶液为按体积计20%的DMSO溶液或者按重量计0.7%的NaCl水溶液(Slkner),或者含有按体积计为H2O的5%的甘油(Weigers)。
生长株系
培养物生长在烘箱中30℃或37℃下(取决于细菌株系)的1000ml锥形瓶中。对于每种细菌株系,将1升相关的无菌培养基首先分到4个瓶中并对于每种情况接种事先解冻的500μl细胞溶液。在层流清洁工作台(Heraeus“Herasafe”,HS9型)中进行所述方法的所有无菌步骤。
收获细胞
取决于细菌株系,3到15天的生长期后,收获细胞。为此,将培养物转移到离心管中并以8000转/分钟在4℃下离心20分钟,并倒出上清液。为了洗涤细胞,将它们悬浮在约40ml缓冲液(50mM Bis-Tris,0.01MMgCl2,pH=6)中并再离心20分钟。进行两次洗涤步骤。随后将细胞重悬浮在少量缓冲液中,转移到圆底烧瓶并休克冷冻。这通过将烧瓶在装有液氮的Dewar容器中旋转完成。在Braun(“Christα1-4”)的冻干机中实施冷冻干燥。将冻干的细胞转移到玻璃瓶中并保存在冰箱中备用。
2.2营养培养基和灭菌
推荐使用细菌株系的相关营养培养基用于生长微生物。接种前将培养基通过高压灭菌(Varioklav蒸汽灭菌器,H+P Labortechnik GmbH,Munich)在121℃和1巴的超级大气压下灭菌。
培养基11
培养基11用于下面细菌株系的营养培养基:
副干酪乳杆菌、嗜酸性乳杆菌、短乳杆菌、L.halotolerans、L.confusus、L.farciminis、格氏乳杆菌、L.alimentarius、詹氏乳杆菌、德氏乳杆菌、弯曲乳杆菌、L.sakei ssp.Sakei、L.kandeleri和L.fructosus。
表3显示了培养基的组成。为了防止可能的Millard反应和盐沉淀,将培养基组分分开灭菌并仅在灭菌后合并。当诸如还原性糖的化合物与氨基酸和蛋白质反应时发生Millard反应,其导致培养基颜色变深。
表3:培养基11的组成
物质 | 浓度[g/l] |
酪蛋白蛋白胨(Oxoid) | 10.00 |
蛋白胨(Oxoid) | 10.00 |
酵母提取物(Oxoid) | 5.00 |
葡萄糖 | 20.00 |
K2HPO4 | 2.00 |
三水合乙酸钠 | 8.00 |
柠檬酸铵 | 2.00 |
MgSO4×7H2O | 0.20 |
MnSO4×H2O | 0.05 |
Tween 80 | 1.00 |
培养基231
培养基231与培养基11仅在pH值上不同,将培养基231用于L.acetotolerans。将表3中所列组分合并然后灭菌,并调节pH到5.2。
培养基92
培养基92用于L.piscicola。它们的组成示于表4中。
表4:培养基92的组成
物质 | 浓度[g/l] |
大豆提取物,胰蛋白酶消化(Oxoid) | 30.00 |
酵母提取物(Oxoid) | 3.00 |
培养基372
培养基372用于株系Haloferax volcanii和Haloarcula vallismortis。
表5:培养基372的组成
物质 | 浓度[g/l] |
酵母提取物(Oxoid) | 5.00 |
酪蛋白氨基酸(Oxoid) | 5.00 |
谷氨酸钠(Oxoid) | 1.00 |
KCl | 2.00 |
柠檬酸钠 | 3.00 |
MgSO4×7H2O | 20.00 |
NaCl | 200.00 |
FeCl2×4H2O | 0.036 |
MnCl2×4H2O | 0.00036 |
B.进行的实验
实施例1:底物和标准物质的合成
a)对映异构纯的2-羟基-3-苯丙氨酸的合成
反应混合物:将1g对映异构纯的苯丙氨酸(6.05mmol)溶于12mlH2SO4(1M)中。分批加入1.66g(24mmol)冰冷的NaNO2。加入后,除去冷却系统并在室温下持续过夜搅拌反应混合物。
