CN1371420A - 编码磷酸烯醇丙酮酸:糖类磷酸转移酶系统蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因 - Google Patents

编码磷酸烯醇丙酮酸:糖类磷酸转移酶系统蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因 Download PDF

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Abstract

本发明描述了分离的编码新的谷氨酸棒杆菌PTS蛋白的核酸分子,该分子被称为PTS核酸分子。本发明也提供了反义核酸分子,含有PTS核酸分子的重组表达载体,以及已导入表达载体的宿主细胞。本发明也进一步提供了分离的PTS蛋白,PTS突变蛋白,融合蛋白质,抗原肽,以及基于谷氨酸棒杆菌PTS基因遗传工程提高由该生物体进行的所需化合物生产的方法。

Description

编码磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统蛋白质的谷氨酸棒杆 菌基因
相关申请
本申请要求1999年7月1日提交申请的编号为No.：60/142,691的美国临时专利申请和1999年8月23日提交申请的编号为No.：60/150,310的美国临时专利申请的优先权，该申请本文全文引为参考。本申请也要求1999年9月3日提交申请的编号为No.：19942095.5的德国专利申请和1999年9月3日提交申请的编号为No.：19942097.1的德国专利申请的优先权，该申请本文全文引为参考。
发明背景
细胞中天然存在的代谢过程中的特定产物和副产物，在很多行业中具有用途，包括食品、饲料、化妆品和制药产业。这些分子总称为“精细化学物质”，包括有机酸、蛋白源的和非蛋白源的氨基酸、核苷酸和核苷、脂质和脂肪酸、二醇、糖类、芳香族化合物、维生素和辅因子以及酶。可以通过大规模培养产生并分泌大量特定所需分子的细菌，最方便的制备这些产品。用于这一目的的一种特别有用的生物体就是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，一种革兰氏阳性非病原菌。通过菌株筛选，出现了许多产生大批所需化合物的突变株。然而，为改进特殊分子生产而进行的菌株筛选，是一个耗时并且困难的过程。
发明概述
本发明提供了新的细菌核酸分子，这些分子具有多种用途。这些用途包括鉴定可以产生精细化学物质的微生物、调节谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌中的精细化学物质的产生、谷氨酸棒杆菌或者亲缘细菌的分型和鉴定、作为绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点。这些新的核酸分子编码蛋白质，此处称为磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统(PTS)蛋白质。
谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性需氧细菌，通常在工业中被用于大规模生产各种精细化学物质，也用于降解烃类(例如在石油泄漏中)和氧化萜品醇。因此，本发明的PTS核酸分子，可用来鉴定能用于生产精细化学物质的微生物，例如通过发酵方法。调节本发明PTS核酸分子的表达，或者修饰本发明PTS核酸分子的序列，可以用于调节微生物中一种或者多种精细化学物质的生产(例如，提高棒杆菌或者短杆菌中一种或者多种精细化学物质的产生)。
本发明PTS核酸分子可用于鉴定一种微生物是否是谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株，或者鉴定微生物混合群体中谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株的存在。本发明提供了许多谷氨酸棒杆菌基因的核酸序列；在严格条件下，用探针探查从单一微生物或者混合微生物群体培养物中提取的基因组DNA，该探针覆盖了谷氨酸棒杆菌基因特有的一段区域，可以确定是否有该微生物存在。尽管谷氨酸棒杆菌本身是非病原性的，但是它与人体中的病原菌种有关，例如白喉棒状菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(白喉致病原)；探测这种微生物具有重大的临床实用性。
本发明PTS核酸分子也可以用作绘制谷氨酸棒杆菌基因组图谱的参照点，或者绘制其亲缘菌株基因组图谱的参照点。相似的，这些分子，或者其变体或其部分，可以用作遗传工程棒杆菌或者短杆菌的遗传标记。
例如，本发明新核酸分子编码的PTS蛋白，能够把像是葡萄糖这样的高能量含碳分子转运进谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的细胞内信号传导。考虑到可在谷氨酸棒杆菌中使用的克隆载体的实用性，例如在Sinskey et al.，美国专利编号No.4,649,119中公开的，并且考虑到谷氨酸棒杆菌和亲缘短杆菌菌种(例如乳发酵短杆菌)的遗传操作技术(Yashihama et al，J.Bacteriol.162：591-597(1985)；Katsumata et al.，J.Bacteriol.159：306-311(1984)；以及Santamaria et al.，J.Gen.Microbiol.130：2237-2246(1984))，本发明的核酸分子可用于该生物体的遗传工程，使之成为一种或者多种精细化学物质更好的或者更有效的生产者。
可以修饰本发明的PTS分子，从而使得一种或者多种精细化学物质的产量、生产和/或生产效率得到提高。例如，通过修饰一种参与葡萄糖摄取的PTS蛋白，可以优化其活性，使得葡萄糖摄取数量或者葡萄糖被转运进细胞的速率得到提高。细胞内葡萄糖或者其他糖类降解可以提供能量，这些能量可用于推动能量不利的生化反应，例如那些涉及精细化学物质生物合成的反应。降解也提供了某些精细化学物质生物合成所必需的中间体或者前体分子，例如氨基酸、维生素和辅因子。通过修饰本发明PTS分子以增加细胞内高能碳分子的数量，既可以增加完成生产一种或者多种精细化学物质所必需的代谢途径的能量供给，又可以增加这种生产所需要的细胞内代谢物质库。
另外，本发明PTS分子可以参与一条或者多条细胞内信号传导途径，这些信号传导途径可以影响谷氨酸棒杆菌中一种或者多种精细化学物质的产量和/或生产速率。例如，一旦细胞内存在足够数量的糖类，从细胞外介质中输入一种或者多种糖类所必需的蛋白质(例如，HPr，Enzyme I，或者Enzyme II复合体中的一种成分)经常被翻译后修饰，从而使它们不能再把糖输入到细胞内。当转运系统关闭时糖的数量，对于维持细胞正常功能来说可能是足够的，这可能限制了所需化学物质的过量生产。因此，修饰本发明PTS蛋白而使其对这种负调节不再有反应是很值得做的，所以，允许细胞内一种或者多种糖达到更高的浓度，并且通过反应延伸，从含有这种PTS蛋白突变体的生物体中，便可以更加有效的生产或者更大产量的获得一种或者多种精细化学物质。
本发明提供了新的编码蛋白质的核酸分子，这种蛋白质在此处称作磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统(PTS)蛋白质，它们参与把高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)输入谷氨酸棒杆菌，和/或参与一条或者多条谷氨酸棒杆菌细胞内信号传导途径。这些蛋白质的实例，包括那些在表1中列出的基因所编码的蛋白质。
因此，本发明的一个方面涉及，分离含有一段编码一种PTS蛋白或者其生物活性部分的核酸序列的核酸分子(例如，cDNA，DNA，或者RNA)，以及分离适合作为探测或扩增PTS编码核酸(例如DNA或者RNA)的引物或者杂交探针的核酸片段。在特别优选的实施方案中，分离的核酸分子包含一段列在序列表中的序列号为奇数的核酸序列(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7)或者一条这种核苷酸序列的编码区域或者其互补序列。在其他特别优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子包含与序列表中的序列号为奇数的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7)或者其部分有至少大约50％同源性，优选的有至少大约60％的同源性，更优选的有至少大约70％，80％，或90％的同源性，甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。在其他优选的实施方案中，已分离的核酸分子编码列在序列表中的偶数序列号氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：8)。本发明优选的PTS蛋白也优选具有至少一种此处描述的PTS活性。
在另一个实施方案中，已分离的核酸分子编码一种蛋白质或者其部分，其中的蛋白质或者其部分包含一段氨基酸序列，该序列与本发明的氨基酸序列(例如，在序列表中偶数序列号的序列)有充分的同源性，例如，与本发明的氨基酸序列有充分的同源性而使得该蛋白质或者其部分具有PTS活性。优选，核酸分子编码的蛋白质或者其部分，具有参与把高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)输入谷氨酸棒杆菌的能力，和/或参与一条或者多条谷氨酸棒杆菌细胞内信号传导途径的能力。在一个实施方案中，核酸分子编码一种蛋白质与本发明的氨基酸序列(例如，从序列表中的偶数序列号序列中选出的完整氨基酸序列)有至少大约50％同源性，优选的有至少大约60％的同源性，更优选的有至少大约70％，80％，90％的同源性，最优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。在另一个优选的实施方案中，蛋白质是全长的谷氨酸棒杆菌蛋白质，该蛋白质与本发明的全长氨基酸序列(由显示在相应序列表中的奇数序列号核酸序列(例如，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7)开放阅读框架编码的)充分同源。
在另一个优选的实施方案中，分离的核酸分子来自谷氨酸棒杆菌，并编码一种蛋白质(例如一种PTS融合蛋白)，该蛋白质包含一段生物活性区域，该区域与本发明的一种氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号序列中的一个序列)有至少大约50％或者更高的同源性，并且该蛋白质能够参与把高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)输入谷氨酸棒杆菌，和/或参与一条或者多条谷氨酸棒杆菌细胞内信号传导途径，或者拥有一种或者多种列在表1中的活性，并且该蛋白质还包含有一段编码异源多肽或者调节区域的异源核酸序列。
在另一个实施方案中，分离的核酸分子至少有15个核苷酸的长度，并且在严格条件下与含有本发明核苷酸序列(例如，在序列表中奇数序列号序列)的核酸分子杂交。优选，分离的核酸分子与天然存在的核酸分子一致。更加优选，分离的核酸分子编码天然存在的谷氨酸棒杆菌PTS蛋白，或者其生物活性部分。
本发明的另一个方面涉及载体的，例如含有本发明核酸分子的重组表达载体，和被引入这种载体的宿主细胞的。在一个实施方案中，通过在合适的培养基中进行培养，这种宿主细胞被用于生产PTS蛋白。然后可以从培养基或者宿主细胞中分离该PTS蛋白。
另外，本发明的另一个方面涉及一种经过遗传改变的微生物，PTS基因已经被引入其中或者已经被改变。在一个实施方案中，通过引入作为转基因的编码野生型或者突变型PTS序列的本发明核酸分子，改变了该微生物的基因组。在另一个实施方案中，改变了该微生物基因组中的内源PTS基因，例如，通过使用已改变的PTS基因进行同源重组而进行功能性破坏。在另一个实施方案中，该微生物中内源的或者引入的PTS基因通过一个或者多个点突变、缺失或者倒位而被改变，但是仍然能编码功能PTS蛋白。在另一个实施方案中，改变微生物PTS基因的一个或者多个调节区域(例如，启动子、阻抑物或者诱导物)，从而调节PTS基因的表达。在优选的实施方案中，微生物属于棒杆菌种或者短杆菌种，特别优选是谷氨酸棒杆菌。在优选的实施方案中，也使用微生物生产所需的化合物，例如氨基酸，特别优选是赖氨酸。
另一方面，本发明提供了一种鉴定受试者中白喉棒杆菌存在或者活性的方法。该方法包括对受试者中本发明的一种或者多种核酸或者氨基酸序列(例如，列在序列表中SEQ ID NO 1至34的序列)的检测，从而可以检测受试者中谷氨酸棒杆菌的存在或者活性。
另外，本发明的另一个方面涉及已分离出PTS蛋白或者其部分，例如其生物活性部分。在一个优选的实施方案中，分离的PTS蛋白或者其部分可以参与把高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)输入谷氨酸棒杆菌，并且也可以参与一条或者多条谷氨酸棒杆菌细胞内信号传导途径。在另一个优选的实施方案中，已分离的PTS蛋白或者其部分与本发明的一种氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号：序列中的一个序列)有足够高的同源性，使得该蛋白质或者其部分可参与把高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)输入谷氨酸棒杆菌的能力，和/或也参与一条或者多条谷氨酸棒杆菌细胞内信号传导途径的能力。
本发明也提供了PTS蛋白的分离制品。在优选的实施方案中，PTS蛋白包含本发明的氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号：序列中的一个序列)。在另一个优选的实施方案中，本发明与分离的全长蛋白质有关，该蛋白质与本发明的完全氨基酸序列(序列表偶数序列号：序列中的一个序列)(由显示在相应序列表中的序列号为奇数的开放阅读框架编码)有相当高的同源性。此外，在另一个实施方案中，蛋白质与本发明的完全氨基酸序列(例如，序列表中偶数序列号序列)有至少大约50％同源性，优选的有至少大约60％的同源性，更优选的有至少大约70％，80％，或90％的同源性，最优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，或99％或者更高的同源性。在另一个实施方案中，分离的PTS蛋白包含的氨基酸序列与本发明的一条氨基酸序列(例如，序列表中的一条偶数序列号序列)有至少大约50％或者更高的同源性，并且能够参与把高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)输入谷氨酸棒杆菌，和/和参与一条或者多条谷氨酸棒杆菌细胞内信号传导途径，或者具有表1中列出的一种或者多种活性。
另外，分离的PTS蛋白可以含有由核酸序列编码的氨基酸序列，该核酸序列与列在序列表中的偶数序列号的一个核酸序列杂交，例如在严格条件下杂交，或者与该核酸序列有至少大约50％的同源性，优选的有至少大约60％的同源性，更优选的有至少大约70％，80％，或90％的同源性，甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，或99％或者更高的同源性。PTS蛋白的优选形式同样具有一种或者多种此处描述的生物活性，也是优选的。
PTS多肽或者其生物活性部分，可以有效的连接到非PTS多肽上而形成融合蛋白质。在优选的实施方案中，该融合蛋白质具有不同于单独PTS蛋白本身的活性。在另外优选的实施方案中，该融合蛋白质引起所需谷氨酸棒杆菌精细化学物质产量、生产和/或生产效率的增加。在特别优选的实施方案中，把该融合蛋白整合进宿主细胞，可以调节细胞中所需化合物的生产。
另一方面，本发明提供了筛选可调节PTS蛋白活性的分子的方法。该分子通过与蛋白质分子本身或者底物相互作用，或者与PTS蛋白的配偶体结合，或者通过调节本发明PTS核酸分子的转录或者翻译来调节PTS蛋白活性。
本发明的另一个方面涉及生产精细化学物质的方法。该方法涉及培养含有一种载体的细胞，该载体指导本发明PTS核酸分子的表达，从而产生精细化学物质。在一个优选的实施方案中，该方法还包含获得含有该载体细胞的步骤，在该步骤中，使用可以指导PTS核酸分子表达的载体转染细胞。在另一个优选的实施方案中，该方法还包含从培养基中回收精细化学物质的步骤。在一个特别优选的实施方案中，细胞是棒杆菌种或者短杆菌种，或者选自列在表3中的那些菌株。
本发明的另一方面涉及调节微生物中分子产生的方法。这种方法包括使用调节PTS蛋白活性或者PTS核酸表达的药剂接触细胞，使得细胞的相关活性相对于缺少这种药剂时的活性发生了改变。在一个优选的实施方案中，为了摄取一种或者多种糖类，调节细胞，使得这种微生物所需精细化学物质的产量或者产生效率得到提高。调节PTS蛋白活性的药剂，可以是刺激PTS蛋白活性或者PTS核酸表达的药剂。刺激PTS蛋白活性或者PTS核酸表达的药剂的实例，包括小分子、活性PTS蛋白、以及编码已导入细胞的PTS蛋白的核酸。抑制PTS蛋白活性或者表达的药剂的实例包括小分子和反义PTS核酸分子。
本发明的另一个方面，涉及调节细胞中所需化合物产量的方法，包括把野生型或者突变型PTS基因导入细胞，该基因或者保留在单独的质粒上，或者整合到宿主细胞基因组中。如果整合到宿主细胞基因组中，这种整合可以是任意的，或者是通过同源重组发生的，从而使得引入的拷贝取代天然基因，导致细胞中所需化合物的产生得到调节。在一个优选的实施方案中，该产量得到增加。在另一个优选的实施方案中，所说的精细化学物质是氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，所说的氨基酸是L-赖氨酸。
发明详述
本发明提供了PTS核酸和蛋白质分子，它们参与谷氨酸棒杆菌摄取高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)，并且也可以参与该微生物中一条或者多条细胞内信号传导途径。本发明的分子可用于调节微生物中精细化学物质的生产。这种调节，可能是由于细胞内所需产生的高能分子水平的增加，例如，ATP，GTP和其他用于推动像是精细化学物质生物合成这样的能量不利生化反应的分子。精细化学物质生产的调节也可能是由于这种事实，即很多糖类的降解产物被用作其他生物合成途径的中间体或者前体，包括某些精细化学物质的生物合成途径。另外，已知PTS蛋白参与某些细胞内信号传导途径，它们可能对一条或者多条精细化学物质的代谢途径具有调节活性；通过利用这些PTS蛋白，可以激活精细化学物质的生物合成途径或者抑制其化学降解途径。本发明的各个方面进一步详细说明如下。
I.精细化学物质
“精细化学物质”这个词是本领域熟知的，包括生物体产生的在各种产业中使用的分子，例如但不仅仅局限于，制药、农业和化妆品产业。这种化合物包括有机酸，例如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸，蛋白质源和非蛋白质源氨基酸，嘌呤碱基和嘧啶碱基，核苷，以及核苷酸(例如像是描述在Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and related compounds，p.561-612，in Biotechnology vol.6，Rehm et al.，eds.VCH：Weinheim及其所含参考文献中的)，脂质，饱和和不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)，二醇(例如，丙烷二醇和丁烷二醇)，芳香族化合物(例如，芳香胺、香草醛和靛)，维生素和辅因子(参见Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry，vol.A27，“Vitamins”，p.443-613(1996)VCH：Weinheim andreferences therein；and Ong，A.S.，Niki，E.& Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific andTechnological Associations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，held Sept.1-3，1994 at Penang，Malaysia，AOCS Press，(1995))，酶，聚酮化合物(ployketides)(Cane et al.，(1998)Science 282：63-68)，以及所有在Gutcho(1983)Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN：0818805086及其参考文献中描述的化学物质。某些这些精细化学物质的代谢和用途进一步详细说明如下。
A.氨基酸的代谢和用途
氨基酸包括所有蛋白质的基本结构单元，同样也是所有生物体正常细胞生物功能所必需的。“氨基酸”这个词是本领域熟知的。蛋白质源的氨基酸有20种，是蛋白质的结构单元，相互之间由肽键相连接，而非蛋白质源氨基酸(已知的有几百种)通常情况下不会出现在蛋白质中(参见Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol.A2，p.57-97VCH：Weinheim(1985))。虽然L-氨基酸通常是天然存在蛋白质中的唯一类型，但是氨基酸可以是D-或者L-光学构型。20种蛋白质源氨基酸中每一种的生物合成或者降解途径，都在原核细胞或者真核细胞中有各自的特点(例如参见Stryer，L.Biochemistry，3rd edition，pages 578-590(1988))。“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)之所以这样命名，是因为这些氨基酸生物合成复杂通常是必需的营养条件，它们可以通过简单的生物合成途径转化为其余的11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸)。虽然高等生物确实具有合成一些这种氨基酸的能力，但是为了正常的蛋白质合成必须从饮食中补充必需氨基酸。
它们除了在蛋白质合成中的功能，这些氨基酸就其自身来说是有趣的化学物质，并且它们中的很多在食品、饲料、化学、化妆品、农业和制药产业中具有各种应用。赖氨酸在营养方面不仅对于人类是一种重要的氨基酸，而且对于像是家禽和猪这样单胃动物也是重要的。谷氨酸是最常用的风味添加剂(谷氨酸单钠，MSG)，并且广泛应用于整个食品产业，如同天冬氨酸、甘氨酸、半胱氨酸一样。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸全部用于制药产业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸都应用在制药产业和化妆品产业中。苏氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常用的饲料添加剂(Leuchtenberger，W.(1996)Amino aids-technical production and use，p.466-502 in Rehm et al.(eds.)Biocemistry vol.6，chapter 14a，VCH：Weinheim)。另外，这些氨基酸作为合成氨基酸和蛋白质合成的前体也是很有用的，例如N-乙酰半胱氨酸，S-羧甲基-L-半胱氨酸，(S)-5-羟色氨酸，以及其他在Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol.A2，p.57-97 VCH：Weinheim，1985中描述的分子。
在能够产生天然氨基酸的生物体中，例如细菌，这些天然氨基酸的生物合成已经了解得很充分(细菌氨基酸的生物合成及其调节，参见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47：533-606)。天冬氨酸由α-酮戊二酸还原型氨化合成，后者是柠檬酸循环的中间体。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸都是由谷氨酸依次产生的。丝氨酸的生物合成是一个三步的过程，开始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间体)，经过氧化作用、转氨作用、水解作用各步骤之后，终止于该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸都由丝氨酸产生；前者由高半胱氨酸与丝氨酸缩合而成，后者是把侧链β-碳原子转移到四氢叶酸得到的，该反应是由丝氨酸羟甲基转移酶催化的。苯丙氨酸和酪氨酸，由4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸在一条9步的生物合成途径中合成，它们是糖酵解途径和戊糖磷酸途径的前体，这两条途径只是在合成预苯酸之后不同。色氨酸也可以由这两种初始分子产生，但是其合成是一个11步的途径。酪氨酸也可以由苯丙氨酸合成，其反应是由苯丙氨酸羟化酶催化的。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸都是糖酵解终产物丙酮酸的生物合成产物。天冬氨酸由草酰乙酸合成，后者是柠檬酸循环的中间体。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸都由天冬氨酸转化而成。异亮氨酸由苏氨酸形成。通过一条复杂的9步的途径，可以从一种活性糖，5-磷酸核糖-1-焦磷酸，产生组氨酸。
超出细胞蛋白质合成所需的氨基酸是不能储存的，而是被降解后为细胞主要代谢途径提供中间体(评论参见Stryer，L.Biochemistry 3rd ed.Ch.21“Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”p.495-516(1988))。尽管细胞能转化多余的氨基酸为有用的代谢中间体，但是产生氨基酸要消耗很多的能量、前体分子和合成所需的酶。因此用反馈抑制来调节氨基酸的生物合成是不令人吃惊的，特殊氨基酸的存在可以减慢或者完全停止其自身的产生(对于氨基酸生物合成途径反馈机制的评论，参见Stryer，L.Biochemistry 3rd ed.Ch.24“Biosynthesis of AminoAcid and Heme”p.575-600(1988))。因此，任何特定氨基酸的产量都被细胞内存在的氨基酸数量所限制。
B.维生素、辅因子和营养制品的代谢和用途
维生素、辅因子和营养制品包括另一组分子，虽然其他生物，例如细菌，可以合成这些分子，但是高等动物失去了合成它们的能力而只能摄取。这些分子或者其本身是生物活性物质，或者是生物活性物质的前体，该生物活性物质可以是电子载体或者各种代谢途径的中间体。除了其营养价值，这些化合物作为色素、抗氧化剂和催化剂或者其他加工助剂也有重大的工业价值。(对于这些化合物结构、活性和工业应用的评述，参见例如，Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613 VCH：Weinheim 1996.)“维生素”这个词是本领域熟知的，包含了生物体正常功能所需但是又不能自身合成的营养素。维生素可以包括辅因子和营养制品化合物。术语“辅因子”包含了进行正常酶活性所需的非蛋白质化合物。这些化合物可以是无机的或者有机的；本发明的辅因子分子优选是有机的。“营养制品”这个词包含了对植物和动物，特别是人体有益的饮食增补剂。这些分子的实例是维生素、抗氧化剂和某些脂质(例如多饱和脂肪酸)。
在能够产生这些分子的生物体，例如细菌中这些分子的生物合成，大部分已经被鉴定(Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”vol.A27，p.443-613，VCH：Weinheim，1996；Michal，G.(1999)BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley & Sons；Ong，A.S.，Niki，E.& Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and TechnologicalAssociations in Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia，heldSept.1-3，1994 at Penang，Malaysia，AOCS Press：Champaign，IL X，374 S)
硫胺素(维生素B1)是由嘧啶和噻唑经化学连接产生的。核黄素(维生素B2)由5’-三磷酸鸟嘌呤核苷和5’-磷酸核糖合成。核黄素依次用于合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合称为“维生素B6”的一组化合物(例如，吡哆醇、吡哆胺，5’-磷酸吡哆醛，以及商品化的盐酸吡哆醛)都是共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸，(R)-(+)-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可由化学合成或者发酵得到。泛酸盐生物合成的最后一步包括ATP驱动的β-丙氨酸和泛解酸的缩合。负责转化成泛解酸和β-丙氨酸酶，以及缩合成泛酸盐的酶都是已知的。泛酸盐的代谢活性形式是辅酶A，其生物合成过程是5个酶促步骤。泛酸盐、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP是辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸盐的形成，也催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton，(R)-泛醇(维生素原B5)泛酰巯基乙胺(及其衍生物)的产生。
在微生物中由前体分子庚二酰辅酶A到生物素的生物合成研究得很详细，并且所涉及的几个基因已被鉴定。很多相应的蛋白质也被发现参与了铁簇(Fe-cluster)的合成，并且是nifS家族蛋白质成员。硫辛酸来自辛酸，在能量代谢中用作辅酶，可以成为丙酮酸脱氢酶复合物和α-酮戊二酸脱氢酶复合物的一部分。叶酸盐是一组叶酸的衍生物，依次来自L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。起始于代谢中间体5’-三磷酸鸟嘌呤(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸的叶酸及其衍生物的生物合成，在某些微生物中有详细的研究。
类咕啉(例如钴胺素，以及特别是维生素B12)和卟啉都属于以四吡咯环体系为特征的化学物质。维生素B12的生物合成是这样的复杂，以至于还没有彻底了解其特征，但是许多涉及的酶和底物现在已知。烟酸(烟酸盐)和烟碱是吡啶底衍生物，也被称作“尼亚新”。尼亚新是重要辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其还原形式的前体。
尽管有些这样的化合物也可以用大规模微生物培养生产，例如核黄素、维生素B6、泛酸和生物素，但是大规模生产这些化合物很大程度还依赖于非细胞化学体系。只有维生素B12，由于其合成的复杂性，只能用发酵生产。体外方法需要相当多的物质和时间投入，经常花费很大。
C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代谢和用途
嘌呤和嘧啶代谢基因及其相应的蛋白质，是肿瘤疾病治疗和病毒感染治疗重要的目标物。术语“嘌呤”和“嘧啶”，包含了作为核酸、辅酶和核苷酸组成的含氮碱基。术语“核苷酸”包含核酸分子基本结构单元，核酸分子由含氮碱基、戊糖(对于RNA，该戊糖是核糖；对于DNA，该戊糖是脱氧核糖)和磷酸组成。术语“核苷”包含了作为核苷酸前体的分子，但是缺少核苷酸所具有的磷酸部分。通过抑制这些分子的生物合成，或者抑制为合成核酸分子而进行的移动，可能会抑制RNA和DNA的合成；通过定向肿瘤细胞的方式来抑制该活性，肿瘤细胞分裂和复制的能量可能会得到抑制。另外，有的核苷酸不用于形成核酸，而是用作能量储存(例如AMP)或者辅酶(例如FAD和NAD)。
有些出版物描述了通过影响嘌呤和/或嘧啶的代谢，这些化学物质作为这些医学指征的使用(例如，Christopherson，R.I.and Lyons，S.D.(1990)“Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents.”Med.Res.Reviews 10：505-548)。涉及嘌呤和嘧啶代谢酶类的研究，集中在可以使用的新药开发上面，例如，作为免疫抑制剂或者抗增生剂(Smith，J.L.，(1995)“Enzyme in nucleotidesynthesis.”Curr.Opin.Struct.Biol.5：752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23：877-902)。然而，嘌呤和嘧啶碱基，核苷和核苷酸还具有另外的作用：作为许多精细化学物质生物合成的中间体(例如，硫胺素、S-腺苷甲硫氨酸、叶酸、或者核黄素)，作为细胞能量载体(例如ATP或者GTP)，而作为化学物质本身，通常用作风味增强剂(例如IMP或者GMP)或者几种医学应用(参见，例如，Kuninaka，A.(1996)Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology vol.6，Rehm et al.，eds.VCH：Weinheim，p.561-612)。同样，涉及嘌呤、嘧啶、核苷或者核苷酸代谢的酶，日渐成为开发出的用作保护农作物的化学物质的作用目标，这些化学物质包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。
细菌中这些化合物的代谢具有特征(评论参见，例如Zalkin，H.andDixon，J.E.(1992)“de novo purine nucleotide biosynthesis”，in：Progress in NucleicAcid Research and Molecular Biology，vol.42，Academic Press：，p.259-287；andMichal，G.(1999)“Nucleotides and Nucleosides”，Chapter 8 in：BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，Wiley：New York)。嘌呤代谢一直是重点研究课题，而且它是细胞正常功能所必需的。高等动物中受损的嘌呤代谢能够造成严重的疾病，例如痛风。嘌呤核苷酸由5’-磷酸核糖合成，通过一系列步骤，经过中间体5’-磷酸次黄嘌呤核苷(IMP)，最终产生5’-单磷酸鸟嘌呤(GMP)和5’-单磷酸腺嘌呤(AMP)，并由它们形成用作核苷酸的三磷酸形式。这些化合物也用作能量储存，其降解为细胞中各种不同的生化过程提供能量。嘧啶的生物合成，是通过由5’-磷酸核糖形成5’-磷酸尿嘧啶核苷(UMP)。UMP接下来转变成5’-三磷酸胞嘧啶(CTP)。所有这些核苷酸的脱氧形式都是经过一步还原反应产生的，由核苷酸的二磷酸核糖形式到核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。一经磷酸化，这些分子就可以参与DNA的合成了。
D.海藻糖的代谢和用途
海藻糖包括两个葡萄糖分子，通过α，α-1，1连接。通常在食品产业中用作增甜剂、干燥食品或者冷冻食品添加剂，以及饮料当中。而且，它也应用在制药、化妆品和生物技术产业(参见，例如Nishimoto et al.，(1998)U.S.Patent No.5,759,610；Singer，M.A.and Lindquist，S.(1998)Trends Biotech.16：460-467；Paiva，C.L.A.and Panek，A.D.(1996)Biotech.Ann.Rev.2：293-314；and Shiosaka，M.(1997)J.Japan 172：97-102)。很多微生物中的酶可以产生海藻糖，并将其天然释放到周围培养基中，可以使用技术上熟知的方法从中进行收集。
II.磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统
细胞在培养基中的快速生长和分裂，在很大程度上依赖于细胞摄取和利用高能分子的程度，例如葡萄糖或者其他糖类。存在有不同的运输蛋白，它们把不同的糖类运输到细胞中。存在有糖类转运蛋白质，例如转运葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖，或者棉子糖，也有淀粉和纤维素降解产物的转运蛋白质。其他转运系统负责输入酒精(例如甲醇或者乙醇)、烷烃、脂肪酸，以及像乙酸或乳酸这样的有机酸。在细菌中，通过各种机制，糖类可以经过细胞膜被转运进细胞。除了和质子的共转运以外，最常使用的糖类摄取过程之一是磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统(PTS)。该系统不仅催化糖类和己糖醇的转运(伴随磷酸化)，而且还调节适应于糖类有效性的细胞代谢。该PTS系统只存在于细菌中，而不出现在古细菌和真核细胞中。
功能方面，PTS系统包含两种细胞质蛋白，酶I和HPr，以及不定数目的糖类特异的整合和外周膜蛋白转运复合体(每种都被称为带有糖类特异下标的“酶II”，例如“酶IIGlu”表示结合葡萄糖的酶II复合体)。已知对单糖、二糖或三糖特异的酶II，像是对葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或者棉子糖。酶I把磷酸基团从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转移至磷酸载体蛋白HPr。然后HPr再把磷酸基团转移至不同的酶II转运复合体。虽然酶I和HPr的氨基酸序列在所有的细菌中是非常相似的，PTS转移体还是可以分为结构不相关的几个家族。另外，这些基因的数目和同源性在不同的细菌中也各不相同。大肠杆菌基因组编码38个不同的PTS蛋白，其中33个是分属于22个不同转移体的亚基。生殖器支原体(M.genitalium)基因组含有酶I和HPr基因各一个，而只有两个PTS转移体基因。T.palladium和沙眼衣原体(C.trachomatis)含有酶I和HPr相似蛋白基因，但是没有PTS转移体基因。
所有PTS转移体包含3个功能单元，IIA，IIB和IIC，它们或者是复合体中的蛋白质亚基(例如，IIAGlcIICBGlc)或者是单多肽链的结构区域(例如，IICBAGlcNAc)。IIA和IIB依次把磷酸基团从HPr传递到被转运的糖类。IIC含有糖类结合位点，并且跨越内膜6或8次。糖类转移与IIB区域的瞬时磷酸化是偶合的。酶I，HPr和IIA在其组氨酸残基发生磷酸化，而IIB亚基是在组氨酸残基或半胱氨酸残基发生磷酸化，这依赖于所涉及的特定转运体。输入后糖类的磷酸化，有这样的优点，即可以阻止糖类扩散过细胞膜而回到培养基中，因为带电荷的磷酸基团不能穿过细胞膜的疏水核心。
