CN1479789A - 棒状杆菌基因 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了称为MP核酸分子的分离核酸分子，其编码来自谷氨酸棒状杆菌的新MP蛋白。本发明还提供了反义核酸分子、含有MP核酸分子的重组表达载体、以及已导入该表达载体的宿主细胞。本发明还提供了分离的MP蛋白、突变的MP蛋白、融合蛋白、抗原肽，并基于谷氨酸棒状杆菌中MP基因的遗传工程提供了提高来自生物体的目标化合物产量的方法。

Description

棒状杆菌基因
本发明描述了称为MP核酸分子的分离核酸分子，其编码来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的新MP蛋白。本发明还提供了反义核酸分子、含有MP核酸分子的重组表达载体、以及已导入该表达载体的宿主细胞。本发明还提供了分离的MP蛋白、突变的MP蛋白、融合蛋白、抗原肽，并基于谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中MP基因的基因工程提供了提高来自该生物体的目标化合物产量的方法。
细胞中天然进行的代谢过程所产生的某些产物和副产物已用于多种工业中，包括食品、饲料、化妆品及制药工业。这些分子合起来称为‘精细化学品’，其包括有机酸、蛋白原性和非蛋白原性氨基酸、核苷酸和核苷、脂类和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素和辅因子以及酶。它们的产生最常见的是通过大规模培养经开发可以产生并分泌大量的特定目标分子的细菌而进行的。一种对此目的尤其有用的生物体是谷氨酸棒状杆菌，其为革兰氏阳性的非致病细菌。通过菌株选择，已开发了许多突变菌株，它们产生一系列的目标化合物。但是，选择用于制备特定分子的改良菌株是一个费时且困难的方法。
本发明提供了有多种用途的新细菌核酸分子。这些用途包括鉴定可用于产生精细化学品的微生物、在谷氨酸棒状杆菌或相关细菌中调节精细化学品的产生、对谷氨酸棒状杆菌或相关细菌进行分型和鉴定、作为参照点绘制谷氨酸棒状杆菌基因组、以及作为转化的标记物。这些新核酸分子编码的蛋白质文中称为代谢途径(MP)蛋白。
谷氨酸棒状杆菌为革兰氏阳性需氧细菌，其通常用在工业上用于大规模产生多种精细化学品，也用于降解碳水化合物(如在石油泄漏物中)，以及用于氧化萜类化合物。本发明的MP核酸分子因此可用于鉴定能例如通过发酵法用来产生精细化学品的微生物。可以通过调节本发明MP核酸的表达或改变本发明MP核酸分子的序列来改变微生物的一种或多种精细化学品的产生(例如，以提高来自棒状杆菌或短杆菌(Brevibacterium)种的一种或多种精细化学品的产率或产量)。
本发明的MP核酸也可用于鉴定属于谷氨酸棒状杆菌或其近亲的生物体，或用于鉴定在混合的微生物群体中谷氨酸棒状杆菌或其亲缘菌的存在。本发明提供了许多谷氨酸棒状杆菌基因的核酸序列；通过对微生物单一群体或混合群体培养物的基因组DNA提取物在严格条件下用跨越谷氨酸棒状杆菌所特有的谷氨酸棒状杆菌基因区域的探针进行探测，可确定该生物体是否存在。虽然谷氨酸棒状杆菌自身为非致病的，但它与对人具致病性的种如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉的致病因子)有亲缘关系；对此类生物体的检测具有显著的临床实用性。
本发明的MP核酸分子还可用作绘制谷氨酸棒状杆菌基因组或相关生物体基因组的参照点。类似地，这些分子或其变体或其部分可用作遗传工程化棒状杆菌或短杆菌种的标记物。
本发明的新核酸分子编码的MP蛋白能够例如实施某些精细化学品代谢中的酶促步骤，其中所述精细化学品包括氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷和海藻糖。考虑到可得到用于谷氨酸棒状杆菌中的克隆载体(如在Sinskey等人，美国专利号4,649,119中所公开的那些)和用于遗传操作谷氨酸棒状杆菌和相关短杆菌种(如乳糖发酵短杆菌(lactofermentum))的技术(Yoshihama等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)162：591-597(1985)；Katsumata等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)159：306-311(1984)；和Santamaria等人，普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)130：2237-2246(1984))，本发明的核酸分子可用于该生物体的遗传改造，使其成为一种或多种精细化学品的更好或更有效的生产者。
精细化学品提高的产量或产生效率可归因于操作本发明的基因的直接效果，或可归因于此类操作的间接效果。具体而言，谷氨酸棒状杆菌中氨基酸、维生素、辅因子、核苷酸和海藻糖代谢途径的改变可对来自该生物体的这些目标化合物中的一种或多种的总产量有直接影响。例如，优化海藻糖或赖氨酸或甲硫氨酸生物合成途径蛋白质的活性或降低海藻糖或赖氨酸或甲硫氨酸降解途径蛋白质的活性可导致此工程化生物体产生海藻糖或赖氨酸或甲硫氨酸的产率或产生效率提高。改变参与这些代谢途径的蛋白质也可对目标精细化学品的产量或产生效率有间接影响。例如，可去除竞争目标分子产生所需的中间体的反应，或可优化对目标化合物的特定中间体的产生所必需的途径。而且，对例如氨基酸、维生素或核苷酸的生物合成或降解的调节可提高微生物快速生长和分裂的总体能力，由此增加培养物中微生物的数量和/或生产能力，并因此增加目标精细化学品的可能产率。
本发明的核酸和蛋白质分子可用于直接提高谷氨酸棒状杆菌的一种或多种目标精细化学品的产量或产生效率。应用本领域熟知的重组遗传技术，可以操作本发明的一种或多种用于氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖的生物合成或降解酶，以改变其功能。例如，可提高生物合成酶的效率，或破坏其别构调节区从而阻止所产生化合物的反馈抑制作用。类似地，可以通过替换、删除或添加以缺失或改变降解酶，从而使其对目标化合物的降解活性减弱而又不影响细胞的存活力。在每种情况下，目标精细化学品的总产率或产生速率都可得以提高。
本发明的蛋白质和核苷酸分子中的此类改变还可能通过间接机制提高除氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷和海藻糖外的其它精细化学品的产量。任一化合物的代谢都必然与细胞内的其它生物合成和降解途径相联系，并且在一个途径中必需的辅因子、中间体或底物可能由另一此类途径提供或受限于另一此类途径。因此，通过调节一种或多种本发明蛋白质的活性，可影响另一精细化学品生物合成或降解途径的产量或活性功效。例如，氨基酸为所有蛋白质的结构单元，但其可以在细胞内以限制蛋白质合成的水平存在；因此，通过提高细胞内的一种或多种氨基酸的产生效率或产率，蛋白质(如生物合成或降解蛋白质)可较易于合成。同样，代谢途径酶的改变，其中该改变或多或少地有利于特定副反应时，可导致一种或多种用作目标精细化学品产生的中间体或底物的化合物过量产生或产生不足。
本发明提供了编码文中称为代谢途径蛋白(MP)的新核酸分子，该蛋白质能够例如实施酶促步骤，即参与对细胞行使正常功能重要的分子的代谢的酶促步骤，其中所述分子如氨基酸、维生素、辅因子、核苷酸和核苷或海藻糖。编码MP蛋白的核酸分子文中称为MP核酸分子。在一个优选的实施方案中，MP蛋白实施与一种或多种下列分子的代谢相关的酶促步骤：氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷和海藻糖。此类蛋白质的实例包括表1中所列基因编码的那些蛋白质。
   表1：本申请的基因
核酸SEQ ID NO 氨基酸SEQ ID NO   基因名(标识符)     功能
1 2 MetH   5-甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶(EC 2.1.1.13)
    3     4     TreS   海藻糖合成酶
因此，本发明的一个方面涉及包含编码MP蛋白或其生物活性部分的核苷酸序列的分离核酸分子(如cDNAs、DNAs或RNAs)，以及适用于作为引物或杂交探针用来检测或扩增编码MP的核酸的核酸片段(如DNA或mRNA)。在尤其优选的实施方案中，该分离的核酸分子包含序列表中SEQID NO奇数编号的核苷酸序列(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3)之一，或包含这些核苷酸序列之一的编码区或其互补序列。在其它尤其优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子包含这样的核苷酸序列，其与编码序列表中SEQID NO偶数编号的蛋白质序列(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4)或其片段的核苷酸序列可杂交或具有至少约63％，优选地至少约71％，更优选地至少约75％，80％或90％，且甚至更优选地至少约95％，96％，97％，98％，99％或更高的同源性。在其它优选的实施方案中，该分离的核酸分子编码序列表中SEQ ID NO偶数编号的氨基酸序列(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4)之一。本发明优选的MP蛋白还优选具有至少一种文中描述的MP活性。
在另一实施方案中，该分离的核酸分子编码这样的蛋白质或其部分，该蛋白质或其部分包含与本发明的氨基酸序列(如在序列表中具有SEQ IDNO偶数编号的序列)充分同源(例如充分同源于本发明的氨基酸序列以致该蛋白质或其部分保留MP活性)的氨基酸序列。优选地，该核酸分子编码的蛋白质或其部分保留在氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中实施酶促反应的能力。在一个实施方案中，该核酸分子编码的蛋白质与本发明的氨基酸序列(例如，选自序列表中具有SEQID NO偶数编号的那些序列的全长氨基酸序列)具有至少约63％，优选地至少约71％，且更优选地至少约75％，80％或90％，且最优选地至少约95％，96％，97％，98％或99％或更高的同源性。在另一优选的实施方案中，该蛋白质为全长的谷氨酸棒状杆菌蛋白质，其与本发明的全长氨基酸序列(由序列表中相应奇数编号的SEQ ID NO所示的开放读码框编码(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4))具有实质上的同源性。
在另一优选的实施方案中，该分离的核酸分子来自谷氨酸棒状杆菌并编码蛋白质(如MP融合蛋白)，其中所述蛋白质包括至少约50％或更高地同源于本发明的一个氨基酸序列(如序列表中偶数编号的SEQ ID NO之一的序列)且可催化氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的反应或具有表1中所示的一种或多种活性的生物活性结构域，并且该核酸分子还包括编码异源多肽的异源核酸序列或调控区。
在另一实施方案中，该分离的核酸分子至少长15个核苷酸，并且可以在严格条件下与包含本发明核苷酸序列(如在序列表中奇数编号的SEQ IDNO的序列)的核酸分子杂交。优选地，该分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子。更优选地，该分离的核酸编码天然存在的谷氨酸棒状杆菌MP蛋白或其生物活性部分。
本发明的另一方面涉及含有本发明核酸分子的载体如重组表达载体，并涉及已导入此类载体的宿主细胞。在一个实施方案中，通过在合适的培养基中培养此宿主细胞用于产生MP蛋白。然后MP蛋白可从培养基或宿主细胞分离。
本发明的又一方面涉及遗传改变的微生物，其中已导入MP基因或已改变MP基因。在一个实施方案中，微生物的基因组已通过导入作为转基因的本发明核酸分子而改变，其中所述本发明核酸分子编码野生型或突变的MP序列。在另一实施方案中，微生物基因组中的内源MP基因已通过与改变的MP基因进行同源重组而被改变，例如被功能性破坏。在另一实施方案中，微生物中的内源或导入的MP基因已通过一处或多处点突变、缺失或倒位而改变，但仍编码功能MP蛋白。又在另一实施方案中，微生物中MP基因的一个或多个调节区(如启动子、阻遏子或诱导子)已被改变(如通过缺失、截短、倒位或点突变)，从而改变了MP基因的表达。在一个优选的实施方案中，微生物属于棒状杆菌属或短杆菌属，尤其优选谷氨酸棒状杆菌。在一个优选的实施方案中，微生物也用于制备目标化合物，所述目标化合物如海藻糖或氨基酸，尤其优选赖氨酸和甲硫氨酸。
在另一方面，本发明提供了在受试对象中鉴定白喉棒状杆菌的存在或活性的方法。该方法包括在受试对象中检测本发明的一个或多个核酸或氨基酸序列(如，序列表中SEQ ID NO 1至4所示的序列)，由此查明受试对象中白喉棒状杆菌的存在或活性。
本发明的另一方面涉及分离的MP蛋白或其部分如生物活性部分。在一个优选的实施方案中，分离的MP蛋白或其部分可催化参与氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢的一个或多个途径的酶促反应。在另一优选的实施方案中，分离的MP蛋白或其部分与本发明的氨基酸序列(例如，在序列表中偶数编号的SEQ ID NO的序列)充分同源，以致该蛋白质或其部分保留了催化参与氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢的一个或多个途径的酶促反应的能力。
本发明也提供了分离的MP蛋白制品。在优选的实施方案中，该MP蛋白包含本发明的氨基酸序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)。在另一优选的实施方案中，本发明涉及分离的全长蛋白质，其与本发明的全长氨基酸序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)(由序列表中相应的奇数编号SEQ ID NO：所示的开放读码框编码)具有实质上的同源性。又在另一实施方案中，该蛋白质至少约63％，优选地至少约71％，且更优选地至少约75％，80％或90％，且最优选地至少约95％，96％，97％，98％或99％或更高地同源于本发明的全长氨基酸序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)。在其它实施方案中，该分离的MP蛋白包含至少约63％或更高地同源于本发明的氨基酸序列之一(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)的氨基酸序列，且该分离的MP蛋白可催化氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或具有表1中所示的一种或多种活性。
或者，分离的MP蛋白可以包含由如下核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列可以与编码具有序列表中偶数编号的SEQ ID NO序列之一的蛋白质的核苷酸序列杂交(如在严格条件下杂交)或与之具有至少约63％，优选地至少约71％，更优选地至少约70％，80％或90％，且甚至更优选地至少约95％，96％，97％，98％或99％或更高的同源性。也优选的是：优选的MP蛋白形式还具有文中描述的一种或多种MP生物活性。
MP多肽或其生物活性部分可以操作性地连接非MP多肽形成融合蛋白。在优选的实施方案中，该融合蛋白具有的活性不同于单独的MP蛋白。在其它优选的实施方案中，该融合蛋白在导入谷氨酸棒状杆菌的氨基酸、维生素、辅因子、营养药的代谢途径中后导致谷氨酸棒状杆菌产生目标精细化学品的产率和/或生产效率提高。在尤其优选的实施方案中，将该融合蛋白整合入宿主细胞的氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途中后，细胞的目标化合物产生被改变。
在另一方面，本发明提供了用于筛选调节MP蛋白活性的分子的方法，其中所述调节分子可以通过与MP蛋白自身或其底物或MP蛋白的结合配偶体相互作用，或通过调节本发明MP核酸分子的转录或翻译而起作用。
本发明的另一方面涉及用于产生精细化学品的方法。该方法包括培养包含指导本发明MP核酸分子表达的载体的细胞，由此产生精细化学品。在一个优选的实施方案中，该方法还包括获得包含此载体的细胞的步骤，其中细胞用指导MP核酸表达的载体转染。在另一优选的实施方案中，该方法还包括从培养物中回收精细化学品的步骤。在一个尤其优选的实施方案中，细胞来自棒状杆菌属或短杆菌属，或选自表2中所示的那些菌株。
    表2：可用于本发明实践中的棒状杆菌和短杆菌菌株
属 种 ATCC  FERM  NRRL  CECT  NCIMB  CBS  NCTC  DSMZ
短杆菌 产氨短杆菌(Ammoniagenes) 21054
短杆菌 产氨短杆菌 19350
短杆菌 产氨短杆菌 19351
短杆菌 产氨短杆菌 19352
短杆菌 产氨短杆菌 19353
短杆菌 产氨短杆菌 19354
短杆菌 产氨短杆菌 19355
短杆菌 产氨短杆菌 19356
短杆菌 产氨短杆菌 21055
短杆菌 产氨短杆菌 21077
短杆菌 产氨短杆菌 21553
短杆菌 产氨短杆菌 21580
短杆菌 产氨短杆菌 39101
短杆菌 Butanicum 21196
短杆菌 叉开短杆(Divaricatum) 21792  P928
短杆菌 黄色短菌(Flavum) 21474
短杆菌 黄色杆菌 21129
短杆菌 黄短杆菌 21518
短杆菌 色短杆菌 B11474
短杆菌 黄色短杆菌 B11472
短杆菌 黄色短杆菌 21127
短杆菌 黄色短杆菌 21128
短杆菌 黄色短杆菌 21427
短杆菌 黄色短杆菌 21475
短杆菌 黄色短杆菌 21517
短杆菌 黄色短杆菌 21528
短杆菌 黄色短杆菌 21529
短杆菌 黄色短杆菌 B11477
短杆菌 黄色短杆菌 B11478
短杆菌 黄色短杆菌 21127
短杆菌 黄色短杆菌 B11474
短杆菌 希氏短杆菌(Healii) 15527
短杆菌 Ketoglutamicum 21004
短杆菌 Ketoglutamicum 21089
短杆菌 Ketosoreductum 21914
短杆菌 乳糖发酵短杆菌(Lactofermentum) 70
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 74
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 77
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 21798
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 21799
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 21800
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 21801
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 B11470
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 B11471
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 21086
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 21420
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 21086
短杆菌 乳糖发酵短杆菌 31269
短杆菌 Linens 9174
短杆菌 Linens 19391
短杆菌 Linens 8377
短杆菌 Paraffinolyticum  11160
短杆菌 种  717.73
短杆菌 种  717.7
 3
短杆菌 种 14604
短杆菌 种 21860
短杆菌 种 21864
短杆菌 种 21865
短杆菌 种 21866
短杆菌 种 19240
棒状杆菌 嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Acetoacidophilum) 21476
棒状杆菌 嗜乙酰乙酸棒状杆菌 13870
棒状杆菌 Acetoglutamicum  B11473
棒状杆菌 Acetoglutamicum  B11475
棒状杆菌 Acetoglutamicum 15806
棒状杆菌 Acetoglutamicum 21491
棒状杆菌 Acetoglutamicum 31270
棒状杆菌 嗜乙酰棒状杆菌(Acetophilum)  B3671
棒状杆菌 产氨棒状杆菌(Ammoniagenes) 6872  2399
棒状杆菌 产氨棒状杆菌 15511
棒状杆菌 Fujiokense 21496
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 14067
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 39137
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21254
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21255
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 31830
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 13032
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 14305
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 15455
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 13058
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 13059
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 13060
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21492
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21513
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21526
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21543
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 13287
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21851
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21253
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21514
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21516
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21299
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21300
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 39684
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21488
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21649
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21650
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19223
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 13869
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21157
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21158
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21159
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21355
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 31808
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21674
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21562
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21563
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21564
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21565
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21566
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21567
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21568
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21569
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21570
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21571
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21572
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21573
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21579
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19049
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19050
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19051
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19052
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19053
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19054
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19055
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19056
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19057
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19058
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19059
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19060
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 19185
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 13286
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21515
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21527
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21544
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21492
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 B8183
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 B8182
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 B12416
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 B12417
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 B12418
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 B11476
棒状杆菌 谷氨酸棒状杆菌 21608
棒状杆菌 百合棒状杆菌(Iilium) P973
棒状杆菌 nitrilophilus 21419 11594
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ATCC：美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，
  Rockville，MD，美国FERM：发酵研究所(Fermentation Research Institute)，Chiba，日本NRRL：农业研究机构保藏中心，北方研究室(ARS Culture Collection，Northern Regional Research Laboratory)，Peoria，IL，美国CECT：西班牙典型培养物保藏中心，Valencia，西班牙NCIMB：国立工业和海洋微生物保藏有限公司，英国CBS：真菌菌种保藏中心，NLNCTC：国立典型培养物保藏中心(National Collection of TypeCultures)，伦敦，英国DSMZ：德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)，Braunschweig，德国
本发明的另一方面涉及用于调节微生物的分子产生的方法。此类方法包括将细胞与调节MP蛋白活性或MP核酸表达的试剂接触，这样细胞相关的活性相对于缺少该试剂时的同一活性而言被改变。在一个优选的实施方案中，对细胞的一个或多个谷氨酸棒状杆菌的氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径进行调节，由此提高该微生物产生目标精细化学品的产率或生产速率。调节MP蛋白活性的试剂可为刺激MP蛋白活性或MP核酸表达的试剂。刺激MP蛋白活性或MP核酸表达的试剂的实例包括小分子、活性MP蛋白和已导入细胞中编码MP蛋白的核酸。抑制MP活性或表达的试剂的实例包括小分子和反义MP核酸分子。
本发明的另一方面涉及用于改变细胞的目标化合物产率的方法，其包括将野生型或突变MP基因导入细胞，其中所述野生型或突变MP基因或位于独立的质粒上或被整合入宿主细胞的基因组中。如果整合入基因组，此整合可为随机的，或此整合可通过同源重组而进行，这样天然基因被导入的拷贝替换从而改变细胞的目标化合物生产。在一个优选的实施方案中，所述产率被增加。在另一优选的实施方案中，所述化学品为精细化学品。在一个尤其优选的实施方案中，所述精细化学品为海藻糖或氨基酸。在尤其优选的实施方案中，所述氨基酸为L-赖氨酸和L-甲硫氨酸。发明详述
本发明提供了参与谷氨酸棒状杆菌中某些精细化学品(包括氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷和海藻糖)代谢的MP核酸和蛋白质分子。本发明的这些分子可用于调节微生物如谷氨酸棒状杆菌对精细化学品的生产，此调节可以是直接的(例如，改变海藻糖或赖氨酸或甲硫氨酸生物合成蛋白的活性可以对该生物体的海藻糖或赖氨酸或甲硫氨酸的产量或产生效率有直接影响)，或可以具有导致目标化合物产率或产生效率增加的间接影响(例如，改变核苷酸生物合成蛋白的活性可影响该细菌的有机酸或脂肪酸产生，这可能是因为提高了生长或增加了必需辅因子、能量化合物或前体分子的提供)。本发明的诸方面进一步阐述如下。
1.精细化学品
术语‘精细化学品’为本领域所认知，其包括用于多种工业的由生物体产生的分子如，其中所述工业例如但不限于制药、农业和化妆品工业。此类化合物包括有机酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白原性和非蛋白原性氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸(如在Rehm等人编辑的生物技术(Biotechnology)第6卷中Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相关化合物(Nucleotides and related compounds)，561-612页，VCH：Weinheim及其中所含参考文献中所述)、脂类、饱和和不饱和脂肪酸(如花生四烯酸)、二醇(如丙二醇和丁二醇)、碳水化合物(如透明质酸和海藻糖)、芳香化合物(如芳族胺、香草醛和靛蓝)、维生素和辅因子(见如Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A27卷，“维生素”(“Vitamins”)，443-613页(1996)VCH：Weinheim及其中的参考文献；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病“论文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行，AOCS Press，(1995))、酶、聚酮化合物(Cabe等人(1998)科学(Science)282：63-68)以及在Gutcho(1983)通过发酵的化学品(Chemicals by Fermentation)，Noyes Data Corporation，ISBN：0818805086和其中的参考文献中所述的所有其它化学品。这些精细化学品中的某些化学品的代谢和用途进一步阐述如下。A.氨基酸代谢和用途
氨基酸包括所有蛋白质的基本结构单元，并且为所有生物体的正常细胞功能所必需。术语”氨基酸”为本领域所认知。蛋白原性氨基酸有20种，为蛋白质的结构单元，在蛋白质中它们通过肽键连接，非蛋白原性氨基酸(已知成百种非蛋白原性氨基酸)在蛋白质中通常不存在(参见Ulmann工业化学百科全书，A2卷，57-97页，VCH：Weinheim(1985))。氨基酸可为D-或L-光学构型，尽管在天然存在的蛋白质中通常仅发现L-氨基酸。在原核和真核细胞中20种蛋白原性氨基酸的每一种的生物合成和降解途径均已充分阐明(参见例如，Stryer，L.生物化学(Biochemistry)，第三版，578-590页(1988))。‘必需’氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)，这样称呼是因为由于它们生物合成的复杂性致使它们通常为必需营养物，其易于通过简单的生物合成途径转化为其余11种‘非必需’氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)。高等动物保留了合成这些氨基酸中的一部分氨基酸的能力，但必需氨基酸必须从食物中提供，以进行正常的蛋白质合成。
除了它们在蛋白质生物合成中的作用外，这些氨基酸本身也是令人感兴趣的化学品，并且许多已发现在食品、饲料、化学品、化妆品、农业和制药工业中具有多种应用。在营养上，赖氨酸不仅对人而且对单胃动物如禽和猪都是一种重要的氨基酸。谷氨酸盐是最常用的调味添加剂(谷氨酸单钠盐，MSG)，并且广泛用于食品工业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于制药工业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于制药和化妆品工业。苏氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常见的饲料添加剂。(Rehm等人(编辑)，生物技术(Biotechnology)，第6卷，第14a章中的Leuchtenberger，W.(1996)氨基酸—技术生产和用途，466-502页，VCH：Weinheim)。此外，这些氨基酸已发现可用作前体，用于合成合成的氨基酸和蛋白质，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨以及在Ulmann工业化学百科全书，A2卷，57-97页，VCH：Weinheim，1985中所述的那些。
已充分阐明了这些天然氨基酸在可产生它们的生物体如细菌中的生物合成(细菌氨基酸生物合成及其调节的综述，见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47：533-606)。谷氨酸通过还原胺化α-酮戊二酸(柠檬酸循环中的中间体)而合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸接下来由谷氨酸产生。丝氨酸的生物合成为三步，由3-磷酸甘油酸(糖酵解中间体)开始，在氧化、氨基转移和水解步骤后产生该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸两者均产生自丝氨酸；前者通过高半胱氨酸与丝氨酸缩合形成，后者在丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中通过侧链β-碳原子转移至四氢叶酸形成。苯丙氨酸和酪氨酸在9步的生物合成途径中合成自糖酵解和磷酸戊糖途径的前体赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸，它们的不同仅在预苯酸合成后的最后两步。色氨酸也从这两种起始分子产生，但其合成为11步的途径。酪氨酸也可在苯丙氨酸羟化酶催化的反应中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸均为丙酮酸盐(糖酵解的终产物)的生物合成产物。天冬氨酸形成自草酰乙酸(柠檬酸循环的中间体)。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸均通过转化天冬氨酸而形成。异亮氨酸从苏氨酸形成。已在多种生物体中研究了导致甲硫氨酸产生的生物合成途径，其显示出相似性和差异。第一步，高丝氨酸的酰化在所有的生物体中都是共同的，但转移的酰基基团的来源不同。大肠杆菌(Escherichia coli)和相关物种使用琥珀酰辅酶A(Michaeli，S.和Ron，E.Z.(1981)，含大肠杆菌K12的metA基因的质粒的构建和物理图谱，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)182，349-354)，而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Langin，T.，Faugeron，G.，Goyon，C.，Nicolas，A.和Rossignol，J.(1986)酿酒酵母的MET2基因：分子克隆和核苷酸序列.基因(Gene)49，283-293)、黄色短杆菌(Brevibacteriam flavum)(Miyajima，R.和Shiio，I.(1973)在黄色短杆菌中天冬氨酸族氨基酸生物合成的调节：高丝氨酸O-转乙酰酶的特性。生物化学杂志(J.Biochem.)73，1061-1068；Ozaki，H.和Shiio，I.(1982)黄色短杆菌中甲硫氨酸的生物合成：O-乙酰高丝氨酸硫解酶的特性和基本作用。生物化学杂志(J.Biochem.)91，1163-1171)、谷氨酸棒状杆菌(Park，S.-D.，Lee，J.-Y.，Kim，Y.，Kim，J.-H.和Lee，H.-S.(1998)分离和合成metA，一种在谷氨酸棒状杆菌中编码高丝氨酸乙酰转移酶的甲硫氨酸生物合成基因。分子细胞学(Mol.Cells)8，286-294)和Leptospira meyeri(Belfaiza，J.，Martel，A.，Maegarita.D.和Saint Girons，I.(1998)在Leptospira meyeri中直接硫解生物合成甲硫氨酸。细菌学杂志(J.Bacteriol.)180，250-255；Bourhy，P.，Martel，A.，Margarita，D.，Saint Girons，I.和Belfaiza，J.(1997)参与Leptospira meyeri甲硫氨酸生物合成途径的高丝氨酸O-乙酰转移酶不被反馈抑制。细菌学杂志(J.Bacteriol.)179，4396-4398)使用乙酰辅酶A作为酰基供体。从酰基高丝氨酸形成高半胱氨酸可以以两种不同方式进行。大肠杆菌使用转硫作用途径，其由胱硫醚γ-合酶(metB的产物)和胱硫醚β-裂合酶(metC的产物)催化。酿酒酵母(S.cerevisiae)(Cherest，H.和Surdin-Kerjan，Y.(1992)在酿酒酵母中赋予半胱氨酸营养缺陷型的新突变的遗传分析：硫代谢途径的更新。遗传学(Genetics)130，51-58)、黄色短杆菌(B.flavum)(Ozaki，H.和Shiio，I.(1982)黄色短杆菌中的甲硫氨酸生物合成：O-乙酰高丝氨酸硫解酶的特性和基本作用。生物化学杂志(J.Biochem.)91，1163-1171)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Foglino，M.，Borne，F.，Bally，M.，Ball，G.和Patte，J.C.(1995)在铜绿假单胞菌中用于甲硫氨酸生物合成的直接硫解途径。微生物学(Microbiology)141，431-439)以及L.meyeri(Belfaiza，J.，Martel，A.，Maegarita.D.和Saint Girons，I.(1998)在Leptospira meyeri中用于甲硫氨酸生物合成的直接硫解作用。细菌学杂志(J.Bacteriol.)180，250-255)使用直接硫解作用途径，其由酰基高丝氨酸硫解酶催化。不像只使用直接硫解作用途径的、亲缘关系接近的黄色短杆菌，在谷氨酸棒状杆菌细胞提取物中检测到了转硫作用途径的酶活性，且提出该途径为此生物体用于甲硫氨酸生物合成的途径(Hwang，B-J.，Kim，Y.，Kim，H.-B.，Kim，J.，Hwang，H.-J.和Lee，H.-S.(1999)谷氨酸棒状杆菌甲硫氨酸生物合成途径的分析：分离和分析编码胱硫醚γ-合酶的metB.Mol.Cells 9，300-308；Kase，H.和Nakayama，K.(1974)甲硫氨酸模拟抗性突变体的O-乙酰-L-高丝氨酸的产生和在谷氨酸棒状杆菌中高丝氨酸-O-转乙酰酶的调节.Agr.Biol.Chem.38，2021-2030；Park，S.-D.，Lee，J.-Y.，Kim，Y.，Kim，J.-H.和Lee，H.-S.(1998)分离和分析metA，一种在谷氨酸棒状杆菌中编码高丝氨酸乙酰转移酶的甲硫氨酸生物合成基因.Mol.Cells 8，286-294)。
虽然近年来分离了一些在谷氨酸棒状杆菌中参与甲硫氨酸生物合成的基因，但有关谷氨酸棒状杆菌中甲硫氨酸生物合成的信息还是有限的。虽然已从该生物体分离到metA和metB基因，且metC和metZ基因也已公知(表4)，但该生物合成的最后步骤仍不清楚。在本发明中，总体上揭示了谷氨酸棒状杆菌中产生甲硫氨酸的生物合成途径，并将负责该生物合成最后一步的生物合成基因定义为metH基因，其编码甲硫氨酸合酶。
经复杂的9-步途径导致从5-磷酸核糖-1-焦磷酸(一种活化糖)产生组氨酸。
超过细胞蛋白质合成所需量的氨基酸不能被贮藏，而是被降解以提供用于细胞主要代谢途径的中间体(综述参见Stryer，L.生物化学(Biochemistry)第三版，21章，”氨基酸降解和尿素循环”495-516页(1988))。虽然细胞可将不想要的氨基酸转化为有用的代谢中间体，但从所需用于合成氨基酸的能量、前体分子和酶来说，氨基酸的产生是昂贵的。因此氨基酸生物合成受到反馈抑制调节并不让人吃惊，其中特定氨基酸的存在起到减缓或完全终止其自身产生的作用(关于氨基酸生物合成途径中的反馈机制的综述参见Stryer，L.生物化学(Biochemistry)第三版，24章：”氨基酸和血红素的生物合成”575-600页(1988))。因此，任何特定氨基酸的产出都受到细胞中该氨基酸的存在量的限制。2.1维生素、辅因子和营养药的代谢和用途
维生素、辅因子和营养药包括高等动物不能合成由此必须摄取的另一类分子，但它们易于被其它生物体如细菌合成。这些分子要么自身为可以在多种代谢途径中作为电子载体或中间体的生物活性物质或为生物活性物质的前体。除了它们的营养价值外，这些化合物作为着色剂、抗氧化剂和催化剂或其它操作助剂也具有重要的工业价值(这些化合物的结构、活性和工业应用的概述参见例如，Ullman工业化学百科全书(Ullman’sEncyclopedia of Industria Chemistry)，“维生素”A27卷，443-613页，VCH：Weinheim，1996)。术语“维生素”为本领域认知，包括生物体行使正常功能所需的且生物体自身不能合成的营养。维生素组中包括辅因子和营养性化合物。术语“辅因子”包括进行正常酶促活性所需的非蛋白原性化合物。此类化合物可为有机的或无机的，本发明的辅因子优选是有机的。术语”营养药”包括对植物和动物尤其是人的健康有益的饮食补充物。此类分子的实例为维生素、抗氧化剂和某些脂类(如多不饱和脂肪酸)。
已在很大程序上阐明了这些分子在可产生它们的生物体如细菌中的生物合成(Ullman工业化学百科全书(Ullman’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，“维生素”A27卷，443-613页，VCH：Weinheim，1996；Michal，G.(1999)生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology)，John Wiley&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟的“营养、脂类、健康和疾病”会议论文集，1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行，AOCS Press：Champaign，IL X，374 S)。
硫胺素(维生素B1)由嘧啶和噻唑部分通过化学偶联产生。核黄素(维生素B2)由鸟苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黄素接下来用于合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合起来称为‘维生素B6’的化合物类(例如，吡哆素、吡哆胺、5’-磷酸吡哆醛和商业上使用的吡哆素盐酸盐)均为共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸，(R)-(+)-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可通过化学合成或发酵产生。泛酸生物合成的最后步骤由ATP-驱动的β-丙氨酸和泛解酸的缩合构成。负责转化产生泛解酸及β-丙氨酸和缩合形成泛酸这些生物合成步骤的酶是已知的。泛酸的代谢活性形式为辅酶A，其生物合成由5步酶促步骤进行。泛酸、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸形成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(维生素B5原)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)和辅酶A的产生。
已详细研究了微生物中生物素从前体分子庚二酰辅酶A的生物合成，并鉴定了几种所涉及的基因。发现许多相应的蛋白质也参与Fe-簇合成，为nifS类蛋白的成员。硫辛酸衍生自辛酸，并在能量代谢中作为辅酶，此时其成为丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体的一部分。叶酸盐为一组这样的物质，其均为叶酸衍生物，而叶酸又来自于L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已详细研究了某些微生物中始于代谢中间体鸟苷-5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸的叶酸及其衍生物的生物合成。
类咕啉(如钴胺素且尤其是维生素B12)和卟啉属于一组以四吡咯环体系为特征的化学品。维生素B12的生物合成太复杂，目前尚未彻底解释清楚，但许多涉及的酶和底物已知。烟酸(烟酸盐)和烟酰胺为吡啶衍生物，也称为‘尼克酸’。烟酸为重要的辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和它们的还原形式的前体。
这些化合物的大规模生产主要依赖于无细胞的化学合成，但这些化学品中的一些如核黄素、维生素B6、泛酸盐和生物素也已通过微生物的大规模培养来产生。只有维生素B12因为其合成的复杂性而仅通过发酵进行生产。体外方法需要耗费大量的材料和时间，代价通常高昂。C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代谢和用途
嘌呤和嘧啶代谢基因及它们相应的蛋白质为治疗肿瘤和病毒感染的重要靶标。术语”嘌呤”或”嘧啶”包括构成核酸、辅酶和核苷酸的含氮碱基。术语”核苷酸”包括核酸分子的基本结构单元，其由含氮碱基、戊糖(对RNA而言，该糖为核糖，对DNA而言，该糖为D-脱氧核糖)和磷酸组成。术语”核苷”包括作为核苷酸前体的分子，但其不含核苷酸所具有的磷酸部分。通过抑制这些分子的生物合成或抑制它们向核酸分子形成方向的流动，可抑制RNA和DNA合成；通过以靶向癌细胞的方式抑制这种活性，可抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。此外，有不形成核酸分子而作为能量贮存体(即AMP)或作为辅酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
一些出版物已描述了这些化学品通过影响嘌呤和/或嘧啶代谢对这些医学适应症的用途(例如Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)”作为化学治疗剂的嘧啶和嘌呤从头生物合成的强力抑制剂”医学研究述评(Med.Res.Reviews)10：505-548)。对参与嘌呤和嘧啶代谢的酶的研究集中在研发可用作如免疫抑制剂或抗增生剂的新药上(Smith，J.L.，(1995)”核苷酸合成中的酶”结构生物学最新观点(Curr.Opin.Struct.Biol.)5：752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23：877-902)。但是，嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸具有其它应用：用作一些精细化学品(例如，硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、叶酸盐或核黄素)生物合成的中间体，作为细胞的能量载体(例如，ATP或GTP)，和本身作为化学品，通常用作增味剂(例如，IMP或GMP)或用于一些医药用途(参见例如，Kuninaka，A.(1996)生物技术中的核苷酸和相关化合物(Nucleotides and Related Compounds inBiotechnology)第6卷，Rehm等人编辑.VCH：Weinheim，561-612页)。同样，参与嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代谢的酶越来越多地用作靶研发用于作物保护的针对它们的化学品，包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。
以阐释了这些化合物在细菌中的代谢(综述参见例如，核酸研究和分子生物学进展(Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology)，第42卷，Academic Press中的Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)”嘌呤核苷酸的从头生物合成”，259-287页；和生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and MolecularBiology)，Wiley：纽约一书中的Michal，G.(1999)”核苷酸和核苷”，第8章)。嘌呤代谢已是深入研究的主题，其对细胞的正常功能是必需的。高等动物中受损的嘌呤代谢可引起严重疾病，如痛风。嘌呤核苷酸合成从核糖-5-磷酸开始，经过一系列步骤，通过中间体化合物次黄苷-5’-磷酸(IMP)产生鸟苷-5’-单磷酸(GMP)或腺苷-5’-单磷酸(AMP)，由此可容易地形成用作核苷酸的三磷酸形式。这些化合物也用作能量贮存体，这样它们的降解可为细胞内许多不同生物化学过程提供能量。嘧啶的生物合成由核糖-5-磷酸形成尿苷-5’-单磷酸(UMP)而进行。UMP接下来转化为胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有这些核苷酸的脱氧形式通过一步还原反应从核苷酸的二磷酸核糖形式生成核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。通过磷酸化后，这些分子可参与DNA合成。D.海藻糖的代谢和用途
海藻糖由两个葡萄糖分子通过α，α-1，1连接组成。它通常用于食品工业，作为甜味剂、干的或冷冻的食品和饮料中的添加剂。但它也用于制药、化妆品和生物技术工业(参见例如，Nishimoto等人(1998)美国专利号5,759,610；Singer，M.A.和Lindquist，S.(1998)生物技术趋势(TrendsBiotech.)16：460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.(1996)Biotech.Ann.Rev.2：293-314；和Shiosaka，M.(1997)J.Japan 172：97-102)。海藻糖可以由许多微生物酶促产生，并天然释放入环境介质中，从中可用本领域公知的方法收集海藻糖。II.本发明的元素和方法
本发明是基于，至少部分是基于，新分子的发现，此处称为MP核酸和蛋白质分子，其参与或在一种或多种细胞代谢途径中起作用。在一个实施方案中，MP分子催化参与一种或多种氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径的酶促反应。在一个优选的实施方案中，本发明MP分子在谷氨酸棒状杆菌用于氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖的一个或多个代谢途径中的活性对该生物体的目标精细化学品的产生有影响。在一个尤其优选的实施方案中，本发明的MP分子在活性上被改变，由此改变了本发明MP蛋白所参与的谷氨酸棒状杆菌代谢途径的生产效率或产出，其直接或间接地改变了谷氨酸棒状杆菌中目标精细化学品的产量或产生效率。该MP分子可与相同或不同代谢途径的其它MP分子组合以增加目标精细化学品的产率，其中目标精细化学品优选海藻糖或氨基酸，更优选赖氨酸或甲硫氨酸。备选地或此外，可通过对MP分子或其它代谢分子的组合破坏来减少不需要的副产物。与同一途径或不同途径的其它MP分子组合的此MP分子可在它们的核苷酸和相应的氨基酸序列水平上被改变，以致在生理条件下它们的活性发生改变而导致目标精细化学品的生产力和/或产率增加。在一个进一步的实施方案中，原初的或上述改变形式的MP分子可与同一途径或不同途径的其它MP分子组合，其中所述其它MP分子的核苷酸序列被改变，以致在生理条件下它们的活性发生改变而导致目标精细化学品的生产力和/或产率增加。优选的组合为将表1的一种或两种MP分子与表4和5中的一种或多种单拷贝或多拷贝MP蛋白或与公开的相同代谢途径(甲硫氨酸生物合成或海藻糖/磷酸烯醇式丙酮酸途径)中的相应MP分子组合。
术语”MP蛋白”或”MP多肽”包括起这样作用的蛋白质，其例如在一种或多种氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中催化酶促反应。MP蛋白的实例包括由表1中所示的MP基因及由奇数编号的SEQ ID NO序列所编码的那些蛋白质。术语”MP基因”或”MP核酸序列”包括编码MP蛋白的核酸序列，其由编码区和相应的5’和3’非翻译序列区组成。MP基因的实例包括表1中所示的那些基因。术语“产量”或“生产力”为本领域认知，包括在给定时间和给定发酵体积下形成的发酵产物(例如，目标精细化学品)的浓度(例如，kg产物/小时/升)。术语”产生效率”包括欲达到特定生产水平所需的时间(例如，细胞通过多长时间达到精细化学品的特定产出速率)。术语”产率”或”产物/碳产率”为本领域认知的，包括将碳源转化为产物(即精细化学品)的效率。其通常表示为如kg产物/kg碳源。通过增加化合物的产率或产量，在给定的时间期间给定量的培养物中该化合物的回收分子或有用的回收分子的量增加。术语”生物合成”或”生物合成途径”为本领域所认知，包括在可为多步骤的和受到高度调节的过程中细胞从中间体化合物合成化合物(优选地有机化合物)。术语”降解”或”降解途径”为本领域所认知，包括在可为多步骤的和受到高度调节的过程中细胞分解化合物(优选地有机化合物)产生降解产物(一般而言为较小或较不复杂的分子)。术语”代谢”为本领域所认知，包括生物体中进行的所有生物化学反应。特定化合物的代谢(例如，氨基酸诸如甘氨酸的代谢)则包含细胞内涉及该化合物的所有生物合成、修饰和降解途径。
在另一实施方案中，本发明的MP分子可改变微生物如谷氨酸棒状杆菌中目标分子如精细化学品的产生。应用重组遗传技术，可操作本发明的用于氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖的一种或多种生物合成或降解酶，从而调节其功能。例如，可提高生物合成酶的功效，或破坏其别构调节区，从而阻止对该化合物产生的反馈抑制。类似地，可通过替换、缺失或添加来删除或改变降解酶，从而减弱其对目标化合物的降解活性同时不损害细胞的存活力。在每种情况下，可增加这些目标精细化学品之一的总产率或产生速率。
对本发明蛋白质和核苷酸分子的此类改变也可能提高除氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷和海藻糖外的其它精细化学品的产生。任何一种化合物的代谢都必然与细胞内的其它生物合成和降解途径相关联，且一个途径中的必需辅因子、中间体或底物可能由另一此类途径提供或受其限制。因此，通过调节一种或多种本发明蛋白质的活性，可影响另一精细化学品生物合成或降解途径的产量或活性功效。例如，氨基酸作为所有蛋白质的结构单元起作用，但其可在胞内以限制蛋白质合成的水平存在；因此，通过增加细胞内一种或多种氨基酸的产生效率或产率，可以较为容易地合成蛋白质，如生物合成或降解蛋白质。同样，改变代谢途径酶且该改变或多或少地有利于特定的副反应时可以导致一种或多种用作目标精细化学品产生的中间体或底物的化合物的过量产生或产生不足。
本发明的分离核酸序列包含在可从美国典型培养物中心获得的谷氨酸棒状杆菌菌株的基因组中，该菌株的保藏号为ATCC 13032。分离的谷氨酸棒状杆菌MP DNA的核苷酸序列和预测的该谷氨酸棒状杆菌MP蛋白的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO奇数编号的序列和SEQ ID NO偶数编号的序列所示。进行计算分析，将这些核苷酸序列归类于和/或鉴定为编码代谢途径蛋白质的序列。
本发明也涉及这样的蛋白质，其具有实质上与本发明的氨基酸序列(例如，序列表中SEQ ID NO偶数编号的序列)同源的氨基酸序列。如此处所用，其所具有的氨基酸序列与所选氨基酸序列实质上同源的蛋白质至少约50％同源于所选氨基酸序列，例如所选完整氨基酸序列。其所具有的氨基酸序列与所选氨基酸序列实质上同源的蛋白质也可至少约50-60％，优选地至少约60-70％，且更优选地至少约70-80％，80-90％，或90-95％，且最优选地至少约96％，97％，98％，99％或更高地同源于所选的氨基酸序列。
本发明的MP蛋白或其生物活性部分或其片段可在一个或多个氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中催化酶促反应，或具有表1中所示的一种或多种活性。
在下列子部分中进一步详细描述了本发明的多个方面：A.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及编码MP多肽或其生物活性部分的分离核酸分子及核酸片段，其中所述核酸片段足以用作杂交探针或引物用来鉴定或扩增编码MP的核酸(例如MP DNA)。如此处所用，术语”核酸分子”是指包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该术语也包括位于基因编码区3’和5’端的非翻译区：基因编码区5’端上游至少约100个核苷酸的序列和基因编码区3’端下游至少约20个核苷酸的序列。核酸分子可为单链或双链，但优选地为双链DNA。”分离的”核酸分子为与存在于其天然源中的其它核酸分子分离的核酸分子。优选地，”分离的”核酸不具有在该核酸所来自的生物体基因组DNA中天然存在于该核酸侧翼的序列(即位于该核酸5’和3’端的序列)。例如，在不同实施方案中，该分离的MP核酸分子可包含少于约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb的在该核酸所来自的细胞(如谷氨酸棒状杆菌细胞)基因组DNA中天然存在于该核酸分子侧翼的核苷酸序列。而且，”分离的”核酸分子如DNA分子当通过重组技术产生时可基本上不含有其它细胞物质或培养基，当通过化学合成产生时，可基本上不含有化学前体或其它化学品。
本发明的核酸分子，如具有表中SEQ ID NO奇数编号的核苷酸序列序列的核酸分子或其部分可用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息分离。例如，使用序列表中SEQ ID NO奇数编号的序列之一的全部或部分作为杂交探针和标准的杂交技术(例如，见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual).第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中所述)，可自谷氨酸棒状杆菌文库分离谷氨酸棒状杆菌MP DNA。而且，包含本发明核酸序列之一(例如，SEQ ID NO奇数编号的序列)的全部或部分的核酸分子可使用根据该序列设计的寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应分离(例如，包含本发明核酸序列之一(例如，序列表中SEQ ID NO奇数编号的序列)的全部或部分的核酸分子可使用根据该同样序列设计的寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应分离)。例如，可从正常的内皮细胞分离mRNA(例如，通过Chirgwin等人(1979)生物化学(Biochemistry)18：5294-5299的硫氰酸胍提取法)以及用反转录酶(例如，莫洛尼鼠类白血病病毒反转录酶，可从Gibco/BRL，Bethesda，MD获得；或AMV反转录酶，可从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL获得)制备DNA。用于聚合酶链反应扩增的合成寡核苷酸引物可根据序列表中所示的核苷酸序列之一设计。本发明的核酸可用cDNA或备选地用基因组DNA作为模板、使用合适的寡核苷酸引物按照标准的PCR扩增技术来扩增。这样扩增的核酸可克隆入合适的载体并通过DNA序列分析鉴定。此外，对应于MP核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准的合成技术制备，例如用DNA自动合成仪制备。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子包含序列表中所示的核苷酸序列之一。如序列表中所示的本发明核酸序列对应于本发明的谷氨酸棒状杆菌MP DNA。该DNA包含编码MP蛋白的序列(即”编码区”，在序列表中每一用奇数编号的SEQ ID NO序列中指出)及5’非翻译区和3’非翻译区(也在序列表中每一用奇数编号的SEQ ID NO序列中指出)。或者，核酸分子可仅包含序列表中任一核酸序列的编码区。
在另一优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子包含与本发明核苷酸序列之一(例如，序列表中SEQ ID NO奇数编号的序列)或其一部分互补的核酸分子。互补于本发明核苷酸序列之一的核酸分子为这样的核酸分子，其充分互补于序列表中所示核苷酸序列之一(例如，SEQ ID NO：奇数编号的序列)，以致它可与本发明的核苷酸序列之一杂交，由此形成双链体。
又在另一优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子包含这样的核苷酸序列，其至少约63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或70％，更优选地至少约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％或90％，或91％，92％，93％，94％，且甚至更优选地至少约95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于本发明的核苷酸序列(例如，序列表中奇数编号的SEQ ID NO：序列)或其一部分。上述范围中的中间范围和同一性值(例如，70-90％同一或80-95％同一)也包括在本发明中。例如，也包括使用任一上述值作为上限和/或下限组合而成的同一性值范围。在另一优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子包含与本发明核苷酸序列之一或其一部分杂交(例如在严格条件下杂交)的核苷酸序列。
而且，本发明的核酸分子可仅包含序列表中SEQ ID NO奇数编号的序列之一的编码区的一部分，如可用作探针或引物的片段或编码MP蛋白生物活性部分的片段。从克隆的谷氨酸棒状杆菌MP基因确定的核苷酸序列使得可产生设计用于鉴定和/或克隆其它细胞类型和生物体中的MP同系物以及来自其它棒状杆菌或相关种的MP同系物的探针和引物。探针/引物一般包含相当纯的寡核苷酸。该寡核苷酸一般包含在严格条件下可以与本发明核苷酸序列之一(例如，序列表中奇数编号的SEQ ID NO序列之一)的有义链、这些序列之一的反义序列或其天然突变体中的至少约12个，优选地约25个，更优选地约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。基于本发明核苷酸序列的引物可用于PCR反应中以克隆MP同系物。基于MP核苷酸序列的探针可用于检测编码相同或同源蛋白质的转录本或基因组序列。在优选的实施方案中，该探针还包含与其连接的标记基团，例如该标记基团可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作诊断试验试剂盒的一部分用来鉴定误表达MP蛋白的细胞，实施方式有例如测定来自受试对象的细胞样本中编码MP的核酸的水平，例如检测MPmRNA水平，或确定基因组MP基因是否已突变或已缺失。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码这样的蛋白质或其部分，其包括的氨基酸序列充分同源于本发明的氨基酸序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO的序列)以至于该蛋白质或其部分保留催化在氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应的能力。如此处所用，术语”充分同源”是指蛋白质或其部分所具有的氨基酸序列包括最小数量的与本发明氨基酸序列相同或等同的氨基酸残基(例如，与序列表中偶数编号的SEQ ID NO序列之一中的氨基酸残基具有相似侧链的氨基酸残基)，以至于该蛋白质或其部分仍可催化谷氨酸棒状杆菌的氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应。此类代谢途径中的蛋白质成员，如此处所述，起到催化一种或多种氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖的生物合成或降解的作用。此类活性的实例也在此进行了描述。因此，”MP蛋白的功能”将影响一种或多种此类代谢途径的总体功能，并直接或间接地影响一种或多种精细化学品的产率、产量和/或产生效率。MP蛋白活性的实例在表1中给出。
在另一实施方案中，该蛋白质至少约50-60％，优选地至少约60-70％，且更优选地至少约70-80％，80-90％，90-95％，且最优选地至少约96％，97％，98％，99％或更高地同源于本发明的全长氨基酸序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)。
