CN1331743A - 一种通过使用腈水解酶或含有腈水解酶的微生物来从腈类物质中制备手性羧酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到编码具腈水解酶活性的多肽的核酸序列,含有该核酸序列的核酸构建物以及含有该核酸序列或该核酸构建物的载体。本发明进一步涉及到被该核酸序列所编码的氨基酸序列,以及含有该核酸序列、该核酸构建物或含有该核酸序列或该核酸构建物的载体的微生物。本发明还涉及到从外消旋的腈类物质中制备手性羧酸的方法。
Description
本发明涉及到编码具腈水解酶活性的多肽的核酸序列，含有该核酸序列的核酸构建物以及含有该核酸序列或该核酸构建物的载体。本发明进一步涉及到被该核酸序列所编码的氨基酸序列，以及含有该核酸序列、该核酸构建物或含有该核酸序列或该核酸构建物的载体的微生物。
本发明还涉及到从外消旋的腈类物质中制备手性羧酸的方法。
手性羧酸是有机化学合成所需的化合物。它们是一大批药学活性成分或用于农作物保护的活性组分的起始材料。手性羧酸可被用于通过非对映体盐类来进行的经典的外消选体拆分。这样，R-(-)-或S-(-)-苯基乙醇酸被用于，例如，外消旋胺的外消旋拆分。R-(-)-苯基乙醇酸还被用作半合成抗生素和大量的农用产品的合成的中间体。
在文献中披露了手性羧酸的多种不同的合成路线。这样，例如，通过发酵方法可工业化地获得旋光活性的氨基酸。这些方法导致以下缺点，即对每一种氨基酸都需要开发一种特别的加工方法。这就是为什么要使用化学或酶学方法以制备最大范围的不同的化合物。化学方法的一个缺点是经常必须在一个复杂的，多阶段的，应用不广泛的合成中构建立体中心。
手性羧酸的酶学合成可见于许多专利或专利中请中。WO92/05275描述α-羟基-α-烷基或α-烷基羧酸的对映构建物在生物物质存在下的合成。EP-B-0 348 901要求一种方法的权利，该方法用于通过使用产碱杆菌属，假单胞菌，红假单胞菌属，棒状杆菌菌株KO-2-4，不动杆菌，芽孢杆菌，分支杆菌，红球菌属和假丝酵菌的微生物来制备旋光活性的α-取代有机酸。使用微生物对L-α-氨基酸的制备的权利要求见EP-B-0 332 379。
α-羟基羧酸的制备，具体来说是使用各种微生物，例如金杆菌属，假单胞菌，红假单胞菌属，棒状杆菌，不动杆菌，乳酪杆菌，芽孢杆菌，分支杆菌，红球菌属，短杆菌属，土壤丝菌属，贪噬菌属，节核细菌属和假丝酵菌的微生物，或使用酶来进行的对乳酸或苯基乙醇酸的制备，其描述见于专利EP-A-0 348 901或其对应的US5,283,193，EP-A-0 449 648，EP-B-0 473 328，EP-B-0 527 553或其对应的US 5,296,373，EP-A-0 610 048，EP-A-0 610 049 EP-A-0666 320或WO97/32030。
这些方法的缺点为它们通常产生具较低的旋光纯度的产物和/或进行这些方法时空间-时间产量较低。这导致这些方法不具经济吸引力。甚至通过添加诸如亚硫酸盐，二亚硫酸盐，连二亚硫酸盐，次亚磷盐或亚磷酸盐这样的物质(见EP-A-0 486 289)或通过使用具备提高的针对α-羟基腈的抗性的微生物(见WO97/32030)来提高生产能力的尝试也导致生产能力增长可忽略。
本发明的一个目标是开发一种简单，有成本效益的，应用广泛的方法以制备旋光活性的手性羧酸，该方法没有上述的缺点。
我们已经发现，这一目标已经通过一个方法实现，该方法根据于本发明，本发明用于在存在一种氨基酸序列或微生物的情况下制备通式I的手性羧酸
该制备包括转化外消旋腈，其具有通式II
该氨基酸序列由选自以下群体的核酸序列编码
a)一个核酸序列，它具有在SEQ ID NO：1中所描述的序列，
b)一些核酸序列，它们衍生于在SEQ ID NO：1中所描述的序列，是遗传密码简并的结果，
c)在SEQ ID NO：1中所描述的序列的变体，它们编码一些多肽，这些多肽具有SEQ ID NO：2中所描述的序列并且在氨基酸水平上具有至少80％的同源性，该多肽的酶活性上无实质性的降低，或者该微生物为一种生长中的，休眠的或被破碎的微生物体，它含有来自上述的群体的一种核酸序列或一种核酸构建物，该构建物将来自所述的群体的核酸序列同一种或更多种调控信号相连接，该体系中至少每小时每毫克蛋白或每克干重将25mmol腈转化为手性羧酸，其中，结构式I和II中的取代基和变量具有以下意义：
*一个旋光活性中心
R1，R2，R3各自独立地为氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，杂芳基，OR4或NR4R5，其中基团R1，R2，R3总是各不相同，
R4氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，杂芳基或杂芳基羰基，
R5氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，芳基或杂芳基。
结构式I和II的化合物的R1，R2，R3各自独立地为氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，杂芳基，OR4或NR4R5，其中基团R1，R2，R3总是各不相同。
可能提及的烷基基团为取代或未取代的，分支或无分支的C1～C10-烷基链，例如，甲基，乙基，n-丙基，1-甲基乙基，n-丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，n-戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，n-己基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，n-庚基，n-辛基，n-壬基，n-癸基。甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，i-丙基或i-丁基较为优选。
可能提及的烯基基团为取代或未取代的C2～C10-烯基链，例如，乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-甲基丙烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-甲基-1丁烯基，2-甲基-1-丁烯基，3-甲基-1丁烯基，1-甲基-2丁烯基，2-甲基-2丁烯基，3-甲基-2丁烯基，1-甲基-3丁烯基，2-甲基-3丁烯基，3-甲基-3丁烯基，1，1-二甲基-2-丙烯基，1，2-二甲基-1-丙烯基，1，2-二甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-丙烯基，1-乙基-2-丙烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-甲基-1-戊烯基，2-甲基-1-戊烯基，3-甲基-1-戊烯基，4-甲基-1-戊烯基，1-甲基-2-戊烯基，2-甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基，4-甲基-2-戊烯基，1-甲基-3-戊烯基，2-甲基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-甲基-4-戊烯基，2-甲基-4-戊烯基，3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-3-丁烯基，1，2-二甲基-1-丁烯基，1，2-二甲基-2-丁烯基，1，2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-1-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基，1，3-二甲基-3-丁烯基，2，2-二甲基-3-丁烯基，2，3-二甲基-1-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-3-丁烯基，3，3-二甲基-1-丁烯基，3，3-二甲基-2-丁烯基，1-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，1-乙基-3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，2-乙基-3-丁烯基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基，1-乙基-2-甲基-1-丙烯基，1-乙基-2-甲基-2-丙烯基，1-庚烯基，2-庚烯基，3-庚烯基，4-庚烯基，5-庚烯基，6-庚烯基，1-辛烯基，2-辛烯基，3-辛烯基，4-辛烯基，5-辛烯基，6-辛烯基，7-辛烯基，壬烯基或癸烯基。乙烯基，丙烯基，丁烯基或戊烯基较为优选。
可能提及的芳基基团为取代或未取代的芳基基团，它们在环或环系统中含有6-20个碳原子。环系统中可能含有稠合在一起的芳香环或通过烷基，烷基羰基，烯基或烯基羰基链，羰基，氧或氮连接的芳香环。在适当情况下，芳基基团还可经C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-环烷基链连接于基础框架。苯基或萘基较为优选。
