ES2343117T3 - Procedimiento para la isomerizacion microbiologica de acidos alfa-hidroxicarboxilicos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de la fórmula I, **(Ver fórmula)** en la cual R representa un alquilo C2-C8 o alquenilo C2-C8 o -(CH2)n-Cyc, de cadena lineal o de cadena ramificada, en la cual n representa un valor entero de 0 a 4 y Cyc es un anillo carbo o heterocíclico, de uno o dos núcleos, eventualmente, mono o polisustituido, en el cual se isomeriza un sustrato que contiene, esencialmente, una primera forma estereoisómera de un ácido alfa-hidroxicarboxílico de la fórmula (I), mediante un extracto enzimático de un microorganismo o en presencia de células enteras de un microorganismo, asimismo, el microorganismo está seleccionado entre microorganismos naturales o recombinantes de la especie de lactobacillus o lactococcus para la racemización, aptos para la racemización de, al menos, un compuesto seleccionado entre la forma (R) y/o la forma (S) de fenillactato, 4-fluorfenillactato, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentancarboxílico y 2-hidroxi-3-metilbutírico, y, eventualmente, se aísla del equilibrio de reacción la mezcla isómera obtenida o un segundo estereoisómero obtenido aislado, o se extrae del equilibrio de reacción un segundo estereoisómero.

Description

Procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos.

La presente invención comprende un procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos acorde a las reivindicaciones.

Estado actual de la técnica

Por el estado actual de la técnica se conocen las denominadas mandelato racemasas microbianas, que tanto in vitro como in vivo son capaces de racemizar el ácido amigdálico (G.l. Kenyon, J.A. Gerlt, G.A. Petsko y J.W. Kozarich, "Mandelate Racemase: Structure-Function Studies of a Pseudosymmetric Enzyme" (Mandelato racemasa: estudios de la función estructural de una enzima pseudosimétrica), Accts. Chem. Res., 28, 178-186 (1995); R. Li, V.M. Powers, J.W. Kozarich y G.l. Kenyon, "Racemization of Vinylglycolate Catalyzed by Mandelate Racemase" (Racemización de glicolatos de vinilo catalizados por mandelato racemasas), J. Org. Chem., 60, 3347-3351 (1995); S.S. Schafer, A.T. Kallarakal, J.W. Kozarich, J.A. Gerlt, J.R. Clifton y G.l. Kenyon, "Mechanism of the Reaction Catalyzed by Mandelate Racemase: The Structure and Mechanistic Properties of the D270N Mutant" (El mecanismo de la reacción catalizada por mandelato racemasa: la estructura y mecánica del mutante D270N), Biochemistry, 35, 5662-5669 (1996); B. Schnell et al., "Enzymatic Racemisation and its Application to Synthetic Biotranformations" (Racemización enzimática y su aplicación para las biotransformaciones sintéticas), Adv. Synth. Catal. 345, 653-666 (2003);U.T. Strauss and K. Faber, "Deracemization of (6) mandelic acid using a lipase-mandelate racemase two-enzyme system" (Desracemización de (6) ácido amigdálico utilizando un sistema de dos enzimas de lipasa-mandelato racemasa), Tetrahedron: Assymetry 10:4079-4081 (1999)).

El metabolismo de lactatos de bacterias de ácido láctico está descrito en S.-Q Liu, "Practical implications of lactat and pyruvate metabolism by lactic acid bacteria in food and beverage fermentations" (Implicancias prácticas del metabolismo de lactato y piruvato mediante bacterias ácido lácticas en fermentaciones de alimentos y bebidas), Int. J. Food Microbiol. 83, 115-131 (2003).

El póster-abstract publicado posteriormente, de S.M. Gluck et al., "Lactate Racemase as a versatile tool for the racemazation of \alpha-hydroxycarbolic acids" (Lactato racemasa como herramienta versátil de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos), Chemicke Listy 97, 363, P121 (2003) menciona la aplicación de lactato racemasas para la racemización de ácidos alfa-hidroxi.

Al mismo tiempo, existe una gran demanda de fabricación simple de sustancias quirales, no racémicas, por ejemplo, para la producción de sustancias activas en la industria farmacéutica. La racemización de catalización enzimática de una forma estereoisómera de un compuesto obteniendo el enantiómero deseado representaría un camino adecuado para la obtención del material quiral no racémico deseado. Las racemasas conocidas, sin embargo, se caracterizan por su elevada especificidad de sustrato. Por ello, la mandelato racemasa sólo es adecuada para la racemización biocatalítica de ácidos alfa-hidroxi beta,gamma-insaturados. No se aceptan ácidos alfa-hidroxicarboxílicos saturados (véase Felfer, U. et al., J. Mol. Catal. B: Enzymatic 15, 213 (2001)).

Breve descripción de la invención

El objeto de la presente invención es presentar microorganismos y preparados enzimáticos que presenten una actividad racémica novedosa, así como la presentación de procedimientos para la racemización de compuestos químicos estereoisómeros utilizando dichas enzimas o microorganismos.

Sorprendentemente, el objeto se alcanzó presentando un procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos acorde a la reivindicación 1.

Un primer objeto de la invención comprende un procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de la fórmula I

1

en la cual

R representa un alquilo C_{2}-C_{8} o alquenilo C_{2}-C_{8} o -(CH_{2})_{n}-Cyc, de cadena lineal o de cadena ramificada, preferentemente, un alquilo C_{2}-C_{8,} en el cual n representa un valor entero de 0 a 4, preferentemente, 1, 2 o 3, y Cyc es un anillo carbo o heterocíclico, de uno o dos núcleos, eventualmente, mono o polisustituido, por ejemplo, un anillo aromático preferentemente heteroaromático eventualmente sustituido, preferentemente, un anillo mononuclear aromático eventualmente sustituido,

en el cual se isomeriza un sustrato que contiene, esencialmente, una primera forma estereoisómera de un ácido alfa-hidroxicarboxílico de la fórmula (I) y eventualmente, se aísla la mezcla isómera obtenida o un segundo estereoisómero obtenido aislado, o se extrae del equilibrio de reacción un segundo estereoisómero.

Preferentemente, la isomerización enzimática se realiza mediante la conversión del sustrato con un extracto celular que contiene enzimas (por ejemplo, un extracto crudo tras la disolución celular y eliminación de fragmentos celulares) o en presencia de células enteras de un microorganismo definido en la reivindicación 1.

Los microorganismos especialmente adecuados son las bacterias de la especie de lactobacillus y lactococcus.

Acorde a una variante preferida, la conversión se realiza en presencia de células enteras de microorganismos de la especie de lactobacillus, o células enteras de un microorganismo recombinante que expresan una actividad enzimática definida anteriormente.

Los microorganismos preferidos están seleccionados entre l. paracasei, l. delbrueckii, l. sakei y l. oris, especialmente, entre las cepas l. paracasei DSM 20207 y DSM 2649, l. delbrueckii DSM20074, l. sakei DSM 20017 y l. oris DSM 4864.

Una actividad enzimática útil acorde a la invención comprende, por ejemplo, la racemización de, al menos, un compuesto seleccionado entre la forma (R) y/o la forma (S) de fenillactato, 4-fluorfenillactato, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentancarboxílico y 2-hidroxi-3-metilbutírico.

En un modo de ejecución preferido del procedimiento anterior, se extrae en gran parte el estereoisómero deseado de la mezcla isómera obtenida, preferentemente, tras aislar la mezcla del medio reactivo, por ejemplo, por cromatografía, reacción siguiente estereoselectiva química o enzimática y, eventualmente, otra separación del producto secuencial y el residuo que contiene, esencialmente, el estereoisómero no deseado, es sometido nuevamente a una isomerización.

Esto puede repetirse la cantidad de veces que sea deseado, hasta alcanzar una conversión completa, obteniendo el estereoisómero deseado o su producto secuencial.

En otra variante preferida del procedimiento, la mezcla isómera obtenida, preferentemente, tras el aislamiento de la mezcla del medio reactivo, por ejemplo, por cromatografía, se somete a una reacción siguiente química o enzimática estereoselectiva y la mezcla de reacción resultante que también contiene el isómero no convertido del ácido hidroxicarboxílico se somete nuevamente a una isomerización acorde a la invención. Esto puede repetirse la cantidad de veces que sea deseado, hasta alcanzar una conversión completa, obteniendo el estereoisómero deseado o su producto secuencial.

En otra variante preferida del procedimiento, la reacción de isomerización se acopla a una reacción siguiente enantioselectiva química o enzimática, preferentemente, en una denominada reacción en un solo tubo, asimismo, el estereoisómero deseado obtenido del ácido alfa-hidroxicarboxílico es extraído del equilibrio de reacción paso a paso o de manera continua.

Las reacciones siguientes enantioselectivas preferidas, químicas o enzimáticas, del paso de isomerización acorde a la invención, están seleccionadas entre una esterificación y una amidación de una forma estereoisómera del ácido alfa-hidroxicarboxílico. La reacción siguiente enantioselectiva puede realizarse, especialmente, en un grupo carboxilo o hidroxilo.

El procedimiento acorde a la invención también sirve como procedimiento de análisis de microorganismos que expresan la actividad enzimática definida anteriormente, en el que un microorganismo en el cual se sospecha dicha actividad se cultiva en presencia de un sustrato que contiene, esencialmente, una forma estereoisómera de un ácido alfa-hidroxicarboxílico de la fórmula I anterior, y el medio reactivo es analizado buscando racemización del sustrato (por ejemplo, reducción de la cantidad de una y/o el incremento de otra forma estereoisómera).

