ES2356271T3 - Proceso para la preparación de ácidos 2-hidroxicarboxílicos empleando bacterias de los géneros pseudonomas, rhodococcus o bacillus. - Google Patents

Proceso para la preparación de ácidos 2-hidroxicarboxílicos empleando bacterias de los géneros pseudonomas, rhodococcus o bacillus. Download PDF

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Abstract

Un proceso para producir un compuesto de ácido -hidroxicarboxílico que contiene azufre representado por la fórmula (2): en la que R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono, o un grupo arilo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono, que comprende someter un cetol que contiene azufre representado por la fórmula (1): en la que R1 es igual a lo definido anteriormente, a la acción de células microbianas de un microorganismo que pertenece al género Pseudomonas, Rhodococcus, o Bacillus, capaz de convertir el cetol que contiene azufre en un compuesto de ácido -hidroxicarboxílico que contiene azufre correspondiente, o un material tratado del mismo, en el que el material tratado se selecciona entre células microbianas tratadas con un disolvente orgánico después de cultivarlas, células microbianas sometidas a tratamiento de liofilización o tratamiento alcalino, células microbianas alteradas física o enzimáticamente, enzimas sin procesar separadas y extraídas de estos materiales tratados y material inmovilizado de estos materiales tratados.

Description

La presente invención se refiere a un proceso para producir un ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre.
Hasta ahora, se ha empleado la hidrólisis de un compuesto de hidroxinitrilo (cianohidrina) como un proceso 5 para producir un ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre. Industrialmente, el ácido sulfúrico se emplea como catalizador. Además, por ejemplo, los documentos JP 58-15120 B, JP 2-84198 A y JP 4-40898 describen la hidrólisis de un compuesto de hidroxinitrilo mediante la acción de un microorganismo para convertirlo en un ácido hidroxicarboxílico correspondiente.
Sin embargo, en un proceso que emplea ácido sulfúrico como catalizador, un compuesto de hidroxinitrilo se 10 hace reaccionar con ácido sulfúrico para producir, además del ácido hidroxicarboxílico objetivo, una cantidad equimolar de sulfato amónico como subproducto. Por tanto, se requiere una etapa para recuperar el subproducto, que hace que las etapas de producción sean complicadas. Además, en un proceso para producir un compuesto de ácido hidroxicarboxílico a partir de un compuesto de hidroxinitrilo correspondiente mediante el uso de un microorganismo, hay problemas tales que la actividad enzimática poseída por el microorganismo se inhibe, debido a 15 los productos de degradación del compuesto de hidroxinitrilo, es decir, ciano, etc., y se requiere el tratamiento de una gran cantidad de una sal de amonio producida, lo que implica un incremento en los costes de producción.
Los documentos de patente WO 2006/030698 A (23 de marzo de 2006) y EP 1 795 602 A (13 de junio de 2007) describen un proceso para la preparación de ácido 2-hidroxi-4-(alquiltio o ariltio) butanoico mediante conversión microbiana de 4-(alquiltio o ariltio) butano-1,2-diol empleando bacterias del género Pseudomonas, 20 Rhodococcus, o Bacillus.
El documento de patente WO 02/33110 A (25 de abril de 2002) describe un proceso para la preparación de ácido 2-hidroxi-4-(alquiltio) butanoico mediante desaminación enzimática del ácido 2-amino 4-(alquiltio) butanoico para formar ácido 2-oxo-4-(alquiltio) butanoico y una reducción enzimática posterior del ácido 2-oxo-4-(alquiltio) butanoico para formar ácido 2-hidroxi 4-(alquiltio) butanoico. 25
Descripción de la Invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para producir un ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre, sin que exista el peligro de que se produzca una gran cantidad de subproducto y que la actividad enzimática se inhiba.
Esto es, la presente invención proporciona: 30
1. Un proceso para producir un compuesto de ácido -hidroxicarboxílico que contiene azufre representado por la fórmula (2)
en la que R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene d 1 a 8 átomos de carbono, o un grupo arilo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono, que comprende someter un cetol que contiene azufre representado por 35 la fórmula (1):
en la que R1 es igual a lo definido anteriormente, a la acción de células microbianas de un microorganismo que pertenece al género Pseudomonas, Rhodococcus, o Bacillus, capaces de convertir el cetol que contiene azufre en un compuesto de ácido -hidroxicarboxílico que contiene azufre correspondiente, o un material tratado del mismo, 40 en el que el material tratado se selecciona a partir de células microbianas tratadas con un disolvente orgánico
después de cultivarlas, células microbianas sometidas a tratamiento de liofilización o tratamiento alcalino, células microbianas alteradas física o enzimáticamente, enzimas sin procesar separadas y extraídas de estos materiales tratados y material inmovilizado de estos materiales tratados.