本发明MP核酸分子编码的蛋白质的部分优选地为MP蛋白之一的生物活性部分。如此处所用，术语”MP蛋白的生物活性部分”意在包括这样的部分，例如可催化谷氨酸棒状杆菌的一个或多个氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应的，或具有表1所示活性的MP蛋白结构域/基序。为确定MP蛋白或其生物活性部分是否可催化氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，可实施酶促活性试验。此类试验方法为本领域普通技术人员所熟知，如在实施例部分的实施例8中所详述。
其它编码MP蛋白生物活性部分的核酸片段可通过分离本发明氨基酸序列之一(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)的部分、表达编码MP蛋白或肽的部分(例如，通过体外重组表达)并评估编码MP蛋白或肽的部分的活性而制备。
本发明还包括这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于本发明的核苷酸序列之一(例如，序列表中奇数编号的SEQ ID NO：序列)(和其部分)，但其与此本发明核苷酸序列编码相同的MP蛋白。在另一实施方案中，本发明的分离核酸分子具有这样的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有如序列表中所示(例如，偶数编号的SEQ ID NO：)的氨基酸序列。在一个进一步的实施方案中，本发明的核酸分子编码全长的谷氨酸棒状杆菌蛋白质，而该蛋白质实质上同源于本发明的氨基酸序列(由序列表中奇数编号的SEQ ID NO：序列中所示的开放读码框编码)。
本领域普通技术人员将了解在实施方案中本发明的序列不包括现有技术中的序列，如表3中所示的那些在本发明之前可获得的Genbank序列。在一个实施方案中，本发明包括这样的核苷酸和氨基酸序列，其与本发明的核苷酸或氨基酸序列的百分同一性大于与现有技术中的序列的百分同一性，即本发明包括其编码的蛋白质序列大于和/或至少71％同一于指定为SEQ ID NO：2的蛋白质序列的核苷酸序列，和/或其编码的蛋白质序列大于和/或至少63％同一于指定为SEQ ID NO：4的蛋白质序列的核苷酸序列。
   表3：序列对比结果
基因名(标识) Genbank中的命中序列 同源性     参考文献
metH GB BA2：MTCY261结核分支杆菌H37Rv全基因组 70.3％ Cole等人(1998)自(Nature)393，537-544
treS GB BA2：MTCY261结核分支杆菌H37Rv全基因组 62.4％ Cole等人(1998)自(Nature)393，537-544
同源性：CLUSTAL-计算的百分同一性(来自基因组的开放读码框，其被翻译为氨基酸序列)
通过检查表3中所示针对给定序列的前三个命中序列中的任一序列的CLUSTAL-计算的百分同一性分值，本领域的普通技术人员可计算出本发明任一给定序列的百分同一性的下限阈值。本领域普通技术人员也将理解：本发明也包括百分同一性大于这样计算的下限阈值的核酸和氨基酸序列(例如，优选地至少约63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或70％，更优选地至少约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，或80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，或90％，或91％，92％，93％，94％，且甚至更优选地至少约95％，96％，97％，98％，99％或更高的同一性)。
除了序列表中以奇数编号的SEQ ID NO示出的谷氨酸棒状杆菌MP核苷酸序列外，本领域普通技术人员将理解：导致MP蛋白氨基酸序列变化的DNA序列多态性可在群体(例如，谷氨酸棒状杆菌群体)中存在。由于自然变异，MP基因中的此遗传多态性可在群体中的个体间存在。如此处所用，术语”基因”和”重组基因”是指包含编码MP蛋白，优选地编码谷氨酸棒状杆菌MP蛋白的开放读码框的核酸分子。此类天然变异一般可在MP基因核苷酸序列中导致1-5％差异。MP中来自天然变异且不改变MP蛋白功能活性的任一和所有此类核苷酸变异和所致氨基酸多态性也在本发明范围内。
对应于本发明谷氨酸棒状杆菌MP DNA的天然变体和非谷氨酸棒状杆菌同系物的核酸分子可根据它们与本文公开的谷氨酸棒状杆菌MP核酸的同源性，使用谷氨酸棒状杆菌DNA或其部分作为杂交探针按照标准的杂交技术在严格的杂交条件下分离。因此，在另一实施方案中，本发明的分离核酸分子长为至少15个核苷酸，且在严格条件下可以与包含序列表中SEQID NO：奇数编号的核苷酸序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，核酸长为至少30个、50个、100个、250个或更多个核苷酸。如此处所用，术语”在严格条件下杂交”是用来描述杂交和洗涤条件，在此条件下，相互间至少60％同源的核苷酸序列一般仍可相互杂交。优选地，严格条件为这样的条件，在此条件下相互间具有至少约65％，更优选地至少约70％，且甚至更优选地至少约75％或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严格条件为本领域普通技术人员所公知，可在分子生物学最新方法(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。严格杂交条件的一个优选、非限制性实例为：在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃杂交，然后在0.2×SSC，0.1％SDS中于50-65℃洗涤一次或多次。优选地，在严格条件与本发明的核苷酸序列杂交的本发明分离核酸分子对应于天然存在的核酸分子。如此处所用，”天然存在的”核酸分子是指具有在自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，其编码天然蛋白)。在一个实施方案中，核酸编码天然的谷氨酸棒状杆菌MP蛋白。
除了群体中可能存在的MP序列的天然变体外，本领域普通技术人员还将理解可通过突变向本发明的核苷酸序列中导入变化，由此导致所编码的MP蛋白的氨基酸序列改变，但MP蛋白的功能不变。例如，可在本发明的核苷酸序列中在”非必需”氨基酸残基处引入导致氨基酸替换的核苷酸替换。”非必需”氨基酸残基为这样的残基，其可以在本发明MP蛋白之一的野生型序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：)中被改变，但其改变不引起所述MP蛋白的活性改变；而”必需”氨基酸残基为MP蛋白活性所需。然而，其它氨基酸残基(例如，在具有MP活性的结构域中不保守或仅为半保守的那些氨基酸残基)对活性可为非必需的，并因此可能适于接受改变而同时又不改变MP活性。
因此，本发明的另一方面涉及这样的核酸分子，其编码的MP蛋白包含有对MP活性非必需的氨基酸残基改变。此类MP蛋白与序列表中偶数编号的SEQ ID NO：序列的氨基酸序列不同，但保留至少一种本文所述的MP活性。在一个实施方案中，该分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中该蛋白质包含至少约50％同源于本发明氨基酸序列的氨基酸序列，并可催化在氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或具有表1中所示的一种或多种活性。优选地，由此核酸分子编码的蛋白质至少约50-60％同源于序列表中奇数编号的SEQ IDNO之一的氨基酸序列，更优选地至少约60-70％同源于这些序列之一，甚至更优选地至少约70-80％，80-90％，90-95％同源于这些序列之一，且最优选地至少约96％，97％，98％或99％同源于本发明的氨基酸序列之一。
为了确定两个氨基酸序列(例如，本发明的氨基酸序列之一和其突变形式)或两个核酸的百分同源性，为了最佳比较目的将序列对比(例如，可以在一个蛋白质或核酸的序列中导入缺口，以便与另一蛋白质或核酸进行最佳序列对比)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当一个序列(例如，本发明的氨基酸序列之一)中的某位置与另一个序列(例如，氨基酸序列的突变形式)中的对应位置处被相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这些分子在该位置是同源的(即，此处所用的氨基酸或核酸”同源性”等同于氨基酸或核酸”同一性”)。两条序列间的百分同源性为两序列共有的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同的位置数/总位置数×100)。
编码同源于本发明蛋白质序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)的MP蛋白的分离核酸分子可通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失导入本发明的核苷酸序列而产生，这样可将一个或多个氨基酸替换、添加或缺失导入所编码的蛋白质中。可通过标准技术，如定点诱变和PCR-介导的诱变将突变导入本发明的核苷酸序列之一中。优选地，在一处或多处预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸替换。”保守氨基酸替换”为将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基类已在本领域定义过。这些类包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在MP蛋白中预测的非必需氨基酸残基优选用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换。或者，在另一实施方案中，可通过例如饱和诱变沿着全部或部分MP编码序列随机导入突变，并对所得突变体筛选文中所述的MP活性，以鉴定保留MP活性的突变体。对序列表中奇数编号的SEQ ID NO序列之一进行核苷酸序列诱变后，可重组表达编码蛋白，并用例如文中所述的试验(参见实施例部分的实施例8)确定蛋白质的活性。
除了编码上述MP蛋白的核酸分子外，本发明的另一方面涉及与这些分子反义的分离核酸分子。“反义”核酸包含这样的核苷酸序列，其互补于编码蛋白质的“有义”核酸，例如互补于双链DNA分子的编码链或互补于mRNA序列。因此，反义核酸可通过氢键与有义核酸键合。反义核酸可互补于全长的MP编码链或仅互补于其部分。在一个实施方案中，反义核酸分子反义于编码MP蛋白的核苷酸序列的编码链的“编码区”。术语“编码区”是指包含可翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域。在另一实施方案中，反义核酸分子反义于编码MP的核苷酸序列的编码链的“非编码区”。术语“非编码区”是指不被翻译为氨基酸的位于编码区侧翼的5’和3’序列(即，也称为5’和3’非翻译区)。
由于编码文中公开的MP的编码链序列(例如，序列表中给出的奇数编号的SEQ ID NO序列)已知，可根据Watson和Crick碱基配对原理设计本发明的反义核酸。反义核酸分子可互补于MP mRNA的全长编码区，但更优选为仅反义于部分MP mRNA编码区或非编码区的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可互补于MP mRNA翻译起始位点周围的区域。反义寡核苷酸可例如长约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸。本发明的反义核酸可使用本领域公知的方法应用化学合成和酶连反应构建。例如，反义核酸(如反义寡核苷酸)可用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学合成，其中所述修饰的核苷酸被设计用于增加分子的生物稳定性或用于增加反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖苷queosine、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖苷queosine、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。备选地，反义核酸可应用表达载体进行生物制备，所述载体中已反义向亚克隆了一段核酸(即，来自插入核酸的RNA转录本对于目的靶核酸将是反义方向的，这将在下面的子部分中进一步描述)。
一般将本发明的反义核酸分子施用给细胞或使其原位产生，以便其可以杂交或结合编码MP蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA，由此通过如抑制转录和/或翻译来抑制该蛋白质的表达。杂交方式可以是通过常规的核苷酸互补形成稳定双链体，或，例如，对于与DNA双链体结合的反义核酸分子，可以是在双螺旋大沟处的特异相互作用。可修饰反义分子，以使它特异结合所选细胞表面表达的受体或抗原，例如，通过将反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体连接。也可使用文中所述的载体将反义核酸分子递送至细胞中。为了达到足够的胞内反义分子浓度，优选其中反义核酸分子被置于强的原核、病毒或真核启动子控制下的载体构建体。
又在另一实施方案中，本发明的反义核酸分子可为α-异核酸(α-anomeric nucleic acid)分子。α-异核酸分子与互补RNA形成特异的双链杂合体，杂合体中两条链走向相互平行，这与通常的β-单元不同(Gaultier等人(1987)，核酸研究(Nucleic Acids Res)15：6625-6641)。反义核酸分子也可包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)，核酸研究(Nucleic Acids Res)15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)，FEBS Lett 215：327-330)。
又在另一实施方案中，本发明的反义核酸为核酶。核酶为具有核糖核酸酶活性能够剪切单链核酸如mRNA的催化RNA分子，其中所述单链核酸具有与核酶互补的区域。这样，核酶(例如，锤头状核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)，自然(Nature)334：585-591)中描述)可用于催化剪切MPmRNA转录本，由此抑制MP mRNA的翻译。对编码MP的核酸具有特异性的核酶可基于此处公开的MP DNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO：1(RXA02229)进行设计。例如，可构建四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与编码MP的mRNA中的待剪切核苷酸序列互补。见，例如Cech等人，美国专利号4,987,071和Cech等人，美国专利号5,116,742。或者，可应用MP mRNA从RNA分子库中选择具有特异核糖核酸酶活性的催化RNA，参见例如，Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)科学(Science)261：1411-1418。
或者，MP基因表达可通过如下方式抑制，即，使核苷酸序列定向互补于MP核苷酸序列的调节区(如MP启动子和/或增强子)以形成三股螺旋结构来阻止MP基因在靶细胞中转录。通常参见Helene，C.(1991)抗癌药物设计(Anticancer Drug Des)6(6)：569-84；Helene，C.等人(1992)Ann NYAcad Sci 660：27-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)：807-15。
本发明的另一方面涉及甲硫氨酸和/或赖氨酸代谢中的基因的组合。优选的组合为metZ与metC、metB(编码胱硫醚合酶)、metA(编码高氨酸-O-乙酰转移酶)、metE(编码甲硫氨酸合酶)、metH(编码甲硫氨酸合酶，此处称为SEQ ID No：1)、hom(编码高丝氨酸脱氢酶)、asd(编码天冬氨酸半醛脱氢酶)、ask(编码天冬氨酸激酶)和rxa00657的组合(表4)。
表4
核酸SEQ ID NO 氨基酸SEQ ID NO   基因名(标识)     功能
    5     6  MetZ 乙酰高丝氨酸硫解酶
    7     8  RXA00657
可以使所有的基因在一株宿主菌株中表达，但也可以仅选择部分所提及的基因，例如metZ和metA，或metZ、metA、metH和hom，或任何其它可能的组合。可以改变这些基因的核苷酸和相应氨基酸序列，以得到在生理条件下活性发生改变以致导致目标精细化学品的产量和/或产率增高的衍生物。对于编码天冬氨酸激酶的ask基因的核苷酸序列，一类此改变或衍生是公知的。这些改变导致去除了赖氨酸和苏氨酸引起的反馈抑制，并接下来导致赖氨酸的过产生。在一个优选的实施方案中，在棒状杆菌菌株中使用metH基因或metH基因的改变形式与ask、hom、metA和metZ或这些基因的衍生物的组合。在另一优选的实施方案中，在棒状杆菌菌株中使用metH基因或metH基因的改变形式与ask、hom、metA、metZ和metE或这些基因的衍生物的组合。在一个更优选的实施方案中，在棒状杆菌菌株中的基因组合为metH基因或metH基因的改变形式与ask、hom、metA和metZ或这些基因的衍生物的组合，或为metH与ask、hom、metA、metZ和metE或这些基因的衍生物的组合，且在生长培养基中使用硫源诸如硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐，及更具还原性的硫源如H2S和硫化物及衍生物。也可添加这样的硫源，如甲硫醇、甲磺酸、硫基乙醇酸盐、硫氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其它含硫化合物。本发明的另一方面涉及上述基因组合在棒状杆菌菌株中的用途，其中所述棒状杆菌菌株在这些基因导入前或后通过辐射或熟知的致突变化学品进行致突变并经选择对高浓度目标精细化学品例如赖氨酸或甲硫氨酸，或目标精细化学品的类似物如甲硫氨酸类似物乙硫氨酸或甲基甲硫氨酸或其它类似物具抗性。在另一实施方案中，上述基因组合可在特定基因被破坏的棒状杆菌菌株中表达。优选的基因破坏为对编码有利于碳流向不想要的代谢物的蛋白质的基因进行破坏。在甲硫氨酸为目标精细化学品时，赖氨酸的形成可能是不利的。在此情况下，上述基因的组合应在lysA基因(编码二氨基庚二酸脱羧酶)或ddh基因(编码催化四氢吡啶甲酸转化为内消旋二氨基庚二酸的内消旋二氨基庚二酸脱氢酶)被破坏的棒状杆菌菌株中进行。在一个优选的实施方案中，上述基因的有利组合为所有基因均以这样一种方式改变，此改变致使这些基因的产物不被导致目标精细化学品产生的生物合成途径的终产物或代谢物反馈抑制。当目标精细化学品为甲硫氨酸时，基因组合可在事先用诱变剂或辐射处理过并经选择具有上述抗性的菌株中表达。此外，菌株应在含有一种或多种上述硫源的生长培养基中生长。
本发明的另一方面涉及参与海藻糖代谢的基因的组合以及参与海藻糖和其它单糖、寡糖或多聚糖代谢的基因的组合。优选的组合为编码海藻糖合酶(文中称为SEQ ID No：3)的基因与表5中公开的基因组合。
本发明的另一方面为编码海藻糖合酶的基因与参与糖类运输的基因(例如用于PTS系统(如表5中公开的)、其它糖类转运系统或促进糖类从细胞外流入周围环境的蛋白质的基因)组合。
              表5：磷酸烯醇式丙酮酸：糖的磷酸转移酶系统核苷酸     氨基酸       识别码        功能 SEQ ID     SEQ ID NO         NO9           10            RXS00315       PTS系统，蔗糖-特异性IIABC
                                     成分(EIIABC-SCR)(蔗糖-透性酶II
                                     ABC成分(磷酸转移酶II，ABC成分)(EC 2.7.1.69)11          12            RXN01299       PTS系统，果糖-特异性IIBC成分(EC 2.7.1.69)13          14            RXA00951       PTS系统，甘露醇(隐性)-特异性IIA成分(EIIA-(C)MTL)
                                     (甘露醇(隐性)-透性酶IIA成分)(磷酸转移酶II，A成分)
                                     (EC 2.7.1.69)15          16            RXN01244       磷酸烯醇式丙酮酸-蛋白质磷酸转移酶(EC 2.7.3.9)17          18            RXA01300       载磷蛋白质(phosphocarrier protein)HPR19          20            RXN03002       PTS系统，甘露醇(隐性)-特异性IIA成分(EIIA-(C)MTL)
                                     (甘露醇(隐性)-透性酶IIA成分)(磷酸转移酶II，A成分)
                                     (EC 2.7.1.69)21          22            RXC00953       参与PTS系统的跨膜蛋白质23          24            RXC03001       参与PTS系统的跨膜蛋白质25          26            RXN01943       PTS系统，葡萄糖-特异性IIABC成分(EC 2.7.1.69)27          28            RXA01503       PTS系统，β-葡糖苷-特异性IIABC成分(EIIABC-BGL)
                                     (β-葡糖苷-透性酶IIABC成分)(磷酸转移酶II，ABC成
                                     分)(EC 2.7.1.69)海藻糖核苷酸     氨基酸       识别码        功能 SEQ ID     SEQ ID NO         NO29          30            RXN00351        α，α-海藻糖-磷酸合酶(UDP型)56 KD亚基(EC
                                      2.4.1.15)31         32          RXA00347       海藻糖-磷酸酶(EC 3.1.3.12) 33         34          RXN01239        麦芽寡糖基海藻糖合酶35         36          RXA02645       麦芽寡糖基海藻糖 海藻糖水解酶37          38          RXN02355        海藻糖/麦芽糖结合蛋白39         40          RXN02909       假定的海藻糖-结合蛋白 41         42           RXS00349        假定的海藻糖转运蛋白43          44          RXS03183        海藻糖/麦芽糖结合蛋白45         46          RXC00874        参与海藻糖代谢的跨膜蛋白
本发明的另一方面涉及上述基因组合在棒状杆菌菌株中的用途，其中所述棒状杆菌菌株在这些基因导入之前或之后，已通过辐射或熟知的致突变化学品致突变并经选择对高浓度给料(如葡萄糖或其它糖类)或目标精细化学品如海藻糖或其它糖类具抗性。
在另一实施方案中，上述基因组合可在具有特异基因破坏或基因弱化(即，与正常水平比较其生物活性降低的基因)的棒状杆菌株中表达。优选的是编码有利于碳流向不产生目标精细化学品的代谢途径的蛋白质的基因被破坏或弱化。在海藻糖为目标精细化学品时，此类不希望的代谢途径可为如糖酵解或磷酸戊糖循环。B.重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一方面涉及包含编码MP蛋白(或其部分)的核酸或包含基因组合且其中至少一个基因编码MP蛋白的载体，优选表达载体。如此处所用，术语”载体”是指这样的核酸分子，其可转运与其连接的另一核酸。一种类型的载体为”质粒”，是指其中可连接额外DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA片段连接入病毒基因组中。某些载体可在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组中，并因此随着宿主基因组一起复制。而且，某些载体可指导与它们操作性连接的基因的表达。此类载体此处称为”表达载体”。一般，用于重组DNA技术中的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，”质粒”和”载体”可互换使用，因为质粒是最经常使用的载体形式。但是，本发明旨在包括其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们起到等同的作用。
本发明的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸，这就是说重组表达载体包括一个或多个调节序列，其选择是基于用于表达的宿主细胞进行的，它们可操作地与待表达的核酸序列连接。在重组表达载体中，”可操作地连接”是指目的核苷酸序列与调节序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞后在宿主细胞中表达)的方式连接。术语”调节序列”意在包括启动子、阻遏物结合位点、激活物结合位点、增强子和其它表达调控元件(例如，终止子、多聚腺苷酸化信号、或具有mRNA二级结构的其它元件)。此类调节序列描述在如Goeddel；基因表达技术：酶学方法(GeneExpressionTechnology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。调节序列包括在许多类型宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的调节序列和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节序列。优选的调节序列为例如启动子，诸如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SPO2、λ-PR-或λ-PL，它们优选地用于细菌。其它调节序列为例如来自酵母和真菌的启动子，诸如ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH，来自植物的启动子，诸如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos或遍在蛋白-或菜豆蛋白-启动子。也可使用人工启动子。本领域普通技术人员将了解到表达载体的设计可取决于如对欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞，以产生由此处所述核酸所编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽(例如，MP蛋白、MP蛋白的突变形式、融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达MP蛋白。例如，MP基因可在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其它真菌细胞(参见Romanos，M.A.等人(1992)“在酵母中外源基因的表达：综述：(”Foreign gene Expression in yeast：areview”)，酵母(Yeast)8：423-488；J.W.Bennet & L.L.Lasure编辑的《更多的用于真菌的基因操作》(More Gene Manipulations in Fungi)，Academic Press：San Diego一书中的van den Hondel，C.A.M.J.J.等人(1991)“丝状真菌中的异源基因表达”，396-428页；以及Peberdy，J.F.等人编辑的《真菌的应用分子遗传学》(Applied Molecular Genetics of Fungi)，Cambridge University Press：Cambridge一书中的van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)“丝状真菌的基因转移体系和载体开发”，1-28页)、藻类和多细胞植物细胞(参见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)“根癌农杆菌介导的拟南芥叶和子叶外植体的高效转化”植物细胞报道(Plant Cell Rep.)：583-586)、或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步进行了讨论。另外，可体外转录并翻译重组表达载体，如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
在原核生物中蛋白质的表达最经常用含有组成型或诱导型启动子的载体进行，指导融合或非融合蛋白表达。融合载体将一些氨基酸添加至其中的编码蛋白质上，通常添加至重组蛋白的氨基末端，但也可添加至C-末端或融合至蛋白质的合适区域内。此类融合载体一般具有三种目的：1)用于增加重组蛋白的表达；2)用于增加重组蛋白的溶解性；和3)在亲和纯化中作为配体而利于重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，于融合部分和重组蛋白的连接处导入蛋白酶剪切位点，这使得在该融合蛋白纯化后可将重组蛋白与融合部分分离。此类酶和它们的对应识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)基因(Gene)67：31-40)、pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A结合至靶重组蛋白上。在一个实施方案中，将MP蛋白的编码序列克隆入pGEX表达载体，以产生编码融合蛋白的载体，该蛋白从N-末端至C-末端包含GST-凝血酶切割位点-X蛋白。该融合蛋白可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析纯化。通过用凝血酶切割该融合蛋白可回收不与GST融合的重组MP蛋白。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人(1988)基因(Gene)69：301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、pBdCl和pET 11d(Studier等人，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；和Pouwels等人编辑(1985)克隆载体(Cloning Vectors).Elsevier：New York IBSN 0 444904018)。pTrc载体中目标基因的表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂合的trp-lac融合启动子的转录。pET 11d载体中目标基因的表达依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的从T7 gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)中居住的、具有位于lacUV 5启动子转录调控下的T7 gn1基因的λ原噬菌体提供。对于其它多种细菌的转化，可选择适宜的载体。例如，质粒pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361公知用于转化链霉菌(Streptomyces)，而质粒pUB110、pC194或pBD214适用于转化芽胞杆菌。用于将遗传信息转移入棒状杆菌的一些质粒包括pHM1519，pBL1，pSA77或pAJ667(Pouwels等人编辑(1985)克隆载体(Cloning Vectors).Elsevier：New York IBSN 0 444 904018)。
使重组蛋白最大化表达的一个策略是将该蛋白质在对重组蛋白进行蛋白酶切割的能力具有缺损的宿主细菌中表达(Gottesman，S.，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一策略是改变欲插入表达载体的核酸的核酸序列，使用于每一氨基酸的各密码子为选择用于表达的细菌如谷氨酸棒状杆菌所优选使用的密码子(Wada等人(1992)核酸研究(Nucleic Acids Res.)20：2111-2118)。本发明核酸序列的此改变可应用标准的DNA合成技术实施。
在另一实施方案中，MP蛋白表达载体为酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体包括例如pYepSec1(Baldari，等人(1987)Embo J.6：229-234)，2ì，pAG-1，Yep6，Yep13，pEMBLYe23，pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)细胞(Cell)30：933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987)基因(Gene)54：113-123)，和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。适用于其它真菌如丝状真菌的载体和用于构建载体的方法包括在：J.F.Peberdy等人编辑的《真菌的应用分子遗传学》，Cambridge UniversityPress：Cambridge一书中的van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)“丝状真菌的基因转移体系和载体开发”，1-28页；和Pouwels等人编辑(1985)克隆载体(Cloning Vectors)Elsevier：New York(IBSN 0 444904018)一书中详述的那些。
另外，本发明的MP蛋白可使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)病毒学(Virology)170：31-39)。
在另一实施方案中，本发明的MP蛋白可在单细胞植物细胞(如藻类)或在来自高等植物(如种子植物，诸如作物植物)的植物细胞中表达。植物表达载体的实例包括在：Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“靠近左边界具有选择性标记的新植物双元载体”，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的双元农杆菌载体”，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)12：8711-8721中详述的那些，并包括pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004和pDH51(Pouwels等人编辑(1985)克隆载体(CloningVectors.)Elsevier：New York IBSN 0 444904018)。
又在另一实施方案中，本发明的核酸用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)自然(Nature)329：840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的调控功能通常由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。用于原核和真核细胞的其它合适表达系统参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的第16和17章。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体可优选地在特定细胞类型中指导核酸的表达(例如，使用组织-特异性调控元件来表达核酸)。组织-特异性调控元件为本领域公知。合适的组织-特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝-特异性；Pinkert等人(1987)基因进展(Genes Dev.)1：268-277)、淋巴-特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人(1983)细胞(Cell)33：729-740；Queen和Baltimore(1983)细胞(Cell)33：741-748)、神经元-特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS 86：5473-5477)、胰-特异性启动子(Edlund等人(1985)科学(Science)230：912-916)、以及乳腺-特异性启动子(例如，奶乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。也包括发育调节的启动子，如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)科学(Science)249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)基因进展(Genes Dev.)3：537-546)。
本发明还提供了含本发明的DNA分子的重组表达载体，其中该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是，DNA分子可操作地连接到调控序列上，该连接方式使得可以表达产生与MP mRNA反义的RNA分子(通过转录该DNA分子)。可以对可操作地连接反义方向克隆的核酸的调控序列进行选择以指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达，例如，可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列以指导反义RNA实现组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，其中在高效调控区域的控制下产生反义核酸，其活性由载体所导入的细胞的类型决定。利用反义基因进行的基因表达调控的讨论见Weintraub，H.等人，反义RNA作为遗传分析的分子工具，Reviews-Trendsin Genetics，Vol.1(1)1986。
本发明的另一方面涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可互换使用。应当理解，该术语不仅指特定的受试细胞，也指该细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响在传代过程中可发生某些改变，这样，后代实际上可能并非与亲代细胞相同，但其仍包括在此处所用术语的范围之内。
宿主细胞可为任何原核或真核细胞。例如，MP蛋白可在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞为本领域普通技术人员公知。与谷氨酸棒状杆菌有关的、可常规用作本发明核酸和蛋白质分子的宿主细胞的微生物如表2所示。
载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用，术语“转化”和“转染”、”接合”和”转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建物)或载体形式的核酸(例如，质粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人(分子克隆：实验室手册第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它的实验室手册中找到。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据应用的表达载体和转染技术，仅一小部分的细胞可将外源DNA整合到基因组中。为鉴定和筛选整合体，一般将编码选择标记的基因(如抗生素抗性基因)与目的基因一同导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些可赋予抗药性的基因，所述药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可与编码MP蛋白质的基因位于同一载体上被导入宿主细胞中或可以位于不同的载体上导入。被导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物筛选进行鉴定(例如，掺入了选择标志基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
为生成同源重组微生物，制备出含至少部分MP基因的载体，所述部分MP基因中已经导入缺失、添加或替代因而可以改变(如功能性破坏)MP基因。优选地，该MP基因为谷氨酸棒状杆菌MP基因，但也可为来自相关细菌或甚至来自哺乳动物、酵母或昆虫的同系物。在一个优选的实施方案中，载体设计为在同源重组后可功能性破坏内源MP基因(即，不再编码功能蛋白质；也称为“敲除”载体)。或者，载体可设计为在同源重组后使内源MP基因发生突变或改变但仍编码功能蛋白质(例如，可改变上游调控区域由此改变内源MP蛋白的表达)。在此同源重组载体中，改变的MP基因部分在其5′和3′端侧翼为MP基因的其它核酸，从而允许在载体携带的外源MP基因和微生物中的内源MP基因之间发生同源重组。此其它的两翼MP核酸的长度应足以使与内源基因的重组成功进行。一般地，载体内包括几千碱基的侧翼DNA(5′及3′端)(参见例如，Thomas，K.R.，和Capecchi，M.R.(1987)细胞(Cell)51：503中对同源重组载体的描述)。使用本领域公知的技术，将该载体导入微生物(例如，通过电穿孔)和细胞，筛选其中导入的MP基因已与内源MP基因同源重组的微生物和细胞。
在另一实施方案中，产生的重组微生物可含有允许调控导入基因表达的所选系统。例如，在载体中包含MP基因将其置于乳糖操纵子的控制下，使得MP基因仅在存在IPTG时表达。此类调控系统为本领域熟知。
在另一实施方案中，宿主细胞中的内源MP基因被破坏(例如，通过同源重组或其它本领域公知的遗传方法)，从而无蛋白质产物表达。在另一实施方案中，通过一处或多处点突变、缺失或倒位而改变宿主细胞中的内源或导入的MP基因，但使其仍编码功能性MP蛋白。又在另一实施方案中，改变(例如，通过缺失、截短、倒位或点突变而改变)微生物中MP基因的一个或多个调控区域(例如启动子、阻遏子或诱导子)，从而调节MP基因的表达。本领域普通技术人员将了解到包含多处所述MP基因和蛋白质改变的宿主细胞可以容易地使用本发明方法产生，并且也包括在本发明中。
本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)MP蛋白。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞来产生MP蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适宜的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码MP蛋白的重组表达载体，或其基因组中已导入了编码野生型或改变的MP蛋白的基因)，直至产生MP蛋白。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞分离MP蛋白。C.分离的MP蛋白
本发明的另一方面涉及分离的MP蛋白及其生物活性部分。当通过重组DNA技术产生时，“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含有细胞材料，或当通过化学合成时，“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含有化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含有细胞材料”包括这样的MP蛋白制品，其中该蛋白质与细胞的细胞性成分分离，所述细胞为天然或重组产生该蛋白质的细胞。在一个实施方案中，术语“基本上不含有细胞材料”包括这样的MP蛋白制品，其含少于约30％(按干重计)的非MP蛋白(在此也称为“污染蛋白质”)，更优选地少于约20％的非MP蛋白，且更优选地少于约10％的非MP蛋白，以及最优选地少于约5％的非MP蛋白。当重组产生MP蛋白或其生物活性部分时，还优选其基本上不含有培养基，即，培养基在蛋白质制品中所占有的体积少于约20％，更优选地小于约10％，且最优选地小于约5％。术语”基本上不含有化学前体或其他化学物质”包括这样的MP蛋白制品，其中蛋白质从参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物中分离出来。在一个实施方案中，术语”基本上不含有化学前体或其他化学物质”包括这样的MP蛋白制品，其具有少于约30％(按干重计)的化学前体或非MP化学物质，更优选地少于约20％的化学前体或非MP化学物质，且更优选地少于约10％的化学前体或非MP化学物质，且最优选地少于约5％的化学前体或非MP化学物质。在优选的实施方案中，分离的蛋白质或其生物活性部分缺少与MP蛋白来自同一生物体的污染蛋白质。一般，此类蛋白质通过在微生物如谷氨酸棒状杆菌中重组表达如谷氨酸棒状杆菌MP蛋白而产生。
本发明的分离MP蛋白或其部分可催化在氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或具有一种或多种如表1中所示的活性。在优选的实施方案中，蛋白质或其部分包含这样的氨基酸序列，其充分同源于本发明的氨基酸序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)，以至于该蛋白质或其部分保留了催化在氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应的能力。该蛋白质的部分优选地为文中所述的生物活性部分。在另一优选的实施方案中，本发明的MP蛋白具有如序列表中偶数编号的SEQ ID NO：所示的氨基酸序列。又在另一优选的实施方案中，MP蛋白具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列由与本发明的核苷酸序列(例如，序列表中奇数编号的SEQ ID NO：序列)杂交，例如在严格条件下杂交的核苷酸序列编码。又在另一优选的实施方案中，MP蛋白具有这样的的氨基酸序列，该氨基酸序列由优选地至少约63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或70％，更优选地至少约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％或80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％或90％，或91％，92％，93％，94％，且甚至更优选地至少约95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于本发明的核酸序列之一或其部分的核苷酸序列编码。上述值中间的范围和同一性值(例如，70-90％同一或80-95％同一)也包括在本发明中。例如，也包括使用任一上述值作为上限和/或下限组合成的同一性值范围。本发明优选的MP蛋白还优选具有至少一种此处所述的MP活性。例如，本发明优选的MP蛋白包括由与本发明核苷酸序列杂交例(如在严格条件下)的核苷酸序列编码的氨基酸序列，且其可催化在氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖代谢途径中的酶促反应，或其具有表1所示的一种或多种活性。
在其它实施方案中，MP蛋白实质上同源于本发明的氨基酸序列(例如，序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的序列)并保留了具有本发明氨基酸序列之一的蛋白质的功能活性，但由于自然变异或诱变它们的氨基酸序列不同，这一点在上面的子部分I中进行了详述。因此，在另一实施方案中，MP蛋白为这样的蛋白质，其包含优选地至少约63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％或70％，更优选地至少约71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，或80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％或90％，或91％，92％，93％，94％，且甚至更优选地至少约95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于本发明的全长氨基酸序列的氨基酸序列，且其具有至少一种文中所述的MP活性。上述值中间的范围和同一性值(例如，70-90％同一或80-95％同一)也包括在本发明中。例如，也包括使用任一上述值作为上限和/或下限组合而成的同一性值范围。在另一实施方案中，本发明涉及实质上同源于本发明的全长氨基酸序列的全长谷氨酸棒状杆菌蛋白质。
MP蛋白的生物活性部分包括这样的肽，其包含的氨基酸序列来自MP蛋白的氨基酸序列(如在序列表中偶数编号的SEQ ID NO：的氨基酸序列)或来自于与MP蛋白同源的蛋白质的氨基酸序列，其包括的氨基酸少于全长MP蛋白或与MP蛋白同源的全长蛋白质，但其显现出至少一种MP蛋白的活性。一般，生物活性部分(肽，如长为5，10，15，20，30，35，36，37，38，39，40，50，100或更多个氨基酸的肽)包含具有至少一种MP蛋白活性的结构域或基序。而且，其它生物活性部分(其中蛋白质的其他区域已缺失)可通过重组技术制备并针对一种或多种文中所述的功能活性进行评价。优选地，MP蛋白的生物活性部分包括具有生物活性的一个或多个所选的结构域/基序或其部分。
MP蛋白优选通过重组DNA技术产生。例如，将编码该蛋白质的核酸分子克隆入表达载体(如上所述)、将表达载体导入宿主细胞(如上所述)以及在宿主细胞中表达MP蛋白。然后可通过合适的纯化方案，使用标准的蛋白质纯化技术从细胞分离MP蛋白。除了重组表达外，MP蛋白、多肽或肽可用标准的肽合成技术化学合成。而且，可从细胞(例如，内皮细胞)分离天然的MP蛋白，例如使用抗-MP抗体进行分离，该抗体可用本发明的MP蛋白或其部分通过标准技术产生。
本发明也提供了MP的嵌合或融合蛋白。如此处所用，MP“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非MP多肽可操作地连接的MP多肽。“MP多肽”指具有与MP相对应的氨基酸序列的多肽。“非MP多肽”指具有如下氨基酸序列的多肽，该序列对应于实质上不同源于MP蛋白的蛋白质，例如，所述蛋白质可以是与MP蛋白质不同且来源于相同或不同的生物体的蛋白质。在融合蛋白内，术语“可操作地连接”意指MP多肽和非MP多肽相互以符合阅读框的形式融合。非MP多肽可与MP多肽的N-末端或C-末端融合。例如，在一个实施方案中，融合蛋白为GST-MP融合蛋白，其中MP序列融合至GST序列的C-末端。此类融合蛋白可利于重组MP蛋白的纯化。在另一实施方案中，融合蛋白为在其N-末端含有异源信号序列的MP蛋白。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过应用异源信号序列可增加MP蛋白的表达和/或分泌。
优选地，本发明的MP嵌合或融合蛋白通过标准的重组DNA技术制备。例如，编码不同多肽序列的DNA片段可根据常规技术以符合阅读框的方式连结在一起，所述技术为例如，应用钝末端或粘末端(用于连接)、限制性酶消化产生合适的末端、适当时填平粘端、碱性磷酸酶处理以避免不需要的接合以及酶促连接。在另一实施方案中，融合基因可由常规技术合成，包括DNA自动合成仪。备选地，可应用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，导致在两连续的基因片段间产生互补突出端，随后可以进行退火及重新扩增以产生嵌合基因序列(参见例如，最新分子生物学方法(Current Protocolsin Molecular Biology)，Ausubel等人编辑，John Wiley & Sons：1992)。此外，许多商售的表达载体已编码有融合部份(如GST多肽)。可将编码MP的核酸克隆到此类表达载体中，以使融合部分与MP蛋白以符合阅读框的形式连为一体。
MP蛋白的同系物可通过诱变产生，例如MP蛋白质的不连续点突变或截短。如此处所用，术语”同系物”是指MP蛋白的变体形式，其可以用作MP蛋白活性的激动剂或拮抗剂。MP蛋白的激动剂可持有与MP蛋白基本相同的生物活性或其部份生物活性。MP蛋白的拮抗剂可以，例如通过竞争性结合包括MP蛋白在内的MP信号级联的下游或上游成员，抑制天然形式的MP蛋白的一种或多种活性。因此，本发明的谷氨酸棒状杆菌MP蛋白及其同系物可调节该微生物中MP蛋白发挥作用的一个或多个代谢途径的活性。
在一个备选实施方案中，MP蛋白的同系物可以通过针对MP激动剂或拮抗剂活性筛选MP蛋白的突变体组合文库进行鉴定，例如，所述文库可以为截短突变体文库。在一个实施方案中，通过在核酸水平上进行组合诱变，产生由多样化基因文库编码的多样化MP变体文库。例如，多样化MP变体文库可通过如下方式制备：将合成的寡核苷酸混合物酶促连接为基因序列以使一组简并的潜在MP序列可表达为单独的多肽，或备选地，表达为其中含有该组MP序列的一组较大融合蛋白(例如，用于噬菌体展示)。有多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在MP同系物文库。可在DNA自动合成仪上进行简并基因序列的化学合成，然后将合成基因连入合适的表达载体。一组简并基因的应用使得可以在一个混合物中提供编码一组所需的潜在MP序列的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法在本领域内是公知的(参见例如，Narang，S.A(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人(1984)科学(Science)198：1056；Ike等人(1983)核酸研究(Nucleic Acid Res)11：477)。
此外，MP蛋白编码序列片段的文库可用于产生多样化的MP片段群，以筛选及随后挑选出MP蛋白的同系物。在一个实施方案中，可通过用核酸酶处理MP编码序列的双链PCR片段(在所述处理进行的条件下，在每个分子中仅发生大约一次切割)、将双链DNA变性、使DNA复性形成双链DNA(此双链DNA中可以包括来自不同切割产物的有义/反义对)、用S1核酸酶处理以从新形成的双链体中除去单链部分，然后将产生的片段文库连入表达载体，由此产生编码序列片段的文库。用该方法可形成表达文库，所述文库编码MP蛋白不同大小的N-末端、C-末端及内部片段。
用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库基因产物以及用于筛选cDNA文库以获得具有所选性质的基因产物的一些技术在本领域内是公知的。这些技术可经修改而适于快速筛选由MP同系物的组合诱变产生的基因文库。最为广泛应用的适于高通量分析以筛选大型基因文库的技术一般包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所获载体文库转化适宜细胞并表达组合基因，在该表达条件下对所需活性的测试将利于分离检测到的基因产物的编码载体。递归总体诱变(Recursive ensemble mutagenesis，REM)为增加文库中功能性突变体频率的一种新技术，可与筛选试验联合应用以鉴定MP同系物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)蛋白质工程(Protein Engineering)6(3)：327-331)。
在另一实施方案中，可以利用基于细胞的试验来分析多样化的MP文库，所用方法为本领域熟知。D.本发明的用途和方法
文中所述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同系物、融合蛋白、引物、载体和宿主细胞可用于一种或多种下述方法中：鉴定谷氨酸棒状杆菌及相关生物体；绘制与谷氨酸棒状杆菌相关的生物体的基因组图谱；鉴定并定位目标谷氨酸棒状杆菌序列；进化研究；确定MP蛋白中为功能所需的区域；调节MP蛋白活性；调节MP途径的活性；以及调节目标化合物如精细化学品的细胞产量。本发明的MP核酸分子具有多种用途。首先，它们可用于鉴定生物体是否为谷氨酸棒状杆菌或其近亲。它们也可用于在混合的微生物群体中鉴定谷氨酸棒状杆菌或其相关菌的存在。本发明提供了许多谷氨酸棒状杆菌基因的核酸序列；通过在严格条件下用跨越对谷氨酸棒状杆菌独特的谷氨酸棒状杆菌基因区域的探针探测单一微生物群体或混合群体的培养物的提取基因组DNA，可确定谷氨酸棒状杆菌是否存在。虽然谷氨酸棒状杆菌自身对人类为非致病的，但它与人类病原体如白喉棒状杆菌有亲缘关系。白喉棒状杆菌为白喉的致病因子，白喉是一种快速发展的、急性发热感染，其涉及到局部和全身病理。在该疾病中，局部损害发生在上呼吸道，并涉及对上皮细胞的坏死性损伤；该杆菌分泌的毒素通过该损伤处传播到身体远端的易感组织。通过在组织中抑制蛋白质合成而引起退化改变(所述组织包括心脏、肌肉、外周神经、肾上腺、肾脏、肝脏和脾脏)从而导致产生疾病的全身病理现象。白喉在世界上许多地方仍具有高发病率，包括非洲、亚州、东欧和前苏联的独立国家。自1990以来，在后两个区域白喉的进行性流行导致了至少5,000人死亡。
在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中鉴定白喉棒状杆菌的存在或活性的方法。该方法包括在受试者中检测本发明的一个或多个核酸或氨基酸序列(例如，序列表中分别用奇数编号或偶数编号的SEQ ID NO显示的序列)，由此检测在该受试者中白喉棒状杆菌的存在或活性。谷氨酸棒状杆菌和白喉棒状杆菌为亲缘菌，在谷氨酸棒状杆菌中许多核酸和蛋白质分子与白喉棒状杆菌的核酸和蛋白质分子同源，因此可用于在受试者中检测白喉棒状杆菌。
本发明的核酸和蛋白质分子也可用作基因组特定区域的标记。这不仅可用于基因组图谱，也可用于谷氨酸棒状杆菌蛋白质的功能研究。例如，为了鉴定与特定的谷氨酸棒状杆菌DNA-结合蛋白结合的基因组区域，可消化谷氨酸棒状杆菌基因组，并将片段与DNA-结合蛋白孵育。另外，那些与蛋白结合的片段可用本发明的核酸分子探测，优选地用具有易于检测的标记物的核酸分子探测；此核酸分子与基因组片段的结合可将片段定位于谷氨酸棒状杆菌的基因组图谱中，并且当用不同的酶进行多次试验时，可利于快速确定与蛋白质结合的核酸序列。而且，本发明的核酸分子可充分同源于亲缘种的序列，这样这些核酸分子可用作在亲缘菌如乳糖发酵短杆菌中构建基因组图谱的标记。
本发明的MP核酸分子也用于进化和蛋白质结构研究。大量的原核和真核细胞应用本发明分子参与的代谢过程；通过将本发明核酸分子的序列与来自其它生物体的编码类似酶的那些序列比较，可评估生物体的进化关系。类似地，此比较使得可评估哪些区域保守和哪些区域不保守，这有利于确定那些对酶功能所必需的蛋白质区域。这种确定对蛋白质工程研究有价值，并可指出该蛋白质可耐受何种诱变且不丢失其功能。
对本发明MP核酸分子进行操作可导致产生与野生型MP蛋白功能不同的MP蛋白。这些蛋白质可以在功效或活性上提高，可以在细胞内以较通常多的量存在，或可以在功效或活性上降低。
本发明也提供了筛选调节MP蛋白活性的分子的方法，所述分子可以与MP蛋白本身相互作用或与MP蛋白的底物或结合部分相互作用，或者调节本发明MP核酸分子的转录或翻译。在此类方法中，将表达本发明一个或多个MP蛋白的微生物与一种或多种受试化合物接触，并评估每一受试化合物对MP蛋白的活性或表达水平的影响。
当待从谷氨酸棒状杆菌大规模发酵培养物中分离的目标精细化学品为氨基酸、维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷或海藻糖时，通过重组遗传机制调节本发明一种或多种蛋白质的活性或活性功效可直接影响这些精细化学品之一的产生。例如，当涉及目标氨基酸的生物合成途径中的酶时，提高酶的功效或活性(包括存在多拷贝该基因)应可以导致目标氨基酸的产量或产生效率提高。而对于与目标氨基酸竞争合成的氨基酸的生物合成途径中的酶，对该酶的功效或活性的任何减弱(包括缺失该基因)应导致目标氨基酸的产量或产生效率提高，这是因为减少了对中间化合物和/或能量的竞争。对于目标氨基酸的降解途径中的酶，对该酶的功效或活性的任何减弱应导致目标产物的产率或产生效率提高，这是因为减少了其降解。最后，当诱变参与目标氨基酸生物合成的酶致使该酶不再能被反馈抑制时，也应导致目标氨基酸的产生或产生效率提高。这些同样适用于本发明的参与维生素、辅因子、营养药、核苷酸、核苷和海藻糖代谢的生物合成和降解酶。
类似地，当目标精细化学品不是上述化合物之一时，调节本发明蛋白质之一的活性也可影响谷氨酸棒状杆菌大规模培养物中该化合物的产率和/或产生效率。任何生物体的代谢途径都为紧密相关的；一个途径所使用的中间体往往由不同的途径提供。可以基于来自不同代谢过程的化合物的细胞水平调节酶的表达和功能，并且为基本生长所必需的分子如氨基酸和核苷酸的细胞水平可关键性地影响大规模培养物中微生物的存活力。因此，调节氨基酸生物合成的酶，例如使该酶不再对反馈抑制起反应或使该酶的功效或周转提高可导致一种或多种氨基酸的细胞水平提高。接下来，该增加的氨基酸池不仅为蛋白质合成提供了增多的必需分子，也使在许多其它生物合成途径中用作中间体和前体的分子的供应增加。如果特定氨基酸在细胞中是限制性的，则其产生增加可提高细胞行使多种其它代谢反应的能力，并使细胞可更有效地产生各种蛋白质，从而可能在大规模培养物中提高细胞的总体生长速率或存活能力。提高的存活力将增加发酵培养物中可产生目标精细化学品的细胞数目，由此提高该化合物的产率。可行的类似方法是调节本发明的降解酶的活性，从而使该酶不再催化或较低效率地催化细胞化合物的降解，其中所述细胞化合物对目标化合物的生物合成是重要的，或其将使细胞更有效地在大规模培养物中生长并繁殖。应强调的是，优化本发明某些分子的降解活性或降低其生物合成活性对于谷氨酸棒状杆菌的某些精细化学品产生也可能具有有益的作用。例如，通过降低与目标化合物生物合成途径竞争一个或多个中间体的途径中的生物合成酶的活性功效，将使更多的这些中间体可用于转化为目标产物。类似的情况可能要求提高对本发明一种或多种蛋白质的降解能力或效率。
上述列出的用于MP蛋白的、导致目标化合物产率增加的诱变策略并非是限制性的；对这些诱变策略的变化对本领域普通技术人员是显而易见的。通过这些机制，本发明的核酸和蛋白质分子可用于产生表达突变的MP核酸和蛋白质分子的谷氨酸棒状杆菌或相关的细菌菌株，从而提高目标化合物的产率、产量和/或产生效率。该目标化合物可为谷氨酸棒状杆菌的任何天然产物，其包括生物合成途径的终产物和天然代谢途径的中间体，该目标化合物也可为非天然存在于谷氨酸棒状杆菌代谢中但为本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株产生的分子。欲由谷氨酸棒状杆菌菌株产生的优选化合物为海藻糖和/或L-赖氨酸和L-甲硫氨酸。
在一个实施方案中，从谷氨酸棒状杆菌中分离了编码甲硫氨酸生物合成途径中第三个酶胱硫醚β-裂合酶的metC基因。该基因的翻译产物显示与来自其它生物体的metC基因没有显著的同源性。将含此metC基因的质粒导入谷氨酸棒状杆菌导致胱硫醚β-裂合酶活性提高5倍。该蛋白质产物现在称为MetC，其为由325个氨基酸组成的35,574道尔顿蛋白质产物，与以前报道的aecD基因相此，除了存在2个不同的氨基酸外均相同。像aecD基因一样，当存在多拷贝时，metC基因赋予对有毒的赖氨酸类似物S-(β-氨基乙基)-半胱氨酸的抗性。但是，遗传学的和生物化学的证据暗示metC基因产物的天然活性是在谷氨酸棒状杆菌中介导甲硫氨酸生物合成。构建了metC的突变株，且这些菌株显示为甲硫氨酸原养型。突变株完全失去了抵抗S-(β-氨基乙基)-半胱氨酸的能力。这些结果表明，除了转硫作用外，另一生物合成途径，即直接硫解作用途径在谷氨酸棒状杆菌中作为甲硫氨酸的平行生物合成途径起作用。
又在另一实施方案中，还显示出O-乙酰高丝氨酸硫解酶催化该额外的硫解作用途径。该途径的存在通过相应的metZ(或metY)基因和酶的分离而证实。在真核生物中，已报道真菌和酵母同时具有转硫作用和直接硫解作用途径(Marzluf，1997)。至今，还没有发现同时拥有这两个途径的原核生物体。与仅拥有单一的赖氨酸生物合成途径的大肠杆菌不同，谷氨酸棒状杆菌对该氨基酸拥有两个平行的生物合成途径。在此方面，谷氨酸棒状杆菌中甲硫氨酸的生物合成途径类似于赖氨酸的生物合成途径。
metZ基因的发现是因为它位于metA的上游区域。我们对metA的上游和下游区域进行了测序-metA基因编码催化甲硫氨酸生物合成的第一步的酶(Park，S.-D.，Lee，J.-Y.，Kim，Y.，Kim，J.-H.，和Lee，H.-S.(1998)，一种在谷氨酸棒状杆菌中编码高丝氨酸乙酰转移酶的甲硫氨酸生物合成基因：metA的分离和分析.Mol.Cells 8，286-294)，发现其它可能的met基因。metZ和metA似乎形成一个操纵子。编码MetA和MetZ的这些基因的表达可以导致相应多肽的过量产生，这一点可由凝胶电泳显示。
令人吃惊的是：metZ克隆可互补甲硫氨酸营养缺陷型的大肠杆菌metB突变株。这显示metZ的蛋白质产物催化的步骤可以成为由metB的蛋白质产物催化的步骤的旁路。
MetZ被破坏后，突变株显示为甲硫氨酸原养型。我们也构建了谷氨酸棒状杆菌metB和metZ双突变体。该双突变体对甲硫氨酸是营养缺陷型的。这样，metZ编码的蛋白质催化从O-乙酰-高丝氨酸至高半胱氨酸的反应，该反应为甲硫氨酸生物合成的硫解作用途径中的一步。谷氨酸棒状杆菌同时包含甲硫氨酸生物合成的转硫作用和硫解作用途径。
将metZ导入谷氨酸棒状杆菌导致一47,000道尔顿的蛋白质表达。将metZ和metA组合导入谷氨酸棒状杆菌导致凝胶电泳上显示出metA和metZ蛋白质出现。如果该棒状杆菌菌株为赖氨酸的过量生产者，导入含metZ和metA的质粒导致较低的赖氨酸滴度，但检测到高半胱氨酸和甲硫氨酸的累积。
在另一实施方案中，将metZ和metA与hom基因一同导入谷氨酸棒状杆菌，其中所述hom基因编码高丝氨酸脱氢酶，其催化天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸。选择来自不同生物体的不同hom基因用于该实验。可使用谷氨酸棒状杆菌的hom基因，以及来自其它原核生物如大肠杆菌或枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的hom基因，或甚至来自真核生物如酿酒酵母、Shizosaccharomyces pombe、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或藻类、高等植物或动物的hom基因。该hom基因可以对天冬氨酸家族的氨基酸如天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸的生物合成途径中存在的任何代谢物所介导的反馈抑制不敏感。此类代谢物为例如天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、天冬氨酰磷酸、天冬氨酸半醛、高丝氨酸、胱硫醚、高半胱氨酸或在该生物合成途径中存在的任何其它代谢物。除了代谢物外，该高丝氨酸脱氢酶也可以对所有这些代谢物的类似物的抑制作用不敏感，或甚至对参与该代谢的其它化合物(如其它氨基酸诸如半胱氨酸或辅因子诸如维生素B12和其全体衍生物以及S-腺苷甲硫氨酸和其代谢物、衍生物和类似物)的抑制作用不敏感。高丝氨酸脱氢酶对所有这些化合物、这些化合物中的一部分或仅这些化合物中的一种具有的不敏感性可以是它的天然属性，或可以由化学或辐射或其它诱变剂进行经典突变然后选择后产生的一个或多个突变引起。也可使用基因技术，例如导入定点突变或通过用于MP或编码MP的DNA序列的上述任一方法，将突变导入hom基因。
当hom基因与metZ和metA基因组合并导入过量产生赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株时，赖氨酸的累积减少且高半胱氨酸和甲硫氨酸的累积增大。如果使用过量产生赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株并在用含有hom基因和metZ及metA组合的DNA转化前破坏ddh基因或lysA基因，可达到高半胱氨酸和甲硫氨酸浓度的进一步增大。可以使用不同的硫源使高半胱氨酸和甲硫氨酸过量产生。可使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐及更具还原性的硫源如H2S和硫化物及衍生物。也可使用有机硫源如甲硫醇、硫基乙醇酸盐、硫氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其它含硫化合物以达到高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量产生。
在另一实施方案中，用上述方法将metC基因导入谷氨酸棒状杆菌菌株。metC基因可与其它基因如metB、metA和metA组合转化入该菌株。甚至可添加hom基因。当将hom基因、metC、metA和metB基因组合在一个载体上并导入谷氨酸棒状杆菌菌株时，实现了高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量产生。高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量产生可使用不同的硫源实现。可使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐及更具还原性的硫源如H2S和硫化物及衍生物。也可使用有机硫源如甲硫醇、硫基乙醇酸盐、硫氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其它含硫化合物以达到高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量产生。
本发明进一步通过下列实施例阐述，这些实施例不应理解为限制性的。在该申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利、公开的专利申请、表及序列表的全部内容特此引入作为参考。
