PT1639119E - Processo para a isomerização microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A ISOMERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ÁCIDOS ALFA—HIDROXICARBOXÍLICOS" A presente invenção refere-se a um processo para a isomerização microbiológica de ácidos alfa-hidroxi-carboxílicos, de acordo com as reivindicações.

Estado da técnica: São conhecidas do estado da técnica as chamadas mandelato-racemases microbianas, que estão em condições de racemizar o ácido mandélico in vivo ou in vitro (G. L. Kenyon, J. A. Gerlt, G. A. Petsko e J. W. Kozarich, "Mandelate Racemase: Structure-Function Studies of a Pseudosymmetric Enzyme", Acts. Chem. Res., 28, 178-186 (1965); R. Li, V. M. Powers, J. W. Kozarich e G. L. Kenyon, "Racemization of

Vinylglycolate Catalized by Mandelate Racemase", J. Org. Chem., 60, 3347-3351 (1995); S. S. Schafeer, A. T.

Kallarakal, J. W. Kozarich, J. A. Gerlt, J. R. Clifton e G. L. Kenyon, "Mechanism of the Reaction Catalized by Mandelate Racemase: The Structure and Mechanistic

Properties of the D270N Mutant", Biochemistry, 35, 5662- 5669 (1996); B. Schnell et al. "Enzymatic Racemization and its Application to Synthetic Biotransformations", Adv. Synth. Catai. 345, 653-666 (2003); U. T. Strauss and K.

Faber, "Deracemization of (+) mandelic acid using a lipase-mandelate racemase two-enzyme System", Tetrahedron:

Assymetry 10: 4079-4081 (1999)). O metabolismo do lactato das bactérias do ácido láctico está descrito em S.-Q Liu, "Practical implications of lactat and pyruvate metabolism by lactic acid bactéria in 2 food and beverage fermentations", Int. J. Food Microbiol. 83, 115-131 (2003). O resumo, publicado posteriormente, de S. M. Gluck et al., "Lactate Racemase as a versatile tool for the racemization of α-hydroxycarbolic acids", Chemicke Listy 97, 363, P121, (2003) menciona a utilização de lactato-racemases para a racemização de alfa-hidroxiácidos.

Ao mesmo tempo, existe uma grande necessidade de uma preparação mais simples de substâncias quirálicas não racémicas, por exemplo, para a produção de substâncias activas na indústria farmacêutica. A racemização, catalisada por enzimas, de uma forma estereoisomérica de um composto com a formação do enantiómero pretendido, representa uma via apropriada para a preparação do material quirálico não racémico pretendido. No entanto, as racemases conhecidas até ao presente são caracterizadas por uma alta especificidade quanto ao substrato. Assim, a mandelato-racemase presta-se simplesmente para a racemização bio-catalítica de ácidos alfa-hidroxicarboxilicos beta,gama-insturados. Os ácidos alfa-hidroxicarboxilicos aturados não são aceites (ver Felfer, U. et al., J. Mol. Catai. B: Enzymatic 15, 213 (2001)).

Breve descrição da invenção: O problema da presente invenção é a revelação de microrganismos e de preparados enzimáticos que possuem uma actividade de racemase de um novo tipo, assim como a revelação de processos para a racemização de compostos químicos estereoisómeros, mediante a utilização destes enzimas ou microrganismos. 3

Surpreendentemente, descobriu-se agora que o presente problema é solucionado pela revelação de um processo para a isomerização microbiológica de ácidos alfa-hidroxi-carboxílicos, de acordo com a reivindicação 1.

Um primeiro objecto da invenção refere-se a um processo para a isomerização microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de fórmula I

em que R representa C2-C8-alquilo ou C2-C8-alcenilo, de preferência C2-C8-alquilo, ou -(CH2)n_Cic, em que n representa um valor em número inteiro de 0 a 4, de preferência 1, 2 ou 3, e Cic representa um anel carbociclico ou heterociclico, com um ou dois núcleos, eventualmente substituídos uma ou mais vezes, como por exemplo, um anel aromático ou heteroaromático eventualmente substituído, de preferência um anel aromático de um núcleo, eventualmente substituído, em que um substrato, que contém essencialmente uma primeira forma isomérica (forma (R) ou (S) ) de um ácido alfa-hidroxicarboxílico de fórmula (I), é isomerizado da forma definida na reivindicação 1, e eventualmente é isolada a mistura de isómeros ((R)/(S)) formada neste caso, ou um segundo estereoisómero (forma (S) ou (R)) formado, ou um segundo estereoisómero formado é eliminado do equilíbrio da reacção. A isomerização enzimática é realizada de preferência por reacção do substrato com um extracto celular que contém enzimas (por exemplo, um extracto bruto posterior à desintegração das células e à eliminação dos fragmentos das 4 células) ou na presença de células inteiras de um microrganismo definido na reivindicação 1.

Os microrganismos especialmente apropriados são bactérias dos géneros Lactobacillus e Lactococcus.

De acordo com uma variante preferida, a reacção é realizada na presença de células inteiras de microrganismos do género Lactobacillus, ou de células inteiras de um microrganismo recombinante, que exprimem uma actividade enzimática definida acima.

Os microrganismos preferidos são escolhidos entre L. paracasei, L. delbrueckii, L. sakei e L. oris, em especial entre as estirpes L. paracasei DSM 20207 e DSM 2649, L. delbrueckii DSM 20074, L. sakei DSM 20017 e L. oris DSM 4864 .

Uma actividade enzimática utilizável de acordo com a invenção compreende, por exemplo, a racemização de pelo menos um composto escolhido entre as formas (R) e/ou (S) de lactato de fenilo, lactato de 4-fluorfenilo, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico, ácido 2-hidroxi-4-metilpenta-carboxilico e ácido 2-hidroxi-3-metilbutirico.

Numa forma de realização preferida do processo anterior, a partir da mistura de isómeros formada, de preferência depois do isolamento da mistura do meio de reacção, por exemplo, por cromatografia, o estereoisómero pretendido é essencialmente eliminado, por exemplo, por cromatografia, reacção secundária estereosselectiva, quimica ou enzimática, e eventualmente a separação posterior do produto secundário, e o residuo, que essencialmente contém 5 o estereoisómero não desejado, é de novo submetido a uma isomerização.

Isto pode ser repetido tantas vezes quantas as necessárias, até se conseguir uma reacção completa ao estereoisómero pretendido, ou até ao seu produto secundário pretendido.

Numa outra variante preferida do processo anterior, a mistura de isómeros formada, de preferência depois do isolamento da mistura a partir do meio de reacção, por exemplo, por cromatografia, é submetido a uma reacção secundária estereosselectiva, quimica ou enzimática, e a mistura reactiva que se forma nestas condições, que também contém o estereoisómero não reagido do ácido hidroxi-carboxilico, é submetido de novo a uma isomerização de acordo com a invenção. Isto pode ser repetido tantas vezes quantas as necessárias, até se conseguir uma reacção completa ao estereoisómero pretendido, ou até ao seu produto secundário pretendido.

Numa outra variante preferida do processo anterior, a reacção de isomerização é acoplada a uma reacção secundária enantiosselectiva, quimica ou enzimática, de preferência a uma chamada "reacção conssecutiva", em que o estereoisómero formado pretendido do ácido alfa-hidroxicarboxílico é eliminado de forma gradual ou continua da reacção no equilíbrio.

As reacções secundárias enantiosselectivas, quimicas ou enzimáticas, preferidas para o passo de isomerização de acordo com a invenção, são escolhidas entre uma esterificação e uma amidação de uma forma estereoisomérica do ácido alfa-hidroxicarboxilico. A reacção secundária 6 enantiosselectiva pode ser realizada em especial num grupo carboxilo ou hidroxilo. 0 processo de acordo com a invenção serve também como processo de selecção para microrganismos que exprimem a actividade enzimática definida acima, em que um microrganismo em que se pressupõe esta actividade, é cultivado na presença de um substrato que contém essencialmente uma forma estereoisomérica de um ácido alfa-hidroxicarboxílico com a fórmula I acima, e o meio reactivo é submetido à racemização do substrato (por exemplo, o decréscimo da quantidade de uma forma estereoisomérica e/ou o acréscimo da outra forma).

Um processo de selecção desta natureza não está limitado a microrganismos especiais. Basicamente pode ser realizado com todos os microrganismos eucarióticos e procarióticos conhecidos, e células animais ou vegetais. São no entanto preferidos os microrganismos que formam ou metabolizam lactatos, como por exemplo, o ácido láctico, ou propionibactérias. As fontes especialmente apropriadas são bactérias do género Lactobacillus. São seleccionados de preferência os microrganismos que racemizam o substrato essencialmente estereoisomérico a 1 até 100%, de preferência a 20 até 100%, em especial a 50 até 100% ou a 80 até 100% (racemização (%) = 2R/ (R+S) χ 100; R = concentração da forma R; S = concentração da forma S) . As taxas de reacção apropriadas situam-se neste caso num intervalo entre 1 e 50%, de preferência entre 5 e 50%, em especial entre 15 e 50% ou entre 30 e 50% (taxa de reacção (%) = R/(R+S) χ 100).