2. El proceso de acuerdo con el punto 1 anterior, en el que el microorganismo pertenece al género Pseudomonas, o Rhodococcus, que se ha cultivado en presencia de un alcohol primario o secundario. 5
3. El proceso de acuerdo con los puntos 1 o 2 anteriores, en el que el microorganismo pertenece a Pseudomonas putida, Pseudomonas diminuta, Pseudomonas mendocina, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, o Rhodococcus sp;
4. El proceso de acuerdo con el punto 1 anterior, en el que el microorganismo pertenece a Bacillus alvei;
5. El proceso de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 3 anteriores, en el que el microorganismo es 10 Pseudomonas putida IFO14164t, Pseudomonas putida IAM1236, Pseudomonas diminuta JCM2788t, Pseudomonas mendocina IFO14162, Rhodococcus globerulus ATCC15076, Rhodococcus erythropolis IFO12320, Rhodococcus rhodochrous ATCC15610, o Rhodococcus sp. ATCC19148;
6. El proceso de acuerdo con los puntos 1 o 4 anteriores, en el que el microorganismo es Bacillus alvei IFO3343t; 15
7. El proceso de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 6 anteriores, en el que R1 en el cetol que contiene azufre representado por la fórmula (1) es un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono;
8. El proceso de acuerdo con el punto 2 anterior, en el que el alcohol primario o secundario es un alcohol primario o secundario que tiene de 1 a 5 átomos de carbono; y
9. El proceso de acuerdo con el anterior 8, en el que el alcohol primario o secundario es 1-propanol. 20
De acuerdo con la presente invención, un compuesto de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre puede producirse eficazmente sin peligro de que se produzca una gran cantidad de subproducto, y se inhiba la actividad enzimática.
En lo sucesivo en este documento, se explicará el proceso de la presente invención.
En el cetol que contiene azufre representado por la fórmula (1), y el compuesto de ácido hidroxicarboxílico 25 que contiene azufre representado por la fórmula (2), los ejemplos del grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono de R1 incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo propilo, un grupo isopropilo, un grupo butilo, un grupo isobutilo, un grupo t-butilo, un grupo pentilo, un grupo hexilo, un grupo heptilo, y un grupo octilo. Además, los ejemplos del grupo arilo, que tiene de 6 a 20 átomos de carbono de R1 incluyen un grupo fenilo, un grupo tolilo, un grupo xililo, un grupo naftilo, y similares. 30
R1 en el compuesto de cetol que contiene azufre representado por la fórmula (1) es, preferiblemente, un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono.
El compuesto de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre representado por la fórmula (2), que se produce mediante el proceso de la presente invención, a partir del compuesto de cetol que contiene azufre correspondiente representado por la fórmula (1), y recuperado de una mezcla de reacción, puede estar en forma de 35 una sal.
El compuesto de la fórmula (1) puede producirse, por ejemplo, mediante una reacción de acoplamiento de 3-metiltiopropionaldehído y paraformaldehído usando una sal de tiazolinio y una base como catalizador (por ejemplo, véase la Solicitud de Patente Japonesa Nº 2006-199127) o una reacción similar.
Las células microbianas de un microorganismo o un material tratado del mismo para usarse como 40 catalizadores en el proceso de la presente invención pueden ser cualquier célula microbiana, o materiales tratados de las mismas, siempre y cuando sean células microbianas de un microorganismo que pertenezca al género Pseudomonas, Rhodococcus, o Bacillus, capaces de convertir un cetol que contiene azufre en un ácido -hidroxicarboxílico que contiene azufre correspondiente, y materiales tratados del mismo. Los ejemplos de las mismas incluyen células microbianas o materiales tratados de un microorganismo que pertenece al género 45 Pseudomonas, tal como Pseudomonas putida, Pseudomonas diminuta, o Pseudomonas mendocina, un microorganismo que pertenece al género Rhodococcus, tal como Rhodococcus globerulus, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, o Rhodococcus sp., y un microorganismo que pertenece al género Bacillus, tal como Bacillus alvei. Los ejemplos preferidos incluyen células microbianas o materiales tratados de un microorganismo que pertenece al género Rhodococcus, tal como Rhodococcus globerulus, Rhodococcus 50 erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, o Rhodococcus sp. Otros ejemplos preferidos incluyen células microbianas o materiales tratados de un microorganismo que pertenece al género Rhodococcus, tal como Rhodococcus rhodochrous, o Rhodococcus sp.