可能提及的杂芳基基团为取代或未取代的，单一的或稠合的芳香环系统，该系统含有一个或多个3-7员的芳香环，该环可能含有一个或多个杂原子，如N，O或S，并且在适当情况下还可经C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-环烷基链连接于基础框架。这一类型的杂环芳基基团的例子有吡唑，咪唑，噁唑，异噁唑，噻唑，三唑，吡啶，喹啉，异喹啉，吖啶，嘧啶，哒嗪，吡嗪，吩嗪，嘌呤或蝶啶。杂环芳基基团可以经过环或环系统中的杂原子或各种碳原子或经过取代基团连接于基础框架。吡啶，咪唑，嘧啶，嘌呤，吡嗪或喹啉较为优选。
对所述的R1，R2和R3较适合的取代基为诸如卤素，如氟、氯或溴，硫代，硝基，氨基，羟基，烷基，烷氧基，烯基，烯基氧基，炔基或其它芳香类或其他饱和或不饱和的非芳香类环或环体系这样的一种或多种取代基。较优选的为诸如C1～C6-烷基这样的烷基基团，例如，甲基、乙基、丙基或丁基，还有芳基，例如苯基，以及诸如氟、氯或溴这样的卤素，羟基或氨基。
在OR4或NR4R5中的R4为氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，杂芳基或杂芳基羰基。
可能提及的烷基基团为取代或未取代的，分支或无分支的C1～C10-烷基链，例如，甲基，乙基，n-丙基，1-甲基乙基，n-丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1，1-二甲基乙基，n-戊基，1-甲基丁基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2，2-二甲基丙基，1-乙基丙基，n-己基，1，1-二甲基丙基，1，2-二甲基丙基，1-甲基戊基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，1，1-二甲基丁基，1，2-二甲基丁基，1，3-二甲基丁基，2，2-二甲基丁基，2，3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基，1-乙基丁基，2-乙基丁基，1，1，2-三甲基丙基，1，2，2-三甲基丙基，1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，n-庚基，n-辛基，n-壬基，n-癸基。甲基，乙基，n-丙基，n-丁基，i-丙基或i-丁基较为优选。
可能提及的烯基基团为分支或无分支的C2～C10-烯基链，例如，乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-甲基丙烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-甲基-1丁烯基，2-甲基-1丁烯基，3-甲基-1丁烯基，1-甲基-2丁烯基，2-甲基-2丁烯基，3-甲基-2丁烯基，1-甲基-3丁烯基，2-甲基-3丁烯基，3-甲基-3丁烯基，1，1-二甲基-2-丙烯基，1，2-二甲基-1-丙烯基，1，2-二甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-丙烯基，1-乙基-2-丙烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-甲基-1-戊烯基，2-甲基-1-戊烯基，3-甲基-1-戊烯基，4-甲基-1-戊烯基，1-甲基-2-戊烯基，2-甲基-2-戊烯基，3-甲基-2-戊烯基，4-甲基-2-戊烯基，1-甲基-3-戊烯基，2-甲基-3-戊烯基，3-甲基-3-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-甲基-4-戊烯基，2-甲基-4-戊烯基，3-甲基-4-戊烯基，4-甲基-4-戊烯基，1，1-二甲基-2-丁烯基，1，1-二甲基-3-丁烯基，1，2-二甲基-1-丁烯基，1，2-二甲基-2-丁烯基，1，2-二甲基-3-丁烯基，1，3-二甲基-1-丁烯基，1，3-二甲基-2-丁烯基，1，3-二甲基-3-丁烯基，2，2-二甲基-3-丁烯基，2，3-二甲基-1-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-3-丁烯基，3，3-二甲基-1-丁烯基，3，3-二甲基-2-丁烯基，1-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，1-乙基-3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，1-乙基-2-丁烯基，2-乙基-3-丁烯基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基，1-乙基-2-甲基-1-丙烯基，1-乙基-2-甲基-2-丙烯基，1-庚烯基，2-庚烯基，3-庚烯基，4-庚烯基，5-庚烯基，6-庚烯基，1-辛烯基，2-辛烯基，3-辛烯基，4-辛烯基，5-辛烯基，6-辛烯基，7-辛烯基，壬烯基或癸烯基。乙烯基，丙烯基，丁烯基或戊烯基较为优选。
可能提及的烷羰基基团为取代或未取代的，分支或无分支的C1～C10-烷羰基基链，例如，甲基羰基，乙基羰基，n-丙基羰基，1-甲基乙基羰基，n-丁基羰基，1-甲基丙基羰基，2-甲基丙基羰基，1，1-二甲基乙基羰基，n-戊基羰基，1-甲基丁基羰基，2-甲基丁基羰基，3-甲基丁基羰基，2，2-二甲基丙基羰基，1-乙基丙基羰基，n-己基羰基，1，1-二甲基丙基羰基，1，2-二甲基丙基羰基，1-甲基戊基羰基，2-甲基戊基羰基，3-甲基戊基羰基，4-甲基戊基羰基，1，1-二甲基丁基羰基，1，2-二甲基丁基羰基，1，3-二甲基丁基羰基，2，2-二甲基丁基羰基，2，3-二甲基丁基羰基，3，3-二甲基丁基羰基，1-乙基丁基羰基，2-乙基丁基羰基，1，1，2-三甲基丙基羰基，1，2，2-三甲基丙基羰基，1-乙基-1-甲基丙基羰基，1-乙基-2-甲基丙基羰基，n-庚基羰基，n-辛基羰基，n-壬基羰基，n-癸基羰基。甲基羰基，乙基羰基，n-丙基羰基，n-丁基羰基，i-丙基羰基或i-丁基羰基较为优选。
可能提及的烯基羰基基团为取代或未取代的C2～C10-烯基羰基链，例如，乙烯基羰基，丙烯基羰基，1-丁烯基羰基，2-丁烯基羰基，3-丁烯基羰基，2-甲基丙烯基羰基，1-戊烯基羰基，2-戊烯基羰基，3-戊烯基羰基，4-戊烯基羰基，1-甲基-1丁烯基羰基，2-甲基-1丁烯基羰基，3-甲基-1丁烯基羰基，1-甲基-2丁烯基羰基，2-甲基-2丁烯基羰基，3-甲基-2丁烯基羰基，1-甲基-3丁烯基羰基，2-甲基-3丁烯基羰基，3-甲基-3丁烯基羰基，1，1-二甲基-2-丙烯基羰基，1，2-二甲基-1-丙烯基羰基，1，2-二甲基-2-丙烯基羰基，1-乙基-1-丙烯基羰基，1-乙基-2-丙烯基羰基，1-己烯基羰基，2-己烯基羰基，3-己烯基羰基，4-己烯基羰基，5-己烯基羰基，1-甲基-1-戊烯基羰基，2-甲基-1-戊烯基羰基，3-甲基-1-戊烯基羰基，4-甲基-1-戊烯基羰基，1-甲基-2-戊烯基羰基，2-甲基-2-戊烯基羰基，3-甲基-2-戊烯基羰基，4-甲基-4-戊烯基羰基，1-甲基-3-戊烯基羰基，2-甲基-3-戊烯基羰基，3-甲基-3-戊烯基羰基，4-甲基-3-戊烯基羰基，1-甲基-4-戊烯基羰基，2-甲基-4-戊烯基羰基，3-甲基-4-戊烯基羰基，4-甲基-4-戊烯基羰基，1，1-二甲基-2-丁烯基羰基，1，1-二甲基-3-丁烯基羰基，1，2-二甲基-1-丁烯基羰基，1，2-二甲基-2-丁烯基羰基，1，2-二甲基-3-丁烯基羰基，1，3-二甲基-1-丁烯基羰基，1，3-二甲基-2-丁烯基羰基，1，3-二甲基-3-丁烯基羰基，2，2-二甲基-3-丁烯基羰基，2，3-二甲基-1-丁烯基羰基，2，3-二甲基-2-丁烯基羰基，2，3-二甲基-3-丁烯基羰基，3，3-二甲基-1-丁烯基羰基，3，3-二甲基-2-丁烯基羰基，1-乙基-1-丁烯基羰基，1-乙基-2-丁烯基羰基，1-乙基-3-丁烯基羰基，2-乙基-1-丁烯基羰基，1-乙基-2-丁烯基羰基，2-乙基-3-丁烯基羰基，1，1，2-三甲基-2-丙烯基羰基，1-乙基-1-甲基-2-丙烯基羰基，1-乙基-2-甲基-1-丙烯基羰基，1-乙基-2-甲基-2-丙烯基羰基，1-庚烯基羰基，2-庚烯基羰基，3-庚烯基羰基，4-庚烯基羰基，5-庚烯基羰基，6-庚烯基羰基，1-辛烯基羰基，2-辛烯基羰基，3-辛烯基羰基，4-辛烯基羰基，5-辛烯基羰基，6-辛烯基羰基，7-辛烯基羰基，壬烯基羰基或癸烯基羰基。乙烯基羰基，丙烯基羰基，丁烯基羰基或戊烯基羰基较为优选。
可能提及的芳基基团为取代或未取代的芳基基团，它们在环或环系统中含有6-20个碳原子。环系统中可能含有稠合在一起的芳香环或通过烷基，烷基羰基，烯基或烯基羰基链，羰基，氧或氮连接的芳香环。在适当情况下，芳基基团还可经C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-环烷基链连接于基础框架。苯基或萘基较为优选。
可能提及的芳基羰基基团为取代或未取代的芳基羰基基团，它们在环或环系统中含有6-20个碳原子。环系统中可能含有稠合在一起的芳香环或通过烷基，烷基羰基，烯基或烯基羰基链，羰基，氧或氮连接的芳香环。苯基羰基或萘基羰基较为优选
可能提及的杂芳基基团为取代或未取代的，单一的或稠合的芳香环系统，该系统含有一个或多个3-7员的芳香环，该环可能含有一个或多个杂原子，如N，O或S，并且在适当情况下还可经C1～C10-烷基，C3～C8-烯基，C3～C6-炔基或C3～C8-环烷基链连接于基础框架。这一类型的杂环芳基基团的例子有吡唑，咪唑，噁唑，异噁唑，噻唑，三唑，吡唑，喹啉，异喹啉，吖啶，嘧啶，哒嗪，吡嗪，吩嗪，嘌呤或蝶啶。杂环芳基基团可以经过杂原子或经过环或环系统中的各种碳原子或经过取代基团连接于基础框架。杂环芳基羰基指的是通过一个羰基基团连接于基础框架的杂芳香取代基团。吡唑，咪唑，嘧啶，嘌呤，吡嗪或喹啉较为优选。