有些PTS蛋白除了活跃的糖类转运功能之外，还在细胞内信号传导中发挥重要作用。这些亚基通过变构或者磷酸化来调节它们的目的物。它们的调节活性随着磷酸化程度(例如，非磷酸化形式与磷酸化形式的比率)而变化，而后者又随着糖依赖去磷酸化和磷酸烯醇丙酮酸依赖再磷酸化的比率而变化。大肠杆菌中这种PTS蛋白的细胞内调节的实例包括，通过IIAGlc去磷酸化抑制甘油激酶，而通过其磷酸化形式激活腺苷酸环化酶。而且，这些微生物中有些转运体的HPr和IIB区域，通过转录抗终止子的可逆磷酸化调节基因表达。在革兰氏阳性细菌中，HPr的活性受HPr特异的丝氨酸激酶和磷酸酶调节。例如，丝氨酸-46磷酸化的HPr，其功能是作为转录抑制子CcpA的辅抑制子。最后，发现未磷酸化的酶I抑制细菌趋化器中的传感蛋白激酶CheA，该激酶在细菌糖类结合转运系统和控制细菌运动的系统之间提供了直接联系(Sonenshein，A.L.，et al.，eds.Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria.ASM：Washington，D.C.；Neidhardt，F.C.，et al.，eds.(1996)Escherichia coli andSalmonella.ASM Press：Washington，D.C.；Lengeler et al.，(1999).Biology ofProkaryotes.Section II，pp.68-87，Thieme Verlag：Stuttgart)
III.本发明的元件和方法
本发明至少部分是建立在发现新分子的基础上的，此处将其称作PTS核酸和蛋白质分子，它们参与谷氨酸棒杆菌对高能碳分子(例如，葡萄糖、果糖、蔗糖)的摄取，并且也可以参与这些微生物中一条或者多条细胞内信号传导途径。在一个实施方案中，PTS分子行使把高能碳分子转入细胞的功能，在细胞中这些分子降解所提供的能量可以为能量不利的生化反应供能，而且，它们的降解产物可以用作很多其他代谢途径的中间体或者前体。在另一个实施方案中，PTS分子可以参与一条或者多条细胞内信号传导途径，其中PTS分子修饰形式(例如，磷酸化PTS分子)的存在，可以参与信号传导级联反应，该级联反应调节一条或多条细胞过程。在一个优选的实施方案中，本发明PTS分子的活性，对于用该微生物生产所需精细化学物质有影响。在一个特别优选的实施方案中，本发明PTS分子的活性被调节，使得谷氨酸棒杆菌中一种或者多种精细化学物质的产量、生产和生产效率也得到了调节。
术语“PTS蛋白”或者“PTS多肽”包含了那些参与从细胞外培养基中向细胞内部摄取一种或者多种高能化合物(例如，单糖、二糖或者寡糖，像是果糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、棉子糖、半乳糖、核糖、乳糖、麦芽糖和山梨糖)的蛋白质。这些PTS蛋白也可以参与一条或者多条细胞内信号传导途径，例如但是不仅仅局限于，那些控制不同糖类摄取进细胞的途径。PTS蛋白的实例包括那些由列在序列表中序列号为奇数的PTS基因编码的蛋白质。关于PTS系统的综合参考文献，参见：Stryer，L.(1998)Biochemistry，Chapter 37：“Membrane Transport”，W.H.Freeman：New York，p.959-961；Darnell，J.et al.(1990)Molecular CellBiology Scientific American Books：New York，p.552-553，and Michal，G.，ed.(1999)Biochemical Pathway：An Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，Chapter 15“Special Bacterial Metabolism”。术语“PTS基因”或者“PTS核酸序列”包含了编码PTS蛋白的核酸序列，后者包含编码区域以及相应的非翻译的5’和3’序列区域。PTS基因的实例包括那些列在表1中的基因。术语“生产”或者“生产力”是本领域熟知的，包含了在给定时间和给定发酵体积内，发酵产物(例如，所需精细化学物质)的浓度(例如，每小时每升千克产物)。术语“生产效率”包含了，要达到特定的生产水平所需的时间(例如，需要多长时间才能使细胞达到特定的精细化学物质)。术语“收益”“产物/碳收益”是本领域熟知的，包含了把碳源转化成产物(例如精细化学物质)的效率。例如，经常写作千克产物每千克碳源。通过提高化合物的收益或者生产，可增加回收分子的数量，或者增加在给定时间内给定数量的培养物中该化合物有用回收分子的数量。术语“生物合成”或者“生物合成途径”是本领域熟知的，包含了在细胞中，从中间化合物经过可能是多步并且是高度调控的过程，合成化合物，特别是有机化合物。术语“降解”或者一条“降解途径”是本领域熟知的，包含了在细胞中，经过可能是多步并且是高度调控的过程，把化合物，优选是有机化合物，分解为降解产物(一般而言，是更小或者复杂性更小的分子)。术语“代谢”是本领域熟知的，包含了生物体中所发生的生化反应的全部。因而，特殊化合物的代谢(例如，像是甘氨酸这样的氨基酸代谢)包括细胞中与该化合物相关的全部生物合成、修饰和降解途径。术语“转运”和“输入”是本领域熟知的，包含了一种或者多种化合物穿过细胞膜的易化移动，而这些化合物通过别的方式不能穿过细胞膜。
在另一个实施方案中，本发明的PTS分子能够调节微生物中，例如谷氨酸棒杆菌中，所需化合物例如精细化学物质的产生。使用重组遗传技术可以操作本发明的一种或者多种PTS分子，从而调节其活性。例如，参与PTS介导的葡萄糖输入的一种蛋白质可以被调节，而使其活性优化，并使得葡萄糖输入的PTS系统，可以转运更多数量的葡萄糖到细胞中。因为葡萄糖分子不仅可以用作能量以推动能量不利生化反应，例如精细化学物质生物合成，而且可以作为许多生物精细化学物质生物合成途径(例如，从3-磷酸甘油酸合成丝氨酸)的前体和中间体。在每一个实例中，或者通过增加生产发生所需的能量提供，或者通过增加生产发生所需的化合物供给，可以增加这些所需精细化学物质的总产量或者生产效率。
另外，很多已知PTS蛋白在细胞内信号传导途径中起关键作用，这些途径调节维持碳源供给的细胞代谢和糖类摄取。例如，已知细胞内1，6-二磷酸果糖(糖酵解中产生的化合物)水平的增加，可以导致HPr丝氨酸残基的磷酸化，从而阻止该蛋白质在任何PTS糖类转运过程中作为磷酸基团供体。通过诱变HPr使得其丝氨酸残基不能被磷酸化，可以组成性的激活HPr，从而增加转运到细胞中的糖类，然后可以确保细胞内用于一种或者多种所需精细化学物质生物合成所需的更多的能量储存和中间体/前体分子。
分离的本发明核酸序列，包含在谷氨酸棒杆菌菌株的基因组中，该菌株可由美国典型培养物保藏中心获得，保藏号ATCC 13032。分离的谷氨酸棒杆菌PTS DNA核酸序列，以及预测的谷氨酸棒杆菌PTS蛋白氨基酸序列，在序列表中分别以奇数序列号和偶数序列号列出。
进行了计算机分析，并将这些核酸序列分类和/或鉴定为编码代谢途径蛋白质的序列。
本发明也与这样的蛋白质有关，该蛋白质的氨基酸序列与本发明的氨基酸序列有充分的同源性(例如，序列表中偶数序列号的序列)。如此处所用的那样，具有与挑选出的氨基酸序列有充分同源性的氨基酸序列的蛋白质，与挑选出的氨基酸序列，例如挑选出的氨基酸全序列，有至少大约50％同源性。具有与挑选出的氨基酸序列有很大同源性的氨基酸序列的蛋白质，也可以与挑选出的氨基酸序列有至少大约50-60％，优选的有至少大约60％的同源性，更优选的有至少大约70％，80％，90％的同源性，最优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。
本发明的PTS蛋白或者其生物活性部分或其片段，能够参与转运像是葡萄糖这样的高能含碳分子进入谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的细胞内信号传导，或者具有表1中列出的一种或者多种活性。
以下各部分更加详细地描述了本发明的各个方面：
A.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及分离的编码PTS多肽或者其生物活性部分的核酸分子，以及足够用作杂交探针或者引物的核酸分子片段，这些片段用于鉴定或者扩增编码PTS的核酸(例如PTS DNA)。如此处所用的那样，术语“核酸分子”的意思是包含DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)，以及由核苷酸类似物产生的DNA或者RNA类似物。该术语也包括位于基因编码区域3’和5’末端的非翻译序列：编码区域5’末端上游序列的至少100个核苷酸，和基因编码区域3’末端下游序列的至少20个核苷酸。核酸分子可以是单链的或者双链的，但是优选是双链DNA。“分离的”核酸分子，是指那些与存在于核酸天然来源中的其他核酸分子相互分离的核酸分子。优选，“分离的”核酸不含有天然位于生物体基因组DNA中核酸两侧的序列(例如，位于核酸5’和3’末端的序列)，核酸就是从该生物体中获得的。例如，在各种实施方案中，分离的PTS核酸分子可以含有少于大约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或者0.1kb的核苷酸序列，该序列天然位于细胞基因组DNA核酸分子的两侧，核酸就是从这些细胞(例如，谷氨酸棒杆菌细胞)中获得的。另外，“分离的”核酸分子，例如DNA分子，当用重组技术生产时可以基本上不含有其他细胞物质或者培养基，当化学合成时可以不含化学前体或者其他化学物质。
本发明核酸分子，例如序列表中奇数序列号的核苷酸序列，或者其部分，可以通过标准分子生物学技术和此处提供的序列信息分离得到。例如，谷氨酸棒杆菌PTS DNA可以从谷氨酸棒杆菌文库中，使用序列表中奇数序列号序列中一个序列的全部或者其部分作为杂交探针，以及标准杂交技术(例如，像是描述在Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的)分离得到。另外，包含一条本发明核酸序列(例如，序列表中奇数序列号的核苷酸序列)全部或者一部分的核酸分子，可以通过聚合酶链式反应，使用基于该序列设计的寡聚核苷酸引物，分离得到(例如，包含一条本发明核酸序列(例如，序列表中奇数序列号的核苷酸序列)全部或者一部分的核酸分子，可以通过聚合酶链式反应，使用基于该相同序列设计的寡聚核苷酸引物，分离得到)。例如，mRNA可以从正常内皮细胞分离得到(例如，使用Chirgwin et al.(1979)Biochemistry 18：5294-5299中的硫氰酸胍提取方法)，DNA可以通过逆转录酶(例如，Gibco/BRL，Bethesda，MD提供的Moloney MLV逆转录酶；或者Seikagaku America，Inc.，St.Peterburg，FL提供的AMV逆转录酶)制备。为聚合酶链式反应合成的寡聚核苷酸引物，可以基于序列表中列出的一条核苷酸序列设计。本发明的核酸，可以使用cDNA或者作为另一种选择的基因组DNA作模板，合适的寡聚核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术来扩增。这样扩增出的核酸，可以克隆到合适的载体中，并用DNA序列分析辨别其特征。另外，与PTS核苷酸序列相对应的寡聚核苷酸，可以用标准合成技术准备，例如使用自动DNA合成仪。
在一个优选的实施方案中，分离的本发明核酸分子包含序列表中列出的一条核苷酸序列。本发明的核酸序列，正如在序列表中列出的那些，与本发明的谷氨酸棒杆菌PTS DNA是一致的。这些DNA包含编码PTS蛋白的序列(即“编码区域”，显示在每条序列表中奇数序列号：序列中)，以及5’非编码序列和3’非编码序列，也显示在每条序列表中奇数序列号：序列中。作为另一种选择，核酸分子可以只包含序列表中核酸序列的编码区域。
为了该申请的目的，可以理解序列表中列出的每条核酸和氨基酸序列，都有一个用于识别的RXA，RXN，RXS或者RXC编码，标明“RXA”，“RXN”，“RXS”，或者“RXC”后面有5个数字(即，RXA01503，RXN01299，RXS00315，或者RXC00953)。每条核酸序列最多包含三部分：5’上游区域，编码区域，下游区域。三个区域的每个部分，都用相同的RXA，RXN，RXS，或者RXC编号确定以消除混淆。于是叙述“序列表中的一条奇数编码的序列”，是指序列表中的任何核酸序列，这些序列也可以用它们不同的RXA，RXN，RXS，或者RXC编号相互区分。每条这种序列的编码区域都被翻译成相应的氨基酸序列，这些序列也列在序列表中，为紧随相应核酸序列之后偶数序列号：。例如，RXA02229的编码区域列在SEQ ID NO：1，而它编码的氨基酸序列列在SEQ ID NO：2。本发明的核酸分子序列，与其编码的氨基酸分子，用相同的RXA，RXN，RXS，或者RXC编号表示，使得它们容易相互联系。例如，指定为RXA01503，RXN01299，RXS00315和RXC00953的氨基酸序列，分别是RXA01503，RXN01299，RXS00315和RXC00953核酸分子核苷酸序列编码区域的翻译。本发明RXA，RXN，RXS和RXC核苷酸和氨基酸序列之间的对应，以及它们被指定的序列号列在表1中。例如，像是列在表1中的核苷酸序列RXN01299是SEQ ID NO：7，相应的氨基酸序列是SEQ ID NO：8。
本发明的几个基因是“F-标明的基因”。F-标明的基因包括那些列在表1中并在RXA，RXN，RXS，或者RXC标明前有“F”的基因。例如，SEQ ID NO：3，像在表1中表示的那样，被指定为“F RXA00315”，就是一个F-标明的基因，同样的还有SEQ ID NO：9，11和13(表1中分别标明为“F RXA01229”、F RXA01883”和“F RXA01889”)。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子不包含汇编在表2中的那些谷氨酸棒杆菌分子。对于dapD基因，该基因的序列发表在Wehrmann，A.，et al.(1998)J.Bacteriol.180(12)：3159-3165。然而，本申请发明者所得到的比发表的版本长很多。据说，发表的版本使用了错误的其实密码子，并因此只表现了真实编码区域的一部分。
在另一个优选的实施方案中，分离的本发明的核酸分子，包含那些是本发明核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号：序列)或者其部分的互补分子的核酸分子。与本发明一条核苷酸序列互补的核酸分子，是指该分子与序列表中列出的一条核苷酸序列(例如，奇数序列号：序列)充分互补，因此它可以与本发明的一条核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双螺旋。
同样在另一个优选的实施方案中，分离的本发明的核酸分子，包含这样的核苷酸序列，该序列与本发明的核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号：序列)或者其部分，有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。以上引用范围(例如，70-90％一致性或者80-95％一致性)中间的范围和一致性值，也包含在本发明中。例如，包含了这样的一致性值范围，这些范围是上面引用的上限和/或下限值的组合。在另一种优选的实施方案中，本发明分离的核酸分子包括这样的核苷酸序列，该序列可以与本发明的一条核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号：序列)或者其部分进行杂交，例如，在严格条件下杂交。
另外，本发明核酸分子可能只包含序列表中奇数序列号序列编码区域的一部分，例如，可以用作探针或者引物的片段，或者编码PTS蛋白生物活性部分的片段。由谷氨酸棒杆菌PTS基因克隆出的核苷酸序列，容许产生探针和引物，这些探针和引物的设计是用于鉴定和/或克隆其他细胞类型或者其他生物体中的PTS同系物，以及其他棒杆菌或者亲缘物种中的PTS同系物。探针/引物典型的包括相当纯化的寡聚核苷酸。寡聚核苷酸典型的包括这样一段核苷酸序列的区域，该区域在严格杂交条件下，与本发明核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号序列)的有义链，这些序列的反义序列，或者其天然存在的突变体的至少大约12个，优选的大约25个，更优选的大约40，50，或者75个连续核苷酸杂交。基于本发明核苷酸序列的引物，可以用于克隆PTS同系物的PCR反应。基于PTS核苷酸序列的探针，可以用于探测相同的或者同源蛋白的转录或者基因组序列。在一个优选的实施方案中，探针更是包括另外的附着标记基团，例如标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或者酶的辅因子。这种探针可以用作诊断检测试剂盒的一部分，该试剂盒用于鉴定错误表达PTS蛋白的细胞，像是通过测定样本细胞中PTS编码核酸的水平，例如，检测PTS mRNA的水平，或者测定基因组PTS基因是否发生了突变或者缺失。
在一个实施方案中，本发明核酸分子编码一种蛋白质或者其部分，该蛋白质或者其部分的氨基酸序列与本发明的氨基酸序列(例如，序列表中偶数序列号序列)有充分的同源性，从而使得该蛋白质或者其部分有能力把高能碳分子(例如葡萄糖)输入谷氨酸棒杆菌，也可以参与一条或者多条细胞内信号传导途径。如此处所用的那样，术语“充分的同源性”是指蛋白质或者其部分的氨基酸序列，含有最小数目的与本发明氨基酸序列一致的或者等价的(例如，具有与序列表偶数序列号序列中的氨基酸残基相似侧链的氨基酸残基)氨基酸残基，从而使得该蛋白质或者其部分，能够把像是葡萄糖这样的高能碳分子输入谷氨酸棒杆菌，也可以参与该微生物中的一条或者多条细胞内信号传导途径。这种代谢途径的蛋白质成员，像这里描述的那样，其功能是把像是葡萄糖这样的高能碳分子输入谷氨酸棒杆菌，也可以参与该微生物中的一条或者多条细胞内信号传导途径。这里也描述了这种活性的实例。因而，“PTS蛋白的功能”对于一条或者多条基于磷酸烯醇丙酮酸的糖类转运途径的全部功能和/或调节有贡献，和/或直接或者间接的对一种或者多种精细化学物质的产量、生产和/或生产效率有贡献。PTS蛋白活性的实例在表1中列出。
在另一个实施方案中，蛋白质与本发明的全部氨基酸序列有至少大约50-60％的同源性，优选的有至少大约60-70％的同源性，更优选的有至少大约70-80％，80-90％，90-95％的同源性，最优选的有至少大约96％，97％，98％，99％或者更高的同源性(例如，序列表中偶数序列号：序列)。
本发明PTS核酸分子编码蛋白质的部分，优选是PTS蛋白的生物活性部分。如此处所用的那样，术语“PTS蛋白的生物活性部分”的意思是包含PTS蛋白这样的部分，例如结构域/基元，该部分能够把像是葡萄糖这样的高能碳分子输入谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的一条或者多条细胞内信号传导途径。可以进行一种酶活性分析，以确定PTS蛋白或者其生物活性部分是否参与了把像是葡萄糖这样的高能碳分子输入谷氨酸棒杆菌，或者参与了该微生物中的一条或者多条细胞内信号传导途径。这种分析方法对于熟悉常规技术者来说是熟知的，在范例的实例8中有详细的描述。
编码PTS蛋白生物活性部分的额外的核酸片段，可以通过以下方法制备，分离本发明氨基酸序列(例如，序列表中偶数序列号：序列)的一部分，表达PTS蛋白或者多肽的编码部分(例如，通过体外重组表达)，并且估算PTS蛋白或者多肽编码部分的活性。
因为遗传密码子的简并性，以及由此可以编码得到和本发明核苷酸序列编码蛋白质相同的PTS蛋白，所以本发明进一步包含不同于本发明核苷酸序列(例如，序列表中奇数序列号：序列)(和其部分)的核酸分子。在另一个实施方案中，分离的本发明的核酸分子具有这样的核苷酸序列，该序列编码具有序列表中列出的氨基酸序列(例如，偶数序列号：)的蛋白质。同样在另一个实施方案中，本发明核酸分子编码全长的谷氨酸棒杆菌蛋白质，该蛋白质与本发明的氨基酸序列(由序列表中奇数序列号：开放阅读框架编码)有充分的同源性。
在一个实施方案中，本发明的序列并不意味着包括以前技术上已知的序列，例如那些列在表2或者表4中的在本发明以前就有效的Genbank序列，这对于熟悉常规技术者来说是可以理解的。在一个实施方案中，本发明包含这样的核苷酸序列和氨基酸序列，该序列与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列有一定百分比的一致性，该百分比大于技术上已知的序列(例如，表2或者表4中列出的Genbank序列(或者该序列编码的蛋白质))与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列一致性的百分比。例如，本发明包含与标明为RXA01503(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列有大于和/或至少44％一致性的核苷酸序列，与标明为RXA00951(SEQ ID NO：15)的核苷酸序列有大于和/或至少41％一致性的核苷酸序列，以及与标明为RXA01300(SEQ ID NO：21)的核苷酸序列有大于和/或至少38％一致性的核苷酸序列。熟悉常规技术者，通过检查表4中列出的对于每个特定序列给出的3个最高符合的GPA-计算百分比一致性，以及经过从百分之一百中减去最高的GPA-计算百分比一致性，可以计算任何本发明特定序列百分比一致性的低端域值。熟悉常规技术者也可以意识到，其百分比一致性大于如此计算出的低端域值(例如，至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％，优选的至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％，更优选的至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的一致性)的核酸和氨基酸序列，也是包含在本发明中的。
熟悉常规技术者可以意识到，除了在序列表中以奇数序列号列出的谷氨酸棒杆菌PTS核苷酸序列之外，导致PTS蛋白氨基酸序列改变的DNA多态性可以在一定群体(例如谷氨酸棒杆菌群体)中存在。这种PTS基因的遗传多态性，可以由于自然条件的变异而在一个群体的不同个体中存在。如此处所用的那样，术语“基因”和“重组基因”是指含有编码PTS蛋白的开放阅读框架的核酸分子，优选的PTS蛋白是谷氨酸棒杆菌PTS蛋白。这种自然条件的变异典型的可以造成PTS基因核苷酸序列1-5％的变化。任何以及全部由于自然条件的变异造成的，并且不改变PTS蛋白功能活性的，这种核苷酸的变化，以及引起的PTS氨基酸的多态性，都属于本发明范围之内。
相应天然变体的核酸分子，和本发明谷氨酸棒杆菌PTS DNA的非谷氨酸棒杆菌同源物，可以基于此处公开的它们与谷氨酸棒杆菌PTS核酸分子的同源性，使用谷氨酸棒杆菌DNA或者其部分作为杂交探针，在严格杂交条件下根据标准杂交技术分离得到。因此，在另一个实施方案中，分离的本发明核酸分子的长度至少有15个核苷酸，在严格条件下与含有序列表奇数序列号：核苷酸序列的核酸分子杂交。在其他实施方案中，核酸分子的长度至少有30，50，100，250或者更多个核苷酸。如此处所用的那样，术语“在严格条件下杂交”的意思是描述这样的杂交和清洗的条件，在该条件下彼此之间有至少60％同源性的核苷酸序列相互之间保持典型的杂交。优选，这种条件是序列之间有至少大约65％，更优选的有至少大约70％，以及甚至更优选的有至少大约75或者更高的同源性，相互之间保持典型的杂交。这种严格条件对于熟悉常规技术者是已知的，可以在Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。一种优选的但不是限制的严格杂交条件是，在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中大约45℃进行杂交，然后用0.2X SSC，0.1％SDS在50-65℃清洗一次或者多次。优选，分离的本发明的核酸分子，在严格杂交条件下与本发明的核苷酸序列杂交，相当于得到天然存在的核酸分子。如此处所用的那样，“天然存在的”核酸分子是指具有自然中存在的核苷酸序列(例如，编码天然蛋白质)的RNA或者DNA分子。在一个实施方案中，核酸编码天然谷氨酸棒杆菌PTS蛋白。
熟悉常规技术者可以进一步意识到，除了群体中存在的天然存在的PTS序列变体以外，可以通过突变把改变引入本发明核苷酸序列中，从而导致被编码PTS蛋白的氨基酸序列的改变，而不改变PTS蛋白的功能。例如，可以在本发明核苷酸序列中，进行可以导致“非必需”氨基酸残基的氨基酸取代的核苷酸取代。“非必需”氨基酸残基是指这样的残基，该残基可以在PTS蛋白的野生型序列(例如，序列表中偶数序列号：序列)中发生改变，而不改变PTS蛋白的活性，而“必需”氨基酸残基是PTS蛋白活性所必需的。然而，其他氨基酸残基(例如，那些在PTS活性结构域中非保守的或者只是半保守的氨基酸残基)可能对于活性不是必需的，因此也可以在不改变PTS活性的情况下被改变。
因此，本发明的另一个方面涉及编码这样的PTS蛋白的核酸分子的，该PTS蛋白含有对PTS活性非必需的氨基酸残基的变化。这些蛋白质的氨基酸序列不同于序列表中偶数序列号：序列，但仍然保持至少一种此处描述的PTS活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含一段编码蛋白质的核苷酸序列，其中该蛋白质的氨基酸序列与本发明的氨基酸序列有至少大约50％的同源性，并且能够把像是葡萄糖这样的高能量含碳分子转运进谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的细胞内信号传导，或者具有表1中列出的一种或者多种活性。优选，核酸分子编码的蛋白质与序列表中奇数序列号氨基酸序列，有至少大约50-60％的同源性，更优选的与这种序列有至少大约60-70％的同源性，甚至更优选的与这种序列有至少大约70-80％，80-90％，90-95％的同源性，最优选的与本发明的氨基酸序列有至少大约96％，97％，98％，或者99％的同源性。
为了确定两种氨基酸序列(例如，本发明的一种氨基酸序列与其突变体形式)或者两种核酸序列的同源性百分比，出于最适宜比较的目的，对序列进行序列对比(例如，为了与其他蛋白质或者核酸进行最适宜的序列对比，可以在一种蛋白质或者核酸的序列中引入间隙)。然后比较相应氨基酸位置的氨基酸残基或者核酸位置的核苷酸。当一条序列(例如，本发明的一条氨基酸序列)中的一个位置被与其他序列(例如，氨基酸序列的突变体形式)相应位置相同的氨基酸残基或者核苷酸占据时，该分子在这个位置是同源的(即，如此处所用的氨基酸或者核酸“同源性”与氨基酸或者核酸的“一致性”是相同的)。两条序列之间的百分比同源性，是一个相同位置数目被序列均分的函数(即，％一致性＝相同位置的#/全部位置的#x 100)。
分离的与本发明蛋白质序列(例如，序列表中偶数序列号：序列)同源的编码PTS蛋白质的核酸分子，可以通过向本发明核苷酸序列中引入一个或者多个核苷酸取代、插入、缺失而产生，从而在编码蛋白质中引入一个或者多个氨基酸取代、插入、缺失。可以使用标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，在本发明核苷酸序列中引入突变。优选，保守的氨基酸取代是在一个或者多个预期的非必需氨基酸残基进行的。“保守的氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族，在技术上有规定。这些家族包括，具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有无电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香组侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，预期的PTS蛋白中的非必需氨基酸残基，优选的被同一侧链家族中的其他氨基酸取代。另外，在另一个实施方案中，可以在PTS编码序列全长或者部分，随机的引入突变，例如通过饱和诱变，根据此处描述的鉴定具有PTS活性突变体的PTS活性，筛选出得到的突变体。在一条序列表中奇数序列号核苷酸序列诱变之后，被编码蛋白质可以重组表达，蛋白质活性也可以，例如使用此处描述的分析(参见范例的实例8)，得到确定。
除了以上描述的编码PTS蛋白质的核酸分子以外，本发明的另一方面还与分离的反义核酸分子有关。“反义”核酸包括与编码蛋白质的“有义”核酸互补的核苷酸序列，例如与双链DNA分子编码链互补，或者与mRNA序列互补。因此，反义核酸可以通过氢键与有义核酸连接。反义核酸可以与全部PTS编码链互补，也可以仅与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子，与编码PTS蛋白的核苷酸序列编码链的“编码区域”反义。术语“编码区域”是指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域(例如，SEQ ID NO.5 (RAX 01503)的全部编码区域包括1至249核苷酸)。在另一个实施方案中，反义核酸分子，与编码PTS的核苷酸序列编码链的反义。术语“非编码区域”是指编码区域两侧不翻译成氨基酸的5’和3’序列(即5’和3’非翻译区域)。
考虑到此处公布的编码PTS的编码链序列(例如，序列表中列出的奇数序列号序列)，本发明反义核酸可以根据Watson和Crick的碱基配对规则进行设计。反义核酸分子可以与PTS mRNA的全部编码区域互补，但是更优选是这样的寡聚核苷酸，该寡聚核苷酸仅与PTSmRNA的编码区域或者非编码区域的部分是反义的。例如，反义寡聚核苷酸可以与PTS mRNA翻译起始位置附近的区域互补。例如，反义寡聚核苷酸的长度可以是5，10，15，20，25，30，35，40，45或者50个核苷酸。本发明的反义核酸分子，可以使用技术上已知的程序，通过化学合成或者酶促连接反应构建。可以使用天然存在的核苷酸或者各种经过修饰的核苷酸，化学合成反义核酸(例如反义寡聚核苷酸)，那些经过修饰的核苷酸，是为了增加分子的生物稳定性，或者为了增加反义核酸与有义核酸之间形成双螺旋的物理稳定性而设计的，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰的核苷酸的实例包括，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，beta-D-半乳糖基肌苷，N6-异戊基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基尿嘧啶-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基queosine，5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-异戊基腺嘌呤，尿嘧啶-5-含氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-含氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-含氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，以及2，6-二氨基嘌呤。另外，反义核酸可以使用表达载体生物合成，其中核酸被反义方向亚克隆到表达载体中(即，由插入核酸转录的RNA，相对于插入的目的核酸是反义方向的，以下部分有进一步叙述)。
本发明的反义核酸分子，被典型的施用于细胞或者在原位产生，从而它们可以与编码PTS蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或者结合，进而抑制蛋白质的表达，例如，抑制转录和/或翻译。杂交可以通过常规核苷酸互补性而形成稳定的双螺旋，或者，例如，当反义核酸分子结合DNA双螺旋时，它与双螺旋的大沟发生特殊相互作用。反义分子可以被修饰，从而使得该分子可以与受体或者与特定细胞表面表达的抗原特异性结合，例如，反义核酸分子与多肽或者抗体的结合，该抗体与细胞表面受体或者抗原结合。反义核酸分子也可以使用此处描述的载体递送至细胞。为了得到细胞内足够浓度的反义分子，这样的载体是优选，即在该载体中，反义核酸分子被置于原核、病毒或者真核启动子的控制之下。
而在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是一种α-异头物核酸分子。α-异头物核酸分子与互补的RNA形成特异的双链杂交体，杂交体中两股链走向彼此平行，这与通常的β-单元相反(Gaultier et al.(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可以包含2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.(1987)Nucleic Acids.Res.15：6131-3148)或者化学RNA-DNA类似物(Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
而在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是核酶。核酶是催化型RNA分子，具有核糖核酸酶活性，能够切割单链核酸，例如mRNA，它具有与单链核酸互补的区域。因此，核酶(例如，锤头核酶(描述于Haselhoff and Gerlach(1988)Nature 334：585-591))可以用于催化切割PTS mRNA转录物，从而抑制PTS mRNA的翻译。对于PTS编码核酸分子有特异性的核酶，可以基于此处公布的PTS DNA核苷酸序列(即SEQ ID NO：5(RAX 01503))来设计。例如，可以构建四膜虫属L-19 IVS RNA的衍生物，其活性位点的核苷酸序列与被切割的PTS-编码mRNA的核苷酸序列是互补的。参见，例如，Cech et al.U.S.PatentNo.4,987,071和Cech et al.U.S.Patent No.5,116,742。另外，PTS mRNA可以用于RNA分子库中筛选具有特异核酶活性的催化型RNA。参见，例如，Bartel，D.and Szostak，J.W.(1993)Science 261：1411-1418。
另外，通过把与PTS核苷酸序列调节区域(例如，PTS启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列作为目标，形成三螺旋结构，可以抑制PTS基因的表达，该三螺旋结构可以阻止PTS基因在目的细胞中的转录。一般参见，Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.et al.(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；and Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)：807-15。
B.重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一方面涉及载体的，优选是含有编码PTS蛋白(或者其部分)核酸的表达载体。如此处所用的那样，术语“载体”是指能够连接其他核酸，并对其进行运输的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，质粒是指环形双链DNA环，其中连接有额外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体，以及附加型哺乳动物载体)。其他的载体(例如，非附加型哺乳动物载体)一经引入宿主细胞就会整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一同复制。另外，某些载体能够指导与之相连接的基因的表达。这些载体此处称作“表达载体”。总之，重组DNA技术使用的表达载体经常是质粒形式。在本说明中，“质粒”和“载体”可以交换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明有意包括这些表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，它们具有相同的功能。
本发明重组表达载体包括本发明的核酸，该核酸在宿主细胞中以适合核酸表达的形式存在，这就意味着重组表达载体含有一条或者多条调节序列，这些序列是基于用作表达的宿主细胞选出的，它们被可行的连接到要表达的核酸序列上。在重组表达载体中，“可行的连接”的意思是指，感兴趣核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式进行连接(例如，在体外转录/翻译系统中，或者在载体被引入的宿主细胞中)。术语“调节序列”的意思是包括启动子、增强子和其他表达控制元素(例如，聚腺苷酸化信号)。这种调节序列在，例如，Goeddel；GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中有描述。调节序列包括，那些在很多类型宿主细胞中，指导核苷酸序列组成型表达的序列，以及那些在某些宿主细胞中，指导核苷酸序列表达的序列。优选的调节序列是，例如，像是cos-，tac-，trp-，tet-，trp-tet-，lpp-，lac-，lpp-lac-，lacIq-，T7-，T5-，T3-，gal-，trc-，ara-，SP6-，amy-，SPO2-，λ-PR-或者λPL这样的启动子，这些启动子优选的使用在细菌中。另外的调节序列是，例如，酵母和真菌的启动子，例如ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH，植物的启动子，例如，CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，nos或者ubiquitin-或phaseolin-启动子。也可以使用人造启动子。这些对于熟悉常规技术者是可以意识到的，即表达载体的设计依赖于这些因素：用于转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以引入宿主细胞，从而产生此处描述的核酸所编码的蛋白质或者多肽，包括融合蛋白质或者多肽(例如，PTS蛋白、PTS蛋白的突变形式、融合蛋白质等)。
可以设计本发明的重组表达载体，用于在原核或者真核细胞中表达PTS蛋白。例如，PTS基因可以在以下细胞中表达，像是谷氨酸棒杆菌这样的细菌细胞，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)，酵母和其他真菌细胞(参见Romanos，M.A.et al.(1992)“Foreign gene expression in yeast：areview”，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.et al.(1991)“Heterologousgene expression in filamentous fungi”in：More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet & L.L.Lasure，eds.，p.396-428：Academic Press：San Diego；and van denHondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.et al.，eds.，p.1-28，Cambridge University Press：Cambridge)藻类或者多细胞植物细胞(参见Schmidt，R.and Willmitzer，L.(1998)Highefficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation ofArabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants”Plant Cell Rep.：583-586)，或者哺乳动物细胞。适当的宿主细胞在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有进一步论述。另外，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