Un procedimiento de análisis de este tipo no está limitado a microorganismos especiales. Puede ser realizado, en principio, con todos los microorganismos eucarióticos y procarióticos conocidos y células animales o vegetales. Sin embargo, se prefieren aquellos microorganismos que forman o metabolizan lactato, por ejemplo, acido láctico o bacterias propiónicas. Las fuentes especialmente adecuadas son las bacterias de la especie de lactobacillus.

Preferentemente, se analizan aquellos microorganismos que racemizan el sustrato esencialmente estereoisómero en un 1 a 100%, preferentemente, en un 20 a 100%, especialmente, en un 50 a 100% u 80 a 100% (racemización (%) = 2R/(R+S) x 100; R = concentración de la forma R; S = concentración de la forma S). Las conversiones adecuadas se encuentran, a su vez, en el rango de 1 a 50%, preferentemente, de 5 a 50%, especialmente, de 15 a 50% o 30 a 50% (conversión (%) = R/(R+S) x 100.

Descripción detallada de la invención A. Conceptos y definiciones generales

Si no se especifica lo contrario, son válidos los siguientes significados generales:

"racematos" son mezclas equimolares de ambos enantiómeros de un compuesto óptimamente activo.

La "racemización" o "isomerización" se lleva a cabo, acorde a la invención, en el átomo de carbono alfa del ácido hidroxicarboxílico.

"Halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo, especialmente, flúor o cloro.

"Alquilo C_{2}-C_{8}" significa, preferentemente, radicales aquilo de cadena lineal o de cadena ramificada con 2 a 8, especialmente, 2 a 6 átomos de C, como etilo, i- o n-propilo, n-, i-, sec.- o terc.-butilo, n-pentilo o 2-metilo-butilo, n-hexilo, 2-metilo-pentilo, 3- metilo-pentilo, 2-etilo-butilo.

El "alquenilo C_{2}-C_{8}" representa los análogos mono o poliinsaturados, preferentemente, monoinsaturados de los radicales aquilo mencionados anteriormente con 2 a 8, especialmente, 2 a 6 átomos de carbono, asimismo, el doble enlace se puede hallar en cualquier posición de la cadena de carbonos.

"Arilo" es un radical aromático mono o polinuclear, preferentemente, mono o binuclear, eventualmente, sustituido, especialmente, fenilo o un naftilo enlazado en cualquier posición del anillo, como 1- o 2-naftilo. Estos radicales arilo pueden portar eventualmente 1 o 2 sustituyentes iguales o diferentes, seleccionados entre halógeno, alquilésteres bajos, alcoxi bajos acorde a la definición anterior o trifluormetilo.

B. Ácidos alfa-hidroxicarboxílicos racemizables

Los ácidos alfa-hidroxicarboxílicos que pueden ser convertidos por racemización, acorde a la invención, son aquellos de la fórmula anterior (I), en la cual R representa un alquilo bajo o alquenilo bajo o -(CH_{2})_{n}-Cyc, de cadena lineal o de cadena ramificada, en el cual n representa un valor entero de 0 a 4 y Cyc es un anillo carbo o heterocíclico, de uno o dos núcleos, eventualmente, mono o polisustituido, Dichos compuestos pueden ser racemizados acorde a la invención en una forma enantioméricamente pura, es decir, como enantiómero R o S o como mezcla no racémica de ambos enantiómeros.

Los ácidos alfa-hidroxicarboxílico de la fórmula (I) utilizados para la síntesis enzimática son compuestos en sí conocidos y se pueden conseguir utilizando procedimientos de síntesis orgánicos generalmente conocidos.

Como ejemplo de grupos carbo- y heterociclos Cyc debemos mencionar, especialmente, grupos mono o binucleares, preferentemente, mononucleares, con hasta 4, por ejemplo, 0, 1 o 2 heteroátomos anulares iguales o diferentes, seleccionados entre O, N y S.

Dichos anillos carbo o heterociclos comprenden especialmente 3 a 12, preferentemente, 4, 5 o 6 átomos de carbono anulares. Como ejemplo pueden mencionarse ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, sus análogos mono o poliinsaturados, como ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclopentadienilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclohexadienilo, cicloheptadienilo, y fenilo; así como radicales heterociclos de 5 a 7 eslabones, saturados o mono o poliinsaturados con 1 a 4 heteroátomos, seleccionados entre o, n y s. Se deben mencionar especialmente los radicales heterociclos derivados de pirrolidina, tetrahidrofurano, piperidina, morfolina, pirrol, furano, tiofeno, pirazol, imidazol, oxazol, tiazol, piridina, pirano, pirimidina, piridazina y pirazina.

Además, se deben mencionar los radicales binucleares, en cuyo caso uno de los carbo o heterociclos mencionados está condensado con otro heterociclo o carbociclo, por ejemplo, radicales derivados de cumarona, indol, quinolina y naftalina.

Los radicales Cyc pueden, a su vez, estar enlazados en cualquier posición al anillo, preferentemente, a través de un átomo de carbono anular.

Ejemplos de radicales Cyc adecuados son fenilo, naftilo, 2-tienilo, 3-tienilo; 2-furanilo, 3-furanilo; 2-piridilo, 3-piridilo o 4-piridilo; 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo; 4-metilo-2-tienilo, 3-etilo-2-tienilo, 2-metilo-3-tienilo, 4-propilo-3-tienilo, 5-n-butilo-2-tienilo, 4-metilo-3-tienilo, 3-metilo-2-tienilo; 3-cloro-2-tienilo, 4-bromo-3-tienilo, 2-yodo-3-tienilo, 5-yodo-3-tienilo, 4-flúor-2-tienilo, 2-bromo-3-tienilo, y 4-cloro-2-tienilo.

Los radicales Cyc también pueden ser mono o polisustituidos, por ejemplo, mono o disustituidos. Preferentemente, los sustituyentes se encuentran en un átomo de carbono anular. Ejemplos de sustituyentes adecuados son halógeno, alquilo bajo, alquileno bajo, alcoxi bajo, -OH, -SH, -NO_{2} o NR^{2}R^{3}, asimismo, R^{2} y R^{3} significan, independientemente entre sí, para H, metilo o etilo. Los sustituyentes preferidos son radicales halógenos.

Otro grupo preferido de radicales Cyc son los radicales arilo acorde a la definición anterior.

C. Enzimas con actividad racémica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos (ya no son objeto de la invención)

Las enzimas acordes a la invención con actividad racémica de ácido alfa-hidroxicarboxílico se pueden obtener, especialmente, a partir de microorganismos de la especie de los lactobacillus.

Las enzimas preferidas se pueden aislar a partir de las cepas de lactobacillus l. paracasei DSM 20207 (DSM 15755) y DSM 2649 (DSM 15751), l. delbrueckii DSM20074 (DSM 15754), l. sakei DSM 20017 (DSM 15753 y l. oris DSM 4864 (DSM 15752). Éstas se pueden obtener en la DSM (Deutsche Stammsammlung für Zellkulturen und Mikroorganismen o Colección alemana de cultivos celulares y microorganismos).

Las enzimas se pueden aislar de los cultivos celulares utilizando métodos bioquímicos preparativos usuales. A partir de las enzimas aisladas se pueden derivar posteriormente, de manera usual, las primeras informaciones de secuencias de aminoácidos, por ejemplo, mediante fragmentación de péptidos y secuenciación N-terminal.

Acorde a la invención, están comprendidos asimismo los "equivalentes funcionales" de las enzimas naturales, aislables de los anteriores organismos, con actividad racémica de ácido alfa-hidroxicarboxílico.

En el marco de la presente invención, los "equivalentes funcionales", o análogos de los racematos naturales, son polipéptidos diferentes de ellos que aún presentan la actividad biológica deseada, por ejemplo, especificidad de sustrato. Por ejemplo, se entiende por "equivalentes funcionales" aquellas enzimas que racemizan, al menos, un compuesto seleccionado entre fenillactato, 4-fluorfenillactato, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentancarboxílico, ácido 2-hidroxi-3-metilbutírico y que presentan, al menos, 20%, preferentemente, al menos, 50%, de modo preferido, al menos, 75%, de modo especialmente preferido, al menos, 90% de la actividad de una enzima natural racémica de una de las cepas mencionadas de lactobacillus o una actividad mayor que ésta.

Los equivalentes funcionales, además, son estables, preferentemente, de aproximadamente pH 4 a 10 y presentan, ventajosamente, un pH óptimo de aproximadamente pH 5 a 8, así como una temperatura óptima en el rango de 20ºC a 80ºC.

Acorde a la invención, también se entiende por "equivalentes funcionales", especialmente, mutantes que, en al menos una posición de secuencia, de las secuencias naturales de aminoácidos, presentan un aminoácido diferente del natural pero igualmente presentan una de las actividades biológicas mencionadas anteriormente. Los "equivalentes funcionales" comprenden entonces los mutantes obtenidos por una o múltiples adiciones, soluciones, deleciones y/o inversiones de aminoácidos, asimismo, las modificaciones mencionadas pueden presentarse en cualquier posición de secuencia, mientras conduzcan a un mutante con el perfil de características acorde a la invención. La equivalencia funcional también está dada, especialmente, si los modelos de reactividad entre el mutante y el polipéptido invariable coinciden cualitativamente, es decir, por ejemplo, se convierten los mismos sustratos a diferente velocidad.