对所述的R4基团较适合的取代基为诸如卤素，如氟、氯或溴，硫代，硝基，氨基，羟基，烷基，烷氧基，烯基，烯基氧基，炔基或其它芳香类或其他饱和或不饱和的非芳香类环或环体系这样的一种或多种取代基。较优选的为诸如C1～C6-烷基这样的烷基基团，例如，甲基、乙基、丙基或丁基，以及诸如氟、氯或溴这样的卤素，羟基或氨基。
优选的R4基团为氢。
在NR4R5中的R5为氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，杂芳基或杂芳基羰基，其中烷基，烯基，芳基和杂环芳基的含义同上文所述。较优选的为氢或C1～C10-烷基，例如甲基，乙基或丙基。
对所述的R5基团较适合的取代基为诸如卤素，如氟、氯或溴，硫代，硝基，氨基，羟基，烷基，烷氧基，烯基，烯基氧基，炔基或其它芳香类或其他饱和或不饱和的非芳香类环或环体系这样的一种或多种取代基。较优选的为诸如C1～C6-烷基这样的烷基基团，例如，甲基、乙基、丙基或丁基，还有芳基，例如苯基，以及诸如氟、氯或溴这样的卤素，羟基或氨基。
两个邻近的R4或R5基团还进一步有可能一起形成另一个取代或未取代的芳香族的饱和或部分饱和的环，环中有5-6个原子并可能含有杂原子，如O，N或S。
结构式I和II中的R1，R2和R3取代基中有一个为芳基是有好处的，例如苯基。结构式I和II中的R1，R2和R3取代基中有一个为羟基并且有一个为氢或甲基则更为优选。
在pH为4-11下进行本发明的方法是有益的，优选情况下pH为4-9。
在方法中使用重量百分比为0.01-10％的腈或者重量百分比为0.01-10％的相对应的醛或酮以及重量百分比为0.01-10％的氢氰酸是进一步有益的。在氢氰酸过量的情况下进行本发明的方法是有益的。在某些情况下，这导致氢氰酸含量超过前述量。不同量的腈被用于该反应，这取决于腈的种类。对于处于与对应的醛和氢氰酸的平衡之中的腈(氰醇)，使用最小量(＝重量百分比为0.01-5％)的腈是有益的。由于醛通常对于微生物或酶是有毒的。同样，挥发性的腈的有益的使用量为重量百分比0.01-5％。较大量的氰醇或腈可延迟反应。在腈具较低的可溶性或不具实际的可溶性的情况下，或当腈仅少量溶于水介质时，腈的使用量多于上文提及的量是可能并有益的。为提高转换量和产量，进行反应时有控制地添加外消旋的腈是有益的。产物可在反应结束后分离或在旁路途径中连续除去。
上文提及的适当的醛和酮指的是一些化合物，它们在该醛或酮与氢氰酸经过适当的酸催化进行反应后可形成腈。醛与氢氰酸的反应形成氰醇，氰醇的优点在于其处于同醛与氢氰酸的平衡之中。建立一个同氰醇之间的平衡意味着在只转化腈的一种对映体的酶的作用下可以获得100％的理论产率，这是因为外消旋的腈被持续地补充。对于其余的腈，不被酶转化的腈(＝“错误的”或其它的对映体)通过化学反应被有益地外消旋化并返回方法以达到100％的理论产率，或者被弃去或在保持立体中心的情况下被纯化和化学水解。
在0℃-80℃下进行本发明的方法是有益的，优选情况下为10℃-60℃，特别优选的情况下为15℃-50℃。
本发明中的方法中的外消旋腈指的腈类物质是由两种对映体的50∶50的混合物或一种对映体较之另一种更为富集的混合物组成。
本发明中的方法中的手性羧酸指的是表现出对映体的富集的羧酸。在优选情况下，该方法产生的对映体纯度至少为90％ee，在较优选的情况下对映体纯度至少为95％ee，在特别优选的情况下对映体纯度至少为98％ee，在非常优选的情况下对映体纯度至少为99％ee。
本发明的方法使得将大量的外消旋腈转化为手性羧酸成为可能。在该方法中，每毫克蛋白或每克干重微生物每小时转化至少25mmol的腈是可能的，优选情况下至少转化30mmol腈，特别优选的情况下至少转化40mmol腈，非常特别优选的情况下至少转化50mmol腈。
将生长中的含有本发明的核酸，核酸构建物或载体用于本发明的方法是可能的。也可使用休眠或被破碎的细胞。被破碎的细胞指的是，例如，经诸如溶剂这样的方法处理而具透性的细胞或者被酶处理、机械处理(例如，French压力法或超声)或其它任何方法处理而解体的细胞。通过这些途径获得的粗抽提物对于本发明的方法是适合并且有益的。该方法还可使用纯化的或部分纯化的酶。固定化的微生物体或酶同样适合并且可有利地用于该反应。
在本发明的方法中制备的手性羧酸可有利地通过抽提或结晶或抽提和结晶从水反应溶液中分离。为此目的，以一种酸来酸化该水相反应溶液，例如，无机酸(例如，HCl或H2SO4)或有机酸，pH值低于2较为有利，随后以一种有机溶剂来抽提该水相反应溶液。该抽提方法可重复数次以提高产量。可以使用的有机溶剂主要为同水表现出界限的所有溶剂，在适当的情况下为加入盐后表现出界限。有利的溶剂为诸如甲苯、苯、己烷、甲基三丁基醚或乙酸乙酯这样的溶剂。
浓缩有机相后通常可以分离出化学纯度良好的产物，即其纯度大于90％。然而，含有产物的有机相在抽提后还可以只经过部分地浓缩，并且该产物可以被结晶。为此目的，该产物被有利地冷却至0℃-10℃。还可以直接在有机溶液中结晶。该结晶产物可以在相同或不同的用于重结晶的溶剂中被吸收并被再一次结晶。根据共晶组成成分的位置，至少一次的后结晶可能进一步提高产物的对映体纯度。
在以酸进行酸化处理至pH有利地低于2后，该手性羧酸还可以直接从水反应溶液中结晶出来。在有利的情况下，这需要通过加热将该水溶液浓缩10％-90％，优选情况下浓缩20-80％，特别优选情况下浓缩30-70％。优选情况下该结晶方法在冷却条件下进行。在0℃-10℃之间的温度对于结晶是优选的。出于成本原因，从水溶液中直接结晶较为优选。经抽提逐步产生手性羧酸同样较为优选，在适当的情况下可随后进行结晶。
经过这些优选的生产方法，本发明的方法的产物以60-100％产量被分离，优选情况下产量为80％-100％，特别优选情况下产量为60％-100％，产量的计算基于用于本反应的腈。该分离产物具有大于90％的高化学纯度，优选情况下纯度大于95％，特别优选情况下纯度大于98％。另外，该产物具有较高的对映体纯度，该纯度可经进一步的结晶来提高。
以该途径获得地产物适合用作有机合成的起始材料以制备药品或农用化学品，也可用作外消旋拆分的起始材料。
本发明进一步涉及到一种经分离的核酸序列，该序列编码一种具有腈水解酶活性的多肽，该序列选自以下群体：
a)一个核酸序列，它具有在SEQ ID NO：1中所描述的序列，
b)一些核酸序列，它们来自在SEQ ID NO：1中所描述的序列，是遗传密码简异的结果，
c)在SEQ ID NO：1中所描述的序列的变体，它们编码一些多肽，这些多肽具有SEQ ID NO：2中所描述的序列并且在氨基酸水平上具有至少80％的同源性，该多肽的酶活性无实质性降低，
本发明的SEQ ID NO：1序列的核酸序列同源物指的是等位基因变体，在全序列范围内，该变体在所产生的氨基酸水平上具有至少95％的同源性，在优选的情况下具有至少97％的同源性，在特别优选的情况下具有至少98％的同源性。在该序列的区域形成部分上具较高的同源性是可能并且有利的。来自SEQ ID NO：1的氨基酸序列可见于SEQ ID NO：2。等位基因变体特别包括功能性变体，该类变体可通过对SEQ ID NO：1所描述的序列进行缺失，插入或替换而获得，对于向一个有机体进行的一个或多个基因的引入，无论如何完成该引入，所产生的蛋白在酶活性上应只有可忽略的降低。本发明因此还涉及到氨基酸序列，这些氨基酸序列由上述核酸序列群体所编码。本发明有利地涉及到由SEQ ID NO：1序列所编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1的同源物还指，例如，真菌或细菌同源物，截短序列，单链DNA或编码或非编码DNA序列的RNA。在SEQ ID NO：1所示的DNA全序列范围内，SEQ ID NO：1的同源物在DNA水平上至少具有60％的同源性，在优选的情况下至少70％，在特别优选的情况下至少80％，在非常特别优选的情况下至少90％。
SEQ ID NO：1的同源物还指一些衍生物，例如，启动子衍生物。在所述的核酸序列之前的启动子可以通过一个或多个核苷交换，通过对启动子的功能性或效能无负面影响的插入或缺失而被修饰。这些启动子还可能通过对其序列的修饰，或者可以以来自有机体或其它物种的更高效启动子来完全替代这些启动子的序列提高其效能。
衍生物还指一些变体，其在起始密码子前的-10～-200区域的序列和终止密码子后的0～1000碱基对被修饰，修饰以改变基因表达和/或蛋白表达的方式进行，在优选情况下提高基因表达和/或蛋白表达。
SEQ ID NO：1或其同源物可通过技术人员所知的方法有利地从细菌中分离，优选情况下从革兰氏阴性菌中分离，特别优选情况下产碱杆菌属的细菌中分离，非常特别优选情况下粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)中分离。
SEQ ID NO：1或其同源物或这些序列的一部分可以从其它真菌或细菌中分离，例如通过传统的杂交方法或PCR技术。这些DNA序列在标准条件下同本发明中的序列进行杂交。在优选情况下，该杂交同保守区域的短寡聚核苷之间进行，保守区域如来自活性中心的区域，，这些区域可以技术人员所知的方式通过同其它腈水解酶或腈水合酶的比较加以鉴别。然而，在杂交中使用本发明的核酸的较长片段或全序列也是可行的。标准条件根据所使用的核酸寡聚核苷，较长片段或全序列，或根据杂交所用的是RNA还是DNA而变化。例如，DNA∶DNA杂交体的退火温度比同样长度的DNA∶RNA杂交体低10℃。