实施例1：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的总基因组DNA的制备
谷氨酸棒状杆菌(ATCC 13032)的培养物在30℃于BHI培养基(Difco)中剧烈振摇过夜。离心收获细胞，弃上清并将细胞重悬于5ml缓冲液-I(培养物原初体积的5％-所有显示的体积为按100ml培养物体积计算所得)。缓冲液-I的组成：140.34g/l蔗糖，2.46g/l MgSO4×7H2O，10ml/l KH2PO4溶液(100g/l，用KOH调节至pH6.7)，50ml/l M12浓缩物(10g/l(NH4)2SO4，1g/l NaCl，2g/l MgSO4×7H2O，0.2g/l CaCl2，0.5g/l酵母提取物(Difco)，10ml/l痕量元素混合物(200mg/l FeSO4×H2O，10mg/l ZnSO4×7H2O，3mg/lMnCl2×4H2O，30mg/l H3BO3，20mg/l CoCl2×6H2O，1mg/l NiCl2×6H2O，3mg/l Na2MoO4×2H2O，500mg/l络合剂(EDTA或柠檬酸)，100ml/l维生素-混合物(0.2mg/l生物素，0.2mg/l叶酸，20mg/l对氨基苯甲酸，20mg/l核黄素，40mg/l泛酸钙，140mg/l烟酸，40mg/l维生素B6盐酸盐，200mg/l肌醇)。向悬液中加入溶菌酶至终浓度2.5mg/ml。在37℃孵育约4小时后，细胞壁降解，离心收获所得的原生质体。沉淀用5ml缓冲液-I洗一次并用5ml TE-缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8)洗一次。将沉淀重悬于4ml TE-缓冲液，并加入0.5ml SDS溶液(10％)和0.5ml NaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至终浓度200μg/ml后，将悬液在37℃孵育约18小时。使用标准方法用酚、酚-氯仿-异戊醇和氯仿-异戊醇提取而纯化DNA。然后，加入1/50体积的3M醋酸钠和2体积的乙醇，于-20℃孵育30分钟，并在高速离心机上使用SS34转子(Sorvall)于12,000转/分离心30分钟，沉淀DNA。将该DNA溶于含20μg/ml RNaseA的1ml TE-缓冲液中，并用1000ml TE-缓冲液于4℃透析至少3小时。在此期间，更换缓冲液3次。向分装的0.4ml透析过的DNA溶液中加入0.4ml 2M LiCl和0.8ml乙醇。于-20℃孵育30分钟后，离心(13,000转/分，Biofuge Fresco，Heraeus，Hanau，德国)收集DNA。将该DNA沉淀溶于TE-缓冲液。用此方法制备的DNA可用于所有目的，包括southern印迹或构建基因组文库。实施例2：在大肠杆菌中构建谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组文库
使用如实施例1所述制备的DNA，按照公知的且已建立的方法(参见例如，Sambrook，J.等人(1989)“分子克隆：实验室手册”，Cold Spring HarborLaboratory Press，或Ausubel，F.M.等人(1994)“分子生物学最新方法”，John Wiley & Sons.)构建粘粒和质粒文库。
可以使用任何质粒或粘粒。特别可以使用的是质粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75：3737-3741)；pACYC177(Change & Cohen(1978)细菌学杂志(J.Bacteriol)134：1141-1156)、pBS系列的质粒(pBSSK+，pBSSK-及其它；Stratagene，LaJolla，USA)、或粘粒如SuperCos1(Stratagene，LaJolla，USA)或Lorist6(Gibson，T.J.，Rosenthal A.和Waterson，R.H.(1987)基因(Gene)53：283-286。特异性用于谷氨酸棒状杆菌的基因文库可用质粒pSL109(Lee，H.-S.和A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4：256-263)构建。实施例3：DNA序列测定和计算机功能分析
如实施例2所述的基因组文库按照标准方法用于DNA序列测定，尤其是使用ABI377序列测定仪通过链终止法测定(参见例如，Fleischman，R.D.等人(1995)“流感嗜血菌(Haemophilus Influenzae)Rd的全基因组随机序列测定和组装”，科学( Science)，269：496-512)。使用具有以下核苷酸序列的测序引物：5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’或5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。实施例4：体内诱变
谷氨酸棒状杆菌的体内诱变可通过将质粒(或其它载体)DNA在不能维持其遗传信息完整性的大肠杆菌或其它微生物(例如芽孢杆菌属种或酵母如酿酒酵母)中传代而实施。典型的增变菌株在用于DNA修复系统的基因中有突变(例如mutHLS，mutD，mutT等；参考文献见大肠杆菌和沙门氏菌(Escherichia coli and Salmonella)，ASM：Washington一书中的Rupp，W.D.(1996)DNA修复机制，2277-2294页)。此类菌株为本领域普通技术人员熟知。此类菌株的用途在例如Greener，A.和Callahan，M.(1994)Strategies7：32-34中进行了阐述。实施例5：在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌之间的DNA转移
几种棒状杆菌和短杆菌种类含有自主复制的内源质粒(例如pHM1519或pBL1)(综述参见例如，Martin，J.F.等人(1987)生物技术(Biotechnology)，5：137-146)。使用标准的大肠杆菌载体易于构建用于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体(Sambrook，J.等人(1989)，“分子克隆：实验室手册”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，或Ausubel，F.M.等人(1994)“最新分子生物学方法”(”Current Protocols in Molecular Biology”)，John Wiley& Sons)，其中加入用于谷氨酸棒状杆菌的复制起点和来自谷氨酸棒状杆菌的适当标记。此类复制起点优选取自从棒状杆菌和短杆菌分离的内源质粒。对于这些物种，作为转化标记尤其有用的是卡那霉素抗性基因(如源自Tn5或Tn903转座子的基因)或氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)”FromGenes to Clones-Introduction to Gene Technology，VCH，Weinheim)。在文献中有许多在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中均复制的多种穿梭载体的构建例子，这些载体可用于多种目的，包括基因过表达(参考文献参见例如，Yoshihama，M.等人(1985)细菌学杂志(J.Bacteriol.)162：591-597，MartinJ.F.等人(1987)生物技术(Biotechnology)，5：137-146和Eikmanns，B.J.等人(1991)基因(Gene)，102：93-98)。
使用标准技术，可将目的基因克隆入上述的穿梭载体之一中并可将此杂合载体导入谷氨酸棒状杆菌菌株。谷氨酸棒状杆菌的转化可通过原生质体转化(Kastsumata，R.等人(1984)细菌学杂志(J.Bacteriol.)159306-311)、电穿孔(Liebl，E.等人(1989)FEMS Microbiol.Letters，53：399-303)以及当使用特别的载体时，也可通过接合(如在Sch_fer，A等人(1990)细菌学杂志(J.Bacteriol.)172：1663-1666中所述)来完成。也可通过制备谷氨酸棒状杆菌的质粒DNA(使用本领域熟知的标准方法)并将其转化至大肠杆菌，将谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体转移至大肠杆菌中。该转化步骤可使用标准方法进行，但有利的是使用Mcr-缺陷的大肠杆菌菌株，如NM522(Gough & Murray(1983)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166：1-19)。
使用包含pCG1(美国专利号4,617,267)或其片段且任选地包含来自TN903的卡那霉素抗性基因的质粒，可在谷氨酸棒状杆菌菌株中过表达基因(Grindley，N.D.和Joyce，C.M.(1980)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77(12)：7176-7180)。此外，也可以使用质粒pSL109在谷氨酸棒状杆菌菌株中过表达基因(Lee，H.-S.和A.J.Sinskey(1994)J.Microbiol.Biotechnol.4：256-263)。
除了使用复制型质粒外，也可通过将基因整合至基因组中来过表达基因。在谷氨酸棒状杆菌或其它棒状杆菌或短杆菌种中，基因组整合可通过熟知的方法完成，如与基因组区域的同源重组、限制性内切酶介导的整合(REMI)(参见例如，DE专利19823834)或通过使用转座子。也可以使用定点方法(如同源重组)或使用基于随机事件的方法(如转座子诱变或REMI)通过序列改变、插入或缺失来改变调节区(如启动子、阻遏子和/或增强子)从而调节目的基因的活性。也可将起转录终止子作用的核酸序列插入本发明一个或多个基因的编码区的3’；此类终止子为本领域熟知，在如Winnacker，E.L.(1987)从基因至克隆-基因技术介绍(From Genes toClones-Introduction to Gene Technology).VCH：Weinheim一书中描述。
            实施例6：评估突变蛋白质的表达
在转化的宿主细胞中对突变蛋白质活性的观察依赖于突变蛋白质与野生型蛋白质以相似的方式和相似的量表达的事实。确定突变基因的转录水平(指示可用于翻译为基因产物的mRNA量)的有用方法是进行Northern印迹(参考文献见例如，Ausubel等人(1988)分子生物学最新方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Wiley：New York)，其中设计为与目的基因结合的引物用可检测标志(通常为放射性的或化学发光的)标记，这样当提取生物体培养物的总RNA、在凝胶上运行、转移至稳定的基质上并与该探针孵育后，探针的结合和结合量将指示该基因的存在和其mRNA量。该信息是突变基因转录程度的证据。通过几种方法可从谷氨酸棒状杆菌中制备总细胞RNA，这些方法均为本领域熟知，如在Bormann，E.R.等人(1992)分子微生物学(Mol.Microbiol.)6：317-326中所描述。
为了评估从该mRNA翻译的蛋白质的存在或相对量，可使用标准技术如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹(参见例如，Ausubel等人(1988)分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley：New York)。在该方法中，提取细胞总蛋白质、通过凝胶电泳分离、转移至基质如硝化纤维上并与能和目标蛋白质特异性结合的探针一起孵育，其中所述探针如抗体。该探针通常用易于检测到的化学发光或显色标记物标记。所观察到的标记物的存在和量将指示在细胞中目标突变蛋白质的存在和量。实施例7：大肠杆菌和遗传改变的谷氨酸棒状杆菌的生长—培养基和培养条件
大肠杆菌菌株通常相应地在MB和LB肉汤中培养(Follettie，M.T.，Peoples，O.，Agoropoulou，C.和Sinskey，A J.(1993)黄色棒状杆菌N13ask-asd操纵子的基因结构和表达。细菌学杂志(J.Bacteriol.)175，4096-4103)。大肠杆菌的极限培养基相应为M9和改良MCGC(Yoshihama，M.，Higashiro，K.，Rao，E.A.，Akedo，M.，Shanabruch，W G.，Follettie，M.T.，Walker，G.C.和Sinskey，A.J.(1985)用于谷氨酸棒状杆菌的克隆载体系统。细菌学杂志(J.Bacteriol.)162，591-507)。加入葡萄糖至终浓度1％。以下列量加入抗生素(μg/ml)：氨苄青霉素，50；卡那霉素，25；萘啶酸，25。以下列量加入氨基酸、维生素和其它补充物：甲硫氨酸，9.3mM；精氨酸，9.3mM；组氨酸，9.3mM；硫胺素，0.05mM。大肠杆菌细胞常规下相应地在37℃生长。
遗传修饰的棒状杆菌培养在合成或天然的生长培养基中。用于棒状杆菌的许多种不同生长培养基为人们熟知并易于获得(Lieb等人(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32：205-210；von der Osten等人(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；DE专利4,120,867；在原核生物(TheProcaryotes)，Volume II，Balows，A.等人编辑.Springer-Verlag一书中的Liebl(1992)“棒状杆菌属”(“The Genus Corynebacteria”))。这些培养基由一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和痕量元素组成。优选的碳源是糖类，如单糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素可以用作很好的碳源。也可通过复合化合物如糖蜜或其它来自糖提炼的副产品，向培养基提供糖。提供不同碳源的混合物也可以是有利的。其它可能的碳源为醇类和有机酸，如甲醇、乙醇、醋酸或乳酸。氮源通常为有机或无机氮化合物，或为包含这些化合物的物质。示例性氮源包括氨气或胺盐如NH4Cl或(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏等。
可以使用不同的硫源过量产生含硫氨基酸如高半胱氨酸和甲硫氨酸。可使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐，也可以使用更具还原性的硫源如H2S和硫化物及衍生物。有机硫源像甲硫醇、硫基乙醇酸盐、硫氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸和其它含硫化合物也可用于实现高半胱氨酸和甲硫氨酸的过量产生。
可包括在培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷盐或硫酸盐。可向培养基中加入螯合物以维持溶液中的金属离子。尤其有用的螯合物包括二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸盐，或有机酸如柠檬酸。培养基一般还包含其它生长因子如维生素或生长促进剂，其实例包括生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐和维生素B6。生长因子和盐常常来自复合培养基成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。培养基化合物的精确组成强烈取决于直接实验并在每一具体情况下单独确定。有关培养基优化的信息在课本”Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury编辑，IRLPress(1997)53-73页，ISBN 0 19 963577 3)中可找到。也可从供应商处选择生长培养基，如standard 1(Merck)或BHI(grain heart infusion，DIFCO)或其它。
通过加热(1.5巴121℃加热20分钟)或过滤除菌对所有的培养基组成成份进行灭菌。组成成份可一起灭菌，或需要的话分开灭菌。所有的培养基组成成份可在生长开始时存在，或它们可任选地连续加入或分批加入。
对每一实验单独规义培养条件。温度应在15℃和45℃的范围之间。在实验过程中温度可保持恒定或可改变。培养基的pH应在5至8.5的范围之间，优选地在7.0附近，可通过向培养基中添加缓冲液来维持。用于此目的的示例性缓冲液为磷酸钾缓冲液。可备选地或同时使用合成缓冲液如MOPS、HEPES、ACES和其它。也可以在生长过程中通过加入NaOH或NH4OH维持恒定的培养pH。如果使用复合培养基成分如酵母提取物，可减少对额外的缓冲液的需要，因为许多复合化合物具有高缓冲能力。如果使用发酵罐培养微生物，也可用气态氨控制pH。
培养时间通常在几小时到几天之间。选择培养时间以允许肉汤中累积最大量的产物。可在多种容器如不同规格的微滴定板、玻璃管、玻璃烧瓶或玻璃或金属发酵罐中实施公开的生长实验。对于筛选大量的克隆，应在微滴定板、玻璃管或在有或没有挡板的摇瓶中培养微生物。优选地使用100ml摇瓶，其中装有10％(体积)的所需生长培养基。该烧瓶应在旋转振荡器(振幅25mm)上以100-300转/分速度摇动。可通过维持潮湿环境减少蒸发损失；备选地，对蒸发损失应进行数学上的校正。
如果试验遗传修饰的克隆，也应试验未修饰的对照克隆或含基本质粒的无任何插入的对照克。使用已于30℃孵育的在琼脂板上生长的细胞接种培养基至OD600 0.5-1.5，其中所述琼脂板如CM板(10g/l葡萄糖，2.5g/lNaCl，2g/l尿素，10g/l聚胨，5g/l酵母抽取物，5g/l肉膏，22g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l聚胨，5g/l酵母抽取物，5g/l肉膏，22g/l琼脂，用2M NaOH调节至pH6.8)。培养基的接种可以通过引入从CM板得到的谷氨酸棒状杆菌细胞的盐水悬液或通过添加该细菌的液体预培养物来完成。
          实施例8：突变蛋白质功能的体外分析
本领域已建立了对酶活性和动力学参数的确定。为了确定任一给定的改变酶的活性，实验应加以修改以适应野生型酶的比活性，这在本领域普通技术人员的能力范围内。可在下列参考文献中找到对酶的一般性总结以及有关结构、动力学、原理、方法、应用和多种酶活性的测定例子的具体细节：例如Dixon，M.和Webb，E.C.，(1979)酶(Enzymes).Longmans：伦敦；Fersht，(1985)酶结构和机制(Enzyme Structure and Mechanism).Freeman：纽约；Walsh，(1979)酶促反应机制(Enzymatic ReactionMechanisms).Freeman：San Francisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)酶学基础(Fundamentals of Enzymology).Oxford Univ.Press：Oxford；Boyer，P.D.编辑(1983)酶(The Enzymes)，第三版，Academic Press：纽约；Bisswanger，H.，(1994)酶动力学(Enzymkinetik)，第二版.VCH：Weinheim(ISBN 3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.编辑(1983-1986)酶促分析方法(Methods of Enzymatic Analysis)，第三版，I-XII卷，Verlag Chemie：Weinheim；以及Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)(1987)A9卷，”酶”.VCH：Weinheim，352-363页。
可通过几种已建立的方法测定结合DNA的蛋白质的活性，如DNA带移动试验(也称为凝胶阻滞试验)。此类蛋白质对其它分子表达的影响可使用报告基因试验测定(如在Kolmar，H.等人(1995) EMBO J.14：3895-3904及其中所引用的参考文献中所述)。报告基因测试系统为人们所熟知，并被建立以应用于原核和真核细胞，使用的酶如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和几种其它的酶。
可根据如在生物膜，分子结构和功能(Biomembranes，MolecularStructure and Function)，Springer：Heidelberg一书中的Gennis，R.B.(1989)”Pores，Channels and Transporters”，85-137；199-234和270-322页中所述的技术进行膜转运蛋白活性的测定。
       实施例9：分析突变蛋白质对目标产物产生的影响
谷氨酸棒状杆菌中的遗传修饰对目标化合物(如氨基酸)产生的影响可通过如下方式评估：将经修饰的微生物在合适的条件(如上文中所描述的那些条件)下生长，并针对目标产物(即氨基酸)产生的增加来分析培养基和/或细胞成分。此类分析技术为本领域普通技术人员熟知，包括光谱学、薄层色谱法、多种染色法、酶学和微生物学方法、以及分析色谱法如高效液相色谱法(参见例如，Ullman工业化学百科全书(Ullman，Encyclopediaof Industrial Chemistry)，A2卷，89-90和443-613页，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.等人(1987)生物化学和分子生物学实验室技术(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology)中的“HPLC在生物化学中的应用”，17卷；Rehm等人(1993)生物技术(Biotechnology)，3卷，III章“产物回收和纯化”，469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等人(1988)生物分离：生物技术中的下游加工，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)生物物质的回收方法John Wileyand Sons；在《Ulmann工业化学百科全书》一书中的Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化学分离，B3卷，11章，1-27页，VCH：Weinheim；以及Dechow，F.J.(1989)生物技术中的分离和纯化技术(Separation andpurification techniques in biotechnology)，Noyes Publications.)。
除了测定发酵终产物外，还可分析用于产生目标化合物的代谢途径的其它成分如中间体和副产物来确定化合物的总体产生效率。分析方法包括测定培养基中的营养素水平(例如，糖类、碳水化合物、氮源、磷酸盐和其它离子)、测定生物量组成和生长、分析生物合成途径中共同代谢物的产生及测定发酵过程中产生的气体。这些测定的标准方法在《应用微生物生理学，实用方法》(Applied Microbial Physiology，A Practical Approach)，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury编辑，IRL Press，103-129；131-163和165-192页(ISBN：0199635773)及其引用的参考文献中列出。
实施例10：从谷氨酸棒状杆菌培养物中纯化目标产物
可通过多种本领域熟知的方法从谷氨酸棒状杆菌细胞或上述培养物上清回收目标产物。如果目标产物不从细胞向外分泌，可低速离心从培养物中收获细胞、用标准技术如机械力或超声裂解细胞。离心去除细胞碎片，保留含有可溶蛋白质的上清级分用于进一步纯化目标化合物。如果化合物从谷氨酸棒状杆菌细胞分泌，则低速离心从培养物中去除细胞，并保留上清级分用于进一步纯化。
将来自任一种纯化方法的上清级分用合适的树脂进行层析，其中目标分子保留在层析树脂上而样本中的许多杂质不保留在层析树脂上，或者杂质保留在层析树脂上而样本不保留。此层析步骤必需时可使用相同或不同的层析树脂重复。本领域普通技术人员在选择合适的层析树脂以及将它们最有效地用于特定的待纯化分子方面是很精通的。可通过过滤或超滤浓缩纯化产物，并贮存在使产物稳定性最大的温度下。
有大量的纯化方法为本领域公知，上述纯化方法为非限制性的。此类纯化技术例如在Bailey，J.E.和Ollis，D.F.生物化学工程基础(BiochemicalEngineering Fundamentals)，McGraw-Hill：纽约(1986)中描述。
分离化合物的特性和纯度可通过本领域的标准技术评定。这些技术包括高效液相色谱(HPLC)、光谱法、染色法、薄层色谱法、NIRS、酶学试验或微生物学方法。此类分析方法的综述见：Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova等人(1996)生物技术(Biotekhnologiya)11：27-32；和Schmidt等人(1998)生物加工工程(Bioprocess Engineer)19：67-70；Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)(1996)A27卷，VCH：Weinheim，89-90页，521-540页，540-547页，559-566页，575-581页和581-587页；Michal，G.(1999)生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology)，John Wileyand Sons；《生物化学和分子生物学中的实验室技术》17卷中的Fallon，A.等人(1987)HPLC在生物化学中的应用。
            实施例11：本发明基因序列的分析
在两个序列间比较序列并确定百分同源性为本领域公知的技术，可使用数学算法完成，如Karlin和Altschul(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87：2264-68的算法，该算法的改进见Karlin和Altschul(1993)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：5873-77。此算法被掺入了Altschul等人(1990)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.215：403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，设置的分值＝100、字长＝12，以获得与本发明MP核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，设置的分值＝50、字长＝3，以获得与本发明MP蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可使用Altschul等人(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17)：3389-3402中所述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，本领域普通技术人员将知道对所分析的具体序列如何优化程序(例如XBLAST和NBLAST)参数。
用于序列比较的数学算法的另一实例为Meyers和Miller((1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)的算法。此算法被掺入ALIGN程序(2.0版本)，其中所述ALIGN程序为GCG序列比较软件包的一部分。当应用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、设置缺口长度罚分为12和缺口罚分为4。其它的序列分析算法为本领域公知，包括Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.10：3-5描述的ADVANCE和ADAM；以及Pearson和Lipman(1988)P.N.A.S.85：2444-8描述的FASTA。
使用GCG软件包(可在 http：//www.gcg.com获得)中的GAP程序也可获得两个氨基酸序列间的百分同源性，其中使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为12、10、8、6或4，且长度权重为2、3或4。使用GCG软件包中的GAP程序可获得两个核酸序列间的百分同源性，其中使用标准参数，如缺口权重为50且长度权重为3。
我们已使用本领域公知的技术(参见例如，Bexevanis和Ouellette编辑(1998)生物信息学：分析基因和蛋白质的实用指南(Bioinformatics：APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins).John Wiley andSons：纽约)将本发明的基因序列与Genbank中的那些基因序列进行了比较分析。
基于氨基酸序列，使用程序CLUSTAL(Higgins等人(1996)使用CLUSTAL用于多序列比较(Using CLUSTAL for multiple sequencealignments)，酶学方法(Methods in Enzymology)266，383-402)将本发明的基因序列与已知的基因进行了比较，其中使用了标准参数(成对序列比较参数：缺口罚分＝3，K-tuple(字)大小＝1，顶对角线数＝5，窗口大小＝5；多个序列比较参数：缺口开放罚分＝10.00，缺口延伸罚分＝0.05，蛋白质权重矩阵＝PAM250)。两个序列间的同源性为所有序列中的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同的位置数/总位置数×100)。该分析结果见表3。
            实施例12：构建和操作DNA微阵列
本发明的序列另外可用于DNA微阵列的构建和应用(DNA阵列的设计、方法学和用途为本领域熟知，在如Schena，M.等人(1995)科学(Science)270：467-470；Wodicka，L.等人(1997)自然生物技术(NatureBiotechnology)15：1359-1367；DeSaizieu，A.等人(1998)自然生物技术(Nature Biotechnology)16：45-48；和Deisi，J.L.等人(1997)科学(Science)278：680-686中描述)。
DNA微阵列为由硝化纤维素、尼龙、玻璃、硅氧烷或其它材料组成的固体或柔软的支持物。核酸分子可以以有序的方式附着在其表面。经过合适的标记后，其它核酸或核酸混合物可与固定的核酸分子杂交，且标记物可用于监测和测定在规定区域处杂交分子的各自信号强度。该方法允许同时定量在所应用的核酸样本或混合物中所有核酸或所选核酸的相对量或绝对量。因此DNA微阵列允许平行分析多个核酸(多至6800个或更多个核酸)的表达(参见例如，Schena，M.(1996)BioEssays 18(5)：427-431)。
本发明的序列可用于设计寡核苷酸引物，其中所述寡核苷酸引物可通过核酸扩增反应如聚合酶链反应扩增一种或多种谷氨酸棒状杆菌基因的限定区域。对5’或3’寡核苷酸引物的选择和设计或对合适接头的选择和设计允许所得的PCR产物能共价连接在上述支持介质表面上(也参见例如Schena，M.等人(1995)科学(Science)270：467-470中描述)。
核酸微阵列也可如Wodicka，L.等人(1997)自然生物技术(NatureBiotechnology)15：1359-1367所述通过原位寡核苷酸合成来构建。通过照相平版印刷法，将基质的精确限定的区域曝光。由此活化光不稳定的保护基，然后进行核苷酸添加，而避光区域不发生任何修饰。接下来的保护和光活化循环允许在规定的位置处合成不同的寡核苷酸。具有本发明基因的小的限定区域可通过固相寡核苷酸合成在微阵列上合成。
存在于样本或核苷酸混合物中的本发明核酸分子可与此微阵列杂交。这些核酸分子可根据标准方法标记。简而言之，核酸分子(例如mRNA分子或DNA分子)在如反转录或DNA合成期间通过掺入同位素或荧光标记的核苷酸而标记。标记的核酸与微阵列的杂交已有描述(例如，Schena，M.等人(1995)见上文；Wodicka，L.等人(1997)，见上文；和DeSaizieu A.等人(1998)，见上文)。杂交分子的检测和定量根据具体掺入的标记而进行。放射性标记可如Schena，M.等人((1995)见上文)所述检测，荧光标记可以例如通过Shalon等人(1996)基因组研究(Genome Research)6：639-645的方法检测。
如上所述，将本发明序列应用于DNA微阵列使得可以比较分析不同的谷氨酸棒状杆菌菌株或其它棒状杆菌菌株。例如，核酸阵列方法有利于基于个体转录谱研究菌株间变异及鉴定对特定和/或目标菌株特性如致病性、生产力和应激耐受力重要的基因。并且，可使用核酸阵列技术比较本发明基因在发酵反应期间的表达谱。
         实施例13：细胞蛋白质群(蛋白质组)的动力学分析
本发明的基因、组合物和方法可用于研究蛋白质群的相互作用和动力学，称为‘蛋白质组学’。目标蛋白质群包括但不限于谷氨酸棒状杆菌的总蛋白质群(例如，与其它生物体的蛋白质群比较)、那些在特定环境或代谢条件下(例如，在发酵过程中、在高温或低温下、或在高或低pH时)具活性的蛋白质、或那些在生长和发育的特定时期具活性的蛋白质。
可通过多种熟知的技术如凝胶电泳分析蛋白质群。细胞蛋白质可例如通过裂解或提取获得，并且可使用多种电泳技术相互分离。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质很大程度上基于它们的分子量。等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)基于等电点分离蛋白质(等电点不仅反映蛋白质的氨基酸序列，也反映蛋白质的翻译后修饰)。另一更优选的蛋白质分析方法为连续组合IEF-PAGE和SDS-PAGE，称为2-D-凝胶电泳(例如，在Hermann等人(1998)电泳(Electrophoresis)19：3217-3221；Fountoulakis等人(1998)电泳(Electrophoresis)19：1193-1202；Langen等人(1997)电泳(Electrophoresis)18：1184-1192；Antelmann等人(1997)电泳(Electrophoresis)18：1451-1463中的描述)。其它分离技术也可用于蛋白质分离，如毛细管凝胶电泳；此类技术在本领域中熟知。
通过这些方法分离的蛋白质可使用标准技术显示，如通过染色或标记显示。合适的染色剂为本领域公知，包括考马斯亮蓝、银染或荧光染料如Sypro Ruby(Molcular Probos)。在谷氨酸棒状杆菌的培养基中包含放射性标记的氨基酸或其它蛋白质前体(例如，35S-甲硫氨酸、35S-半胱氨酸、14C-标记的氨基酸、15N-氨基酸、15NO3或15NH4 +或13C-标记的氨基酸)将允许这些细胞的蛋白质在它们分离前被标记上。类似地，可采用荧光标记。可根据前述的技术提取、分离和分开这些标记的蛋白质。
通过这些技术显示的蛋白质可进一步通过测定所用染料或标记的量来分析。可使用如光学方法定量确定给定蛋白质的量，并且可与同一凝胶或其它凝胶中的其它蛋白质的量比较。凝胶上蛋白质的比较可例如通过光学比较、光谱学、图像扫描并分析凝胶、或通过使用照相胶片和屏来进行。此类技术在本领域中熟知。
为确定任一给定蛋白质的身份，可采用直接序列测定或其它标准技术。例如，可使用N-和/或C-端氨基酸序列测定(诸如Edman降解)，也可使用质谱(特别是MALDI或ESI技术(参见例如，Langen等人(1997)电泳(Electrophoresis)18：1184-1192))。此处提供的蛋白质序列可用于通过这些技术鉴定谷氨酸棒状杆菌蛋白质。
通过这些方法获得的信息可用于比较来自各种生物条件(例如，尤其是，不同生物体、发酵时间点、培养基条件、或不同的小生境等)的不同样本间的蛋白质存在、活性或修饰模式。从单独这些实验或与其它技术组合获得的数据可用于多种用途，如比较在给定情形下(例如，代谢情形下)多种生物体的行为、增加产生精细化学品的菌株的生产力或提高精细化学品的产生效率。
等同物
本领域普通技术人员将意识到或能确定(只是使用常规的实验)文中所描述的本发明具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在包括在下列权利要求中。
                  序列表<110>巴斯福股份公司<120>棒状杆菌基因<130>936_2000<140>936_2000<141>2000-12-22<160>46<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>3793<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)<220><221>CDS<222>(101)..(3763)<400>1agactagtgg cgctttgcct gtgttgctta ggcggcgttg aaaatgaact acgaatgaaa  60agttcgggaa ttgtctaatc cgtactaagc tgtctacaca atg tct act tca gtt    115
                                        Met Ser Thr Ser Val
                                          1               5act tca cca gcc cac aac aac gca cat tcc tcc gaa ttt ttg gat gcg    163Thr Ser Pro Ala His Asn Asn Ala His Ser Ser Glu Phe Leu Asp Ala
             10                  15                  20ttg gca aac cat gtg ttg atc ggc gac ggc gcc atg ggc acc cag ctc    211Leu Ala Asn His Val Leu Ile Gly Asp Gly Ala Met Gly Thr Gln Leu
         25                  30                  35caa ggc ttt gac ctg gac gtg gaa aag gat ttc ctt gat ctg gag ggg    259Gln Gly Phe Asp Leu Asp Val Glu Lys Asp Phe Leu Asp Leu Glu Gly
     40                  45                  50tgt aat gag att ctc aac gac acc cgc cct gat gtg ttg agg cag att    307Cys Asn Glu Ile Leu Asn Asp Thr Arg Pro Asp Val Leu Arg Gln Ile
 55                  60                  65cac cgc gcc tac ttt gag gcg gga gct gac ttg gtt gag acc aat act    355His Arg Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Leu Val Glu Thr Asn Thr70                  75                  80                  85ttt ggt tgc aac ctg ccg aac ttg gcg gat tat gac atc gct gat cgt    403Phe Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr Asp Ile Ala Asp Arg
             90                  95                 100tgc cgt gag ctt gcc tac aag ggc act gca gtg gct agg gaa gtg gct    451Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val Ala Arg Glu Val Ala
        105                 110                 115gat gag atg ggg ccg ggc cga aac ggc atg cgg cgt ttc gtg gtt ggt    499Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg Arg Phe Val Val Gly
    120                 125                 130tcc ctg gga cct gga acg aag ctt cca tcg ctg ggc cat gca ccg tat    547Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu Gly His Ala Pro Tyr
135                 140                 145gca gat ttg cgt ggg cac tac aag gaa gca gcg ctt ggc atc atc gac    595Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala Leu Gly Ile Ile Asp150                 155                 160                 165ggt ggt ggc gat gcc ttt ttg att gag act gct cag gac ttg ctt cag    643Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr Ala Gln Asp Leu Leu Gln
            170                 175                 180gtc aag gct gcg gtt cac ggc gtt caa gat gcc atg gct gaa ctt gat    691Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala Met Ala Glu Leu Asp
        185                 190                 195aca ttc ttg ccc att att tgc cac gtc acc gta gag acc acc ggc acc    739Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val Glu Thr Thr Gly Thr
    200                 205                 210atg ctc atg ggt tct gag atc ggt gcc gcg ttg aca gcg ctg cag cca    787Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu Thr Ala Leu Gln Pro
215                 220                 225ctg ggt atc gac atg att ggt ctg aac tgc gcc acc ggc cca gat gag    835Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala Thr Gly Pro Asp Glu230                 235                 240                 245atg agc gag cac ctg cgt tac ctg tcc aag cac gcc gat att cct gtg    883Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Lys His Ala Asp Ile Pro Val
            250                 255                 260tcg gtg atg cct aac gca ggt ctt cct gtc ctg ggt aaa aac ggt gca    931Ser Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu Gly Lys Asn Gly Ala
        265                 270                 275gaa tac cca ctt gag gct gag gat ttg gcg cag gcg ctg gct gga ttc    979Glu Tyr Pro Leu Glu Ala Glu Asp Leu Ala Gln Ala Leu Ala Gly Phe
    280                 285                 290gtc tcc gaa tat ggc ctg tcc atg gtg ggt ggt tgt tgt ggc acc aca    1027Val Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Met Val Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr
295                 300                 305cct gag cac atc cgt gcg gtc cgc gat gcg gtg gtt ggt gtt cca gag    1075Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Asp Ala Val Val Gly Val Pro Glu310                 315                 320                 325cag gaa acc tcc aca ctg acc aag atc cct gca ggc cct gtt gag cag    1123Gln Glu Thr Ser Thr Leu Thr Lys Ile Pro Ala Gly Pro Val Glu Gln
            330                 335                 340gcc tcc cgc gag gtg gag aaa gag gac tcc gtc gcg tcg ctg tac acc    1171Ala Ser Arg Glu Val Glu Lys Glu Asp Ser Val Ala Ser Leu Tyr Thr
        345                 350                 355tcg gtg cca ttg tcc cag gaa acc ggc att tcc atg atc ggt gag cgc    1219Ser Val Pro Leu Ser Gln Glu Thr Gly Ile Ser Met Ile Gly Glu Arg
    360                 365                 370acc aac tcc aac ggt tcc aag gca ttc cgt gag gca atg ctg tct ggc    1267Thr Asn Ser Asn Gly Ser Lys Ala Phe Arg Glu Ala Met Leu Ser Gly
375                 380                 385gat tgg gaa aag tgt gtg gat att gcc aag cag caa acc cgc gat ggt    1315Asp Trp Glu Lys Cys Val Asp Ile Ala Lys Gln Gln Thr Arg Asp Gly390                 395                 400                 405gca cac atg ctg gat ctt tgt gtg gat tac gtg gga cga gac ggc acc    1363Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val Gly Arg Asp Gly Thr
            410                 415                 420gcc gat atg gcg acc ttg gca gca ctt ctt gct acc agc tcc act ttg    1411Ala Asp Met Ala Thr Leu Ala Ala Leu Leu Ala Thr Ser Ser Thr Leu
        425                 430                 435cca atc atg att gac tcc acc gag cca gag gtt att cgc aca ggc ctt    1459Pro Ile Met Ile Asp Ser Thr Glu Pro Glu Val Ile Arg Thr Gly Leu
    440                 445                 450gag cac ttg ggt gga cga agc atc gtt aac tcc gtc aac ttt gaa gac    1507Glu His Leu Gly Gly Arg Ser Ile Val Asn Ser Val Asn Phe Glu Asp
455                 460                 465ggc gat ggc cct gag tcc cgc tac cag cgc atc atg aaa ctg gta aag    1555Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Ile Met Lys Leu Val Lys470                 475                 480                 485cag cac ggt gcg gcc gtg gtt gcg ctg acc att gat gag gaa ggc cag    1603Gln His Gly Ala Ala Val Val Ala Leu Thr Ile Asp Glu Glu Gly Gln
            490                 495                 500gca cgt acc gct gag cac aag gtg cgc att gct aaa cga ctg att gac    1651Ala Arg Thr Ala Glu His Lys Val Arg Ile Ala Lys Arg Leu Ile Asp
        505                 510                 515gat atc acc ggc agc tac ggc ctg gat atc aaa gac atc gtt gtg gac    1699Asp Ile Thr Gly Ser Tyr Gly Leu Asp Ile Lys Asp Ile Val Val Asp
    520                 525                 530tgc ctg acc ttc ccg atc tct act ggc cag gaa gaa acc agg cga gat    1747Cys Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr Gly Gln Glu Glu Thr Arg Arg Asp
535                 540                 545ggc att gaa acc atc gaa gcc atc cgc gag ctg aag aag ctc tac cca    1795Gly Ile Glu Thr Ile Glu Ala Ile Arg Glu Leu Lys Lys Leu Tyr Pro550                 555                 560                 565gaa atc cac acc acc ctg ggt ctg tcc aat att tcc ttc ggc ctg aac    1843Glu Ile His Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile Ser Phe Gly Leu Asn
            570                 575                 580cct gct gca cgc cag gtt ctt aac tct gtg ttc ctc aat gag tgc att    1891Pro Ala Ala Arg Gln Val Leu Asn Ser Val Phe Leu Asn Glu Cys Ile
        585                 590                 595gag gct ggt ctg gac tct gcg att gcg cac agc tcc aag att ttg ccg    1939Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Ala His Ser Ser Lys Ile Leu Pro
    600                 605                 610atg aac cgc att gat gat cgc cag cgc gaa gtg gcg ttg gat atg gtc    1987Met Asn Arg Ile Asp Asp Arg Gln Arg Glu Val Ala Leu Asp Met Val
615                 620                 625tat gat cgc cgc acc gag gat tac gat ccg ctg cag gaa ttc atg cag    2035Tyr Asp Arg Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Pro Leu Gln Glu Phe Met Gln630                 635                 640                 645ctg ttt gag ggc gtt tct gct gcc gat gcc aag gat gct cgc gct gaa    2083Leu Phe Glu Gly Val Ser Ala Ala Asp Ala Lys Asp Ala Arg Ala Glu
            650                 655                 660cag ctg gcc gct atg cct ttg ttt gag cgt ttg gca cag cgc atc atc    2131Gln Leu Ala Ala Met Pro Leu Phe Glu Arg Leu Ala Gln Arg Ile Ile
        665                 670                 675gac ggc gat aag aat ggc ctt gag gat gat ctg gaa gca ggc atg aag    2179Asp Gly Asp Lys Asn Gly Leu Glu Asp Asp Leu Glu Ala Gly Met Lys
    680                 685                 690gag aag tct cct att gcg atc atc aac gag gac ctt ctc aac ggc atg    2227Glu Lys Ser Pro Ile Ala Ile Ile Asn Glu Asp Leu Leu Asn Gly Met
695                 700                 705aag acc gtg ggt gag ctg ttt ggt tcc gga cag atg cag ctg cca ttc    2275Lys Thr Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln Met Gln Leu Pro Phe710                 715                 720                 725gtg ctg caa tcg gca gaa acc atg aaa act gcg gtg gcc tat ttg gaa    2323Val Leu Gln Ser Ala Glu Thr Met Lys Thr Ala Val Ala Tyr Leu Glu
            730                 735                 740ccg ttc atg gaa gag gaa gca gaa gct acc gga tct gcg cag gca gag    2371Pro Phe Met Glu Glu Glu Ala Glu Ala Thr Gly Ser Ala Gln Ala Glu
        745                 750                 755ggc aag ggc aaa atc gtc gtg gcc acc gtc aag ggt gac gtg cac gat    2419Gly Lys Gly Lys Ile Val Val Ala Thr Val Lys Gly Asp Val His Asp
    760                 765                 770atc ggc aag aac ttg gtg gac atc att ttg tcc aac aac ggt tac gac    2467Ile Gly Lys Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser Asn Asn Gly Tyr Asp
775                 780                 785gtg gtg aac ttg ggc atc aag cag cca ctg tcc gcc atg ttg gaa gca    2515Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Gln Pro Leu Ser Ala Met Leu Glu Ala790                 795                 800                 805gcg gaa gaa cac aaa gca gac gtc atc ggc atg tcg gga ctt ctt gtg    2563Ala Glu Glu His Lys Ala Asp Val Ile Gly Met Ser Gly Leu Leu Val
            810                 815                 820aag tcc acc gtg gtg atg aag gaa aac ctt gag gag atk aac aac gcc    2611Lys Ser Thr Val Val Met Lys Glu Asn Leu Glu Glu Xaa Asn Asn Ala
        825                 830                 835ggc gca tcc aat tac cca gtc att ttg ggt ggc gct gcg ctg acg cgt    2659Gly Ala Ser Asn Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly Ala Ala Leu Thr Arg
    840                 845                 850acc tac gtg gaa aac gat ctc aac gag gtg tac acc ggt gag gtg tac    2707Thr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Asn Glu Val Tyr Thr Gly Glu Val Tyr
855                 860                 865tac gcc cgt gat gct ttc gag ggc ctg cgc ctg atg gat gag gtg atg    2755Tyr Ala Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu Met Asp Glu Val Met870                 875                 880                 885gca gaa aag cgt ggt gaa gga ctt gat ccc aac tca cca gaa gct att    2803Ala Glu Lys Arg Gly Glu Gly Leu Asp Pro Asn Ser Pro Glu Ala Ile
            890                 895                 900gag cag gcg aag aag aag gcg gaa cgt aag gct cgt aat gag cgt tcc    2851Glu Gln Ala Lys Lys Lys Ala Glu Arg Lys Ala Arg Asn Glu Arg Ser
        905                 910                 915cgc aag att gcc gcg gag cgt aaa gct aat gcg gct ccc gtg att gtt    2899Arg Lys Ile Ala Ala Glu Arg Lys Ala Asn Ala Ala Pro Val Ile Val
    920                 925                 930ccg gag cgt tct gat gtc tcc acc gat act cca acc gcg gca cca ccg    2947Pro Glu Arg Ser Asp Val Ser Thr Asp Thr Pro Thr Ala Ala Pro Pro
935                 940                 945ttc tgg gga acc cgc att gtc aag ggt ctg ccc ttg gcg gag ttc ttg    2995Phe Trp Gly Thr Arg Ile Val Lys Gly Leu Pro Leu Ala Glu Phe Leu950                 955                 960                 965ggc aac ctt gat gag cgc gcc ttg ttc atg ggg cag tgg ggt ctg aaa    3043Gly Asn Leu Asp Glu Arg Ala Leu Phe Met Gly Gln Trp Gly Leu Lys
            970                 975                 980tcc acc cgc ggc aac gag ggt cca agc tat gag gat ttg gtg gaa act    3091Ser Thr Arg Gly Asn Glu Gly Pro Ser Tyr Glu Asp Leu Val Glu Thr
        985                 990                 995gaa ggc cga cca cgc ctg cgc tac tgg ctg gat cgc ctg aag tct gag    3139Glu Gly Arg Pro Arg Leu Arg Tyr Trp Leu Asp Arg Leu Lys Ser Glu
   1000                1005                1010ggc att ttg gac cac gtg gcc ttg gtg tat ggc tac ttc cca gcg gtc    3187Gly Ile Leu Asp His Val Ala Leu Val Tyr Gly Tyr Phe Pro Ala Val1015                1020                1025gcg gaa ggc gat gac gtg gtg atc ttg gaa tcc ccg gat cca cac gca    3235Ala Glu Gly Asp Asp Val Val Ile Leu Glu Ser Pro Asp Pro His Ala1030               1035                1040                1045gcc gaa cgc atg cgc ttt agc ttc cca cgc cag cag cgc ggc agg ttc    3283Ala Glu Arg Met Arg Phe Ser Phe Pro Arg Gln Gln Arg Gly Arg Phe
           1050                1055                1060ttg tgc atc gcg gat ttc att cgc cca cgc gag caa gct gtc aag gac    3331Leu Cys Ile Ala Asp Phe Ile Arg Pro Arg Glu Gln Ala Val Lys Asp
       1065                1070                1075ggc caa gtg gac gtc atg cca ttc cag ctg gtc acc atg ggt aat cct    3379Gly Gln Val Asp Val Met Pro Phe Gln Leu Val Thr Met Gly Asn Pro
   1080                1085                1090att gct gat ttc gcc aac gag ttg ttc gca gcc aat gaa tac cgc gag    3427Ile Ala Asp Phe Ala Asn Glu Leu Phe Ala Ala Asn Glu Tyr Arg Glu1095                1100                1105tac ttg gaa gtt cac ggc atc ggc gtg cag ctc acc gaa gca ttg gcc    3475Tyr Leu Glu Val His Gly Ile Gly Val Gln Leu Thr Glu Ala Leu Ala1110               1115                1120                1125gag tac tgg cac tcc cga gtg cgc agc gaa ctc aag ctg aac gac ggt    3523Glu Tyr Trp His Ser Arg Val Arg Ser Glu Leu Lys Leu Asn Asp Gly
           1130                1135                1140gga tct gtc gct gat ttt gat cca gaa gac aag acc aag ttc ttc gac    3571Gly Ser Val Ala Asp Phe Asp Pro Glu Asp Lys Thr Lys Phe Phe Asp
       1145                1150                1155ctg gat tac cgc ggc gcc cgc ttc tcc ttt ggt tac ggt tct tgc cct    3619Leu Asp Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Phe Gly Tyr Gly Ser Cys Pro
   1160                1165                1170gat ctg gaa gac cgc gca aag ctg gtg gaa ttg ctc gag cca ggc cgt    3667Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys Leu Val Glu Leu Leu Glu Pro Gly Arg1175                1180                1185atc ggc gtg gag ttg tcc gag gaa ctc cag ctg cac cca gag cag tcc    3715Ile Gly Val Glu Leu Ser Glu Glu Leu Gln Leu His Pro Glu Gln Ser1190               1195                1200                1205aca gac gcg ttt gtg ctc tac cac cca gag gca aag tac ttt aac gtc    3763Thr Asp Ala Phe Val Leu Tyr His Pro Glu Ala Lys Tyr Phe Asn Val