Descrição pormenorizada da invenção: 7 A. Expressões e definições gerais

Se não forem dadas quaisquer outras indicações, são válidos os seguintes significados gerais: "racematos" significam misturas equimoleculares dos dois enantiómeros de um composto opticamente activo; a "racemização" ou "isomerização" é realizada, de acordo com a invenção, no átomo de carbono alfa do ácido hidroxicarboxilico; "halogéneo" significa flúor, cloro, bromo ou iodo, em especial flúor ou cloro; "C2-C8-alquilo" representa de preferência radicais alquilo de cadeia linear ou ramificada com 2 a 8 átomos de carbono, em especial com 2 a 6 átomos, como etilo, isopropilo ou n-propilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo ou t-butilo, n-pentilo ou 2-metil-butilo, n-hexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-etilbutilo; "C2-C8~alcenilo" representa radicais análogos, monoinsaturados ou poli-insaturados, de preferência monoinsaturados, aos radicais alquilo com 2 a 8 átomos de carbono, em especial com 2 a 6 átomos, acima citados, em que a dupla ligação pode estar em qualquer posição da cadeia de carbono; iguais ou "arilo" representa um radical aromático eventualmente substituído, com um ou mais núcleos, de preferência com um ou dois núcleos, em especial fenilo ou um naftilo ligado por qualquer posição do anel, como 1-naftilo ou 2-naftilo. Estes radicais arilo podem eventualmente ser portadores de 1 ou 2 substituintes 8 diferentes, escolhidos entre halogéneo, alquilo inferior, alcoxi inferior de acordo com a definição anterior, ou trifluormetilo. B. Ácidos alfa-hidroxicarboxilicos racemizáveis

De acordo com a invenção, os ácidos alfa-hidroxicarboxilicos susceptiveis de serem submetidos a reacção por racemização, são os que correspondem à fórmula (I) acima, em que R representa alquilo inferior ou alcenilo inferior de cadeia linear ou ramificada ou -(CH2)n-Cic, em que n representa um valor, em números inteiros, de 0 a 4, e cic representa um anel carbociclico ou heterociclico, com um ou dois núcleos, eventualmente substituídos uma ou mais vezes. Estes compostos podem ser racemizados de acordo com a invenção na forma enantiomericamente pura, isto é, como enantiómeros R ou S ou como misturas não racémicas dos dois enantiómeros.

Os ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de fórmula I, utilizados para a sintese enzimática, são compostos conhecidos em si mesmos e podem ser obtidos mediante a utilização de processos da sintese orgânica conhecidos na generalidade.

Como exemplos dos grupos cic carbociclicos ou heterociclicos são de referir, em especial, grupos com um ou dois núcleos, de preferência com um núcleo, que possuem no anel até 4 heteroátomos, como por exemplo, 0, 1 ou 2 heteroátomos iguais ou diferentes, escolhidos entre O, N e S.

Estes anéis carbociclicos ou heterociclicos compreendem, em especial, 3 a 12 e de preferência 4, 5 ou 6 átomos de carbono do anel. Podem mencionar-se como exemplos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, 9 cicloheptilo, os seus análogos insaturados uma ou mais vezes, como ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclopentadie-nilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclohexadienilo, cicloheptadienilo, e fenilo; assim como radicais heterociclicos com 5 a 7 membros, saturados ou insaturados uma ou mais vezes, possuindo 1 a 4 heteroátomos que são escolhidos entre 0, N e S. São de referir em especial radicais heterociclicos derivados de pirrolidina, tetrahidrofurano, piperidina, morfolina, pirrol, furano, tiofeno, pirazol, imidazol, oxazol, tiazol, piridina, pirano, pirimidina, piridazina e pirazina.

Além destes são de mencionar também radicais com dois núcleos, nos quais um dos carbociclos ou heterociclos acima referidos está condensado com outro heterociclo ou carbo-ciclo, como por exemplo, radicais derivados de cumarona, indol, quinolina e naftalina.

Os radicais cic, nestes casos, podem estar ligados através de qualquer posição do anel, de preferência através de um átomo de carbono do anel.

Os exemplos de radicais cic apropriados são fenilo, naftilo, 2-tienilo, 3-tienilo; 2-furanilo, 3-furanilo; 2-piridilo, 3-piridilo ou 4-piridilo; 2-tiazolilo, 4-tiazolilo ou 5-tiazolilo; 4-metil-2-tienilo, 3-etil-2-tienilo, 2-metil-3-tienilo, 4-propil-3-tienilo, 5-n-butil-2-tienilo, 4-metil-3-tienilo, 3-metil-2-tienilo; 3-cloro-2-tienilo, 4-bromo-3-tienilo, 2-iodo-3-tienilo, 5-iodo-3-tienilo, 4-flúor-2-tienilo, 2-bromo-3-tienilo, e 4-cloro-2-tienilo.

Os radicais cic podem ainda estar substituidos uma ou mais vezes, como por exemplo, uma ou duas vezes. De preferência, 10 os substituintes estão ligados a um átomo de carbono do anel. Os exemplos de substituintes apropriados são halogéneo, alquilo inferior, alcenilo inferior, alcoxi inferior, -OH, -SH, -NO2 ou NR2R3, em que R2 e R3, independentemente um do outro, representam H, metilo ou etilo. OS substituintes preferidos são os radicais halogéneo.

Um outro grupo preferido de radicais cic são radicais arilo de acordo com a definição anterior. C. Enzimas com actividade de racemase de ácido alfa-hidroxicarboxilico (já não são objecto da invenção)

Os enzimas de acordo com a invenção com actividade de racemase de ácido alfa-hidroxicarboxílico são susceptíveis de ser obtidos em especial a partir de microrganismos do género Lactobacillus.

Os enzimas preferidos podem ser isolados a partir das estirpes de Lactobacillus L. paracasei DSM 20207 (DSM 15755) e DSM 2649 (DSM 15751), L. delbrueckii DSM 20074 (DSM 15754), L. sakei DSM 20017 (DSM 15753) e L. oris DSM 4864 (DSM 15752). Estas podem ser obtidas no DSM (Deutsche Stammsammlung fiir Zellkulturen und Mikroorganismen).

Os enzimas podem ser isolados a partir de culturas celulares, por meio da utilização de métodos bioquimicos preparativos correntes. A partir dos enzimas isolados podem ser então obtidas as primeiras informações sobre as sequências de aminoácidos, por vias convencionais, por exemplo, por fragmentação de peptideos e a sequenciação N-terminal. 11

Estão igualmente compreendidos, de acordo com a invenção, "equivalentes funcionais" dos enzimas naturais com actividade de racemase de ácido alfa-hidroxi-carboxílico, que podem ser isolados a partir dos organismos acima.

No âmbito da presente invenção, "equivalentes funcionais" ou análogos das racemase naturais são polipeptideos diferentes daquelas, que possuem, além disso, a actividade biológica pretendida, como por exemplo, especificidade ao substrato. Assim, entendem-se por "equivalentes funcionais" por exemplo, enzimas que racemizam pelo menos um composto escolhido entre lactato de fenilo, lactato de 4-flúor-fenilo, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutirico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentano-carboxilico e ácido 2-hidroxi-3-metilbutirico e que possuem pelo menos 20%, de preferência pelo menos 50%, especialmente de preferência pelo menos 75%, muito especialmente de preferência pelo menos 90% da actividade de um enzima de racemase natural de uma das estirpes de Lactobacillus mencionada acima ou uma actividade maior do que esta.

Além disso, os equivalentes funcionais são de preferência estáveis entre valores de pH de aproximadamente 4 e 10 e possuem vantajosamente um pH óptimo a um pH entre cerca de 5 e 8, assim como uma temperatura óptima situada no intervalo entre 20 e 80°C.

Entendem-se também por "equivalentes funcionais", de acordo com a invenção, em especial mutantes que possuem, em pelo menos uma posição da sequência das sequências naturais de aminoácidos, um outro aminoácido diferente do natural, mas que apesar disso possuem uma das actividades biológicas mencionadas acima. "Equivalentes funcionais" compreendem, em conformidade, os mutantes que podem ser obtidos por uma 12 ou mais adições, substituições, eliminações e/ou inversões de aminoácidos, em que as alterações referidas podem ocorrer em qualquer posição da sequência, desde que conduzam a um mutante com o perfil de propriedades de acordo com a invenção. Existe também equivalência funcional em especial quando o padrão de reactividade entre mutantes e os polipeptideos inalterados concordam qualitativamente, isto é, por exemplo, substratos iguais são submetidos a reacção com velocidades diferentes. São também "equivalentes funcionais", no sentido anterior, "precursores" dos polipeptideos descritos, assim como "derivados funcionais" e "sais" dos polipeptideos. "Precursores", neste caso, são precursores naturais ou sintéticos dos polipeptideos, com ou sem a actividade biológica desejada.

Entendem-se pela expressão "sais" tanto os sais de grupos carboxilo, como também os sais de adição de ácido de grupos amino das moléculas de proteinas de acordo com a invenção. Os sais de grupos carboxilo podem ser preparados de forma conhecida por si e compreendem sais inorgânicos, como por exemplo, sais de sódio, de cálcio, de amónio, de ferro e de zinco, assim como sais com bases orgânicas, como por exemplo, aminas, como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina e semelhantes. São igualmente objecto da invenção os sais de adição de ácido, como por exemplo, os sais com ácidos minerais, como o ácido clorídrico ou o ácido sulfúrico, e os sais com os ácidos orgânicos, como o ácido acético e o ácido oxálico.

Podem ser igualmente preparados "derivados funcionais" de enzimas de acordo com a invenção em grupos laterais de 13 aminoácidos funcionais ou nas suas extremidades N-terminais ou C-terminais, com o auxílio de técnicas conhecidas. Os derivados desta natureza compreendem, por exemplo, ésteres alifáticos de grupos ácido carboxílico, amidas de grupos ácido carboxílico, que podem ser obtidos por reacção com amoníaco ou com uma amina primária ou secundária; derivados de N-acilo de grupos amino livres, preparados por reacção com grupos acilo; ou derivados de O-acilo de grupos hidroxi livres, preparados por reacção com grupos acilo.

Como é natural, os "equivalentes funcionais" compreendem também polipeptídeos que podem ser obtidos a partir de outros organismos, assim como variantes de ocorrência natural. Podem, por exemplo, ser verificados, por comparação de sequências, regiões homólogas de regiões de sequências, e ser determinados enzimas equivalentes com base nas indicações concretas da invenção.

Os "equivalentes funcionais" compreendem igualmente fragmentos, de preferência domínios individuais ou motivos de sequências, dos polipeptídeos de acordo com a invenção, que possuem, por exemplo, a função biológica desejada.