Los "equivalentes funcionales" en el sentido anterior también son "precursores" de los polipéptidos descritos así como "derivados funcionales" y "sales" de los polipéptidos.

Los "precursores" son, a su vez, precursores naturales o sintéticos de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.

Con la expresión "sales" se abarca tanto las sales de grupos carboxilo como así también las sales de adición de ácido de grupos amino de la molécula de proteína acorde a la invención. Las sales de grupos carboxilo pueden ser obtenidas de manera conocida y comprenden sales inorgánicas, por ejemplo, sal de sodio, de calcio, de amonio, de hierro y de zinc, así como sales con bases orgánicas, por ejemplo, aminas, como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina y similares. Las sales de adición de ácido, por ejemplo, sales con ácidos minerales, como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y sales con ácidos orgánicos, como ácido acético y ácido oxálico, también son objeto de la invención.

Los "derivados funcionales" de enzimas acordes a la invención también pueden ser obtenidos en los grupos laterales de los aminoácidos funcionales o en sus extremos N o C terminales mediante técnicas conocidas. Dichos derivados comprenden, por ejemplo, ésteres alifáticos de grupos de ácido carboxílico, amidas de grupos de ácido carboxílico, que se pueden obtener por conversión con amoníaco o con una amina primaria o secundaria; derivados de N-acilo de grupos amino libres, obtenidos por conversión con grupos acilo; o derivados de O-acilo de grupos hidroxi libres, obtenidos por conversión con grupos acilo.

Los "equivalentes funcionales" naturalmente también comprenden polipéptidos obtenibles a través de otros organismos, así como variantes naturales. Por ejemplo, se pueden determinar regiones de secuencia homólogas a través de la comparación de secuencias y determinar la enzima equivalente conforme a las especificaciones concretas de la de la invención.

Los "equivalentes funcionales" comprenden, asimismo, fragmentos, preferentemente, dominios individuales o motivos de secuencias de los polipéptidos deseados que presentan, por ejemplo, la función biológica deseada.

También son "equivalentes funcionales" las proteínas de fusión que presentan un equivalente a las secuencias naturales racémicas o equivalentes funcionales derivados de ellas y, al menos, otra secuencia heterológica funcionalmente diferente en un enlace funcional N o C terminal (es decir, sin provocar un daño esencial funcional mutuo de las proteínas de fusión). Ejemplos no restrictivos de tales secuencias heterogéneas son, por ejemplo, péptidos señal o enzimas.

Los "equivalentes funcionales" también comprendidos acorde a la invención son los homólogos de las proteínas naturales. Éstos presentan, al menos, 60%, preferentemente, al menos, 75% especialmente, al menos, 85%, como, por ejemplo, 90%, 95% o 99% de homología respecto de una secuencia natural de aminoácidos, calculada acorde al algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Una homología porcentual de un polipéptido homólogo acorde a la invención significa, especialmente, una identidad porcentual de los restos de aminoácidos en relación a la longitud total de una de las secuencias de aminoácidos de una enzima acorde a la invención o de una subunidad de enzima.

En el caso de una posible glicosilación proteica, los "equivalentes funcionales" acordes a la invención comprenden proteínas del tipo mencionado en forma desglicosilada o glicosilada así como formas derivadas obtenidas por la modificación del modelo de glicosilación.

Los homólogos de las proteínas acordes a la invención o polipéptidos pueden ser generados por mutagénesis, por ejemplo, por mutación puntual o acortamiento de la proteína.

Los homólogos de las racemasas acordes a la invención pueden ser identificados por el análisis de bancos combinatorios de mutantes, por ejemplo, mutantes acortados. Por ejemplo, un banco variegado de variantes proteicas por mutagénesis combinatoria en un plano de ácido nucleico, por ejemplo, por ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Existe una gran cantidad de procedimientos que pueden ser utilizados para la obtención de bancos de potenciales homólogos a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia genética degenerada puede ser realizada con una máquina automática de síntesis de ADN, y el gen sintético puede ser ligado en un vector de expresión adecuado. La utilización del conjunto de genes degenerado posibilita la facilitación de todas las secuencias en una mezcla que codifican el conjunto deseado de secuencias de proteína. Los procedimientos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados son conocidos por el especialista (por ejemplo, por Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

En el estado actual de la técnica se conocen múltiples técnicas para el análisis de productos genéticos de bancos combinatorios obtenidos por mutación puntual o acortamiento, y para el análisis de productos genéticos con una característica seleccionada en los bancos de ADNc. Dichas técnicas se pueden adaptar rápidamente al análisis rápido de los bancos de genes generados por la mutagénesis combinatoria de los homólogos acordes a la invención. Las técnicas más utilizadas para el análisis de grandes bancos de genes, sujetos a un análisis con un rendimiento elevado, comprenden la clonación del banco de genes en vectores de expresión replicables, transformación de las células adecuadas con el banco de vectores resultante y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la comprobación de la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen, cuyo producto fue comprobado. La mutagénesis de conjunto recursiva (REM, o recursive-ensemble-mutagenese), una técnica que aumenta la frecuencia de los mutantes funcionales en los bancos, puede ser utilizada en combinación con las pruebas de análisis para la identificación de homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

D. Secuencias de ácido nucleico codificantes (ya no objeto de la invención)

El objeto de la invención también comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para una enzima con actividad racémica de ácido alfa-hidroxicarboxílico. Se prefieren las secuencias de ácido nucleico, que comprenden las secuencias de ácido nucleico derivadas de racemasas aislables de las secuencias naturales de aminoácidos de los microorganismos mencionados.

Todas las secuencias de ácido nucleico acordes a la invención (secuencias de ADN y ARN de cadena doble, por ejemplo, ADNc y ARNm) se pueden obtener de manera conocida por síntesis química a partir de los componentes de nucleótidos, por ejemplo, por condensación por fragmentación de componentes de nucleótidos complementarios, individualmente superpuestos, de doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede realizarse, por ejemplo, de manera conocida, según el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2ª edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La fijación por adición de oligonucleótidos sintéticos y el rellenado de intervalos mediante el fragmento de Klenow de la polimerasa de ADN y la reacción de ligación, así como los procedimientos generales de clonación, se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Son objeto de la invención, especialmente, las secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN de cadena doble, por ejemplo, ADNc y ARNm), que codifican para una de las enzimas acordes a la invención y sus equivalentes funcionales, que pueden ser obtenidos, por ejemplo, utilizando análogos artificiales de nucleótidos.

La presente invención comprende tanto moléculas aisladas de ácido nucleico, que codifican para polipéptidos o proteínas acordes a la invención, o sus segmentos biológicamente activos, como así también fragmentos de ácido nucleico, que, por ejemplo, se utilizan para la aplicación como sondas de hibridación o cebador para la identificación o amplificación de los ácidos nucleicos que codifican acorde a la invención.

Las moléculas de ácido nucleico acordes a la invención pueden contener, asimismo, secuencias no trasladadas del extremo 3' y/o 5' del área del gen codificante.

La invención comprende, además, las moléculas de ácido nucleico complementarias a las secuencias de nucleótidos concretamente descritas, o uno de sus segmentos.

Las secuencias de nucleótidos acordes a la invención posibilitan la generación de sondas y cebadores (primers), utilizables para la identificación y/o clonación de secuencias homólogas en otros tipos de células y organismos. Dichas sondas o cebadores comprenden usualmente un área de secuencia de nucleótidos que en condiciones "de lavado de rigor" (véase más adelante) hibridiza en, al menos, aproximadamente 12, preferentemente, al menos, aproximadamente, 25, por ejemplo, aproximadamente 40, 50 o 75 nucleótidos seguidos de una cadena en sentido de una secuencia de ácido nucleico acorde a la invención o una cadena correspondiente antisentido.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico es separada de otras moléculas de ácido nucleico, presentes en las fuentes naturales de ácido nucleico y puede estar esencialmente libre de otros materiales celulares o medio de cultivo, si se obtiene a través de técnicas recombinadas, o libre de precursores químicos u otros químicos, si es sintetizado químicamente.

Una molécula de ácido nucleico acorde a la invención puede ser aislada mediante técnicas estándar de la biología molecular y la información de secuencia facilitada acorde a la invención. Por ejemplo, puede aislarse ADNc de un banco adecuado de ADNc, utilizando una de secuencias completas concretamente publicadas o un segmento de ella como sonda de hibridación y técnicas estándar de hibridación (descritas, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio). 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Asimismo, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que comprende una de las secuencias publicadas o un segmento de ellas, por reacción en cadena de la polimerasa, asimismo, se utilizan los cebadores del oligonucleótido, obtenidos a base de esta secuencia. El ácido nucleico amplificado de esta manera puede ser clonado en un vector adecuado y ser caracterizado por un análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos acordes a la invención pueden ser obtenidos, además, mediante un procedimiento de síntesis estándar, por ejemplo, con un equipo automático de síntesis de ADN.

En principio, las secuencias de ácido nucleico acordes a la invención se pueden identificar y aislar, a partir de todos los organismos. De manera ventajosa, las secuencias de ácido nucleico acordes a la invención pueden aislarse de las bacterias del tipo mencionado.