           1210                1215                1220taacaccttt  gagagggaaa  actttcccgc                             3793<210>2<211>1221<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>2Met Ser Thr Ser Val Thr Ser Pro Ala His Asn Asn Ala His Ser Ser1               5                  10                  15Glu Phe Leu Asp Ala Leu Ala Asn His Val Leu Ile Gly Asp Gly Ala
         20                  25                  30Met Gly Thr Gln Leu Gln Gly Phe Asp Leu Asp Val Glu Lys Asp Phe
     35                  40                  45Leu Asp Leu Glu Gly Cys Asn Glu Ile Leu Asn Asp Thr Arg Pro Asp
 50                  55                  60Val Leu Arg Gln Ile His Arg Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Leu65                  70                  75                  80Val Glu Thr Asn Thr Phe Gly Cys Asn Leu Pro Asn Leu Ala Asp Tyr
             85                  90                  95Asp Ile Ala Asp Arg Cys Arg Glu Leu Ala Tyr Lys Gly Thr Ala Val
        100                 105                 110Ala Arg Glu Val Ala Asp Glu Met Gly Pro Gly Arg Asn Gly Met Arg
    115                 120                 125Arg Phe Val Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Thr Lys Leu Pro Ser Leu
130                 135                 140Gly His Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Arg Gly His Tyr Lys Glu Ala Ala145                 150                 155                 160Leu Gly Ile Ile Asp Gly Gly Gly Asp Ala Phe Leu Ile Glu Thr Ala
            165                 170                 175Gln Asp Leu Leu Gln Val Lys Ala Ala Val His Gly Val Gln Asp Ala
        180                 185                 190Met Ala Glu Leu Asp Thr Phe Leu Pro Ile Ile Cys His Val Thr Val
    195                 200                 205Glu Thr Thr Gly Thr Met Leu Met Gly Ser Glu Ile Gly Ala Ala Leu
210                 215                 220Thr Ala Leu Gln Pro Leu Gly Ile Asp Met Ile Gly Leu Asn Cys Ala225                 230                 235                 240Thr Gly Pro Asp Glu Met Ser Glu His Leu Arg Tyr Leu Ser Lys His
            245                 250                 255Ala Asp Ile Pro Val Ser Val Met Pro Asn Ala Gly Leu Pro Val Leu
        260                 265                 270Gly Lys Asn Gly Ala Glu Tyr Pro Leu Glu Ala Glu Asp Leu Ala Gln
    275                 280                 285Ala Leu Ala Gly Phe Val Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Met Val Gly Gly
290                 295                 300Cys Cys Gly Thr Thr Pro Glu His Ile Arg Ala Val Arg Asp Ala Val305                 310                 315                 320Val Gly Val Pro Glu Gln Glu Thr Ser Thr Leu Thr Lys Ile Pro Ala
            325                 330                 335Gly Pro Val Glu Gln Ala Ser Arg Glu Val Glu Lys Glu Asp Ser Val
        340                 345                 350Ala Ser Leu Tyr Thr Ser Val Pro Leu Ser Gln Glu Thr Gly Ile Ser
    355                 360                 365Met Ile Gly Glu Arg Thr Asn Ser Asn Gly Ser Lys Ala Phe Arg Glu
370                 375                 380Ala Met Leu Ser Gly Asp Trp Glu Lys Cys Val Asp Ile Ala Lys Gln385                 390                 395                 400Gln Thr Arg Asp Gly Ala His Met Leu Asp Leu Cys Val Asp Tyr Val
            405                 410                 415Gly Arg Asp Gly Thr Ala Asp Met Ala Thr Leu Ala Ala Leu Leu Ala
        420                 425                 430Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ile Met Ile Asp Ser Thr Glu Pro Glu Val
    435                 440                 445Ile Arg Thr Gly Leu Glu His Leu Gly Gly Arg Ser Ile Val Asn Ser
450                 455                 460Val Asn Phe Glu Asp Gly Asp Gly Pro Glu Ser Arg Tyr Gln Arg Ile465                 470                 475                 480Met Lys Leu Val Lys Gln His Gly Ala Ala Val Val Ala Leu Thr Ile
            485                 490                 495Asp Glu Glu Gly Gln Ala Arg Thr Ala Glu His Lys Val Arg Ile Ala
        500                 505                 510Lys Arg Leu Ile Asp Asp Ile Thr Gly Ser Tyr Gly Leu Asp Ile Lys
    515                 520                 525Asp Ile Val Val Asp Cys Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr Gly Gln Glu
530                 535                 540Glu Thr Arg Arg Asp Gly Ile Glu Thr Ile Glu Ala Ile Arg Glu Leu545                 550                 555                 560Lys Lys Leu Tyr Pro Glu Ile His Thr Thr Leu Gly Leu Ser Asn Ile
            565                 570                 575Ser Phe Gly Leu Asn Pro Ala Ala Arg Gln Val Leu Asn Ser Val Phe
        580                 585                 590Leu Asn Glu Cys Ile Glu Ala Gly Leu Asp Ser Ala Ile Ala His Ser
    595                 600                 605Ser Lys Ile Leu Pro Met Asn Arg Ile Asp Asp Arg Gln Arg Glu Val
610                 615                 620Ala Leu Asp Met Val Tyr Asp Arg Arg Thr Glu Asp Tyr Asp Pro Leu625                 630                 635                 640Gln Glu Phe Met Gln Leu Phe Glu Gly Val Ser Ala Ala Asp Ala Lys
            645                 650                 655Asp Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Met Pro Leu Phe Glu Arg Leu
        660                 665                 670Ala Gln Arg Ile Ile Asp Gly Asp Lys Asn Gly Leu Glu Asp Asp Leu
    675                 680                 685Glu Ala Gly Met Lys Glu Lys Ser Pro Ile Ala Ile Ile Asn Glu Asp
690                 695                 700Leu Leu Asn Gly Met Lys Thr Val Gly Glu Leu Phe Gly Ser Gly Gln705                 710                 715                 720Met Gln Leu Pro Phe Val Leu Gln Ser Ala Glu Thr Met Lys Thr Ala
            725                 730                 735Val Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Met Glu Glu Glu Ala Glu Ala Thr Gly
        740                 745                 750Ser Ala Gln Ala Glu Gly Lys Gly Lys Ile Val Val Ala Thr Val Lys
    755                 760                 765Gly Asp Val His Asp Ile Gly Lys Asn Leu Val Asp Ile Ile Leu Ser
770                 775                 780Asn Asn Gly Tyr Asp Val Val Asn Leu Gly Ile Lys Gln Pro Leu Ser785                 790                 795                 800Ala Met Leu Glu Ala Ala Glu Glu His Lys Ala Asp Val Ile Gly Met
            805                 810                 815Ser Gly Leu Leu Val Lys Ser Thr Val Val Met Lys Glu Asn Leu Glu
        820                 825                 830Glu Xaa Asn Asn Ala Gly Ala Ser Asn Tyr Pro Val Ile Leu Gly Gly
    835                 840                 845Ala Ala Leu Thr Arg Thr Tyr Val Glu Asn Asp Leu Asn Glu Val Tyr
850                 855                 860Thr Gly Glu Val Tyr Tyr Ala Arg Asp Ala Phe Glu Gly Leu Arg Leu865                 870                 875                 880Met Asp Glu Val Met Ala Glu Lys Arg Gly Glu Gly Leu Asp Pro Asn
            885                 890                 895Ser Pro Glu Ala Ile Glu Gln Ala Lys Lys Lys Ala Glu Arg Lys Ala
        900                 905                 910Arg Asn Glu Arg Ser Arg Lys Ile Ala Ala Glu Arg Lys Ala Asn Ala
    915                 920                 925Ala Pro Val Ile Val Pro Glu Arg Ser Asp Val Ser Thr Asp Thr Pro
930                 935                 940Thr Ala Ala Pro Pro Phe Trp Gly Thr Arg Ile Val Lys Gly Leu Pro945                 950                 955                 960Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asn Leu Asp Glu Arg Ala Leu Phe Met Gly
            965                 970                 975Gln Trp Gly Leu Lys Ser Thr Arg Gly Asn Glu Gly Pro Ser Tyr Glu
        980                 985                 990Asp Leu Val Glu Thr Glu Gly Arg Pro Arg Leu Arg Tyr Trp Leu Asp
    995                1000                1005Arg Leu Lys Ser Glu Gly Ile Leu Asp His Val Ala Leu Val Tyr Gly1010                1015                1020Tyr Phe Pro Ala Val Ala Glu Gly Asp Asp Val Val Ile Leu Glu Ser025                1030                1035                1040Pro Asp Pro His Ala Ala Glu Arg Met Arg Phe Ser Phe Pro Arg Gln
           1045                1050                1055Gln Arg Gly Arg Phe Leu Cys Ile Ala Asp Phe Ile Arg Pro Arg Glu
       1060                1065                1070Gln Ala Val Lys Asp Gly Gln Val Asp Val Met Pro Phe Gln Leu Val
   1075                1080                1085Thr Met Gly Asn Pro Ile Ala Asp Phe Ala Asn Glu Leu Phe Ala Ala1090                1095                1100Asn Glu Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Val His Gly Ile Gly Val Gln Leu105                1110                1115                1120Thr Glu Ala Leu Ala Glu Tyr Trp His Ser Arg Val Arg Ser Glu Leu
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       1140                1145                1150Thr Lys Phe Phe Asp Leu Asp Tyr Arg Gly Ala Arg Phe Ser Phe Gly
   1155                1160                1165Tyr Gly Ser Cys Pro Asp Leu Glu Asp Arg Ala Lys Leu Val Glu Leu1170                1175                1180Leu Glu Pro Gly Arg Ile Gly Val Glu Leu Ser Glu Glu Leu Gln Leu185                1190                1195                1200His Pro Glu Gln Ser Thr Asp Ala Phe Val Leu Tyr His Pro Glu Ala
           1205                1210                1215Lys Tyr Phe Asn Val
       1220<210>3<211>1981<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1951)<400>3tcaatattcc gaagaaaacc gcgcagctct ctcactagtc tcaggtgagg  cgaaagtggt  60gaaagacccg ctacgcatgg tgcgcctggc tttttagaat gtg ctg caa acc tcc     115
                                        Val Leu Gln Thr Ser
                                          1               5tgg cat ttc tct atc ctg gca ggc atg act gat acc tct ccg ttg aat     163Trp His Phe Ser Ile Leu Ala Gly Met Thr Asp Thr Ser Pro Leu Asn
             10                  15                  20tct cag ccg agt gca gat cac cac cct gat cac gcg gct cgc cca gtt     211Ser Gln Pro Ser Ala Asp His His Pro Asp His Ala Ala Arg Pro Val
         25                  30                  35ctt gat gcc cac ggc ttg atc gtt gag cac gaa tcg gaa gag ttt cca     259Leu Asp Ala His Gly Leu Ile Val Glu His Glu Ser Glu Glu Phe Pro
     40                  45                  50gtc ccc gca ccc gct ccc ggt gaa cag ccc tgg gag aag aaa aac cgc     307Val Pro Ala Pro Ala Pro Gly Glu Gln Pro Trp Glu Lys Lys Asn Arg
 55                  60                  65gag tgg tac aaa gac gcc gtt ttc tac gaa gtg ctg gtt cgt gcc ttc     355Glu Trp Tyr Lys Asp Ala Val Phe Tyr Glu Val Leu Val Arg Ala Phe70                  75                  80                  85tac gat cca gaa ggc aac gga gtc gga tcg ttg aaa ggc ctg acc gaa     403Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Gly Val Gly Ser Leu Lys Gly Leu Thr Glu
             90                  95                     100aaa ctg gat tac atc cag tgg ctc ggc gtg gat tgc att tgg atc cca     451Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Trp Leu Gly Val Asp Cys Ile Trp Ile Pro
        105                 110                     115ccg ttt tat gat tcc cca ctg cgc gac ggc ggt tac gat atc cgc aac    499Pro Phe Tyr Asp Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly Tyr Asp Ile Arg Asn
    120                 125                 130ttc cgt gaa atc ctg ccc gaa ttc ggc acc gtc gat gac ttc gtg gaa    547Phe Arg Glu Ile Leu Pro Glu Phe Gly Thr Val Asp Asp Phe Val Glu
135                 140                 145ctc gtt gac cac gcc cac cgc cgt ggc ctg cgt gtt atc acc gac ttg    595Leu Val Asp His Ala His Arg Arg Gly Leu Arg Val Ile Thr Asp Leu150                 155                 160                 165gtc atg aat cac acc tcc gac cag cac gca tgg ttc caa gaa tcc cgg    643Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Ala Trp Phe Gln Glu Ser Arg
            170                 175                     180cgc gac cca acc ggc ccc tac gga gat ttc tat gtg tgg agc gat gat    691Arg Asp Pro Thr Gly Pro Tyr Gly Asp Phe Tyr Val Trp Ser Asp Asp
        185                 190                     195ccc acc ctg tac aac gaa gcc cgc atc atc ttt gta gat aca gaa gaa    739Pro Thr Leu Tyr Asn Glu Ala Arg Ile Ile Phe Val Asp Thr Glu Glu
    200                 205                     210tcc aac tgg acc tat gat ccg gtg cgt ggc cag tac ttc tgg cac cgc    787Ser Asn Trp Thr Tyr Asp Pro Val Arg Gly Gln Tyr Phe Trp His Arg
215                 220                     225ttc ttc tcc cac caa cca gac ctc aac tac gac aac ccc gca gtc caa    835Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Asp Asn Pro Ala Val Gln230                 235                     240             245gag gcc atg cta gat gtc ttg cgt ttc tgg ctg gac ctg gga ctt gat    883Glu Ala Met Leu Asp Val Leu Arg Phe Trp Leu Asp Leu Gly Leu Asp
            250                     255             260ggt ttc cga cta gat gcc gtt cct tat ctt ttt gaa cgc gaa ggc acc    931Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Phe Glu Arg Glu Gly Thr
        265                     270             275aac ggc gaa aac ctc aaa gaa acc cac gat ttc ctc aaa ctg tgt cgc    979Asn Gly Glu Asn Leu Lys Glu Thr His Asp Phe Leu Lys Leu Cys Arg
    280                     285             290tct gtc att gag aag gaa tac ccc ggc cga atc ctg ctc gca gaa gcc    1027Ser Val Ile Glu Lys Glu Tyr Pro Gly Arg Ile Leu Leu Ala Glu Ala
295                     300             305aac caa tgg ccc caa gat gtg gtc gaa tac ttc ggt gaa aaa gac aaa    1075Asn Gln Trp Pro Gln Asp Val Val Glu Tyr Phe Gly Glu Lys Asp Lys310                 315                 320                 325ggc gat gaa tgc cac atg gcc ttc cac ttc cct ttg atg ccg cgc atc    1123Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe Pro Leu Met Pro Arg Ile
            330                 335                 340ttc atg gga gtt cgc caa ggt tca cgc acc ccg atc agt gag atc ctg    1171Phe Met Gly Val Arg Gln Gly Ser Arg Thr Pro Ile Ser Glu Ile Leu
        345                 350                 355gcc aac acc ccg gag att ccc aag act gcc caa tgg ggt att ttc ctg    1219Ala Asn Thr Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ala Gln Trp Gly Ile Phe Leu
    360                 365                 370cgt aat cat gat gag ctc acc ctt gaa atg gtc tcc gat gag gaa cgc    1267Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val Ser Asp Glu Glu Arg
375                 380                 385agc tac atg tac tcc caa ttc gcc tcc gaa cct cgc atg cgc gcc aac    1315Ser Tyr Met Tyr Ser Gln Phe Ala Ser Glu Pro Arg Met Arg Ala Asn390                 395                 400                 405gta gga atc cgc agg cgc ctt tcc cca ctg ctt gaa ggc gac cgc aac    1363Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asp Arg Asn
            410                 415                 420cag ctg gaa ctc ctt cac ggt ttg ttg ctg tct cta cct ggc tca ccc    1411Gln Leu Glu Leu Leu His Gly Leu Leu Leu Ser Leu Pro Gly Ser Pro
        425                 430                 435gtg ttg tat tac ggt gat gaa att ggc atg ggc gac aat atc tgg ctc    1459Val Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly Asp Asn Ile Trp Leu
    440                 445                 450cac gac cgc gac gga gtg cgc acc ccc atg cag tgg tcc aac gac cgc    1507His Asp Arg Asp Gly Val Arg Thr Pro Met Gln Trp Ser Asn Asp Arg
455                 460                 465aac ggt ggt ttc tcc aaa gct gat cct gaa cgc ctg tac ctt cca gcg    1555Asn Gly Gly Phe Ser Lys Ala Asp Pro Glu Arg Leu Tyr Leu Pro Ala470                 475                 480                 485atc caa aat gat caa tac ggc tac gcc caa gta aac gtg gaa agc caa    1603Ile Gln Asn Asp Gln Tyr Gly Tyr Ala Gln Val Asn Val Glu Ser Gln
            490                 495                 500ctc aac cgc gaa aac tcc ctg ctg cgc tgg ctc cga aac caa atc ctt    1651Leu Asn Arg Glu Asn Ser Leu Leu Arg Trp Leu Arg Asn Gln Ile Leu
        505                 510                 515atc cgc aag cag tac cgc gca ttt ggt gcc gga acc tac cgt gaa gtg    1699Ile Arg Lys Gln Tyr Arg Ala Phe Gly Ala Gly Thr Tyr Arg Glu Val
    520                 525                 530tcc tcc acc aat gag tca gtg ttg aca ttt tta cga gaa cac aag ggc    1747Ser Ser Thr Asn Glu Ser Val Leu Thr Phe Leu Arg Glu His Lys Gly
535                 540                 545caa acc att ttg tgt gtc aac aac atg agc aaa tat cct cag gca gtc    1795Gln Thr Ile Leu Cys Val Asn Asn Met Ser Lys Tyr Pro Gln Ala Val550                 555                 560                 565tcg ctt gat ttg cgt gaa ttt gca gga cac acc cct cga gag atg tcg    1843Ser Leu Asp Leu Arg Glu Phe Ala Gly His Thr Pro Arg Glu Met Ser
            570                 575                 580ggc ggg cag ctg ttc cct acc att gct gaa cgg gag tgg att gtc act    1891Gly Gly Gln Leu Phe Pro Thr Ile Ala Glu Arg Glu Trp Ile Val Thr
        585                 590                 595tta gcc cct cac gga ttc ttc tgg ttt gat ctc acc gcc gat gaa aag    1939Leu Ala Pro His Gly Phe Phe Trp Phe Asp Leu Thr Ala Asp Glu Lys
    600                 605                 610gac gat atg gaa tgagcattgg ccaacacatc  atcaccgagc                  1981Asp Asp Met Glu
615<210>4<211>617<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>4Val Leu Gln Thr Ser Trp His Phe Ser Ile Leu Ala Gly Met Thr Asp1               5                  10                  15Thr Ser Pro Leu Asn Ser Gln Pro Ser Ala Asp His His Pro Asp His
         20                  25                  30Ala Ala Arg Pro Val Leu Asp Ala His Gly Leu Ile Val Glu His Glu
     35                  40                  45Ser Glu Glu Phe Pro Val Pro Ala Pro Ala Pro Gly Glu Gln Pro Trp
 50                  55                  60Glu Lys Lys Asn Arg Glu Trp Tyr Lys Asp Ala Val Phe Tyr Glu Val65                  70                  75                  80Leu Val Arg Ala Phe Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Gly Val Gly Ser Leu
             85                  90                  95Lys Gly Leu Thr Glu Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Trp Leu Gly Val Asp
        100                 105                 110Cys Ile Trp Ile Pro Pro Phe Tyr Asp Ser Pro Leu Arg Asp Gly Gly
    115                 120                 125Tyr Asp Ile Arg Asn Phe Arg Glu Ile Leu Pro Glu Phe Gly Thr Val
130                 135                 140Asp Asp Phe Val Glu Leu Val Asp His Ala His Arg Arg Gly Leu Arg145                 150                 155                 160Val Ile Thr Asp Leu Val Met Asn His Thr Ser Asp Gln His Ala Trp
            165                 170                 175Phe Gln Glu Ser Arg Arg Asp Pro Thr Gly Pro Tyr Gly Asp Phe Tyr
        180                 185                 190Val Trp Ser Asp Asp Pro Thr Leu Tyr Asn Glu Ala Arg Ile Ile Phe
    195                 200                 205Val Asp Thr Glu Glu Ser Asn Trp Thr Tyr Asp Pro Val Arg Gly Gln210                  215                 220Tyr Phe Trp His Arg Phe Phe Ser His Gln Pro Asp Leu Asn Tyr Asp225                 230                 235                 240Asn Pro Ala Val Gln Glu Ala Met Leu Asp Val Leu Arg Phe Trp Leu
            245                 250                 255Asp Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro Tyr Leu Phe
        260                 265                 270Glu Arg Glu Gly Thr Asn Gly Glu Asn Leu Lys Glu Thr His Asp Phe
    275                 280                 285Leu Lys Leu Cys Arg Ser Val Ile Glu Lys Glu Tyr Pro Gly Arg Ile
290                 295                 300Leu Leu Ala Glu Ala Asn Gln Trp Pro Gln Asp Val Val Glu Tyr Phe305                 310                 315                 320Gly Glu Lys Asp Lys Gly Asp Glu Cys His Met Ala Phe His Phe Pro
            325                 330                 335Leu Met Pro Arg Ile Phe Met Gly Val Arg Gln Gly Ser Arg Thr Pro
        340                 345                 350Ile Ser Glu Ile Leu Ala Asn Thr Pro Glu Ile Pro Lys Thr Ala Gln
    355                 360                 365Trp Gly Ile Phe Leu Arg Asn His Asp Glu Leu Thr Leu Glu Met Val
370                 375                 380Ser Asp Glu Glu Arg Ser Tyr Met Tyr Ser Gln Phe Ala Ser Glu Pro385                 390                 395                 400Arg Met Arg Ala Asn Val Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ser Pro Leu Leu
            405                 410                 415Glu Gly Asp Arg Asn Gln Leu Glu Leu Leu His Gly Leu Leu Leu Ser
        420                 425                 430Leu Pro Gly Ser Pro Val Leu Tyr Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Met Gly
    435                 440                 445Asp Asn Ile Trp Leu His Asp Arg Asp Gly Val Arg Thr Pro Met Gln
450                 455                 460Trp Ser Asn Asp Arg Asn Gly Gly Phe Ser Lys Ala Asp Pro Glu Arg465                 470                 475                 480Leu Tyr Leu Pro Ala Ile Gln Asn Asp Gln Tyr Gly Tyr Ala Gln Val
            485                 490                 495Asn Val Glu Ser Gln Leu Asn Arg Glu Asn Ser Leu Leu Arg Trp Leu
        500                 505                 510Arg Asn Gln Ile Leu Ile Arg Lys Gln Tyr Arg Ala Phe Gly Ala Gly
    515                 520                 525Thr Tyr Arg Glu Val Ser Ser Thr Asn Glu Ser Val Leu Thr Phe Leu
530                 535                 540Arg Glu His Lys Gly Gln Thr Ile Leu Cys Val Asn Asn Met Ser Lys545                 550                 555                 560Tyr Pro Gln Ala Val Ser Leu Asp Leu Arg Glu Phe Ala Gly His Thr
            565                 570                 575Pro Arg Glu Met Ser Gly Gly Gln Leu Phe Pro Thr Ile Ala Glu Arg
        580                 585                 590Glu Trp Ile Val Thr Leu Ala Pro His Gly Phe Phe Trp Phe Asp Leu
    595                 600                 605Thr Ala Asp Glu Lys Asp Asp Met Glu
610                 615<210>5<211>1840<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(363)..(1676)<400>5cagaaactgt gtgcagaaat gcatgcagaa aaaggaaagt tcgggccaag atgggtgttt 60ctgtatgccg atgatcggat ctttgacagc tgggtatgcg acaaatcacc gagagttgtt 120aattcttaac aatggaaaag taacattgag agatgattta taccatcctg caccatttag 180agtggggcta gtcatacccc cataacccta gctgtacgca atcgatttca aatcagttgg 240aaaaagtcaa gaaaattacc cgagaattaa tttataccac acagtctatt gcaatagacc 300aagctgttca gtagggtgca tgggagaaga atttcctaat aaaaactctt aaggacctcc 360aa atg cca aag tac gac aat tcc aat gct gac cag tgg ggc ttt gaa    407Met Pro Lys Tyr Asp Asn Ser Asn Ala Asp Gln Trp Gly Phe Glu
 1               5                  10                  15acc cgc tcc att cac gca ggc cag tca gta gac gca cag acc agc gca   455Thr Arg Ser Ile His Ala Gly Gln Ser Val Asp Ala Gln Thr Ser Ala
            20                   25                  30cga aac ctt ccg atc tac caa tcc acc gct ttc gtg ttc gac tcc gct   503Arg Asn Leu Pro Ile Tyr Gln Ser Thr Ala Phe Val Phe Asp Ser Ala
         35                  40                  45gag cac gcc aag cag cgt ttc gca ctt gag gat cta ggc cct gtt tac   551Glu His Ala Lys Gln Arg Phe Ala Leu Glu Asp Leu Gly Pro Val Tyr
     50                  55                  60tcc cgc ctc acc aac cca acc gtt gag gct ttg gaa aac cgc atc gct   599Ser Arg Leu Thr Asn Pro Thr Val Glu Ala Leu Glu Asn Arg Ile Ala
 65                  70                  75tcc ctc gaa ggt ggc gtc cac gct gta gcg ttc tcc tcc gga cag gcc   647Ser Leu Glu Gly Gly Val His Ala Val Ala Phe Ser Ser Gly Gln Ala80                  85                  90                  95gca acc acc aac gcc att ttg aac ctg gca gga gcg ggc gac cac atc   695Ala Thr Thr Asn Ala Ile Leu Asn Leu Ala Gly Ala Gly Asp His Ile
            100                 105                 110gtc acc tcc cca cgc ctc tac ggt ggc acc gag act cta ttc ctt atc   743Val Thr Ser Pro Arg Leu Tyr Gly Gly Thr Glu Thr Leu Phe Leu Ile
        115                 120                 125act ctt aac cgc ctg ggt atc gat gtt tcc ttc gtg gaa aac ccc gac   791Thr Leu Asn Arg Leu Gly Ile Asp Val Ser Phe Val Glu Asn Pro Asp
    130                 135                 140gac cct gag tcc tgg cag gca gcc gtt cag cca aac acc aaa gca ttc   839Asp Pro Glu Ser Trp Gln Ala Ala Val Gln Pro Asn Thr Lys Ala Phe
145                 150                 155ttc ggc gag act ttc gcc aac cca cag gca gac gtc ctg gat att cct   887Phe Gly Glu Thr Phe Ala Asn Pro Gln Ala Asp Val Leu Asp Ile Pro160                 165                 170                 175gcg gtg gct gaa gtt gcg cac cgc aac agc gtt cca ctg atc atc gac   935Ala Val Ala Glu Val Ala His Arg Asn Ser Val Pro Leu Ile Ile Asp
            180                 185                     190aac acc atc gct acc gca gcg ctc gtg cgc ccg ctc gag ctc ggc gca   983Asn Thr Ile Ala Thr Ala Ala Leu Val Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala
        195                 200                     205gac gtt gtc gtc gct tcc ctc acc aag ttc tac acc ggc aac ggc tcc   1031Asp Val Val Val Ala Ser Leu Thr Lys Phe Tyr Thr Gly Asn Gly Ser
    210                 215                 220gga ctg ggc ggc gtg ctt atc gac ggc gga aag ttc gat tgg act gtc   1079Gly Leu Gly Gly Val Leu Ile Asp Gly Gly Lys Phe Asp Trp Thr Val
225                 230                 235gaa aag gat gga aag cca gta ttc ccc tac ttc gtc act cca gat gct   1127Glu Lys Asp Gly Lys Pro Val Phe Pro Tyr Phe Val Thr Pro Asp Ala240                 245                 250                 255gct tac cac gga ttg aag tac gca gac ctt ggt gca cca gcc ttc ggc   1175Ala Tyr His Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Pro Ala Phe Gly
            260                 265                 270ctc aag gtt cgc gtt ggc ctt cta cgc gac acc ggc tcc acc ctc tcc   1223Leu Lys Val Arg Val Gly Leu Leu Arg Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser
        275                 280                 285gca ttc aac gca tgg gct gca gtc cag ggc atc gac acc ctt tcc ctg   1271Ala Phe Asn Ala Trp Ala Ala Val Gln Gly Ile Asp Thr Leu Ser Leu
    290                 295                 300cgc ctg gag cgc cac aac gaa aac gcc atc aag gtt gca gaa ttc ctc   1319Arg Leu Glu Arg His Asn Glu Asn Ala Ile Lys Val Ala Glu Phe Leu
305                 310                 315aac aac cac gag aag gtg gaa aag gtt aac ttc gca ggc ctg aag gat   1367Asn Asn His Glu Lys Val Glu Lys Val Asn Phe Ala Gly Leu Lys Asp320                 325                 330                 335tcc cct tgg tac gca acc aag gaa aag ctt ggc ctg aag tac acc ggc   1415Ser Pro Trp Tyr Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Thr Gly
            340                 345                 350tcc gtt ctc acc ttc gag atc aag ggc ggc aag gat gag gct tgg gca   1463Ser Val Leu Thr Phe Glu Ile Lys Gly Gly Lys Asp Glu Ala Trp Ala
        355                 360                 365ttt atc gac gcc ctg aag cta cac tcc aac ctt gca aac atc ggc gat   1511Phe Ile Asp Ala Leu Lys Leu His Ser Asn Leu Ala Asn Ile Gly Asp
    370                 375                 380gtt cgc tcc ctc gtt gtt cac cca gca acc acc acc cat tca cag tcc   1559Val Arg Ser Leu Val Val His Pro Ala Thr Thr Thr His Ser Gln Ser
385                 390                 395gac gaa gct ggc ctg gca cgc gcg ggc gtt acc cag tcc acc gtc cgc   1607Asp Glu Ala Gly Leu Ala Arg Ala Gly Val Thr Gln Ser Thr Val Arg400                 405                 410                 415ctg tcc gtt ggc atc gag acc att gat gat atc atc gct gac ctc gaa   1655Leu Ser Val Gly Ile Glu Thr Ile Asp Asp Ile Ile Ala Asp Leu Glu
            420                 425                 430ggc ggc ttt gct gca atc tag ctttaaatag actcacccca gtgcttaaag         1706Gly Gly Phe Ala Ala Ile
        435cgctgggttt ttctttttca gactcgtgag aatgcaaact agactagaca gagctgtcca    1766tatacactgg acgaagtttt agtcttgtcc acccagaaca ggcggttatt ttcatgccca    1826ccctcgcgcc ttca                                                      1840<210>6<211>437<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>6Met Pro Lys Tyr Asp Asn Ser Asn Ala Asp Gln Trp Gly Phe Glu Thr1               5                  10                  15Arg Ser Ile His Ala Gly Gln Ser Val Asp Ala Gln Thr Ser Ala Arg
         20                  25                  30Asn Leu Pro Ile Tyr Gln Ser Thr Ala Phe Val Phe Asp Ser Ala Glu
     35                  40                  45His Ala Lys Gln Arg Phe Ala Leu Glu Asp Leu Gly Pro Val Tyr Ser
 50                  55                  60Arg Leu Thr Asn Pro Thr Val Glu Ala Leu Glu Asn Arg Ile Ala Ser65                  70                  75                  80Leu Glu Gly Gly Val His Ala Val Ala Phe Ser Ser Gly Gln Ala Ala
             85                  90                  95Thr Thr Asn Ala Ile Leu Asn Leu Ala Gly Ala Gly Asp His Ile Val
        100                 105                 110Thr Ser Pro Arg Leu Tyr Gly Gly Thr Glu Thr Leu Phe Leu Ile Thr
    115                 120                 125Leu Asn Arg Leu Gly Ile Asp Val Ser Phe Val Glu Asn Pro Asp Asp
130                 135                 140Pro Glu Ser Trp Gln Ala Ala Val Gln Pro Asn Thr Lys Ala Phe Phe145                 150                 155                 160Gly Glu Thr Phe Ala Asn Pro Gln Ala Asp Val Leu Asp Ile Pro Ala
            165                 170                 175Val Ala Glu Val Ala His Arg Asn Ser Val Pro Leu Ile Ile Asp Asn
        180                 185                 190Thr Ile Ala Thr Ala Ala Leu Val Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp
    195                 200                 205Val Val Val Ala Ser Leu Thr Lys Phe Tyr Thr Gly Asn Gly Ser Gly
210                 215                 220Leu Gly Gly Val Leu Ile Asp Gly Gly Lys Phe Asp Trp Thr Val Glu225                 230                 235                 240Lys Asp Gly Lys Pro Val Phe Pro Tyr Phe Val Thr Pro Asp Ala Ala
            245                 250                 255Tyr His Gly Leu Lys Tyr Ala Asp Leu Gly Ala Pro Ala Phe Gly Leu
        260                 265                 270Lys Val Arg Val Gly Leu Leu Arg Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser Ala
    275                 280                 285Phe Asn Ala Trp Ala Ala Val Gln Gly Ile Asp Thr Leu Ser Leu Arg
290                 295                 300Leu Glu Arg His Asn Glu Asn Ala Ile Lys Val Ala Glu Phe Leu Asn305                 310                 315                 320Asn His Glu Lys Val Glu Lys Val Asn Phe Ala Gly Leu Lys Asp Ser
            325                 330                 335Pro Trp Tyr Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gly Leu Lys Tyr Thr Gly Ser
        340                 345                 350Val Leu Thr Phe Glu Ile Lys Gly Gly Lys Asp Glu Ala Trp Ala Phe
    355                 360                 365Ile Asp Ala Leu Lys Leu His Ser Asn Leu Ala Asn Ile Gly Asp Val
370                 375                 380Arg Ser Leu Val Val His Pro Ala Thr Thr Thr His Ser Gln Ser Asp385                 390                 395                 400Glu Ala Gly Leu Ala Arg Ala Gly Val Thr Gln Ser Thr Val Arg Leu
            405                 410                 415Ser Val Gly Ile Glu Thr Ile Asp Asp Ile Ile Ala Asp Leu Glu Gly
        420                 425                 430Gly Phe Ala Ala Ile
    435<210>7<211>1033<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1006)<400>7gtgcggatcg ggtatccgcg ctacacttag aggtgttaga gatcatgagt ttccacgaac  60tgtaacgcag gattcaccaa tcaatgaaag gtcgaccgac atg agc act gaa gac    115
                                        Met Ser Thr Glu Asp