Além disso, são "equivalentes funcionais" proteínas de fusão que possuem uma das sequências de racemases naturais, ou equivalentes funcionais delas derivados, e pelo menos uma outra sequência heteróloga, funcionalmente diferente daquela, em acoplamento funcional N- ou C-terminal (isto é, sem prejuízo essencialmente funcional, oposto, das partes da proteína de fusão). São exemplos não limitativos para as sequências heterólogas desta natureza, por exemplo, os peptídeos sinal ou enzimas. 14

De acordo com a invenção, por "equivalentes funcionais" entendem-se homólogos das proteínas naturais. Estas possuem pelo menos 60%, de preferência pelo menos 75%, em especial pelo menos 85%, como por exemplo, 90%, 95% ou 99% de homologia com uma das sequências naturais de aminoácidos, calculada de acordo com o algoritmo de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Uma homologia percentual de um polipeptideo homólogo de acordo com a invenção significa em especial uma identidade percentual de resíduos de aminoácidos referida ao comprimento total de uma das sequências de aminoácidos de um enzima de acordo com a invenção ou de uma sub-unidade de enzima.

No caso de uma possível glicosilação de proteína, os "equivalentes funcionais" de acordo com a invenção compreendem proteínas do tipo caracterizado acima, na forma desglicosilada ou glicosilada, assim como formas conjugadas susceptíveis de obtenção por alteração do padrão de glicosilação.

Podem ser produzidos por mutagénese homólogos das proteínas ou polipeptídeos de acordo com a invenção, por exemplo, por mutação pontual ou por encurtamento da proteína.

Os homólogos das racemases de acordo com a invenção podem ser identificados, por exemplo, por selecção de bancos combinatórios de mutantes, como por exemplo, mutantes por encurtamento. A título de exemplo, pode ser produzido um banco variegado de variantes de proteínas por mutagénese combinatória ao nível dos ácidos nucleicos, como por exemplo, por ligação enzimática de uma mistura de oligonucleótidos sintéticos. Existe um grande número de processos que podem ser utilizados para a produção de 15 bancos de potenciais homólogos, a partir de uma sequência degenerada de oligonucleótido. A sintese quimica de uma sequência genética degenerada pode ser realizada num autómato de sintese de ADN, e o gene sintético pode então ser ligado num vector de expressão apropriado. A utilização de um fragmento de gene degenerado possibilita a disponibilização de todas as sequências numa mistura, que codificam o fragmento desejado em sequências potenciais de proteínas. Os processos para a síntese de oligonucleótidos degenerados são conhecidos dos peritos na técnica (p. ex. Narang , S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Ver. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477) .

No estado da técnica são conhecidas várias técnicas para a selecção de produtos genéticos em bancos combinatórios que foram preparados por mutações pontuais ou encurtamento, e para a selecção de bancos de ADNc quanto a produtos genéticos com uma propriedade escolhida. Estas técnicas podem ser adaptadas à selecção rápida dos bancos de genes que tenham sido produzidos por mutagénese combinatória de homólogos de acordo com a invenção. As técnicas mais frequentemente utilizadas para a selecção dos grandes bancos de genes, que são sujeitos a uma análise com elevada manipulação, compreendem a clonagem do banco genético em vectores de expressão replicáveis, a transformação das células apropriadas com o banco de vectores resultante e a expressão dos genes combinatórios em condições sob as quais a comprovação da actividade desejada facilita o isolamento do vector que codifica o gene cujo produto foi comprovado. A "Recursive-Ensemble-Mutagenese" (REM), uma técnica que aumenta a frequência de mutantes funcionais nos bancos, pode ser utilizada em combinação com os testes de selecção 16 para a identificação de homólogos (Arkin e Yourvan (1992) PNAS 89: 7811-7815/ Delgrave et al. (1993) Protein

Engineering 6(3): 327-331). D. Sequências codificadoras de ácidos nucleicos (já não são objecto da invenção) São também objecto da invenção sequências de ácidos nucleicos que codificam para um enzima com actividade de racemase de ácido alfa-hidroxicarboxilico. São preferidas as sequências de ácidos nucleicos que compreendem as sequências de ácidos nucleicos derivadas das sequências de aminoácidos naturais das racemases que podem ser isoladas dos microrganismos acima.

Todas as sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção (sequências de ADN e ARN de cadeia simples ou cadeia dupla, como p. ex. ADNc e ARNm) podem ser obtidas, de forma conhecida por si, por sintese química, a partir dos nucleótidos componentes, como por exemplo, por condensação de fragmentos de componentes de ácidos nucleicos complementares da hélice dupla, que se sobrepõem individualmente. A síntese química de oligonucleótidos pode ser realizada, por exemplo, de forma conhecida, de acordo com o método da fosfoamidite (Voet, Voet, 2a edição, Wiley Press New York, páginas 896-897). A reacção de adição de oligonucleótidos sintéticos e o preenchimento de lacunas com o auxílio do fragmento de Klenow da ADN-polimerase e as reacções de ligação, assim como processos gerais de clonagem, são descritos em Sambrook et al. (1989),

Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 17 São objecto da invenção, em especial, sequências de ácidos nucleicos (sequências de ADN e ARN de cadeia simples ou cadeia dupla, como p. ex. ADNc e ARNm) , que codificam para um dos enzimas de acordo com a invenção, e os seus equivalentes funcionais, que podem ser obtidos, por exemplo, mediante a utilização de análogos de nucleótidos artificiais. A invenção refere-se tanto a moléculas de ácidos nucleicos isoladas, que codificam para polipeptídeos, ou proteínas, ou secções biologicamente activas das mesmas, de acordo com a invenção, como também a fragmentos de ácidos nucleicos, que podem ser utilizados, por exemplo, para a utilização como sondas de hibridização ou como "primers" para a identificação ou a amplificação de ácidos nucleicos codificadores, de acordo com a invenção.

Além disso, as moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com a invenção, podem conter sequência não transladadas das extremidades 3' e/ou 5' da região codificadora do gene. A invenção compreende ainda as moléculas de ácidos nucleicos complementares das sequências de nucleótidos descritas concretamente, ou uma secção das mesmas.

As sequências de nucleótidos de acordo com a invenção tornam possível a produção de sondas e "primers" que são utilizáveis para a identificação e/ou a clonagem de sequências homólogas noutros tipos de células e organismos. Aquelas sondas e "primers" compreendem geralmente uma região de sequência de nucleótidos que em condições "estritas" (ver adiante) hibridizam em pelo menos cerca de 12 nucleótidos, de preferência em pelo menos 25, como por exemplo, cerca de 40, 50 ou 75 nucleótidos consecutivos de 18 uma cadeia "sentido" de uma sequência de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, ou de uma correspondente cadeia anti-sentido.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural de ácidos nucleicos e pode, além disso, estar essencialmente isenta de outro material celular ou do meio de cultura, se for preparada por técnicas recombinantes, ou estar isenta de precursores quimicos ou de outras substâncias quimicas, se for sintetizada quimicamente.

Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser isolada por meio de técnicas padrão da biologia molecular e da informação da sequência disponibilizada de acordo com a invenção. A titulo de exemplo, pode ser isolado ADNc a partir de um banco de ADNc apropriado, em que são utilizadas como sondas de hibridizaçao uma das sequências completas reveladas concretamente, ou uma secção das mesmas, e são utilizadas técnicas normalizadas de hibridização (como é descrito, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989) . Além disso, pode ser isolada, por reacção em cadeia de polimerase, uma molécula de ácido nucleico que compreende uma das sequências reveladas, ou uma secção da mesma, em que são utilizados os primers de oligonucleótidos que foram citados com base nesta sequência. O ácido nucleico assim ampliado pode ser clonado num vector apropriado e ser caracterizado por análise de sequências de ADN. Os oligonucleótidos de acordo com a invenção podem ainda ser preparados por processos de 19 síntese padrão, por exemplo, com um aparelho automático de síntese de ADN.

As sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem, em princípio, ser identificadas e isoladas a partir de todos os organismos. As sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem ser isoladas com vantagem a partir de bactérias do tipo acima.

As sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, ou os seus derivados, os homólogos ou partes destas sequências, podem ser isoladas, por exemplo, por processos de hibridização correntes ou por técnicas de PCR, a partir de outros microrganismos, por exemplo, através de bancos genómicos ou de ADNc. Estas sequências de ADN hibridizam, em condições normalizadas, com as sequências de acordo com a invenção. Para a hibridização são utilizadas, com vantagem, sequências curtas de oligonucleótidos da região conservada, por exemplo, do centro activo, que podem ser determinadas, de forma conhecida dos peritos na técnica, por comparação com a racemase de ácido alfa-hidroxicarboxílico. No entanto, também podem ser utilizados para a hibridização fragmentos mais longos dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção, ou as sequências completas. Consoante o ácido nucleico utilizado (oligonucleótido, fragmento mais longo ou sequência completa), ou consoante o tipo de ácido nucleico, ADN ou ARN, que é utilizado para a hibridização, assim variam estas condições normalizadas. Assim, por exemplo, as temperaturas de fusão para híbridos ADN:ADN são cerca de 10°C menores do que as dos híbridos ADN: ARN com o mesmo comprimento. 20

Entendem-se por condições normalizadas, consoante o ácido nucleico, por exemplo, temperaturas entre 42 e 58°C numa solução tampão aquosa com uma concentração de 0,1 a 5 χ SSC (1 χ SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM de citrato de sódio, pH 7,2) ou adicionalmente na presença de 50% de formamida, como por exemplo, 42°C em 5 χ SSC, 50% de formamida. As condições de hibridização para híbridos ADN:ADN situam-se vantajosamente em 0,1 χ SSC e temperaturas de cerca de 20°C até 45°C, de preferência de cerca de 30°C até 45°C. Para os híbridos ADN:ARN as condições de hibridização situam-se vantajosamente em 0,1 χ SSC e temperaturas de cerca de 30°C até 55°C, de preferência de cerca de 45 até 55°C. Estas temperaturas indicadas para a hibridização são calculadas, por exemplo, a partir dos valores da temperatura de fusão para um ácido nucleico com um comprimento de cerca de 100 nucleótidos e com um teor de G + C de 50%, na ausência de formamida. As condições experimentais para a hibridização de ADN estão descritas nos correspondentes compêndios de genética, como por exemplo, em Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory 1989, e podem ser calculadas de acordo com as fórmulas conhecidas dos peritos na técnica, por exemplo, em função do comprimento os ácidos nucleicos, da natureza dos híbridos ou do teor de G + C. Podem ser obtidas pelos peritos na técnica outras informações para a hibridização nos seguintes manuais: Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley % Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford. 21 São também objecto da invenção derivados das sequências de aminoácidos concretamente reveladas ou que podem ser deduzidas.