例如，根据核酸，标准条件为温度在42℃到58℃之间，水缓冲液含0.1～5×SSC(1×SSC＝0.15 M NaCl，15 mM柠檬酸钠，pH7.2)或再加上50％的甲酰胺，如42℃，5×SSC，50％甲酰胺。用于DNA∶DNA杂交体的杂交条件有利地包括0.1×SSC和温度在20℃到45℃之间，在优选情况下温度在30℃到45℃之间。用于DNA∶RNA杂交体的杂交条件有利地包括0.1×SSC和温度在30℃到55℃之间，在优选情况下温度在45℃到55℃之间。对于杂交所提到的温度为退火温度，该温度的示例性计算所根据的核酸长约100核苷，G＋C含量为50％，不含甲酰胺。DNA杂交所用的实验条件在相关的遗传学教科书中有描述，例如，Sambrook et al.，″Molecular Cloning″，Cold Spring HarborLaboratory，1989，这些条件可根据技术人员所知的公式计算，如根据该核酸的长度，杂交体的性质或G＋C含量。技术人员还可在下列教科书中找到进一步的杂交信息：Ausubel et al.，(eds)，1985，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York；Hames and Higgins(eds)，1985，Nucleic AcidsHybridizaton：A Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford；Brown(ed)，1991，EssentialMolecular Biology：A Pratical Approach.IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford。
本发明的核酸构建物指的是SEQ ID NO：1或其类似物的腈水解酶基因，在有利情况下，该基因功能地连接于一个或多个调控信号以增强表达。这些调控序列为，例如，可被诱导物或抑制物结合并由此而调控该核酸表达的序列。除这些新的调控序列之外，这些序列的天然调控还可能存在于实际的结构基因之前，并在适当情况下经遗传学上的修饰以关闭该天然调控并且该基因的表达已被增强。然而，该核酸构建物还可具有较简单的结构，即在SEQ ID NO：1或其类似物之前并不插入额外的调控序列并且不缺失该天然启动子及其调控。作为替代，该天然调控序列经突变以使调控消失，并且该基因的表达被增强。在有利情况下，该核算机构体可以额外地含有一个或多个增强子序列，增强子序列可使该核酸序列表达的提高成为可能，该序列与启动子功能性地连接。在DNA序列的3’末端插入额外的有益序列是可行的，例如，其它调控元件或终止子。本发明的该核酸序列可能在该构建物中存在一个或多个拷贝。为便于构建物的选择时，该构建物可能还含有进一步的标记，如抗生素抗性或营养缺陷型的互补基因。
对于本发明的方法有利的调控序列为，例如，在启动子中存在的序列如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL启动子，它们可在革兰氏阴性菌中有利地使用。进一步有利的调控序列存在于，例如，革兰氏阳性启动子amy和SPO2，真菌或酵母启动子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH。与此联系的其它有利的序列为丙酮酸脱羧酶和乙醇氧化酶，它们来自汉逊酵母属。使用人工启动子用于调控也是可行的。
该核酸构建物被有利地插入一种载体以用于在宿主机体中表达，例如，一种质粒，一种噬菌体或其它DNA，该载体可使该基因的最大表达成为可能。这些载体为本发明的进一步开发。在大肠杆菌中的适当载体的例子有pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS1，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11或pBdCI，在链霉菌中的适当载体的例子有pIJ101，pIJ364，pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌中的适当载体的例子有pUB110，pC194或pBD214，在棒状杆菌中的适当载体的例子有pSA77或pAJ667，在酵母中的适当载体的例子有2μM，pAG-1，Yep6，Yep13或pEMBLYe23，在植物中的适当载体的例子有pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004或pDH51。所述的载体为可行的质粒的一小部分选择。进一步的质粒为技术人员所熟知，它们可见于，例如，Cloning Vectors(eds.Pouwels P.H.et al.Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)。
对于其它存在的基因的表达，该核酸构建物还可有利地含有额外的3’和/或5’终止调控序列以增强表达，它们根据所选用的宿主有机体和基因而被选出以进行最佳的表达。
这些调控序列的目的在于使该基因的特异表达和蛋白的表达成为可能。这意味着，根据诸如宿主有机体这样的因素，该基因只在诱导后表达或过表达或者被直接表达和或过表达。
进一步，该调控序列或因子可能优选地正性影响并因此而增强被诱导基因的表达。这样，该调控元件的增强作用可以有利地在转录水平上进行。然而，通过诸如提高mRNA的稳定性以额外地增强翻译也是可行的。
在载体的另一个实施方案中，含有本发明的核酸构建物或核酸的载体可能被有利地以线性DNA的形式引入微生物体并通过异源或同源重组而整合入该宿主有机体的基因组中。该线性DNA可以由一个线性化载体组成，例如一种质粒，或仅仅由该核酸构建物或核酸组成。
对于异源基因在有机体中的最佳表达，修饰核酸序列以使其同在该有机体中所特异使用的密码子的使用相一致是有益的。密码子的使用可在对在相关有机体的其它已知基因的计算机分析基础上较容易地确立。
适合于本发明的核酸结构提或核酸的宿主有机体主要为所有的原核和真核有机体。可有利地使用的宿主有机体为微生物体，如细菌，真菌或酵母。使用革兰氏阴性或革兰式阳性细菌是有利的，在优选情况下为肠细菌或诺卡氏菌家族的细菌，特别优选的情况下为埃希氏杆菌属，假单胞菌属或红球菌属的细菌。非常特别优选的情况下为大肠埃希氏杆菌。
本发明的宿主有机体进一步优选地含有至少一种蛋白性质的试剂以用于折叠它合成的蛋白并且含有具有本发明所述的腈水解酶活性的核酸序列和/或编码该试剂的基因，该试剂的存在量高于所考虑的有机体中的基础含量。编码这以试剂的基因存在于染色体或染色体外元件如质粒中。
实施例实施例1：从粪产碱菌1650中纯化腈水解酶1.细胞的生产粪产碱菌1650在培养基A中30℃振荡培养8小时。培养基A：酵母抽提物 5 g/l蛋白胨 3.5 g/lCH3CO2NH4 5 g/lKH2PO4 5 g/lMgSO4 0.2 g/lFeSO4 0.03 g/lNaCl 1 g/l丁腈 1 g/l
将该预培养物200ml注入10L发酵罐，该罐含有8L的新鲜培养基。pH，温度，气流或搅拌速度为7.2，30℃，300 l/h和300rpm。22小时后获得了81g的生物物质。这对应于3.8g/l的细胞干重和600nm下吸光密度为8。2.对苯乙醇腈的酶活性的测定
如实施例1所述获取细胞，在10mM，pH7.2的Na/K磷酸缓冲液中洗涤两次。40mg的干重细胞被重悬浮于20ml的10mM，pH6.8的Na/K磷酸缓冲液中，加入8.3mM苯乙醇腈以起始反应。该反应在40℃下振荡进行。通过取样并随后在高效液相色谱(ODS Hypersil)的辅助下除去细胞来跟踪外消旋的拆分动力学。在这一条件下测定苯乙醇腈，苯甲醛，mandelamide和苯基乙醇酸。结果见图1[苯乙醇腈转化为苯基乙醇酸，每批]。苯基乙醇酸的形成速度为41.3 U每克干重细胞，转化率30％，在此1U定义为在40℃下每分钟形成lμmol苯基乙醇酸。3.对苯乙醇腈的酶选择性的测定
如实施例1所述获取细胞，在10mM，pH7.2的Na/K磷酸缓冲液中洗涤两次。40mg的干重细胞被重悬浮于20ml的10mM，pH6.8的Na/K磷酸缓冲液中，加入8.3mM苯乙醇腈以起始反应。该反应在30℃下振荡进行。通过取样并随后在高效液相色谱(Nucleodex β-PM)的辅助下除去细胞来跟踪外消旋的拆分动力学。在这一条件下测定S-(＋)-和R-(-)-苯基乙醇酸。所形成的R-(-)-苯基乙醇酸在50％的转化率下旋光纯度为98％。酶(＝E)的选择性在50％的转化率下为499。4.纯化除非另外说明，纯化期间所有的缓冲液中均含有10mM DTT。步骤1：细胞破碎
每一次如实施例1所述从10L发酵物中获取细胞，离心沉淀下细胞并在1L的0.1M，pH7.2的Tris/HCl缓冲液中洗涤两次。所产生的细胞干重约162g。每次在160ml 1L的0.1M，pH7.2的Tris/HCl缓冲液中重悬浮81g细胞，使用Menton-Gaulin在750巴下破碎4次。匀浆物随后在30,000g下离心39分钟，弃去沉淀。如表1所示，上清(140ml)具有73％的剩余活力。步骤2：离子交换层析