                                          1               5att gtc gtc gta gca gta gat ggc tcg gac gcc tca aaa caa gct gtt    163Ile Val Val Val Ala Val Asp Gly Ser Asp Ala Ser Lys Gln Ala Val
             10                  15                  20cgg tgg gct gca aat acc gcc aac aaa cgt ggc att cca ctt cgc ttg    211Arg Trp Ala Ala Asn Thr Ala Asn Lys Arg Gly Ile Pro Leu Arg Leu
         25                  30                  35gct tcc agc tac acc atg cct cag ttc ctc tac gca gag gga atg gtt    259Ala Ser Ser Tyr Thr Met Pro Gln Phe Leu Tyr Ala Glu Gly Met Val
     40                  45                  50cca cca caa gag ctt ttc gat gac ctc cag gcc gaa gcc ctg gaa aag    307Pro Pro Gln Glu Leu Phe Asp Asp Leu Gln Ala Glu Ala Leu Glu Lys
 55                  60                  65att aac gaa gcc cgt gac atc gcc cat gag gta gcg cca gaa atc aag    355Ile Asn Glu Ala Arg Asp Ile Ala His Glu Val Ala Pro Glu Ile Lys70                  75                  80                  85atc ggg cac acc atc gct gaa ggc agt ccc atc gac atg ctg ttg gaa    403Ile Gly His Thr Ile Ala Glu Gly Ser Pro Ile Asp Met Leu Leu Glu
             90                  95                 100atg tct ccc gat gcc aca atg atc gtc atg ggt tcc cgc gga ctc ggc    451Met Ser Pro Asp Ala Thr Met Ile Val Met Gly Ser Arg Gly Leu Gly
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135                 140                 145gaa gac agc aag tac ggc cca gtc gtc gtc ggt gtg gat ggc tcc gaa    595Glu Asp Ser Lys Tyr Gly Pro Val Val Val Gly Val Asp Gly Ser Glu150                 155                 160                 165gtc tcc caa cag gca acc gaa tac gca ttt gcg gaa gct gaa gct cgt    643Val Ser Gln Gln Ala Thr Glu Tyr Ala Phe Ala Glu Ala Glu Ala Arg
            170                 175                 180ggc gcc gaa ctc gtt gca gtt cac acc tgg atg gac atg cag gta cag    691Gly Ala Glu Leu Val Ala Val His Thr Trp Met Asp Met Gln Val Gln
        185                 190                 195gca tca ctt gca ggt ctt gca gct gct caa cag cag tgg gat gaa gtg    739Ala Ser Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln Gln Gln Trp Asp Glu Val
    200                 205                 210gaa cgt cag caa acc gac atg ctg atc gaa cgc ctc gca cca ctg gtg    787Glu Arg Gln Gln Thr Asp Met Leu Ile Glu Arg Leu Ala Pro Leu Val
215                 220                 225gaa aag tac cca agt gta acc gtc aag aag atc atc acc cgt gac cgc    835Glu Lys Tyr Pro Ser Val Thr Val Lys Lys Ile Ile Thr Arg Asp Arg230                 235                 240                 245cca gtt cgc gca ctt gca gaa gca tct gaa aac gcg cag ctc cta gtc    883Pro Val Arg Ala Leu Ala Glu Ala Ser Glu Asn Ala Gln Leu Leu Val
            250                 255                 260gtt ggt tcc cat ggt cgt ggc gga ttt aag ggc atg ctc ctt ggc tcc    931Val Gly Ser His Gly Arg Gly Gly Phe Lys Gly Met Leu Leu Gly Ser
        265                 270                 275acc tcc cgc gca ctg ctg caa tcc gca ccg tgc cca atg atg gtg gtt    979Thr Ser Arg Ala Leu Leu Gln Ser Ala Pro Cys Pro Met Met Val Val
    280                 285                 290cgc cca cct gag aag att aag aag tag tttcttttaa gtttcgatgc cccggtt  1033Arg Pro Pro Glu Lys Ile Lys Lys
295                 300<210>8<211>301<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>8Met Ser Thr Glu Asp Ile Val Val Val Ala Val Asp Gly Ser Asp Ala1               5                  10                  15Ser Lys Gln Ala Val Arg Trp Ala Ala Asn Thr Ala Asn Lys Arg Gly
         20                  25                  30Ile Pro Leu Arg Leu Ala Ser Ser Tyr Thr Met Pro Gln Phe Leu Tyr
     35                  40                  45Ala Glu Gly Met Val Pro Pro Gln Glu Leu Phe Asp Asp Leu Gln Ala
 50                  55                 60Glu Ala Leu Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Asp Ile Ala His Glu Val65                  70                  75                  80Ala Pro Glu Ile Lys Ile Gly His Thr Ile Ala Glu Gly Ser Pro Ile
             85                  90                  95Asp Met Leu Leu Glu Met Ser Pro Asp Ala Thr Met Ile Val Met Gly
        100                 105                 110Ser Arg Gly Leu Gly Gly Leu Ser Gly Met Val Met Gly Ser Val Ser
    115                 120                 125Gly Ala Val Val Ser His Ala Lys Cys Pro Val Val Val Val Arg Glu
130                 135                 140Asp Ser Ala Val Asn Glu Asp Ser Lys Tyr Gly Pro Val Val Val Gly145                 150                 155                 160Val Asp Gly Ser Glu Val Ser Gln Gln Ala Thr Glu Tyr Ala Phe Ala
            165                 170                 175Glu Ala Glu Ala Arg Gly Ala Glu Leu Val Ala Val His Thr Trp Met
        180                 185                 190Asp Met Gln Val Gln Ala Ser Leu Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln Gln
    195                 200                 205Gln Trp Asp Glu Val Glu Arg Gln Gln Thr Asp Met Leu Ile Glu Arg
210                 215                 220Leu Ala Pro Leu Val Glu Lys Tyr Pro Ser Val Thr Val Lys Lys Ile225                 230                 235                 240Ile Thr Arg Asp Arg Pro Val Arg Ala Leu Ala Glu Ala Ser Glu Asn
            245                 250                 255Ala Gln Leu Leu Val Val Gly Ser His Gly Arg Gly Gly Phe Lys Gly
        260                 265                 270Met Leu Leu Gly Ser Thr Ser Arg Ala Leu Leu Gln Ser Ala Pro Cys
    275                 280                 285Pro Met Met Val Val Arg Pro Pro Glu Lys Ile Lys Lys
290                 295                 300<210>9<211>1527<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1504)<223>RXS00315<400>9ctcatggcat ctgcgccgtt cgcgttcttg ccagtgttgg ttggtttcac cgcaaccaag  60cgtttcggcg gcaatgagtt cctgggcgcc gcgtattggt atg gcg atg gtg ttc    115
                                        Met Ala Met Val Phe
                                          1               5ccg agc ttg gtg aac ggc tac gac gtg gcc gcc acc atg gct gcg ggc    163Pro Ser Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala Ala Thr Met Ala Ala Gly
             10                  15                  20gaa atg cca atg tgg tcc ctg ttt ggt tta gat gtt gcc caa gcc ggt    211Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu Asp Val Ala Gln Ala Gly
         25                  30                  35tac cag ggc acc gtg ctt cct gtg ctg gtg gtt tct tgg att ctg gca    259Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val Val Ser Trp Ile Leu Ala
     40                  45                  50acg atc gag aag ttc ctg cac aag cga ctc aag ggc act gca gac ttc    307Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu Lys Gly Thr Ala Asp Phe
 55                  60                  65ctg atc act cca gtg ctg acg ttg ctg ctc acc gga ttc ctt aca ttc    355Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu Thr Gly Phe Leu Thr Phe70                  75                  80                  85atc gcc att ggc cca gca atg cgc tgg gtg ggc gat gtg ctg gca cac    403Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val Gly Asp Val Leu Ala His
             90                  95                 100ggt cta cag gga ctt tat gat ttc ggt ggt cca gtc ggc ggt ctg ctc    451Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly Pro Val Gly Gly Leu Leu
        105                 110                 115ttc ggt ctg gtc tac tca cca atc gtc atc act ggt ctg cac cag tcc    499Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile Thr Gly Leu His Gln Ser
    120                 125                 130ttc ccg cca att gag ctg gag ctg ttt aac cag ggt gga tcc ttc atc    547Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn Gln Gly Gly Ser Phe Ile
135                 140                 145ttc gca acg gca tct atg gct aat atc gcc cag ggt gcg gca tgt ttg    595Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala Gln Gly Ala Ala Cys Leu150                 155                 160                 165gca gtg ttc ttc ctg gcg aag agt gaa aag ctc aag ggc ctt gca ggt    643Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys Leu Lys Gly Leu Ala Gly
            170                 175                 180gct tca ggt gtc tcc gct gtt ctt ggt att acg gag cct gcg atc ttc    691Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile Thr Glu Pro Ala Ile Phe
        185                 190                 195ggt gtg aac ctt cgc ctg cgc tgg ccg ttc ttc atc ggt atc ggt acc    739Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe Phe Ile Gly Ile Gly Thr
    200                 205                 210gca gct atc ggt ggc gct ttg att gca ctc ttt aat atc aag gca gtt    787Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu Phe Asn Ile Lys Ala Val
215                 220                 225gcg ttg ggc gct gca ggt ttc ttg ggt gtt gtt tct att gat gct cca    835Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val Val Ser Ile Asp Ala Pro230                 235                 240                 245gat atg gtc atg ttc ttg gtg tgt gca gtt gtt acc ttc ttc atc gca    883Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val Val Thr Phe Phe Ile Ala
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        265                 270                 275agc att gat cca gat gca acc gct gct cca gtg cct gca gga acg acc    979Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro Val Pro Ala Gly Thr Thr
    280                 285                 290aaa gcc gaa gca gaa gca ccc gca gaa ttt tca aac gat tcc acc atc    1027Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe Ser Asn Asp Ser Thr Ile
295                 300                 305atc cag gca cct ttg acc ggt gaa gct att gca ctg agc agc gtc agc    1075Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile Ala Leu Ser Ser Val Ser310                 315                 320                 325gat gcc atg ttt gcc agc gga aag ctt ggc tcg ggc gtt gcc atc gtc    1123Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly Ser Gly Val Ala Ile Val
            330                 335                 340cca acc aag ggg cag tta gtt tct ccg gtg agt gga aag att gtg gtg    1171Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val Ser Gly Lys Ile Val Val
        345                 350                 355gca ttc cca tct ggc cat gct ttc gca gtt cgc acc aag gct gag gat    1219Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val Arg Thr Lys Ala Glu Asp
    360                 365                 370ggt tcc aat gtg gat atc ttg atg cac att ggt ttc gac aca gta aac    1267Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile Gly Phe Asp Thr Val Asn
375                 380                 385ctc aac ggc acg cac ttt aac ccg ctg aag aag cag ggc gat gaa gtc    1315Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys Lys Gln Gly Asp Glu Val390                 395                 400                 405aaa gca ggg gag ctg ctg tgt gaa ttc gat att gat gcc att aag gct    1363Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp Ile Asp Ala Ile Lys Ala
            410                 415                 420gca ggt tat gag gta acc acg ccg att gtt gtt tcg aat tac aag aaa    1411Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val Val Ser Asn Tyr Lys Lys
        425                 430                 435acc gga cct gta aac act tac ggt ttg ggc gaa att gaa gcg gga gcc    1459Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly Glu Ile Glu Ala Gly Ala
    440                 445                 450aac ctg ctc aac gtc gca aag aaa gaa gcg gtg cca gca aca cca        1504Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala Val Pro Ala Thr Pro
455                 460                 465taagttgaaa ccttgagtgt tcg                                          1527<210>10<211>468<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>10Met Ala Met Val Phe Pro Ser Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala Ala1                   5                  10                  15Thr Met Ala Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu Asp
         20                  25                  30Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val Val
     35                  40                  45Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu Lys
 50                  55                  60Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu Thr65                  70                  75                  80Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val Gly
             85                  90                  95Asp Val Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly Pro
        100                 105                 110Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile Thr
    115                 120                 125Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn Gln
130                 135                 140Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala Gln145                 150                 155                 160Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys Leu
            165                 170                 175Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile Thr
        180                 185                 190Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe Phe
    195                 200                 205Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu Phe
210                 215                 220Asn Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val Val225                 230                 235                 240Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val Val
            245                 250                 255Thr Phe Phe Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr Leu
        260                 265                 270Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro Val
    275                 280                 285Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe Ser
290                 295                 300Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile Ala305                 310                 315                 320Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly Ser
            325                 330                 335Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val Ser
        340                 345                 350Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val Arg
    355                 360                 365Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile Gly
370                 375                 380Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys Lys385                 390                 395                 400Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp Ile
            405                 410                 415Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val Val
        420                 425                 430Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly Glu
    435                 440                 445Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala Val
450                 455                 460Pro Ala Thr Pro465<210>11<211>2187<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(2164)<223>RXN01299<400>11cgactgcggc gtctcttcct ggcactacca ttcctcgtcc tgaccaactc gccacagctg  60gtgcaacggt cacccaagtc aaaggattga aagaatcagc atg aat agc gta aat    115
                                        Met Asn Ser Val Asn
                                          1               5aat tcc tcg ctt gtc cgg ctg gat gtc gat ttc ggc gac tcc acc acg    163Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe Gly Asp Ser Thr Thr
             10                  15                  20gat gtc atc aac aac ctt gcc act gtt att ttc gac gct ggc cga gct    211Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe Asp Ala Gly Arg Ala
         25                  30                 35tcc tcc gcc gac gcc ctt gcc aaa gac gcg ctg gat cgt gaa gca aag    259Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu Asp Arg Glu Ala Lys
     40                  45                  50tcc ggc acc ggc gtt cct ggt caa gtt gct atc ccc cac tgc cgt tcc    307Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile Pro His Cys Arg Ser
 55                  60                  65gaa gcc gta tct gtc cct acc ttg ggc ttt gct cgc ctg agc aag ggt    355Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala Arg Leu Ser Lys Gly70                  75                  80                  85gtg gac ttc agc gga cct gat ggc gat gcc aac ttg gtg ttc ctc att    403Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn Leu Val Phe Leu Ile
             90                  95                 100gca gca cct gct ggc ggc ggc aaa gag cac ctg aag atc ctg tcc aag    451Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu Lys Ile Leu Ser Lys
        105                 110                 115ctt gct cgc tcc ttg gtg aag aag gat ttc atc aag gct ctg cag gaa    499Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile Lys Ala Leu Gln Glu
    120                 125                 130gcc acc acc gag cag gaa atc gtc gac gtt gtc gat gcc gtg ctc aac    547Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val Asp Ala Val Leu Asn
135                 140                 145cca gca cca aaa acc acc gag cca gct gca gct ccg gct gcg gcg gcg    595Pro Ala Pro Lys Thr Thr Glu Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala150                 155                 160                 165gtt gct gag agt ggg gcg gcg tcg aca agc gtt act cgt atc gtg gca    643Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val Thr Arg Ile Val Ala
            170                 175                 180atc acc gca tgc cca acc ggt atc gca cac acc tac atg gct gcg gat    691Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr Tyr Met Ala Ala Asp
        185                 190                 195tcc ctg acg caa aac gcg gaa ggc cgc gat gat gtg gaa ctc gtt gtg    739Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp Val Glu Leu Val Val
    200                 205                 210gag act cag ggc tct tcc gct gtc acc cca gtc gat ccg aag atc atc    787Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val Asp Pro Lys Ile Ile
215                 220                 225gaa gct gcc gac gcc gtc atc ttc gcc acc gac gtg gga gtt aaa gac    835Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp Val Gly Val Lys Asp230                 235                 240                 245cgc gag cgt ttc gct ggc aag cca gtc att gaa tcc ggc gtc aag cgc    883Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu Ser Gly Val Lys Arg
            250                 255                 260gcg atc aat gag cca gcc aag atg atc gac gag gcc atc gca gcc tcc    931Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu Ala Ile Ala Ala Ser
        265                 270                 275aag aac cca aac gcc cgc aag gtt tcc ggt tcc ggt gtc gcg gca tct    979Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser Gly Val Ala Ala Ser
    280                 285                 290gct gaa acc acc ggc gag aag ctc ggc tgg ggc aag cgc atc cag cag    1027Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly Lys Arg Ile Gln Gln
295                 300                305gca gtc atg acc ggc gtg tcc tac atg gtt cca ttc gta gct gcc ggc    1075Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro Phe Val Ala Ala Gly310                 315                 320                 325ggc ctc ctg ttg gct ctc ggc ttc gca ttc ggt gga tac gac atg gcg    1123Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly Gly Tyr Asp Met Ala
            330                 335                 340aac ggc tgg caa gca atc gcc acc cag ttc tct ctg acc aac ctg cca    1171Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser Leu Thr Asn Leu Pro
        345                 350                 355ggc aac acc gtc gat gtt gac ggc gtg gcc atg acc ttc gag cgt tca    1219Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met Thr Phe Glu Arg Ser
    360                 365                 370ggc ttc ctg ttg tac ttc ggc gca gtc ctg ttc gcc acc ggc caa gca    1267Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe Ala Thr Gly Gln Ala
375                 380                 385gcc atg ggc ttc atc gtg gca gcc ctg tct ggc tac acc gca tac gca    1315Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Thr Ala Tyr Ala390                 395                 400                 405ctt gct gga cgc cca ggc atc gcg ccg ggc ttc gtc ggt ggc gcc atc    1363Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe Val Gly Gly Ala Ile
            410                 415                 420tcc gtc acc atc ggc gct ggc ttc att ggt ggt ctg gtt acc ggt atc    1411Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly Leu Val Thr Gly Ile
        425                 430                 435ttg gct ggt ctc att gcc ctg tgg att ggc tcc tgg aag gtg cca cgc    1459Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser Trp Lys Val Pro Arg
    440                 445                 450gtg gtg cag tca ctg atg cct gtg gtc atc atc ccg cta ctt acc tca    1507Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile Pro Leu Leu Thr Ser
455                 460                 465gtg gtt gtt ggt ctc gtc atg tac ctc ctg ctg ggt cgc cca ctc gca    1555Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Pro Leu Ala470                 475                 480                 485tcc atc atg act ggt ttg cag gac tgg cta tcg tca atg tcc gga agc    1603Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser Ser Met Ser Gly Ser
            490                 495                 500tcc gcc atc ttg ctg ggt atc atc ttg ggc ctc atg atg tgt ttc gac    1651Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu Met Met Cys Phe Asp
        505                 510                 515ctc ggc gga cca gta aac aag gca gcc tac ctc ttt ggt acc gca ggc    1699Leu Gly Gly Pro Val Asn Lys Ala Ala Tyr Leu Phe Gly Thr Ala Gly
    520                 525                 530ctg tct acc ggc gac caa gct tcc atg gaa atc atg gcc gcg atc atg    1747Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ser Met Glu Ile Met Ala Ala Ile Met
535                 540                 545gca gct ggc atg gtc cca cca atc gcg ttg tcc att gct acc ctg ctg    1795Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile Ala Leu Ser Ile Ala Thr Leu Leu550                 555                 560                 565cgc aag aag ctg ttc acc cca gca gag caa gaa aac ggc aag tct tcc    1843Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu Asn Gly Lys Ser Ser
            570                 575                 580tgg ctg ctt ggc ctg gca ttc gtc tcc gaa ggt gcc atc cca ttc gcc    1891Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly Ala Ile Pro Phe Ala
        585                 590                 595gca gct gac cca ttc cgt gtg atc cca gca atg atg gct ggc ggt gca    1939Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met Met Ala Gly Gly Ala
    600                 605                 610acc act ggt gca atc tcc atg gca ctg ggc gtc ggc tct cgg gct cca    1987Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val Gly Ser Arg Ala Pro
615                 620                 625cac ggc ggt atc ttc gtg gtc tgg gca atc gaa cca tgg tgg ggc tgg    2035His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu Pro Trp Trp Gly Trp630                 635                 640                 645ctc atc gca ctt gca gca ggc acc atc gtg tcc acc atc gtt gtc atc    2083Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser Thr Ile Val Val Ile
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        665                 670                 675aag caa gaa gca caa caa gca gct gta aac gca taatcggacc ttgacccgat  2184Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala
680                 685gtc                                                                2187<210>12<211>688<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>12Met Asn Ser Val Asn Asn Ser Ser Leu Val Arg Leu Asp Val Asp Phe1               5                  10                  15Gly Asp Ser Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Leu Ala Thr Val Ile Phe
         20                  25                  30Asp Ala Gly Arg Ala Ser Ser Ala Asp Ala Leu Ala Lys Asp Ala Leu
     35                  40                  45Asp Arg Glu Ala Lys Ser Gly Thr Gly Val Pro Gly Gln Val Ala Ile
 50                  55                  60Pro His Cys Arg Ser Glu Ala Val Ser Val Pro Thr Leu Gly Phe Ala65                  70                  75                  80Arg Leu Ser Lys Gly Val Asp Phe Ser Gly Pro Asp Gly Asp Ala Asn
             85                  90                  95Leu Val Phe Leu Ile Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Lys Glu His Leu
        100                 105                 110Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ala Arg Ser Leu Val Lys Lys Asp Phe Ile
    115                 120                 125Lys Ala Leu Gln Glu Ala Thr Thr Glu Gln Glu Ile Val Asp Val Val
130                 135                 140Asp Ala Val Leu Asn Pro Ala Pro Lys Thr Thr Glu Pro Ala Ala Ala145                 150                 155                160Pro Ala Ala Ala Ala Val Ala Glu Ser Gly Ala Ala Ser Thr Ser Val
            165                 170                 175Thr Arg Ile Val Ala Ile Thr Ala Cys Pro Thr Gly Ile Ala His Thr
        180                 185                 190Tyr Met Ala Ala Asp Ser Leu Thr Gln Asn Ala Glu Gly Arg Asp Asp
    195                 200                 205Val Glu Leu Val Val Glu Thr Gln Gly Ser Ser Ala Val Thr Pro Val
210                 215                 220Asp Pro Lys Ile Ile Glu Ala Ala Asp Ala Val Ile Phe Ala Thr Asp225                 230                 235                 240Val Gly Val Lys Asp Arg Glu Arg Phe Ala Gly Lys Pro Val Ile Glu
            245                 250                 255Ser Gly Val Lys Arg Ala Ile Asn Glu Pro Ala Lys Met Ile Asp Glu
        260                 265                 270Ala Ile Ala Ala Ser Lys Asn Pro Asn Ala Arg Lys Val Ser Gly Ser
    275                 280                 285Gly Val Ala Ala Ser Ala Glu Thr Thr Gly Glu Lys Leu Gly Trp Gly
290                 295                 300Lys Arg Ile Gln Gln Ala Val Met Thr Gly Val Ser Tyr Met Val Pro305                 310                 315                 320Phe Val Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Ala Leu Gly Phe Ala Phe Gly
            325                 330                 335Gly Tyr Asp Met Ala Asn Gly Trp Gln Ala Ile Ala Thr Gln Phe Ser
        340                 345                 350Leu Thr Asn Leu Pro Gly Asn Thr Val Asp Val Asp Gly Val Ala Met
    355                 360                 365Thr Phe Glu Arg Ser Gly Phe Leu Leu Tyr Phe Gly Ala Val Leu Phe
370                 375                 380Ala Thr Gly Gln Ala Ala Met Gly Phe Ile Val Ala Ala Leu Ser Gly385                 390                 395                 400Tyr Thr Ala Tyr Ala Leu Ala Gly Arg Pro Gly Ile Ala Pro Gly Phe
            405                 410                 415Val Gly Gly Ala Ile Ser Val Thr Ile Gly Ala Gly Phe Ile Gly Gly
        420                 425                 430Leu Val Thr Gly Ile Leu Ala Gly Leu Ile Ala Leu Trp Ile Gly Ser
    435                 440                 445Trp Lys Val Pro Arg Val Val Gln Ser Leu Met Pro Val Val Ile Ile
450                 455                 460Pro Leu Leu Thr Ser Val Val Val Gly Leu Val Met Tyr Leu Leu Leu465                 470                 475                 480Gly Arg Pro Leu Ala Ser Ile Met Thr Gly Leu Gln Asp Trp Leu Ser
            485                 490                 495Ser Met Ser Gly Ser Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Ile Leu Gly Leu
        500                 505                 510Met Met Cys Phe Asp Leu Gly Gly Pro Val Asn Lys Ala Ala Tyr Leu
    515                 520                 525Phe Gly Thr Ala Gly Leu Ser Thr Gly Asp Gln Ala Ser Met Glu Ile
530                 535                 540Met Ala Ala Ile Met Ala Ala Gly Met Val Pro Pro Ile Ala Leu Ser545                 550                 555                 560Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu
            565                 570                 575Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly
        580                 585                 590Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met
    595                 600                 605Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val
610                 615                 620Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu625                 630                 635                 640Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser
            645                 650                 655Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val
        660                 665                 670Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Glu Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala
    675                 680                 685<210>13<211>416<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(393)<223>RXA00951<400>13atc caa gca atc tta gag aag gca gca gcg ccg gcg aag cag aag gct    48Ile Gln Ala Ile Leu Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Lys Ala1               5                  10                  15cct gct gtg gct cct gct gta aca ccc act gac gct cct gca gcc tca    96Pro Ala Val Ala Pro Ala Val Thr Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Ser
         20                  25                  30gtc caa tcc aaa acc cac gac aag atc ctc acc gtc tgt ggc aac ggc    144Val Gln Ser Lys Thr His Asp Lys Ile Leu Thr Val Cys Gly Asn Gly
     35                  40                  45ttg ggt acc tcc ctc ttc ctc aaa aac acc ctt gag caa gtt ttc gac    192Leu Gly Thr Ser Leu Phe Leu Lys Asn Thr Leu Glu Gln Val Phe Asp
 50                  55                  60acc tgg ggt tgg ggt cca tac atg acg gtg gag gca acc gac act atc    240Thr Trp Gly Trp Gly Pro Tyr Met Thr Val Glu Ala Thr Asp Thr Ile65                  70                  75                  80tcc gcc aag ggc aaa gcc aag gaa gct gat ctc atc atg acc tct ggt    288Ser Ala Lys Gly Lys Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile Met Thr Ser Gly
             85                  90                  95gaa atc gcc cgc acg ttg ggt gat gtt gga atc ccg gtt cac gtg atc    336Glu Ile Ala Arg Thr Leu Gly Asp Val Gly Ile Pro Val His Val Ile
        100                 105                 110aat gac ttc acg agc acc gat gaa atc gat gct gcg ctt cgt gaa cgc    384Asn Asp Phe Thr Ser Thr Asp Glu Ile Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg
    115                 120                 125tac gac atc taactacttt aaaaggacga aaa                              416Tyr Asp Ile
130<210>14<211>131<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>14Ile Gln Ala Ile Leu Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Lys Ala1               5                  10                  15Pro Ala Val Ala Pro Ala Val Thr Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Ser
         20                  25                  30Val Gln Ser Lys Thr His Asp Lys Ile Leu Thr Val Cys Gly Asn Gly
     35                  40                  45Leu Gly Thr Ser Leu Phe Leu Lys Asn Thr Leu Glu Gln Val Phe Asp