Los ejemplos específicos de las mismas incluyen células microbianas o materiales tratados de un microorganismo de Pseudomonas putida IF014164t, Pseudomonas putida IAM1236, Pseudomonas diminuta 55
JCM2788t, Pseudomonas mendocina IF014162, Rhodococcus globerulus ATCC15076, Rhodococcus erythropolis IFO12320, Rhodococcus rhodochrous ATCC15610, Rhodococcus sp. ATCC19148, o Bacillus alvei IFO3343t, que se cultiva en presencia de agua. Los ejemplos preferidos incluyen células microbianas o materiales tratados de un microorganismo de Rhodococcus globerulus ATCC15076, Rhodococcus erythropolis, IFO12320, Rhodococcus rhodochrous ATCC15610, o Rhodococcus sp. ATCC19148, y otros ejemplos preferidos incluyen células microbianas 5 o materiales tratados de un microorganismo de Rhodococcus rhodochrous ATCC15610 o Rhodococcus sp. ATCC19148, que se cultiva en presencia de agua.
De acuerdo con el proceso de la presente invención, el grupo carbonilo del cetol que contiene azufre representado por la fórmula (1) puede reducirse, y el grupo hidroxilo puede oxidarse preferentemente. El "oxidarse preferentemente" empleado aquí significa que la oxidación del grupo hidroxilo primario preferentemente progresa en 10 comparación con la oxidación del azufre o del cetol que contiene azufre.
El microorganismo que pertenece al género Pseudomonas, tal como Pseudomonas putida, Pseudomonas diminuta, o Pseudomonas mendocina, el microorganismo que pertenece al género Rhodococcus, tal como Rhodococcus globerulus, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, o Rhodococcus sp., o los microorganismos que pertenecen al género Bacillus, tales como Bacillus alvei, que se emplea en la presente 15 invención, puede cultivarse empleando un medio de cultivo para cultivar diversos microorganismos, que contienen apropiadamente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sal orgánica, una sal inorgánica, y similares.
Los ejemplos de la fuente de carbono contenida en el medio de cultivo incluyen glucosa, sacarosa, glicerol, almidón, alcohol, ácido orgánico y melaza. Como alcoholes se prefieren, particularmente, alcoholes primarios o secundarios que tienen 1 a 5 átomos de carbono, y los ejemplos de los mismos incluyen metanol, etanol, 1-propanol, 20 2-propanol, 1-butanol, 2-metil-1-propanol, y 2,2-dimetil-1-propanol. Mediante el cultivo del microorganismo anterior en un medio de cultivo al que se le añade alcohol, se puede mejorar la reactividad. Los ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen extracto de levadura, extracto de carne, peptona, ácido casamino, extracto de malta, polvo de semilla de soja, extracto soluble de maíz, polvo de semilla de algodón, levadura seca, sulfato amónico y nitrato sódico, y los ejemplos de la sal orgánica y la sal inorgánica incluyen cloruro sódico, cloruro potásico, carbonato 25 sódico, fosfato monopotásico, fosfato dipotásico, carbonato cálcico, acetato amónico, sulfato magnésico, sulfato cúprico, sulfato de cinc, sulfato férrico y cloruro de cobalto.
Los ejemplos del método de cultivo incluyen cultivo sólido, y cultivo líquido (cultivo en tubo de ensayo, cultivo en matraz, cultivo de fermentación en tarro, etc.).
La temperatura de cultivo y un pH de un medio de cultivo líquido no están particularmente limitados, 30 siempre y cuando se encuentren en un intervalo en el que pueda crecer el microorganismo a emplearse en la presente invención. Por ejemplo, la temperatura de cultivo se encuentra normalmente en un intervalo de aproximadamente 15 a 45ºC, y el pH de un medio de cultivo líquido se encuentra normalmente en un intervalo de aproximadamente 4 a 8. El tiempo de cultivo puede seleccionarse apropiadamente dependiendo de las condiciones de cultivo, y normalmente es 1 a 7 días aproximadamente. 35
Las células microbianas cultivadas pueden emplearse tal cual en el proceso de la presente invención. Para el empleo de células microbianas tal cual, por ejemplo, (1) puede emplearse un medio líquido cultivado tal cual o (2) se recogen células microbianas mediante la centrifugación de un medio líquido cultivado, seguido del empleo de las células recogidas (si fuera necesario, como células húmedas tras lavarlas con un tampón o con agua).