Deste modo, das sequências naturais podem ser derivadas outras sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, que se distinguem daquelas por adição, substituição, inserção ou eliminação de um ou vários nucleótidos, mas que ainda codificam para polipeptídeos com o perfil de propriedades desejado.

Estão também abrangidas, de acordo com a invenção, as sequências de ácidos nucleicos que compreendem as chamadas mutações mudas, ou que estão modificadas, em comparação com uma sequência referida concretamente, em conformidade com o aproveitamento do codão de um organismo original ou hospedeiro especial, do mesmo modo que variantes de origem natural das mesmas, como por exemplo, variantes "fendidas" ou variantes alelo. São igualmente objecto da invenção sequências susceptiveis de obtenção por substituições conservativas de nucleótidos (isto é, o respectivo aminoácido é substituído por um aminoácido com carga, tamanho, polaridade e/ou solubilidade iguais). São também objecto da invenção as moléculas derivadas dos ácidos nucleicos revelados concretamente, por polimorfismos de sequências. Estes polimorfismos genéticos podem existir entre indivíduos dentro de uma população, em virtude de variações naturais. Estas variações naturais geralmente dão origem a uma variância de 1 a 5% na sequência de nucleótidos de um gene. 22

Entendem-se por derivados dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção, por exemplo, variantes de alelos que possuem pelo menos 40% de homologia ao nivel dos aminoácidos derivados, de preferência pelo menos 60% de homologia, muito especialmente de preferência pelo menos 80% de homologia, em toda a região da sequência (no que se refere à homologia ao nivel dos aminoácidos remete-se para as formas de realização acima para os polipeptideos). Em regiões parciais das sequências as homologias podem situar-se, com vantagem, em valores superiores.

Além disso, por derivados entendem-se também homólogos das sequências de ácidos nucleicos de acordo com a invenção, por exemplo, homólogos fúngicos ou bacterianos, sequências encurtadas, ADN ou ARN de cadeia simples da sequência de ADN codificadora e não codificadora. Assim, por exemplo, os homólogos da SEQ ID NO: 1 possuem, ao nivel do ADN, uma homologia de pelo menos 40%, de preferência de pelo menos 50%, especialmente de preferência de pelo menos 70%, muito especialmente de preferência de pelo menos 80% em toda a região do ADN indicada na SEQ ID NO: 1.

Além disso, entendem-se por derivados, por exemplo, fusões com promotores. Os promotores que estão ligados à frente das sequências de nucleótidos indicadas podem ser modificados por uma ou mais permutas de nucleótidos, inserções, inversões e/ou eliminações, sem que, no entanto, a funcionalidade ou a eficácia dos promotores seja prejudicada. Além disso, os promotores podem ser aumentados na sua eficácia por alteração da sua sequência, ou podem ser permutados completamente por promotores mais eficazes e também organismos de tipo estranho. 23

Entendem-se por derivados também variantes cuja sequência de nucleótidos, na região de 1 a 1000 bases a montante do codão de partida ou de 1 a 1000 bases a jusante depois do codão de paragem foi modificada de tal forma que a expressão do gene e/ou a expressão de proteínas seja alterada e de preferência seja aumentada.

Além disso, a invenção compreende também sequências de ácidos nucleicos que hibridizam em "condições estritas" com as sequências codificadoras mencionadas acima. Estes polinucleótidos podem ser encontrados na amostragem transversal de bancos genómicos ou bancos de ADNc e eventualmente multiplicados a partir daqueles com primers apropriados, por meio de PCR, e em seguida isolados, por exemplo, com sondas apropriadas. Além disso, podem ser também sintetizados por via química polinucleótidos de acordo com a invenção. Entende-se por esta propriedade a capacidade de um polinucleótido ou oligonucleótido se ligar, em condições estritas, a uma sequência quase complementar, ao passo que, nestas condições, não se realizam as ligações não específicas entre parceiros não complementares. Para este efeito, as sequências deverão ser complementares em 70 a 100%, de preferência em 90 a 100%. A propriedade de as sequências complementares se poderem ligar especificamente umas às outras torna-se útil, por exemplo, nas técnicas de Northern Blot ou Southern Blot ou na ligação com primers em PCR ou RT-PCR. Geralmente são utilizados para este efeito oligonucleótidos a partir de um comprimento de 30 pares de bases. Por "condições estritas" entendem-se, por exemplo, na técnica Northern Blot, a utilização de soluções de lavagem quentes a 50 - 70°C, de preferência a 60 - 65°C, por exemplo, tampão 0,1 χ SCC com 0,1% de SDS (20 χ SCC: 3 M NaCl, 0,3 M citrato de Na, pH 7,0) para a eluição de sondas de ADNc ou de 24 oligonucleótidos hibridizados de forma não específica. Neste caso, como foi referido anteriormente, ligaram-se entre si em alto grau apenas ácidos nucleicos complementares. A criação das condições estritas é conhecida dos peritos na técnica e é descrita, por exemplo, em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. E. Constructos (já não são objecto da invenção)

Além disso, são objecto da invenção constructos de expressão, que contêm, sob o controle genético de sequências de ácidos nucleicos reguladoras, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para um enzima de acordo com a invenção; assim como vectores, que compreendem pelo menos um estes constructos de expressão.

Estes constructos de acordo com a invenção compreendem, de preferência, um promotor a montante de 5' da respectiva sequência codificadora e a jusante de 3' uma sequência terminador, assim como eventualmente outros elementos reguladores correntes e, nomeadamente, operativamente acoplados em cada caso com a sequência codificadora.

Entende-se por um "acoplamento operativo" a disposição sequencial do promotor, sequência codificadora, terminador e eventualmente outros elementos reguladores, de tal forma que cada um dos elementos reguladores possa realizar corretamente a sua função na expressão da sequência codificadora. Os exemplos de sequências operativamente acopláveis são sequências-alvo, assim como intensificadores, sinais de poliadenilação e semelhantes. Outros elementos reguladores compreendem marcadores seleccionáveis, sinais de amplificação, origens de 25 replicação e semelhantes. As sequências regulatórias apropriadas são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Entendem-se por constructos de ácido nucleico de acordo com a invenção em especial os genes racemase de ácido alfa-hidroxi-carboxilico naturais e os derivados e homólogos dos mesmos, que tenham sido vantajosamente acoplados operativa ou funcionalmente com um ou mais sinais de regulação para o controle, por exemplo, o aumento, da expressão do gene.

Para além destas sequências reguladoras, a regulação natural destas sequências pode estar ainda dependente dos genes estruturais propriamente ditos e pode eventualmente ser alterada geneticamente de tal forma que não seja realizada a regulação natural e a expressão dos genes seja aumentada. No entanto, o constructo do ácido nucleico pode também ser construído de forma mais simples, isto é, não foram inseridos quaisquer sinais reguladores adicionais antes da sequência codificadora e não foi eliminado o promotor natural com a sua regulação. Em vez disso, a sequência reguladora natural sofre uma mutação tal que já não seja realizada qualquer regulação e a expressão do gene seja reforçada.

Vantajosamente, um constructo de ácido nucleico, preferido, contém também uma ou mais das sequências "intensificadoras" já referidas, acoplada funcionalmente com o promotor, que permitem uma alta expressão da sequência de ácido nucleico. Adicionalmente, podem ser também inseridas na extremidade 3' das sequências de ADN sequências vantajosas, como outros elementos regulatórios ou terminadores. Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem estar contidos no constructo 26 numa ou em mais cópias. Podem ainda estar presentes no constructo outros marcadores, como genes que complementam a resistência a antibióticos ou autotrofias, eventualmente para a selecção no constructo.

As sequências de regulação vantajosas para o processo de acordo com a invenção encontram-se presentes, por exemplo, em promotores como cos, tac, trp, tet, trp-tet, IPP/ lac, lpp-lac, laclq“, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6-, lambda-PR- ou no promotor lambda-PL, que têm aplicação, vantajosamente, em bactérias Gram-negativas. Outras sequências reguladoras vantajosas estão presentes, por exemplo, nos promotores Gram-positivos amy e SP02, nos promotores de leveduras ou fungos ADC1, MFalfa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Podem ser utilizados também promotores artificiais para a regulação. 0 constructo de ácido nucleico é inserido, para a expressão, num organismo hospedeiro, vantajosamente num vector, como por exemplo, um plasmideo ou um fago, que permita uma expressão óptima dos genes no hospedeiro. Além dos plasmideos e fagos, entendem-se por vectores também todos os outros vectores conhecidos dos peritos na técnica, por conseguinte, por exemplo, virus, como SV40, CMV, baculovirus e adenovirus, transposões, elementos IS, fasmideos, cosmideos, e ADN linear ou circular. Estes vectores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou ser replicados cromossomicamente. Estes vectores representam uma outra forma de realização da invenção. Os plasmideos apropriados são, por exemplo, em E. coli plG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, Àgtll ou pBdCl, em Streptomyces pLJlOl, pLJ364, pLJ702 ou pLJ361, em Bacillus pUBUO, pC194 27 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl, pIL2 ou ρΒΒΙΙβ, em leveduras 2alfaM, pAG-1, YEp6, YEpl3 ou pEMBLYe23 ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Os plasmídeos citados representam uma pequena escolha dos plasmídeos possíveis. Outros plasmídeos são bem conhecidos dos peritos na técnica e podem ser retirados, por exemplo, de Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdão-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) .

Vantajosamente, o constructo de ácido nucleico contém ainda, adicionalmente, para a expressão dos outros genes presentes, sequências reguladoras terminais em 3' e/ou 5' para o reforço da expressão, que são escolhidos em função do organismo hospedeiro escolhido e do gene ou genes para uma expressão óptima.