 50                  55                  60Thr Trp Gly Trp Gly Pro Tyr Met Thr Val Glu Ala Thr Asp Thr Ile65                  70                  75                  80Ser Ala Lys Gly Lys Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile Met Thr Ser Gly
             85                  90                  95Glu Ile Ala Arg Thr Leu Gly Asp Val Gly Ile Pro Val His Val Ile
        100                 105                 110Asn Asp Phe Thr Ser Thr Asp Glu Ile Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg
    115                 120                 125Tyr Asp Ile
130<210>15<211>1827<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1804)<223>RXN01244<400>15gatatgtgtt tgtttgtcaa tatccaaatg tttgaatagt tgcacaactg ttggttttgt  60ggtgatcttg aggaaattaa ctcaatgatt gtgaggatgg gtg gct act gtg gct    115
                                        Val Ala Thr Val Ala
                                          1               5gat gtg aat caa gac act gta ctg aag ggc acc ggc gtt gtc ggt gga    163Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr Gly Val Val Gly Gly
             10                  15                  20gtc cgt tat gca agc gcg gtg tgg att acc cca cgc ccc gaa cta ccc    211Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro Arg Pro Glu Leu Pro
         25                  30                  35caa gca ggc gaa gtc gtc gcc gaa gaa aac cgt gaa gca gag cag gag    259Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg Glu Ala Glu Gln Glu
     40                  45                  50cgt ttc gac gcc gct gca gcc aca gtc tct tct cgt ttg ctt gag cgc    307Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser Arg Leu Leu Glu Arg
 55                  60                  65tcc gaa gct gct gaa gga cca gca gct gag gtg ctt aaa gct act gct    355Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val Leu Lys Ala Thr Ala70                 75                  80                  85ggc atg gtc aat gac cgt ggc tgg cgt aag gct gtc atc aag ggt gtc    403Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala Val Ile Lys Gly Val
             90                  95                 100aag ggt ggt cac cct gcg gaa tac gcc gtg gtt gca gca aca acc aag    451Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val Ala Ala Thr Thr Lys
        105                 110                 115ttc atc tcc atg ttc gaa gcc gca ggc ggc ctg atc gcg gag cgc acc    499Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu Ile Ala Glu Arg Thr
    120                 125                 130aca gac ttg cgc gac atc cgc gac cgc gtc atc gca gaa ctt cgt ggc    547Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile Ala Glu Leu Arg Gly
135                 140                 145gat gaa gag cca ggt ctg cca gct gtt tcc gga cag gtc att ctc ttt    595Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly Gln Val Ile Leu Phe150                 155                 160                 165gca gat gac ctc tcc cca gca gac acc gcg gca cta gac aca gat ctc    643Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala Leu Asp Thr Asp Leu
            170                 175                 180ttt gtg gga ctt gtc act gag ctg ggt ggc cca acg agc cac acc gcg    691Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro Thr Ser His Thr Ala
        185                 190                 195atc atc gca cgc cag ctc aac gtg cct tgc atc gtc gca tcc ggc gcc    739Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile Val Ala Ser Gly Ala
    200                 205                 210ggc atc aag gac atc aag tcc ggc gaa aag gtg ctt atc gac ggc agc    787Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val Leu Ile Asp Gly Ser
215                 220                 225ctc ggc acc att gac cgc aac gcg gac gaa gct gaa gca acc aag ctc    835Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala Glu Ala Thr Lys Leu230                 235                 240                 245gtc tcc gag tcc ctc gag cgc gct gct cgc atc gcc gag tgg aag ggt    883Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile Ala Glu Trp Lys Gly
            250                 255                 260cct gca caa acc aag gac ggc tac cgc gtt cag ctg ttg gcc aac gtc    931Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln Leu Leu Ala Asn Val
        265                 270                 275caa gac ggc aac tct gca cag cag gct gca cag acc gaa gca gaa ggc    979Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln Thr Glu Ala Glu Gly
    280                 285                 290atc ggc ctg ttc cgc acc gaa ctg tgc ttc ctt tcc gcc acc gaa gag    1027Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu Ser Ala Thr Glu Glu
295                 300                 305cca agc gtt gat gag cag gct gcg gtc tac tca aag gtg ctt gaa gca    1075Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser Lys Val Leu Glu Ala310                 315                 320                 325ttc cca gag tcc aag gtc gtt gtc cgc tcc ctc gac gca ggt tct gac    1123Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu Asp Ala Gly Ser Asp
            330                 335                 340aag cca gtt cca ttc gca tcg atg gct gat gag atg aac cca gca ctg    1171Lys Pro Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu Met Asn Pro Ala Leu
        345                 350                 355ggt gtt cgt ggc ctg cgt atc gca cgt gga cag gtt gat ctg ctg act    1219Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln Val Asp Leu Leu Thr
    360                 365                 370cgc cag ctc gac gca att gcg aag gcc agc gaa gaa ctc ggc cgt ggc    1267Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu Glu Leu Gly Arg Gly
375                 380                 385gac gac gcc cca acc tgg gtt atg gct cca atg gtg gct acc gct tat    1315Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met Val Ala Thr Ala Tyr390                 395                 400                 405gaa gca aag tgg ttt gct gac atg tgc cgt gag cgt ggc cta atc gcc    1363Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu Arg Gly Leu Ile Ala
            410                 415                 420ggc gcc atg atc gaa gtt cca gca gca tcc ctg atg gca gac aag atc    1411Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu Met Ala Asp Lys Ile
        425                 430                 435atg cct cac ctg gac ttt gtt tcc atc ggt acc aac gac ctg acc cag    1459Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln
    440                 445                 450tac acc atg gca gcg gac cgc atg tct cct gag ctt gcc tac ctg acc    1507Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu Leu Ala Tyr Leu Thr
455                 460                 465gat cct tgg cag cca gca gtc ctg cgc ctg atc aag cac acc tgt gac    1555Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile Lys His Thr Cys Asp470                 475                 480                 485gaa ggt gct cgc ttt aac acc ccg gtc ggt gtt tgt ggt gaa gca gca    1603Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val Cys Gly Glu Ala Ala
            490                 495                 500gca gac cca ctg ttg gca act gtc ctc acc ggt ctt ggc gtg aac tcc    1651Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Asn Ser
        505                 510                 515ctg tcc gca gca tcc act gct ctc gca gca gtc ggt gca aag ctg tca    1699Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val Gly Ala Lys Leu Ser
    520                 525                 530gag gtc acc ctg gaa acc tgt aag aag gca gca gaa gca gca ctt gac    1747Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asp
535                 540                 545gct gaa ggt gca act gaa gca cgc gat gct gta cgc gca gtg atc gac    1795Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val Arg Ala Val Ile Asp550                 555                 560                 565gca gca gtc taaaccactgttgagctaaa aag                               1827Ala Ala Val<210>16<21l>568<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>16Val Ala Thr Val Ala Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr1               5                  10                  15Gly Val Val Gly Gly Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro
         20                  25                  30Arg Pro Glu Leu Pro Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg
     35                  40                  45Glu Ala Glu Gln Glu Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser
 50                  55                  60Arg Leu Leu Glu Arg Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val65                  70                  75                  80Leu Lys Ala Thr Ala Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala
             85                  90                  95Val Ile Lys Gly Val Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val
        100                 105                 110Ala Ala Thr Thr Lys Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu
    115                 120                 125Ile Ala Glu Arg Thr Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile
130                 135                 140Ala Glu Leu Arg Gly Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly145                 150                 155                 160Gln Val Ile Leu Phe Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala
            165                 170                 175Leu Asp Thr Asp Leu Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro
        180                 185                 190Thr Ser His Thr Ala Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile
    195                 200                 205Val Ala Ser Gly Ala Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val
210                 215                 220Leu Ile Asp Gly Ser Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala225                 230                 235                 240Glu Ala Thr Lys Leu Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile
            245                 250                 255Ala Glu Trp Lys Gly Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln
        260                 265                 270Leu Leu Ala Asn Val Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln
    275                 280                 285Thr Glu Ala Glu Gly Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu
290                 295                 300Ser Ala Thr Glu Glu Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser305                 310                 315                 320Lys Val Leu Glu Ala Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu
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        340                 345                 350Met Asn Pro Ala Leu Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln
    355                 360                 365Val Asp Leu Leu Thr Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu
370                 375                 380Glu Leu Gly Arg Gly Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met385                 390                 395                 400Val Ala Thr Ala Tyr Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu
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450                 455                 460Leu Ala Tyr Leu Thr Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile465                 470                 475                 480Lys His Thr Cys Asp Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val
            485                 490                 495Cys Gly Glu Ala Ala Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly
        500                 505                 510Leu Gly Val Asn Ser Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val
    515                 520                 525Gly Ala Lys Leu Ser Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala
530                 535                 540Glu Ala Ala Leu Asp Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val545                 550                 555                 560Arg Ala Val Ile Asp Ala Ala Val
            565<210>17<211>390<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(367)<223>RXA01300<400>17gatcgacatt aaatcccctc ccttgggggg tttaactaac aaatcgctgc gccctaatcc  60gttcggatta acggcgtagc aacacgaaag gacactttcc atg gct tcc aag act    115
                                        Met Ala Ser Lys Thr
                                          1               5gta acc gtc ggt tcc tcc gtt ggc ctg cac gca cgt cca gca tcc atc    163Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala Arg Pro Ala Ser Ile
             10                  15                  20atc gct gaa gcg gct gct gag tac gac gac gaa atc ttg ctg acc ctg    211Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu Ile Leu Leu Thr Leu
         25                  30                  35gtt ggc tcc gat gat gac gaa gag acc gac gcg tcc tct tcc ctc atg    259Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ser Leu Met
     40                  45                  50atc atg gcg ctg ggc gca gag cac ggc aac gaa gtt acc gtc acc tcc    307Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu Val Thr Val Thr Ser
 55                  60                  65gac aac gct gaa gct gtt gag aag atc gct gcg ctt atc gca cag gac    355Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala Leu Ile Ala Gln Asp70                  75                  80                  85ctt gac gct gag taaacaacgc tctgcttgtt aaa                          390Leu Asp Ala Glu<210>18<211>89<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>18Met Ala Ser Lys Thr Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala1               5                  10                  15Arg Pro Ala Ser Ile Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu
         20                  25                  30Ile Leu Leu Thr Leu Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala
     35                  40                  45Ser Ser Ser Leu Met Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu
 50                  55                  60Val Thr Val Thr Ser Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala65                  70                  75                  80Leu Ile Ala Gln Asp Leu Asp Ala Glu
             85<210>19<211>508<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(508)<223>RXN03002<400>19ggaacttcga ggtgtcttcg tggggcgtac ggagatctag caagtgtggc tttatgtttg  60accctatccg aatcaacatg cagtgaatta acatctactt atg ttt gta ctc aaa    115
                                        Met Phe Val Leu Lys
                                          1               5gat ctg cta aag gca gaa cgc ata gaa ctc gac cgc acg gtc acc gat    163Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp Arg Thr Val Thr Asp
             10                  15                  20tgg cgt gaa ggc atc cgc gcc gca ggt gta ctc cta gaa aag aca aac    211Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu Leu Glu Lys Thr Asn
         25                  30                  35agc att gat tcc gcc tac acc gat gcc atg atc gcc agc gtg gaa gaa    259Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile Ala Ser Val Glu Glu
     40                  45                  50aaa ggc ccc tac att gtg gtc gct cca ggt ttc gct ttc gcg cac gcc    307Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe Ala Phe Ala His Ala
 55                  60                  65cgc ccc agc aga gca gtc cgc gag acc gct atg tcg tgg gtg cgc ctg    355Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu70                  75                  80                  85gcc tcc cct gtt tcc ttc ggt cac agt aag aat gat ccc ctc aat ctc    403Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn Asp Pro Leu Asn Leu
             90                  95                 100atc gtt gct ctc gct gcc aaa gat gcc acc gca cat acc caa gcg atg    451Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala His Thr Gln Ala Met
        105                 110                 115gcg gca ttg gct aaa gct tta gga aaa tac cga aag gat ctc gac gag    499Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg Lys Asp Leu Asp Glu
    120                 125                 130gca caa agt                                                        508Ala Gln Ser
135<210>20<211>136<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>20Met Phe Val Leu Lys Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp1               5                  10                  15Arg Thr Val Thr Asp Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu
         20                  25                  30Leu Glu Lys Thr Asn Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile
     35                  40                  45Ala Ser Val Glu Glu Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe
 50                  55                  60Ala Phe Ala His Ala Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met65                  70                  75                  80Ser Trp Val Arg Leu Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn
             85                  90                  95Asp Pro Leu Asn Leu Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala
        100                 105                 110His Thr Gln Ala Met Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg
    115                 120                 125Lys Asp Leu Asp Glu Ala Gln Ser
130                 135<210>21<211>789<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(14)..(766)<223>RXC00953<400>21cttgcattcc ccaatg gcg cca cca acg gta ggc aac tac atc atg cag tcc  52
          Met Ala Pro Pro Thr Val Gly Asn Tyr Ile Met Gln Ser
            1               5                  10ttc act caa ggt ctg cag ttc ggc gtt gca gtt gcc gtg att ctc ttt    100Phe Thr Gln Gly Leu Gln Phe Gly Val Ala Val Ala Val Ile Leu Phe
 15                  20                  25ggt gtc cgc acc att ctt ggt gaa ctg gtc ccc gca ttc caa ggt att    148Gly Val Arg Thr Ile Leu Gly Glu Leu Val Pro Ala Phe Gln Gly Ile30                  35                  40                  45gct gcg aag gtt gtt ccc gga gct atc ccc gca ttg gat gca ccg atc    196Ala Ala Lys Val Val Pro Gly Ala Ile Pro Ala Leu Asp Ala Pro Ile
             50                  55                  60gtg ttc ccc tac gcg cag aac gcc gtt ctc att ggt ttc ttg tct tcc    244Val Phe Pro Tyr Ala Gln Asn Ala Val Leu Ile Gly Phe Leu Ser Ser
         65                  70                  75ttc gtc ggt ggc ttg gtt ggc ctg act gtt ctt gca tcg tgg ctg aac    292Phe Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Ser Trp Leu Asn
    80                  85                  90cca gct ttt ggt gtc gcg ttg att ctg cct ggt ttg gtc ccc cac ttc    340Pro Ala Phe Gly Val Ala Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Pro His Phe
 95                 100                 105ttc act ggt ggc gcg gcg ggc gtt tac ggt aat gcc acg ggt ggt cgt    388Phe Thr Gly Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Asn Ala Thr Gly Gly Arg110                 115                 120                 125cga gga gca gta ttt ggc gcc ttt gcc aac ggt ctt ctg att acc ttc    436Arg Gly Ala Val Phe Gly Ala Phe Ala Asn Gly Leu Leu Ile Thr Phe
            130                 135                 140ctc cct gct ttc ctg ctt ggt gtg ctt ggt tcc ttc ggg tca gag aac    484Leu Pro Ala Phe Leu Leu Gly Val Leu Gly Ser Phe Gly Ser Glu Asn
        145                 150                 155acc act ttc ggt gat gcg gac ttt ggt tgg ttc gga atc gtt gtt ggt    532Thr Thr Phe Gly Asp Ala Asp Phe Gly Trp Phe Gly Ile Val Val Gly
    160                 165                 170tct gca gcc aag gtg gaa ggt gct ggc ggg ctc atc ttg ttg ctc atc    580Ser Ala Ala Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Leu Ile Leu Leu Leu Ile
175                 180                 185atc gca gcg gtt ctt ctg ggt ggc gcg atg gtc ttc cag aag cgc gtc    628Ile Ala Ala Val Leu Leu Gly Gly Ala Met Val Phe Gln Lys Arg Val190                 195                 200                 205gtg aat ggg cac tgg gat cca gct ccc aac cgt gag cgc gtg gag aag    676Val Asn Gly His Trp Asp Pro Ala Pro Asn Arg Glu Arg Val Glu Lys
            210                 215                 220gcg gaa gct gat gcc act cca acg gct ggg gct cgg acc tac cct aag    724Ala Glu Ala Asp Ala Thr Pro Thr Ala Gly Ala Arg Thr Tyr Pro Lys
        225                 230                 235att gct cct ccg gcg ggc gct cct acc cca ccg gct cga agc    766Ile Ala Pro Pro Ala Gly Ala Pro Thr Pro Pro Ala Arg Ser
    240                 245                 250taagatctcc aaaaccctga gat                                          789<210>22<211>251<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>22Met Ala Pro Pro Thr Val Gly Asn Tyr Ile Met Gln Ser Phe Thr Gln1               5                  10                  15Gly Leu Gln Phe Gly Val Ala Val Ala Val Ile Leu Phe Gly Val Arg
         20                  25                  30Thr Ile Leu Gly Glu Leu Val Pro Ala Phe Gln Gly Ile Ala Ala Lys
     35                  40                  45Val Val Pro Gly Ala Ile Pro Ala Leu Asp Ala Pro Ile Val Phe Pro
 50                  55                  60Tyr Ala Gln Asn Ala Val Leu Ile Gly Phe Leu Ser Ser Phe Val Gly65                  70                  75                  80Gly Leu Val Gly Leu Thr Val Leu Ala Ser Trp Leu Asn Pro Ala Phe
             85                  90                  95Gly Val Ala Leu Ile Leu Pro Gly Leu Val Pro His Phe Phe Thr Gly
        100                 105                 110Gly Ala Ala Gly Val Tyr Gly Asn Ala Thr Gly Gly Arg Arg Gly Ala
    115                 120                 125Val Phe Gly Ala Phe Ala Asn Gly Leu Leu Ile Thr Phe Leu Pro Ala
130                 135                 140Phe Leu Leu Gly Val Leu Gly Ser Phe Gly Ser Glu Asn Thr Thr Phe145                 150                 155                 160Gly Asp Ala Asp Phe Gly Trp Phe Gly Ile Val Val Gly Ser Ala Ala
            165                 170                 175Lys Val Glu Gly Ala Gly Gly Leu Ile Leu Leu Leu Ile Ile Ala Ala
        180                 185                 190Val Leu Leu Gly Gly Ala Met Val Phe Gln Lys Arg Val Val Asn Gly
    195                 200                 205His Trp Asp Pro Ala Pro Asn Arg Glu Arg Val Glu Lys Ala Glu Ala
210                 215                 220Asp Ala Thr Pro Thr Ala Gly Ala Arg Thr Tyr Pro Lys Ile Ala Pro225                 230                 235                 240Pro Ala Gly Ala Pro Thr Pro Pro Ala Arg Ser
            245                 250<210>23<211>553<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(553)<223>RXC03001<400>23cccggttcac gtgatcaatg acttcacgag caccgatgaa atcgatgctg cgcttcgtga  60acgctacgac atctaactac tttaaaagga cgaaaatatt atg gac tgg tta acc    115
                                        Met Asp Trp Leu Thr
                                          1               5att cct ctt ttc ctc gtt aat gaa atc ctt gcg gtt ccg gct ttc ctc    163Ile Pro Leu Phe Leu Val Asn Glu Ile Leu Ala Val Pro Ala Phe Leu
             10                  15                  20atc ggt atc atc acc gcc gtg gga ttg ggt gcc atg ggg cgt tcc gtc    211Ile Gly Ile Ile Thr Ala Val Gly Leu Gly Ala Met Gly Arg Ser Val
         25                  30                  35ggt cag gtt atc ggt gga gca atc aaa gca acg ttg ggc ttt ttg ctc    259Gly Gln Val Ile Gly Gly Ala Ile Lys Ala Thr Leu Gly Phe Leu Leu
     40                  45                  50att ggt gcg ggt gcc acg ttg gtc act gcc tcc ctg gag cca ctg ggt    307Ile Gly Ala Gly Ala Thr Leu Val Thr Ala Ser Leu Glu Pro Leu Gly
 55                  60                  65gcg atg atc atg ggt gcc aca ggc atg cgt ggt gtt gtc cca acg aat    355Ala Met Ile Met Gly Ala Thr Gly Met Arg Gly Val Val Pro Thr Asn70                  75                  80                  85gaa gcc atc gcc gga atc gca cag gct gaa tac ggc gcg cag gtg gcg    403Glu Ala Ile Ala Gly Ile Ala Gln Ala Glu Tyr Gly Ala Gln Val Ala
             90                  95                 100tgg ctg atg att ctg ggc ttc gcc atc tct ttg gtg ttg gct cgt ttc    451Trp Leu Met Ile Leu Gly Phe Ala Ile Ser Leu Val Leu Ala Arg Phe
        105                 110                 115acc aac ctg cgt tat gtc ttg ctc aac gga cac cac gtg ctg ttg atg    499Thr Asn Leu Arg Tyr Val Leu Leu Asn Gly His His Val Leu Leu Met
    120                 125                 130tgc acc atg ctc acc atg gtc ttg gcc acc gga aga gtt gat gcg tgg    547Cys Thr Met Leu Thr Met Val Leu Ala Thr Gly Arg Val Asp Ala Trp
135                 140                 145atc ttc                                                            553Ile Phe150<210>24<211>151<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>24Met Asp Trp Leu Thr Ile Pro Leu Phe Leu Val Asn Glu Ile Leu Ala1               5                  10                  15Val Pro Ala Phe Leu Ile Gly Ile Ile Thr Ala Val Gly Leu Gly Ala
         20                  25                  30Met Gly Arg Ser Val Gly Gln Val Ile Gly Gly Ala Ile Lys Ala Thr
     35                  40                  45Leu Gly Phe Leu Leu Ile Gly Ala Gly Ala Thr Leu Val Thr Ala Ser
 50                  55                  60Leu Glu Pro Leu Gly Ala Met Ile Met Gly Ala Thr Gly Met Arg Gly65                  70                  75                  80Val Val Pro Thr Asn Glu Ala Ile Ala Gly Ile Ala Gln Ala Glu Tyr
             85                  90                  95Gly Ala Gln Val Ala Trp Leu Met Ile Leu Gly Phe Ala Ile Ser Leu
        100                 105                 110Val Leu Ala Arg Phe Thr Asn Leu Arg Tyr Val Leu Leu Asn Gly His
    115                 120                 125His Val Leu Leu Met Cys Thr Met Leu Thr Met Val Leu Ala Thr Gly
130                 135                 140Arg Val Asp Ala Trp Ile Phe145                 150<210>25<211>2172<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(2149)<223>RXN01943<400>25ccgattcttt ttcggcccaa ttcgtaacgg cgatcctctt aagtggacaa gaaagtctct  60tgcccgcggg agacagaccc tacgtttaga aaggtttgac atg gcg tcc aaa ctg    115
                                        Met Ala Ser Lys Leu
                                          1               5acg acg aca tcg caa cat att ctg gaa aac ctt ggt gga cca gac aat    163Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu Gly Gly Pro Asp Asn
             10                  15                  20att act tcg atg act cac tgt gcg act cgc ctt cgc ttc caa gtg aag    211Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Phe Gln Val Lys
         25                  30                  35gat caa tcc att gtt gat caa caa gaa att gac tcc gac cca tca gtt    259Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp Ser Asp Pro Ser Val
     40                  45                  50ctt ggc gta gta ccc caa gga tcc acc ggt atg cag gtg gtg atg ggt    307Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met Gln Val Val Met Gly
 55                  60                  65gga tct gtt gca aac tat tac caa gaa atc ctc aaa ctt gat gga atg    355Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu Lys Leu Asp Gly Met70                  75                  80                  85aag cac ttc gcc gac ggt gaa gct aca gag agt tca tcc aag aag gaa    403Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser Ser Ser Lys Lys Glu
             90                  95                 100tac ggc gga gtc cgt ggc aag tac tcg tgg att gac tac gcc ttc gag    451Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Phe Glu
        105                 110                 115ttc ttg tct gat act ttc cga cca atc ctg tgg gcc ctg ctt ggt gcc    499Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp Ala Leu Leu Gly Ala
    120                 125                 130tca ctg att att acc ttg ttg gtt ctt gcg gat act ttc ggt ttg caa    547Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp Thr Phe Gly Leu Gln
135                 140                 145gac ttc cgc gct cca atg gat gag cag cct gat act tat gta ttc ctg    595Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp Thr Tyr Val Phe Leu150                 155                 160                 165cac tcc atg tgg cgc tcg gtc ttc tac ttc ctg cca att atg gtt ggt    643His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu Pro Ile Met Val Gly
            170                 175                 180gcc acc gca gct cga aag ctc ggc gca aac gag tgg att ggt gca gct    691Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu Trp Ile Gly Ala Ala
        185                 190                 195att cca gcc gca ctt ctt act cca gaa ttc ttg gca ctg ggt tct gcc    739Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu Ala Leu Gly Ser Ala
    200                 205                 210ggc gat acc gtc aca gtc ttt ggc ctg cca atg gtt ctg aat gac tac    787Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met Val Leu Asn Asp Tyr
215                 220                 225tcc gga cag gta ttc cca ccg ctg att gca gca att ggt ctg tac tgg    835Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala Ile Gly Leu Tyr Trp230                 235                 240                 245gtg gaa aag gga ctg aag aag atc atc cct gaa gca gtc caa atg gtg    883Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu Ala Val Gln Met Val
            250                 255                 260ttc gtc cca ttc ttc tcc ctg ctg att atg atc cca gcg acc gca ttc    931Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile Pro Ala Thr Ala Phe
        265                 270                 275ctg ctt gga cct ttc ggc atc ggt gtt ggt aac gga att tcc aac ctg    979Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn Gly Ile Ser Asn Leu
    280                 285                 290ctt gaa gcg att aac aac ttc agc cca ttt att ctt tcc atc gtt atc   1027Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile Leu Ser Ile Val Ile
295                 300                 305cca ttg ctc tac cca ttc ttg gtt cca ctt gga ttg cac tgg cca cta    1075Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly Leu His Trp Pro Leu310                 315                 320                 325aac gcc atc atg atc cag aac atc aac acc ctg ggt tac gac ttc att    1123Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu Gly Tyr Asp Phe Ile
            330                 335                 340cag gga cca atg ggt gcc tgg aac ttc gcc tgc ttc ggc ctg gtc acc    1171Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys Phe Gly Leu Val Thr
        345                 350                 355ggc gtg ttc ttg ctc tcc att aag gaa cga aac aag gcc atg cgt cag    1219Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn Lys Ala Met Arg Gln
    360                 365                 370gtt tcc ctg ggt ggc atg ttg gct ggt ttg ctc ggc ggc att tcc gag    1267Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu Gly Gly Ile Ser Glu
375                 380                 385cct tcc ctc tac ggt gtt ctg ctc cga ttc aag aag acc tac ttc cgc    1315Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys Lys Thr Tyr Phe Arg390                 395                 400                 405ctc ctg ccg ggt tgt ttg gca ggc ggt atc gtg atg ggc atc ttc gac    1363Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Gly Gly Ile Val Met Gly Ile Phe Asp
            410                 415                 420atc aag gcg tac gct ttc gtg ttc acc tcc ttg ctt acc atc cca gca    1411Ile Lys Ala Tyr Ala Phe Val Phe Thr Ser Leu Leu Thr Ile Pro Ala