原核细胞中的蛋白质表达，经常是由含有组成型或者诱导型启动子的载体进行的，这些启动子指导融合蛋白质或者非融合蛋白质的表达。融合载体在编码蛋白质上添加一定数目的氨基酸，通常是在重组蛋白质的氨基末端。这种融合载体具有3个典型用途：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解性；和3)用作亲和纯化的配基，帮助融合蛋白纯化。在融合表达载体中，蛋白质切割位点经常是被引入到融合部分与重组蛋白质的结合处，使得在纯化出融合蛋白质之后，能够把重组蛋白质与融合部分分离开。这种酶，以及它们的同源识别序列，包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.and Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)，pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别与目标重组蛋白融合了谷光甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白，或者蛋白质A。在一个实施方案中，PTS蛋白编码序列被克隆到pGEX表达载体中，产生一个编码融合蛋白的载体，该载体从N-末端到C-末端包括，GST-凝血酶切割位点-X蛋白质。融合蛋白可以使用谷光甘肽-琼脂糖树脂，通过亲和层析纯化。与GST分离开的重组PTS蛋白，可以通过用凝血酶切割融合蛋白质得到。
合适的大肠杆菌诱导型非融合表达载体的实例包括，pTrc(Amannet al.，(1988)Gene 69：301-315)，pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pSH1，pSH2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III 113-B1，λgt11，pBdC1，和pET 11d(Studier et al.，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，California(1990)60-89；and Pouwels et al.，eds.(1985)CloningVectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。pTrc载体的目标基因表达，依赖于杂交trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶的转录。pET11d载体的目标基因表达，依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的T7 gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或者HMS174(DE3)中驻留的λ噬菌体提供，该噬菌体含有在lacUV 5启动子转录控制下的T7 gn1基因。对于其他种类细菌的转化，可以选择合适的载体。例如，已知质粒pIJ101，pIJ364，pIJ702和pIJ361转化链霉菌是有效的，而质粒pUB110，pC194，或者pBD214适合转化杆状菌种。有助于把遗传信息转入棒状杆菌的几种质粒包括pHM1519，pBL1，pSA77或者pAJ667(Pouwels et al.，eds.(1985)CloningVectors，Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。
一种最大限度增大重组蛋白表达的方案是，在宿主细胞中表达这样的蛋白质，该蛋白质具有不会减弱的蛋白酶剪切重组蛋白质的能力(Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一种方案是改变插入表达载体中核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的密码子都是所选用于表达的细菌优先使用的，例如谷氨酸棒杆菌(Wada et al.(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明核酸序列的这种改变，是可以通过标准DNA合成技术进行的。
在另一个实施方案中，PTS蛋白表达载体是酵母表达载体。酵母S.cerivisae用于表达的载体的实例包括，pYepSecl(Baldari，et al.，(1987)Embo J.6：229-234)，2μ，pAG-1，Yep6，Yep13，pEMBK Ye23，pMFa(Kurjan and Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz et al.，(1987)Gene 54：113-123)，和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。用于构建适合在其他真菌中，例如丝状真菌中，使用的载体的载体和方法，包括那些详述于下列文献中的：van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systems and vector development forfilamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy，et al.，eds.，p.1-28，Cambridge University Press：Cambridge，and Pouwelset al.，eds.(1985)Cloning Vectors，Elsevier：New York IBSN 0 444904018)。
另外，本发明PTS蛋白可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中，用于表达蛋白质的杆状病毒载体包括，pAC系列(Smith et al.(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summer(1989)Virology 170：31-39)。
在另一个实施方案中，本发明PTS蛋白可以在单细胞植物细胞(例如藻类)中表达，或者在高等植物(例如种子植物，像是作物植物)的植物细胞中表达。植物表达载体的实例包括那些详述于下列文献中的：Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.and Masterson，R.(1992)″New plant binaryvectors with selectable markers located proximal to the left border″，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)″Binary Agrobacterium vectors for planttransformation”，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721，包括pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004和pDH51(Pouwels et al.，eds.(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。
也是在另一个实施方案中，本发明核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman et al.(1987)EMBO J.6：187-195)。表达载体的控制功能，当时用在哺乳动物中时，经常是由病毒调节元素提供的。例如，通常使用的启动子来自多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其他对于原核细胞和真核细胞都合适的表达体系，参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的16章和17章。
在另一个实施方案中，重组的哺乳动物表达载体，能够指导特定细胞类型中优选核酸的表达(例如，组织特异性调节元素被用于表达核酸)。组织特异性调节元素在技术上是已知的。合适的组织特异性启动子的实例包括但不局限于，白蛋白启动子(肝脏特异；Pinkert et al.(1987)Gene Dev.1：268-277)，淋巴特异启动子(Calame and Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，T-细胞受体的特殊启动子(Winoto and Baltimore(1989)EMBO J.8：729-933)和免疫球蛋白的特殊启动子(Banerji et al.(1983)Cell 33：729-740；Queen and Baltimore(1983)Cell 33：741-748)，神经元特异的启动子(例如神经丝启动子；Byrne and Ruddle(1989)PANS 86：5473-5477)，胰腺特异的启动子(Edlund et al.(1985)Science230：912-916)，以及乳腺特异的启动子(例如乳汁乳清启动子；U.S.Patent No.4,873,316和European Application Publication No.264,166)。也包括发育调节的启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel and Gruss(1990)Science 249：374-379)和α-胎蛋白启动子(Campes and Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。
本发明此外还提供了含有本发明DNA分子的重组表达载体，该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是说，DNA分子可以可操作性的按以下方式连接到调节序列上，即允许与PTS mRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子的转录)的方式。可以选择那些在各种细胞类型中指导反义RNA分子连续表达的调节序列，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择指导连续的、组织特异的或者细胞类型特异的反义RNA表达的调节序列，作为调节序列。反义表达载体可以以重组质粒、噬菌粒或者减毒病毒的形式存在，在其中反义核酸在高效调节区域的控制下产生，其活性可以通过引入载体的细胞类型来确定。关于使用反义基因调节基因表达，可以参见Weintraub，H.et al.，Antisense RNA as a molecular tool for genetics analysis，Review-Trendsin Genetics，Vol.1(1)1986。
本发明的另一方面，涉及被引入本发明重组表达载体的宿主细胞的。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可以交替使用。该术语应该理解为，不仅指被挑选的特定细胞，而且也指这些细胞的后代或者可能的后代。因为突变或者环境影响会使得某些修饰发生在成功的传代中，这些后代细胞实际上不可能与母细胞完全相同，但是也包含在此处使用的术语范围之内。
宿主细胞可以是任何原核或者真核细胞。例如，PTS蛋白可以在像是谷氨酸棒杆菌这样的细菌细胞中、昆虫细胞中、酵母细胞中或者哺乳动物细胞(例如中国大鼠卵巢细胞(CHO)或者COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞，对于熟悉常规技术者来说是熟知的。可以用作本发明核酸和蛋白质分子宿主细胞的谷氨酸棒杆菌亲缘微生物，在表3中列出。
载体DNA可以通过常规转化或者转染技术，引入原核或者真核细胞。如此处所用的那样，术语“转化”和“转染”的意思是指各种本领域熟知的，把外源核酸(例如，线性DNA或者RNA(例如，线性载体或者没有载体的单独基因结构))或者以载体形式存在的核酸(例如，质粒、噬菌体、噬菌粒、噬菌粒、转座子或者其他DNA)转入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或者氯化钙共沉淀，DEAE-右旋糖苷介导的转染，脂质转染，或者电传孔。转化或者转染宿主细胞的合适方法，可以在Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd ed..，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，以及其他实验室手册上找到。
已知，为了稳定的转染哺乳动物细胞，依靠使用的表达载体和转染技术，只有一小部分可以把外源DNA整合到其自身基因组中。为了鉴定和筛选这些整合体，编码筛选标记(例如，对抗生素的抗性)的基因通常与感兴趣的基因被一同引入宿主细胞。优选的筛选标记包括那些能赋予药物抗性的标记，例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码筛选标记的核酸，可以与PTS蛋白在同一个载体上被引入宿主细胞，或者在单独的载体上引入宿主细胞。经被引入核酸稳定转染的细胞，可以使用药物筛选鉴定(例如，与筛选标记基因合并的细胞可以存活，而其他细胞则死掉)。
为了创造同源重组微生物，制备含有至少部分PTS基因的载体，该基因具有缺失、添加或者取代，从而改变，例如功能性破坏，PTS基因。优选的该是谷氨酸棒杆菌PTS基因，但是它也可以是来自亲缘细菌的同源物，甚至是来自哺乳动物、酵母或者昆虫。在一个优选的实施方案中，设计载体，使得根据同源重组，内源PTS基因被功能性破坏(即，不在编码功能蛋白质；也称作“敲除”载体)。另外，可以设计载体，使得根据同源重组，内源PTS基因被发生突变或者改变，但是仍编码功能蛋白质(例如，改变上游调节区域，从而改变内源PTS基因的表达)。在同源重组载体中，被改变的PTS基因部分，在其5’和3’末端侧面连接有多余的PTS核酸，使得同源重组可以发生在载体携带的外源PTS基因和微生物的内源PTS基因之间。多余的侧面连接的PTS核酸具有足够的长度，可以与内源基因成功的发生同源重组。典型的，载体中含有几千个碱基的侧链DNA(5’和3’末端)(参见，例如，Thomas，K.R.，and Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503 for adescription of homologous recombination vectors)。引入微生物(例如电传孔)和细胞的载体，选择那些其中引入的PTS基因与内源PTS基因，使用技术上已知的技术可以同源重组的。
在另一个实施方案中，可以产生含有所选择系统的重组微生物，该系统允许调节引入基因的表达。例如，包含的PTS基因在载体中处于lac操纵子的控制之下，使得PTS基因只能在IPTG存在时表达。这种调节系统在技术上是熟知的。
在另一个实施方案中，宿主细胞中的内源PTS基因被破坏(例如，通过同源重组或者其他技术上已知的遗传方法)，使得其蛋白质产物的表达不能发生。在另一个实施方案中，宿主细胞中的内源的或者引入的PTS基因，经一个或者多个点突变、缺失或者倒置而改变，但是仍旧编码功能PTS蛋白。而在另一个实施方案中，微生物PTS基因的一个或者多个调节区域(例如，启动子、阻抑物或者诱导子)被改变(例如，通过缺失、剪切、倒置或者点突变)，使得PTS基因的表达得到调节。熟悉常规技术者可以意识到，含有不止一个所述PTS基因和蛋白质修饰的宿主细胞，使用本发明的方法可以很容易的产生，这些细胞也包含在本发明中。
本发明宿主细胞，例如培养的原核或者真核宿主细胞，可以用于产生(例如表达)PTS蛋白。因此，本发明进一步提供了，使用本发明宿主细胞产生PTS蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中引入了编码PTS蛋白的重组表达载体，或者其基因组中引入了编码野生型或者改变的PTS蛋白的基因)，直到产生PTS蛋白。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从培养基或者宿主细胞中分离PTS蛋白。
C.分离的PTS蛋白
本发明的另一方面涉及分离的PTS蛋白及其生物活性部分的。“分离的”或者“纯化的”蛋白，或者其生物活性部分，当使用重组DNA技术生产时基本上没有细胞物质，当化学合成时基本上没有化学前体或者其他化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括这样的PTS蛋白制备，其中蛋白质被从天然或者重组产生该蛋白质的细胞的细胞组分中分离出。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞物质”包括制备含有至少大约30％(干重)非PTS蛋白(此处也称作“污染蛋白质”)的PTS蛋白，更优选的含有少于大约20％的非PTS蛋白，甚至更优选的含有少于大约10％的非PTS蛋白，最优选的含有少于大约5％的非PTS蛋白。当PTS蛋白或者其生物活性部分经重组产生时，优选是基本上不含培养基，即培养基少于制备蛋白质体积的大约20％，优选的少于10％，最优选的少于大约5％。术语“基本上不含化学前体或者其他化学物质”包括这样的PTS蛋白制备，其中蛋白质被从参与蛋白质合成的化学前体或者其他化学物质中分离出。在一个实施方案中，术语“基本上不含化学前体或者其他化学物质”包括制备含有至少大约30％(干重)化学前体或者非PTS化学物质的PTS蛋白，更优选的含有少于大约20％的化学前体或者非PTS化学物质，甚至更优选的含有少于大约10％的化学前体或者非PTS化学物质，最优选的含有少于大约5％的化学前体或者非PTS化学物质。在一个优选的实施方案中，分离的蛋白质或者其生物活性部分，不含有来自获得PTS蛋白的同一生物体的污染蛋白质。这种蛋白质典型的是由重组表达产生，例如像谷氨酸棒杆菌这样微生物中的谷氨酸棒杆菌PTS蛋白的重组表达。
分离的本发明的PTS蛋白或者其生物活性部分，能够参与把像是葡萄糖这样的高能量含碳分子转运进谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的细胞内信号传导，或者具有一种或者多种列在表1中的活性。在一个优选的实施方案中，蛋白质或者其部分含有这样的氨基酸序列，该序列与本发明的氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号：序列中的一个序列)有充分的同源性，使得该蛋白质或者其生物活性部分，有能力参与把像是葡萄糖这样的高能量含碳分子转运进谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的细胞内信号传导。蛋白质的部分，优选是指此处描述的生物活性部分。在另一个优选的实施方案中，本发明的PTS蛋白具有在序列表中以偶数序列号：列出的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，PTS蛋白具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与本发明的核苷酸序列(例如，序列表奇数序列号：序列中的一个序列)杂交，例如在严格条件下杂交。在另一个优选的实施方案中，PTS蛋白具有由这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与本发明的一条核酸序列或者其部分，有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性。介于上面引述的值之间的范围或者一致性值(例如，70-90％的一致性或者80-95％的一致性)，也有意的包含在本发明中。例如，有意的包含了这样的一致性值范围，这些范围是上面引用的上限和/或下限值的组合。本发明优选的PTS蛋白也优选的具有至少一种此处描述的PTS活性。例如，一种本发明优选的PTS蛋白包含这样的核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列与本发明的核苷酸序列杂交，例如在严格条件下杂交，并且该序列能够参与把像是葡萄糖这样的高能量含碳分子转运进谷氨酸棒杆菌，或者参与该微生物中的细胞内信号传导，或者具有一种或者多种列在表1中的活性。
在其他实施方案中，PTS蛋白与本发明的氨基酸序列(例如，序列表偶数序列号：序列中的一个序列)有充分的同源性，并且具有本发明氨基酸序列蛋白质的功能活性，正如以上I部分详细描述的那样，其氨基酸序列由于天然改变或者突变而有所不同。因此，在另一个实施方案中，PTS蛋白是这样的蛋白质，它具有的氨基酸序列与本发明的完全氨基酸序列，有至少大约50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％或者60％的同源性，优选的有至少大约61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或者70％的同源性，更优选的有至少大约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或者80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，88％，89％或者90％，或者91％，92％，93％，94％，以及甚至更优选的有至少大约95％，96％，97％，98％，99％或者更高的同源性，并且具有至少一种此处描述的PTS活性。介于上面引述的值之间的范围或者一致性值(例如，70-90％的一致性或者80-95％的一致性)，也有意的包含在本发明中。例如，有意的包含了这样的一致性值范围，这些范围是上面引用的上限和/或下限值的组合。在另一个实施方案中，本发明与这样的全长谷氨酸棒杆菌蛋白质有关，该蛋白质与本发明的氨基酸序列有充分的同源性。
PTS蛋白的生物活性部分包含这样的多肽，该多肽含有来自PTS蛋白氨基酸序列的氨基酸序列，例如，序列表偶数序列号：的氨基酸序列或者与PTS蛋白同源蛋白质的氨基酸序列，该部分含有比全长PTS蛋白或者全长PTS蛋白同源蛋白质更少的氨基酸，并且表现出至少一种PTS蛋白活性。典型的生物活性部分(肽，例如，氨基酸长度为像是5，10，15，20，30，35，36，37，38，39，40，50，100或者更多的肽)包括一个具有至少一种PTS蛋白活性的结构域或者基元。另外，其他生物活性部分，其中蛋白质的其他部分已被删除，可以通过重组技术制备，并鉴定其此处描述的一种或者多种活性。优选的PTS蛋白的生物活性部分，含有一个或者多个挑选的具有生物活性的结构域/基元或者其部分。
PTS蛋白优选的通过重组DNA技术生产。例如，把编码蛋白质的核酸分子克隆到表达载体中(如上所述)，将表达载体引入宿主细胞(如上所述)并在宿主细胞中表达PTS蛋白。然后按照合适的纯化方案，使用标准蛋白质纯化技术，从细胞中分离PTS蛋白。除了重组表达，可以使用标准肽合成技术化学合成PTS蛋白、多肽或者肽。另外，天然PTS蛋白可以从细胞(例如内皮细胞)中分离，例如使用抗-PTS抗体，该抗体可以使用本发明的PTS蛋白或者其部分通过标准技术产生。
本发明也提供了PTS嵌合蛋白或者融合蛋白。如此处所用的，PTS“嵌合蛋白”或者“融合蛋白”含有可操作性连接到非PTS多肽上的PTS多肽。“PTS多肽”是指含有PTS相关氨基酸序列的多肽，而“非PTS蛋白”是指含有这样的蛋白质相关氨基酸序列的多肽，该蛋白质与PTS蛋白没有基本的同源性，例如，来自相同或者不同生物体的与PTS蛋白不同的蛋白质。在融合蛋白质中，术语“可操作性连接”的意思是指，PTS蛋白与非PTS蛋白相互之间是符合读框的融合。非PTS多肽可以融合到PTS多肽的N-末端或者C-末端。例如，在一个实施方案中，融合蛋白质是DST-PTS融合蛋白，其中PTS序列融合到GST序列的C-末端。该融合蛋白质有助于重组PTS蛋白的纯化。在另一个实施方案中，融合蛋白质是在其N-末端有异源信号序列的PTS蛋白。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列可以增加PTS蛋白的表达和/或分泌。
优选，本发明的嵌合蛋白或者融合蛋白通过标准重组DNA技术产生。例如，依照常规技术编码不同多肽序列的DNA片段被符合读框的连接在一起，例如，使用平头末端或者交错末端的末端连接，使用限制性酶进行消化以提供合适的末端，使用粘性末端补平作为合适的末端，使用碱性磷酸酶处理以避免不合需要的连接，以及使用酶促连接。在另一个实施方案中，可以使用常规技术包括自动DNA合成仪合成融合基因。另外，可以使用锚引物进行基因片段的PCR扩增，锚引物可以增加两条连续基因片段之间的互补的突出端，连续基因可以随后进行退火和再扩增而产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols inMolecular Biology，eds.Ausubel et al.John Wiley & Sons：1992)。另外，很多已经编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体是商业提供的。PTS-编码核酸可以被克隆到这种表达载体中，使得融合部分符合读框的连接到PTS蛋白上。
PTS蛋白的同源物可以通过突变产生，例如PTS蛋白的不连续点突变或者剪切。如此处所用的，术语“同源物”是指PTS蛋白的变体形式，它们可以用作PTS蛋白活性的激动剂或者拮抗物。PTS蛋白的激动剂可以基本上具有PTS蛋白相同的或者部分的生物活性。PTS蛋白的拮抗物可以抑制PTS蛋白天然存在形式的一种或者多种活性，例如，通过与包含PTS蛋白的PTS系统的下游或者上游成员竞争性结合。因此，本发明的谷氨酸棒杆菌PTS蛋白及其同源物，可以调节一条或者多条糖类转运途径的活性，或者调节PTS蛋白在该微生物中发挥作用的细胞内信号传导途径的活性。
在另外的实施方案中，PTS蛋白的同源物可以通过筛选PTS蛋白突变体的组合文库，例如剪切突变体，来鉴定PTS蛋白激动剂或者拮抗剂活性。在一个实施方案中，PTS变体的多样性文库通过在核酸水平上组合性突变而产生，并由多样性基因文库编码。PTS变体的多样性文库可以通过，例如，把合成的寡聚核苷酸混合物酶促连接到基因序列中，使得潜在PTS序列的简并集合作为单个多肽，或者其中含有PTS序列集合的更大的融合蛋白质(例如为了噬菌体展示)的集合，是可以表达的。有各种方法可以用于从简并寡聚核苷酸序列，产生潜在PTS同源物文库。可以用自动DNA合成仪进行简并基因序列的化学合成，然后合成基因被连接到合适的表达载体中。基因简并集合的使用，允许混合的提供编码所需潜在PTS序列集合的全部序列。合成简并寡聚核苷酸的方法在技术上是已知的(参见，例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。
另外，编码PTS蛋白片段的文库，可用于产生PTS片段的多样性群体，该群体用于筛选并挑选PTS蛋白的同源物。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可以这样产生，即在大约每分子只产生一个切口的条件下，用核酸酶处理PTS编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，复性DNA以形成双链DNA，该双链DNA可以包含从不同有切口的产物形成的有义/反义对，在重新形成的双螺旋中通过S1核酸酶处理除去单链部分，以及把最后得到的片段文库连接到表达载体中。通过该方法，可以得到编码N-末端、C-末端和不同大小PTS蛋白中间片段的表达文库。
筛选由点突变或者剪切得到的组合文库中的基因产物的许多技术，以及筛选cDNA文库中具有所挑选特性基因产物的技术，在技术上都是已知的。这些技术都适用于由PTS同源物组合突变得到的基因文库的快速筛选。筛选大型基因库的应用最广泛的技术，能够用于高产量分析，包括把基因组文库克隆到可复制表达载体中，用得到的载体文库转化载体文库，以及在一定条件下表达组合基因，在该条件下所需活性的检测有助于编码被检测产物基因的载体的分离。回归系综突变(REM)，一种增加文库中功能突变体频率的新技术，可以与筛选分析一起用于鉴定PTS同源物(Arkin and Yourvan(1992)PANS 89：7811-7815；Delgrave et al.(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。
在另一个实施方案中，使用技术上已知的方法，基于细胞的分析可以用于分析多样性PTS文库。
D.本发明的应用和方法
此处描述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同源物、融合蛋白质、引物、载体和宿主细胞，可以应用于下述一种或者多种方法中：鉴定谷氨酸棒杆菌和亲缘微生物；绘制谷氨酸棒杆菌亲缘生物体的基因组图谱；鉴定和定位谷氨酸棒杆菌的感兴趣序列；进化研究；确定PTS蛋白的功能必需区域；PTS蛋白活性调节；PTS途径活性调节；所需化合物，例如精细化学物质的细胞生产的调节。
本发明PTS核酸分子具有各种用途。首先，它们可以用于鉴定一种生物体是否是谷氨酸棒杆菌或者其近亲生物体。它们也可以用于鉴定混合微生物群体中谷氨酸棒杆菌或者其亲缘生物体的存在。本发明提供了许多谷氨酸棒杆菌基因的核酸序列；在严格条件下，使用跨越对谷氨酸棒杆菌特异基因的探针，探测从单一或者混合微生物培养物中提取的基因组DNA，可以确定该生物体是否存在。
尽管谷氨酸棒杆菌本身是非致病性的，但是它与致病种类相关，例如白喉棒杆菌。白喉棒杆菌是白喉的致病源，白喉是一种发展迅速、急性、发烧的感染，它涉及局部病状和系统病状。得这种疾病时，上呼吸道发生局部病变，并且包括上皮细胞坏死性损伤；细菌分泌毒素，毒素从病变处散布到身体易受感染的末梢组织。这些组织包括心脏、肌肉、外周神经、肾上腺、肾脏、肝脏和脾脏，在其中由于蛋白质合成被抑制而造成的变质性改变，会导致该疾病的系统病状。白喉在世界许多地区保持高发病率，这些地区包括非洲、亚洲、东欧和前苏联的独立国家。从1990年起，在后两个地区白喉的持续流行，导致了至少5,000人死亡。
在一个实施方案中，本发明与鉴定受试者中白喉棒杆菌存在或者活性的方法有关。该方法包括鉴定受试者中本发明的一条或者多条核酸或者氨基酸序列(例如，分别列在序列表中的奇数或者偶数序列号序列)，从而检测受试者中白喉棒杆菌的存在或者活性。谷氨酸棒杆菌和白喉棒杆菌是有亲缘关系的细菌，谷氨酸棒杆菌中的许多核酸和蛋白质分子是白喉棒杆菌中核酸和蛋白质分子的同源物，因此也可以用于检测受试者中的白喉棒杆菌。
本发明的核酸和蛋白质分子也可以用作基因组特定区域的标记。这不仅在绘制基因组图谱时有用，而且可以用于谷氨酸棒杆菌蛋白质功能研究。例如，为了鉴定特定谷氨酸棒杆菌DNA结合蛋白与之结合的基因组区域，可以消化谷氨酸棒杆菌基因组，将片段与DNA结合蛋白孵育。与蛋白质结合的片段可以进一步用本发明的核酸分子探测，优选使用易检测标记；这些核酸分子与基因组片段的结合，可以定位片段在谷氨酸棒杆菌基因组图谱上的位置，而且，当使用不同的酶进行多次操作时，有助于快速确定蛋白质与之结合的核酸序列。另外，本发明核酸分子可以与亲缘种类有充分的同源性，使得这些核酸分子可以作为构建亲缘细菌基因组图谱的标记，例如乳发酵短杆菌。
本发明的PTS核酸分子又可以用于进化和蛋白质结构研究。本发明分子参与的糖类摄取系统，被各种各样的细菌所使用；通过比较本发明核酸分子序列和那些在其他生物体中编码相似酶的核酸分子序列，可以估算生物体的进化相关性。类似的，这种比较允许估算保守序列区域和非保守序列区域，这可以有助于确定蛋白质中对于酶功能必需的区域。这种类型的确定对于蛋白质工程研究是有价值的，并且可以指示那些蛋白质可以忍受突变而不失去功能。
本发明PTS核酸分子的操作可以导致具有与野生型PTS蛋白不同功能的PTS蛋白的产生。可以提高这些蛋白质的效率或者活性，可以使之以比通常更多的数目出现在细胞中，或者降低其效率或者活性。
本发明提供了筛选可调节PTS蛋白活性的分子的方法，这些分子或者通过与蛋白质本身或者底物相互作用，或者与PTS蛋白的配偶体结合，或者通过调节本发明PTS核酸分子的转录或者翻译来调节PTS蛋白活性。在该方法中，表达一种或者多种PTS蛋白的微生物，与一种或者多种试验化合物接触，并且评估每种测试化合物对于PTS蛋白活性或者表达水平的作用。
本发明PTS分子可以被修饰，使得一种或者多种化学物质的产量、生产和/或生产效率得到提高。例如，通过修饰参与葡萄糖摄取的PTS蛋白使其活性得到优化，可以增加葡萄糖摄取量或者葡萄糖被转运进细胞的速率。细胞内葡萄糖和其他糖类的降解，提供能量推动能量不利的生化反应，例如那些涉及精细化学物质生物合成的反应。降解也提供了生物合成某些精细化学物质所必需的中间体或者前体分子，例如氨基酸、维生素和辅因子。通过修饰本发明PTS分子以增加细胞内高能碳分子的数量，从而可以既增加生产一种或者多种精细化学物质所必需的执行代谢途径的能量，又可以增加这种生产所需要的细胞内代谢物库。相反的，有些糖类的降解产物含有一种化合物，该化合物只用于这样的代谢途径，该途径因为酶、辅因子或者中间体而与用作产生所需精细化学物质的途径相互竞争，通过减少这些糖类的输入，可以负调节该途径。
另外，本发明的PTS分子可以参与一种或者多种细胞内信号传导途径，这些途径可以影响谷氨酸棒杆菌中一种或者多种精细化学物质的产量和/或生产效率。例如，一旦细胞内存在足够数量的糖类，从细胞外介质中输入一种或者多种糖类所必需的蛋白质(例如，HPr，Enzyme I，或者Enzyme II复合体中的一种成分)经常被翻译后修饰，从而使它们不能再把糖输入到细胞内。这样的一个实例出现在大肠杆菌中，细胞内1，6-二磷酸果糖的高水平，导致HPr丝氨酸-46的磷酸化，使该分子不能再参与任何糖类的转运。然而，在转运系统关闭的这一细胞内糖类水平，对于维持细胞的正常功能是足够的，这可能限制所需精细化学物质的过量生产。因此，这样修饰本发明的PTS蛋白是合乎需要的，即使得它们不再对这种负调节有效，从而允许可以达到一种或者多种糖类更高的细胞内浓度，并且，扩展一下，允许从含有这种突变PTS蛋白的生物体中得到一种或者多种精细化学物质更有效的生产或者更高的产量。
前面提到的导致所需化合物产量增加的PTS突变方案的列表，并不意味着仅局限于此；这些突变方案的变化对于熟悉技术的人来说是很明白的。经过这些机制，本发明的核酸和蛋白质分子可以用于产生表达突变PTS核酸和蛋白质分子的谷氨酸棒杆菌或者其亲缘菌株，从而增加所需化合物的产量、生产和/或生产效率。该所需化合物可以是谷氨酸棒杆菌的任何天然产物，这包括生物合成途径的最终产物和天然存在代谢途径的中间体，以及不是在谷氨酸棒杆菌代谢中天然存在但是由本发明谷氨酸棒杆菌菌株产生的分子。
本发明进一步由以下实例阐明，这些实例不应该被解释为仅局限于此。本申请中所引用的所有参考文献、专利申请、专利、发表的专利申请、表和序列列表中的内容，特此全部合并入参考文献。
                                        表1：本发明包括的基因磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统核苷酸    氨基酸 编号          毗连群  NT起始  NT终止                                                      功能SEQ ID NO SEQ ID NO1         2        RXS00315                             PTS系统，蔗糖-特异性IIABC成分(EIIABC-SCR)(蔗糖-通透酶IIABC成分(磷酸转移酶II，ABC成分)
                                                    (EC 2.7.1.69)3         4        F RXA00315    GR00053    6537 5452   PTS系统，BETA-糖苷-特异性IIABC成分(EIIABC-BGL)(BETA-糖苷-通透酶IIABC成分)(磷酸转移酶
                                                    II，ABC成分)(EC 2.7.1.69)5         6        RXA01503      GR00424    1039210640  PTS系统，BETA-糖苷-特异性IIABC成分(EIIABC-BGL)(BETA-糖苷-通透酶IIABC成分)(磷酸转移酶
                                                    II，ABC成分)(EC 2.7.1.69)7         8        RXN01299      VV0068     119549891   PTS系统，果糖-特异性IIBC成分(EC 2.7.1.69)9        10        F RXA01299    GR00375    6    446    PTS系统，果糖-特异性IIBC成分(EC 2.7.1.69)11       12        F RXA01883    GR00538    2154 2633   PTS系统，果糖-特异性IIBC成分(EC 2.7.1.69)13       14        F RXA01889    GR00540    77   631    PTS系统，果糖-特异性IIBC成分(EC 2.7.1.69)15       16        RXA00951      GR00261    564  172    PTS系统，甘露醇(隐秘)-特异性IIA成分(EIIA-(C)MTL)(甘露醇(隐秘)-通透酶IIA成分)(磷酸转移酶
                                                    II，A成分)(EC 2.7.1.69)17       18        RXN01244      VV0068     1414115844  磷酸烯醇丙酮酸-蛋白磷酸转移酶(EC 2.7.3.9)19       20        F RXA01244    GR00359    4837 3329   磷酸烯醇丙酮酸-蛋白磷酸转移酶(EC 2.7.3.9)21       22        RXA01300      GR00375    637  903    磷酸载体蛋白HPR23       24        RXN03002      VV0236     1437 1844   PTS系统，甘露醇(隐秘)-特异性IIA成分(EIIA-(C)MTL)(甘露醇(隐秘)-通透酶IIA成分)(磷酸转移酶
                                                    II，A成分)(EC 2.7.1.69)25       26        RXC00953      VV0260     1834 1082   PTS系统中的跨膜蛋白27       28        RXC03001                            PTS系统中的跨膜蛋白29       30        RXN01943      VV0120     4326 6374   PTS系统，葡萄糖-特异性IIABC成分(EC 2.7.1.69)31       32        F RXA02191    GR00642    3395 4633   磷酸烯醇丙酮酸糖类磷酸转移酶33       34        F RXA01943    GR00557    3944 3540   crr基因；磷酸转移酶系统葡萄糖-特异性酶III表2：GENBANK鉴定的基因