Estas sequências regulatórias deverão permitir a expressão intencional dos genes e da proteína de expressão. Isto pode significar, por exemplo, consoante o organismo hospedeiro, que o gene só é expresso ou sobre-expresso depois da indução, ou que é imediatamente expresso e/ou sobre-expresso .

Neste caso, as sequências regulatórias ou os fatores podem, de preferência, influenciar positivamente a expressão do gene inserido e, desta forma, aumentá-la. Assim, pode ser realizado vantajosamente um reforço do elemento regulador ao nível da transcrição, sendo utilizados sinais de transcrição fortes, como "intensificadores" e/ou promotores. Além disso, é também possível, no entanto, um reforço da translação, sendo desta forma melhorada, por exemplo, a estabilidade do ARNm. 28

Numa outra forma de realização do vector, o vector que contém o constructo de ácido nucleico de acordo com a invenção ou o ácido nucleico de acordo com a invenção também podem ser inseridos vantajosamente no microrganismo na forma de um ADN linear e ser integrados no genoma do organismo hospedeiro através de uma recombinação heteróloga ou homóloga. Este ADN linear pode consistir num vector linearizado, como um plasmideo, ou apenas no constructo de ácido nucleico ou no ácido nucleico de acordo com a invenção.

Para uma expressão óptima de genes heterólogos em organismos é vantajoso modificar as sequências de ácidos nucleicos em conformidade com o "codon usage" especifico utilizado no organismo. 0 "codon usage" pode ser facilmente determinado com base na avaliação por computador de outros genes conhecidos do respetivo organismo. A preparação de uma cassete de expressão de acordo com a invenção é realizada por fusão de um promotor apropriado com uma sequência de nucleótidos codificadora apropriada, assim como com um sinal de terminador ou de poliadenilação. Para o efeito utilizam-se técnicas correntes de recombinação e de clonagem, como são descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), assim como em T. J. Silhavy. M. L. Berman e L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984) e em Ausubel, F. M. et al.,

Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, and Wiley Interscience (1987). 29 0 constructo de ácido nucleico recombinante ou o constructo de gene é inserido, para expressão, num organismo hospedeiro apropriado, vantajosamente num vector especifico do hospedeiro, que torna possível uma expressão óptima do gene no hospedeiro. Os vectores são perfeitamente conhecidos dos peritos na técnica e podem ser retirados, por exemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al. Editor Elsevier, Amsterdão-New York-Oxford, 1985). F. Hospedeiros utilizáveis de acordo com a invenção

Com o auxilio dos vectores podem ser preparados microrganismos recombinantes, que são transformados, por exemplo, com pelo menos um vector, e que podem ser utilizados para a produção dos enzimas ramificáveis de acordo com a invenção. Os constructos recombinantes descritos acima são vantajosamente incorporados e expressos num sistema hospedeiro apropriado. Neste caso são utilizados de preferência métodos de clonagem e de transfecção correntes, conhecidos dos peritos na técnica, como por exemplo, coprecipitação, fusão em protoplasma, electroporação, transfecção retroviral e semelhantes, para levar à expressão em cada um dos sistemas de expressão os ácidos nucleicos referidos. Os sistemas apropriados estão descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds. Wiley Interscience, New York 1987, ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989.

De acordo com a invenção, também podem ser preparados microrganismos recombinantes homólogos. Para este efeito é preparado um vector que contém pelo menos uma secção de um gene de acordo com a invenção ou de uma sequência 30 codificadora em que eventualmente foi aplicada pelo menos uma eliminação, adição ou substituição de aminoácidos para modificar a sequência de acordo com a invenção, por exemplo, para a romper funcionalmente (vector "knock-out") . A sequência incorporada pode ser também, por exemplo, um homólogo de um microrganismo aparentado ou ser derivada de uma fonte de um mamífero, levedura ou insecto. O vector utilizado para a recombinação homóloga pode, em alternativa, ser construído de tal forma que o gene endógeno seja sujeito a mutação na recombinação homóloga ou seja modificado por qualquer outra forma, mas que, no entanto, ainda codifique a proteína funcional (por exemplo, a região reguladora situada a montante pode ser alterada de tal forma que seja alterada deste modo a expressão da proteína endógena). A secção modificada do gene de acordo com a invenção é inserida no vector de recombinação homóloga. A concentração de vectores apropriados para a recombinação homóloga é descrita, por exemplo, em Thomas, K. R. e Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Como microrganismos hospedeiros recombinantes para o ácido nucleico ou para o constructo de ácido nucleico interessam em princípio todos os organismos procarióticos ou eucarióticos. São vantajosamente utilizados como organismos hospedeiros microrganismos como bactérias, fungos ou leveduras. São utilizadas com vantagem bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas. O género e espécie da maior preferência é Escherichia coli. O organismo hospedeiro ou os organismos hospedeiros de acordo com a invenção contêm neste caso, de preferência, pelo menos uma sequência de ácido nucleico, constructos de ácidos nucleicos ou vectores que codificam para um enzima com a actividade aqui definida. 31

Consoante a natureza do organismo hospedeiro, os organismos utilizados no processo de acordo com a invenção são criados ou cultivados de forma conhecida dos peritos na técnica. Os microrganismos, regra geral, são cultivados num meio liquido que contém uma fonte de carbono, geralmente na forma de açúcares, uma fonte de azoto, geralmente na forma de fontes de azoto orgânicas, como extracto de levedura, ou sais como sulfato de amónio, oligoelementos como sais de ferro, de manganês, de magnésio, e eventualmente vitaminas, a temperaturas de 0°C até 100°C, de preferência de 10°C até 60°C, com fornecimento de oxigénio gasoso. Nestas condições o pH do liquido nutriente pode ser mantido num valor fixo, isto é, durante o período da cultura são regulados ou não. A cultura pode ser realizada de uma forma descontínua, semi-contínua ou contínua. Os nutrientes podem ser introduzidos no início da fermentação ou ser adicionados de forma contínua ou semi-contínua. A cetona pode ser adicionada directamente à cultura ou, vantajosamente, depois da cultura. Consoante o processo descrito nos exemplos, os enzimas podem ser isolados dos organismos ou ser utilizados como um extracto bruto para a reacção. G. Preparação recombinante dos enzimas de acordo com a invenção: (já não são objecto da invenção) São ainda objecto da invenção processos para a preparação recombinante de polipeptídeos de acordo com a invenção ou de fragmentos funcionais biologicamente activos dos mesmos, em que se cultiva um microrganismo que produz o polipeptídeo, eventualmente se induz a expressão do polipeptídeo e se isola este da cultura. Os polipeptídeos podem pois ser também produzidos em grande escala técnica, caso isso seja desejado. 32 0 microrganismo recombinante pode ser cultivado e ser fermentado de acordo com processos conhecidos. As bactérias podem, por exemplo, ser multiplicadas em meio TB ou LB e a uma temperatura de 20 a 40°C e a um valor de pH entre 6 e 9. Em particular, são descritas condições apropriadas de cultura, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).

No caso de os polipeptídeos não serem decompostos no meio de cultura, as células são então desagregadas e o produto é obtido do lisado de acordo com processos conhecidos de isolamento de proteínas. As células podem ser desagregadas, conforme desejado, por ultrassons de alta frequência, por pressão elevada, como por exemplo, numa célula de pressão French, por osmólise, por acção de detergentes, por enzimas líticos ou solventes, por meio de homogeneizadores ou por combinação de vários dos processos referidos.

Pode ser realizada uma purificação do polipeptídeo com processos cromatográficos conhecidos, como cromatografia através de peneiros moleculares (filtração por gel), como cromatografia através de Q-Sepharose, cromatografia de permuta iónica e cromatografia hidrófoba, assim como com outros processos correntes, como ultrafiltração, cristalização, separação por meio de sais, diálise e electroforèse por gel nativa. Os processos apropriados estão descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlim, New York, ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlim.

Para o isolamento das proteínas recombinantes pode ser vantajoso utilizarem-se sistemas de vectores ou oligo- 33 nucleótidos que prolongam o ADNc de determinadas sequências de nucleótidos e, por consequência, codificam para polipeptideos modificados ou proteínas de fusão, que servem, por exemplo, para uma purificação mais simples. As modificações apropriadas desta natureza os chamados "tags", que funcionam como âncoras, como por exemplo, a modificação conhecida como âncora de hexa-histidina, ou epítopos, que podem ser reconhecidos como antigenes de anticorpos (descritos, por exemplo, em Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Press). Estas âncoras podem ser servir para a aderência das proteínas a um suporte sólido, como por exemplo, uma matriz polimérica, que pode ser utilizado, por exemplo, como enchimento de uma coluna cromatográfica, ou a uma placa de microtítulo, ou a um outro suporte.

Simultaneamente, estas âncoras também podem ser utilizadas para o reconhecimento das proteínas. Além disso, para o reconhecimento das proteínas podem ser utilizados marcadores correntes, como corantes fluorescentes, marcadores enzimáticos, que, depois da reacção com um substrato, formam um produto de reacção detectável, ou um marcador reactivo, isolados ou em combinação com âncoras para a obtenção de derivados das proteínas. H. Isolamento não recombinante de enzimas de acordo com a invenção (já não são objecto da invenção) 0 isolamento dos enzimas de acordo com a invenção é realizado convenientemente a partir de uma das fontes naturais descritas acima (estirpes Lactobacillus) , ou a partir de outros microrganismos que exprimem a actividade de racemase de ácido alfa-hidroxicarboxílico, identificados 34 com o auxílio de um processo de selecção de acordo com a invenção. 0 microrganismo pode ser cultivado e fermentado de acordo com processos conhecidos. As células são então desagregadas, no caso de os polipeptídeos não terem sido decompostos no meio de cultura, e o produto é obtido a partir do lisado, de acordo com processos conhecidos de isolamento de proteínas. As células podem ser desagregadas, conforme desejado, por ultrassons de alta frequência, por pressão elevada, como por exemplo, numa célula de pressão French, por osmólise, por acção de detergentes, por enzimas líticos ou solventes orgânicos, por homogeneizadores ou por combinação de vários dos processos referidos.