Las secuencias de ácido nucleico acordes a la invención o sus derivados, homólogos o partes de dichas secuencias, se pueden aislar de los demás microorganismos, por ejemplo, con procedimientos usuales de hibridación o la técnica de PCR, por ejemplo, a través de bancos genómicos o de ADNc. Dichas secuencias de ADN se hibridan con las secuencias acordes a la invención en condiciones estándar. Para la hibridación se utilizan, ventajosamente, oligonucleótidos cortos de las áreas conservadas, por ejemplo, del centro activo, que pueden ser determinadas mediante la comparación con la racemasa de ácido alfa-hidroxicarboxílico de manera conocida por el especialista. Pero también pueden utilizarse fragmentos más largos del ácido nucleico acorde a la invención o las secuencias completas para la hibridación. Según el ácido nucleico utilizado (oligonucleótido, fragmento prolongado o secuencia completa) o según qué tipo de ácido nucleico ADN o ARN se utiliza para la hibridación, varían dichas condiciones estándar. Por ejemplo, las temperaturas de fundición para híbridos ADN:ADN se encuentran aproximadamente 10ºC por debajo de las de los híbridos ADN:ARN de la misma longitud.

Por condiciones estándar se debe entender, por ejemplo, según el ácido nucleico, temperaturas de entre 42 y 58ºC en una solución acuosa tope con una concentración de 0,1 a 5 x SSC (1 X SSC = 0,15M de NaCl, 15 mM de citrato de sodio, pH 7,2) o adicionalmente, en presencia de 50% de formamida, por ejemplo, 42ºC en 5 x SSC, 50% de formamida. De manera ventajosa, las condiciones de hibridación para híbridos de ADN:ADN se encuentran en 0,1 x SSC y a temperaturas de, aproximadamente, 20ºC a 45ºC, preferentemente, de, aproximadamente, 30ºC a 45ºC. Para híbridos de ADN:ARN las condiciones de hibridación se encuentran, ventajosamente, en 0,1 x SSC y a temperaturas de, aproximadamente, 30ºC a 55ºC, preferentemente, de, aproximadamente, 45ºC a 55ºC. Dichas temperaturas indicadas para la hibridación son valores de temperaturas de fundición calculados a modo de ejemplo para un ácido nucleico con una longitud de, aproximadamente, 100 nucleótidos y una proporción de G + C de 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN están descritas en los manuales correspondientes de genética, por ejemplo, en Sambrook et al., "Molecular Cloning" (Clonación molecular), Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y se pueden calcular mediante fórmulas conocidas por el especialista, por ejemplo, dependiendo de la longitud de los ácidos nucleicos, el tipo de híbridos o la proporción de G + C. El especialista puede acceder a otras informaciones correspondientes a la hibridación en los siguientes manuales: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales de la biología molecular), John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach (Hibridización de ácidos nucléicos: una aproximación práctica), IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach (Biología molecular esencial: una aproximación práctica), IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

También son objeto de la invención los derivados de las secuencias de ácido nucleico concretamente publicadas o derivables.

Por ejemplo, otras secuencias de ácido nucleico acordes a la invención pueden ser derivadas de las secuencias naturales y diferenciarse de uno o múltiples nucleótidos por adición, sustitución, inserción o deleción, pero todavía codificar para polipéptidos con el perfil deseado de características.

Acorde a la invención, también están incluidas aquellas secuencias de ácido nucleico que comprenden las denominadas mutaciones mudas o modificadas correspondientemente a la utilización de codón de un organismo de origen o huésped, en comparación con una secuencia concretamente mencionada, así como variantes naturales, por ejemplo, variantes de empalme o variantes de alelos.

Son igualmente objeto de la invención las secuencias que pueden ser obtenidas mediante la sustitución conservativa de nucleótidos (es decir, el aminoácido correspondiente es reemplazado por un aminoácido de igual carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).

También son objeto de la invención las moléculas derivadas de los ácidos nucleicos concretamente publicados mediante polimorfismos de secuencias. Dichos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población, debido a la variación natural. Dichas variaciones naturales provocan usualmente una varianza de 1 a 5% en la secuencias de nucleótidos de un gen.

Por derivados de los ácidos nucleicos acordes a la invención se deben entender, por ejemplo, variantes de alelos que presentan, al menos, 40% de homología en el plano de los aminoácidos derivados, preferentemente, al menos, 60% de homología, de modo especialmente preferido, al menos, 80% de homología a lo largo de toda el área de secuencia (en lo referente a homología en el plano de los aminoácidos se remite a las ejecuciones anteriores de los polipéptidos). De manera ventajosa, en ciertas áreas parciales de las secuencias las homologías pueden ser mayores.

Además, también se debe entender por derivados los homólogos de las secuencias de ácido nucleico acordes a la invención, por ejemplo, homólogos producidos por hongos o bacteriales, secuencias acortadas, ADN de una cadena o ARN de la secuencia de ADN codificante o no codificante. Por ejemplo, los homólogos de la SEQ ID NO: 1 presentan en el plano del ADN una homología de, al menos, 40%, preferentemente, al menos, 60%, de modo preferido, al menos, 70%, de modo especialmente preferido, al menos, 80% a lo largo de toda el área de ADN indicada en SEQ ID NO: 1.

Además, se debe entender por derivados, por ejemplo, fusiones con promotores. Los promotores anteriores a las secuencias de nucleótidos indicadas pueden estar modificados por uno o múltiples intercambios de nucleótidos, inserciones, inversiones y/o deleciones, sin que por ello se reduzca la funcionalidad o la efectividad de los promotores. Por lo demás, gracias a la modificación de su secuencia los promotores pueden incrementar su rendimiento o ser intercambiados completamente por promotores efectivos, también de organismos extraños.

También se entiende, por derivados, las variantes cuya secuencia de nucleótidos fue modificada en el área de -1 a -1000 bases aguas arriba antes del codón inicial o 0 a 1000 bases aguas abajo tras el codón de terminación, que la expresión genética y/o la expresión proteica se modifica, preferentemente, se incrementa.

Además, la invención también comprende secuencias de ácido nucleico que hibridizan con las secuencias codificantes mencionadas anteriormente en "condiciones de lavado de rigor". Dichos polinucleótidos se pueden detectar en la examinación de bancos genómicos o de ADNc y, eventualmente, reproducir a partir de ello, con cebadores adecuados, mediante PCR y aislar posteriormente, por ejemplo, con sondas adecuadas. Más allá de ello, los polinucleótidos acordes a la invención también pueden ser sintetizados mediante un proceso químico. Esta característica se entiende como la capacidad de un poli u oligonucleótido de enlazarse en condiciones de lavado de rigor a una secuencia aproximadamente complementaria, mientras que en estas condiciones no se presentan enlaces no específicos entre pares no complementarios. Para ello las secuencias deben ser un 70-100% complementarias, preferentemente, 90-100%. La propiedad de las secuencias complementarias de poder enlazarse de manera específica entre sí, es aprovechada, por ejemplo, en la técnica Northern o Southem-Blot o en el enlace de cebadores en PCR o RT-PCR. Usualmente, se utilizan para ello oligonucleótidos a partir de una longitud de 30 pares de bases. Se entiende por condiciones de lavado de rigor, por ejemplo, en la técnica Northem-Blot, la utilización de una solución de lavado a 50-70ºC, preferentemente, a 60-65ºC, por ejemplo, tampones 0,1x SSC con 0,1% de SDS (20x SSC: 3M de NaCl, 0,3M de citrato de Na, pH 7,0) para la elución de sondas de ADNc hibridas no específicas u oligonucleótidos. A su vez, como ya se ha mencionado, sólo permanecen enlazados entre sí los ácidos nucleicos altamente complementarios. La regulación de las condiciones de lavado de rigor es conocida por el especialista y está descrita, por ejemplo, en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales de la biología molecular), John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

E. Constructos (ya no objeto de la invención)

También son objeto de la invención los constructos de expresión que contienen, en el control genético de secuencias regulatorias de ácido nucleico, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima acorde a la invención; así como vectores que comprenden, al menos, uno de estos constructos de expresión.

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Preferentemente, dichos constructos acordes a la invención comprenden 5'-aguas arriba de la secuencia respectivamente codificante, un promotor, y 3'-aguas abajo, una secuencia de terminador así como, eventualmente, otros elementos reguladores usuales, a saber, enlazado respectivamente con la secuencia codificante.

Por "enlace operativo" se entiende, en la disposición secuencial de promotor, la secuencia codificante, terminador y, eventualmente, otros elementos reguladores, de modo que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir con su función en la expresión de la secuencia codificante, acorde a lo determinado. Ejemplos de secuencias que pueden ser enlazadas operativamente son las secuencias diana (target) así como potenciadores, señales de poliadenilización y similares. Otros elementos de regulación comprenden marcadores selectivos, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. Las secuencias adecuadas de regulación están descritas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology (Tecnología de expresión de genes: métodos de enzimología), 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Por constructo de ácido nucleico acorde a la invención se entienden, especialmente, los genes de racemasa naturales de ácido alfa-hidroxicarboxílico y sus derivados y homólogos enlazados ventajosamente de modo operativo o funcional con una o múltiples señales de regulación para el control, por ejemplo, el incremento de la expresión genética.

Adicionalmente a estas secuencias reguladoras, la regulación natural de dichas secuencias antes de los genes estructurales en sí puede estar presente todavía y, eventualmente, modificados genéticamente, de modo que la regulación natural se desactiva y se incrementa la expresión de los genes se incrementa. Pero el constructo de ácido nucleico también puede estar configurado de manera más simple, es decir, no han sido insertadas señales adicionales de regulación antes de la secuencia codificante y el promotor natural con su regulación no fue extraído. En cambio, la secuencia natural de regulación es mutada de modo tal que no se efectúa ya ninguna regulación y se incrementa la expresión genética.