GenBankTM检索号  基因名称 基因功能 参考文献
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AB025424  acn 顺乌头酸酶
AB027714  rep 复制蛋白
AB027715  rep；aad 复制蛋白；氨基糖苷腺嘌呤基转移酶
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AF048764  argH 精氨琥珀酸裂合酶
AF049897  argC；argJ；argB；argD；argF；argR；argG；argH N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶；鸟氨酸乙酰转移酶；N-乙酰谷氨酸激酶；乙酰鸟氨酸transminase；鸟氨酸氨甲酰基转移酶；精氨酸阻遏物；精氨琥珀酸合酶；精氨琥珀酸裂合酶
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U43536 clpB 热激ATP-结合蛋白
U53587 aphA-3 3’5”-氨基糖苷磷酸转移酶
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X86157  argB；argC；argD；argF；argJ 乙酰谷氨酸激酶；N-乙酰-gamma-谷氨酰-磷酸还原酶；乙酰鸟氨酸转氨酶；鸟氨酸氨甲酰基转移酶；谷氨酸N-乙酰转移酶 Sakanyan，V.et al.“Genes and enzymes of the acetyl cycle of argininebiosynthesis in Corynebacterium glutamicum：enzyme evolution in the earlysteps of the arginine pathway，”Microbiology，142：99-108(1996)
X89084  pta；ackA 磷酸乙酰转移酶；乙酸激酶 Reinscheid，D.J.et al.“Cloning，sequence analysis，expression and inactivationof the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encodingphosphotransacetylase and acetate kinase，”Microbiology， 145：503-513(1999)
X89850  attB 附着位点 Le Marrec，C.et al.“Genetic characterization of site-specific integrationfunctions of phi AAU2 infecting“Arthrobacter aureus C70，”J.Bacteriol.，178(7)：1996-2004(1996)
X90356 启动子片段F1 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90357 启动子片段F2 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90358 启动子片段F10 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90359 启动子片段F13 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90360 启动子片段F22 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90361 启动子片段F34 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90362 启动子片段F37 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
GenBankTM检索号 基因名称 基因功能 参考文献
X90363 启动子片段F45 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90364 启动子片段F64 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90365 启动子片段F75 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90366 启动子片段PF101 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90367 启动子片段PF104 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X90368 启动子片段PF109 Patek，M.et al.“Promoters from Corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif，”Microbiology，142：1297-1309(1996)
X93513 amt 氨转运系统 Siewe，R.M.et al.“Functional and genetic characterization of the(methyl)ammonium uptake carrier of Corynebacterium glutamicum，”J.Biol Chem.，271(10)：5398-5403(1996)
X93514 betP 甘氨酸甜菜碱转运系统 Peter，H. et al.“Isolation，characterization，and expression of theCorynebacterium glutamicum betP gene，encoding the transport system for thecompatible solute glycine betaine，”J.Bacteriol.，178(17)：5229-5234(1996)
X95649 orf4 Patek，M.et al.“Identification and transcriptional analysis of the dapB-ORF2-dapA-ORF4 operon of Corynebacterium glutamicum，encoding two enzymesinvolved in L-lysine synthesis，”Biotechnol.Lett.，19：1113-1117(1997)
X96471 lysE；lysG 赖氨酸输出蛋白；赖氨酸输出调节蛋白 Vrljic，M.et al.“A new type of transporter with a new type of cellularfunction：L-lysine export from Corynebacterium glutamicum，”Mol.Microbiol.，22(5)：815-826(1996)
GenBankTM检索号 基因名称 基因功能 参考文献
X96580 panB；panC；xylB 3-甲基-2-氧丁酸羟甲基转移酶；泛酸-beta-丙氨酸连接酶；木酮糖激酶 Sahm，H.et al.“D-pantothenate synthesis in Corynebacterium glutamicum anduse of panBC and genes encoding L-valine synthesis for D-pantothenateoverproduction，”Appl.Environ Microbiol.，65(5)：1973-1979(1999)
X96962 插入序列IS1207和转座酶
X99289 延伸因子P Ramos，A.et al.“Cloning，sequencing and expression of the gene encodingelongation factor P in the amino-acid producer Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum ATCC 13869)，”Gene，198：217-222(1997)
Y00140  thrB 高丝氨酸激酶 Mateos，L.M.et al.“Nucleotide sequence of the homoserine kinase(thrB)geneof the Brevibacterium lactofermenturn，”Nucleic Acids Res.，15(9)：3922(1987)
Y00151  ddh 内消旋-二氨基庚二酸D-脱氢酶(EC1.4.1.16) Ishino，S.et al.“Nucleotide sequence of the meso-diaminopimelate D-dehydrogenase gene from Corynebacterium glutamicum，”Nucleic Acids Res.，15(9)：3917(1987)
Y00476  thrA 高丝氨酸脱氢酶 Mateos，L.M.et al.“Nucleotide sequence of the homoserine dehydrogenase(thrA)gene of the Brevibacterium lactofermentum，”Nucleic Acids Res.，15(24)：10598(1987)
Y00546  hom；thrB 高丝氨酸脱氢酶；高丝氨酸激酶 Peoples，O.P.et al.“Nucleotide sequence and fine structural analysis of theCorynebacterium glutamicum hom-thrB operon，”Mol.Microbiol.，2(1)：63-72(1988)
Y08964  murC；ftsQ/divD；ftsZ UPD-N-乙酰胞壁酸-丙氨酸连接酶；分裂起始蛋白或细胞分裂蛋白；细胞分裂蛋白 Honrubia，M.P.et al.“Identification，characterization，and chromosomalorganization of the ftsZ gene from Brevibacterium lactofermentum，”Mol.Gen.Genet.，259(1)：97-104(1998)
Y09163  putP 高亲和力脯氨酸转运系统 Peter，H.et al.“Isolation of the putP gene of Corynebacteriumglutamicumproline and characterization of a low-affinity uptake system forcompatible solutes，”Arch.Microbiol.，168(2)：143-151(1997)
Y09548  pyc 丙酮酸羧化酶 Peters-Wendisch，P.G.et al.“Pyruvate carboxylase from Corynebacteriumglutamicum：characterization，expression and inactivation of the pyc gene，”Microbiology，144：915-927(1998)
Y09578  leuB 3-异丙基苹果酸脱氢酶 Patek，M.et al.“Analysis of the leuB gene from Corynebacteriumglutamicum，”Appl.Microbiol.Biotechnol.，50(1)：42-47(1998)
Y12472 噬菌体Phi-16附着位点 Moreau，S.et al.“Site-specific integration of corynephage Phi-16：Theconstruction of an integration vector，”Microbiol.，145：539-548(1999)
GenBankTM检索号 基因名称 基因功能 参考文献
Y12537 proP 脯氨酸/ectoine吸收系统蛋白 Peter，H.et al.“Corynebacterium glutamicum is equipped with four secondarycarriers for compatible solutes：Identification，sequencing，and characterizationof the proline/ectoine uptake system，ProP，and the ectoine/proline/glycine
betaine carrier，EctP，”J.Bacteriol.，180(22)：6005-6012(1998)
Y1322l  glnA 谷氨酰胺合成酶I Jakoby，M.et al.“Isolation of Corynebacterium glutamicum glnA geneencoding glutamine synthetase I，”FEMS Microbiol.Lett.，154(1)：81-88(1997)
Y16642  lpd 二氢硫辛酰胺脱氢酶
Y18059 棒杆菌噬菌体304L附着位点 Moreau，S.et al.“Analysis of the integration functions of & phi；304L：Anintegrase module among corynephages，”Virology，255(1)：150-159(1999)
Z21501  argS；lysA 精氨酰-tRNA合成酶；二氨基庚二酸脱羧酶(部分) Oguiza，J.A.et al.“A gene encoding arginyl-tRNA synthetase is located in theupstream region of the lysA gene in Brevibacterium lactofermentum：Regulation of argS-lysA cluster expression by arginine，”J.Bacteriol.，175(22)：7356-7362(1993)
Z21502  dapA；dapB 二氢2，6-吡啶二羧酸合酶；二氢2，6-吡啶二羧酸还原酶 Pisabarro，A.et al.“A cluster of three genes(dapA，orf2，and dapB)ofBrevibacterium lactofermentum encodes dihydrodipicolinate reductase，and athird polypeptide of unknown function，”J.Bacteriol.，175(9)：2743-2749(1993)
Z29563  thrC 苏氨酸合酶 Malumbres，M.et al.“Analysis and expression of the thrC gene of the encodedthreonine synthase，”Appl.Environ Microbiol.，60(7)2209-2219(1994)
Z46753  16S rDNA 16S核糖体RNA基因
Z49822  sigA SigA sigma因子 Oguiza，J.A.et al“Multiple sigma factor genes in Brevibacteriumlactofermentum：Characterization of sigA and sigB，”J.Bacteriol.，178(2)：550-553(1996)
Z49823  galE；dtxR UDP-半乳糖4-表异构酶催化活性；白喉毒素调节蛋白 Oguiza，J.A.et al“The galE gene encoding the UDP-galactose 4-epimerase ofBrevibacterium lactofermentum is coupled transcriptionally to the dmdRgene，”Gene，177：103-107(1996)
Z49824  orf1；sigB ？；SigB sigma因子 Oguiza，J.A.et al“Multiple sigma factor genes in Brevibacteriumlactofermentum：Characterization of sigA and sigB，”J.Bacteriol.，178(2)：550-553(1996)
Z66534 转座酶 Correia，A.et al.“Cloning and characterization of an IS-like element present inthe genome of Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869，”Gene，170(1)：91-94(1996)
1该基因序列在所列参考文献中已经公开。但是，本发明获得的序列明显较公开序列长。推测公开的序列起始密码子错误，因此仅为实际编码区的一个片段。
表3：可用于实施本发明的棒杆菌和短杆菌菌株
Figure A0081216500631
短杆菌 乳发酵短杆菌   21086
短杆菌 乳发酵短杆菌   31269
短杆菌 扩展短杆菌   9174
短杆菌 扩展短杆菌   19391
短杆菌 扩展短杆菌   8377
短杆菌 解石蜡短杆菌   11160
短杆菌 种  717.73
短杆菌 种  717.73
短杆菌 种   14604
短杆菌 种   21860
短杆菌 种   21864
短杆菌 种   21865
短杆菌 种   21866
短杆菌 种   19240
棒杆菌 嗜乙酰乙酸棒杆菌   21476
棒杆菌 嗜乙酰乙酸棒杆菌   13870
棒杆菌 醋谷棒杆菌 B11473
棒杆菌 醋谷棒杆菌 B11475
棒杆菌 醋谷棒杆菌   15806
棒杆菌 醋谷棒杆菌   21491
棒杆菌 醋谷棒杆菌   31270
棒杆菌 嗜乙酰棒杆菌 B3671
棒杆菌 产氨棒杆菌   6872  2399
棒杆菌 产氨棒杆菌   15511
棒杆菌 fujiokense   21496
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   14067
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   39137
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21254
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21255
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   31830
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   13032
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   14305
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   15455
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   13058
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   13059
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   13060
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21492
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21513
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21526
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21543
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   13287
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21851
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21253
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21514
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21516
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21299
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21300
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   39684
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21488
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   21649
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21650
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19223
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    13869
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21157
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21158
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21159
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21355
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    31808
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21674
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21562
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21563
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21564
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21565
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21566
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21567
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21568
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21569
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21570
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21571
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21572
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21573
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21579
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19049
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19050
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19051
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19052
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19053
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19054
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19055
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19056
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19057
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19058
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19059
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19060
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    19185
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    13286
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21515
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21527
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21544
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21492
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   B8183
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   B8182
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   B12416
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   B12417
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   B12418
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌   B11476
棒杆菌 谷氨酸棒杆菌    21608
棒杆菌 百合棒杆菌 P973
棒杆菌 nitrilophilus    21419   11594
棒杆菌 种 P4445
棒杆菌 种 P4446
棒杆菌 种   31088
棒杆菌 种   31089
棒杆菌 种   31090
棒杆菌 种   31090
棒杆菌 种   31090
棒杆菌 种   15954  20145
棒杆菌 种   21857
棒杆菌 种   21862
棒杆菌 种   21863
ATCC：美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，USA
FERM：发酵研究所，Chiba，日本
NRRL：农业研究机构保藏中心，北方区域研究实验室，Peoria，IL，USA
CECT：西班牙典型培养物保藏中心，Valencia，西班牙
NCIMB：国立工业和海洋微生物保藏中心，Aberdeen，UK
CBS：真菌菌种保藏中心，Baarn，NL
NCTC：国立典型培养物保藏中心，London，UK
DSMZ：德意志微生物保藏中心，Braunschweig，德国
可参见Sugawara，H.et al.(1993)World directory of collections ofcultures of microorganisms：
Bacteria，fungi and yeasts(4th edn)，World federation for culture collections world data center on
microorganisms，Saimata，Japen.
                                                          表4：序列比较结果ID#        Genbank命中结果         长度     检索号     Genbank命中结果名称                                                   Genbank命中结果          ％           入库日
       (NT)                                        来源                                                                                           同源性
                                                                                                                                                  (GAP)rxa00315   1527 GB_BA1：AB007125   4078     AB007125   Serratia marcescens slaA gene for surface layer protein，complete     Serratia marcescens      40,386       26-MAR-1998
                                                   cds， isolate 8000.
            GB_IN1：CELC47D2   17381    U64861     Caenorhabditis elegans cosmid C47D2.                                  Caenorhabditis elegans   36,207       28-Jul-96
            GB_HTG2：AC006732  159453   AC006732   Caenorhabditis elegans clone Y32G9，*** SEQUENCING IN                Caenorhabditis elegans   36,436       23-Feb-99
                                                   PROGRESS ***，9 unordered pieces.rxa01503    372 GB_PR3：AC005019   188362   AC005019   Homo sapiens BAC clone GS250A16 from 7p21-p22， complete              Homo sapiens             39,722       27-Aug-98
            GB_GSS12：AQ390040 680      AQ390040   RPCI11-157C9.TJ RPCI-11 Homo sapiens genomic clone RPCI-              Homo sapiens             43,137       21-MAY-1999
                                                   11-157C9，genomic survey sequence.
            GB_GSS5：AQ784231  542      AQ784231   HS_3087_B1_C10_T7C CIT Approved Human Genomic Sperm                   Homo sapiens             37,643       3-Aug-99
                                                   Library D Homo sapiens genomic clone Plate＝3087 Col＝19
                                                   Row＝F， genomic survey sequence.rxa01299   2187 GB_EST38：AW047296 614      AW047296   UI-M-BH1-amh-e-03-0-UI.s1 NIH_BMAP_M_S2 Mus musculus                  Mus musculus             41,475       18-Sep-99
                                                   cDNA clone UI-M-BH1-amh-e-03-0-UI 3′，mRNA sequence.
            GB_RO：AB004056    1581     AB004056   Rattus norvegicus mRNA for BarH-class homeodomain                     Rattus norvegicus        41,031       2-Sep-98
                                                   transcription factor，complete cds.
            GB_RO：AB004056    1581     AB004056   Rattus norvegicus mRNA for BarH-class homeodomain                     Rattus norvegicus        40,717       2-Sep-98
                                                   transcription factor， complete cds.rxa00951    416 GB_BA1：SCJ21      31717    AL109747   Streptomyces coelicolor cosmid J21.                                   Streptomyces coelicolor  34,913       5-Aug-99
                                                                                                                         A3(2)
            GB_VI：MCU68299    230278   U68299     Mouse cytomegalovirus 1 complete genomic sequence.                    Mouse cytomegalovirus 1  40,097       04-DEC-1996
            GB_VI：U93872      133661   U93872     Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus glycoprotein M，DNA          Kaposi′s sarcoma-       36,029       9-Jul-97
                                                   replication protein，glycoprotein，DNA replication protein，FLICE     associated herpesvirus
                                                   inhibitory protein and v-cyclin genes，complete cds，and tegumentrxa01244   1827 GB_BA1：AFAPHBHI   4501     M69036     Alcaligenes eutrophus protein H(phbH)and protein I(phbl)              Ralstonia eutropha       45,624       26-Apr-93
                                                   genes，complete cds.
            GB_PR3：HSJ836E13  78055    AL050326   Human DNA sequence from clone 836E13 on chromosome 20                 Homo sapiens             37,303       23-Nov-99
                                                   Contains ESTs，STS and GSSs，complete sequence.