Como alternativa, en el proceso de la presente invención, puede emplearse un material tratado de las 40 células microbianas obtenidas como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos del material tratado incluyen células microbianas tratadas con un disolvente orgánico (por ejemplo, acetona, etanol, etc.) tras el cultivo de las mismas, células microbianas sometidas a tratamiento de liofilización o tratamiento alcalino, células microbianas alteradas física o enzimáticamente, enzimas sin procesar separadas y extraídas de estos materiales tratados. Además, el material tratado incluye un material inmovilizado del material tratado previamente mencionado preparado por un 45 método conocido.
El proceso de la presente invención se realiza normalmente en presencia de agua. En este caso, el agua puede estar en forma de un tampón. Los ejemplos de un agente tamponante empleado en el tampón incluyen sales de metales alcalinos de ácido fosfórico, tales como fosfato sódico, fosfato potásico, etc., y sales de metales alcalinos de ácido acético, tales como acetato potásico, etc. 50
Como alternativa, el proceso de la presente invención puede realizarse en presencia de agua y un disolvente orgánico hidrófobo. Los ejemplos del disolvente orgánico hidrófobo a emplear incluyen ésteres tales como formiato de etilo, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de butilo, propionato de etilo, propionato de butilo, etc., alcoholes tales como alcohol n-butílico, alcohol n-amílico, alcohol n-octílico, etc., hidrocarburos aromáticos tales como benceno, tolueno, xileno, etc., éteres tales como éter dietílico, éter diisopropílico, metil terc-butiléter, etc., e 55 hidrocarburos halogenados tales como cloroformo, 1,2-dicloroetano, etc., además de una mezcla de los mismos.
Además, el proceso de la presente invención también puede realizarse en presencia de agua y un disolvente orgánico hidrófilo. Los ejemplos del disolvente orgánico hidrófilo a emplear incluyen alcoholes tales como metanol, etanol, etc., cetonas, tales como acetona, etc., y éteres tales como dietoximetano, tetrahidrofurano,
dioxano, etc., además de una mezcla de los mismos.
El proceso de la presente invención se realiza normalmente en un intervalo de pH de la capa acuosa de 3 a 10, pero el pH puede cambiarse apropiadamente en un intervalo tal que la reacción transcurra.
El proceso de la presente invención se realiza normalmente en un intervalo de aproximadamente 0 a 60ºC, pero la temperatura puede cambiarse apropiadamente en un intervalo tal que la reacción transcurra. 5
El proceso de la presente invención se realiza normalmente en un intervalo de aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 10 días. El punto final de la reacción puede confirmarse, tras la finalización de la adición del material de partida, es decir, el cetol que contiene azufre, mediante la medición de la cantidad de cetol que contiene azufre, en la mezcla de reacción, mediante, por ejemplo, cromatografía de líquidos, cromatografía de gases o similares. 10
La concentración de materia prima, es decir, el cetol que contiene azufre en el proceso de la presente invención normalmente no es superior al 50% (p/v), y el cetol que contiene azufre puede añadirse continua o secuencialmente a un sistema de reacción para mantener una concentración casi constante del cetol que contiene azufre en el sistema de reacción.
En el proceso de la presente invención, si es necesario, por ejemplo, puede añadirse al sistema de reacción 15 un azúcar, tal como glucosa, sacarosa, fructosa, etc., un tensioactivo tal como Triton X-100 (marca comercial registrada), Tween 60 (marca comercial registrada), etc.
Tras la finalización de la reacción, el compuesto objetivo de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre correspondiente puede recuperarse de una mezcla de reacción mediante la realización de un post-tratamiento convencional, tal como extracción con disolvente orgánico y concentración. El compuesto de ácido hidroxicarboxílico 20 que contiene azufre recuperado puede purificarse además, si fuera necesario, mediante cromatografía en columna, destilación o similares. El proceso de la presente invención se explicará en detalle a continuación mediante Ejemplos.