Un constructo preferido de ácido nucleico también contiene, ventajosamente, una o múltiples de las secuencias "potenciadoras" mencionadas, enlazadas funcionalmente con el promotor, que posibilita una expresión incrementada de la secuencia de ácido nucleico. También en el extremo 3' de las secuencias de ADN pueden insertarse secuencias adicionales ventajosas, como otros elementos reguladores o terminadores. Los ácidos nucleicos acordes a la invención pueden encontrarse en una o múltiples copias en el constructo. En el constructo pueden hallarse otros marcadores, como genes complementarios a resistencias a antibióticos o auxotrofias, eventualmente, para la selección en el constructo.

Secuencias ventajosas de regulación para el procedimiento acorde a la invención están presentes, por ejemplo, en promotores como cos, tac-trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ippl-ac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD)SP6, lambda-PR o en el promotor lambda-PL, que se utilizan, ventajosamente, en bacterias gram negativas. Otras secuencias ventajosas de regulación son, por ejemplo, los promotores gram positivos amy y SPO2, en la levadura o promotores en hongos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. También pueden utilizarse promotores artificiales para la regulación.

El constructo de ácido nucleico es insertado para la expresión en un organismo huésped, ventajosamente, en un vector, como por ejemplo, un plásmido o un fago, que posibilita una expresión óptima de los genes en el huésped. Por vectores se entienden, además de plásmidos y fagos, también todos los demás vectores conocidos por el especialista, por ejemplo, virus, como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmidos, y ADN lineal o circular. Dichos vectores pueden ser replicados autónomamente en el organismo huésped o cromosómicamente. Dichos vectores son una realización más de la invención. Plásmidos adecuados son, por ejemplo, e. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III^{113}-B1,\lambdagt11 o pBdCl, en streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, en corynebacterium pSA77 o pAJ667, en hongos pALS1, pIL2 o pBB116, en levaduras 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHIac^{+}, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados representan una pequeña selección de los posibles plásmidos. Otros plásmidos también son conocidos por el especialista y ser tomados, por ejemplo, del libro Cloning Vectors (Vectores de clonación), (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).

De manera ventajosa, el constructo de ácido nucleico contiene, adicionalmente, para la expresión de los demás genes presentes, secuencias reguladoras terminales 3' y/o 5' para el incremento de la expresión, seleccionados acorde al organismo huésped y gen o genes elegidos para una expresión óptima.

Dichas secuencias reguladoras deben posibilitar la expresión adecuada de los genes y de la expresión proteica. Esto puede significar, según el organismo huésped, que el gen se expresa o sobreexpresa sólo tras la inducción, o que es expresado o sobreexpresado inmediatamente.

Las secuencias reguladoras factores reguladores pueden, a su vez, influir, preferentemente, en la expresión genética de los genes incorporados e incrementarla. Por ejemplo, un aumento de los elementos reguladores puede realizarse ventajosamente en el plano de la transcripción, utilizando señales intensas de transcripción como promotores y/o "potenciadores". Asimismo, también es posible, sin embargo, un incremento de la traslación, mejorando, por ejemplo, la estabilidad de los ARNm.

En otro modo de ejecución del vector, el constructo de ácido nucleico acorde a la invención o el vector que contiene ácido nucleico, acorde a la invención, también puede ser introducido, ventajosamente, en forma de un ADN lineal, en los microorganismos y ser integrado en el genoma del organismo huésped mediante recombinación heteróloga u homóloga. Dicho ADN lineal puede consistir en un vector linealizado, como un plásmido o sólo en un constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico acorde a la invención.

Para una expresión óptima de genes heterólogos en los organismos es ventajoso modificar las secuencias de ácido nucleico del "uso de codones" (codon usage) utilizado correspondientemente al organismo. El "uso de codones" se puede determinar de manera sencilla a partir de evaluaciones mediante el ordenador de otros genes conocidos del correspondiente organismo.

La obtención de un casette de expresión acorde a la invención se lleva a cabo por fusión de un promotor adecuado con una secuencia de nucleótidos codificante adecuada así como una señal de terminador o poliadenilización. Para ello, se utilizan técnicas habituales de recombinación y clonación, por ejemplo, las descritas en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y en T.J. Silhavy, M.l. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions (Experimentos con fusión genética), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales de la biología molecular), Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

El constructo de ácido nucleico recombinante o el constructo genético es insertado para la expresión en un organismo huésped adecuado, ventajosamente, en un vector de huésped específico, que posibilita una expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son conocidos por el especialista y pueden ser tomados, por ejemplo, de "Cloning Vectors" (Vectores de clonación), (Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

F. Huéspedes utilizables acorde a la invención

Mediante los vectores se pueden obtener microorganismos recombinantes transformados, por ejemplo, con, al menos, un vector y que pueden ser utilizados para la producción de las enzimas utilizables acordes a la invención. Ventajosamente, los constructos recombinantes descritos son dispuestos en un sistema huésped adecuado y allí son expresados. Para ello se utilizan, preferentemente, los métodos habituales de clonación y transfección conocidos por el especialista, por ejemplo, co-precipitación, fusión de protoplastos, electroporación, transfección retroviral y similares, para que se expresen los ácidos nucleicos mencionados en el sistema de expresión respectivo. Los sistemas adecuados están descritos, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales de la biología molecular), F. Ausubel et al., Eds, Wiley Interscience, New York 1997, o Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio). 2^{a} edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Acorde a la invención, también se pueden obtener microorganismos de recombinación homóloga. Para ello, se fabrica un vector que contiene, al menos, un segmento de un gen acorde a la invención o de una secuencia codificante, en donde, eventualmente, se ha colocado una deleción, adición o sustitución de aminoácidos para modificar la secuencia acorde a la invención, por ejemplo, disrumpirla funcionalmente (vector de bloqueo o knockout). La secuencia introducida también puede, por ejemplo, ser un homólogo de un microorganismo emparentado o ser derivada de una fuente de mamífero, levadura o insectos. El vector utilizado para la recombinación homóloga puede estar configurado, de modo alternativo, de modo tal que en la recombinación homóloga el gen endógeno mute o se modifique de otra manera, pero la proteína funcional aún codifique (por ejemplo, el área reguladora dispuesta aguas arriba puede estar modificada de modo tal que por ello se modifique la expresión de la proteína endógena). El segmento modificado del gen acorde a la invención se encuentra en el vector de recombinación homólogo. La construcción de los vectores adecuados para la recombinación homóloga está descrita, por ejemplo, en Thomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.

Como organismos huéspedes recombinantes para el ácido nucleico o el constructo de ácido nucleico se pueden utilizar, en principio, todos los organismos procariónticos o eucariónticos. De manera ventajosa, se utilizan organismos huésped como bacterias, hongos o levaduras. De manera ventajosa, se utilizan bacterias gram positivas o gram negativas. Es especialmente preferida la especie y el tipo escherichia coli.

El o los organismos huésped acordes a la invención contienen, a su vez, preferentemente, al menos una secuencia de ácido nucleico, constructor de ácido nucleico o vectores que codifican para una enzima con actividad definida en la presente.

Los organismos utilizados en el procedimiento acorde a la invención se cultivan, según el organismo huésped, de manera conocida por el especialista. Los microorganismos generalmente se cultivan en un medio líquido que contiene una fuente de carbono, en general, en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, en general, en forma de fuentes orgánicas de nitrógeno, como extracto de levadura o sales como sulfato de amonio, oligoelementos como sales de hierro, manganeso, magnesio y, eventualmente, vitaminas, a temperaturas de 0ºC a 100ºC, preferentemente, de 10ºC a 60ºC, bajo suministro de oxígeno gaseoso. A su vez, el pH de los nutrientes líquidos puede mantenerse en un valor fijo, es decir, ser regulado o no durante el cultivo. El cultivo puede realizarse de modo discontinuo, semicontinuo o continuo. Los nutrientes pueden ser dispuestos al comienzo de la fermentación o ser suministrados posteriormente de manera semicontinua o continua. La cetona puede ser agregada directamente para el cultivo o, ventajosamente, tras el cultivo. Las enzimas pueden ser aisladas de los organismos, acorde al procedimiento descrito o ser utilizadas como extracto crudo para la reacción.

G. Obtención recombinante de las enzimas acordes a la invención: (ya no objeto de la invención)

También son objeto de la invención los procedimientos para la obtención de polipéptidos acordes a la invención o sus fragmentos funcionales, biológicamente activos, en los cuales se cultiva un microorganismo que produce polipéptidos, eventualmente, se induce la expresión de los polipéptidos y se aíslan los mismos del cultivo. De ese modo, los polipéptidos también pueden ser producidos a escala industrial si es necesario.

El microorganismo recombinante puede ser cultivado y fermentado según los procedimientos conocidos. Las bacterias pueden reproducirse, por ejemplo, en medios TB o LB y a una temperatura de 20 a 40ºC y un valor de pH de 6 a 9. Se describen condiciones de cultivo individuales, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Las células se desintegran en el caso de que no se segreguen los polipéptidos y el producto es obtenido a partir del lisado según procedimientos conocidos de aislamiento proteico. Las células pueden ser desintegradas por ultrasonido de alta frecuencia, por presión elevada, por ejemplo, en una prensa French, por ejemplo, por lisis osmótica, por efecto de detergentes, enzimas líticas o disolventes orgánicos, por homogeneizadores o por combinación de varios de los procedimientos enumerados.