Pode ser realizada uma purificação do polipeptídeo com processos cromatográficos conhecidos, como cromatografia através de peneiros moleculares (filtração por gel), como cromatografia através de Q-Sepharose, cromatografia de permuta iónica e cromatografia hidrófoba, assim como com outros processos correntes, como ultrafiltração, cristalização, separação por meio de sais, diálise e electroforèse por gel nativa. Os processos apropriados estão descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlim, New York, ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlim. I. Realização do processo de acordo com a invenção para a isomerização de ácidos alfa-hidroxicarboxilicos O processo de acordo com a invenção é vantajosamente realizado a uma temperatura no intervalo entre 0°C e 95°C, de preferência entre 10°C e 85°C, especialmente de 35 preferência entre 15°C e 75°C, em especial entre 25°C e 40 °C.

No processo de acordo com a invenção o pH é mantido, com vantagem, num intervalo entre pH 4 e 12, de preferência entre pH 4,5 e 9, especialmente de preferência entre pH 5 e

Para o processo de acordo com a invenção podem ser utilizadas, conforme desejado, células em crescimento que contêm os ácidos nucleicos, constructos de ácidos nucleicos ou vectores de acordo com a invenção. Também podem ser utilizadas células em repouso ou desagregadas. Entendem-se por células desagregadas, por exemplo, as células que foram tornadas translúcidas por meio de um tratamento, por exemplo, com um solvente, ou a células que foram rompidas por meio de um tratamento com enzimas, por meio de um tratamento mecânico (por exemplo, com a French Press ou ultrassons) ou por meio de um outro método. Os extractos brutos assim obtidos são apropriados vantajosamente para o processo de acordo com a invenção. Podem ser também utilizados para o processo enzimas purificados ou não purificados. São igualmente apropriados microrganismos ou enzimas imobilizados, que podem, com vantagem, ter utilização na invenção.

Se forem utilizados para o processo de acordo com a invenção organismos livres ou enzimas imobilizados, estes são então separados convenientemente antes da extracção, por exemplo, por meio de uma filtração ou centrifugação. O produto preparado no processo de acordo com a invenção pode ser obtido vantajosamente da solução aquosa da reacção por extracção ou destilação. A extracção pode ser repetida 36 várias vezes para se aumentar o rendimento. Os exemplos de meios de extracção apropriados são solventes comuns bem conhecidos dos peritos na técnica, como tolueno, cloreto de metileno, éter diisopropilico, benzeno, MTBE ou acetato de etilo, sem estarem limitados a estes.

Depois da concentração da fase orgânica, os produtos podem ser obtidos, regra geral, com boa pureza quimica, isto é, com mais de 80% de pureza quimica. Depois da extracção, a fase orgânica pode ser concentrada com o produto, mas também pode ser concentrada apenas parcialmente, e o produto ser recristalizado. Para este efeito a solução é arrefecida com vantagem até uma temperatura de 0 a 10°C. A cristalização também pode ser realizada directamente a partir da solução orgânica ou a partir de uma solução aquosa. O produto recristalizado pode ser tomado de novo no mesmo solvente, ou num outro solvente, para nova cristalização, e ser novamente recristalizado. O processo de acordo com a invenção pode ser realizado de forma descontinua, semi-continua ou continua. A realização do processo pode ter lugar, vantajosamente, em biorreactores, como é descrito, por exemplo, em

Biotechnology, Vol. 3, 2a edição, Rehm et al. Editores, (1993) . K. Outras aplicações da invenção A presente invenção abre inúmeras outras possibilidades de utilização das reacções de isolamento de acordo com a invenção. Sem que estejam limitados a estes, apontam-se alguns exemplos: 37 a) a racemização de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos para a "recuperação" do estereoisómero não desejado em separações clássicas de racematos, depois da separação do produto pretendido. A vantagem reside na reacção enzimática de racemização mais limpa; pelo contrário, as racemizações catalisadas quimicamente decorrem frequentemente em condições de reacção drásticas, que conduzem à decomposição, à formação de produtos secundários e a reacções colaterais (eliminação, etc.) (ver também "Kontrollierte Racemisierung von organischen Verbindungen": E. J. Ebbers, G. J. A. Ariaans, J. P. Houbiers, A. Bruggink, B. Zwanenburg, Tetrahedron, 1997, 53, 9417- 9476) ; b) a desracemização por passos dos ácidos alfa- hidroxicarboxílicos. Sempre que a actividade enzimática definida acima (por exemplo, em virtude das condições de reacção necessárias) não puder ser utilizada no "processo conssecutivo" directamente com um passo enantiosselectivo (catalisado química ou enzimaticamente), a racemização enzimática é realizada depois do passo enantiosselectivo sem a separação dos produtos enantioméricos (ver exemplo análogo mediante a utilização de mandelato-racemase: U. T. Strauss, K. Faber, Tetrahedron, Asymmetry, 1999, 10, 4079-4081); c) o caso ideal para a utilização corresponde a uma combinação directa da actividade enzimática definida acima com um passo quimiocatalítico ou biocatalítico no "processo conssecutivo", uma chamada "separação dinâmica de racemato". Estes processos são elegantes e extremamente eficazes. 38

Como exemplo para um passo enantiosselectivo, que pode ser combinado com uma racemização de acordo com a invenção, serão de referir: (i) a esterificação catalisada por lipase, ou reacção de transferência de acilo (U. T. Strauss, K. Faber, Tetrahedron, Asymmetry, 1999, 10, 4079-4081); (ii) a formação de amida catalisada por lipase ou protease (F. van Rantwijk, Μ. A. P. J. Hacking, R. A. Sheldon, Monatsch. Chem. /Chem. Monthly, 2000, 131, 549-569). A descrição anterior e os exemplos que se seguem servem apenas para a elucidação da invenção. Estão igualmente compreendidas, de acordo com a invenção, as inúmeras modificações possíveis, evidentes para os peritos na técnica.

Parte experimental A. Indicações gerais 1. Aparelhos e métodos utilizados

Cromatografia em camada fina O controle da marcha das reacções, assim como o ensaio da pureza dos produtos, são realizados por meio de cromatografia em camada fina. Para este efeito foi utilizada sílica-gel 60F254 sobre folha de alumínio, da Merck. A detecção foi realizada tanto com luz ultravioleta (254 nm), como também por pulverização com solução de molibdato [ (NH4) 6Mo7024 x 4 H20 (100 g/L) e Ce(S04)2 * 4 H20 (4 g/L) em H2S04 (10%)], e em seguida aquecimento.

Cromatografia em coluna 39 A purificação dos produtos da racemização foi realizada por cromatografia em coluna. Para o efeito foi utilizada como fase estacionária sílica-gel com a granulometria 43-63 pm da Firma Merck. Como eluentes serviram misturas de benzina (B) e acetato de etilo (EE) , em que a composição foi ajustada ao respetivo problema de separação. A separação foi realizada sob pressão elevada.

Cromatografia em fase gasosas A separação dos produtos da racemização por cromatografia em fase gasosa foi realizada com um cromatógrafo de gás Varian 3800 — injector "split/splitless" (FID). Serviu como coluna uma coluna Chirasil-DEX, Chrompack, permetil-β-ciclodextrina, ligada quimicamente, 25 m χ 0,32 mm χ 0,25 pm, H2. Os exemplos das condições de separação apropriadas estão indicadas no quadro 1 a seguir.

Quadro 1: separação de enantiómeros em GC quirálica composto Pressão prévia da coluna [psi] Programa de temperatura [°C] Tempo de retenção [min] Lactato 12 45°C 4,6 (R) 6,0 (S) Lactato de fenilo 12 125° 7.5 (R) 8.5 (S) Lactato de 4-fluorfenilo 12 80°C/0-5°C/min 170°C 12,0 (R) 12,5 (S)

RMN

Foram obtidos espetros por 1H-RMN e 13C-RMN num aparelho Brucker a 360 ou 500 MHz, as transposições químicas estão indicadas em ppm (escala õ) , e foi utilizado como padrão interno tetrametilsilano (TMS).

HPLC

As determinações do valor e.e. foram realizadas por meio de um sistema de HPLC de JASCO com bombas do tipo PU-980 e com 40 um detector UV MD 910. Para a separação foi utilizada uma coluna DAICEL Chiralpack AD (0,46 cm χ 25 cm).

Ponto de fusão

Os pontos de fusão foram determinados com um aparelho MPD 350.BML.5 da Firma GALLENKAMP. 2. Métodos e materiais microbiolóqicos 2.1 Colheita de culturas

Estirpes de bactérias O Quadro 2 contém a apresentação das estirpes investigadas, das suas condições de cultura e dos seus números de depósito.

Quadro 2: condições de crescimento das estirpes bacterianas investigadas

Estirpe Número DSM meio temperatura L. haloferax volcanii 5176 372 37 °C L. haloarcula vallismortis 3756 372 37 °C L. paracasei 20008 11 30°C L. paracasei 20207 11 30°C L. paracase 2649 11 30°C L. acidophilus 20079 11 30°C L. brevis 20054 11 30°C L. piscicola 20722 92 30°C L. halotolerans 20190 11 30°C L. confusus 20196 11 30°C L. acetotolerans 20749 231 30°C L. delbrueckii ssp. delbrueckii 20074 11 37 °C L. kandleri 20593 11 30°C L. fructosus 20349 11 30°C L. farciminis 20184 11 30°C L. gasseri 20243 11 37 °C L. alimentarius 20249 11 30°C L. jensenii 20557 11 37 °C L. curvatus 20010 11 30°C L. sakei ssp. sakei 20017 11 30°C L. oris 4864 11 37 °C

Manutenção das estirpes 41 A manutenção das estirpes foi realizada por meio da refrigeração das células em soluções de refrigeração especiais. Para o efeito as culturas foram transferidas para copos de centrifugação esterilizados, foram centrifugadas 30 minutos a 8000 r.p.m. e a 4°C e a solução sobrenadante foi decantada. Em seguida as células foram postas em suspensão na solução de refrigeração, foram transferidas para frascos esterilizados e foram conservadas a -70°C. Foi utilizada como solução de refrigeração ou uma solução a 20% em volume de DMSO e 0,7% em peso de NaCl em H2O (Firma Sõlkner) ou glicerina com 5% em volume de H2O (Firma Weigers).