以400ml(20mM Tris/HCl，pH8.5)稀释上清并以23,000g再离心20分钟。350ml缓冲液A中的液体被加样至一个Q-Sepharose(来自Pharmacia的直径5厘米，高22厘米，体积432毫升的Q-SepharoseFast Flow)柱。一开始用10％的缓冲液B(含1M NaCl的缓冲液A)以20ml/min的流速洗柱(总上样和洗柱体积相当于1.5L)。在90分钟的时间里该比率线性上升至60％的缓冲液B。随后在91至120分钟之间使用100％的缓冲液B进行洗脱。共收集了100份40ml的流分。腈水解酶在流分50至60之间被洗脱。混合该流分并通过使用10kDa膜(Amicon)进行的超滤将其浓缩至10ml。步骤3：分子筛层析
离子交换层析(步骤2)后的浓缩物通过分子筛层析(Superdex200 prep.Grade，Pharmacia，分离范围10～600kDa，直径2.6厘米，高60厘米，体积325毫升)进一步纯化成各为5ml的两部分。在280nm处检测。该柱在20mM，pH7.4磷酸缓冲液，5mM的DTT和150mM的NaCl中进行平衡，该平衡以1.5ml/min的流速进行。收集到40个流分。在流分3～5中发现了腈水解活性。步骤4：离子交换层析
分子筛层析(步骤3)后的流分混合后在一个Mono Q柱(柱体积1ml，Mono Q HR515，Pharmacia)上进行进一步纯化。所使用的缓冲液A为含5mM DTT的20mM，pH7.4磷酸缓冲液，所使用的缓冲液B为含有1M NaCl的缓冲液A。流速为1ml/min。来自分子筛层析的活性组分(约100ml)被稀释至电导率为6ms/ml并直接加样至Mono Q柱，这样，蛋白便被吸附。上样后以5％的缓冲液B洗柱。在30分钟内，以梯度为5％～40％的缓冲液B洗柱，随后以100％的缓冲液B洗脱10分钟。腈水解酶在梯度中的17和18流分中被洗脱。表I所示为纯化的步骤1-4。表I：纯化方案
| 样品 | 体积[ml] | 活性[u/l] | 总活性[mu] | 产率[％] | 蛋白[mg/ml] | 总蛋白[mg] | 特异活性[u/g] |
| 破碎前 | 160 | 480 | 76,800 | 100 | - | - | - |
| 破碎后 | 140 | 400 | 56,000 | 72.9 | - | - | - |
| Q-Sepharose | |||||||
| 上样量 | 140 | 192 | 26,880 | 35 | 12.4 | 1736 | 15 |
| AF | 400 | 77 | 30,800 | 40.1 | 0.26 | 104 | 296 |
| Superdex 200 | |||||||
| 上样量 | 9.5 | ＞378 | ＞3591 | 4.7 | 2.41 | 22.90 | ＞157 |
| AF | 43 | 59 | 2537 | 3.3 | 0.21 | 9.03 | 281 |
| Mono Q | |||||||
| 上样量 | 100 | 4.8 | 480 | 0.6 | 0.06 | 6.33 | 76 |
| AF | 4 | ＞77 | 308 | 0.4 | 0.19 | 0.76 | ＞405 |
如图2所示，来自分子筛层析(步骤3)和离子交换层析的(步骤4)的活性组分(＝AF，表I)经SDS-PAGE分离。步骤5：反相(RP)高效液相色谱
以RP色谱检测Mono Q层析的活性流分(流分17和18)的均一性并对其进一步纯化以准备进行胰蛋白酶切割。该分离以Abimed柱(3厘米)在一个Helett-Packard设备(HP 1090)上进行。所使用的流动相为缓冲液A：含0.1％TFA的水，以及缓冲液B：含0.1％TFA的丙氰。注入体积0.1ml，流速0.5ml/min。洗脱梯度具以下特征：
| 分钟 | ％缓冲液A | ％缓冲液B |
| 0 | 80 | 20 |
| 2 | 80 | 20 |
| 22 | 30 | 70 |
| 22.1 | 0 | 100 |
| 24 | 0 | 100 |
| 25 | 100 | 0 |
| 30 | 100 | 0 |
在第12和13分钟之间洗脱下腈水解酶。这对应于SDS-PAGE上的37 kDa带。使用Applied Biosystem 494 Promise蛋白质测序仪对该带进行部分测序。通过该途径获得39个氨基酸的N末端序列被称为后文的SEQ ID NO：3。该序列被包含于附加的序列表中，为：Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala AlaSer Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile GluLeu Ala Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly。5.胰蛋白酶肽的制备
来自Mono Q层析(步骤4)的样品进行如下预处理：以12.5％的TCA沉淀蛋白，以1ml的乙醚/乙醇(1∶1)洗涤沉淀3次。在0.2ml的6M盐酸胍，25mM Tris/HCl，pH 8.5，溶液中溶解沉淀。2.6μl的1M DTT溶液被加入该溶液以还原二硫桥。该样品在黑暗中振荡1小时。随后该蛋白同1.5μl的4-乙烯基嘧啶溶液(35％)在黑暗中反应2小时。通过加入2.6μl的1M DTT溶液温浴1小时来终止反应。如上文所述通过RP-HPLC来纯化vinylpyrrilidated酶。保留时间现在为10到11分钟之间。通过分子量鉴别出的活性组分被收集并浓缩至0.02ml。这一组分可经加入0.01ml的乙腈和0.1M，pH 8.5的Tris/HCl调节至0.2ml。再加入0.05ml 0.1M的NaOH来校正pH值。该样品(蛋白含量约0.3mg)同0.032ml 1mg/ml胰蛋白酶相混合并在37℃下温浴过夜，该胰蛋白酶处于0.1M，pH 8.5的Tris/HCl和5％乙腈中。以0.01ml的乙酸终止该消化，随后进行离心。在C18(洗脱系统：缓冲液A：水，0.1％TFA，缓冲液B：乙腈，0.1％TFA)上以RP-HPLC分离该上清。收集肽(在205nm和280nm下检测)并测序。使用的是Applied Biosystems 494 Procise蛋白测序仪。在内部的21个氨基酸的肽序列在后文被称为SEQ ID NO：4，在内部的11个氨基酸的肽序列在后文被称为SEQ ID NO：5。SEQ ID NO：4和5被包括在附加的序列表中，它们是：SEQ ID NO：4Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser ValAla Ile Ser His Pro GlnSEQ ID NO：5Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys6.纯化的腈水解酶对苯乙醇腈的活性
根据实施例2所述探测了纯化的腈水解酶对苯乙醇腈的活性。纯化的腈水解酶对苯乙醇腈的特异活性为12，380 u/克蛋白。实施例2：从Alcaligenes faecalis 1650中对腈水解酶的克隆
被合成的核苷探针来自于实施例1中所描述的肽序列SEQ IDNO：3和4。来自SEQ ID NO：3，N末端肽序列的核苷探针是一个64倍(mal)简并的23基体(mer)(在该核苷探针序列中，A，C，G和T被N替代；A或G被R替代；C或G被S替代)。文献中所描述的产碱杆菌属菌株中的高比率GC意味着对于谷氨酸和异亮氨酸，其密码子第三位的选择已经预先确定。在后文被称为SEQ ID NO：6的核苷探针是以下的PCR的5’引物，其中S＝C或G并且N＝A，C，G或T，该序列为：SEQ ID NO：65’-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3’
一个作为核苷探针的256倍简并的20基体来自于SEQ ID NO：4，该序列为内部的肽序列(在核苷碱基序列中，A，C，G和T被N替代；A或G被R替代；C或G被S替代)。产碱杆菌属菌株中的高比率GC意味着对于赖氨酸，其密码子第三位的选择已经预先确定。该核苷序列是以下的PCR的3’引物，它在在后文被称为SEQ ID NO：7。SEQ IDNO：7被包括在附加的序列表中，它是：SEQ ID NO：75’-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3’
SEQ ID NO：6和7这对引物被用于进行对来自粪产碱菌1650的染色体的PCR。根据技术人员已知的经典方法以溶菌酶和蛋白酶处理使细胞裂解，此后进行对染色体DNA的分离(Ausbel，F.M.et al.(1994)Current protocols in molecular biology，John Wiley andSons)。
使用Pwo多聚酶进行的PCR包括在95℃下3分钟；进行35个循环，每个循环中在95℃下变性1分钟，引物在58℃下退火1分30秒，在72℃下多聚化1分30秒；在72℃下5分钟完成多聚化。
在这些条件下从来自Alcaligenes faecalis 1650的染色体中扩增出了大小约1kb的片段。为克隆该载体，在上述两个引物上均附加了一个XbaI限制性切点和两个额外的核苷(5’-AATCTAGA和5’-AATCTAGA)，在上述的条件下重复PCR反应。一个大小约1kb的片段再一次被扩增出来，该片段经纯化和XbaI消化后被连接入经同样消化的pUC18。在对大肠杆菌JM109进行转化并将所产生的质粒进行分离之后，该DNA通过测序和随后的基因组Southern印记被纯化。用于分离全长腈水解酶基因(nit)的分子生物学和微生物学的方法是技术人员所已知的经典的方法。全长腈水解酶基因见SEQ ID NO：1。实施例3：与其他蛋白的同源性，该同源序列的鉴另