Una purificación de los polipéptidos puede lograrse con procedimientos cromatográficos conocidos, como la cromatografía de tamiz molecular (de filtración en gel), como cromatografía Q-Sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba, así como con otros procedimientos usuales como ultrafiltración, cristalización, salificación, diálisis y electroforesis nativa en gel. En Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden (Métodos de trabajo bioquímicos), Editorial Walter de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes, R., Protein Purification (Purificación de proteínas), Ed. Springer, New York, Heidelberg, Berlín, por ejemplo, se describen procedimientos adecuados.

Puede ser ventajoso para el aislamiento de la proteína recombinante utilizar sistemas de vectores u oligonucleótidos que prolonga el ADNc en unas determinadas secuencias de nucleótidos y con ello codifica para polipéptidos modificados, o proteínas de fusión que sirven, por ejemplo, para una purificación más simple. Dichas modificaciones adecuadas son, por ejemplo, los denominados "tags" que funcionan como anclajes, por ejemplo, la modificación conocida como anclaje de hexa-histidina o epítope, que pueden ser reconocidos como antígenos de anticuerpos (descritos, por ejemplo, en Harlow, E. y Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: un manual de laboratorio). Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Dichos anclajes pueden servir para la adhesión de las proteínas a un portador sólido, por ejemplo, una matriz de polímero, que puede estar rellenada en una columna de cromatografía, o puede ser utilizada en una placa de microtitulación o en otro tipo de portador.

Al mismo tiempo, dichos anclajes también pueden ser utilizados para el reconocimiento de las proteínas. Para el reconocimiento de las proteínas pueden utilizarse, asimismo, marcadores usuales, como colorantes fluorescentes, marcadores enzimáticos que tras la reacción con un sustrato forman un producto de reacción detectable, o marcadores radioactivos, solos o en combinación con los anclajes para la derivatización de las proteínas.

H. Aislamiento no recombinante de las enzimas acordes a la invención (ya no objeto de la invención)

El aislamiento de las enzimas acordes a la invención se lleva a cabo, convenientemente, a partir de una de las fuentes naturales descritas (cepas de lactobacillus) o de otro microorganismo que expresa una actividad de racemasa de ácido alfa-hidroxicarboxílico, identificado mediante un procedimiento de análisis acorde a la invención.

El microorganismo puede ser cultivado y fermentado según los procedimientos conocidos. Luego, las células se desintegran, en el caso de que no se segreguen los polipéptidos, y el producto es obtenido a partir del lisado según procedimientos conocidos de aislamiento proteico. Las células pueden ser desintegradas por ultrasonido de alta frecuencia, por presión elevada, por ejemplo, en una prensa French, por ejemplo, por lisis osmótica, por efecto de detergentes, enzimas líticas o disolventes orgánicos, por homogeneizadores o por combinación de varios de los procedimientos enumerados.

Una purificación de los polipéptidos puede lograrse con procedimientos cromatográficos conocidos, como la cromatografía de tamiz molecular (de filtración en gel), como cromatografía Q-Sefarosa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía hidrófoba, así como con otros procedimientos usuales como ultrafiltración, cristalización, salificación, diálisis y electroforesis nativa en gel. En Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden (Métodos de trabajo bioquímicos), Ed. Walter de Gruyter, Berlín, New York o en Scopes, R., Protein Purification (Purificación de proteínas), Ed. Springer, New York, Heidelberg, Berlín, por ejemplo, se describen procedimientos adecuados.

I. Realización del procedimiento acorde a la invención para la isomerización de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos

El procedimiento acorde a la invención se realiza, ventajosamente, a una temperatura en el rango de 0ºC a 95ºC, preferentemente, de 10ºC a 85ºC, de modo especialmente preferido, de 15ºC a 75ºC, especialmente, de 25 a 40ºC.

El valor del pH en el procedimiento acorde a la invención se mantiene, ventajosamente, en un rango de pH 4 a 12, preferentemente, de pH 4,5 a 9, de modo especialmente preferido, de pH 5 a 8.

Para el procedimiento acorde a la invención pueden utilizarse células en crecimiento que contienen un ácido nucleico acorde a la invención, constructos de ácido nucleico o vectores. También pueden utilizarse células en reposo o desintegradas. Se entiende por células desintegradas, por ejemplo, aquellas células que han sido permeabilizadas mediante un tratamiento, por ejemplo, con disolventes, o células que fueron rotas mediante un tratamiento enzimático, un tratamiento mecánico (por ejemplo, con una prensa French Press o ultrasonido) o con otro método. Los extractos crudos obtenidos de este modo son ventajosamente adecuados para el procedimiento acorde a la invención. También las enzimas limpiadas o purificadas pueden ser utilizadas para el procedimiento. También son adecuados los microorganismos o las enzimas inmovilizadas que se pueden utilizar ventajosamente en la reacción.

Si para el procedimiento acorde a la invención se utilizan organismos libres o enzimas inmovilizadas, es conveniente que se liberen antes de la extracción, por ejemplo, por filtración o centrifugación.

El producto obtenido mediante el procedimiento acorde a la invención se puede obtener, ventajosamente, de la solución acuosa de reacción mediante la extracción o la destilación. La extracción puede ser repetida varias veces para incrementar el rendimiento. Ejemplos de medios de extracción adecuados son los disolventes habituales, conocidos por el especialista, como tolueno, cloruro de metileno, éter de diisopropilo, benceno, MTBE o éster acético, sin limitarse a ellos.

Tras la concentración de la fase orgánica, los productos pueden obtenerse, en general, en grados muy buenos de pureza química, es decir, mayores que 80% de pureza química. Pero tras la extracción, la fase orgánica también puede ser concentrada sólo en parte y el producto puede ser cristalizado. Para ello, la solución se enfría, ventajosamente, a una temperatura de 0ºC a 10ºC. La cristalización también puede realizarse directamente desde la solución orgánica o desde una solución acuosa. El producto cristalizado puede ser colocado nuevamente en el mismo disolvente o en otro para una nueva cristalización y ser cristalizado nuevamente.

El procedimiento acorde a la invención puede ser ejecutado de modo discontinuo, semicontinuo o continuo.

La realización del procedimiento puede llevarse a cabo, ventajosamente, en bioreactores, como se describe, por ejemplo, en Biotechnology, tomo 3, 2ª edición, Rehm et al Eds., (1993), especialmente, el capítulo II.

K. Otras aplicaciones de la invención

La presente invención abre numerosas posibilidades de aplicación de la reacción de isomerización acorde a la invención. Sin ser restrictivos, mencionaremos los siguientes ejemplos:

a)

racemización de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos para el "retorno" del estereoisómero indeseado en la separación clásica de racematos tras la separación del producto deseado. La ventaja es la reacción de racemización enzimática limpia; las racemizaciones catalizadas, por el contrario, generalmente se desarrollan en condiciones de reacción drásticas que provocan la descomposición, la formación de productos secundarios y las reacciones secundarias (eliminación, etc.). (véase también Kontrollierte Racemisierung von organischen Verbindungen (Racemización controlada de compuestos orgánicos): E. J. Ebbers, G. J. A. Ariaans, J. P. M. Houbiers, A. Bruggink, B. Zwanenburg, Tetrahedron, 1997, 53, 9417-9476)

b)

desracemización escalonada de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos En tanto la actividad enzimática definida no puede ser utilizada directamente (por ejemplo, debido a las condiciones de reacción requeridas) en un paso enantioselectivo (de catalización química o enzimática) en el proceso de un solo recipiente, la racemización enzimática se realizará acorde al paso enantioselectivo sin la separación de los productos enantiómeros.

(véase el ejemplo análogo utilizando mandelato racemasa: U. T. Strauss, K. Faber, Tetrahedron: Asymmetry, 1999, 10, 4079-4081).

c)

el caso ideal de una aplicación corresponde a la combinación directa de la actividad enzimática definida anteriormente con un paso quimio o biocatalítico en el "proceso de un solo recipiente", una denominada "separación racémica dinámica". Dichos procedimientos son elegantes y extremadamente efectivos.

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Como ejemplo de un paso enantioselectivo combinable con una racemización acorde a la invención, deberían mencionarse los siguientes:

(i)

Lipase-katalysierte Veresterung, bzw. Acyl-Transfer-Reaktion (Esterificación catalizada con lipasa o reacción de transferencia acilo), (U. T. Strauss, K. Faber, Tetrahedron: Asymmetry, 1999, 10, 4079-4081).

(ii)

Formación de amidas catalizada con lipasa o proteasa. (F. van Rantwijk, M. A. P. J. Hacking, R. A. Sheldon, Monatsh. Chem./Chem. Monthly, 2000, 131, 549-569.)

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La descripción anterior y los siguientes ejemplos sólo tienen la finalidad de clarificar la invención. También están comprendidas en la invención las posibles numerosas derivaciones evidentes para el especialista.

Parte experimental A. Indicaciones generales 1. Equipos y métodos utilizados Cromatografía en capa fina

El control de conversión de las reacciones así como la verificación de la pureza de los productos se llevó a cabo mediante cromatografía en capa fina. Con esta finalidad, se utilizó gel de sílice 60F254 sobre la película de aluminio de Merck. La detección se llevó a cabo tanto a través de luz UV (254 mm) como así también a través del rociado con solución de molibdato [(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24} x 4H_{2}O (100 g/l) y Ce(SO_{4})_{2} x 4H_{2}O (4 g/l) en H_{2}SO_{4} (10%)] y un posterior calentamiento.