            GB_EST24：AI170227 409      AI170227   EST216152 Normalized rat lung， Bento Soares Rattus sp. cDNA          Rattus sp.               39,098       20-Jan-99
                                                   clone RLUCF56 3′end，mRNA sequence.rxa01300    390 GB_PR3：HUMDODDA   26764    L39874     Homo sapiens deoxycytidylate deaminase gene，complete cds.            Homo sapiens             37,644       11-Aug-95
            GB_PAT：I40899     26764    I40899     Sequence 1 from patent US 5622851.                                    Unknown.                 37,644       13-MAY-1997
            GB_PAT：I40900     1317     I40900     Sequence 2 from patent US 5622851.                                    Unknown.                 37,644       13-MAY-1997rxa00953    789 GB_BA1：SCJ21      31717    AL109747   Streptomyces coelicolor cosmid J21.                                   Streptomyces coelicolor  39,398       5-Aug-99
                                                                                                                         A3(2)
            GB_BA1：BLTRP      7725     X04960     Brevibacterium lactoferrnentum tryptophan operon.                     Corynebacterium          39,610       10-Feb-99
                                                                                                                         glutamicum
            GB_PAT：E01375     7726     E01375     DNA sequence of tryptophan operon.                                    Corynebacterium          46,753       29-Sep-97
                                                                                                                         glutamicum
                                                                           表4(续)rxa01943  2172 GB_BA1：CORPTSMA  2656  L18874    Corynebacterium glutamicum phosphoenolpyruvate sugar     Corynebacterium  100,000  24-Nov-94
                                               phosphotransferase(ptsM)mRNA，complete cds.              glutamicum
             GB_BA1：BRLPTSG   3163  L18875    Brevibacterium lactofermentum phosphoenolpyruvate sugar  Brevbacterium     84,963  01-OCT-1993
                                               phosphotransferase(ptsG)gene，complete cds.              lactofermentum
             GB_BA2：AF045481  2841  AF045481  Corynebacterium ammoniagenes glucose permease(ptsG)gene，Corynebacterium   53,558   29-Jul-98
                                               complete cds.                                            amrnoniagenes
实施例
实施例1：谷氨酸棒杆菌ATCC 13032全部基因组DNA的制备
谷氨酸棒杆菌(ATCC 13032)培养物在BHI培养基(Difco)中，30℃剧烈振荡培养过夜。离心收集细胞，弃上清，细胞重新悬浮在5ml缓冲液I(培养物原体积的5％-所有指出的体积都是对于100ml培养物体积计算的)中。缓冲液I的组成：140.34g/l蔗糖，2.46g/lMgSO4×7H2O，10ml/l KH2PO4溶液(100g/l，KOH调节至PH6.7)，50g/l M12浓缩物(10g/l(NH4)2SO4，1g/l NaCl，2g/l MgSO4×7H2O，0.2g/l CaCl2，0.5g/l酵母提取物(Difco))，10ml/l微量元素混合物(200mg/lFeSO4×H2O，10mg/l ZnSO4×7H2O，3mg/l MnCl2×4H2O，30mg/l H3BO3，20mg/l CoCl2×6H2O，1mg/l NiCl2×6H2O，3mg/l Na2MoO4×2H2O)，500mg/l络合剂(EDTA或者柠檬酸)，100ml/l维生素混合物(0.2mg/l生物素，0.2mg/l叶酸，20mg/l p-氨基安息香酸，20mg/l核黄素，40mg/lpanthothenate，140mg/l烟酸，40mg/l盐酸吡多醛，200mg/l肌醇)。悬浮液中加入溶菌酶至终浓度2.5mg/ml。37℃孵育大约4小时之后，细胞壁被降解，得到的原生质体用离心收集。沉淀用5ml缓冲液I洗一次，用5ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1ml EDTA，pH8)洗一次。沉淀用4ml TE缓冲液重悬，并加入0.5ml SDS溶液(10％)和0.5mlNaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至终浓度200g/ml，悬浮液在37℃孵育约18小时。DNA用苯酚、苯酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇按照标准程序提取纯化。然后，加入1/50体积的3M乙酸钠和2倍体积的乙醇，在-20℃孵育30分钟，用使用SS34转头(Sorvall)的高速离心机12,000rpm离心30分钟，沉淀DNA。把DNA溶解在含有20g/ml RNaseA的1ml TE缓冲液中，在1000ml TE缓冲液中4℃透析至少3小时。这段时间中，更换缓冲液3次。每0.4ml透析的DNA溶液中，加入0.4ml2M LiCl和0.8ml乙醇。在-20℃孵育30分钟后，离心(13,000rpm，Biofuge Fresco，Heraeus，Hanau，Germany)收集DNA。DNA沉淀融解在TE缓冲液中。按该程序制备的DNA可以用于所有目的，包括southern杂交和基因组文库的构建。
实施例2：在大肠杆菌中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组文库的构建
使用如在实施例1中所描述制备的DNA，按照已知的和充分建立的方法(参见，例如Sambrook，J.et al.(1989)“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，或者Ausubel，F.M.et al.(1994)“Current Protocols inMolecular Bilogy”，John Wiley & Sons.)，可以构建粘粒文库和质粒文库。
可以使用任何质粒和粘粒。质粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3737-3741)；pACY177(Change & Cohen(1978)J.Bacteriol 134：1141-1156)，pBS系列质粒(pBSSK+，pBSSK-和其他质粒；Stratagene，LaJolla，USA)，粘粒SuperCos1(Stratagene，LaJolla，USA)或者Lorist6(Gibson，T.J.，Rosenthal A.and Waterson，R.H.(1987)Gene 53：283-286)可以用于特殊用途。专门在谷氨酸棒杆菌中使用的基因文库可以用质粒pSL109(Lee，H.-S.and A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4：256-263)构建。
实施例3：DNA测序和计算机功能分析
按照标准方法，使用如在实施例2中所描述基因组文库，可以进行DNA测序，特别是用使用ABI377测序仪的链终止方法(参见，例如Fleischman，R.D.et al.(1995)“Whole-genome Random Sequencing andAssembly of Haemophilus Influenzae Rd.，Science，269：496-512)。使用具有以下核苷酸序列的测序引物：5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’或者5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。
实施例4：体内突变
可以通过大肠杆菌或者其他微生物(例如，芽孢杆菌某些菌或者像是酿酒酵母的酵母)的质粒(或者其他载体)DNA的传代，进行谷氨酸棒杆菌的体内突变，其中这些微生物保持其遗传信息整体性的能力已被损伤。典型的突变株，在DNA修复系统的基因中有突变(例如，mutHLS，mutD，mutT等；参考文献参见Rupp，W.D.(1996)DNA repairmechanisms，in：Escherichia coli and Salmonella，p.2277-2294，ASM：Washington.)。这些菌株对于技术熟练的人来说是熟知的。这些菌株的使用阐述在，例如Greener，A.and Callahan，M.(1994)Strategies 7：32-34中。
实施例5：在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间传递的DNA
棒杆菌和短杆菌菌种含有能自发复制的内源质粒(像是例如，pHM1519或者pBL1)(评论参见，例如，Martin，J.F.et al.(1987)Biotechnology，5：137-146)。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭载体，可以使用大肠杆菌的标准载体容易的构建(Sambrook，J.et al.(1989)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press或者Ausubel，F.M.et al.(1994)“Current Protocols in Molecular Bilogy”，John Wiley & Sons.)，即在其中加入谷氨酸棒杆菌的复制叉起始点和合适的标记。这种复制起始点，优选是从棒杆菌和短杆菌菌种中分离的内源质粒获得的。用作这些菌种转化标记这一特殊用途的是卡那霉素抗性基因(例如来自Tn5或者Tn903转座子的那些卡那霉素抗性基因)或者氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)“From Genes to Clones-Introduction to GeneTechnology，VCH，Weinheim)。在构建各种野生型穿梭载体的文献中有许多实例，这些穿梭载体可以在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制，并且可以用于各种目的，其中包括基因过量表达(参考文献参见，例如，Yoshihama，M.et al.(1985)J.Bacteriol.162：591-597，Martin J.F.et al.(1987)Biotechnology，5：137-146和Eikmanns，B.J.et a；.(1991)Gene，102：93-98)。
使用标准方法可以把感兴趣的基因克隆到上述穿梭载体中，并且可以把该杂交载引入谷氨酸棒杆菌菌株中。谷氨酸棒杆菌的转化可以通过原生质体转化(Kastsumata，R.et al.(1984)J.Bacteriol.159306-311)，电传孔(Liebl，E.et al.(1989)FEMS Microbiol.Letters，53：399-303)实现，当使用特殊的载体时，也可以通过结合作用(例如在Schfer，A etal.(1990)J.Bacteriol.172：1663-1666)实现。也可以通过从谷氨酸棒杆菌制备质粒DNA(使用技术上已知的标准方法)并将其转化到大肠杆菌中，而把穿梭载体从谷氨酸棒杆菌转移到大肠杆菌。这一转化步骤可以使用标准方法进行，但是使用Mcr缺陷型大肠杆菌菌株，例如NM522(Gough & Murray(1983)J.Mol.Biol.166：1-19)是有利的。
使用含有pCG1(U.S.Patent No.4,617,267)或者其片段的质粒，并且可以选择来自TN903的卡那霉素抗性基因(Grindley，N.D.andJoyce，C.M.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(12)：7176-7180)，就可以在谷氨酸棒杆菌中过量表达基因。另外，使用质粒pSL109(Lee，H.-S.and A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4：256-263)也可以在谷氨酸棒杆菌中过量表达基因。
除了使用可复制质粒以外，也可以通过基因组整合而实现基因的过量表达。谷氨酸棒杆菌或者其他棒杆菌或者短杆菌菌种的基因组整合，可以通过熟知的方法实现，例如基因组区域的同源重组，限制性核酸内切酶介导的整合(REMI)(参见例如，DE Patent 19823834)，或者通过使用转座子。也可以通过修饰调节区域(例如，启动子、阻抑物和/或增强子)，通过使用定向位点方法(例如同源重组)或者基于随机事件方法(例如转座子突变或者REMI)的序列修饰、插入或者缺失，来调节感兴趣基因的活性。用作转录终止子的核酸序列，也可以被插入到本发明一个或者多个基因编码区域的3’；这样的终止子在技术上是熟知的，并且描述在例如Winnacker，E.L.(1987)From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology.VCH：Weinheim中。
实施例6：突变蛋白质表达的估算
被转化宿主细胞中突变蛋白质活性的观测，依赖于这一事实，即突变蛋白质以与野生型蛋白质相似的方式和相似的数量表达。确定突变基因转录水平(用于基因产物翻译的mRNA的数量指标)的一种有用的方法是进行Northern杂交(参考文献参见，例如，Ausubel et al.(1988)Current Protocols in Molecular Biology，Wiley：New York)，其中设计的用于结合感兴趣基因的引物标记有可探测的标记(通常是放射性的或者化学发光的)，从而，当生物体培养物的全部RNA被提取出，跑凝胶电泳，转移到稳定介质上并与该探针孵育，结合探针的结合和数量便指示了该基因mRNA的存在和数量。该信息是突变基因转录程度的证据。可以使用几种方法从谷氨酸棒杆菌中制备全部细胞RNA，这在技术上是熟知的，例如描述在Bormann，E.R.et al.(1992)Mol.Microbiol.6：317-326中的。
为了估算由该mRNA翻译的蛋白质的存在和相对数量，可以使用标准技术，例如Wesstern杂交(参见，例如，Ausubel et al.(1988)CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley：New York)。在该方法中，提取全部细胞蛋白质，通过凝胶电泳分离，转移到像是硝酸纤维素这样的介质上，和与所需蛋白质特异结合的探针共孵育，例如抗体。该探针通常标记有易于检测的化学发光的或者比色的标记。观测到的标记的存在和数量，指示了出现在细胞中的所需突变蛋白质的存在和数量。
实施例7：遗传修饰的谷氨酸棒杆菌的生长-介质和培养条件
遗传修饰的谷氨酸棒杆菌可以培养在合成或者天然生长培养基中。用于谷氨酸棒杆菌的各种不同的生长培养基是已知的并且是易于得到的(Lieb，et al.(1989)Appl.Microbiol.Biotechno.，32：205-210；von derOsten et al.(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；Patent DE 4,120,867；Liebl(1992)“The Genus Corynebacterium，in：Procaryotes，Volume II，Balows，A.et al.，eds.Springer-Verlag)。这些培养基含有一种或者多种碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素。优选的碳源是糖类，例如单糖、二糖或者多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖，棉子糖，淀粉或者纤维素，都可用作很好的碳源。也可以通过复杂化合物向培养基提供糖类，例如糖蜜或者其他糖类精炼的副产物。提高不同碳源的混合物也是有利的。其他可用的碳源有酒精和有机酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或者乳酸。氮源通常是有机或者无机的氮化合物，或者含有这些化合物的物质。代表性的氮源包括氨气或者铵盐，例如NH4Cl或者(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复杂的氮源，例如玉米浸泡液、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉类提取物或者其他。
可以包含在培养基中的无机盐化合物，包括盐酸盐、磷酸盐或者硫酸盐的钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜或者铁。螯合剂可以加到培养基中，以维持溶液中的金属离子。特别有用的螯合剂包括二羟基苯酚，像是儿茶酚和原儿茶酸，或者有机酸，像是柠檬酸。培养基典型的也含有生长因子，例如维生素和生长促进剂，它们的实例包括生物素、核黄素、硫胺、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡多醇。生长因子和盐经常来自复杂的培养基成分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浸泡液和其他成分。培养基化合物的确切组成强烈的依赖于直接实验，而且对于每一个具体情况具体决定。关于培养基最优化的信息通过在教科书“AppliedMicrobiol.Physiology，A Practical Approach”(eds.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp.53-73，ISBN 0 19 963577 3)”中。也可以从商业供应商那里选择生长培养基，像是standard 1(Merck)或者BHI(grain heart infusion，DIFCO)或者其他的。
所有培养基组分都要通过加热(1.5bar，120℃，20分钟)或者无菌过滤灭菌。组分可以一起灭菌，或者如果必要的话分开单独灭菌。所有的培养基组分可以在生长的开始就加入，或者可以选择连续性或者分批加入。
培养条件对每个实验分别确定。温度应该在15℃到45℃范围内。温度可以保持恒定，或者在实验中改变。培养基的pH在5到8.5范围内，优选的在大约7.0，并且可以通过培养基中缓冲液的添加来维持。针对这一目的有代表性的缓冲液是磷酸钾缓冲液。合成缓冲液，例如MOPS、HEPES、ACES以及其他的，也可以代替使用或者同时使用。也可以在生长过程中通过添加NaOH或者NH4OH，以维持稳定的培养pH。如果使用像是酵母提取物这样的复杂培养基组分，可以减少添加缓冲液的必要性，这是因为许多复杂化合物具有很强的缓冲能力这一事实。如果使用发酵罐培养微生物，也可以使用氨气控制pH。
孵育时间通常在几小时到几天范围内。这一时间的选取是为了允许在液体培养基中积累最大量的产物。公布的生长实验可是在各种容器中进行，例如微量滴定板、玻璃试管、玻璃摇瓶或者不同大小的玻璃或者金属的发酵罐。为了筛选大量的克隆，微生物应该培养在有挡板或者没有挡板的微量滴定板、玻璃试管或者摇瓶中。优选的使用100ml摇瓶，加入10％(体积)的所需培养基。摇瓶应该放在摇床上摇动(振幅25毫米)，速度范围100-300rpm。可以通过保持湿润的空气减少蒸发损失；或者，对蒸发损失进行数学修正。
如果要检测遗传修饰的克隆，那么也应该检测未经修饰的对照克隆或者含有基本质粒但没有任何插入的对照克隆。使用生长在琼脂板上30℃孵育的细胞，例如CM平板(10g/l葡萄糖，2.5g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l多胨，5g/l酵母提取物，5g/l肉汁提取物，22g/l琼脂，2MNaOH调至pH 6.8)，接种培养基至OD600值为0.5-1.5。培养基的接种可以通过引入来自CM平板的谷氨酸棒杆菌细胞的盐悬浮液，或者通过加入该细菌的液体预培养物实现。
实施例8：突变蛋白质功能的体外分析
酶的活性和动力学参数的测定在技术上是已经很好建立了的。任何对给定的经过改变的酶的活性测定实验，必须适合野生型酶的特殊活性，这完全在技术熟练者的能力之内。关于酶的概括评论，以及关于结构、动力学、原理、方法、应用和确定许多酶活性实例的明确细节，可以在例如以下参考文献中找到：Dixon，M.，and Webb，E.C.，(1979)Enzymes.Longmans：London；Fersht，(1985)Enzyme Structure and Mechanism.Freeman：New York；Walsh，(1979)Enzymatic Reaction Mechanisms.Freeman：SanFrancisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)Fundamentals of Enzymology.OxfordUniv.Press：Oxford；Boyer，P.D.，ed.(1983)The Enzymes，3rd ed.Academic Press：New York；Bisswanger，H.，(1994)Enzymkinetik，2nd ed.VCH：Weinheim(ISBN3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.，eds.(1983-1986)Methods of Enzymatic Analysis，3rd ed.，vol.I-XII，Verlag Chemie：Weinheim；andUllmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(1987)vol.A9，“Enzymes”.VCH：Weinheim，p.352-363。
结合DNA的蛋白质的活性可以通过几种技术上已知的方法测定，例如DNA条带移位分析(也称作凝胶阻滞分析)。这些蛋白质对其他分子表达的作用，可以用报告基因分析测定(例如描述在Kolmar，H.etal.(1995)EMBO J.14：3895-3904中的，及其引用的参考文献)。报告基因测试系统是已知的，并且在原核和真核细胞中的应用都已建立，使用像是beta-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和几种其他蛋白质这样的酶。
膜转运蛋白质活性的测定可以根据例如描述在Gennis，R.B.(1989)“Pores，Channels and Transporters”，in Biomembrane，Molecular Structureand Function，Springer：Heidelberg，p.85-137；199-234；and 270-322中的那些技术进行。
实施例9：突变蛋白质对于所需产物生产的效果的分析
谷氨酸棒杆菌遗传修饰对于所需化合物(例如氨基酸)生产的作用，可以这样估计，即通过合适条件下(例如以上描述的那些)生长已修饰的微生物，并且分析增加所需产物(例如，氨基酸)生产的培养基和/或细胞组分。这些分析技术对于熟练常规技术者来说是熟知的，包括光谱分析、薄层层析、各种染色方法、酶促方法和微生物方法，以及像是高效液相色谱(Ullman，Encyclopedia of Industrial Chemistry，vol.A2，p.89-90 and p.443-613，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.et al.，(1987)“Applications of HPLC in Biochemistry”in：Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，vol.17；Rehm et al.(1993)Biotechnology，vol.3，Chapter III：“Product recovery and purification”，page 469-714，VCH：Weinheim；Belter，P.A.et al.(1988)Bioseparations：downstream processing forbiotechnology，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.and Cabral，J.M.S.(1992)Recovery processes for biological materials，John Wiley and Sons；Shaeiwitz，J.A.and Henry，J.D.(1988)Biochemical separations，in：Ulmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，vol.B3，Chapter 11，page 1-27，VCH：Weinheim；andDechow，F.J.(1989)Separation and purification techniques in biotechnology，Noyes Publications)这样的分析层析。
除了对最终发酵产物的测定，也可以对用于所需化合物生产的代谢途径的其他组分进行分析，例如中间体和副产物，以确定生物体的生产能力、产量、和/或化合物的生产效率。分析方法包括培养基中营养物水平(例如，糖类、烃、氮源、磷酸以及其他离子)的测定，生物量组成和生长的测定，生物合成途径常见代谢产物的生产的分析，以及对发酵中产生气体的测定。这些测定的标准方法略述在Applied MicrobialPhysiology，A Practical Approach，P.M.Rhodes and P.F.Stanbury，eds.，IRL Press，p.103-163；and 165-192(ISBN：0199635773)及其引用的参考文献中。
实施例10：谷氨酸棒杆菌培养物中所需产物的纯化
从谷氨酸棒杆菌细胞中或者上述培养基的上清中回收所需产物，可以通过技术上已知的各种方法进行。如果所需产物不是细胞分泌的，那么可以通过低速离心从培养基中收集细胞，用标准技术裂解细胞，例如机械力或者超声波。离心除去细胞碎片，保留含有可溶蛋白的上清部分用于进一步纯化所需化合物。如果产物是从谷氨酸棒杆菌细胞分泌的，那么用低速离心从培养基中除去细胞，保留上清部分用于进一步纯化。
任何一种纯化方法得到的上清部分，用合适的树脂进行层析，所需分子被层析树脂保留，而样品中的很多杂质不被保留，或者杂质被树脂保留，而样品不被保留。使用相同或者不同的层析树脂，可以根据需要重复这一层析步骤。熟悉常规技术者可以非常熟练的选择合适的层析树脂，并且熟知这些树脂对于待纯化特定分子最有效的应用。纯化的产物可以用过滤或者超滤浓缩，并且贮存在产物稳定性最大的温度下。
技术上已知的纯化方法非常多，前述的纯化方法并不意味着仅仅局限于此。这些纯化方法描述在，例如Bailey，J.E.& Ollis，D.F.Biochmical Engineering Fundamentals，McGraw-Hill：New York(1986)中。
分离化合物的特性和纯度，可以技术上的标准技术估计。这包括高效液相色谱(HPLC)、分光方法、染色方法、薄层层析、NIRS、酶促方法或者微生物方法。这些分析方法在以下文献中有评论：Patek et al.(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova et al.(1996)Biotekhnologiya 11：27-32；and Schmidt et al.(1998)Bioprocess Engineer.19：67-70.Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，(1996)vol.A27，VCH：Weinheim，p.89-90，p.521-540，p.540-547，p.559-566，575-581 and p.581-587；Michal，G.(1999)Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry andMolecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.et al.(1987)Applications ofHPLC in Biochemistry in：Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，vol.17。
实施例11：本发明基因序列的分析
序列比较和两条序列之间同源性百分比的测定，是技术上已知的技术，可以使用数学运算法则完成，例如Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中的运算法则，该运算法则在Karlinand Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中有修改。该运算法则被整合在Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST核苷酸搜寻可以用NBLAST程序进行，score＝100，wordlength＝12，可以得到与本发明PTS核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜寻可以用XBLAST程序进行，score＝50，wordlength＝3，可以得到与本发明PTS蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较的目的，为了获得有间隙的序列对比，可以使用描述在Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，熟悉常规技术者知道对于特定的待分析序列如何优化程序(例如，XBLAST和NBLAST)的参数。
用于序列比较的另一个数学运算法则实例是，Meyers和Miller运算法则((1998)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)。该运算法则被整合在ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列序列对比软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表、间隙长度处罚12、间隙处罚4。其他的序列分析运算法则在技术上也是已知的，包括ADVANCE和ADAM，叙述在Torelli and Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.10：3-5中；和FASTA，叙述在Pearson andLipman(1998)P.N.A.S.85：2444-8中。
两条氨基酸序列之间的百分比同源性也可以使用GCG软件包(http：//www.gcg.com有提供)中的GAP程序实现，使用Blosum 62矩阵或者PAM 250矩阵，间隙分量12、10、8、6或者4，长度分量2、3或者4。两条核酸序列之间的百分比同源性可以使用GCG软件包中的GAP程序实现，使用标准参数，例如间隙分量50和长度分量3。
本发明基因序列与Genbank中序列之间的比较分析，可以使用技术上已知的技术进行(参见，例如，Bexevanis and Ouellette，eds.(1998)Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins.John Wiley and Sons：New York)。本发明基因序列，通过三个步骤的方法与Genbank中的序列进行比较。在第一步中，对本发明的每一条序列相对Genbank中的核苷酸序列进行BLASTN分析(例如，本地序列对比分析)，保留最高的500个匹配作进一步分析。然后对这500个匹配作FASTA搜寻(例如，本地与全世界的组合序列对比分析，在其中对限定的序列区域进行序列对比)。接下来，对本发明的每条基因序列与FASTA的三个最高匹配，使用GCG软件包中的GAP程序(使用标准参数)进行全世界序列对比。为了得到正确结果，从Genbank选出的序列长度，使用技术上熟知的方法调节为查询序列的长度。该分析的结果列在表4中。虽然这样得到的结果，与对本发明每条基因相对于Genbank每条对照所进行的单独GAP(全世界)分析得到的结果，是一致的，但是相对于大数据库的GAP(全世界)分析来说，所需的计算时间大大减少。没有得到截止值以上序列对比的本发明序列，在表4中表明，缺少序列对比信息。熟悉常规技术者能够深一层的理解，在表4中列出的标题“％homology(GPA)”下的GAP序列对比同源性百分比，是以欧洲数字格式列出的，其中‘，’代表十进制点。例如，该列中的值“40,345”代表“40.345％”。
实施例12：DNA微阵列的构建和操作
本发明的序列还可以用于DNA微阵列(DNA阵列的设计、方法和应用技术上是熟知的，描述在，例如，Schena，M.te al.(1995)Science 270：467-470；Wodicka，L.et al.(1997)Nature Biotechnology 15：1359-1367；DeSaizieu，A.et al.(1998)Nature Biotechnology 16：45-48；and DeRisi，J.L.et al.(1997)Science 278：680-686)的构建和应用。
DNA微阵列使用固体或者可弯曲的支持物，包括硝酸纤维素、尼龙、玻璃、硅或者其他材料。核酸分子可以以有序的方式连接在表面。合适标记之后，其他核酸或者核酸混合物可以与固定的核酸分子杂交，标记可以用于监控和测量确定区域杂交分子的单独的信号强度。本方法允许同时定量适用的核酸样品或者混合物中的全部或者所选择核酸的相对或者绝对数量。因此，DNA微阵列允许多种(多至6800或者更多)类似核酸表达的分析(参见例如，Schena，M.(1996)BioEssays 18(5)：427-431)。
本发明序列可以用于设计寡聚核苷酸引物，这些引物可以通过像聚合酶链式反应这样的核酸扩增反应扩增一条或者多条谷氨酸棒杆菌基因的确定区域。5’或者3’寡聚核苷酸引物或者合适连接体的选择和设计，允许得到的PCR产物共价连接到上述支持介质的表面(也描述在，例如，Schena，M.et al.(1995)Science 270：467-470)。
核酸微阵列也可以通过如在Wodicka，L.et al.(1997)NatureBiotechnology 15：1359-1367中描述的原位寡聚核苷酸合成构建。通过照相平板方法，可将矩阵中精确确定的区域暴露在光线中。保护基团是光不稳定的，从而被激活并经受核苷酸添加，但是被掩饰而见不到光的区域不进行任何修饰。接下来的保护和光激活循环，允许在确定位置不同寡聚核苷酸的合成。本发明确定的小区域可以在微阵列上通过固相寡聚核苷酸合成而合成。
出现在样品或者核苷酸混合物中的本发明核酸分子，可以与微阵列杂交。可以根据标准方法标记这些核酸分子。简单的说，核酸分子(例如，mRNA分子或者DNA分子)可以通过与同位素或者荧光标记的核苷酸结合而被标记，例如，在逆转录或者DNA合成中。标记核酸与微阵列的杂交有描述(例如在Schena，M.et al.(1995)supra；Wodicka，L.etal.(1997)，supra；and DeSaizieu A.et al.(1998)，supra中)。杂交分子的检测和定量要适合特定的结合标记。放射性标记可被探测，例如，在Schena，M.et al.(1995)supra中描述的，荧光标记也可以探测，例如使用Shalon et al.(1996)Gemone Research 6：639-645的方法。
如上所述，本发明序列在DNA微阵列中的应用，允许不同的谷氨酸棒杆菌菌株或者其他棒杆菌的比较分析。例如，通过核酸阵列方法，可以促进基于个别转录分部图的菌株内改变的研究，以及促进对特定和/或所需的像是致病性、生产能力和压力承受能力这样的菌株性质重要的基因的鉴定。同样，使用核酸阵列技术，也可以比较发酵反应过程中本发明基因表达的分部图。
实施例13：细胞蛋白质群体动力学的分析(蛋白质组学)
本发明的基因、组成和方法，可以用于研究蛋白质群体的相互作用和动力学，称作“蛋白质组学”。感兴趣的蛋白质群体包括，但是不局限于，谷氨酸棒杆菌的全部蛋白质群体(例如，和其他生物体的蛋白质群体比较起来)，在特殊环境或者代谢条件下(例如，发酵中、高温或者低温、或者高pH或低pH)有活性的那些蛋白质，或者在特定生长或者发育阶段有活性的那些蛋白质。
可以用各种熟知的技术分析蛋白质群体，例如凝胶电泳。细胞蛋白质可以通过例如裂解或者提取获得，也可以使用各种电泳技术彼此分离。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，很大程度上基于它们的分子重量。等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)通过等点点(这不仅反映了氨基酸序列，而且放映了蛋白质的翻译后修饰)分离蛋白质。另一种更加优选的蛋白质分析方法是，IEF-PAGE和SDS-PAGE的连续结合，称为2-D-凝胶电泳(在例如Hermann et al.(1998)Electrophoresis 19：3217-3221；Fountoulakis et al.(1998)Electrophoresis 19：1193-1202；Langen et al.(1997)Electrophoresis 18：1184-1192；Antelmann et al.(1997)Electrophoresis 18：1451-1463中有描述)。
用这些方法分离的蛋白质可以通过标准技术显现，例如通过染色或者标记。合适的染色在技术上是已知的，包括考马斯亮蓝、银染或者荧光染料，例如Sypro Ruby(Molecular Probes)。谷氨酸棒杆菌培养基中包含有放射性标记的氨基酸或者其他蛋白质前体(例如，35S-甲硫氨酸，35S-半胱氨酸，14C-标记氨基酸，15N-氨基酸，15NO3或者15NH4 +或者13C-标记氨基酸)，可以使得这些细胞在其蛋白质分离之前就标记蛋白质。类似的，也可以使用荧光标记。根据前述技术可以提取、隔离和分离这些标记蛋白质。
用这些技术显现的蛋白质，可以通过测量所用的染料或者标记作进一步分析。特定蛋白质的数量可以使用例如光学方法，进行定量确定，并且可以与在同一块凝胶上或者其他凝胶上的其他蛋白质的数量进行比较。可以通过例如光学比较、分光分析、凝胶图象分析和扫描，或者通过使用照相胶片或者显示器，对凝胶上的蛋白质进行比较。这些技术在技术上是熟知的。
为了确定特定蛋白质的特性，可以使用直接序列测定或者其他标准技术。例如，可以使用N-和/或C-末端氨基酸测序(例如Edman降解)，以及质谱分析(特别是MALDI或者ESI技术(参见例如，Langen et al.(1997)Electrophoresis 18：1184-1192))。此处提供的蛋白质序列，可以用作通过这些技术进行的谷氨酸棒杆菌蛋白质鉴定。
通过这些技术得到的信息，可以用于比较蛋白质存在、活性、不同生物条件下(例如，在其他条件中的不同生物体、发酵时间点、培养基条件、或者生物环境)不同样品间修饰的各种模式。这些试验得到的数据，可以单独的，或者与其他技术相结合的用于各种应用，例如比较特定情况下(例如代谢情况)各种生物体的行为，增加生产精细化学物质的菌株的生产能力，或者增加精细化学物质生产的效率。
等同声明
熟悉常规技术者可以认识到，或者能够确定仅仅使用常规实验，此处描述的本发明的特定实施方案有很多等价物。下面的权利要求意图包含这些等价物。
                          序列表<110>BASF公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>编码磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统蛋白的谷氨酸棒杆菌基因<130>BGI-122CPPC<140>PCT/IB00/00973<141>2000-06-27<150>US 60/142,691<151>1999-07-01<150>US 60/150,310<151>1999-08-23<150>DE 19942095.5<151>1999-09-03<150>DE 19942097.1<151>1999-09-03<160>36<210>1<211>1527<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(1504)<223>RXS00315<400>1ctcatggcat ctgcgccgtt cgcgttcttg ccagtgttgg ttggtttcac cgcaaccaag 60cgtttcggcg gcaatgagtt cctgggcgcc gcgtattggt atg gcg atg gtg ttc   115
                                        Met Ala Met Val Phe
                                          1               5ccg agc ttg gtg aac ggc tac gac gtg gcc gcc acc atg gct gcg ggc   163Pro Ser Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala Ala Thr Met Ala Ala Gly
             10                  15                  20gaa atg cca atg tgg tcc ctg ttt ggt tta gat gtt gcc caa gcc ggt   211Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu Asp Val Ala Gln Ala Gly
         25                  30                  35tac cag ggc acc gtg ctt cct gtg ctg gtg gtt tct tgg att ctg gca   259Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val Val Ser Trp Ile Leu Ala
     40                  45                  50acg atc gag aag ttc ctg cac aag cga ctc aag ggc act gca gac ttc   307Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu Lys Gly Thr Ala Asp Phe
 55                  60                  65ctg atc act cca gtg ctg acg ttg ctg ctc acc gga ttc ctt aca ttc   355Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu Thr Gly Phe Leu Thr Phe70                  75                  80                  85atc gcc att ggc cca gca atg cgc tgg gtg ggc gat gtg ctg gca cac   403Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val Gly Asp Val Leu Ala His
             90                  95                 100ggt cta cag gga ctt tat gat ttc ggt ggt cca gtc ggc ggt ctg ctc   451Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly Pro Val Gly Gly Leu Leu
        105                 110                 115ttc ggt ctg gtc tac tca cca atc gtc atc act ggt ctg cac cag tcc   499Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile Thr Gly Leu His Gln Ser
    120                 125                 130ttc ccg cca att gag ctg gag ctg ttt aac cag ggt gga tcc ttc atc   547Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn Gln Gly Gly Ser Phe Ile
135                 140                 145ttc gca acg gca tct atg gct aat atc gcc cag ggt gcg gca tgt ttg   595Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala Gln Gly Ala Ala Cys Leu150                 155                 160                 165gca gtg ttc ttc ctg gcg aag agt gaa aag ctc aag ggc ctt gca ggt   643Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys Leu Lys Gly Leu Ala Gly
            170                 175                 180gct tca ggt gtc tcc gct gtt ctt ggt att acg gag cct gcg atc ttc   691Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile Thr Glu Pro Ala Ile Phe
        185                 190                 195ggt gtg aac ctt cgc ctg cgc tgg ccg ttc ttc atc ggt atc ggt acc   739Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe Phe Ile Gly Ile Gly Thr
    200                 205                 210gca gct atc ggt ggc gct ttg att gca ctc ttt aat atc aag gca gtt   787Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu Phe Asn Ile Lys Ala Val
215                 220                 225gcg ttg ggc gct gca ggt ttc ttg ggt gtt gtt tct att gat gct cca   835Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val Val Ser Ile Asp Ala Pro230                 235                 240                 245gat atg gtc atg ttc ttg gtg tgt gca gtt gtt acc ttc ttc atc gca   883Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val Val Thr Phe Phe Ile Ala
            250                 255                 260ttc ggc gca gcg att gct tat ggc ctt tac ttg gtt cgc cgc aac ggc   931Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr Leu Val Arg Arg Asn Gly
        265                 270                 275agc att gat cca gat gca acc gct gct cca gtg cct gca gga acg acc   979Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro Val Pro Ala Gly Thr Thr
    280                 285                 290aaa gcc gaa gca gaa gca ccc gca gaa ttt tca aac gat tcc acc atc   1027Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe Ser Asn Asp Ser Thr Ile
295                 300                 305atc cag gca cct ttg acc ggt gaa gct att gca ctg agc agc gtc agc   1075Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile Ala Leu Ser Ser Val Ser310                 315                 320                 325gat gcc atg ttt gcc agc gga aag ctt ggc tcg ggc gtt gcc atc gtc   1123Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly Ser Gly Val Ala Ile Val
            330                 335                 340cca acc aag ggg cag tta gtt tct ccg gtg agt gga aag att gtg gtg   1171Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val Ser Gly Lys Ile Val Val
        345                 350                 355gca ttc cca tct ggc cat gct ttc gca gtt cgc acc aag gct gag gat   1219Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val Arg Thr Lys Ala Glu Asp
    360                 365                 370ggt tcc aat gtg gat atc ttg atg cac att ggt ttc gac aca gta aac   1267Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile Gly Phe Asp Thr Val Asn
375                 380                 385ctc aac ggc acg cac ttt aac ccg ctg aag aag cag ggc gat gaa gtc   1315Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys Lys Gln Gly Asp Glu Val390                 395                 400                 405aaa gca ggg gag ctg ctg tgt gaa ttc gat att gat gcc att aag gct   1363Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp Ile Asp Ala Ile Lys Ala
            410                 415                 420gca ggt tat gag gta acc acg ccg att gtt gtt tcg aat tac aag aaa   1411Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val Val Ser Asn Tyr Lys Lys
        425                 430                 435acc gga cct gta aac act tac ggt ttg ggc gaa att gaa gcg gga gcc   1459Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly Glu Ile Glu Ala Gly Ala
    440                 445                 450aac ctg ctc aac gtc gca aag aaa gaa gcg gtg cca gca aca cca       1504Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala Val Pro Ala Thr Pro
455                 460                 465taagttgaaa ccttgagtgt tcg                                         1527<210>2<211>468<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>2Met Ala Met Val Phe Pro Ser Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala Ala1               5                  10                  15Thr Met Ala Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu Asp
         20                  25                  30Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val Val
     35                  40                  45Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu Lys
 50                  55                  60Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu Thr65                  70                  75                  80Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val Gly
             85                  90                  95Asp Val Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly Pro
        100                 105                 110Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile Thr
    115                 120                 125Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn Gln
130                 135                 140Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala Gln145                 150                 155                 160Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys Leu
            165                 170                 175Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile Thr
        180                 185                 190Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe Phe
    195                 200                 205Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu Phe
210                 215                 220Asn Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val Val225                 230                 235                 240Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val Val
            245                 250                 255Thr Phe Phe Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr Leu
        260                 265                 270Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro Val
    275                 280                 285Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe Ser
290                 295                 300Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile Ala305                 310                 315                 320Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly Ser
            325                 330                 335Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val Ser
        340                 345                 350Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val Arg
    355                 360                 365Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile Gly
370                 375                 380Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys Lys385                 390                 395                 400Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp Ile
            405                 410                 415Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val Val
        420                 425                 430Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly Glu
    435                 440                 445Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala Val
450                 455                 460Pro Ala Thr Pro465<210>3<211>1109<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(1)..(1086)<223>FRXA00315<400>3tat gat ttc ggc ggt cca gtc ggc ggt ctg ctc ttc ggt ctg gtc tac   48Tyr Asp Phe Gly Gly Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr1               5                  10                  15tca cca atc gtc atc act ggt ctg cac cag tcc ttc ccg cca att gag   96Ser Pro Ile Val Ile Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu
         20                  25                  30ctg gag ctg ttt aac cag ggt gga tcc ttc atc ttc gca acg gca tct   144Leu Glu Leu Phe Asn Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser
     35                  40                  45atg gct aat atc gcc cag ggt gcg gca tgt ttg gca gtg ttc ttc ctg   192Met Ala Asn Ile Ala Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu
 50                  55                  60gcg aag agt gaa aag ctc aag ggc ctt gca ggt gct tca ggt gtc tcc   240Ala Lys Ser Glu Lys Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser65                  70                  75                  80gct gtt ctt ggt att acg gag cct gcg atc ttc ggt gtg aac ctt cgc   288Ala Val Leu Gly Ile Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg
             85                  90                  95ctg cgc tgg ccg ttc ttc atc ggt atc ggt acc gca gct atc ggt ggc   336Leu Arg Trp Pro Phe Phe Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly
        100                 105                 110gct ttg att gca ctc ttt aat atc aag gca gtt gcg ttg ggc gct gca   384Ala Leu Ile Ala Leu Phe Asn Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala
    115                120                  125ggt ttc ttg ggt gtt gtt tct att gat gct cca gat atg gtc atg ttc   432Gly Phe Leu Gly Val Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe
130                 135                 140ttg gtg tgt gca gtt gtt acc ttc ttc atc gca ttc ggc gca gcg att   480Leu Val Cys Ala Val Val Thr Phe Phe Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile145                 150                 155                 160gct tat ggc ctt tac ttg gtt cgc cgc aac ggc agc att gat cca gat   528Ala Tyr Gly Leu Tyr Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp
            165                 170                 175gca acc gct gct cca gtg cct gca gga acg acc aaa gcc gaa gca gaa   576Ala Thr Ala Ala Pro Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu
        180                 185                 190gca ccc gca gaa ttt tca aac gat tcc acc atc atc cag gca cct ttg   624Ala Pro Ala Glu Phe Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu
    195                 200                 205acc ggt gaa gct att gca ctg agc agc gtc agc gat gcc atg ttt gcc   672Thr Gly Glu Ala Ile Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala
210                 215                 220agc gga aag ctt ggc tcg ggc gtt gcc atc gtc cca acc aag ggg cag   720Ser Gly Lys Leu Gly Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln225                 230                 235                 240tta gtt tct ccg gtg agt gga aag att gtg gtg gca ttc cca tct ggc   768Leu Val Ser Pro Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly
            245                 250                 255cat gct ttc gca gtt cgc acc aag gct gag gat ggt tcc aat gtg gat   816His Ala Phe Ala Val Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp
        260                 265                 270atc ttg atg cac att ggt ttc gac aca gta aac ctc aac ggc acg cac   864Ile Leu Met His Ile Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His
    275                 280                 285ttt aac ccg ctg aag aag cag ggc gat gaa gtc aaa gca ggg gag ctg   912Phe Asn Pro Leu Lys Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu
290                 295                 300ctg tgt gaa ttc gat att gat gcc att aag gct gca ggt tat gag gta   960Leu Cys Glu Phe Asp Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val305                 310                 315                 320acc acg ccg att gtt gtt tcg aat tac aag aaa acc gga cct gta aac   1008Thr Thr Pro Ile Val Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn
            325                 330                 335act tac ggt ttg ggc gaa att gaa gcg gga gcc aac ctg ctc aac gtc  1056Thr Tyr Gly Leu Gly Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val
        340                 345                 350gca aag aaa gaa gcg gtg cca gca aca cca taagttgaaa ccttgagtgt    1106Ala Lys Lys Glu Ala Val Pro Ala Thr Pro
355                     360tcg                                                              1109<210>4<211>362<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>4Tyr Asp Phe Gly Gly Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr1               5                  10                  15Ser Pro Ile Val Ile Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu
         20                  25                  30Leu Glu Leu Phe Asn Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser
     35                  40                  45Met Ala Asn Ile Ala Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu
 50                  55                  60Ala Lys Ser Glu Lys Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser65                  70                  75                  80Ala Val Leu Gly Ile Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg
             85                  90                  95Leu Arg Trp Pro Phe Phe Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly
        100                 105                 110Ala Leu Ile Ala Leu Phe Asn Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala
    115                 120                 125Gly Phe Leu Gly Val Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe
130                 135                 140Leu Val Cys Ala Val Val Thr Phe Phe Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile145                 150                 155                 160Ala Tyr Gly Leu Tyr Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp
            165                 170                 175Ala Thr Ala Ala Pro Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu
        180                 185                 190Ala Pro Ala Glu Phe Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu
    195                 200                 205Thr Gly Glu Ala Ile Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala
210                 215                 220Ser Gly Lys Leu Gly Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln225                 230                 235                 240Leu Val Ser Pro Val Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly
            245                 250                 255His Ala Phe Ala Val Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp
        260                 265                 270Ile Leu Met His Ile Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His
    275                 280                 285Phe Asn Pro Leu Lys Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu
290                 295                 300Leu Cys Glu Phe Asp Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val305                 310                 315                 320Thr Thr Pro Ile Val Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn
            325                 330                 335Thr Tyr Gly Leu Gly Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val
        340                 345                 350Ala Lys Lys Glu Ala Val Pro Ala Thr Pro
    355                 360<210>5<211>372<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(349)<223>RXA01503<400>5gtatcctcaa aggccttcta gctgttgcag ctgcagcgca ctcggtggat acgacatcca 60cgacctatca aattctttat gctgcaggcg atgccttttc atg ttc ttg gca gtc   115
                                        Met Phe Leu Ala Val
                                          1               5att ttg gcg att act gcg gct cgt aaa ttc ggt gcc aat gtc ttt aca   163Ile Leu Ala Ile Thr Ala Ala Arg Lys Phe Gly Ala Asn Val Phe Thr
             10                  15                  20tca gtc gca ctc gct ggt gca ttg ctg cac aca cag ctt cag gca gta   211Ser Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu His Thr Gln Leu Gln Ala Val
         25                  30                  35acc gtg ttg gtt gac ggt gaa ctc cag tcg atg act ctg gtg gct ttc   259Thr Val Leu Val Asp Gly Glu Leu Gln Ser Met Thr Leu Val Ala Phe
     40                  45                  50caa aag gct ggt aat gac gtc acc ttc ctg ggc att cca gtg gtg ctg   307Gln Lys Ala Gly Asn Asp Val Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Val Leu
 55                  60                  65cag ttg gcg ttg cat gta gcg agt ttg atg aag ttg tcg cga           349Gln Leu Ala Leu His Val Ala Ser Leu Met Lys Leu Ser Arg70                  75                  80taagaggagg ggcgtgtcgg tct                                         372<210>6<211>83<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>6Met Phe Leu Ala Val Ile Leu Ala Ile Thr Ala Ala Arg Lys Phe Gly1               5                  10                  15Ala Asn Val Phe Thr Ser Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu His Thr
         20                  25                  30Gln Leu Gln Ala Val Thr Val Leu Val Asp Gly Glu Leu Gln Ser Met
     35                  40                  45Thr Leu Val Ala Phe Gln Lys Ala Gly Asn Asp Val Thr Phe Leu Gly
 50                  55                  60Ile Pro Val Val Leu Gln Leu Ala Leu His Val Ala Ser Leu Met Lys65                  70                  75                  80Leu Ser Arg<210>7<211>2187<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(2164)<223>RXN01299<400>7cgactgcggc gtctcttcct ggcactacca ttcctcgtcc tgaccaactc gccacagctg 60gtgcaacggt cacccaagtc aaaggattga aagaatcagc atg aat agc gta aat   115
                                        Met Asn Ser Val Asn
                                          1               5aat tcc tcg ctt gtc cgg ctg gat gtc gat ttc ggc gac tcc acc acg   163Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe Gly Asp Ser Thr Thr
             10                  15                  20gat gtc atc aac aac ctt gcc act gtt att ttc gac gct ggc cga gct   211Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe Asp Ala Gly Arg Ala
         25                  30                  35tcc tcc gcc gac gcc ctt gcc aaa gac gcg ctg gat cgt gaa gca aag   259Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu Asp Arg Glu Ala Lys
     40                  45                  50tcc ggc acc ggc gtt cct ggt caa gtt gct atc ccc cac tgc cgt tcc   307Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile Pro His Cys Arg Ser
 55                  60                  65gaa gcc gta tct gtc cct acc ttg ggc ttt gct cgc ctg agc aag ggt   355Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala Arg Leu Ser Lys Gly70                  75                  80                  85gtg gac ttc agc gga cct gat ggc gat gcc aac ttg gtg ttc ctc att   403Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn Leu Val Phe Leu Ile
             90                  95                 100gca gca cct gct ggc ggc ggc aaa gag cac ctg aag atc ctg tcc aag   451Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu Lys Ile Leu Ser Lys
        105                 110                 115ctt gct cgc tcc ttg gtg aag aag gat ttc atc aag gct ctg cag gaa   499Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile Lys Ala Leu Gln Glu
    120                 125                 130gcc acc acc gag cag gaa atc gtc gac gtt gtc gat gcc gtg ctc aac   547Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val Asp Ala Val Leu Asn
135                 140                 145cca gca cca aaa acc acc gag cca gct gca gct ccg gct gcg gcg gcg   595Pro Ala Pro Lys Thr Thr Glu Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala150                 155                 160                 165gtt gct gag agt ggg gcg gcg tcg aca agc gtt act cgt atc gtg gca   643Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val Thr Arg Ile Val Ala
            170                 175                 180atc acc gca tgc cca acc ggt atc gca cac acc tac atg gct gcg gat   691Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr Tyr Met Ala Ala Asp
        185                 190                 195tcc ctg acg caa aac gcg gaa ggc cgc gat gat gtg gaa ctc gtt gtg   739Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp Val Glu Leu Val Val
    200                 205                 210gag act cag ggc tct tcc gct gtc acc cca gtc gat ccg aag atc atc   787Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val Asp Pro Lys Ile Ile
215                 220                 225gaa gct gcc gac gcc gtc atc ttc gcc acc gac gtg gga gtt aaa gac   835Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp Val Gly Val Lys Asp230                 235                 240                 245cgc gag cgt ttc gct ggc aag cca gtc att gaa tcc ggc gtc aag cgc   883Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu Ser Gly Val Lys Arg
            250                 255                 260gcg atc aat gag cca gcc aag atg atc gac gag gcc atc gca gcc tcc   931Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu Ala Ile Ala Ala Ser
        265                 270                 275aag aac cca aac gcc cgc aag gtt tcc ggt tcc ggt gtc gcg gca tct   979Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser Gly Val Ala Ala Ser
    280                 285                 290gct gaa acc acc ggc gag aag ctc ggc tgg ggc aag cgc atc cag cag   1027Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly Lys Arg Ile Gln Gln
295                 300                 305gca gtc atg acc ggc gtg tcc tac atg gtt cca ttc gta gct gcc ggc   1075Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro Phe Val Ala Ala Gly310                 315                 320                 325ggc ctc ctg ttg gct ctc ggc ttc gca ttc ggt gga tac gac atg gcg   1123Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly Gly Tyr Asp Met Ala
            330                 335                 340aac ggc tgg caa gca atc gcc acc cag ttc tct ctg acc aac ctg cca   1171Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser Leu Thr Asn Leu Pro
        345                 350                 355ggc aac acc gtc gat gtt gac ggc gtg gcc atg acc ttc gag cgt tca   1219Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met Thr Phe Glu Arg Ser
    360                 365                 370ggc ttc ctg ttg tac ttc ggc gca gtc ctg ttc gcc acc ggc caa gca   1267Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe Ala Thr Gly Gln Ala
375                 380                 385gcc atg ggc ttc atc gtg gca gcc ctg tct ggc tac acc gca tac gca   1315Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Thr Ala Tyr Ala390                 395                 400                 405ctt gct gga cgc cca ggc atc gcg ccg ggc ttc gtc ggt ggc gcc atc   1363Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe Val Gly Gly Ala Ile
            410                 415                 420tcc gtc acc atc ggc gct ggc ttc att ggt ggt ctg gtt acc ggt atc   1411Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly Leu Val Thr Gly Ile
        425                 430                 435ttg gct ggt ctc att gcc ctg tgg att ggc tcc tgg aag gtg cca cgc   1459Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser Trp Lys Val Pro Arg
    440                 445                 450gtg gtg cag tca ctg atg cct gtg gtc atc atc ccg cta ctt acc tca   1507Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile Pro Leu Leu Thr Ser
455                 460                 465gtg gtt gtt ggt ctc gtc atg tac ctc ctg ctg ggt cgc cca ctc gca   1555Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Pro Leu Ala470                 475                 480                 485tcc atc atg act ggt ttg cag gac tgg cta tcg tca atg tcc gga agc   1603Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser Ser Met Ser Gly Ser
            490                 495                 500tcc gcc atc ttg ctg ggt atc atc ttg ggc ctc atg atg tgt ttc gac   1651Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu Met Met Cys Phe Asp
        505                 510                 515ctc ggc gga cca gta aac aag gca gcc tac ctc ttt ggt acc gca ggc   1699Leu Gly Gly Pro Val Asn Lys Ala Ala Tyr Leu Phe Gly Thr Ala Gly
    520                 525                 530ctg tct acc ggc gac caa gct tcc atg gaa atc atg gcc gcg atc atg   1747Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ser Met Glu Ile Met Ala Ala Ile Met
535                 540                 545gca gct ggc atg gtc cca cca atc gcg ttg tcc att gct acc ctg ctg   1795Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile Ala Leu Ser Ile Ala Thr Leu Leu550                 555                 560                 565cgc aag aag ctg ttc acc cca gca gag caa gaa aac ggc aag tct tcc   1843Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu Asn Gly Lys Ser Ser
            570                 575                 580tgg ctg ctt ggc ctg gca ttc gtc tcc gaa ggt gcc atc cca ttc gcc   1891Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly Ala Ile Pro Phe Ala
        585                 590                 595gca gct gac cca ttc cgt gtg atc cca gca atg atg gct ggc ggt gca   1939Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met Met Ala Gly Gly Ala
    600                 605                 610acc act ggt gca atc tcc atg gca ctg ggc gtc ggc tct cgg gct cca   1987Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val Gly Ser Arg Ala Pro
615                 620                 625cac ggc ggt atc ttc gtg gtc tgg gca atc gaa cca tgg tgg ggc tgg   2035His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu Pro Trp Trp Gly Trp630                 635                 640                 645ctc atc gca ctt gca gca ggc acc atc gtg tcc acc atc gtt gtc atc   2083Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser Thr Ile Val Val Ile
            650                 655                 660gca ctg aag cag ttc tgg cca aac aag gcc gtc gct gca gaa gtc gcg   2131Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val Ala Ala Glu Val Ala
        665                 670                 675aag caa gaa gca caa caa gca gct gta aac gca taatcggacc ttgacccgat 2184Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala
    680                 685gtc                                                               2187<210>8<211>688<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>8Met Asn Ser Val Asn Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe1               5                  10                  15Gly Asp Ser Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe
         20                  25                  30Asp Ala Gly Arg Ala Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu
     35                  40                  45Asp Arg Glu Ala Lys Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile
 50                  55                  60Pro His Cys Arg Ser Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala65                  70                  75                  80Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn
             85                  90                  95Leu Val Phe Leu Ile Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu
        100                 105                 110Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile
    115                 120                 125Lys Ala Leu Gln Glu Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val
130                 135                 140Asp Ala Val Leu Asn Pro Ala Pro Lys Thr Thr Glu Pro Ala Ala Ala145                 150                 155                 160Pro Ala Ala Ala Ala Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val
            165                 170                 175Thr Arg Ile Val Ala Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr
        180                 185                 190Tyr Met Ala Ala Asp Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp
    195                 200                 205Val Glu Leu Val Val Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val
210                 215                 220Asp Pro Lys Ile Ile Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp225                 230                 235                 240Val Gly Val Lys Asp Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu
            245                 250                 255Ser Gly Val Lys Arg Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu
        260                 265                 270Ala Ile Ala Ala Ser Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser
    275                 280                 285Gly Val Ala Ala Ser Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly
290                 295                 300Lys Arg Ile Gln Gln Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro305                 310                 315                 320Phe Val Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly
            325                 330                 335Gly Tyr Asp Met Ala Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser
        340                 345                 350Leu Thr Asn Leu Pro Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met
    355                 360                 365Thr Phe Glu Arg Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe
370                 375                 380Ala Thr Gly Gln Ala Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly385                 390                 395                 400Tyr Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe
            405                 410                 415Val Gly Gly Ala Ile Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly
        420                 425                 430Leu Val Thr Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser
    435                 440                 445Trp Lys Val Pro Arg Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile
450                 455                 460Pro Leu Leu Thr Ser Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu465                 470                 475                 480Gly Arg Pro Leu Ala Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser
            485                 490                 495Ser Met Ser Gly Ser Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu
        500                 505                 510Met Met Cys Phe Asp Leu Gly Gly Pro Val Asn Lys Ala Ala Tyr Leu
    515                 520                 525Phe Gly Thr Ala Gly Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ser Met Glu Ile
530                 535                 540Met Ala Ala Ile Met Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile Ala Leu Ser545                 550                 555                 560Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu
            565                 570                 575Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly
        580                 585                 590Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met
    595                 600                 605Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val
610                 615                 620Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu625                 630                 635                 640Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser
            645                 650                 655Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val
        660                 665                 670Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala
    675                 680                 685<210>9<211>464<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(1)..(441)<223>FRXA01299<400>9atg gaa atc atg gcc gcg atc atg gca gct ggc atg gtc cca cca atc   48Met Glu Ile Met Ala Ala Ile Met Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile1               5                  10                  15gcg ttg tcc att gct acc ctg ctg cgc aag aag ctg ttc acc cca gca   96Ala Leu Ser Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala
         20                  25                  30gag caa gaa aac ggc aag tct tcc tgg ctg ctt ggc ctg gca ttc gtc   144Glu Gln Glu Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val
     35                  40                  45tcc gaa ggt gcc atc cca ttc gcc gca gct gac cca ttc cgt gtg atc   192Ser Glu Gly Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile
 50                  55                  60cca gca atg atg gct ggc ggt gca acc act ggt gca atc tcc atg gca   240Pro Ala Met Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala65                  70                  75                  80ctg ggc gtc ggc tct cgg gct cca cac ggc ggt atc ttc gtg gtc tgg   288Leu Gly Val Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp
             85                  90                  95gca atc gaa cca tgg tgg ggc tgg ctc atc gca ctt gca gca ggc acc   336Ala Ile Glu Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr
        100                 105                 110atc gtg tcc acc atc gtt gtc atc gca ctg aag cag ttc tgg cca aac   384Ile Val Ser Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn
    115                 120                 125aag gcc gtc gct gca gaa gtc gcg aag caa gaa gca caa caa gca gct 432Lys Ala Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala
130                 135                 140gta aac gca taatcggacc ttgacccgat gtc                           464Val Asn Ala145<210>10<211>147<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>10Met Glu Ile Met Ala Ala Ile Met Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile1               5                  10                  15Ala Leu Ser Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala
         20                  25                  30Glu Gln Glu Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val
     35                  40                  45Ser Glu Gly Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile
 50                  55                  60Pro Ala Met Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala65                  70                  75                  80Leu Gly Val Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp
             85                  90                  95Ala Ile Glu Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr
        100                 105                 110Ile Val Ser Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn
    115                 120                 125Lys Ala Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala
130                 135                 140Val Asn Ala145<210>11<211>580<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(580)<223>FRXA01883<400>11cgactgcggc gtctcttcct ggcactacca ttcctcgtcc tgaccaactc gccacagctg 60gtgcaacggt cacccaagtc aaaggattga aagaatcagc atg aat agc gta aat   115
                                        Met Asn Ser Val Asn
                                          1               5aat tcc tcg ctt gtc cgg ctg gat gtc gat ttc ggc gac tcc acc acg   163Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe Gly Asp Ser Thr Thr
             10                  15                  20gat gtc atc aac aac ctt gcc act gtt att ttc gac gct ggc cga gct   211Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe Asp Ala Gly Arg Ala
         25                  30                  35tcc tcc gcc gac gcc ctt gcc aaa gac gcg ctg gat cgt gaa gca aag   259Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu Asp Arg Glu Ala Lys
     40                  45                  50tcc ggc acc ggc gtt cct ggt caa gtt gct atc ccc cac tgc cgt tcc   307Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile Pro His Cys Arg Ser
 55                  60                  65gaa gcc gta tct gtc cct acc ttg ggc ttt gct cgc ctg agc aag ggt   355Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala Arg Leu Ser Lys Gly70                  75                  80                  85gtg gac ttc agc gga cct gat ggc gat gcc aac ttg gtg ttc ctc att   403Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn Leu Val Phe Leu Ile
             90                  95                 100gca gca cct gct ggc ggc ggc aaa gag cac ctg aag atc ctg tcc aag   451Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu Lys Ile Leu Ser Lys
        105                 110                 115ctt gct cgc tcc ttg gtg aag aag gat ttc atc aag gct ctg cag gaa  499Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile Lys Ala Leu Gln Glu
    120                 125                 130gcc acc acc gag cag gaa atc gtc gac gtt gtc gat gcc gtg ctc aac  547Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val Asp Ala Val Leu Asn
135                 140                 145cca gca cca aaa aac cac cga gcc agc tgc agc                      580Pro Ala Pro Lys Asn His Arg Ala Ser Cys Ser150                 155                 160<210>12<211>160<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>12Met Asn Ser Val Asn Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe1               5                  10                  15Gly Asp Ser Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe
         20                  25                  30Asp Ala Gly Arg Ala Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu
     35                  40                  45Asp Arg Glu Ala Lys Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile
 50                  55                  60Pro His Cys Arg Ser Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala65                  70                  75                  80Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn
             85                  90                  95Leu Val Phe Leu Ile Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu
        100                 105                 110Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile
    115                 120                 125Lys Ala Leu Gln Glu Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val
130                 135                 140Asp Ala Val Leu Asn Pro Ala Pro Lys Asn His Arg Ala Ser Cys Ser145                 150                 155                 160<210>13<211>631<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(77)..(631)<223>FRXA01889<400>13accgagccag ctgcagctcc ggctgcggcg gccggttgtt aagagtgggg cggcgtcgac  60aagcgttact cgtatc gtg gca atc acc gca tgc cca acc ggt atc gca cac  112
              Val Ala Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His
                1               5                  10acc tac atg gct gcg gat tcc ctg acg caa aac gcg gaa ggc cgc gat    160Thr Tyr Met Ala Ala Asp Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp
     15                  20                  25gat gtg gaa ctc gtt gtg gag act cag ggc tct tcc gct gtc acc cca    208Asp Val Glu Leu Val Val Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro
 30                  35                  40gtc gat ccg aag atc atc gaa gct gcc gac gcc gtc atc ttc gcc acc    256Val Asp Pro Lys Ile Ile Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr45                  50                  55                  60gac gtg gga gtt aaa gac cgc gag cgt ttc gct ggc aag cca gtc att    304Asp Val Gly Val Lys Asp Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile
             65                  70                  75gaa tcc ggc gtc aag cgc gcg atc aat gag cca gcc aag atg atc gac   352Glu Ser Gly Val Lys Arg Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp
         80                  85                  90gag gcc atc gca gcc tcc aag aac cca aac gcc cgc aag gtt tcc ggt   400Glu Ala Ile Ala Ala Ser Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly
     95                 100                 105tcc ggt gtc gcg gca tct gct gaa acc acc ggc gag aag ctc ggc tgg   448Ser Gly Val Ala Ala Ser Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp
110                 115                 120ggc aag cgc atc cag cag gca gtc atg acc ggc gtg tcc tac atg gtt   496Gly Lys Arg Ile Gln Gln Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val125                 130                 135                 140cca ttc gta gct gcc ggc ggc ctc ctg ttg gct ctc ggc ttc gca ttc   544Pro Phe Val Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe
            145                 150                 155ggt gga tac gac atg gcg aac ggc tgg caa gca atc gcc acc cag ttc   592Gly Gly Tyr Asp Met Ala Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe
        160                 165                 170tct ctg acc aac ctg cca ggc aac acc gtc gat gtt gac               631Ser Leu Thr Asn Leu Pro Gly Asn Thr Val Asp Val Asp
    175                 180                 185<210>14<211>185<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>14Val Ala Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr Tyr Met Ala1               5                  10                  15Ala Asp Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp Val Glu Leu
         20                  25                  30Val Val Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val Asp Pro Lys
     35                  40                  45Ile Ile Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp Val Gly Val
 50                  55                  60Lys Asp Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu Ser Gly Val65                  70                  75                  80Lys Arg Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu Ala Ile Ala
             85                  90                  95Ala Ser Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser Gly Val Ala
        100                 105                 110Ala Ser Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly Lys Arg Ile
    115                 120                 125Gln Gln Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro Phe Val Ala
130                 135                 140Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly Gly Tyr Asp145                 150                 155                 160Met Ala Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser Leu Thr Asn
            165                 170                 175Leu Pro Gly Asn Thr Val Asp Val Asp
        180                 185<210>15<211>416<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(1)..(393)<223>RXA00951<400>15atc caa gca atc tta gag aag gca gca gcg ccg gcg aag cag aag gct  48Ile Gln Ala Ile Leu Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Lys Ala1               5                  10                  15cct gct gtg gct cct gct gta aca ccc act gac gct cct gca gcc tca   96Pro Ala Val Ala Pro Ala Val Thr Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Ser
         20                  25                  30gtc caa tcc aaa acc cac gac aag atc ctc acc gtc tgt ggc aac ggc   144Val Gln Ser Lys Thr His Asp Lys Ile Leu Thr Val Cys Gly Asn Gly
     35                  40                  45ttg ggt acc tcc ctc ttc ctc aaa aac acc ctt gag caa gtt ttc gac   192Leu Gly Thr Ser Leu Phe Leu Lys Asn Thr Leu Glu Gln Val Phe Asp
 50                  55                  60acc tgg ggt tgg ggt cca tac atg acg gtg gag gca acc gac act atc   240Thr Trp Gly Trp Gly Pro Tyr Met Thr Val Glu Ala Thr Asp Thr Ile65                  70                  75                  80tcc gcc aag ggc aaa gcc aag gaa gct gat ctc atc atg acc tct ggt   288Ser Ala Lys Gly Lys Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile Met Thr Ser Gly
             85                  90                  95gaa atc gcc cgc acg ttg ggt gat gtt gga atc ccg gtt cac gtg atc   336Glu Ile Ala Arg Thr Leu Gly Asp Val Gly Ile Pro Val His Val Ile
        100                 105                 110aat gac ttc acg agc acc gat gaa atc gat gct gcg ctt cgt gaa cgc   384Asn Asp Phe Thr Ser Thr Asp Glu Ile Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg
    115                 120                 125tac gac atc taactacttt aaaaggacga aaa                             416Tyr Asp Ile
130<210>16<211>131<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>16Ile Gln Ala Ile Leu Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Lys Ala1               5                  10                  15Pro Ala Val Ala Pro Ala Val Thr Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Ser
         20                  25                  30Val Gln Ser Lys Thr His Asp Lys Ile Leu Thr Val Cys Gly Asn Gly
     35                  40                  45Leu Gly Thr Ser Leu Phe Leu Lys Asn Thr Leu Glu Gln Val Phe Asp
 50                  55                  60Thr Trp Gly Trp Gly Pro Tyr Met Thr Val Glu Ala Thr Asp Thr Ile65                  70                  75                  80Ser Ala Lys Gly Lys Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile Met Thr Ser Gly