步骤(Work-up):在每种情况下,将水性溶液用4ml乙醚萃取3次,用饱和氯化钠溶液洗涤有机相,并用乙醚再次萃取氯化钠溶液。合并有机相并用Na2SO4干燥并在Rotavapor上蒸发溶剂。用2ml己烷处理黄色油状残渣并通过用玻璃棒刮削结晶。形成白色晶体沉淀。用约2ml己烷洗涤晶体三次,并在旋转蒸发器上蒸发剩余溶剂。
旋光性(文献):(S)-苯基乳酸:[α]=D 25=-20.8(c=2,H2O)
(R)-苯基乳酸:[α]=D 25=+20.9(c=2.3,H2O)
b)外消旋-4-氟苯基乳酸rac-3的合成
反应混合物:400mg(2.2mmol)rac-4-氟苯丙氨酸,670mg(9.7mmol)NaNO2溶于4.8ml H2SO4(1M)中。
产量:197mg(49.0%),白色晶体
1 H-NMR:(360MHz,CDCl3)δ=2.97(1H,dd,J1=7.2Hz,J2=14.4Hz,CH2);3.17(1H,dd,J1=3.6Hz,J2=14.4Hz,CH2);4,49(1H,dd,J1=3.6Hz,J2=6.1Hz,CH-OH);6.98-7.02(2H,m,Ar);7.20-7.28(2H,m,Ar).
13 C-NMR:(90MHz,CDCl3)δ=39.2(CH2);70.9(CH-OH);115.3(d,J=21.6Hz,Ar-m);130.9(d,J=21.6Hz,Ar-o);131.6(d,J=3.6Hz,Ar-i);162.1(d,J=243.9Hz,Ar-p);178.1(COOH)。
TLC数据:溶剂:EA;RF=0.35
熔点:73℃
c)(S)-4-氟苯基乳酸-(S)-3d的合成
反应混合物:452mg(2.5mmol)(S)-4-氟苯丙氨酸,750mg(10.9mmol)NaNO2,溶于5.4ml H2SO4(1M)中。
产量:330mg(72.5%),白色晶体
1 H NMR:见外消旋-4-氟苯基乳酸
13 C NMR:见外消旋-4-氟苯基乳酸
TLC数据:EA;RF=0.35
熔点:69℃
从相应的可通过商业途径获得的对映异构纯的氨基酸开始,类似于实施例1合成化合物
(S)-(+)-2-羟基-3-甲基丁酸
(S)-(-)-2-羟基-4-甲基戊酸
(S)-2-羟基-4-苯基丁酸
(S)-2-羟基-3-苯基丙酸。
实施例2:筛选外消旋酶活性
为了得到关于微生物的外消旋活性的第一指示,观察它们对(天然)底物(S)-乳酸1和/或(非天然)底物(S)-苯基乳酸2和(S)-4-氟苯基乳酸3的外消旋化。
为了筛选,将约10mg冻干细胞在Eppendorf瓶中的900μl Bis-Tris缓冲液(50mM Bis-Tris,pH=6)在42℃和150转/分钟下再水化1小时。然后,对于每种情况加入10mg底物,其已经事先溶于100μl缓冲液中并用NaOH调节到pH6-7。在摇床培养箱中以42℃和150转/分钟温育反应混合物。与每个反应混合物平行测量空白值,在空白中保持相同反应条件但是不加入细胞。由于所有对照实验都是阴性,所以可排除这些给定反应条件下的自发外消旋化。
在摇床培养箱中1或2天后,以13000转/分钟离心Eppendorf瓶5分钟并且对于每种情况随后取出400μl上清液。对每种情况用600μl EA摇动萃取溶液两次并合并有机相后用Na2SO4干燥,在旋转蒸发器上蒸发溶剂。为了实现用手性柱对两种对映异构体的分离,需要对所有研究的化合物进行衍生。为此,将每个样品用500μl BF3-甲醇处理,60℃下摇动10分钟并通过用1ml CH2Cl2摇动进行萃取。用Na2SO4干燥有机相并浓缩到约100μl体积。
当2天后对映异构体过量>95%,那么认为外消旋反应是阴性(-)的,对映异构体过量<20%被评估为阳性(+)。任何其他结果得到得分(~)。筛选结果编辑于表6。
表6:活性筛选的结果
微生物 | DSM号 | 底物 | ||
(S)-1 | (S)-2 | (S)-3 | ||
副干酪乳杆菌 | 20008 | + | + | + |
副干酪乳杆菌 | 20207 | + | + | + |
副干酪乳杆菌 | 2649 | - | + | + |
嗜酸乳杆菌 | 20079 | n.d. | - | - |