同来自SWISSPROT蛋白数据库的序列进行的比较表明，本发明的腈水解酶基因同已知的腈水解酶在氨基酸水平上具有11到96％的同源性。这一巨大的序列同源性见于该酶同来自粪产碱菌JM3的芳基乙腈特异的腈水解酶之间(Nagasawa et al.，Eur.J.Biochem.1990，194，765-772)。在一个1071bp区域内，这两种腈水解酶基因在核苷水平上具有93.2％的相同性。所产生的氨基酸序列在一个356个氨基酸的区域内具有96.1％的相同性。最小的相同性为在534个氨基酸的区域内具有11.4％的相同性，这见于该基因同来自RhodococcuSerythropolis SK92的腈水解酶之间。实施例4：腈水解酶在大肠杆菌中的异源表达
nit基因被扩增用以克隆入表达载体pJOE2702。在该情况下被选中用于PCR的5’引物为上述的SEQ ID NO：3，该引物在nit的5’末端附加有一个与翻译起始密码子重叠的NdeI切点。该引物在下文被称为SEQ ID NO：8，它被包括入附加的序列表。被选用的3’引物是nit基因的3’区域的一个24基体，该引物在终止密码子附近添加有一个BamHI切点。该引物在下文被称为SEQ ID NO：9，它被包括入附加的序列表。
5′-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3′(＝SEQ ID NO：8)
5′-AAGGATCCTCAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-3′(＝SEQ ID NO：9)
使用Pwo多聚酶的PCR包括在94℃下3分钟；进行25个循环，每个循环中在93℃下变性1分钟，引物在55℃下退火1分30秒，在72℃下多聚化1分30秒；在72℃下5分钟完成多聚化。所产生的PCR片段被纯化，经过NdeI/BamHI消化并整合入经同样消化的pJOE2702(Volff et al.，1996 Mol.Microbiol.，21(5)，1037-1047)。所产生的质粒被称为pDHE19.2并在图3中有描述。通过NdeI/BamHI切点的整合意味着在质粒pDHE19.2中该nit基因处于启动子rhap的控制之下，该启动子存在于pJOE2702中并由在大肠杆菌中的正性调控的L-鼠李糖操纵子rhaBAD起始(Egan & Schleif，1994，J.Mol.Biol.，243，821-829)。nit基因转录的终止和翻译的起始同样通过载体序列进行。另外，该治理含有一个赋予氨苄青霉素抗性的基因ApR。
通过含质粒pDHE19.2的大肠杆菌JM109菌株表现出腈水解酶的异源表达。为此目的，在含100μg/ml的氨苄青霉素的TB培养基中37℃震荡培养菌株JM109(pDHE19.2)。OD600达到1.7时，按1∶200将培养物转入新鲜TB培养基并在30℃震荡培养，该新鲜培养基含用于诱导腈水解酶的0.2％(w/v)的L-鼠李糖。8小时后收集细胞，在10mM，pH7.2的Na/K磷酸缓冲液中洗涤，重悬浮于同样的磷酸缓冲液中至OD600为10，处理后进行超声破碎。实施例5：重组菌株大肠杆菌JM109(pDHE19.2)的腈水解酶的活性的测定1.细胞的产生
大肠杆菌JM109(pDHE19.2)在含100μg/ml的氨苄青霉素的TB培养集中37℃下震荡培养6小时。OD600达到4时，用100ml的预培养物注入含8L新鲜TB培养基的10L发酵罐，该培养基中含100μg/ml的氨苄青霉素和2g/l的L-鼠李糖。pH值，温度，空气流速和搅拌速度为7.2，30℃，300 l/h和400-650rpm。16小时后收集细胞。这时在600nm下的光密度为18，该值对应于7.8g/l的干重细胞。2.苯乙醇腈的酶活性的测定
如实施例1所述获取细胞，在10mM，pH7.2的Na/K磷酸缓冲液中洗涤。2mg的干重细胞被重悬浮于1ml的10mM，pH6.8的Na/K磷酸缓冲液中，加入8.3mM苯乙醇腈以起始反应。该反应在40℃下振荡进行。通过取样并随后以高效液相色谱(ODS Hypersil)来跟踪外消旋的拆分动力学。在这一条件下测定苯乙醇腈，苯甲醛，mandelamide和苯基乙醇酸。苯基乙醇酸的形成速度为403 U每克干重细胞，转化率30％，在此1U定义为在40℃下每分钟形成1μmol苯基乙醇酸。实施例6：使用在悬浮物中的大肠杆菌JM109(pDHE19.2)通过水解苯乙醇腈而进行的R-苯基乙醇酸的合成
在10个小时的期间内测量1L的10mM，pH6.8的Na/K磷酸缓冲液中的含量为1.3g/l的苯乙醇腈，该溶液含有浓度为2g/l的大肠杆菌JM109(pDHE19.2)，在40℃下以桨式搅拌器进行搅拌。测量根据腈的消耗来进行。R-苯基乙醇酸的消耗速度按实施例5中的描述来跟踪。结果见图4所示。实施例7：通过从悬浮物中的大肠杆菌JM109(pDHE19.2)进行苯乙醇腈水解而产生的反应混合物中提取来分离R-苯基乙醇酸
在实施例6中所获得的水相苯基乙醇酸反应混合物经离心来除去细胞，以酸调节pH值至2并以四丁基醚(MTBE)抽提三次。通过蒸发从苯基乙醇酸抽提物中除去有机溶剂后，所产生的白色苯基乙醇酸晶体被重新溶解并以高效液体色谱检测其化学和旋光纯度。该化学纯度为99％，R-苯基乙醇酸的旋光纯度为97.4％ee。实施例8：通过在悬浮物中的大肠杆菌JM109(pDHE19.2)进行苯乙醇腈水解而产生的反应混合物而进行冷却结晶来分离R-苯基乙醇酸
在实施例6中所获得的水相苯基乙醇酸反应混合物经离心来除去细胞，通过加热并搅拌来将其浓缩至初始体积的40％并且以酸调节pH值至2。通过冰浴使苯基乙醇酸结晶析出，通过抽气滤出所产生的白色晶体并干燥。该晶体被重新溶解并以高效液体色谱检测其化学和旋光纯度。该化学纯度为99.1％，R-苯基乙醇酸的旋光纯度为99.8％ee。实施例9：各种腈的转化率
该大肠杆菌菌株(见实施例6)或原来的产碱杆菌菌株被用来转进行培养化各种腈类。该产碱杆菌细胞在30℃下在400ml的产碱杆菌培养基中(见上文的培养基A)160rpm培养16小时(＝h)。离心收集该细胞(4℃，5000rpm，30分钟)。向微量滴定板中每孔加入细胞悬浮物150μl。随后离心该板。吸去上清并以Na2HPO4(1.42g/l，溶于finnaqua中，pH 7.2)洗涤细胞沉淀两次。加入底物溶液(150μl)并重悬浮细胞。向微量滴定板每排12孔加入一种底物。只有底物而无细胞的一排被用作参照(＝空白)。
该微量滴定板被置于振荡温浴器，在200rpm和30℃下2小时。随后离心沉淀细胞并使用Biomek仪器来测定上清中产生的NH4的量。测量在620nm下使用以各种NH4OH溶液构建的标准图来进行(见图5)。所用的底物为苯乙醇腈(＝1)，2-苯基丙腈(＝2)，2-苯基丁腈(＝3)，苯乙腈化物(＝4)，4-氯苯乙腈化物(＝5)，4-溴苯乙腈化物(＝6)，丙腈(＝7)，2-甲基丁腈(＝8，2-氰基丁烷)，geranonitrile(＝9)，valeronitrile(＝10)，3-氰基吡啶(＝11)，3-二苯基-2-羟基丁腈(＝12)，4-氟苯基氰化物(＝13，4-氟苯甲基乙腈(acetronitrile))和α-(3-庚酸)-硝基-三乙腈(＝14)。每种底物均制成在甲醇中的0.2摩尔的储存溶液，该溶液被以Na2HPO4(1.42g/l，溶于finnaqua中，pH 7.2)稀释至10mM。该细胞悬浮物经标准化至2g每升干生物物质。袁II所示为微量滴定板中一排的转化平均值。
表II：腈水解酶1650对各种腈类的转化率
| 底物No. | μmol/l | 活性 | ％转化率 |
| 1 | 2141.2 | 8.9 | 86.3 |
| 2 | 1001.1 | 4.1 | 70.2 |
| 3 | 24.2 | 0.1 | 44.3 |
| 4 | 2210.5 | 9.2 | 100 |
| 5 | 2136.3 | 8.9 | 100 |
| 6 | 1500.8 | 6.2 | 100 |
| 7 | 4.9 | 0.02 | NA |
| 8 | - | - | NA |
| 9 | - | - | NA |
| 10 | 113.4 | 0.47 | NA |
| 11 | - | - | NA |
| 12 | - | - | NA |
| 13 | 2222.9 | 9.2 | 100 |
| 14 | 84.8 | 0.35 | 44.1 |
图6所示为作为活性的转化的结果
序列表(1)基本信息：(i)申请人：
(A)名称：BASF Aktiengesellschaft
(B)街道：Car-Bosch-strasse 38
(C)城市：Ludwigshafen
(D)州/省/邦：Rheinland Palatinate
(E)国家：德意志联邦共和国
(F)邮编：D-67056(ii)申请题目：一种通过使用腈水解酶或含有腈水解酶的微生物来从腈类物质中制备手性羧酸的方法(iii)序列数：9(iv)机读格式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25