Ejemplo de Referencia 1
Síntesis de 4-metiltio-2-oxo-1-butanol 25
Un matraz de 200 ml equipado con un agitador magnético se cargó con 23,7 g de 3-metiltiopropionaldehído, 17,7 g de paraformaldehído, 4 g de bromuro de 3-etilbenzotiazolinilo y 100 g de terc-butanol a temperatura ambiente, y la mezcla se agitó. A esta mezcla se le añadieron 1,3 g de trietilamina, la temperatura se aumentó a una temperatura interna de 80ºC, y la mezcla se agitó a la misma temperatura durante 24 horas. Tras la finalización de la reacción, se añadieron 100 g de acetato de etilo, la mezcla se lavó dos veces con 20 g de agua, y la capa orgánica 30 resultante se concentró. El aceite resultante se destiló a presión reducida, se recuperaron 15 g de 3-metiltiopropionaldehído como fracción a una temperatura de destilación de 45 a 50ºC (0,5 a 0,6 kPa), y se obtuvieron 15 g de una fracción (en lo sucesivo en este documento, fracción A) a una temperatura de destilación de 85 a 95ºC (0,3 kPa). Cuando se analizó la fracción A mediante un método de porcentaje de área de cromatografía de gases, 4-(metiltio)-2-oxo-1-butanol se encontraba en una concentración del 40%. La fracción A se purificó adicionalmente 35 mediante una columna de gel de sílice. Después de expulsar impurezas de baja polarización mediante elución con acetato de etilo:n-hexano = 1:4, se eluyó el 4-(metiltio)-2-oxo-1-butanol con acetato de etilo:n-hexano = 2:4. El disolvente se retiró por destilación para obtener 1,4 g de una fracción de 4-(metiltio)-2-oxo-1-butanol que tenía una pureza del 91% (método de porcentaje de área de cromatografía de gases) y 2,0 g de una fracción que tenía una pureza del 82% (método de porcentaje del área de cromatografía de gases). Todas estas fracciones se solidificaron 40 a temperatura ambiente. Los datos espectrales de 4-(metiltio)-2-oxo-1-butanol 1H-RMN (ppm, DMSO-d6, patrón de TMS): 2,05 (s, 3H), 2,62 (m, 2H), 2,70 (m, 2H), 4,06 (s, 2H), 5,13 (sa, 1H) EM, m/z (intensidad relativa): 134 (32, M+), 106 (20), 103 (19), 86 (5), 75 (55), 61 (100)
Ejemplo 1
Producción del compuesto de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre a partir de cetol que contiene azufre, de 45 acuerdo con el proceso de la presente invención.
En un tubo de ensayo, se pusieron 5 ml de un medio esterilizado (obtenido añadiendo 20 g de 1-propanol, 5 g de polipeptona, 3 g de extracto de levadura, 3 g de extracto de carne, 0,2 g de sulfato amónico, 1 g de dihidrogenofosfato potásico y 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidrato en 1 l de agua, y después ajustando el pH a 7,0), y el medio se inoculó con la cepa ATCC15610 que pertenecía a Rhodococcus rhodochrous. El medio inoculado 50 se cultivó en agitación a 30ºC en condiciones aerobias. Tras la finalización del cultivo, las células microbianas se separaron por centrifugación para obtener células microbianas vivas. En un tubo de ensayo con apertura a rosca se puso 1 ml de un tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7), las células microbianas vivas se añadieron al mismo para preparar una suspensión. A la suspensión se le añadió 1 mg de un material de partida (4-metiltio-2-oxo-1-butanol), y entonces la mezcla resultante se agitó a 30ºC durante 7 días. 55
Tras la finalización de la reacción, se muestrearon 0,5 ml de la mezcla de reacción. Después de retirar las células microbianas de la mezcla de muestra, la cantidad de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido se analizó
mediante cromatografía de líquidos. Como resultado, la concentración ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido fue de 0,75 g/l.
Condiciones de análisis de contenido
Columna: Cadenza CD-C18 (4,6 mmf x 15 cm, 3 m)
(fabricada por Imtakt) 5
Fase móvil: ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% como solución A, metanol como solución B
Tiempo (min)
Solución A (%) : Solución B (%)
0
80 : 20
10
80 : 20
20
50 : 50
30
50 : 50
30,1
80 : 20
Caudal: 0,5 ml/min
Temperatura de columna: 40ºC
Detección: 220 nm
Ejemplo 2 10
Producción del compuesto de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre a partir de cetol que contiene azufre, de acuerdo con el proceso de la presente invención.