             85                  90                  95Glu Ile Ala Arg Thr Leu Gly Asp Val Gly Ile Pro Val His Val Ile
        100                 105                 110Asn Asp Phe Thr Ser Thr Asp Glu Ile Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg
    115                 120                 125Tyr Asp Ile
130<210>17<211>1827<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(1804)<223>RXN01244<400>17gatatgtgtt tgtttgtcaa tatccaaatg tttgaatagt tgcacaactg ttggttttgt 60ggtgatcttg aggaaattaa ctcaatgatt gtgaggatgg gtg gct act gtg gct   115
                                        Val Ala Thr Val Ala
                                          1               5gat gtg aat caa gac act gta ctg aag ggc acc ggc gtt gtc ggt gga   163Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr Gly Val Val Gly Gly
             10                  15                  20gtc cgt tat gca agc gcg gtg tgg att acc cca cgc ccc gaa cta ccc   211Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro Arg Pro Glu Leu Pro
         25                  30                  35caa gca ggc gaa gtc gtc gcc gaa gaa aac cgt gaa gca gag cag gag   259Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg Glu Ala Glu Gln Glu
     40                  45                  50cgt ttc gac gcc gct gca gcc aca gtc tct tct cgt ttg ctt gag cgc   307Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser Arg Leu Leu Glu Arg
 55                  60                  65tcc gaa gct gct gaa gga cca gca gct gag gtg ctt aaa gct act gct   355Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val Leu Lys Ala Thr Ala70                  75                  80                  85ggc atg gtc aat gac cgt ggc tgg cgt aag gct gtc atc aag ggt gtc   403Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala Val Ile Lys Gly Val
             90                  95                 100aag ggt ggt cac cct gcg gaa tac gcc gtg gtt gca gca aca acc aag   451Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val Ala Ala Thr Thr Lys
        105                 110                 115ttc atc tcc atg ttc gaa gcc gca ggc ggc ctg atc gcg gag cgc acc   499Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu Ile Ala Glu Arg Thr
    120                 125                 130aca gac ttg cgc gac atc cgc gac cgc gtc atc gca gaa ctt cgt ggc   547Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile Ala Glu Leu Arg Gly
135                 140                 145gat gaa gag cca ggt ctg cca gct gtt tcc gga cag gtc att ctc ttt   595Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly Gln Val Ile Leu Phe150                 155                 160                 165gca gat gac ctc tcc cca gca gac acc gcg gca cta gac aca gat crc   643Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala Leu Asp Thr Asp Leu
            170                 175                 180ttt gtg gga ctt gtc act gag ctg ggt ggc cca acg agc cac acc gcg   691Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro Thr Ser His Thr Ala
        185                 190                 195atc atc gca cgc cag ctc aac gtg cct tgc atc gtc gca tcc ggc gcc   739Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile Val Ala Ser Gly Ala
    200                 205                 210ggc atc aag gac atc aag tcc ggc gaa aag gtg ctt atc gac ggc agc   787Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val Leu Ile Asp Gly Ser
215                 220                 225ctc ggc acc att gac cgc aac gcg gac gaa gct gaa gca acc aag ctc   835Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala Glu Ala Thr Lys Leu230                 235                 240                 245gtc tcc gag tcc ctc gag cgc gct gct cgc atc gcc gag tgg aag ggt   883Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile Ala Glu Trp Lys Gly
            250                 255                 260cct gca caa acc aag gac ggc tac cgc gtt cag ctg ttg gcc aac gtc   931Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln Leu Leu Ala Asn Val
        265                 270                 275caa gac ggc aac tct gca cag cag gct gca cag acc gaa gca gaa ggc   979Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln Thr Glu Ala Glu Gly
    280                 285                 290atc ggc ctg ttc cgc acc gaa ctg tgc ttc ctt tcc gcc acc gaa gag   1027Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu Ser Ala Thr Glu Glu
295                 300                 305cca agc gtt gat gag cag gct gcg gtc tac tca aag gtg ctt gaa gca   1075Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser Lys Val Leu Glu Ala310                 315                 320                 325ttc cca gag tcc aag gtc gtt gtc cgc tcc ctc gac gca ggt tct gac   1123Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu Asp Ala Gly Ser Asp
            330                 335                 340aag cca gtt cca ttc gca tcg atg gct gat gag atg aac cca gca ctg   1171Lys Pro Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu Met Asn Pro Ala Leu
        345                 350                 355ggt gtt cgt ggc ctg cgt atc gca cgt gga cag gtt gat ctg ctg act   1219Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln Val Asp Leu Leu Thr
    360                 365                 370cgc cag ctc gac gca att gcg aag gcc agc gaa gaa ctc ggc cgt ggc   1267Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu Glu Leu Gly Arg Gly
375                 380                 385gac gac gcc cca acc tgg gtt atg gct cca atg gtg gct acc gct tat   1315Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met Val Ala Thr Ala Tyr390                 395                 400                 405gaa gca aag tgg ttt gct gac atg tgc cgt gag cgt ggc cta atc gcc   1363Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu Arg Gly Leu Ile Ala
            410                 415                 420ggc gcc atg atc gaa gtt cca gca gca tcc ctg atg gca gac aag atc   1411Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu Met Ala Asp Lys Ile
        425                 430                 435atg cct cac ctg gac ttt gtt tcc atc ggt acc aac gac ctg acc cag   1459Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln
    440                 445                 450tac acc atg gca gcg gac cgc atg tct cct gag ctt gcc tac ctg acc   1507Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu Leu Ala Tyr Leu Thr
455                 460                 465gat cct tgg cag cca gca gtc ctg cgc ctg atc aag cac acc tgt gac   1555Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile Lys His Thr Cys Asp470                 475                 480                 485gaa ggt gct cgc ttt aac acc ccg gtc ggt gtt tgt ggt gaa gca gca   1603Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val Cys Gly Glu Ala Ala
            490                 495                 500gca gac cca ctg ttg gca act gtc ctc acc ggt ctt ggc gtg aac tcc   1651Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Asn Ser
        505                 510                 515ctg tcc gca gca tcc act gct ctc gca gca gtc ggt gca aag ctg tca   1699Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val Gly Ala Lys Leu Ser
    520                 525                 530gag gtc acc ctg gaa acc tgt aag aag gca gca gaa gca gca ctt gac   1747Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asp
535                 540                 545gct gaa ggt gca act gaa gca cgc gat gct gta cgc gca gtg atc gac  1795Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val Arg Ala Val Ile Asp550                 555                 560                 565gca gca gtc taaaccactg ttgagctaaa aag                            1827Ala Ala Val<210>18<211>568<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>18Val Ala Thr Val Ala Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr1               5                  10                  15Gly Val Val Gly Gly Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro
         20                  25                  30Arg Pro Glu Leu Pro Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg
     35                  40                  45Glu Ala Glu Gln Glu Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser
 50                  55                  60Arg Leu Leu Glu Arg Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val65                  70                  75                  80Leu Lys Ala Thr Ala Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala
             85                  90                  95Val Ile Lys Gly Val Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val
        100                 105                 110Ala Ala Thr Thr Lys Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu
    115                 120                 125Ile Ala Glu Arg Thr Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile
130                 135                 140Ala Glu Leu Arg Gly Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly145                 150                 155                 160Gln Val Ile Leu Phe Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala
            165                 170                 175Leu Asp Thr Asp Leu Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro
        180                 185                 190Thr Ser His Thr Ala Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile
    195                 200                 205Val Ala Ser Gly Ala Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val
210                 215                 220Leu Ile Asp Gly Ser Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala225                 230                 235                 240Glu Ala Thr Lys Leu Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile
            245                 250                 255Ala Glu Trp Lys Gly Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln
        260                 265                 270Leu Leu Ala Asn Val Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln
    275                 280                 285Thr Glu Ala Glu Gly Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu
 90                 295                 300Ser Ala Thr Glu Glu Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser305                 310                 315                 320Lys Val Leu Glu Ala Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu
            325                 330                 335Asp Ala Gly Ser Asp Lys Pro Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu
        340                 345                 350Met Asn Pro Ala Leu Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln
    355                 360                 365Val Asp Leu Leu Thr Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu
370                 375                 380Glu Leu Gly Arg Gly Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met385                  390                  395               400Val Ala Thr Ala Tyr Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu
            405                 410                 415Arg Gly Leu Ile Ala Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu
        420                 425                 430Met Ala Asp Lys Ile Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr
    435                 440                 445Asn Asp Leu Thr Gln Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu
450                 455                 460Leu Ala Tyr Leu Thr Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile465                 470                 475                 480Lys His Thr Cys Asp Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val
            485                 490                 495Cys Gly Glu Ala Ala Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly
        500                 505                 510Leu Gly Val Asn Ser Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val
    515                 520                 525Gly Ala Lys Leu Ser Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala
530                 535                 540Glu Ala Ala Leu Asp Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val545                 550                 555                 560Arg Ala Val Ile Asp Ala Ala Val
            565<210>19<211>1629<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(98)..(1606)<223>FRXA01244<400>19agatgtcgat ttctcgagga agaagttaac gccgaagaaa accgtgaatc agagcaggag  60cgcttcgacg ccgctgcagc cacagtctct tcttcgt ttg ctt gag cgc tcc gaa   115
                                     Leu Leu Glu Arg Ser Glu
                                       1               5gct gct gaa gga cca gca gct gag gtg ctt aaa gct act gct ggc atg    163Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val Leu Lys Ala Thr Ala Gly Met
         10                  15                  20gtc aat gac cgt ggc tgg cgt aag gct gtc atc aag ggt gtc aag ggt    211Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala Val Ile Lys Gly Val Lys Gly
     25                  30                  35ggt cac cct gcg gaa tac gcc gtg gtt gca gca aca acc aag ttc atc    259Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val Ala Ala Thr Thr Lys Phe Ile
 40                  45                  50tcc atg ttc gaa gcc gca ggc ggc ctg atc gcg gag cgc acc aca gac    307Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu Ile Ala Glu Arg Thr Thr Asp55                  60                  65                  70ttg cgc gac atc cgc gac cgc gtc atc gca gaa ctt cgt ggc gat gaa    355Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile Ala Glu Leu Arg Gly Asp Glu
             75                  80                  85gag cca ggt ctg cca gct gtt tcc gga cag gtc att ctc ttt gca gat    403Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly Gln Val Ile Leu Phe Ala Asp
         90                  95                 100gac ctc tcc cca gca gac acc gcg gca cta gac aca gat ctc ttt gtg    451Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala Leu Asp Thr Asp Leu Phe Val
    105                 110                 115gga ctt gtc act gag ctg ggt ggc cca acg agc cac acc gcg atc atc    499Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro Thr Ser His Thr Ala Ile Ile
120                 125                 130gca cgc cag ctc aac gtg cct tgc atc gtc gca tcc ggc gcc ggc atc    547Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile Val Ala Ser Gly Ala Gly Ile135                 140                 145                 150aag gac atc aag tcc ggc gaa aag gtg ctt atc gac ggc agc ctc ggc   595Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val Leu Ile Asp Gly Ser Leu Gly
            155                 160                 165acc att gac cgc aac gcg gac gaa gct gaa gca acc aag ctc gtc tcc   643Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala Glu Ala Thr Lys Leu Val Ser
        170                 175                 180gag tcc ctc gag cgc gct gct cgc atc gcc gag tgg aag ggt cct gca   691Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile Ala Glu Trp Lys Gly Pro Ala
    185                 190                 195caa acc aag gac ggc tac cgc gtt cag ctg ttg gcc aac gtc caa gac   739Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln Leu Leu Ala Asn Val Gln Asp
200                 205                 210ggc aac tct gca cag cag gct gca cag acc gaa gca gaa ggc atc ggc   787Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln Thr Glu Ala Glu Gly Ile Gly215                 220                 225                 230ctg ttc cgc acc gaa ctg tgc ttc ctt tcc gcc acc gaa gag cca agc   835Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu Ser Ala Thr Glu Glu Pro Ser
            235                 240                 245gtt gat gag cag gct gcg gtc tac tca aag gtg ctt gaa gca ttc cca   883Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser Lys Val Leu Glu Ala Phe Pro
        250                 255                 260gag tcc aag gtc gtt gtc cgc tcc ctc gac gca ggt tct gac aag cca   931Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu Asp Ala Gly Ser Asp Lys Pro
    265                 270                 275gtt cca ttc gca tcg atg gct gat gag atg aac cca gca ctg ggt gtt   979Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu Met Asn Pro Ala Leu Gly Val
280                 285                 290cgt ggc ctg cgt atc gca cgt gga cag gtt gat ctg ctg act cgc cag   1027Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln Val Asp Leu Leu Thr Arg Gln295                 300                 305                 310ctc gac gca att gcg aag gcc agc gaa gaa ctc ggc cgt ggc gac gac   1075Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu Glu Leu Gly Arg Gly Asp Asp
            315                 320                 325gcc cca acc tgg gtt atg gct cca atg gtg gct acc gct tat gaa gca   1123Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met Val Ala Thr Ala Tyr Glu Ala
        330                 335                 340aag tgg ttt gct gac atg tgc cgt gag cgt ggc cta atc gcc ggc gcc   1171Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu Arg Gly Leu Ile Ala Gly Ala
    345                 350                 355atg atc gaa gtt cca gca gca tcc ctg atg gca gac aag atc atg cct   1219Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu Met Ala Asp Lys Ile Met Pro
360                 365                 370cac ctg gac ttt gtt tcc atc ggt acc aac gac ctg acc cag tac acc   1267His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln Tyr Thr375                 380                 385                 390atg gca gcg gac cgc atg tct cct gag ctt gcc tac ctg acc gat cct   1315Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu Leu Ala Tyr Leu Thr Asp Pro
            395                 400                 405tgg cag cca gca gtc ctg cgc ctg atc aag cac acc tgt gac gaa ggt   1363Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile Lys His Thr Cys Asp Glu Gly
        410                 415                 420gct cgc ttt aac acc ccg gtc ggt gtt tgt ggt gaa gca gca gca gac   1411Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val Cys Gly Glu Ala Ala Ala Asp
    425                 430                 435cca ctg ttg gca act gtc ctc acc ggt ctt ggc gtg aac tcc ctg tcc   1459Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Asn Ser Leu Ser
440                 445                 450gca gca tcc act gct ctc gca gca gtc ggt gca aag ctg tca gag gtc   1507Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val Gly Ala Lys Leu Ser Glu Val455                 460                 465                 470acc ctg gaa acc tgt aag aag gca gca gaa gca gca ctt gac gct gaa   1555Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asp Ala Glu
            475                 480                 485ggt gca act gaa gca cgc gat gct gta cgc gca gtg atc gac gca gca   1603Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val Arg Ala Val Ile Asp Ala Ala
        490                 495                 500gtc taaaccactg ttgagctaaa aag                                     1629Val<210>20<211>503<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>20Leu Leu Glu Arg Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val Leu1               5                  10                  15Lys Ala Thr Ala Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala Val
         20                  25                  30Ile Lys Gly Val Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val Ala
     35                  40                  45Ala Thr Thr Lys Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu Ile
 50                  55                  60Ala Glu Arg Thr Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile Ala65                  70                  75                  80Glu Leu Arg Gly Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly Gln
             85                  90                  95Val Ile Leu Phe Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala Leu
        100                 105                 110Asp Thr Asp Leu Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro Thr
    115                 120                 125Ser His Thr Ala Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile Val
130                 135                 140Ala Ser Gly Ala Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val Leu145                 150                 155                 160Ile Asp Gly Ser Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala Glu
            165                 170                 175Ala Thr Lys Leu Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile Ala
        180                 185                 190Glu Trp Lys Gly Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln Leu
    195                 200                 205Leu Ala Asn Val Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln Thr
210                 215                 220Glu Ala Glu Gly Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu Ser225                 230                 235                 240Ala Thr Glu Glu Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser Lys
            245                 250                 255Val Leu Glu Ala Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu Asp
        260                 265                 270Ala Gly Ser Asp Lys Pro Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu Met
    275                 280                 285Asn Pro Ala Leu Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln Val
290                 295                 300Asp Leu Leu Thr Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu Glu305                 310                 315                 320Leu Gly Arg Gly Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met Val
            325                 330                 335Ala Thr Ala Tyr Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu Arg
        340                 345                 350Gly Leu Ile Ala Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu Met
    355                 360                 365Ala Asp Lys Ile Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr Asn
370                 375                 380Asp Leu Thr Gln Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu Leu385                 390                 395                 400Ala Tyr Leu Thr Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile Lys
            405                 410                 415His Thr Cys Asp Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val Cys
        420                 425                 430Gly Glu Ala Ala Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly Leu
    435                 440                 445Gly Val Asn Ser Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val Gly
450                 455                 460Ala Lys Leu Ser Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala Glu465                 470                 475                 480Ala Ala Leu Asp Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val Arg
            485                 490                 495Ala Val Ile Asp Ala Ala Val
        500<210>21<211>390<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(367)<223>RXA01300<400>21gatcgacatt aaatcccctc ccttgggggg tttaactaac aaatcgctgc gccctaatcc 60gttcggatta acggcgtagc aacacgaaag gacactttcc atg gct tcc aag act   115
                                        Met Ala Ser Lys Thr
                                          1               5gta acc gtc ggt tcc tcc gtt ggc ctg cac gca cgt cca gca tcc atc   163Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala Arg Pro Ala Ser Ile
             10                  15                  20atc gct gaa gcg gct gct gag tac gac gac gaa atc ttg ctg acc ctg   211Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu Ile Leu Leu Thr Leu
         25                  30                  35gtt ggc tcc gat gat gac gaa gag acc gac gcg tcc tct tcc ctc atg  259Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ser Leu Met
     40                  45                  50atc atg gcg ctg ggc gca gag cac ggc aac gaa gtt acc gtc acc tcc  307Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu Val Thr Val Thr Ser
 55                  60                  65gac aac gct gaa gct gtt gag aag atc gct gcg ctt atc gca cag gac  355Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala Leu Ile Ala Gln Asp70                  75                  80                  85ctt gac gct gag taaacaacgc tctgcttgtt aaa                        390Leu Asp Ala Glu<210>22<211>89<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>22Met Ala Ser Lys Thr Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala1               5                  10                  15Arg Pro Ala Ser Ile Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu
         20                  25                  30Ile Leu Leu Thr Leu Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala
     35                  40                  45Ser Ser Ser Leu Met Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu
 50                  55                  60Val Thr Val Thr Ser Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala65                  70                  75                  80Leu Ile Ala Gln Asp Leu Asp Ala Glu
             85<210>23<211>508<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(508)<223>RXN03002<400>23ggaacttcga ggtgtcttcg tggggcgtac ggagatctag caagtgtggc tttatgtttg 60accctatccg aatcaacatg cagtgaatta acatctactt atg ttt gta ctc aaa   115
                                        Met Phe Val Leu Lys
                                          1               5gat ctg cta aag gca gaa cgc ata gaa ctc gac cgc acg gtc acc gat   163Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp Arg Thr Val Thr Asp
             10                  15                  20tgg cgt gaa ggc atc cgc gcc gca ggt gta ctc cta gaa aag aca aac   211Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu Leu Glu Lys Thr Asn
         25                  30                  35agc att gat tcc gcc tac acc gat gcc atg atc gcc agc gtg gaa gaa   259Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile Ala Ser Val Glu Glu
     40                  45                  50aaa ggc ccc tac att gtg gtc gct cca ggt ttc gct ttc gcg cac gcc   307Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe Ala Phe Ala His Ala
 55                  60                  65cgc ccc agc aga gca gtc cgc gag acc gct atg tcg tgg gtg cgc ctg   355Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu70                  75                  80                  85gcc tcc cct gtt tcc ttc ggt cac agt aag aat gat ccc ctc aat ctc   403Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn Asp Pro Leu Asn Leu
             90                  95                 100atc gtt gct ctc gct gcc aaa gat gcc acc gca cat acc caa gcg atg   451Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala His Thr Gln Ala Met
        105                 110                 115gcg gca ttg gct aaa gct tta gga aaa tac cga aag gat ctc gac gag  499Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg Lys Asp Leu Asp Glu
    120                 125                 130gca caa agt                                                      508Ala Gln Ser
135<210>24<211>136<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>24Met Phe Val Leu Lys Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp1               5                  10                  15Arg Thr Val Thr Asp Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu
         20                  25                  30Leu Glu Lys Thr Asn Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile
     35                  40                  45Ala Ser Val Glu Glu Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe
 50                  55                  60Ala Phe Ala His Ala Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met65                  70                  75                  80Ser Trp Val Arg Leu Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn
             85                  90                  95Asp Pro Leu Asn Leu Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala
        100                 105                 110His Thr Gln Ala Met Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg
    115                 120                 125Lys Asp Leu Asp Glu Ala Gln Ser
130                 135<210>25<211>789<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(14)..(766)<223>RXC00953<400>25cttgcattcc cca atg gcg cca cca acg gta ggc aac tac atc atg cag tcc 52
           Met Ala Pro Pro Thr Val Gly Asn Tyr Ile Met Gln Ser
             1               5                  10ttc act caa ggt ctg cag ttc ggc gtt gca gtt gcc gtg att ctc ttt    100Phe Thr Gln Gly Leu Gln Phe Gly Val Ala Val Ala Val Ile Leu Phe
 15                  20                  25ggt gtc cgc acc att ctt ggt gaa ctg gtc ccc gca ttc caa ggt att    148Gly Val Arg Thr Ile Leu Gly Glu Leu Val Pro Ala Phe Gln Gly Ile30                  35                  40                  45gct gcg aag gtt gtt ccc gga gct atc ccc gca ttg gat gca ccg atc    196Ala Ala Lys Val Val Pro Gly Ala Ile Pro Ala Leu Asp Ala Pro Ile
             50                 55                  60gtg ttc ccc tac gcg cag aac gcc gtt ctc att ggt ttc ttg tct tcc    244Val Phe Pro Tyr Ala Gln Asn Ala Val Leu Ile Gly Phe Leu Ser Ser
         65                  70                  75ttc gtc ggt ggc ttg gtt ggc ctg act gtt ctt gca tcg tgg ctg aac    292Phe Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Ser Trp Leu Asn
     80                  85                  90cca gct ttt ggt gtc gcg ttg att ctg cct ggt ttg gtc ccc cac ttc    340Pro Ala Phe Gly Val Ala Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Pro His Phe
  95                100                 105ttc act ggt ggc gcg gcg ggc gtt tac ggt aat gcc acg ggt ggt cgt    388Phe Thr Gly Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Asn Ala Thr Gly Gly Arg110                 115                 120                 125cga gga gca gta ttt ggc gcc ttt gcc aac ggt ctt ctg att acc ttc    436Arg Gly Ala Val Phe Gly Ala Phe Ala Asn Gly Leu Leu Ile Thr Phe
            130                 135                 140ctc cct gct ttc ctg ctt ggt gtg ctt ggt tcc ttc ggg tca gag aac   484Leu Pro Ala Phe Leu Leu Gly Val Leu Gly Ser Phe Gly Ser Glu Asn
        145                 150                 155acc act ttc ggt gat gcg gac ttt ggt tgg ttc gga atc gtt gtt ggt   532Thr Thr Phe Gly Asp Ala Asp Phe Gly Trp Phe Gly Ile Val Val Gly
    160                 165                 170tct gca gcc aag gtg gaa ggt gct ggc ggg ctc atc ttg ttg ctc atc   580Ser Ala Ala Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Leu Ile Leu Leu Leu Ile
175                 180                 185atc gca gcg gtt ctt ctg ggt ggc gcg atg gtc ttc cag aag cgc gtc   628Ile Ala Ala Val Leu Leu Gly Gly Ala Met Val Phe Gln Lys Arg Val190                 195                 200                 205gtg aat ggg cac tgg gat cca gct ccc aac cgt gag cgc gtg gag aag   676Val Asn Gly His Trp Asp Pro Ala Pro Asn Arg Glu Arg Val Glu Lys
            210                 215                 220gcg gaa gct gat gcc act cca acg gct ggg gct cgg acc tac cct aag   724Ala Glu Ala Asp Ala Thr Pro Thr Ala Gly Ala Arg Thr Tyr Pro Lys
        225                 230                 235att gct cct ccg gcg ggc gct cct acc cca ccg gct cga agc           766Ile Ala Pro Pro Ala Gly Ala Pro Thr Pro Pro Ala Arg Ser
    240                 245                 250taagatctcc aaaaccctga gat                                         789<210>26<211>251<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>26Met Ala Pro Pro Thr Val Gly Asn Tyr Ile Met Gln Ser Phe Thr Gln1               5                  10                  15Gly Leu Gln Phe Gly Val Ala Val Ala Val Ile Leu Phe Gly Val Arg
         20                  25                  30Thr Ile Leu Gly Glu Leu Val Pro Ala Phe Gln Gly Ile Ala Ala Lys
     35                  40                  45Val Val Pro Gly Ala Ile Pro Ala Leu Asp Ala Pro Ile Val Phe Pro
 50                  55                  60Tyr Ala Gln Asn Ala Val Leu Ile Gly Phe Leu Ser Ser Phe Val Gly65                  70                  75                  80Gly Leu Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Ser Trp Leu Asn Pro Ala Phe
             85                  90                  95Gly Val Ala Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Pro His Phe Phe Thr Gly
        100                 105                 110Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Asn Ala Thr Gly Gly Arg Arg Gly Ala
    115                 120                 125Val Phe Gly Ala Phe Ala Asn Gly Leu Leu Ile Thr Phe Leu Pro Ala
130                 135                 140Phe Leu Leu Gly Val Leu Gly Ser Phe Gly Ser Glu Asn Thr Thr Phe145                 150                 155                 160Gly Asp Ala Asp Phe Gly Trp Phe Gly Ile Val Val Gly Ser Ala Ala