Cultura das estirpes O crescimento das culturas foi realizado em balões de Erlenmeyer de 1000 mL, em estufa de secagem, a 30°C ou a 37°C (consoante a estirpe da bactéria). Primeiro, para cada estirpe de bactéria 1 litro do respectivo meio estéril foi dividido em cada caso por 4 balões e cada um foi inoculado com 500 yL da solução celular previamente descongelada. Todos os passos de trabalho em condições estéreis foram realizados em fluxo laminar (Heraeus "Herasafe", tipo HS9).

Colheita das células

Depois de uma fase de crescimento de 3 a 15 dias, consoante a estirpe da bactéria, as células foram colhidas. Para o efeito a cultura foi transferida para um copo de centrífuga, centrifugou-se durante 20 minutos a 8000 r.p.m. e a 4°C e o sobrenadante foi decantado. Para a lavagem, as células foram postas em suspensão em cerca de 40 mL de tampão (50 mM de bis-tris, 0,01 MgCl2, pH = 6) e foram de novo centrifugadas durante 20 minutos. O processo de lavagem foi realizado duas vezes. Em seguida as células foram postas de novo em suspensão com um pouco de tampão, 42 foram transferidas para um balão de fundo redondo e submetidas a ultracongelação. Isto foi realizado agitando-se o balão num vaso de Dewar cheio com azoto liquido. A liofilização foi realizada num liofilizador da Firma Braun ("Christ Alpha 1-4") . As células liofilizadas foram embaladas em frascos de vidro e foram conservadas em armário frigorifico até à sua utilização. 2.2 Meios nutrientes e esterilização

Para a cultura dos microrganismos foram utilizados os meios nutrientes recomendados para a respetiva estirpe bacteriana. Estas foram esterilizadas, antes da inoculação, por meio de tratamento em autoclave (esterilizador por vapor Varioklav, H+P Labortechnik GmbH, Munique) a 121°C e a um bar de sobrepressão.

Meio 11 0 meio 11 foi utilizado como meio nutriente para as seguintes estirpes de bactérias: L. paracasei, L. acidophilus, L. brevis, L. halotolerans, L. confusus, L. farciminis, L. gasseri, L. alimentarius, L. jensenii, L. delbrieckii, L. curvatus, L. sakei ssp. Sakei, L. kandeleri e L. fructosus.

No Quadro 3 está indicada a composição do meio. Para impedir uma possível reacção de Maillard, assim como a precipitação de sais, os constituintes do meio foram esterilizados em separado e foram reunidos depois da esterilização. A reacção de Maillard ocorre quando compostos como açúcares redutores reagem com aminoácidos ou com proteínas, e originam uma coloração escura do meio. 43 43 Quadro 3: composição do meio 11 substância concentração [g/L] Peptona de caseína (firma Oxoid) 10, 00 Peptona (firma Oxoid) 10, 00 Extracto de levedura (firma Oxoid) 5, 00 Glucose 20, 00 k2hpo4 2,00 Acetato de sódio trihidrato 8, 00 Citrato de amónio 2,00 MgS04 x 7 H20 0,20 MnS04 x H20 0, 05 Tween 80 1,00

Meio 231 231, que se do pH. Os reunidos logo valor 5,2.

Para L. acetotolerans foi utilizado o meio distingue do meio 11 apenas no valor constituintes indicados no Quadro 3 foram antes da esterilização e o pH foi ajustado ao

Meio 92 0 meio 92 foi utilizado para L. piscicola. A sua composição está indicada no Quadro 4.

Quadro 4: composição do meio 92 substância concentração [g/L] Extracto de soja tríptico desagregado (firma Oxoid) 30, 00 Extracto de levedura (firma Oxoid) 3, 00

Meio 372 0 meio 372 foi utilizado para as estirpes haloferax volcanii e haloarcula vallismortis. 44

Quadro 5: composição do meio 372 substância concentração [g/L] Extracto de levedura (firma Oxoid) 5, 00 Ácido casâmico (firma Oxoid) 5, 00 Glutamato de sódio (firma Oxoid) 1, 00 KC1 2,00 Citrato de sódio 3, 00 MgS04 x 7 H20 20, 00 NaCl 200,00 FeCl2 x 4 H20 0, 036 MnCl2 x 4 H20 0,00036 B. Ensaios realizados

Exemplo 1: síntese de substratos e material de referência A) Preparação de propionato de 2-hidroxi-3-fenilo enantiomericamente puro

Preparação; 1 g de fenilalanina enantiomericamente pura (6,05 mmol) é dissolvido em 12 mL de H2SO4 (1 M) . São adicionados às porções 1,66 g (24 mmol) de NaNC>2, mediante arrefecimento com gelo. Depois da adição retira-se o arrefecimento e o preparado é agitado ainda à temperatura ambiente durante uma noite.

Processamento: a solução aquosa é extraida três vezes com 4 mL de éter etílico de cada vez, a fase orgânica é lavada com solução saturada de cloreto de sódio e a solução salina é extraída uma vez com éter etílico, por retorno. A fase orgânica reunida é seca som sulfato de sódio e o solvente é eliminado em evaporador rotativo. O resíduo oleoso amarelo é misturado com 2 mL de hexano e promove-se a cristalização por meio de raspagem com uma vareta de vidro. Forma-se um sedimento de cristais brancos. Os cristais são lavados três vezes com aproximadamente 2 mL de hexano e o resíduo do solvente é eliminado em evaporador rotativo. 45

Poder rotatório (literatura): (S)-lactato de fenilo: [a] D25 = -20,8 (c = 2, H2O) , (R)-lactato de fenilo: [a]D25 = +20,9 (c = 2,3, H20) . b) Preparação de rac lactato de 4-fluorfenilo rac-3

Preparação: 400 mg (2,2 iranol) de rac 4-fluorfenilalanina, 67 0 mg (9,7 mmol) de NaN02 em 4,8 mL de H2SO (1 M) . Rendimento: 197 mg (49,0%), cristais brancos. 1H-RMN: (360 MHz, CDC13) δ = 2,97 (1H, dd, Ji = 7,2 Hz, J2 = 14,4 Hz, CH2) ; 3,17 (1H, dd, Ji = 3,6 Hz, J2 = 14,4 Hz, CH2) ; 4,49 (1H, dd, Ji = 3, 6 Hz, J2 = 6, 1 Hz, CH-OH); 6,98 - 7,02 (2H, m, Ar); 7,20 - 7,28 (2H, m, Ar). 13C-RMN: (90 MHz, CDC13) δ = 39,2 (CH2) ; 70,9 (CH-OH); 115,3 (d, J = 21,6 Hz, Ar-m) ; 130,9 (d, J = 21,6 Hz, Ar-o); 131,6 (d, J = 3,6 Hz, Ar-i); 162,1 (d, J = 243,9 Hz, Ar-p); 178,1 (COOH).

Dados de DC: LM:EE; RF = 0,35 Ponto de fusão: 73°C. c) Preparação de (S)-lactato de 4-fluorfenilo (S)-3

Preparação: 452 mg (2,5 mmol) de (S)-4-fluorfenilalanina, 750 mg (10,9 mmol) de NaN02 em 5,4 mL de H2S04 (1 M) . Rendimento: 330 mg (72,5%), cristais brancos. 1H-RMN: ver rac-lactato de 4-fluorfenilo. 13C-RMN: ver rac-lactato de 4-fluorfenilo.

Dados de DC: LM:EE; RF = 0,35 Ponto de fusão: 69°C. A síntese dos compostos ácido (S)-(+)-2-hidroxi-3-metilbutanóico ácido (S)-(-)-2-hidroxi-4-metilpentanóico ácido (S)-2-hidroxi-4-fenilbutírico ácido (S)-2-hidroxi-3-fenilpropanóico 46 foi realizada de forma análoga ao exemplo 1, a partir dos correspondentes aminoácidos enantiomericamente puros, de obtenção comercial.

Exemplo 2: selecção segundo a actividade de racemase

Para se obter um primeiro ponto de referência relativamente à actividade de racemização dos microrganismos, foi investigado se estes mostram uma racemização do substrato (natural) (S)-lactato 1 e/ou do substrato (não natural) (S)-lactato de fenilo 2, assim como (S)-lactato de 4-fluorfenilo 3.

Para a selecção, cerca de 10 mg de células liofilizadas foram reidratadas durante uma hora, a 42°C e a 150 r.p.m., num balão de Eppendorf em 900 pL de tampão bis-tris (50 mM de bis-tris, pH = 6) . Em seguida, realizou-se a adição de 10 mg de substrato em cada caso, o qual tinha sido previamente dissolvido em 100 pL de tampão e ajustado a pH 6-7 com NaOH. O preparado foi incubado a 42°C e a 150 r.p.m. numa estufa com agitação. Paralelamente a cada preparação foi medido um ensaio cego, em que foram mantidas condições de reacção idênticas, mas sem adição de células. Como os ensaios de controle tiveram em todos os casos um resultado negativo, pode ser excluída uma racemização espontânea nas condições de reacção indicadas.

Depois de um ou dois dias na estufa com agitação, os balões de Eppendorf foram centrifugados a 13 000 r.p.m. durante 5 minutos e em seguida recolheram-se de cada um 400 pL da solução sobrenadante. A solução foi extraída duas vezes, com 600 pL de EE de cada vez, a fase orgânica foi reunida, foi seca com Na2S04 e o solvente foi eliminado em evaporador rotativo. Para se conseguir uma separação dos 47 dois enantiómeros através de uma coluna quirálica, tiveram que ser obtidos derivados de todos os compostos ensaiados. Para esse fim, cada amostra foi misturada com 500 pL de BF3-metanol, agitou-se durante 10 minutos a 60°C e extraiu-se com 1 mL de CH2CI2. A fase orgânica foi seca com Na2S04 e foi concentrada até um volume de cerca de 100 pL.