        425                 430                 435atg gac cca tgg ttg ggc tac acc att ggt atc gca gtt gca ttc ttc    1459Met Asp Pro Trp Leu Gly Tyr Thr Ile Gly Ile Ala Val Ala Phe Phe
    440                 445                 450gtt tcc atg ttc ctt gtt ctc gca ctg gac tac cgt tcc aac gaa gag    1507Val Ser Met Phe Leu Val Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Ser Asn Glu Glu
455                 460                 465cgc gat gag gca cgt gca aag gtt gct gct gac aag cag gca gaa gaa    1555Arg Asp Glu Ala Arg Ala Lys Val Ala Ala Asp Lys Gln Ala Glu Glu470                 475                 480                 485gat ctg aag gca gaa gct aat gca act cct gca gct cca gta gct gct    1603Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asn Ala Thr Pro Ala Ala Pro Val Ala Ala
            490                 495                 500gca ggt gcg gga gcc ggt gca ggt gca gga gcc gct gct ggc gct gca    1651Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala
        505                 510                 515acc gcc gtg gca gct aag ccg aag ctg gcc gct ggg gaa gta gtg gac    1699Thr Ala Val Ala Ala Lys Pro Lys Leu Ala Ala Gly Glu Val Val Asp
    520                 525                 530att gtt tcc cca ctc gaa ggc aag gca att cca ctt tct gaa gta cct    1747Ile Val Ser Pro Leu Glu Gly Lys Ala Ile Pro Leu Ser Glu Val Pro
535                 540                 545gac cca atc ttt gca gca ggc aag ctt gga cca ggc att gca atc caa    1795Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro Gly Ile Ala Ile Gln550                 555                 560                 565cca act gga aac acc gtt gtt gct cca gca gac gct act gtc atc ctt    1843Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp Ala Thr Val Ile Leu
            570                 575                 580gtc cag aaa tct gga cac gca gtg gca ttg cgc tta gat agc gga gtt    1891Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg Leu Asp Ser Gly Val
        585                 590                 595gaa atc ctt gtc cac gtt gga ttg gac acc gtg caa ttg ggc ggc gaa    1939Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val Gln Leu Gly Gly Glu
    600                 605                 610ggc ttc acc gtt cac gtt gag cgc agg cag caa gtc aag gcg ggg gat    1987Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln Val Lys Ala Gly Asp
615                 620                 625cca ctg atc act ttt gac gct gac ttc att cga tcc aag gat cta cct    2035Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg Ser Lys Asp Leu Pro630                 635                 640                 645ttg atc acc cca gtt gtg gtg tct aac gcc gcg aaa ttc ggt gaa att    2083Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala Lys Phe Gly Glu Ile
            650                 655                 660gaa ggt att cct gca gat cag gca aat tct tcc acg act gtg atc aag    2131Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser Thr Thr Val Ile Lys
        665                 670                 675gtc aac ggc aag aac gagtaacctggga tccatgttgc gca                   2172Val Asn Gly Lys Asn Glu
    680<210>26<211>683<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>26Met Ala Ser Lys Leu Thr Thr Thr Ser Gln His Ile Leu Glu Asn Leu1               5                  10                  15Gly Gly Pro Asp Asn Ile Thr Ser Met Thr His Cys Ala Thr Arg Leu
         20                  25                  30Arg Phe Gln Val Lys Asp Gln Ser Ile Val Asp Gln Gln Glu Ile Asp
     35                  40                  45Ser Asp Pro Ser Val Leu Gly Val Val Pro Gln Gly Ser Thr Gly Met
 50                  55                  60Gln Val Val Met Gly Gly Ser Val Ala Asn Tyr Tyr Gln Glu Ile Leu65                  70                  75                  80Lys Leu Asp Gly Met Lys His Phe Ala Asp Gly Glu Ala Thr Glu Ser
             85                  90                  95Ser Ser Lys Lys Glu Tyr Gly Gly Val Arg Gly Lys Tyr Ser Trp Ile
        100                 105                 110Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Leu Ser Asp Thr Phe Arg Pro Ile Leu Trp
    115                 120                 125Ala Leu Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ile Thr Leu Leu Val Leu Ala Asp
130                 135                 140Thr Phe Gly Leu Gln Asp Phe Arg Ala Pro Met Asp Glu Gln Pro Asp145                 150                 155                 160Thr Tyr Val Phe Leu His Ser Met Trp Arg Ser Val Phe Tyr Phe Leu
            165                170                  175Pro Ile Met Val Gly Ala Thr Ala Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Glu
        180                 185                 190Trp Ile Gly Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Leu Thr Pro Glu Phe Leu
    195                 200                 205Ala Leu Gly Ser Ala Gly Asp Thr Val Thr Val Phe Gly Leu Pro Met
210                 215                 220Val Leu Asn Asp Tyr Ser Gly Gln Val Phe Pro Pro Leu Ile Ala Ala225                 230                 235                 240Ile Gly Leu Tyr Trp Val Glu Lys Gly Leu Lys Lys Ile Ile Pro Glu
            245                 250                 255Ala Val Gln Met Val Phe Val Pro Phe Phe Ser Leu Leu Ile Met Ile
        260                 265                 270Pro Ala Thr Ala Phe Leu Leu Gly Pro Phe Gly Ile Gly Val Gly Asn
    275                 280                 285Gly Ile Ser Asn Leu Leu Glu Ala Ile Asn Asn Phe Ser Pro Phe Ile
290                 295                 300Leu Ser Ile Val Ile Pro Leu Leu Tyr Pro Phe Leu Val Pro Leu Gly305                 310                 315                 320Leu His Trp Pro Leu Asn Ala Ile Met Ile Gln Asn Ile Asn Thr Leu
            325                 330                 335Gly Tyr Asp Phe Ile Gln Gly Pro Met Gly Ala Trp Asn Phe Ala Cys
        340                 345                 350Phe Gly Leu Val Thr Gly Val Phe Leu Leu Ser Ile Lys Glu Arg Asn
    355                 360                 365Lys Ala Met Arg Gln Val Ser Leu Gly Gly Met Leu Ala Gly Leu Leu
370                 375                 380Gly Gly Ile Ser Glu Pro Ser Leu Tyr Gly Val Leu Leu Arg Phe Lys385                 390                 395                 400Lys Thr Tyr Phe Arg Leu Leu Pro Gly Cys Leu Ala Gly Gly Ile Val
            405                 410                 415Met Gly Ile Phe Asp Ile Lys Ala Tyr Ala Phe Val Phe Thr Ser Leu
        420                 425                 430Leu Thr Ile Pro Ala Met Asp Pro Trp Leu Gly Tyr Thr Ile Gly Ile
    435                 440                 445Ala Val Ala Phe Phe Val Ser Met Phe Leu Val Leu Ala Leu Asp Tyr
450                 455                 460Arg Ser Asn Glu Glu Arg Asp Glu Ala Arg Ala Lys Val Ala Ala Asp465                 470                 475                 480Lys Gln Ala Glu Glu Asp Leu Lys Ala Glu Ala Asn Ala Thr Pro Ala
            485                 490                 495Ala Pro Val Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala
        500                 505                 510Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Val Ala Ala Lys Pro Lys Leu Ala Ala
    515                 520                 525Gly Glu Val Val Asp Ile Val Ser Pro Leu Glu Gly Lys Ala Ile Pro
530                 535                 540Leu Ser Glu Val Pro Asp Pro Ile Phe Ala Ala Gly Lys Leu Gly Pro545                 550                 555                 560Gly Ile Ala Ile Gln Pro Thr Gly Asn Thr Val Val Ala Pro Ala Asp
            565                 570                 575Ala Thr Val Ile Leu Val Gln Lys Ser Gly His Ala Val Ala Leu Arg
        580                 585                 590Leu Asp Ser Gly Val Glu Ile Leu Val His Val Gly Leu Asp Thr Val
    595                 600                 605Gln Leu Gly Gly Glu Gly Phe Thr Val His Val Glu Arg Arg Gln Gln
610                 615                 620Val Lys Ala Gly Asp Pro Leu Ile Thr Phe Asp Ala Asp Phe Ile Arg625                 630                 635                 640Ser Lys Asp Leu Pro Leu Ile Thr Pro Val Val Val Ser Asn Ala Ala
            645                 650                 655Lys Phe Gly Glu Ile Glu Gly Ile Pro Ala Asp Gln Ala Asn Ser Ser
        660                 665                 670Thr Thr Val Ile Lys Val Asn Gly Lys Asn Glu
    675                 680<210>27<211>372<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(349)<223>RXA01503<400>27gtatcctcaa aggccttcta gctgttgcag ctgcagcgca ctcggtggat acgacatcca  60cgacctatca aattctttat gctgcaggcg atgccttttc atg ttc ttg gca gtc    115
                                        Met Phe Leu Ala Val
                                          1               5att ttg gcg att act gcg gct cgt aaa ttc ggt gcc aat gtc ttt aca    163Ile Leu Ala Ile Thr Ala Ala Arg Lys Phe Gly Ala Asn Val Phe Thr
             10                  15                  20tca gtc gca ctc gct ggt gca ttg ctg cac aca cag ctt cag gca gta    211Ser Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu His Thr Gln Leu Gln Ala Val
         25                  30                  35acc gtg ttg gtt gac ggt gaa ctc cag tcg atg act ctg gtg gct ttc    259Thr Val Leu Val Asp Gly Glu Leu Gln Ser Met Thr Leu Val Ala Phe
     40                  45                  50caa aag gct ggt aat gac gtc acc ttc ctg ggc att cca gtg gtg ctg    307Gln Lys Ala Gly Asn Asp Val Thr Phe Leu Gly Ile Pro Val Val Leu
 55                  60                  65cag ttg gcg ttg cat gta gcg agt ttg atg aag ttg tcg cga            349Gln Leu Ala Leu His Val Ala Ser Leu Met Lys Leu Ser Arg70                  75                  80taagaggagg ggcgtgtcgg tct                                          372<210>28<211>83<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>28Met Phe Leu Ala Val Ile Leu Ala Ile Thr Ala Ala Arg Lys Phe Gly1               5                  10                  15Ala Asn Val Phe Thr Ser Val Ala Leu Ala Gly Ala Leu Leu His Thr
         20                  25                  30Gln Leu Gln Ala Val Thr Val Leu Val Asp Gly Glu Leu Gln Ser Met
     35                  40                  45Thr Leu Val Ala Phe Gln Lys Ala Gly Asn Asp Val Thr Phe Leu Gly
 50                  55                  60Ile Pro Val Val Leu Gln Leu Ala Leu His Val Ala Ser Leu Met Lys65                  70                  75                  80Leu Ser Arg<210>29<211>1578<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1555)<223>RXN00351<400>29gaaggctgct gctaagaaaa cgaccaagaa gaccactaag aaaactacta aaaagaccac  60cgcaaagaag accacaaaga agtcttaagc cggatcttat atg gat gat tcc aat    115
                                        Met Asp Asp Ser Asn
                                          1               5agc ttt gta gtt gtt gct aac cgt ctg cca gtg gat atg act gtc cac    163Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val Asp Met Thr Val His
             10                  15                  20cca gat ggt agc tat agc atc tcc ccc agc ccc ggt ggc ctt gtc acg    211Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser Pro Gly Gly Leu Val Thr
         25                  30                  35ggg ctt tcc ccc gtt ctg gaa caa cat cgt gga tgt tgg gtc gga tgg    259Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg Gly Cys Trp Val Gly Trp
     40                  45                  50cct gga act gta gat gtt gca ccc gaa cca ttt cga aca gat acg ggt    307Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro Phe Arg Thr Asp Thr Gly
 55                  60                  65gtt ttg ctg cac cct gtt gtc ctc act gca agt gac tat gaa ggc ttc    355Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala Ser Asp Tyr Glu Gly Phe70                  75                  80                  85tac gag ggc ttt tca aac gca acg ctg tgg cct ctt ttc cac gat ctg    403Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp Pro Leu Phe His Asp Leu
             90                  95                 100att gtt act ccg gtg tac aac acc gat tgg tgg cat gcg ttt cgg gag    451Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp Trp His Ala Phe Arg Glu
        105                 110                 115gta aac ctc aag ttc gct gaa gcc gtg agc caa gtg gcg gca cac ggt    499Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser Gln Val Ala Ala His Gly
    120                 125                 130gcc act gtg tgg gtg cag gac tat cag ctg ttg ctg gtt cct ggc att    547Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu Leu Leu Val Pro Gly Ile
135                 140                 145ttg cgc cag atg cgc cct gat ttg aag atc ggt ttc ttc ctc cac att    595Leu Arg Gln Met Arg Pro Asp Leu Lys Ile Gly Phe Phe Leu His Ile150                 155                 160                 165ccc ttc cct tcc cct gat ctg ttc cgt cag ctg ccg tgg cgt gaa gag    643Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln Leu Pro Trp Arg Glu Glu
            170                 175                 180att gtt cga ggc atg ctg ggc gca gat ttg gtg gga ttc cat ttg gtt    691Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu Val Gly Phe His Leu Val
        185                 190                 195caa aac gca gaa aac ttc ctt gcg tta acc cag cag gtt gcc ggc act    739Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr Gln Gln Val Ala Gly Thr
    200                 205                 210gcc ggg tct cat gtg ggt cag ccg gac acc ttg cag gtc agt ggt gaa    787Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr Leu Gln Val Ser Gly Glu
215                 220                 225gca ttg gtg cgt gag att ggc gct cat gtt gaa acc gct gac gga agg    835Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val Glu Thr Ala Asp Gly Arg230                 235                 240                 245cga gtt agc gtc ggg gcg ttc ccg atc tcg att gat gtt gaa atg ttt    883Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile Asp Val Glu Met Phe
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                                        Met Thr Leu Thr Ile
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    195                 200                 205Asp Asp Arg Ala Leu Thr Val Lys Val Gly Glu Gly Asp Thr Ala Ala
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    280                 285                 290ggc acc act ggc tac gac gcc ctc cgt gaa ctc gac ggc gtg ttt atc    1027Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Glu Leu Asp Gly Val Phe Ile
295                 300                 305tcc cga gaa tct gag gac aaa ttc tcc atg ctg gcg ctg acc cac agt    1075Ser Arg Glu Ser Glu Asp Lys Phe Ser Met Leu Ala Leu Thr His Ser310                 315                 320                 325gga tcc acc tgg gat gaa cgc gcc ctc aaa tcc acg gag gaa agc ctc    1123Gly Ser Thr Trp Asp Glu Arg Ala Leu Lys Ser Thr Glu Glu Ser Leu
            330                 335                 340aaa cga gtc gtc gcc caa caa gaa ctc gca gcc gaa atc tta agg ctc    1171Lys Arg Val Val Ala Gln Gln Glu Leu Ala Ala Glu Ile Leu Arg Leu
        345                 350                 355gcc cgc gcc atg cgc cgc gat aac ttc tcc acc gca ggc acc aac gtc    1219Ala Arg Ala Met Arg Arg Asp Asn Phe Ser Thr Ala Gly Thr Asn Val
    360                 365                 370acc gaa gac aaa ctt agc gaa acc atc atc gaa tta gtc gcc gcc atg    1267Thr Glu Asp Lys Leu Ser Glu Thr Ile Ile Glu Leu Val Ala Ala Met
375                 380                 385ccc gtc tac cgc gcc gac tac atc tcc ctc tca cgc acc acc gcc acc    1315Pro Val Tyr Arg Ala Asp Tyr Ile Ser Leu Ser Arg Thr Thr Ala Thr390                 395                 400                 405gtc atc gcg gag atg tcc aaa cgc ttc ccc tcc cgg cgt gac gca ctc    1363Val Ile Ala Glu Met Ser Lys Arg Phe Pro Ser Arg Arg Asp Ala Leu
            410                 415                 420gac ctc atc gcg gcc gcc cta ctt ggc aat ggc gag gcc aaa atc cgc    1411Asp Leu Ile Ala Ala Ala Leu Leu Gly Asn Gly Glu Ala Lys Ile Arg
        425                 430                 435ttc gct caa gtc tgc ggc gcc gtc atg gct aaa ggt gtg gaa gac acc    1459Phe Ala Gln Val Cys Gly Ala Val Met Ala Lys Gly Val Glu Asp Thr
    440                 445                 450acc ttc tac cgc gca tct agg ctc gtt gca ttg caa gaa gtc ggt ggc    1507Thr Phe Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Val Ala Leu Gln Glu Val Gly Gly
455                 460                 465gcg ccg ggg aga ttc ggc gtc tcc gct gca gaa ttc cac ttg ctg cag    1555Ala Pro Gly Arg Phe Gly Val Ser Ala Ala Glu Phe His Leu Leu Gln470                 475                 480                 485gaa gaa cgc agc ctg ctg tgg cca cgc acc atg acc acc ttg tcc acg    1603Glu Glu Arg Ser Leu Leu Trp Pro Arg Thr Met Thr Thr Leu Ser Thr
            490                 495                 500cat gac acc aaa cgt ggc gaa gat acc cgc gcc cgc atc atc tcc ctg    1651His Asp Thr Lys Arg Gly Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ile Ser Leu
        505                 510                 515tct gaa gtc ccc gat atg tac tcc gag ctg gtc aat cgt gtt ttc gcg    1699Ser Glu Val Pro Asp Met Tyr Ser Glu Leu Val Asn Arg Val Phe Ala
    520                 525                 530gtg ctc ccc gcg cca gac ggc gca acg ggc agt ttc ctc cta caa aac    1747Val Leu Pro Ala Pro Asp Gly Ala Thr Gly Ser Phe Leu Leu Gln Asn
535                 540                 545ctg ctg ggc gta tgg ccc gcc gac ggc gtg atc acc gat gcg ctg cgc    1795Leu Leu Gly Val Trp Pro Ala Asp Gly Val Ile Thr Asp Ala Leu Arg550                 555                 560                 565gat cga ttc agg gaa tac gcc cta aaa gct atc cgc gaa gca tcc aca    1843Asp Arg Phe Arg Glu Tyr Ala Leu Lys Ala Ile Arg Glu Ala Ser Thr
            570                 575                 580aaa acc acg tgg gtg gac ccc aac gag tcc ttc gag gct gcg gtc tgc    1891Lys Thr Thr Trp Val Asp Pro Asn Glu Ser Phe Glu Ala Ala Val Cys
        585                 590                 595gat tgg gtg gaa gcg ctt ttc gac gga ccc tcc acc tca cta atc acc    1939Asp Trp Val Glu Ala Leu Phe Asp Gly Pro Ser Thr Ser Leu Ile Thr
    600                 605                 610gaa ttt gtc tcc cac atc aac cgt ggc tct gtg caa atc tcc tta ggc    1987Glu Phe Val Ser His Ile Asn Arg Gly Ser Val Gln Ile Ser Leu Gly
615                 620                 625agg aaa ctg ctg caa atg gtg ggc gct gga atc ccc gac act tac caa    2035Arg Lys Leu Leu Gln Met Val Gly Ala Gly Ile Pro Asp Thr Tyr Gln630                 635                 640                 645
gga act gag ttt tta gaa gac tcc ctg gta gat ccc gat aac cga cgc    2083Gly Thr Glu Phe Leu Glu Asp Ser Leu Val Asp Pro Asp Asn Arg Arg
            650                 655                 660ttt gtt gat tac acc gcc aga gaa caa gtc ctg gag cgc ctg caa acc    2131Phe Val Asp Tyr Thr Ala Arg Glu Gln Val Leu Glu Arg Leu Gln Thr
        665                 670                 675tgg gct tgg acg cag gtt aat tcg gta gaa gac ttg gtg gat aac gcc    2179Trp Ala Trp Thr Gln Val Asn Ser Val Glu Asp Leu Val Asp Asn Ala
    680                 685                 690gac atc gcc aaa atg gcc gtg gtc cat aaa tcc ctc gag ttg cgt gct    2227Asp Ile Ala Lys Met Ala Val Val His Lys Ser Leu Glu Leu Arg Ala
695                 700                 705gaa ttt cgt gca agc ttt gtt ggt gga gat cat cag gca gta ttt ggc    2275Glu Phe Arg Ala Ser Phe Val Gly Gly Asp His Gln Ala Val Phe Gly710                 715                 720                 725gaa ggt cgc gca gaa tcc cac atc atg ggc atc gcc cgc ggt aca gac    2323Glu Gly Arg Ala Glu Ser His Ile Met Gly Ile Ala Arg Gly Thr Asp
            730                 735                 740cga aac cac ctc aac atc att gct ctt gct acc cgt cga cca ctg atc    2371Arg Asn His Leu Asn Ile Ile Ala Leu Ala Thr Arg Arg Pro Leu Ile
        745                 750                 755ttg gaa gac cgt ggc gga tgg tat gac acc acc gtc acg ctt cct ggt    2419Leu Glu Asp Arg Gly Gly Trp Tyr Asp Thr Thr Val Thr Leu Pro Gly
    760                 765                 770gga caa tgg gaa gac agg ctc acc ggg caa cgc ttc agt ggt gtt gtc    2467Gly Gln Trp Glu Asp Arg Leu Thr Gly Gln Arg Phe Ser Gly Val Val
775                 780                 785cca gcc acc gat ttg ttc tca cat cta ccc gta tct ttg ttg gtt tta    2515Pro Ala Thr Asp Leu Phe Ser His Leu Pro Val Ser Leu Leu Val Leu790                 795                 800                 805gta ccc gat agt gag ttt tgatccctgc acaggaaagt tag                  2556Val Pro Asp Ser Glu Phe
            810<210>34<211>811<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>34Met Ala Arg Pro Ile Ser Ala Thr Tyr Arg Leu Gln Met Arg Gly Pro1               5                  10                  15Gln Ala Asp Ser Ala Gly Arg Ser Phe Gly Phe Ala Gln Ala Lys Ala
         20                  25                  30Gln Leu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Ile Ser His Leu Tyr Leu Ser
     35                  40                  45Pro Ile Phe Thr Ala Met Pro Asp Ser Asn His Gly Tyr Asp Val Ile
 50                  55                  60Asp Pro Thr Thr Ile Asn Glu Glu Leu Gly Gly Met Glu Gly Leu Arg65                  70                  75                  80Asp Leu Ala Ala Ala Thr His Glu Leu Gly Met Gly Ile Ile Ile Asp
             85                  90                  95Ile Val Pro Asn His Leu Gly Val Ala Val Pro His Leu Asn Pro Trp
        100                 105                 110Trp Trp Asp Val Leu Lys Asn Gly Lys Asp Ser Ala Phe Glu Phe Tyr
    115                 120                 125Phe Asp Ile Asp Trp His Glu Asp Asn Gly Ser Gly Gly Lys Leu Gly
130                 135                 140Met Pro Ile Leu Gly Ala Glu Gly Asp Glu Asp Lys Leu Glu Phe Ala145                 150                 155                 160Glu Leu Asp Gly Glu Lys Val Leu Lys Tyr Phe Asp His Leu Phe Pro
            165                 170                 175Ile Ala Pro Gly Thr Glu Glu Gly Thr Pro Gln Glu Val Tyr Lys Arg
        180                 185                 190Gln His Tyr Arg Leu Gln Phe Trp Arg Asp Gly Val Ile Asn Phe Arg
    195                 200                 205Arg Phe Phe Ser Val Asn Thr Leu Ala Gly Ile Arg Gln Glu Asp Pro
210                 215                 220Leu Val Phe Glu His Thr His Arg Leu Leu Arg Glu Leu Val Ala Glu225                 230                 235                 240Asp Leu Ile Asp Gly Val Arg Val Asp His Pro Asp Gly Leu Ser Asp
            245                 250                 255Pro Phe Gly Tyr Leu His Arg Leu Arg Asp Leu Ile Gly Pro Asp Arg
        260                 265                 270Trp Leu Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ser Val Asp Glu Pro Leu Asp Pro
    275                 280                 285Arg Leu Ala Val Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Glu Leu
290                 295                 300Asp Gly Val Phe Ile Ser Arg Glu Ser Glu Asp Lys Phe Ser Met Leu305                 310                 315                 320Ala Leu Thr His Ser Gly Ser Thr Trp Asp Glu Arg Ala Leu Lys Ser
            325                 330                 335Thr Glu Glu Ser Leu Lys Arg Val Val Ala Gln Gln Glu Leu Ala Ala
        340                 345                 350Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Ala Met Arg Arg Asp Asn Phe Ser Thr
    355                 360                 365Ala Gly Thr Asn Val Thr Glu Asp Lys Leu Ser Glu Thr Ile Ile Glu
370                 375                 380Leu Val Ala Ala Met Pro Val Tyr Arg Ala Asp Tyr Ile Ser Leu Ser385                 390                 395                400Arg Thr Thr Ala Thr Val Ile Ala Glu Met Ser Lys Arg Phe Pro Ser
            405                 410                 415Arg Arg Asp Ala Leu Asp Leu Ile Ala Ala Ala Leu Leu Gly Asn Gly
        420                 425                 430Glu Ala Lys Ile Arg Phe Ala Gln Val Cys Gly Ala Val Met Ala Lys
    435                 440                 445Gly Val Glu Asp Thr Thr Phe Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Val Ala Leu
450                 455                 460Gln Glu Val Gly Gly Ala Pro Gly Arg Phe Gly Val Ser Ala Ala Glu465                 470                 475                 480Phe His Leu Leu Gln Glu Glu Arg Ser Leu Leu Trp Pro Arg Thr Met
            485                 490                 495Thr Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Gly Glu Asp Thr Arg Ala
        500                 505                 510Arg Ile Ile Ser Leu Ser Glu Val Pro Asp Met Tyr Ser Glu Leu Val
    515                 520                 525Asn Arg Val Phe Ala Val Leu Pro Ala Pro Asp Gly Ala Thr Gly Ser
530                 535                 540Phe Leu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Trp Pro Ala Asp Gly Val Ile545                 550                 555                 560Thr Asp Ala Leu Arg Asp Arg Phe Arg Glu Tyr Ala Leu Lys Ala Ile
            565                 570                 575Arg Glu Ala Ser Thr Lys Thr Thr Trp Val Asp Pro Asn Glu Ser Phe
        580                 585                 590Glu Ala Ala Val Cys Asp Trp Val Glu Ala Leu Phe Asp Gly Pro Ser
    595                 600                 605Thr Ser Leu Ile Thr Glu Phe Val Ser His Ile Asn Arg Gly Ser Val
610                 615                 620Gln Ile Ser Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln Met Val Gly Ala Gly Ile625                 630                 635                 640Pro Asp Thr Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Leu Glu Asp Ser Leu Val Asp
            645                 650                 655Pro Asp Asn Arg Arg Phe Val Asp Tyr Thr Ala Arg Glu Gln Val Leu
        660                 665                 670Glu Arg Leu Gln Thr Trp Ala Trp Thr Gln Val Asn Ser Val Glu Asp
    675                 680                 685Leu Val Asp Asn Ala Asp Ile Ala Lys Met Ala Val Val His Lys Ser
690                 695                 700Leu Glu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Ala Ser Phe Val Gly Gly Asp His705                 710                 715                 720Gln Ala Val Phe Gly Glu Gly Arg Ala Glu Ser His Ile Met Gly Ile
            725                 730                 735Ala Arg Gly Thr Asp Arg Asn His Leu Asn Ile Ile Ala Leu Ala Thr
        740                 745                 750Arg Arg Pro Leu Ile Leu Glu Asp Arg Gly Gly Trp Tyr Asp Thr Thr
    755                 760                 765Val Thr Leu Pro Gly Gly Gln Trp Glu Asp Arg Leu Thr Gly Gln Arg
770                 775                 780Phe Ser Gly Val Val Pro Ala Thr Asp Leu Phe Ser His Leu Pro Val785                 790                 795                 800Ser Leu Leu Val Leu Val Pro Asp Ser Glu Phe
            805                 810<210>35<211>1953<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1930)<223>RXA02645<400>35gatacagctc cttgatggag tgaataaatt cgcgagcctg ctcctgatct tgcacacgcg  60tgatataggt cagaaatcgc gagcgcttga tctctagttc atg ctc aaa gac ttg    115
                                        Met Leu Lys Asp Leu
                                          1               5acc ggc ctg agg gag ttg gta ttg cgt gag atg tgc cat agc atc tca    163Thr Gly Leu Arg Glu Leu Val Leu Arg Glu Met Cys His Ser Ile Ser
             10                  15                  20cat ctt agc tcg cca acc ggc agc att ttc act agc ctg gtg gcc atg    211His Leu Ser Ser Pro Thr Gly Ser Ile Phe Thr Ser Leu Val Ala Met
         25                  30                  35ttg acc tcg caa agc ttt tca gtg tgg gct cca ctt ccc cac gat gta    259Leu Thr Ser Gln Ser Phe Ser Val Trp Ala Pro Leu Pro His Asp Val
     40                  45                  50cat ctg atc ctc aac ggc gaa acc ctc ccc atg cac aaa acg gag ggc    307His Leu Ile Leu Asn Gly Glu Thr Leu Pro Met His Lys Thr Glu Gly
 55                  60                  65agc tgg tgg cgc gcc gag atc gcg ccc aag gcc ggc gat cgt tac ggt    355Ser Trp Trp Arg Ala Glu Ile Ala Pro Lys Ala Gly Asp Arg Tyr Gly70                  75                  80                  85ttt tcg ctt ttc gac ggc tcc tcc tgg tca aaa acc ctc ccc gat ccc    403Phe Ser Leu Phe Asp Gly Ser Ser Trp Ser Lys Thr Leu Pro Asp Pro
             90                  95                 100cgc tcc aca tct caa cca gac ggg gtt cat ggt tta agt gaa gtc tcc    451Arg Ser Thr Ser Gln Pro Asp Gly Val His Gly Leu Ser Glu Val Ser
        105                 110                 115gat gat tcc tat ctg tgg ggt gac cag cag tgg act ggc cga att ctc    499Asp Asp Ser Tyr Leu Trp Gly Asp Gln Gln Trp Thr Gly Arg Ile Leu
    120                 125                 130cct ggc tcg gtg tta tat gag ctg cat gtg ggc acc ttt agt gaa gat    547Pro Gly Ser Val Leu Tyr Glu Leu His Val Gly Thr Phe Ser Glu Asp
135                 140                 145gga acg ttt gag gga gtc gtc gac aag ctt cct tat ctg cgc gac ctc    595Gly Thr Phe Glu Gly Val Val Asp Lys Leu Pro Tyr Leu Arg Asp Leu150                 155                 160                 165ggc gtg acc gcc atc gaa ctt tta ccc gtg cag ccc ttt ggc ggc aac    643Gly Val Thr Ala Ile Glu Leu Leu Pro Val Gln Pro Phe Gly Gly Asn
            170                 175                 180cgc aat tgg ggc tac gac ggg gtg ctg tgg cac gcc gtc cat gca ggc    691Arg Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Leu Trp His Ala Val His Ala Gly
        185                 190                 195tac ggc ggt ccg gcg ggc ttg aaa aag ctt atc gac gcc tcc cac cag    739Tyr Gly Gly Pro Ala Gly Leu Lys Lys Leu Ile Asp Ala Ser His Gln
    200                 205                 210gcc ggc atc gcc gtc tac tta gac gtc gtg tac aac cac ttc ggc ccc    787Ala Gly Ile Ala Val Tyr Leu Asp Val Val Tyr Asn His Phe Gly Pro
215                 220                 225gac ggc aac tac aac ggg caa ttt ggc ccc tac acc tct ggc ggc agc    835Asp Gly Asn Tyr Asn Gly Gln Phe Gly Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Ser230                 235                 240                 245acc ggc tgg ggc gac gtg gtc aac atc aac ggc cat gat tca gat gaa    883Thr Gly Trp Gly Asp Val Val Asn Ile Asn Gly His Asp Ser Asp Glu
            250                 255                 260gtc cgc aat tat att ctc gac gcc gca cgc cag tgg ttc gaa gat ttt    931Val Arg Asn Tyr Ile Leu Asp Ala Ala Arg Gln Trp Phe Glu Asp Phe
        265                 270                 275cac gtt gat ggg ctc cgc ctc gat gcg gtg cat tct ctc gat gat cgc    979His Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ser Leu Asp Asp Arg
    280                 285                 290ggc gcc tat tcc cta ctt gcg cag ctg acc atg gtg gcc gag gat gtc    1027Gly Ala Tyr Ser Leu Leu Ala Gln Leu Thr Met Val Ala Glu Asp Val
295                 300                 305tcc gca caa aca ggc atc cca cgc tca ttg att gca gaa tct gaa ctc    1075Ser Ala Gln Thr Gly Ile Pro Arg Ser Leu Ile Ala Glu Ser Glu Leu310                 315                 320                 325aat gac ccc aag ttc gtt acc tcc cgc gag gcc ggc ggt ttt ggc ctg    1123Asn Asp Pro Lys Phe Val Thr Ser Arg Glu Ala Gly Gly Phe Gly Leu
            330                 335                 340gat gca cag tgg gtt gac gat atc cac cac gcc ctc cat gcc ctc gtt    1171Asp Ala Gln Trp Val Asp Asp Ile His His Ala Leu His Ala Leu Val
        345                 350                 355tct ggc gaa cgc aat ggt tat tac agc gat ttc gga tct gtc gac aca    1219Ser Gly Glu Arg Asn Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Gly Ser Val Asp Thr
    360                 365                 370tta gcc aaa acc ctg cgt gaa gta ttt gaa cac acc gga aac tac tcc    1267Leu Ala Lys Thr Leu Arg Glu Val Phe Glu His Thr Gly Asn Tyr Ser