            165                 170                 175Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Leu Ile Leu Leu Leu Ile Ile Ala Ala
        180                 185                 190Val Leu Leu Gly Gly Ala Met Val Phe Gln Lys Arg Val Val Asn Gly
    195                 200                 205His Trp Asp Pro Ala Pro Asn Arg Glu Arg Val Glu Lys Ala Glu Ala
210                 215                 220Asp Ala Thr Pro Thr Ala Gly Ala Arg Thr Tyr Pro Lys Ile Ala Pro225                 230                 235                 240Pro Ala Gly Ala Pro Thr Pro Pro Ala Arg Ser
            245                 250<210>27<211>553<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(553)<223>RXC03001<400>27cccggttcac gtgatcaatg acttcacgag caccgatgaa atcgatgctg cgcttcgtga 60acgctacgac atctaactac tttaaaagga cgaaaatatt atg gac tgg tta acc   115
                                        Met Asp Trp Leu Thr
                                          1               5att cct ctt ttc ctc gtt aat gaa atc ctt gcg gtt ccg gct ttc ctc   163Ile Pro Leu Phe Leu Val Asn Glu Ile Leu Ala Val Pro Ala Phe Leu
             10                  15                  20atc ggt atc atc acc gcc gtg gga ttg ggt gcc atg ggg cgt tcc gtc   211Ile Gly Ile Ile Thr Ala Val Gly Leu Gly Ala Met Gly Arg Ser Val
         25                  30                  35ggt cag gtt atc ggt gga gca atc aaa gca acg ttg ggc ttt ttg ctc   259Gly Gln Val Ile Gly Gly Ala Ile Lys Ala Thr Leu Gly Phe Leu Leu
     40                  45                  50att ggt gcg ggt gcc acg ttg gtc act gcc tcc ctg gag cca ctg ggt   307Ile Gly Ala Gly Ala Thr Leu Val Thr Ala Ser Leu Glu Pro Leu Gly
 55                  60                  65gcg atg atc atg ggt gcc aca ggc atg cgt ggt gtt gtc cca acg aat   355Ala Met Ile Met Gly Ala Thr Gly Met Arg Gly Val Val Pro Thr Asn70                  75                  80                  85gaa gcc atc gcc gga atc gca cag gct gaa tac ggc gcg cag gtg gcg   403Glu Ala Ile Ala Gly Ile Ala Gln Ala Glu Tyr Gly Ala Gln Val Ala
             90                  95                 100tgg ctg atg att ctg ggc ttc gcc atc tct ttg gtg ttg gct cgt ttc   451Trp Leu Met Ile Leu Gly Phe Ala Ile Ser Leu Val Leu Ala Arg Phe
        105                 110                 115acc aac ctg cgt tat gtc ttg ctc aac gga cac cac gtg ctg ttg atg  499Thr Asn Leu Arg Tyr Val Leu Leu Asn Gly His His Val Leu Leu Met
    120                 125                 130tgc acc atg ctc acc atg gtc ttg gcc acc gga aga gtt gat gcg tgg  547Cys Thr Met Leu Thr Met Val Leu Ala Thr Gly Arg Val Asp Ala Trp
135                 140                 145atc ttc                                                          553Ile Phe150<210>28<211>151<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>28Met Asp Trp Leu Thr Ile Pro Leu Phe Leu Val Asn Glu Ile Leu Ala1               5                  10                  15Val Pro Ala Phe Leu Ile Gly Ile Ile Thr Ala Val Gly Leu Gly Ala
         20                  25                  30Met Gly Arg Ser Val Gly Gln Val Ile Gly Gly Ala Ile Lys Ala Thr
     35                  40                  45Leu Gly Phe Leu Leu Ile Gly Ala Gly Ala Thr Leu Val Thr Ala Ser
 50                  55                  60Leu Glu Pro Leu Gly Ala Met Ile Met Gly Ala Thr Gly Met Arg Gly65                  70                  75                  80Val Val Pro Thr Asn Glu Ala Ile Ala Gly Ile Ala Gln Ala Glu Tyr
             85                  90                  95Gly Ala Gln Val Ala Trp Leu Met Ile Leu Gly Phe Ala Ile Ser Leu
        100                 105                 110Val Leu Ala Arg Phe Thr Asn Leu Arg Tyr Val Leu Leu Asn Gly His
    115                 120                 125His Val Leu Leu Met Cys Thr Met Leu Thr Met Val Leu Ala Thr Gly
130                 135                 140Arg Val Asp Ala Trp Ile Phe145                 150<210>29<211>2172<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(2149)<223>RXN01943<400>29ccgattcttt ttcggcccaa ttcgtaacgg cgatcctctt aagtggacaa gaaagtctct 60tgcccgcggg agacagaccc tacgtttaga aaggtttgac atg gcg tcc aaa ctg   115
                                        Met Ala Ser Lys Leu
                                          1               5acg acg aca tcg caa cat att ctg gaa aac ctt ggt gga cca gac aat   163Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu Gly Gly Pro Asp Asn
             10                  15                  20att act tcg atg act cac tgt gcg act cgc ctt cgc ttc caa gtg aag   211Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Phe Gln Val Lys
         25                  30                  35gat caa tcc att gtt gat caa caa gaa att gac tcc gac cca tca gtt   259Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp Ser Asp Pro Ser Val
     40                  45                  50ctt ggc gta gta ccc caa gga tcc acc ggt atg cag gtg gtg atg ggt   307Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met Gln Val Val Met Gly
 55                  60                  65gga tct gtt gca aac tat tac caa gaa atc ctc aaa ctt gat gga atg   355Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu Lys Leu Asp Gly Met70                  75                  80                  85aag cac ttc gcc gac ggt gaa gct aca gag agt tca tcc aag aag gaa   403Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser Ser Ser Lys Lys Glu
             90                  95                 100tac ggc gga gtc cgt ggc aag tac tcg tgg att gac tac gcc ttc gag   451Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Phe Glu
        105                 110                 115ttc ttg tct gat act ttc cga cca atc ctg tgg gcc ctg ctt ggt gcc   499Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp Ala Leu Leu Gly Ala
    120                 125                 130tca ctg att att acc ttg ttg gtt ctt gcg gat act ttc ggt ttg caa   547Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp Thr Phe Gly Leu Gln
135                 140                 145gac ttc cgc gct cca atg gat gag cag cct gat act tat gta ttc ctg   595Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp Thr Tyr Val Phe Leu150                 155                 160                 165cac tcc atg tgg cgc tcg gtc ttc tac ttc ctg cca att atg gtt ggt   643His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu Pro Ile Met Val Gly
            170                 175                 180gcc acc gca gct cga aag ctc ggc gca aac gag tgg att ggt gca gct   691Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu Trp Ile Gly Ala Ala
        185                 190                 195att cca gcc gca ctt ctt act cca gaa ttc ttg gca ctg ggt tct gcc   739Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu Ala Leu Gly Ser Ala
    200                 205                 210ggc gat acc gtc aca gtc ttt ggc ctg cca atg gtt ctg aat gac tac   787Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met Val Leu Asn Asp Tyr
215                 220                 225tcc gga cag gta ttc cca ccg ctg att gca gca att ggt ctg tac tgg   835Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala Ile Gly Leu Tyr Trp230                 235                 240                 245gtg gaa aag gga ctg aag aag atc atc cct gaa gca gtc caa atg gtg   883Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu Ala Val Gln Met Val
            250                 255                 260ttc gtc cca ttc ttc tcc ctg ctg att atg atc cca gcg acc gca ttc   931Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile Pro Ala Thr Ala Phe
        265                 270                 275ctg ctt gga cct ttc ggc atc ggt gtt ggt aac gga att tcc aac ctg   979Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn Gly Ile Ser Asn Leu
    280                 285                 290ctt gaa gcg att aac aac ttc agc cca ttt att ctt tcc atc gtt atc   1027Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile Leu Ser Ile Val Ile
295                 300                 305cca ttg ctc tac cca ttc ttg gtt cca ctt gga ttg cac tgg cca cta   1075Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly Leu His Trp Pro Leu310                 315                 320                 325aac gcc atc atg atc cag aac atc aac acc ctg ggt tac gac ttc att   1123Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu Gly Tyr Asp Phe Ile
            330                 335                 340cag gga cca atg ggt gcc tgg aac ttc gcc tgc ttc ggc ctg gtc acc   1171Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys Phe Gly Leu Val Thr
        345                 350                 355ggc gtg ttc ttg ctc tcc att aag gaa cga aac aag gcc atg cgt cag   1219Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn Lys Ala Met Arg Gln
    360                 365                 370gtt tcc ctg ggt ggc atg ttg gct ggt ttg ctc ggc ggc att tcc gag   1267Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu Gly Gly Ile Ser Glu
375                 380                 385cct tcc ctc tac ggt gtt ctg ctc cga ttc aag aag acc tac ttc cgc   1315Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys Lys Thr Tyr Phe Arg390                 395                 400                 405ctc ctg ccg ggt tgt ttg gca ggc ggt atc gtg atg ggc atc ttc gac   1363Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Gly Gly Ile Val Met Gly Ile Phe Asp
            410                 415                 420atc aag gcg tac gct ttc gtg ttc acc tcc ttg ctt acc atc cca gca   1411Ile Lys Ala Tyr Ala Phe Val Phe Thr Ser Leu Leu Thr Ile Pro Ala
        425                 430                 435atg gac cca tgg ttg ggc tac acc att ggt atc gca gtt gca ttc ttc   1459Met Asp Pro Trp Leu Gly Tyr Thr Ile Gly Ile Ala Val Ala Phe Phe
    440                 445                 450gtt tcc atg ttc ctt gtt ctc gca ctg gac tac cgt tcc aac gaa gag   1507Val Ser Met Phe Leu Val Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Ser Asn Glu Glu
455                 460                 465cgc gat gag gca cgt gca aag gtt gct gct gac aag cag gca gaa gaa   1555Arg Asp Glu Ala Arg Ala Lys Val Ala Ala Asp Lys Gln Ala Glu Glu470                 475                 480                 485gat ctg aag gca gaa gct aat gca act cct gca gct cca gta gct gct   1603Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asn Ala Thr Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala
            490                 495                 500gca ggt gcg gga gcc ggt gca ggt gca gga gcc gct gct ggc gct gca   1651Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala
        505                 510                 515acc gcc gtg gca gct aag ccg aag ctg gcc gct ggg gaa gta gtg gac   1699Thr Ala Val Ala Ala Lys Pro Lys Leu Ala Ala Gly Glu Val Val Asp
    520                 525                 530att gtt tcc cca ctc gaa ggc aag gca att cca ctt tct gaa gta cct   1747Ile Val Ser Pro Leu Glu Gly Lys Ala Ile Pro Leu Ser Glu Val Pro
535                 540                 545gac cca atc ttt gca gca ggc aag ctt gga cca ggc att gca atc caa   1795Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro Gly Ile Ala Ile Gln550                 555                 560                 565cca act gga aac acc gtt gtt gct cca gca gac gct act gtc atc ctt   1843Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp Ala Thr Val Ile Leu
            570                 575                 580gtc cag aaa tct gga cac gca gtg gca ttg cgc tta gat agc gga gtt   1891Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg Leu Asp Ser Gly Val
        585                 590                 595gaa atc ctt gtc cac gtt gga ttg gac acc gtg caa ttg ggc ggc gaa   1939Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val Gln Leu Gly Gly Glu
    600                 605                 610ggc ttc acc gtt cac gtt gag cgc agg cag caa gtc aag gcg ggg gat   1987Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln Val Lys Ala Gly Asp
615                 620                 625cca ctg atc act ttt gac gct gac ttc att cga tcc aag gat cta cct   2035Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg Ser Lys Asp Leu Pro630                 635                 640                 645ttg atc acc cca gtt gtg gtg tct aac gcc gcg aaa ttc ggt gaa att   2083Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala Lys Phe Gly Glu Ile
            650                 655                 660gaa ggt att cct gca gat cag gca aat tct tcc acg act gtg atc aag   2131Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser Thr Thr Val Ile Lys
        665                 670                 675gtc aac ggc aag aac gag taacctggga tccatgttgc gca                 2172Val Asn Gly Lys Asn Glu
    680<210>30<211>683<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400> 30Met Ala Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu1               5                  10                  15Gly Gly Pro Asp Asn Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu
         20                  25                  30Arg Phe Gln Val Lys Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp
     35                  40                  45Ser Asp Pro Ser Val Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met
 50                  55                  60Gln Val Val Met Gly Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu65                  70                  75                  80Lys Leu Asp Gly Met Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser
             85                  90                  95Ser Ser Lys Lys Glu Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile
        100                 105                 110Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp
    115                 120                 125Ala Leu Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp
130                 135                 140Thr Phe Gly Leu Gln Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp145                 150                 155                 160Thr Tyr Val Phe Leu His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu
            165                 170                 175Pro Ile Met Val Gly Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu
        180                 185                 190Trp Ile Gly Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu
    195                 200                 205Ala Leu Gly Ser Ala Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met
210                 215                 220Val Leu Asn Asp Tyr Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala225                 230                 235                 240Ile Gly Leu Tyr Trp Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu
            245                 250                 255Ala Val Gln Met Val Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile
        260                 265                 270Pro Ala Thr Ala Phe Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn
    275                 280                 285Gly Ile Ser Asn Leu Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile
290                 295                 300Leu Ser Ile Val Ile Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly305                 310                 315                 320Leu His Trp Pro Leu Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu
            325                 330                 335Gly Tyr Asp Phe Ile Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys
        340                 345                 350Phe Gly Leu Val Thr Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn
    355                 360                 365Lys Ala Met Arg Gln Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu
370                 375                 380Gly Gly Ile Ser Glu Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys385                 390                 395                 400Lys Thr Tyr Phe Arg Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Gly Gly Ile Val
            405                 4l0                 415Met Gly Ile Phe Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Phe Val Phe Thr Ser Leu
        420                 425                 430Leu Thr Ile Pro Ala Met Asp Pro Trp Leu Gly Tyr Thr Ile Gly Ile
    435                 440                 445Ala Val Ala Phe Phe Val Ser Met Phe Leu Val Leu Ala Leu Asp Tyr
450                 455                 460Arg Ser Asn Glu Glu Arg Asp Glu Ala Arg Ala Lys Val Ala Ala Asp465                 470                 475                 480Lys Gln Ala Glu Glu Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asn Ala Thr Pro Ala
            485                 490                 495Ala Pro Val Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
        500                 505                 510Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Val Ala Ala Lys Pro Lys Leu Ala Ala
    515                 520                 525Gly Glu Val Val Asp Ile Val Ser Pro Leu Glu Gly Lys Ala Ile Pro
530                 535                 540Leu Ser Glu Val Pro Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro545                 550                 555                 560Gly Ile Ala Ile Gln Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp
            565                 570                 575Ala Thr Val Ile Leu Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg
        580                 585                 590Leu Asp Ser Gly Val Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val
    595                 600                 605Gln Leu Gly Gly Glu Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln
610                 615                 620Val Lys Ala Gly Asp Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg625                 630                 635                 640Ser Lys Asp Leu Pro Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala
            645                 650                 655Lys Phe Gly Glu Ile Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser
        660                 665                 670Thr Thr Val Ile Lys Val Asn Gly Lys Asn Glu
    675                 680<210>31<211>1339<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(1339)<223>FRXA02191<400>31ccgattcttt ttcggcccaa ttcgtaacgg cgatcctctt aagtggacaa gaaagtctct 60tgcccgcggg agacagaccc tacgtttaga aaggtttgac atg gcg tcc aaa ctg   115
                                        Met Ala Ser Lys Leu
                                          1               5acg acg aca tcg caa cat att ctg gaa aac ctt ggt gga cca gac aat   163Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu Gly Gly Pro Asp Asn
             10                  15                  20att act tcg atg act cac tgt gcg act cgc ctt cgc ttc caa gtg aag   211Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Phe Gln Val Lys
         25                  30                  35gat caa tcc att gtt gat caa caa gaa att gac tcc gac cca tca gtt   259Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp Ser Asp Pro Ser Val
     40                  45                  50ctt ggc gta gta ccc caa gga tcc acc ggt atg cag gtg gtg atg ggt   307Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met Gln Val Val Met Gly
 55                  60                  65gga tct gtt gca aac tat tac caa gaa atc ctc aaa ctt gat gga atg   355Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu Lys Leu Asp Gly Met70                  75                  80                  85aag cac ttc gcc gac ggt gaa gct aca gag agt tca tcc aag aag gaa   403Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser Ser Ser Lys Lys Glu
             90                  95                 100tac ggc gga gtc cgt ggc aag tac tcg tgg att gac tac gcc ttc gag   451Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Phe Glu
        105                 110                 115ttc ttg tct gat act ttc cga cca atc ctg tgg gcc ctg ctt ggt gcc   499Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp Ala Leu Leu Gly Ala
    120                 125                 130tca ctg att att acc ttg ttg gtt ctt gcg gat act ttc ggt ttg caa   547Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp Thr Phe Gly Leu Gln
135                 140                 145gac ttc cgc gct cca atg gat gag cag cct gat act tat gta ttc ctg   595Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp Thr Tyr Val Phe Leu150                 155                 160                 165cac tcc atg tgg cgc tcg gtc ttc tac ttc ctg cca att atg gtt ggt   643His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu Pro Ile Met Val Gly
            170                 175                 180gcc acc gca gct cga aag ctc ggc gca aac gag tgg att ggt gca gct   691Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu Trp Ile Gly Ala Ala
        185                 190                 195att cca gcc gca ctt ctt act cca gaa ttc ttg gca ctg ggt tct gcc   739Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu Ala Leu Gly Ser Ala
    200                 205                 210ggc gat acc gtc aca gtc ttt ggc ctg cca atg gtt ctg aat gac tac   787Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met Val Leu Asn Asp Tyr
215                 220                 225tcc gga cag gta ttc cca ccg ctg att gca gca att ggt ctg tac tgg   835Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala Ile Gly Leu Tyr Trp230                 235                 240                 245gtg gaa aag gga ctg aag aag atc atc cct gaa gca gtc caa atg gtg   883Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu Ala Val Gln Met Val
            250                 255                 260ttc gtc cca ttc ttc tcc ctg ctg att atg atc cca gcg acc gca ttc   931Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile Pro Ala Thr Ala Phe
        265                 270                 275ctg ctt gga cct ttc ggc atc ggt gtt ggt aac gga att tcc aac ctg   979Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn Gly Ile Ser Asn Leu
    280                 285                 290ctt gaa gcg att aac aac ttc agc cca ttt att ctt tcc atc gtt atc   1027Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile Leu Ser Ile Val Ile
295                 300                 305cca ttg ctc tac cca ttc ttg gtt cca ctt gga ttg cac tgg cca cta   1075Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly Leu His Trp Pro Leu310                 315                 320                 325aac gcc atc atg atc cag aac atc aac acc ctg ggt tac gac ttc att   1123Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu Gly Tyr Asp Phe Ile
            330                 335                 340cag gga cca atg ggt gcc tgg aac ttc gcc tgc ttc ggc ctg gtc acc   1171Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys Phe Gly Leu Val Thr
        345                 350                 355ggc gtg ttc ttg ctc tcc att aag gaa cga aac aag gcc atg cgt cag   1219Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn Lys Ala Met Arg Gln
    360                 365                 370gtt tcc ctg ggt ggc atg ttg gct ggt ttg ctc ggc ggc att tcc gag   1267Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu Gly Gly Ile Ser Glu
375                 380                 385cct tcc ctc tac ggt gtt ctg ctc cga ttc aag aag acc tac ttc cgc   1315Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys Lys Thr Tyr Phe Arg390                 395                 400                 405ctc ctg ccg ggt tgt ttg gca gca                                   1339Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Ala
            410<210>32<211>413<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>32Met Ala Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu1               5                  10                  15Gly Gly Pro Asp Asn Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu
         20                  25                  30Arg Phe Gln Val Lys Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp
     35                  40                  45Ser Asp Pro Ser Val Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met
 50                  55                  60Gln Val Val Met Gly Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu65                  70                  75                  80Lys Leu Asp Gly Met Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser
             85                  90                  95Ser Ser Lys Lys Glu Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile
        100                 105                 110Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp
    115                 120                 125Ala Leu Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp
130                 135                 140Thr Phe Gly Leu Gln Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp145                 150                 155                 160Thr Tyr Val Phe Leu His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu
            165                 170                 175Pro Ile Met Val Gly Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu
        180                 185                 190Trp Ile Gly Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu
    195                 200                 205Ala Leu Gly Ser Ala Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met
210                 215                 220Val Leu Asn Asp Tyr Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala225                 230                 235                 240Ile Gly Leu Tyr Trp Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu
            245                 250                 255Ala Val Gln Met Val Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile
        260                 265                 270Pro Ala Thr Ala Phe Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn
    275                 280                 285Gly Ile Ser Asn Leu Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile
290                 295                 300Leu Ser Ile Val Ile Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly305                 310                 315                 320Leu His Trp Pro Leu Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu
            325                 330                 335Gly Tyr Asp Phe Ile Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys
        340                 345                 350Phe Gly Leu Val Thr Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn
    355                 360                 365Lys Ala Met Arg Gln Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu
370                 375                 380Gly Gly Ile Ser Glu Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys385                 390                 395                 400Lys Thr Tyr Phe Arg Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Ala
            405                 410<210>33<211>428<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(1)..(405)<223>FRXA01943<400>33cct gac cca atc ttt gca gca ggc aag ctt gga cca ggc att gca atc   48Pro Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro Gly Ile Ala Ile1               5                  10                  15caa cca act gga aac acc gtt gtt gct cca gca gac gct act gtc atc   96Gln Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp Ala Thr Val Ile
         20                  25                  30ctt gtc cag aaa tct gga cac gca gtg gca ttg cgc tta gat agc gga   144Leu Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg Leu Asp Ser Gly
     35                  40                  45gtt gaa atc ctt gtc cac gtt gga ttg gac acc gtg caa ttg ggc ggc   192Val Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val Gln Leu Gly Gly
 50                  55                  60gaa ggc ttc acc gtt cac gtt gag cgc agg cag caa gtc aag gcg ggg   240Glu Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln Val Lys Ala Gly65                  70                  75                  80gat cca ctg atc act ttt gac gct gac ttc att cga tcc aag gat cta   288Asp Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg Ser Lys Asp Leu
             85                  90                  95cct ttg atc acc cca gtt gtg gtg tct aac gcc gcg aaa ttc ggt gaa   336Pro Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala Lys Phe Gly Glu
        100                 105                 110att gaa ggt att cct gca gat cag gca aat tct tcc acg act gtg atc   384Ile Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser Thr Thr Val Ile
    115                 120                 125aag gtc aac ggc aag aac gag taacctggga tccatgttgc gca             428Lys Val Asn Gly Lys Asn Glu
130                 135<210>34<211>135<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)<400>34Pro Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro Gly Ile Ala Ile1               5                  10                  15Gln Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp Ala Thr Val Ile
         20                  25                  30Leu Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg Leu Asp Ser Gly
     35                  40                  45Val Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val Gln Leu Gly Gly
 50                  55                  60Glu Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln Val Lys Ala Gly65                  70                  75                  80Asp Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg Ser Lys Asp Leu
             85                  90                  95Pro Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala Lys Phe Gly Glu
        100                 105                 110Ile Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser Thr Thr Val Ile
    115                 120                 125Lys Val Asn Gly Lys Asn Glu
130                 135<210>35<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>35ggaaacagta tgaccatg                                        18<210>36<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：引物<400>36gtaaaacgac ggccagt                                         17

Claims (38)

1.从谷氨酸棒杆菌分离的，编码磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统蛋白质或者其片段的核酸分子，条件是该核酸分子不包括表1中列出的任何F-标明的基因。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所说的磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统蛋白质，选自参与转运葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、甘露醇、棉子糖、核糖、乳糖、麦芽糖、山梨糖、山梨糖醇、木糖和半乳糖的蛋白质。
3.分离的谷氨酸棒杆菌核酸分子，该分子选自序列表中以奇数序列号列出的序列或者其部分，条件是该核酸分子不包括表1中列出的任何F-标明的基因。
4.分离的编码多肽序列的核酸分子，该多肽序列选自序列表中以偶数序列号列出的序列，条件是该核酸分子不包括表1中列出的任何F-标明的基因。
5.分离的编码多肽的天然存在等位基因变体的核酸分子，该多肽序列选自序列表中以偶数序列号列出的序列的氨基酸序列，条件是该核酸分子不包括表1中列出的任何F-标明的基因。
6.分离的含有这样核苷酸序列的核酸分子，该序列与选自序列表中以奇数序列号列出的序列或者其部分的核苷酸序列有至少50％的同源性，条件是该核酸分子不包括表1中列出的任何F-标明的基因。
7.分离的含有至少15个核苷酸片段的核酸分子，该片段来自这样的核酸，该核酸含有选自序列表中以奇数序列号列出的序列的核苷酸序列，条件是该核酸分子不包括表1中列出的任何F-标明的基因。
8.分离的核酸分子，该核酸分子在严格条件下可以与权利要求1-7中任一项的核酸分子杂交。
9.分离的核酸分子，该核酸分子包括权利要求1-8中任一项的核酸分子或者其部分和编码异源多肽的核苷酸序列。
10.包含权利要求1-9中任一项核酸分子的载体。
11.权利要求10的载体，该载体是表达载体。
12.权利要求11的表达载体转染的宿主细胞。
13.权利要求12的宿主细胞，其中该细胞是微生物。
14.权利要求13的宿主细胞，其中该细胞属于棒杆菌属或者短杆菌属。
15.权利要求12的宿主细胞，其中所说的核酸分子的表达，导致该细胞精细化学物质生产的调节。
16.权利要求15的宿主细胞，其中所说的精细化学物质选自下列物质：有机酸，蛋白质源氨基酸，非蛋白质源氨基酸，嘌呤碱基和嘧啶碱基，核苷，核苷酸，脂质，饱和和不饱和脂肪酸，二醇，糖类，芳香族化合物，维生素，辅因子，聚酮化合物和酶。
17.生产多肽的方法，包括在合适的培养基中培养宿主细胞，从而生产多肽。
18.分离的来自谷氨酸棒杆菌的磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统多肽或者其片段。
19.权利要求18的蛋白质，其中所说的磷酸烯醇丙酮酸：糖类磷酸转移酶系统蛋白质，选自参与转运葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、甘露醇、棉子糖、核酮糖、核糖、乳糖、麦芽糖、山梨糖和半乳糖的蛋白质。
20.分离的含有这样氨基酸序列的多肽，该序列选自序列表中以偶数序列号列出的序列，条件是该氨基酸序列不是由表1中列出的任何F-标明的基因编码的。
21.分离的含有这样的多肽的天然存在等位基因变体的多肽，该多肽含有选自序列表中以偶数序列号列出的序列或其部分，条件是该氨基酸序列不是由表1中列出的任何F-标明的基因编码的。
22.权利要求18-21中任一项的分离的多肽，该多肽另外包含异源氨基酸序列。
23.分离的由核酸分子编码的多肽，该核酸分子包含的核苷酸序列，与选自序列表中以奇数序列号列出的序列的核酸，有至少50％的同源性，条件是该核酸分子不包括表1中列出的任何F-标明的核酸分子。
24.分离的多肽，该多肽包含的氨基酸序列，与选自序列表中以偶数序列号列出的序列的氨基酸序列，有至少50％的同源性，条件是该氨基酸序列不是由表1中列出的任何F-标明的基因编码的。
25.生产精细化学物质的方法，包括培养含有权利要求12的载体的细胞，从而产生精细化学物质。
26.权利要求25的方法，其中所说的方法另外包括从所说的培养物中回收精细化学物质的步骤。
27.权利要求25的方法，其中所说的方法另外包括用权利要求11的载体转染所说细胞的步骤，这导致产生含有该载体的细胞。
28.权利要求25的方法，其中所说的细胞属于棒杆菌属或者短杆菌属。
29.权利要求25的方法，其中所说的细胞选自以下菌株：谷氨酸棒杆菌、力士棒杆菌、百合花棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、嗜乙酰棒杆菌、产氨棒杆菌、Corynebacterium fujiokense、Corynebacterium nitrilophilus、产氨短杆菌、Brevibacterium butanicum、分歧短杆菌、黄色短杆菌、希氏短杆菌、酮戊二酸短杆菌、Brevibacteriumketosoreductum、乳发酵短杆菌、扩展短杆菌、解石蜡短杆菌和表3所列菌株。
30.权利要求25的方法，其中所说载体的核酸分子的表达，导致该细胞精细化学物质生产的调节。
31.权利要求25的方法，其中所说的精细化学物质选自下列物质：有机酸，蛋白质源氨基酸，非蛋白质源氨基酸，嘌呤碱基和嘧啶碱基，核苷，核苷酸，脂质，饱和和不饱和脂肪酸，二醇，糖类，芳香族化合物，维生素，辅因子，聚酮化合物和酶。
32.权利要求25的方法，其中所说的精细化学物质是氨基酸。
33.权利要求32的方法，其中所说的氨基酸选自下列氨基酸：赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸。
34.生产精细化学物质的方法，包括培养这样的细胞，该细胞的基因组DNA被插入了权利要求1-9中任一项的核酸分子而改变。
35.诊断受试者中白喉棒杆菌的存在或者活性的方法，包括检测受试者中列在序列表中的SEQ ID NO 1到34的一条或者多条序列的存在，条件是这些序列不是表1中列出的任何F-标明的序列或者由它们编码的序列，因此可以诊断受试者中白喉棒杆菌的存在或者活性。
36.含有选自序列表中以奇数序列号列出的核酸分子的核酸分子的宿主细胞，其中的核酸分子被破坏。
37.含有选自序列表中以奇数序列号列出的核酸分子的核酸分子的宿主细胞，其中的核酸分子含有一个或者多个对于序列表中以奇数序列号列出序列的核酸修饰。
38.含有选自序列表中以奇数序列号列出的核酸分子的核酸分子的宿主细胞，其中该核酸分子调节区域相对于该分子野生型调节区域进行了修饰。
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