Uma reacção de racemizaçao foi avaliada como negativa (-) quando o excesso de enantiómeros depois de 2 dias era > 95%, quando o excesso de enantiómeros era < 20% foram avaliadas como positivas ( + ) . Todas as restantes receberam a avaliação (~). Os resultados da selecção são apresentados no Quadro 6.

Quadro 6: resultados da selecção de actividade

Microrganismo Número DSM substrato (S)-l (S)~ 2 (S)~ 3 L paracasei 20008 + + + L. paracasei 20207 + + + L. paracasei 2649 - + + L. acidophilus 20079 n.d. - - L. brevis 20054 + - - L. piscicola 20722 n.d. - - L. halotolerans 20190 + - - L. confusus 20196 - - - L. acetotolerans 20749 + - - L. delbrueckii 20074 + + + L. kandleri 20593 n.d. - - L. fructosus 20349 - - - L. farciminis 20184 - ~ - L. gasseri 20243 n.d. - - L. alimentarius 20249 + - - L. jensenii 20557 + - - L. haloferax volcanii 5176 n.d. - - L. haloarcula vallismortis 3756 n.d. - - + = boa actividade = actividade moderada n = nenhuma actividade d. não determinado

Exemplo 3: determinação do excesso enantiomérico com diferentes substratos 48

Na determinação do excesso enantiomérico procedeu-se como no exemplo 2. Apenas foi reduzida para 50 mg a quantidade de células utilizada. a) ensaios com ácido L-(-)-3-fenil-láctico como substrato

Primeiro foram misturados 50 mg de células liofilizadas com 1 mL de tampão bis-tris (50 mM, pH 6), que foram reidratadas durante 1 hora no agitador, a 42°C e a 150 r.p.m. Em seguida foram adicionados, em cada caso, 5 mg do substrato dissolvidos em 100 pL de tampão e foram incubados em estufa com agitação (30°C, 150 r.p.m.). Todas as amostras foram medidas, em cada caso, após 24 ou 48 horas, por meio de GC quirálica. Para se conseguir uma separação dos enantiómeros por GC, tiveram que ser obtidos derivados de todos os compostos ensaiados. A preparação dos derivados foi realizada com BF3~metanol (ver acima) ou com anidrido de ácido trifluoracético. Para a obtenção dos derivados com o anidrido de ácido triflúor-acético 5 mg de ácido 3-fenil-láctico foram dissolvidos em 500 pL de CH2CI2, foram misturados com 5 gotas de anidrido de ácido trifluoracético, agitou-se 1 minuto à temperatura ambiente, em seguida misturou-se com cerca de 500 pL de H20. A fase orgânica foi seca com Na2S04, em seguida foi realizada a medição em GC com coluna quirálica. O cálculo dos resultados foi realizado de acordo com as seguintes fórmulas: e.e. [%]: (R-S)/(R+S) x 100 reagido [%]: R/(R+S) x 100 racemização [%]: 2R/(R+S) x 100 49

Além da estirpe Lactobacillus paracasei, subespécie paracasei DSM 20008, descobriu-se que as outras quatro estirpes indicadas a seguir possuíam uma boa ou excelente actividade de racemase relativamente ao ácido L-(-)-3-fenil-láctico - Lactobacillus paracasei subespécie paracasei DSM 2649 - Lactobacillus paracasei subespécie paracasei DSM 20207 - Lactobacillus delbrueckii subespécie delbrueckii DSM 20074 - Lactobacillus oris DSM 4864

Os resultados para as estirpes anteriores são apresentados no Quadro 7 a seguir, divididos segundo as condições da cultura (agitação ou estufa de secagem; atmosfera de árgon ou ar) e a duração da cultura.

Quadro 7: resultados da selecção com ácido L(-)-fenil-láctico

Estirpe Estufa de secagem (árgon) Agitador (ar) Estufa de secagem (ar) Número DSM 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h e. Rea- Racem. e. Rea- Racem. e. Rea- Racem e. Rea- Racem e. Rea- Racem e. Rea- Racem Dia de e. gido e. gido e. gido e. gido e. gido e. gido colheita [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] [%] 2649 3o 80 10 20 49 26 51 69 15 31 51 24 49 77 12 23 0 50 100 4o 14 43 86 0 50 100 20207 3o 8 46 92 0 50 100 4° 65 17 35 46 26 54 17 41 83 0 50 100 20074 3o 83 8 16 64 18 36 - - - - - - 13 43 87 0 50 100 4864 4o 23 38 77 0 50 100 70 15 30 45 27 55 20008 3o 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 51

Para se verificar se a actividade de racemase observada estava correlacionada com uma actividade de lactato-racemase, fez-se reagir o substrato natural ácido L-( + )-láctico com as estirpes que apresentavam uma actividade boa a muito boa com o ácido L-(-)-3-fenil-láctico.

Provou-se que na reacção do substrato natural ácido L-(+)-láctico com as estirpes DSM 20207, 20074 e 20008 logo após 24 horas se podia detectar uma racemização de 100%.

No caso da estirpe DSM 2 64 9 não se chegou a qualquer reacção. b) ensaios com diversos outros substratos alquilados

Foram utilizados como substratos: ácido (S) - ( + )-2-hidroxi-3-metilbutanóico (C5H10O3) ácido (S) - (-)-2-hidroxi-isocaprónico (C6H1203)

Ambos os substratos foram levados a reagir com todas as estirpes. Em cada caso foi medido o grau de racemização após 24 horas e 48 horas, por meio de GC.

No caso do ácido S)-(+)-2-hidroxi-3-metilbutanóico apenas a estirpe DSM 20207 manifestou actividade. Em relação ao substrato ácido (S)-(-)-2-hidroxi-isocaprónico manifestaram actividade de racemização um total de 5 estirpes. Os resultados são apresentados nos Quadros 8 e 9.

Quadro 8: selecção com o ácido (S)-(+)-2-hidroxi-3- metilbutanóico estirpe 24 h 48 h e. e. [%] Reagido [%] Racémico [%] e. e. [%] Reagido [%] Racémico [%] DS 20207 86 7 14 73 14 27 52

Quadro 9: selecção com o ácido (S)-(-)-2-hidroxi- isocaprónico estirpe 24 h 48 h e. e. [%] Reagido [%] Racémico [%] e. e. [%] Reagido [%] Racémico [%] DSM 2649 88 6 12 75 12 25 DSM 20008 85 7 15 82 9 18 DSM 20207 94 3 6 73 14 17 DSM 20074 94 3 6 93 4 7 DSM 20017 86 7 14 89 10 20

Resumindo, pode dizer-se que apresentam actividade as mesmas estirpes que também eram activas em relação ao ácido L- (-)-3-fenil-láctico. c) ensaios com o ácido (S)-2-hidroxi-4-fenilbutirico

Foi medido o grau de racemização por meio de HPLC, em cada caso após 24 horas e após 48 horas. Os resultados são apresentados no Quadro 10.

Quadro 10: selecção com o ácido (S)-2-hidroxi-4- fenilbutírico estirpe 24 h e. e. [%] Reagido [%] Racémico [%] DSM 2649 6 47 94 DSM 20054 90 5 10 DSM 20190 70 15 30 DSM 20008 25 38 75 DSM 20207 3 48 97 DSM 20749 48 26 52

Em ligação com a presente invenção, as seguintes estirpes de microrganismos do DSMZ, acessíveis publicamente, foram depositadas novamente em 11 de Julho de 2003, de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste. 53 Número DSM Número de depósito 20207 DSM 15755 20074 DSM 15754 20017 DSM 15753 4864 DSM 15752 2649 DSM 15751

Lisboa, 9 de Junho de 2010

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a isomerização microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de fórmula I

   em que R representa C2-C8-alquilo ou C2-C8-alcenilo ou -(CH2)n~ Cic, em que n representa um valor em número inteiro de 0 a 4 e Cic representa um anel carbociclico ou heterociclico, com um ou dois núcleos, eventualmente substituídos uma ou mais vezes, em que um substrato, que contém essencialmente uma primeira forma estereoisomérica de um ácido alfa-hidroxicarboxílico de fórmula (I), é isomerizado com o auxilio de um extracto, contendo enzimas, de um microrganismo, ou na presença de células completas de um microrganismo, em que o microrganismo para a racemização é escolhido entre microrganismos naturais ou recombinantes dos géneros Lactobacillus ou Lactococcus, em que para a racemização está apto pelo menos um composto escolhido entre as formas (R) e/ou (S) de lactato de fenilo, lactato de 4-fluorfenilo, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutirico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentanocarboxílico e ácido 2-hidroxi-3-metil-butírico, e eventualmente é isolada a mistura de isómeros formada neste caso, ou um segundo estereoisómero formado, ou um segundo estereoisómero formado é eliminado do equilíbrio da reacção.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o microrganismo é escolhido entre L. paracasei, L. delbrueckii, L. sakei e L. oris. 2
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, em que o microrganismo é escolhido entre as estirpes L. paracasei DSM 20207 (DSM 15755) e DSM 2649 (DSM 15751), L. delbrueckii DSM 20074 (DSM 15754), L. sakei DSM 20017 (DSM 15753) e L. oris DSM 4864 (DSM 15752) .
4. 4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que, a partir da mistura de isómeros formada, essencialmente se elimina o estereoisómero pretendido e o residuo é de novo submetido a uma isomerização.
5. 5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que a mistura de isómeros formada é submetida a uma reacção consecutiva estereosselectiva química ou enzimática e a mistura reactiva em processamento é de novo submetida a uma isomerização.
6. 6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que a reacção de isomerização é acoplada a uma reacção consecutiva enantioselectiva, química ou enzimática, em que o estereoisómero formado desejado do ácido alfa-hidroxicarboxílico é eliminado do equilíbrio da reacção.
7. 7. Processo de acordo com uma das reivindicações 5 e 6, em que a reacção consecutiva enantioselectiva, química ou enzimática, é escolhida entre uma esterificação e uma amidação do ácido alfa-hidroxicarboxílico. Lisboa, 9 de Junho de 2010