En un tubo de ensayo se pusieron 5 ml de un medio esterilizado (obtenido añadiendo 20 g de 1-propanol, 5 g de polipeptona, 3 g de extracto de levadura, 3 g de extracto de carne, 0,2 g de sulfato amónico, 1 g de dihidrogenofosfato potásico y 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidrato en 1 l de agua, y después ajustando el pH a 15 7,0), y el medio se inoculó con la cepa ATCC19148 que pertenecía a Rhodococcus sp. El medio inoculado se cultivó en agitación a 30ºC en condiciones aerobias. Tras la finalización del cultivo, las células microbianas se separaron por centrifugación para obtener células microbianas vivas. En un tubo de ensayo con apertura a rosca se puso 1 ml de un tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7), las células microbianas vivas se añadieron al mismo para preparar una suspensión. A la suspensión se le añadió 1 mg de un material de partida (4-metiltio-2-oxo-1-butanol), y entonces 20 la mezcla resultante se agitó a 30ºC durante 7 días.
Tras la finalización de la reacción, se muestrearon 0,5 ml de la mezcla de reacción. Después de retirar las células microbianas de la mezcla de muestra, la cantidad de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido se analizó mediante cromatografía de líquidos. Como resultado, la concentración del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido fue de 0,43 g/l. 25
Condiciones de análisis de contenido
Columna: Cadenza CD-C18 (4,6 mmf x 15 cm, 3 m)
(fabricada por Imtakt)
Fase móvil: ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% como solución A, metanol como solución B
Tiempo (min)
Solución A (%) : Solución B (%)
0
80 : 20
10
80 : 20
20
50 : 50
30
50 : 50
30,1
80 : 20
Caudal: 0,5 ml/min 30
Temperatura de columna: 40ºC
Detección: 220 nm
Ejemplo 3
Producción del compuesto de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre a partir de cetol que contiene azufre, de acuerdo con el proceso de la presente invención.
En un tubo de ensayo se pusieron 5 ml de un medio esterilizado (obtenido añadiendo 20 g de glucosa, 5 g de polipeptona, 3 g de extracto de levadura, 3 g de extracto de carne, 0,2 g de sulfato amónico, 1 g de 5 dihidrogenofosfato potásico y 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidrato en 1 l de agua, y después ajustando el pH a 7,0), y el medio se inoculó con la cepa IFO3343t que pertenecía a Bacillus alvei. El medio inoculado se cultivó en agitación a 30ºC en condiciones aerobias. Tras la finalización del cultivo, las células microbianas se separaron por centrifugación para obtener células microbianas vivas. En un tubo de ensayo con apertura a rosca se puso 1 ml de un tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7), las células microbianas vivas se añadieron al mismo para preparar una 10 suspensión. A la suspensión se le añadió 1 mg de un material de partida (4-metiltio-2-oxo-1-butanol), y entonces la mezcla resultante se agitó a 30ºC durante 7 días.
Tras la finalización de la reacción, se muestrearon 0,5 ml de la mezcla de reacción. Después de retirar las células microbianas de la mezcla de muestra, la cantidad de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido se analizó mediante cromatografía de líquidos. Como resultado, la concentración ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido fue 15 de 0,03 g/l.
Condiciones de análisis de contenido
Columna: Cadenza CD-C18 (4,6 mmf x 15 cm, 3 m)
(fabricada por Imtakt)
Fase móvil: ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% como solución A, metanol como solución B 20
Tiempo (min)
Solución A (%) : Solución B (%)
0
80 : 20
10
80 : 20
20
50 : 50
30
50 : 50
30,1
80 : 20
Caudal: 0,5 ml/min
Temperatura de columna: 40ºC
Detección: 220 nm
Ejemplo 4
Producción del compuesto de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre a partir de cetol que contiene azufre, de 25 acuerdo con el proceso de la presente invención.