短乳杆菌 | 20054 | + | - | - |
L.piscicola(L.carnis) | 20722 | n.d. | - | - |
L.halotolerans | 20190 | + | - | - |
L.confusus | 20196 | - | - | - |
L.acetotolerans | 20749 | + | ~ | - |
德氏乳杆菌 | 20074 | + | + | + |
L.kandeleri | 20593 | n.d. | - | - |
L.fructosus | 20349 | - | - | - |
L.farciminis | 20184 | - | ~ | - |
格氏乳杆菌 | 20243 | n.d. | - | - |
L.alimentarius | 20249 | + | - | - |
詹氏乳杆菌 | 20557 | + | - | - |
L.halofaxvolcanii | 5176 | n.d. | - | - |
L.haloarculavasllismortis | 3756 | n.d. | - | - |
+=良好活性 -=无活性 ~=中等活性 n.d.=未测定
实施例3:用多种底物测定对映异构体过量
为了测定对映异构体过量,按照实施例2的操作,只是所用细胞的量减少到50mg。
a)用L-(-)-3-苯基乳酸作为底物的实验
首先,将50mg冻干的细胞用1ml Bis-Tris缓冲液(50mM,pH6)处理并在摇床培养箱中42℃℃和150转/分钟下再水化1小时。之后,对于每种情况,加入溶于100μl缓冲液中的5mg底物并在摇床培养箱中(30℃,150转/分钟)孵育混合物。在每种情况中24或48小时后通过手性GC测量所有样品。为了实现通过GC的对映异构体分离,样品需要衍生化。
用BF3-甲醇(见上文)或者三氟乙酸酐进行衍生。对于用三氟乙酸酐衍生,将5mg 3-苯基乳酸溶于500μl CH2Cl2中,用5滴三氟乙酸酐处理,在室温下摇动1分钟,随后用约500μl H2O处理。用Na2SO4干燥有机相,然后通过GC在手性柱上测量样品。
用下面的公式计算结果:
ee[%]:(R-S)/(R+S)×100
转化率[%]:R/(R+S)×100
外消旋[%]:2R(R+S)×100
除了株系Lactobacillus paracasei subsp.paracasei DSM 20008,还发现了下面的株系对L-(-)-3-苯基乳酸具有良好或者极好的外消旋酶活性:
Lactobacillus paracasei subsp.paracasei DSM 2649
Lactobacillus paracasei subsp.paracasei DSM 20207
Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii DSM 2649
Lactobacillus oris DSM 4864
上述株系的结果编辑于表7中并且显示为培养条件组(摇床或者烘箱;氩气或者天然大气)和培养时间组。
表7:用L(-)-苯基乳酸的筛选结果
株系的DMS号收获时天数 | 烘箱(氩气) | 摇床(空气) | 烘箱(氩气) | ||||||||||||||||
24h | 48h | 24h | 48h | 24h | 48h | ||||||||||||||
ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ||
2649 | 3 | 80 | 10 | 20 | 49 | 26 | 51 | 69 | 15 | 31 | 51 | 24 | 49 | 77 | 12 | 23 | 0 | 50 | 100 |
4 | 14 | 43 | 86 | 0 | 50 | 100 | |||||||||||||
20207 | 3 | 8 | 46 | 92 | 0 | 50 | 100 | ||||||||||||