375                 380                 385acg tac cgc gga cgc aac cac ggc cgc cct gtg cac ccc gat atc acc    1315Thr Tyr Arg Gly Arg Asn His Gly Arg Pro Val His Pro Asp Ile Thr390                 395                 400                 405cct gcc tcg cgc ttt gtc acc tac acc acc acc cat gat cag acc ggc    1363Pro Ala Ser Arg Phe Val Thr Tyr Thr Thr Thr His Asp Gln Thr Gly
            410                 415                 420aac cgc gca atc ggc gac cgt cct tcc acg act ctc acc ccg gaa cag    1411Asn Arg Ala Ile Gly Asp Arg Pro Ser Thr Thr Leu Thr Pro Glu Gln
        425                 430                 435cag gtg ttg aag gca gcc att atc tac agc tcg ccg tat acc ccg atg    1459Gln Val Leu Lys Ala Ala Ile Ile Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr Pro Met
    440                 445                 450ttg ttt atg ggt gaa gaa ttc gga gcc acc acc cca ttc gcc ttc ttt    1507Leu Phe Met Gly Glu Glu Phe Gly Ala Thr Thr Pro Phe Ala Phe Phe
455                 460                 465tgc tcc cac acc gac ccc gag ctc aac cgg cta acc tcc gag ggc cgc    1555Cys Ser His Thr Asp Pro Glu Leu Asn Arg Leu Thr Ser Glu Gly Arg470                 475                 480                485aaa cgg gaa ttc gca cgc ctt ggc tgg aac gcc gac gac atc ccc tcc    1603Lys Arg Glu Phe Ala Arg Leu Gly Trp Asn Ala Asp Asp Ile Pro Ser
            490                 495                 500ccc gag ctg gaa tcc acc ttc acc tcc tcc aaa ctc gat tgg gag ttc    1651Pro Glu Leu Glu Ser Thr Phe Thr Ser Ser Lys Leu Asp Trp Glu Phe
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    520                 525                 530ctg cgg cac acc ttg ggc ttc tcc caa cca aac ttg ctc aca ctc gag    1747Leu Arg His Thr Leu Gly Phe Ser Gln Pro Asn Leu Leu Thr Leu Glu
535                 540                 545gtt gag cac ggc gag aac tgg cta tcg atg gcc aat ggt cgc ggc cga    1795Val Glu His Gly Glu Asn Trp Leu Ser Met Ala Asn Gly Arg Gly Arg550                 555                 560                 565att ctg gcg aat ttc tcc gac gac acc atc acc gtc ccg ctt ggc ggc    1843Ile Leu Ala Asn Phe Ser Asp Asp Thr Ile Thr Val Pro Leu Gly Gly
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         20                  25                  30Ser Leu Val Ala Met Leu Thr Ser Gln Ser Phe Ser Val Trp Ala Pro
     35                  40                  45Leu Pro His Asp Val His Leu Ile Leu Asn Gly Glu Thr Leu Pro Met
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130                 135             140Thr Phe Ser Glu Asp Gly Thr Phe Glu Gly Val Val Asp Lys Leu Pro145                 150             155                     160Tyr Leu Arg Asp Leu Gly Val Thr Ala Ile Glu Leu Leu Pro Val Gln
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    195             200                     205Asp Ala Ser His Gln Ala Gly Ile Ala Val Tyr Leu Asp Val Val Tyr
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    260                     265                 270Trp Phe Glu Asp Phe His Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His
275                     280                 285Ser Leu Asp Asp Arg Gly Ala Tyr Ser Leu Leu Ala Gln Leu Thr Met
290                 295                 300Val Ala Glu Asp Val Ser Ala Gln Thr Gly Ile Pro Arg Ser Leu Ile305                 310                 315                 320Ala Glu Ser Glu Leu Asn Asp Pro Lys Phe Val Thr Ser Arg Glu Ala
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        580                 585                 590Thr Asp Thr Ser Thr Thr Leu Gln Pro Trp Gly Phe Ala Ile Leu Thr
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                                        Met Ser Ser Ile Ser
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     40                  45                  50ggc aaa aac gac acc gac aaa gtc att ccg atc atc gac cgc tgg aac    307Gly Lys Asn Asp Thr Asp Lys Val Ile Pro Ile Ile Asp Arg Trp Asn
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             90                  95                 100tct gac tac gac gtc atg gcg ctc gac gtc atc tgg acc gca gac ttc    451Ser Asp Tyr Asp Val Met Ala Leu Asp Val Ile Trp Thr Ala Asp Phe
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215                 220                 225aga cag cac gac ggc aag gca ggc ctt caa gcg ctt gtc gac ggc        832Arg Gln His Asp Gly Lys Ala Gly Leu Gln Ala Leu Val Asp Gly230                 235                 240<210>38<211>244<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>38Met Ser Ser Ile Ser Arg Lys Thr Gly Ala Ser Leu Ala Ala Thr Thr1               5                  10                  15Leu Leu Ala Ala Ile Ala Leu Ala Gly Cys Ser Ser Asp Ser Ser Ser
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     35                  40                  45Ile Thr Phe Ala Met Gly Lys Asn Asp Thr Asp Lys Val Ile Pro Ile
 50                  55                  60Ile Asp Arg Trp Asn Glu Ala His Pro Asp Glu Gln Val Thr Leu Asn65                  70                  75                  80Glu Leu Ala Gly Glu Ala Asp Ala Gln Arg Glu Thr Leu Val Gln Ser
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    115                 120                 125Asp Leu Glu Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln Ser Thr Val Asp Ser
130                 135                 140Ala Thr Tyr Asn Gly Thr Leu Tyr Ala Leu Pro Gln Asn Thr Asn Gly145                 150                 155                 160Gln Leu Leu Phe Arg Asn Thr Glu Ile Ile Pro Glu Ala Pro Ala Asn
            165                 170                 175Trp Ala Asp Leu Val Glu Ser Cys Thr Leu Ala Glu Glu Ala Gly Val
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    195                 200                 205Thr Ile Gly Phe Ile Glu Gly Trp Gly Gly Ser Val Leu Asp Asp Asp
210                 215                 220Gly Lys Arg His Arg Arg Gln His Asp Gly Lys Ala Gly Leu Gln Ala225                 230                 235                 240Leu Val Asp Gly<210>39<211>609<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(586)<223>RXN02909<400>39caacgcgaat gaaaacgaac agcgagcagg tctataccca cgacgtcaac gtgtgggcta  60atagtttcct ggattgtttg gcacagtcgg gagaaaactc atg aac cgc gca cga    115
                                        Met Asn Arg Ala Arg
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135                 140                 145cca gca atc cgc ttg gtg tcc tgg atc gcg ccg aca tct taaggtgcca     596Pro Ala Ile Arg Leu Val Ser Trp Ile Ala Pro Thr Ser150                 155                 160gggctttaaa gtg                                                     609<210>40<211>162<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>40Met Asn Arg Ala Arg Ile Ala Thr Ile Gly Val Leu Pro Leu Ala Leu1               5                  10                  15Leu Leu Ala Ser Cys Gly Ser Asp Thr Val Glu Met Thr Asp Ser Thr
         20                 25                 30Trp Leu Val Thr Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Asp Glu Ser Asn Ser Ile
     35                  40                  45Ser Asn Leu Val Ile Ser Gln Pro Ser Leu Asp Phe Gly Asn Ser Ser
 50                  55                  60Leu Ser Gly Phe Thr Gly Cys Val Pro Phe Thr Gly Arg Ala Glu Phe65                 70                  75                  80Phe Gln Asn Gly Glu Gln Ser Ser Val Leu Asp Ala Asp Tyr Val Thr
             85                  90                  95Leu Ser Ser Leu Asp Phe Asp Lys Leu Pro Asp Asp Cys Gln Gly Gln
        100                 105                 110Glu Leu Lys Val His Asn Glu Leu Val Asp Leu Leu Pro Gly Ser Phe
    115                 120                 125Glu Ile Ser Arg Thr Ser Gly Ser Glu Ile Leu Leu Thr Ser Asp Val
130                 135                 140Asp Glu Leu Asp Arg Pro Ala Ile Arg Leu Val Ser Trp Ile Ala Pro145                 150                 155                 160Thr Ser<210>41<211>1590<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1567)<223>RXS00349<400>41tgtgtacatc acaatggaat tcggggctag agtatctggt gaaccgtgca taaacgacct  60gtgattggac tctttttcct tgcaaaatgt tttccagcgg atg ttg agt ttt gcg    115
                                        Met Leu Ser Phe Ala
                                          1               5acc ctt cgt ggc cgc att tca aca gtt gac gct gca aaa gcc gca cct    163Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala Ala Lys Ala Ala Pro
             10                  15                  20ccg cca tcg cca cta gcc ccg att gat ctc act gac cat agt caa gtg    211Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr Asp His Ser Gln Val
         25                  30                  35gcc ggt gtg atg aat ttg gct gcg aga att ggc gat att ttg ctt tct    259Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly Asp Ile Leu Leu Ser
     40                  45                  50tca ggt acg tca aat agt gac acc aag gta caa gtt cga gca gtg acc    307Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln Val Arg Ala Val Thr
 55                  60                  65tct gcg tac ggt ttg tac tac acg cac gtg gat atc acg ttg aat acg    355Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp Ile Thr Leu Asn Thr70                  75                  80                  85atc acc atc ttc acc aac atc ggt gtg gag agg aag atg ccg gtc aac    403Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg Lys Met Pro Val Asn
             90                  95                 100gtg ttt cat gtt gta ggc aag ttg gac acc aac ttc tcc aaa ctg tct    451Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn Phe Ser Lys Leu Ser
        105                110                  115gag gtt gac cgt ttg atc cgt tcc att cag gct ggt gcg acc ccg cct    499Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Pro
    120                 125                 130gag gtt gcc gag aaa atc ctg gac gag ttg gag caa tcc cct gcg tct    547Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu Gln Ser Pro Ala Ser
135                 140                 145tat ggt ttc cct gtt gcg ttg ctt ggc tgg gca atg atg ggt ggt gct    595Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala Met Met Gly Gly Ala150                 155                 160                 165gtt gct gtg ctg ttg ggt ggt gga tgg cag gtt tcc cta att gct ttt    643Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val Ser Leu Ile Ala Phe
            170                 175                 180att acc gcg ttc acg atc att gcc acg acg tca ttt ttg gga aag aag    691Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser Phe Leu Gly Lys Lys
        185                 190                 195ggt ttg cct act ttc ttc caa aat gtt gtt ggt ggt ttt att gcc acg    739Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly Gly Phe Ile Ala Thr
    200                 205                 210ctg cct gca tcg att gct tat tct ttg gcg ttg caa ttt ggt ctt gag    787Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu Gln Phe Gly Leu Glu
215                 220                 225atc aaa ccg agc cag atc atc gca tct gga att gtt gtg ctg ttg gca    835Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile Val Val Leu Leu Ala230                 235                 240                 245ggt ttg aca ctc gtg caa tct ctg cag gac ggc atc acg ggc gct ccg    883Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly Ile Thr Gly Ala Pro
            250                 255                     260gtg aca gca agt gca cga ttt ttc gaa aca ctc ctg ttt acc ggc ggc   931Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu Leu Phe Thr Gly Gly
        265                 270                 275att gtt gct ggc gtg ggt ttg ggc att cag ctt tct gaa atc ttg cat    979Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu Ser Glu Ile Leu His
    280                 285                 290gtc atg ttg cct gcc atg gag tcc gct gca gca cct aat tat tcg tct    1027Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala Pro Asn Tyr Ser Ser
295                 300                 305aca ttc gcc cgc att atc gct ggt ggc gtc acc gca gcg gcc ttc gca    1075Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr Ala Ala Ala Phe Ala310                 315                 320                 325gtg ggt tgt tac gcg gag tgg tcc tcg gtg att att gcg ggg ctt act    1123Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile Ile Ala Gly Leu Thr
            330                 335                 340gcg ctg atg ggt tct gcg ttt tat tac ctc ttc gtt gtt tat tta ggc    1171Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe Val Val Tyr Leu Gly
        345                 350                 355ccc gtc tct gcc gct gcg att gct gca aca gca gtt ggt ttc act ggt    1219Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala Val Gly Phe Thr Gly
    360                 365                 370ggt ttg ctt gcc cgt cga ttc ttg att cca ccg ttg att gtg gcg att    1267Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro Leu Ile Val Ala Ile
375                 380                 385gcc ggc atc aca cca atg ctt cca ggt cta gca att tac cgc gga atg    1315Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala Ile Tyr Arg Gly Met390                 395                 400                 405tac gcc acc ctg aat gat caa aca ctc atg ggt ttc acc aac att gcg    1363Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly Phe Thr Asn Ile Ala
            410                 415                 420gtt gct tta gcc act gct tca tca ctt gcc gct ggc gtg gtt ttg ggt    1411Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly Val Val Leu Gly
        425                 430                 435gag tgg att gcc cgc agg cta cgt cgt cca cca cgc ttc aac cca tac    1459Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro Arg Phe Asn Pro Tyr
    440                 445                 450cgt gca ttt acc aag gcg aat gag ttc tcc ttc cag gag gaa gct gag    1507Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe Gln Glu Glu Ala Glu
455                 460                 465cag aat cag cgc cgg cag aga aaa cgt cca aag act aat cag aga ttc    1555Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys Thr Asn Gln Arg Phe470                 475                 480                 485ggt aat aaa agg taaaaatcaa cctgcttagg cgt                          1590Gly Asn Lys Arg<210>42<211>489<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>42Met Leu Ser Phe Ala Thr Leu Arg Gly Arg Ile Ser Thr Val Asp Ala1               5                  10                  15Ala Lys Ala Ala Pro Pro Pro Ser Pro Leu Ala Pro Ile Asp Leu Thr
         20                  25                  30Asp His Ser Gln Val Ala Gly Val Met Asn Leu Ala Ala Arg Ile Gly
    35                  40                  45Asp Ile Leu Leu Ser Ser Gly Thr Ser Asn Ser Asp Thr Lys Val Gln
 50                  55                  60Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Leu Tyr Tyr Thr His Val Asp65                  70                  75                  80Ile Thr Leu Asn Thr Ile Thr Ile Phe Thr Asn Ile Gly Val Glu Arg
             85                  90                  95Lys Met Pro Val Asn Val Phe His Val Val Gly Lys Leu Asp Thr Asn
        100                 105                 110Phe Ser Lys Leu Ser Glu Val Asp Arg Leu Ile Arg Ser Ile Gln Ala
    115                 120                 125Gly Ala Thr Pro Pro Glu Val Ala Glu Lys Ile Leu Asp Glu Leu Glu
130                 135                 140Gln Ser Pro Ala Ser Tyr Gly Phe Pro Val Ala Leu Leu Gly Trp Ala145                 150                 155                 160Met Met Gly Gly Ala Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Gly Trp Gln Val
            165                 170                 175Ser Leu Ile Ala Phe Ile Thr Ala Phe Thr Ile Ile Ala Thr Thr Ser
        180                 185                 190Phe Leu Gly Lys Lys Gly Leu Pro Thr Phe Phe Gln Asn Val Val Gly
    195                 200                 205Gly Phe Ile Ala Thr Leu Pro Ala Ser Ile Ala Tyr Ser Leu Ala Leu
210                 215                 220Gln Phe Gly Leu Glu Ile Lys Pro Ser Gln Ile Ile Ala Ser Gly Ile225                 230                 235                 240Val Val Leu Leu Ala Gly Leu Thr Leu Val Gln Ser Leu Gln Asp Gly
            245                 250                 255Ile Thr Gly Ala Pro Val Thr Ala Ser Ala Arg Phe Phe Glu Thr Leu
        260                 265                 270Leu Phe Thr Gly Gly Ile Val Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Gln Leu
    275                 280                 285Ser Glu Ile Leu His Val Met Leu Pro Ala Met Glu Ser Ala Ala Ala
290                 295                 300Pro Asn Tyr Ser Ser Thr Phe Ala Arg Ile Ile Ala Gly Gly Val Thr305                 310                 315                 320Ala Ala Ala Phe Ala Val Gly Cys Tyr Ala Glu Trp Ser Ser Val Ile
            325                 330                 335Ile Ala Gly Leu Thr Ala Leu Met Gly Ser Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe
        340                 345                 350Val Val Tyr Leu Gly Pro Val Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Thr Ala
    355                 360                 365Val Gly Phe Thr Gly Gly Leu Leu Ala Arg Arg Phe Leu Ile Pro Pro
370                 375                 380Leu Ile Val Ala Ile Ala Gly Ile Thr Pro Met Leu Pro Gly Leu Ala385                 390                 395                 400Ile Tyr Arg Gly Met Tyr Ala Thr Leu Asn Asp Gln Thr Leu Met Gly
            405                 410                 415Phe Thr Asn Ile Ala Val Ala Leu Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ala Ala
        420                 425                 430Gly Val Val Leu Gly Glu Trp Ile Ala Arg Arg Leu Arg Arg Pro Pro
    435                 440                 445Arg Phe Asn Pro Tyr Arg Ala Phe Thr Lys Ala Asn Glu Phe Ser Phe
450                 455                 460Gln Glu Glu Ala Glu Gln Asn Gln Arg Arg Gln Arg Lys Arg Pro Lys465                 470                 475                 480Thr Asn Gln Arg Phe Gly Asn Lys Arg
            485<210>43<211>440<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(417)<223>RXS03183<400>43gaa gcc gaa gca acc gca ggc aaa ttc gaa gta cag ccc ctc gta ggt    48Glu Ala Glu Ala Thr Ala Gly Lys Phe Glu Val Gln Pro Leu Val Gly1               5                  10                  15aaa gac ggc gtc ggc gta tcc acc ctt ggt ggc tac aac aac ggc atc    96Lys Asp Gly Val Gly Val Ser Thr Leu Gly Gly Tyr Asn Asn Gly Ile
         20                  25                  30aac gtc aac tcc gaa aac aag gca acc gcc cgc gac ttc atc gaa ttc    144Asn Val Asn Ser Glu Asn Lys Ala Thr Ala Arg Asp Phe Ile Glu Phe
     35                  40                  45atc atc aac gaa gag aac caa acc tgg ttc gcg gac aac tcc ttc cca    192Ile Ile Asn Glu Glu Asn Gln Thr Trp Phe Ala Asp Asn Ser Phe Pro
 50                  55                  60cca gtt ctg gca tcc atc tac gat gat gag tcc ctt gtt gag cag tac    240Pro Val Leu Ala Ser Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Val Glu Gln Tyr65                  70                  75                  80cca tac ctg cca gca ctg aag gaa tcc ctg gaa aac gca gca cca cgc    288Pro Tyr Leu Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Glu Asn Ala Ala Pro Arg
             85                  90                  95cca gtg tct cct ttc tac cca gcc atc tcc aag gca atc cag gac aac    336Pro Val Ser Pro Phe Tyr Pro Ala Ile Ser Lys Ala Ile Gln Asp Asn
        100                 105                 110gcc tac gca gcg ctt aac ggc aac gtc gac gtt gac cag gca acc acc    384Ala Tyr Ala Ala Leu Asn Gly Asn Val Asp Val Asp Gln Ala Thr Thr
    115                 120                 125gat atg aag gca gcg atc gaa aac gct tcc agc tagttcggta atttagttca  437Asp Met Lys Ala Ala Ile Glu Asn Ala Ser Ser
130                 135ttc                                                                440<210>44<211>139<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>44Glu Ala Glu Ala Thr Ala Gly Lys Phe Glu Val Gln Pro Leu Val Gly1               5                  10                  15Lys Asp Gly Val Gly Val Ser Thr Leu Gly Gly Tyr Asn Asn Gly Ile
         20                  25                  30Asn Val Asn Ser Glu Asn Lys Ala Thr Ala Arg Asp Phe Ile Glu Phe
     35                  40                  45Ile Ile Asn Glu Glu Asn Gln Thr Trp Phe Ala Asp Asn Ser Phe Pro
 50                  55                  60Pro Val Leu Ala Ser Ile Tyr Asp Asp Glu Ser Leu Val Glu Gln Tyr65                  70                  75                  80Pro Tyr Leu Pro Ala Leu Lys Glu Ser Leu Glu Asn Ala Ala Pro Arg
             85                  90                  95Pro Val Ser Pro Phe Tyr Pro Ala Ile Ser Lys Ala Ile Gln Asp Asn
        100                 105                 110Ala Tyr Ala Ala Leu Asn Gly Asn Val Asp Val Asp Gln Ala Thr Thr
    115                 120                 125Asp Met Lys Ala Ala Ile Glu Asn Ala Ser Ser
130                 135<210>45<211>1212<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌<220><221>CDS<222>(101)..(1189)<223>RXC00874<400>45agctgttccc taccattgct gaacgggagt ggattgtcac tttagcccct cacggattct  60tctggtttga tctcaccgcc gatgaaaagg acgatatgga atg agc att ggc caa    115
                                        Met Ser Ile Gly Gln
                                          1               5cac atc atc acc gag cgt ttc tac ggc gcc aag tcc cac acc atc gac    163His Ile Ile Thr Glu Arg Phe Tyr Gly Ala Lys Ser His Thr Ile Asp
             10                  15                  20aac gta gat att gtg ttg tcc cgc gaa tgt ggc gag aac act ttg gct    211Asn Val Asp Ile Val Leu Ser Arg Glu Cys Gly Glu Asn Thr Leu Ala
         25                  30                  35gta gtg cgc atc aac aat gcg ctg tat cag ttg ttg gtc aat gat gat    259Val Val Arg Ile Asn Asn Ala Leu Tyr Gln Leu Leu Val Asn Asp Asp
     40                  45                  50ggc aaa gat gtt ctc aac gac cac gta gaa gag gtc ggt gcg agt ttc    307Gly Lys Asp Val Leu Asn Asp His Val Glu Glu Val Gly Ala Ser Phe
 55                  60                  65gga gca tgg act ggc agc tct gct ttt ccc att ggc cct ttc act cca    355Gly Ala Trp Thr Gly Ser Ser Ala Phe Pro Ile Gly Pro Phe Thr Pro70                  75                  80                  85ctc ggc aca gaa caa tcc aat agc tct ttc atc acc gcc gac aat aaa    403Leu Gly Thr Glu Gln Ser Asn Ser Ser Phe Ile Thr Ala Asp Asn Lys
             90                  95                 100gcg atc gtg aaa tac ttc cgc aaa tta gaa tcc ggg caa aac ccc gat    451Ala Ile Val Lys Tyr Phe Arg Lys Leu Glu Ser Gly Gln Asn Pro Asp
        105                 110                 115gtg gag cta att tct aaa att tcc tcc tgc ccc aac atc gcg ccc atc    499Val Glu Leu Ile Ser Lys Ile Ser Ser Cys Pro Asn Ile Ala Pro Ile
    120                 125                 130ctg ggt ttt tcc tcc gct gag atc tcc ggg gct aac tac acc ctg gtc    547Leu Gly Phe Ser Ser Ala Glu Ile Ser Gly Ala Asn Tyr Thr Leu Val
135                 140                 145atg gcg cag cag tac gtt cca ggt ttg gat ggc tgg tca cac gcg ctg    595Met Ala Gln Gln Tyr Val Pro Gly Leu Asp Gly Trp Ser His Ala Leu150                 155                 160                 165act act acc tct ggc agc ttt gca gag gat gca gaa aag atc ggc gaa    643Thr Thr Thr Ser Gly Ser Phe Ala Glu Asp Ala Glu Lys Ile Gly Glu
            170                 175                 180gcc acc cgc aat gtt cac act gct ctt gca tcg gcc ttc cct act cgg    691Ala Thr Arg Asn Val His Thr Ala Leu Ala Ser Ala Phe Pro Thr Arg
        185                 190                 195gta gtt ccc gta gaa gca ctc gcc gat gcg ctc act acc cgc ctt aat    739Val Val Pro Val Glu Ala Leu Ala Asp Ala Leu Thr Thr Arg Leu Asn
    200                 205                 210gaa cta atc tcc caa gca ccc gaa atc gcc cgc ttc aaa gaa gca gcc    787Glu Leu Ile Ser Gln Ala Pro Glu Ile Ala Arg Phe Lys Glu Ala Ala
215                 220                 225atc gac ctc tac caa tcg ttg gaa ggc gaa gcc cac atc caa cgc atc    835Ile Asp Leu Tyr Gln Ser Leu Glu Gly Glu Ala His Ile Gln Arg Ile230                 235                 240                 245cac ggt gac ctc cac ttg ggg cag ctc atc aaa acc ccc gaa cgc tac    883His Gly Asp Leu His Leu Gly Gln Leu Ile Lys Thr Pro Glu Arg Tyr
            250                 255                  260atc ctc atc gat ttc gaa ggc gaa cct gcc cgc cca ctt aat caa cga    931Ile Leu Ile Asp Phe Glu Gly Glu Pro Ala Arg Pro Leu Asn Gln Arg
        265                 270                 275cgc ctc ccc gac tct ccc ctg aaa gat ctc gcc ggc atc atc aga tcc    979Arg Leu Pro Asp Ser Pro Leu Lys Asp Leu Ala Gly Ile Ile Arg Ser
    280                 285                 290atc gac tac gca gcc tac ttc gac ggc gaa cac acc caa tgg gcc aac    1027Ile Asp Tyr Ala Ala Tyr Phe Asp Gly Glu His Thr Gln Trp Ala Asn
295                 300                 305gaa gcc acc gcg cta ttc ctc gac ggc tac gga tca att gaa gac caa    1075Glu Ala Thr Ala Leu Phe Leu Asp Gly Tyr Gly Ser Ile Glu Asp Gln310                 315                 320                 325gaa ctc ctc aat gcc tac att ctg gac aag gcg ttg tac gag gtt gcc    1123Glu Leu Leu Asn Ala Tyr Ile Leu Asp Lys Ala Leu Tyr Glu Val Ala
            330                 335                 340tat gaa ata aac aac cgc ccc gac tgg gtg aaa atc cca ctc gag gcg    1171Tyr Glu Ile Asn Asn Arg Pro Asp Trp Val Lys Ile Pro Leu Glu Ala
        345                 350                 355gtc gaa agg ctt cta gac tagttagtta ctctgcgtca aac                  1212Val Glu Arg Leu Leu Asp
    360<210>46<211>363<212>PRT<213>谷氨酸棒状杆菌<400>46Met Ser Ile Gly Gln His Ile Ile Thr Glu Arg Phe Tyr Gly Ala Lys1               5                  10                  15Ser His Thr Ile Asp Asn Val Asp Ile Val Leu Ser Arg Glu Cys Gly
         20                  25                  30Glu Asn Thr Leu Ala Val Val Arg Ile Asn Asn Ala Leu Tyr Gln Leu
     35                  40                  45Leu Val Asn Agp Asp Gly Lys Asp Val Leu Asn Asp His Val Glu Glu
 50                  55                  60Val Gly Ala Ser Phe Gly Ala Trp Thr Gly Ser Ser Ala Phe Pro Ile65                  70                  75                  80Gly Pro Phe Thr Pro Leu Gly Thr Glu Gln Ser Asn Ser Ser Phe Ile
             85                  90                  95Thr Ala Asp Asn Lys Ala Ile Val Lys Tyr Phe Arg Lys Leu Glu Ser
        100                 105                 110Gly Gln Asn Pro Asp Val Glu Leu Ile Ser Lys Ile Ser Ser Cys Pro
    115                 120                 125Asn Ile Ala Pro Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ala Glu Ile Ser Gly Ala
130                 135                 140Asn Tyr Thr Leu Val Met Ala Gln Gln Tyr Val Pro Gly Leu Asp Gly145                 150                 155                 160Trp Ser His Ala Leu Thr Thr Thr Ser Gly Ser Phe Ala Glu Asp Ala
            165                 170                 175Glu Lys Ile Gly Glu Ala Thr Arg Asn Val His Thr Ala Leu Ala Ser
        180                 185                 190Ala Phe Pro Thr Arg Val Val Pro Val Glu Ala Leu Ala Asp Ala Leu
    195                 200                 205Thr Thr Arg Leu Asn Glu Leu Ile Ser Gln Ala Pro Glu Ile Ala Arg
210                 215                 220Phe Lys Glu Ala Ala Ile Asp Leu Tyr Gln Ser Leu Glu Gly Glu Ala225                 230                 235                 240His Ile Gln Arg Ile His Gly Asp Leu His Leu Gly Gln Leu Ile Lys
            245                 250                 255Thr Pro Glu Arg Tyr Ile Leu Ile Asp Phe Glu Gly Glu Pro Ala Arg
        260                 265                 270Pro Leu Asn Gln Arg Arg Leu Pro Asp Ser Pro Leu Lys Asp Leu Ala
    275                 280                 285Gly Ile Ile Arg Ser Ile Asp Tyr Ala Ala Tyr Phe Asp Gly Glu His
290                 295                 300Thr Gln Trp Ala Asn Glu Ala Thr Ala Leu Phe Leu Asp Gly Tyr Gly305                 310                 315                 320Ser Ile Glu Asp Gln Glu Leu Leu Asn Ala Tyr Ile Leu Asp Lys Ala
            325                 330                 335Leu Tyr Glu Val Ala Tyr Glu Ile Asn Asn Arg Pro Asp Trp Val Lys
        340                 345                 350Ile Pro Leu Glu Ala Val Glu Arg Leu Leu Asp
    355                 360

Claims (37)

1.分离的谷氨酸棒状杆菌核酸分子，其选自表1中所示的序列表中奇数编号的SEQ ID NO序列或其部分。
2.分离的核酸分子，其编码的多肽序列选自表1中所示的序列表中偶数编号的SEQ ID NO序列。
3.分离的核酸分子，其编码多肽的天然等位变体，其中所述多肽选自表1中所示的序列表中偶数编号的SEQ ID NO氨基酸序列。
4.分离的核酸分子，其包含这样的核苷酸序列或其部分，其中所述核苷酸序列基于其氨基酸序列至少63％同源于选自编码序列表中SEQ IDNO 2所示氨基酸序列的那些序列的核苷酸序列，或者基于其氨基酸序列所述核苷酸序列至少71％同源于选自编码如序列表中SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的那些序列的核苷酸序列。
5.分离的核酸分子，其包含如下核酸中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核酸包含选自表1中所示的序列表中奇数编号的SEQ ID NO序列的核苷酸序列。
6.分离的核酸分子，其在严格条件下可以与权利要求1-5中任意一项所述的核酸分子杂交。
7.分离的核酸分子，其包含权利要求1-6中任意一项所述的核酸分子或其部分及编码异源多肽的核苷酸序列。
8.DNA构建体，其包含权利要求1-7中任意一项所述的核酸分子和调控序列。
9.载体，其包含权利要求1-7中任意一项所述的核酸分子。
10.权利要求9的载体，其还包含一个或多个拷贝的相同或不同的核酸分子，其中所述的核酸分子为表4中与甲硫氨酸相关的核酸分子或表5中与海藻糖相关的核酸分子。
11.权利要求9或10中任意一项所述的载体，其为表达载体。
12.宿主细胞，其已被权利要求11的表达载体转染。
13.权利要求12的宿主细胞，其中所述细胞为微生物。
14.权利要求13的宿主细胞，其中所述细胞属于棒状杆菌属或短杆菌属。
15.权利要求12的宿主细胞，其中所述核酸分子的表达导致所述细胞的精细化学品产生被改变。
16.权利要求15的宿主细胞，其中所述精细化学品选自：有机酸、非蛋白原性氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基、核苷、核苷酸、脂类、饱和及不饱和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素、辅因子、聚酮化合物和酶。
17.产生多肽的方法，其包括在适当的培养基中培养权利要求12的宿主细胞，由此产生多肽。
18.分离的多肽，其包含选自表1中所示的序列表中偶数编号的SEQ IDNO序列的氨基酸序列。
19.分离的多肽，其包含含有以下氨基酸序列的多肽的天然等位变体，其中所述序列选自表1中所示的序列表中偶数编号的SEQ ID NO序列或其部分。
20.权利要求18或19中任意一项所述的分离多肽，其还包含异源氨基酸序列。
21.分离的多肽，其由包含如下核苷酸序列的核酸分子编码，其中所述序列至少63％同源于选自表1中所示的序列表中奇数编号的SEQ IDNO序列的核酸。
22.分离的多肽，其包含这样的氨基酸序列，该序列至少63％同源于选自表1中所示的序列表中偶数编号的SEQ ID NO序列的氨基酸序列。
23.产生精细化学品的方法，其包括培养含权利要求11的载体的细胞，由此产生精细化学品。
24.权利要求23的方法，其中所述方法还包括从所述培养物中回收精细化学品的步骤。
25.权利要求23的方法，其中所述方法还包括步骤：用权利要求11的载体转染所述细胞，以产生含所述载体的细胞。
26.权利要求23的方法，其中所述细胞属于棒状杆菌属或短杆菌属。
27.权利要求23的方法，其中所述细胞选自：谷氨酸棒状杆菌、力士棒状杆菌(Corynebacterium herculis)、百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)、嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、Corynebacterium acetoglutamicum、嗜乙酰棒状杆菌(Corynebacterium acetophilum)、产氨棒状杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、Corynebacterium fujiokense、Corynebacteriumnitrilophilus、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacterium butanicum、叉开短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、希氏短杆菌(Brevibacterium healii)、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium ketosoreductum、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、Brevibacterium linens、Brevibacteriumparaffinolyticum以及表2中所示的那些菌株。
28.权利要求23的方法，其中从所述载体进行的核酸分子的表达导致所述精细化学品的产生改变。
29.权利要求23的方法，其中所述精细化学品选自：有机酸、非蛋白原性氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基、核苷、核苷酸、脂类、饱和及不饱和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素、辅因子、聚酮化合物和酶。
30.权利要求23的方法，其中所述精细化学品为氨基酸或碳水化合物。
31.权利要求30的方法，其中所述氨基酸或碳水化合物选自甲硫氨酸或海藻糖。
32.用于产生精细化学品的方法，其包括培养其基因组DNA已通过包含权利要求1-7中任意一项所述的核酸分子而改变的细胞。
33.权利要求32的用于产生精细化学品的方法，其还包括一个或多个拷贝的相同或不同的核酸分子，其中所述核酸分子为表4中与甲硫氨酸有关的核酸分子或表5中与海藻糖有关的核酸分子。
34.用于在受试者中诊断白喉棒状杆菌的存在或活性的方法，其包括在受试者中检测序列表中SEQ ID NO 1至4之一个或多个序列的存在，由此诊断在受试者中白喉棒状杆菌的存在或活性。
35.宿主细胞，其包含选自序列表中奇数编号的SEQ ID NO核酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子被破坏。
36.宿主细胞，其包含选自序列表中奇数编号的SEQ ID NO核酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子与此序列表中奇数编号的SEQ ID NO序列相比包含一处或多处核酸修饰。
37.宿主细胞，其包含选自序列表中奇数编号的SEQ ID NO核酸序列的核酸分子，其中所述核酸分子的调控区相对于该分子的野生型调控区而言是改变的。
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