En un tubo de ensayo se pusieron 5 ml de un medio esterilizado (obtenido añadiendo 20 g de 1-propanol, 5 g de polipeptona, 3 g de extracto de levadura, 3 g de extracto de carne, 0,2 g de sulfato amónico, 1 g de dihidrogenofosfato potásico y 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidrato en 1 l de agua, y después ajustando el pH a 7,0), y el medio se inoculó con cada cepa de Pseudomonas putida IFO14164t, Pseudomonas putida IAM1236, 30 Pseudomonas diminuta JCM2788t, Pseudomonas mendocina IFO14162, Rhodococcus globerulus ATCC15076, y Rhodococcus erythropolis IFO12320. Cada medio inoculado se cultivó en agitación a 30ºC en condiciones aerobias. Tras la finalización del cultivo, las células microbianas se separaron por centrifugación para obtener células microbianas vivas. En un tubo de ensayo con apertura a rosca se puso 1 ml de un tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7), las células microbianas vivas se añadieron al mismo para preparar una suspensión. A la suspensión se le 35 añadió 1 mg de un material de partida (4-metiltio-2-oxo-1-butanol), y entonces la mezcla resultante se agitó a 30ºC durante 5 o 10 días.
Tras la finalización de la reacción, se muestrearon 0,5 ml de la mezcla de reacción. Después de retirar las células microbianas de la mezcla de muestra, la cantidad de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido se analizó mediante cromatografía de líquidos. Los resultados se muestran en la Tabla 1 40
Tabla 1
Cepa
Tiempo de reacción (días) Concentración de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico producido (g/l)
Pseudomonas putida IFO14164t
10 0,43
Pseudomonas putida IAM1236
5 0,27
Pseudomonas diminuta JCM2788t
10 0,45
Pseudomonas mendocina IFO14162
10 0,25
Rhodococcus globerulus ATCC15076
5 0,02
Rhodococcus erythropolis IFO12320
5 0,05
Condiciones de análisis de contenido
Columna: Cadenza CD-C18 (4,6 mmf x 15 cm, 3 m) (fabricada por Imtakt)
Fase móvil: ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% como solución A, metanol como solución B
Tiempo (min)
Solución A (%) : Solución B (%)
0
80 : 20
10
80 : 20
20
50 : 50
30
50 : 50
30,1
80 : 20
Caudal: 0,5 ml/min 5
Temperatura de columna: 40ºC
Detección: 220 nm
De acuerdo con la presente invención, un compuesto de ácido hidroxicarboxílico que contiene azufre puede producirse eficazmente.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un proceso para producir un compuesto de ácido -hidroxicarboxílico que contiene azufre representado por la fórmula (2):
    en la que R1 representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono, o un grupo arilo que tiene de 6 a 20 átomos de carbono, que comprende someter un cetol que contiene azufre representado por 5 la fórmula (1):
    en la que R1 es igual a lo definido anteriormente, a la acción de células microbianas de un microorganismo que pertenece al género Pseudomonas, Rhodococcus, o Bacillus, capaz de convertir el cetol que contiene azufre en un compuesto de ácido -hidroxicarboxílico que contiene azufre correspondiente, o un material tratado del mismo, en el 10 que el material tratado se selecciona entre células microbianas tratadas con un disolvente orgánico después de cultivarlas, células microbianas sometidas a tratamiento de liofilización o tratamiento alcalino, células microbianas alteradas física o enzimáticamente, enzimas sin procesar separadas y extraídas de estos materiales tratados y material inmovilizado de estos materiales tratados.
  2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo es uno que pertenece al género 15 Pseudomonas, o Rhodococcus, que se haya cultivado en presencia de un alcohol primario o secundario.
  3. 3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el microorganismo es uno que pertenece al género Pseudomonas putida, Pseudomonas diminuta, Pseudomonas mendocina, Rhodococcus globerulus, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus, rhodochrous, o Rhodococcus sp.
  4. 4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo es uno que pertenece a Bacillus 20 alvei.
  5. 5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el microorganismo es Pseudomonas putida IFO14164t, Pseudomonas putida IAM1236, Pseudomonas diminuta JCM2788t, Pseudomonas mendocina IFO14162, Rhodococcus globerulus ATCC15076, Rhodococcus erythropolis IFO12320, Rhodococcus rhodochrous ATCC15610, o Rhodococcus sp. ATCC19148. 25
  6. 6. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que el microorganismo es Bacillus alvei IFO3343t.
  7. 7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que R1 en el cetol que contiene azufre representado por la fórmula (1) es un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono.
  8. 8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el alcohol primario o secundario es un alcohol 30 primario o secundario que tiene de 1 a 5 átomos de carbono.
  9. 9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el alcohol primario o secundario es 1-propanol.
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