4 | 65 | 17 | 35 | 46 | 26 | 54 | 17 | 41 | 83 | 0 | 50 | 100 | |||||||
2007 | 3 | 83 | 8 | 16 | 64 | 18 | 36 | - | - | - | - | - | - | 13 | 43 | 87 | 0 | 50 | 100 |
4864 | 4 | 23 | 38 | 77 | 0 | 50 | 100 | 70 | 15 | 30 | 45 | 27 | 55 | ||||||
20008 | 3 | 0 | 50 | 100 | 0 | 50 | 100 | 0 | 50 | 100 | 0 | 50 | 100 |
为了测定所观察的外消旋酶活性是否与乳酸外消旋酶活性相关,将天然底物L-(+)-乳酸与株系反应,揭示对L-(-)-3-苯基乳酸的好到极好的活性。
当允许DSM 20207、20074和20008转化天然底物L-(+)-乳酸时,少至24小时就可以检测到100%外消旋化。
用株系DMS2649没有得到转化。
b)用多种其他烷基底物进行的实验
用下面的作为底物:
(S)-(+)-羟基-3-甲基丁酸(C5H10O3)
(S)-(-)-2-羟基异己酸(C6H12 O3)
将这两种底物与所有株系反应。对每种情况在24小时和48小时后通过GC测量外消旋化程度。
对于(S)-(+)-羟基-3-甲基丁酸,仅株系DSM 20207表现出活性。共5种株系表现出对底物(S)-(-)-2-羟基异己酸的外消旋。结果编辑于表8和9。
表8:用(S)-(+)-羟基-3-甲基丁酸筛选
株系 | 24小时 | 48小时 | ||||
ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | |
DSM20207 | 86 | 7 | 14 | 73 | 14 | 27 |
表9:用(S)-(-)-2-羟基异己酸筛选
株系 | 24小时 | 48小时 | ||||
ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | |
DSM2649 | 88 | 6 | 12 | 75 | 12 | 25 |
DSM | 85 | 7 | 15 | 82 | 9 | 18 |
20008 | ||||||
DSM20207 | 94 | 3 | 6 | 73 | 14 | 17 |
DSM20074 | 94 | 3 | 6 | 93 | 4 | 7 |
DSM20017 | 86 | 7 | 14 | 89 | 10 | 20 |
总之,再次可以陈述对L-(-)-3-苯基乳酸具有活性的相同株系在此处也表现出活性。
c)用(S)-2-羟基-4-苯基丁酸进行实验
对于每种情况在24小时和48小时后通过HPLC测量外消旋化程度。结果编辑于10中。
表10:用(S)-2-羟基-4-苯基丁酸筛选
株系 | 24小时 | ||
ee[%] | 转化率[%] | 外消旋[%] | |
DSM 2649 | 6 | 47 | 94 |
DSM 20054 | 90 | 5 | 10 |
DSM 20190 | 70 | 15 | 30 |
DSM 20008 | 25 | 38 | 75 |
DSM 20207 | 3 | 48 | 97 |
DSM 20749 | 48 | 26 | 52 |
关于本发明,根据布达佩斯条约的规定在2003年7月11日再次保藏了下面的DSMZ(德意志微生物保藏中心)的微生物,它们是公众可以得到的。
DSM号 | 保藏号 |
20207 | DSM 15755 |
20074 | DSM 15754 |
20017 | DSM 15753 |
4864 | DSM 15752 |
2649 | DSM 15751 |
Claims (22)
1.式I的α-羟基羧酸的微生物异构化方法
式I中,
R为直链或者分支的低级烷基或者低级链烯基或者-(CH2)n-Cyc,其中n为0到4的整数,Cyc为未经取代或单或多取代的、单或二核碳环或杂环,