(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1071个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iv)反义：非(v)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vi)说明：
(A)NAME/KEY：CDS
(B)位置：1…1071(vii)序列描述：SEQ ID NO：1ATG CAG ACA AGA AAA ATC GTC CGG GCA GCC GCC GTA CAG GCC GCC TCT 48Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser1 5 10 15CCC AAC TAC GAT CTG GCA ACG GGT GTT GAT AAA ACC ATT GAG CTG GCT 96Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala
20 25 30CGT CAG GCC CGC GAT GAG GGC TGT GAC CTG ATC GTG TTT GGT GAA ACC 144Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr
35 40 45TGG CTG CCC GGA TAT CCC TTC CAC GTC TGG CTG GGC GCA CCG GCC TGG 192Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp
50 55 60TCG CTG AAA TAC AGT GCC CGC TAC TAT GCC AAC TCG CTC TCG CTG GAC 240Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp65 70 75 80AGT GCA GAG TTT CAA CGC ATT GCC CAG GCC GCA CGG ACC TTG GGT ATT 288Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile
85 90 95TTC ATC GCA CTG GGT TAT AGC GAG CGC AGC GGC GGC AGC CTT TAC CTG 336Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu
100 105 110GGC CAA TGC CTG ATC GAC GAC AAG GGC GAG ATG CTG TGG TCG CGT CGC 384Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg
115 120 125AAA CTC AAA CCC ACG CAT GTA GAG CGC ACC GTA TTT GGT GAA GGT TAT 432Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr
130 135 140GCC CGT GAT CTG ATT GTG TCC GAC ACA GAA CTG GGA CGC GTC GGT GCT 480Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala145 150 155 160CTA TGC TGC TGG GAG CAT TTG TCG CCC TTG AGC AAG TAC GCG CTG TAC 528Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr
165 170 175TCC CAG CAT GAA GCC ATT CAC ATT GCT GCC TGG CCG TCG TTT TCG CTA 576Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu
180 185 190TAC AGC GAA CAG GCC CAC GCC CTC AGT GCC AAG GTG AAC ATG GCT GCC 624Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala
195 200 205TCG CAA ATC TAT TCG GTT GAA GGC CAG TGC TTT ACC ATC GCC GCC AGC 672Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser
210 215 220AGT GTG GTC ACC CAA GAG ACG CTA GAC ATG CTG GAA GTG GGT GAA CAC 720Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His225 230 235 240AAC GCC CCC TTG CTG AAA GTG GGC GGC GGC AGT TCC ATG ATT TTT GCG 768Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala
245 250 255CCG GAC GGA CGC ACA CTG GCT CCC TAC CTG CCT CAC GAT GCC GAG GGC 816Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His ASp Ala Glu Gly
260 265 270TTG ATC ATT GCC GAT CTG AAT ATG GAG GAG ATT GCC TTC GCC AAA GCG 864Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala
275 280 285ATC AAT GAC CCC GTA GGC CAC TAT TCC AAA CCC GAG GCC ACC CGT CTG 912Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu
290 295 300GTG CTG GAC TTG GGG CAC CGA GAC CCC ATG ACT CGG GTG CAC TCC AAA 960Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys305 310 315 320AGC GTG ACC AGG GAA GAG GCT CCC GAG CAA GGT GTG CAA AGC AAG ATT 1008Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile
325 330 335GCC TCA GTC GCT ATC AGC CAT CCA CAG GAC TCG GAC ACA CTG CTA GTG 1056Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val
340 345 350CAA GAG CCG TCT TGA 1071Gln Glu Pro Ser
355(3)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：365个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)构型：线性 (ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser1 5 10 15Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala
20 25 30Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr
35 40 45Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp
50 55 60Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp65 70 75 80Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile
85 90 95Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu
100 105 110Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg
115 120 125Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Ty
130 135 140Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala145 150 155 160Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr
165 170 175Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu
180 185 190Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala
195 200 205Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser
210 215 220Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His225 230 235 240ASh Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala
245 250 255Pro ASp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly
260 265 270Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala
275 280 285Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu
290 295 300Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys305 310 315 320Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile
325 330 335Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val
340 345 350Gln Glu Pro Ser
355(4)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：39个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)构型：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义：非(v)片段类型：N-末端(vi)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vii)直接来源：
(B)克隆：腈水解酶(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser1 5 10 15Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala
20 25 30Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly
35(5)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：21个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)构型：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无(iv)反义：非(v)片段类型：内部(vi)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vii)直接来源：
(B)克隆：腈水解酶(xii)序列描述：SEQ ID NO：4Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala1 5 10 15Ile Ser His Pro Gln
20(6)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)构型：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：无 (iv)反义：非(v)片段类型：内部(vi)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vii)直接来源：
(B)克隆：腈水解酶(xiii)序列描述：SEQ ID NO：5Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys
1 5 10(7)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iv)反义：非(v)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vi)直接来源：
(B)克隆：腈水解酶(xi)序列描述：SEQ ID NO：6ATGCAGACNA GNAARATCGT SCG 23(8)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iv)反义：非(v)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vi)直接来源：
(B)克隆：腈水解酶(xii)序列描述：SEQ ID NO：7TNGCSACNGA NGCRATCTTG 20(9)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iv)反义：非(v)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vi)直接来源：
(B)克隆：腈水解酶(xiii)序列描述：SEQ ID NO：8TTAATCATAT GCAGACAAGA AAAATCGTCC G 31(10)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：32个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)构型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：无(iv)反义：非(v)原始来源：
(A)有机体：粪产碱菌
(B)菌株：1650(vi)直接来源：
(B)克隆：腈水解酶(xiv)序列描述：SEQ ID NO：9AAGGATCCTC AAGACGGCTCTTGCACTAGC AG 32
Claims (15)
1.一种被分离的核酸序列，该序列编码一种具有腈水解酶活性的多肽，该核酸序列选自以下群体：
a)一个核酸序列，该序列具有在SEQ ID NO：1中所描述的序列，
b)一些核酸序列，它们衍生自SEQ ID NO：1所描述的序列，使遗传密码简并性的结果，
c)SEQ ID NO：1所描述的核酸序列的衍生体，这些衍生体编码的多肽具有在SEQ ID NO：2中所描述的氨基酸序列并且在氨基酸水平上具有至少95％的同源性，这些多肽在酶活性上没有实质性降低。
2.一个氨基酸序列，该序列由权利要求1中所要求的核酸序列编码。
3.权利要求2所要求的氨基酸序列，该序列由SEQ ID NO：1所描述的序列编码。
4.一种核酸构建物，该构建物含有权利要求1所要求的核酸序列，该核酸序列被连接于一个或多个调控信号。
5.一种载体，该载体含有权利要求1所要求的核酸序列或权利要求4所要求的核酸构建物。
6.一种微生物体，该微生物体含有至少一种权利要求1所要求的核酸序列或至少一种权利要求4所要求的核酸构建物。
7.一种权利要求6所要求的微生物体，其中该微生物体是埃希氏菌属、假单胞菌属或产碱杆菌属的细菌。
8.一种方法，该方法用于制备手性羧酸，该羧酸具通式I
该方法包括转化具通式II的外消旋腈
该转化在权利要求2或3所要求的氨基酸序列存在或存在生长中的、休眠的或破碎的权利要求6或7所要求的微生物体的情况下进行，其中每毫克蛋白或者每克干重每小时至少将25mmol腈转化成为手性羧酸，
其中通式I和II重的取代基和变量具有以下的意义：
*一个旋光活性中心
R1，R2，R3各自独立地为氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，取代或未取代的芳基，杂芳基，OR4或NR4R5，其中基团R1，R2，R3总是各不相同，
R4氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，C1～C10-烷羰基，C2～C10-烯基羰基，芳基，芳基羰基，杂芳基或杂芳基羰基，
R5氢，取代或未取代的及分支或无分支的C1～C10-烷基，C2～C10-烯基，芳基或杂芳基。
9.权利要求8所要求的方法，其中取代基R1，R2，R3之一为R4。
10.权利要求8或9任一所要求的方法，其中取代基R1，R2，R3之一为芳基。
11.权利要求8到10任一所要求的方法，其方法在一种含水反应溶液中进行，pH值在4到11之间。
12.权利要求8到11任一所要求的方法，其中重量比为0.01～10％的腈或者重量比为0.01～10％的相应的醛或酮或重量比为0.01～10％的氰氢酸在该方法中被转化。
13.权利要求8到12任一所要求的方法，其方法在温度0℃至80℃之间进行。
14.权利要求8到13任一所要求的方法，其中该手性羧酸从反应溶液中通过提取或结晶或提取和结晶来分离，产率从60到100％。
15.权利要求8到14任一所要求的方法，其中该手性羧酸所具有的旋光纯度至少为90％ee。
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|---|---|---|---|
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