Cromatografía de columnas

La purificación de los productos de racemización se llevó a cabo en cromatografía de columnas. Para ello se utilizó gel de sílice con un tamaño de grano de 43-63 mm de Merck como fase estacionaria. Como medio de eluación se utilizaron mezclas de bencina (B) y etiléter de ácido acético (EE), asimismo, la composición se adaptó al respectivo problema de separación. La separación se llevó a cabo bajo presión elevada.

Cromatografía de gases

Una separación por cromatografía de gases de los productos de racemización se realizó con un cromatógrafo de gases Varian 3800 - Split/Splitless Injektor (FID). Como columna se utilizó una ciclodetrina Chirasil-DEX, Chrompack, Permethyl-®, de enlace químico, 25 m x 0.32 mm x 0.25 m\mu, H_{2}. Los ejemplos de condiciones adecuadas de separación se indican en la siguientes tabla 1.

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TABLA 1 Separación de enantiomeros en el GC quiral

2

RMN

Los espectros de RMN de 1H y 13C fueron tomados con un Bruker 360 o 500 MHz, los desplazamientos químicos están indicados con ppm (escala \delta), como estándar interno se utilizó tetrametilsilano (TMS).

HPLC

Las determinaciones del valor de e.e. (exceso entianomérico o enantiomeric excess) se llevaron a cabo mediante un sistema HPLC de JASCO con bombas del tipo PU-980 y un detector UV MD910. Para la separación se utilizó una columna DAICEL Chiralpack AD (0.46 cm x 25 cm).

Puntos de fusión

Los puntos de fusión se determinaron con un MPD 350.BML.5 de GALLENKAMP.

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2. Materiales y métodos microbiológicos 2.1 Cultivos

Cepas de bacterias

La tabla 2 contiene un listado de las cepas analizadas, sus condiciones de cultivo y sus números de registro.

TABLA 2 Condiciones de crecimiento de las cepas bacteriológicas analizadas

3

TABLA 2 (continuación)

4

Conservación de las cepas

La conservación de las cepas se llevó a cabo por congelación de las células en soluciones especiales de refrigeración. Para ello, se pasó el cultivo a un vaso estéril de centrífuga, se centrifugó 30 min a 8000 rpm y a 4ºC se decantó la solución restante. Posteriormente, las células en la solución de congelación se separaron por gravedad, se pasaron a Viales estériles y se conservaron a -70ºC. Como solución de congelación se utilizó, o bien una solución de 20% en volumen de DMSO y 0,7% en peso de NaCl en H2O (Solkner) o glicerina con 5% en volumen, H2O (Weigers).

Cultivo de las cepas

El crecimiento de los cultivos se llevó a cabo en un matraz de Erlenmeyer de 1000 ml en un armario de secado a 30ºC o 37ºC (según la cepa bacteriana). Primero, se distribuyó un litro del medio estéril correspondiente a cada cepa bacteriana en cuatro matraces y se inocularon, respectivamente, 500 \mul de la solución celular previamente descongelada. Todos los pasos de trabajo esterilizados se realizaron en el Laminarflow (Heraeus "Herasafe", tipo HS9).

Cosecha de las células

Tras una fase de crecimiento de 3 a 15 días, según la cepa bacteriana, se cosecharon las células. Para ello, se pasó el cultivo a un vaso de centrífuga, se centrifugó 20 min a 8000 rpm y a 4ºC y se decantaron los residuos. Para el lavado, las células fueron separadas por gravedad con, aproximadamente, 40 ml de tampón (50 mM de Bis-Tris, 0,01 M de MgCl_{2}, pH = 6) y se centrifugaron nuevamente 20 min. El proceso de lavado se efectuó dos veces. Posteriormente, las células fueron separadas nuevamente por gravedad con poco tampón, se pasaron a un matraz redondo y se congelaron por choque. Esto se efectuó por la agitación del matraz en un recipiente Dewar rellenado con nitrógeno líquido. El secado por enfriamiento se efectuó con Liofilizador de Braun ("Christ Alpha 1-4"). Las células de liofilización se rellenaron en botellas de vidrio y se conservaron en el refrigerador hasta su utilización.

2.2 Medios de cultivo y esterilización

Para el cultivo de los microorganismos se utilizaron los medios de cultivo recomendados para la respectiva cepa bacteriana. Dichos medios fueron esterilizados antes de la inoculación mediante autoclaves (Esterilizador por vapor Varioklav, H+P Labortechnik GmbH, Munich) a 121ºC y 1 bar de sobrepresión.

Medio 11

El medio 11 se utilizó como medio de cultivo para las siguientes cepas bacterianas: l. paracasei, l. acidophilus, l. brevis, l. halotolerans, l, confusus, l. farciminis, l. gasseri, l. alimentarius, l. jensenii, l. delbrueckii, l. curvatus, l. sakei ssp. sakei, l. kandeleri y l. fructosus.

En la tabla 3 se indica la composición del medio. Para impedir una posible reacción de Maillard y así como una precipitación de las sales, los componentes de los medios se esterilizan por separado y se reúnen tan sólo tras la esterilización. La reacción de Maillard se presenta cuando reaccionan los compuestos como las azúcares reductoras con aminoácidos o proteínas y provoca una coloración oscura del medio.

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TABLA 3 Composición del medio 11

5

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Medio 231

Para l. acetotolerans se utilizó el medio 231, que sólo se diferencia del medio 11 en su valor de pH. Los componentes de la tabla 3 ya son unidos antes de la esterilización y el valor de pH se regula en 5.2.

Medio 92

El medio 92 se utilizó como medio de cultivo para l. piscicola. La composición está representada en la tabla 4.

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TABLA 4 Composición del medio 92

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Medio 372

El medio 372 fue utilizado para las cepas haloferax volcanii y haloarcula vallismortis.

TABLA 5 Composición del medio 372

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B. Pruebas realizadas Ejemplo 1 Síntesis de sustratos y material de referencia a) Representación de 2-hidroxi-3-fenilpropionato enantioméricamente puro

Solución: 1 g de fenilalanina enantioméricamente pura (6,05 mmol) se disuelve en 12 ml de H_{2}SO_{4} (1M). Bajo refrigeración con hielo se agregaron 1,66 g (24 mmol) de NaNO_{2} en porciones. Tras la adición, se retira la refrigeración y se continúa la agitación de la mezcla a temperatura ambiente.

Procesamiento: La solución acuosa se extrae tres veces con, respectivamente, 4 ml de etiléter, la fase orgánica se lava con una solución de sal común y la solución de sal común es reextraída una vez con etiléter. Las fases orgánicas reunidas se secan con Na_{2}SO_{4} y el disolvente es extraído en el evaporador de rotación. El residuo amarillo, aceitoso se descompone con 2 ml de hexano y se induce la cristalización mediante raspado con una varilla de vidrio. Se forma una precipitación de cristales blancos. Los cristales se lavan tres veces con, aproximadamente, 2 ml de hexano y el disolvente restante es extraído por rotación.

Valores de rotación (literatura): fenillactato (S): [\alpha]= D

25 = -20,8 (c = 2, H_{2}O)

Fenillactato (R) [\alpha] = D ^{25} = +20,9 (c = 2,3, H_{2}O)

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b) Representación de rac-4-flúor-fenillactato rac-3

Solución: 400 mg (2.2 mmol) de rac-4-flúor-fenilalanina, 670 mg (9,7 mmol) de NaNO_{2} en 4,8 ml de H_{2}SO (1M).

Producto obtenido: 197 mg (49.0%), cristales blancos

^{1}H-RNM: (360 MHz, CDCl_{3}) \delta= 2,97 (1H, dd, J_{1} = 7,2 Hz, J_{2} = 14,4 Hz, CH_{2}); 3,17 (1H, dd, J_{1} = 3,6 Hz, J_{2} = 14,4 Hz, CH_{2}); 4,49 (1H,dd, J_{1} = 3,6 Hz, J_{2} = 6,1 Hz, CH-OH); 6,98 - 7,02 (2H, m, Ar); 7,20 - 7,28 (2H, m, Ar).

^{13}C-RNM: (90 MHz, CDCl_{3}) \delta = 39,2 (CH_{2}); 70,9 (CH-OH); 115,3 (d, J = 21,6 Hz, Ar-m); 130,9 (d, J = 21,6 Hz, Ar-o); 131,6 (d, J = 3,6 Hz, Ar-i); 162,1 (d, J = 243,9 Hz, Ar-p); 178,1 (COOH).

Datos DC: LM:EE; RF = 0,35

Punto de fusión: 73ºC

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c) Representación de (S)-4-flúor-fenillactato (S)-3

Solución: 452 mg (2,5 mmol) de (S)-4-flúor-fenilalanina, 750 mg (10,9 mmol) NaNO_{2} en 5,4 ml H_{2}SO_{4} (1 M). Producto obtenido: 330 mg (72,5%), cristales blancos

^{1}H-RNM: véase rac-4-flúor-fenillactato

^{13}C-RNM: véase rac-4-flúor-fenillactato

Datos DC: LM:EE; RF = 0,35

Punto de fusión 69ºC

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La síntesis de los compuestos

ácido (s)-(+)-2-hidroxi-3-metilbutano

ácido (s)-(-)-2-hidroxi-4-metilpentano

ácido (s)-2-hidroxi-4-fenilbutírico

ácido (S)-2-hidroxi-3-fenilpropano

se llevó a cabo de manera análoga al ejemplo 1, partiendo de los correspondientes aminoácidos enantioméricamente puros que se pueden adquirir en el mercado.