其中利用α-羟基羧酸外消旋酶活性异构化含有基本上为式(I)α-羟基羧酸的第一种立体异构形似的底物,并且适当的话,分离所得异构体混合物或者所得第二种立体异构体,或者从反应平衡取走所得的第二种立体异构体。
2.权利要求1的方法,其中通过用纯化的酶、含有酶的细胞提取物或者通过在表达具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的至少一种酶的完整细胞存在下转化底物来实现酶促异构化。
3.前面任一项权利要求的方法,其中可以从乳杆菌属或者乳球菌属微生物分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中在乳杆菌属或者乳球菌属微生物的完整细胞或者表达α-羟基羧酸外消旋酶活性的重组微生物的完整细胞存在下实施转化。
5.权利要求4的方法,其中微生物选自副干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、L.sakei和L.oris。
6.权利要求5的方法,其中微生物选自副干酪乳杆菌DSM 20207(DSM 15755)和DSM 2649(DSM 15751)、德氏乳杆菌DSM 20074(DSM15754)、L.sakei DSM 20017(DSM 15753)和L.oris DSM 4864(DSM 15752)菌株。
7.前面任一项权利要求的方法,其中所述酶为异构化至少一种式I的其他α-羟基羧酸的乳酸外消旋酶。
8.前面任一项权利要求的方法,其中酶异构化选自苯基乳酸、4-氟苯基乳酸、2-羟基-4-苯基丁酸、2-羟基-4-甲基戊烷羧酸、2-羟基-3-甲基丁酸的至少一种化合物。
9.表达具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的酶的筛选方法,其中预计表达所述外消旋酶活性的微生物在包含基本上为上述式Iα-羟基羧酸的一种立体异构体形式的底物存在下生长,并检查反应培养基中底物的外消旋。
10.权利要求9的筛选方法,其中筛选权利要求4或5中定义的微生物。
11.权利要求9或10的筛选方法,其中筛选将基本上立体异构体的底物外消旋1到100%的微生物。
12.通过培养微生物并从培养物分离α-羟基羧酸外消旋酶而得到的α-羟基羧酸外消旋酶,所述微生物经权利要求9到11的筛选方法测试为外消旋酶活性呈阳性。
13.权利要求12的α-羟基羧酸外消旋酶,其将上述式I的至少一种α-羟基羧酸外消旋1到100%,优选20到100%,特别是50到100%。
14.核酸序列,其编码至少一种权利要求12或13的α-羟基羧酸外消旋酶。
15.表达载体,其包含权利要求14的编码核酸序列,该序列与至少一种调节核酸序列有效连接。
16.重组原核或者真核微生物,其包含至少一种权利要求14的核酸序列或至少一种权利要求15的表达载体。
17.产生具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法,其中生长权利要求16的重组微生物并从培养物分离所述蛋白质。
18.分离具有α-羟基羧酸外消旋酶活性的蛋白质的方法,其中破碎经测试对外消旋酶活性呈阳性的微生物,除去细胞壁碎片并分离具有所需酶活性的蛋白质。
19.权利要求1到8中任一项的方法,其中从形成的异构体混合物基本上取走所需的立体异构体,并将剩余物进行进一步异构化步骤。
20.权利要求1到8中任一项的方法,其中将形成的异构体混合物进行随后的化学或者酶立体选择反应,并将反应混合物进行进一步异构化步骤。
21.权利要求1到8中任一项的方法,其中异构化反应与随后的化学或者酶对映选择反应耦联,在所述反应期间,从反应平衡取出产生的所需α-羟基羧酸立体异构体。
22.权利要求20或21的方法,其中随后的化学或酶对映选择反应选自α-羟基羧酸的酯化和酰胺化。
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