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Ejemplo 2 Análisis de actividad de racemasa

Para obtener una primera referencia en lo referente a la actividad de racemización de los microorganismos, se analizó si presentan una racemización del sustrato (natural) (S)-lactato 1 y/o del sustrato (no natural) (S)-fenillactato 2 así como (S)-4-flúoerfenillactato 3.

Para el análisis se rehidrataron aproximadamente 10 mg de células liofilizadas en un tubo Eppendorf en 900 \mul de tampón Bis-Tris (50 mM de Bis-Tris, pH = 6) durante una hora, a 42ºC y 150 rpm. Posteriormente, se llevó a cabo la adición de, respectivamente, 10 mg de sustrato, que antes se ha disuelto en 100 \mul de tampón y se reguló con NaOH hasta alcanzar un pH de 6-7. Las mezclas se incubaron en el armario de agitación a 42ºC y 150 rpm. Paralelamente a cada mezcla, se midió un valor de ensayo en blanco, en el cual se mantenían condiciones idénticas de reacción sin agregar células. Dado que las pruebas de control resultaron negativas en todos los casos, se puede excluir una racemización espontánea en las condiciones dadas de reacción.

Tras uno o dos días en el armario de agitación, se centrifugaron los tubos Eppendorf durante 5 minutos a 13000 rmp y posteriormente se extrajo 400 \mul de cada solución restante. La solución se extrajo dos veces por agitación con, respectivamente, 600 \mul de EE, se reunieron las fases orgánicas, se secaron mediante Na_{2}SO_{4} y se extrajo por rotación el disolvente. Para alcanzar una separación de ambos enantiómeros a través de una columna quiral, se debieron derivatizar todos los compuestos analizados. A este fin, cada muestra fue mezclada con 500 \mul de metanol BF_{3}, durante 10 minutos, a 60ºC y se extrajo por agitación con 1 ml de CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se secó mediante Na_{2}SO_{4} y se concentró hasta alcanzar un volumen de, aproximadamente, 100 \mul.

Una reacción de racemización era considerada negativa (-) cuando el excedente enantiomérico tras dos días era > 95%, los excedentes enantioméricos < 20% se consideraron positivos (+). Todos los demás fueron clasificados como (\sim). Los resultados del análisis están resumidos en la tabla 6.

TABLA 6 Resultados del análisis de actividad

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Ejemplo 3 Determinación de los excedentes enantiómeros con diferentes sustratos

En la determinación de los excedentes enantiómeros se procedió como en el ejemplo 2. Sólo se redujo la cantidad de las células utilizadas a 50 mg.

a) Pruebas con ácido L-(-)-3-fenilláctico como sustrato

Primero se mezclaron 50 mg de células liofilizadas con 1 ml de tampón BisTris (50 mM, pH 6) y se rehidrataron durante 1 h en el agitador, a 42ºC y 150 rpm. Posteriormente, se agregaron, respectivamente, 5 mg de sustrato disuelto en 100 \mul de tampón y se incubaron en el armario de agitación (30ºC, 150 rpm). Todas las muestras se midieron, respectivamente, tras 24 o 48 horas mediante GC quiral. Para lograr una separación de los enantiómeros en el GC, se debieron derivatizar las muestras.

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La derivatización se llevó a cabo con metanol BF_{3} (véase arriba) o con anhídrido de ácido trifluoracético. Para la derivatización con anhídrido de ácido trifluoracético se disolvieron 5 mg de ácido 3-fenilláctico en 500 \mul de CH_{2}Cl_{2}, se mezclaron con 5 gotas de anhídrido de ácido trifluoracético, se agitaron 1 min a temperatura ambiente, posteriormente se mezclaron con aproximadamente 500 \mul de H_{2}O. La fase orgánica se seca con Na_{2}SO_{4}, luego se lleva a cabo la medición en el GC en la columna quiral.

El cálculo de los resultados llevó a cabo según las siguientes fórmulas:

e.e. [%]: (R-S)/(R+S) x 100

Conversión [%]: R/(R+S) x 100

Racemización [%]: 2R/(R+S) x 100

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Además de la cepa lactobacillus paracasei subesp. paracasei DSM 20008 se pudieron hallar las siguientes cuatro cepas con buena o excelente actividad racémica en lo referente a ácido L-(-)-3-fenilláctico.

-

Lactobacillus paracasei subesp. paracasei DSM 2649

-

Lactobacillus paracasei subesp. paracasei DSM 20207

-

Lactobacillus delbrueckii subesp. delbrueckii DSM 20074

-

Lactobacillus oris DSM 4864

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Los resultados para las cepas anteriores están resumidos en la siguiente tabla 7, detallando las condiciones de cultivo (agitador o armario de secado; argón o aire atmosférico) y la duración del cultivo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

11

Para comprobar si la actividad de la racemasa observada es correlativa con una actividad de racemasa lactasa, se convirtió con las buenas cepas, que presentaban buena a muy buena actividad con ácido L-(-)-3-fenilláctico, el sustrato natural ácido L-(+)- láctico.

Se pudo observar que en la conversión del sustrato natural ácido L-(+)-láctico con las cepas DSM 20207, 20074 y 20008 se detectó ya tras 24 horas una racemización del 100%.

En el caso de la cepa DSM 2649 no se pudo obtener ninguna conversión.

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b) Pruebas con diferentes sustratos alquilo

Se utilizó como sustrato:

ácido (S)-(+)-2-hidroxi-3-metilbutano (C_{5}H_{10}O_{3})

ácido (S)-(-)-2-hidroxiisocaprónico (C_{6}H_{12}O_{3}).

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Ambos sustratos se convirtieron con todas las cepas. Tras, respectivamente, 24 y 48 horas se midió el grado de racemización mediante GC.

En el caso del ácido (S)-(+)-2-hidroxi-3-metilbutano sólo se observó actividad en la cepa DSM 20207. A diferencia del sustrato ácido (S)-(-)-2-hidroxiisocaprónico, se observó actividad de racemización en 5 cepas. Los resultados están resumidos en las tablas 8 y 9.

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TABLA 8 Análisis con ácido (S)-(+)-2-hidroxi-3-metilbutano

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TABLA 9 Análisis con ácido (S)-(-)-2-hidroxicaprónico

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Resumiendo, podemos decir que nuevamente se observó actividad en las mismas cepas que también eran activas ante ácido L-(-)-3-fenilláctico.

c) Pruebas con ácido (S)-2-hidroxi-4-fenilbutírico

Tras, respectivamente, 24 y 48 horas se midió el grado de racemización mediante HPLC. Los resultados están representados en la tabla 10.

TABLA 10 Análisis con ácido (S)-2-hidroxi-4-fenilbutírico

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En relación con la presente invención, se registraron nuevamente las siguientes cepas de microorganismos de acceso público de DSMZ acorde a las determinaciones del tratado de Budapest del 11 de julio de 2003.

16

Claims (7)

1. Procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de la fórmula I,

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en la cual

R representa un alquilo C_{2}-C_{8} o alquenilo C_{2}-C_{8} o -(CH_{2})_{n}-Cyc, de cadena lineal o de cadena ramificada, en la cual n representa un valor entero de 0 a 4 y Cyc es un anillo carbo o heterocíclico, de uno o dos núcleos, eventualmente, mono o polisustituido, en el cual se isomeriza un sustrato que contiene, esencialmente, una primera forma estereoisómera de un ácido alfa-hidroxicarboxílico de la fórmula (I), mediante un extracto enzimático de un microorganismo o en presencia de células enteras de un microorganismo, asimismo, el microorganismo está seleccionado entre microorganismos naturales o recombinantes de la especie de lactobacillus o lactococcus para la racemización, aptos para la racemización de, al menos, un compuesto seleccionado entre la forma (R) y/o la forma (S) de fenillactato, 4-fluorfenillactato, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentancarboxílico y 2-hidroxi-3-metilbutírico, y, eventualmente, se aísla del equilibrio de reacción la mezcla isómera obtenida o un segundo estereoisómero obtenido aislado, o se extrae del equilibrio de reacción un segundo estereoisómero.

2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, en el cual el microorganismo está seleccionado entre l. paracasei, l. delbrueckii, l. sakei y l. oris.

3. Procedimiento acorde a la reivindicación 2, en el cual el microorganismo está seleccionado entre l. paracasei DSM 20207 (DSM 15755) y DSM 2649 (DSM 15751), l. delbrueckii DSM20074 (DSM 15754), l. sakei DSM 20017 (DSM 15753 y l. oris DSM 4864 (DSM 15752).

4. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual, a partir de la mezcla resultante de isomerización se extrae en gran parte el estereoisómero deseado y el residuo es sometido nuevamente a una isomerización.

5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la mezcla isómera obtenida se somete a una reacción siguiente estereoselectiva química o enzimática y la mezcla de reacción obtenida es sometida nuevamente a una isomerización.

6. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la reacción de mezcla isómera se acopla a una reacción subsiguiente enantioselectiva, química o enzimática, en donde el estereoisómero deseado obtenido del ácido alfa-hidroxicarboxílico es extraído del equilibrio de reacción.

7. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 5 y 6, en el cual la reacción subsiguiente enantioselectiva química o enzimática está seleccionada entre una esterificación y una amidación del ácido alfa-hidroxicarboxílico.