CN1615363A - 重组芽孢杆菌植酸酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明克隆并分析了来自于公认安全的微生物：地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌168的两种植酸酶基因。建立了植酸酶超表达及纯化的方法。这些酶的分子量约为48kDa(千道尔顿)，具有细胞外植酸酶水解活性。这些重组的酶可用于增强植酸酶在各种商业领域的应用，包括制备动物饲料和成熟生长、开花和结果速度增加的转基因植物。

Description

重组芽孢杆菌植酸酶及其用途
本申请对2001年11月21日提交、系列号为No.60/332,060的美国临时申请享有并要求优先权，其整体在此引入作为参考。
1.引言
本发明涉及来自于两种公认安全(GRAS)微生物-地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌168的植酸酶基因，和它们各自所编码的蛋白质产物及其片段、衍生物、类似物和变体。本发明还提供了生产和纯化植酸酶、衍生物、类似物、变体和抗体的方法。本发明还提供了这些植酸酶在动物饲料中的用途。本发明还提供了这两种植酸酶在中性pH时具有活性(“中性植酸酶”)的转基因植物及其他中性植酸酶。这些转基因植物的生长、开花及果实的生长增加。
2.发明背景
肌醇六磷酸盐(phytate)为植酸的盐形式(肌-肌醇1，2，3，4，5，6-六磷酸二氢盐，(myo-inositol 1，2，3，4，5，6-hexakis dihydrogen phosphate))，占谷类和豆类中总磷的80％以上，谷类及豆类与含油种子(oilseed)作物共占据全世界作物收获面积的90％以上(Reddy N.R.，Pierson M.D.，Sathe S.k.和Salunkhe D.K.，1989，豆类和谷类中的植酸酶，CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达)。尽管肌醇六磷酸盐是磷的储存形式，但其中的磷并不易为动植物所用，这是因为需要特异性的酶将肌醇六磷酸盐水解成无机磷酸盐。
植酸酶偏向于以肌醇六磷酸盐作为底物，可通过将肌醇六磷酸盐催化生成无机磷酸盐和磷酸肌醇并释放可被动植物利用的磷酸盐，使可利用的磷增加。
由于植酸酶在经济和环境方面的重要性，它的超表达(over-expression)是生物技术和酶生产工业中长期的、竞争性的课题。研究者们已找到使用最少的纯化步骤获得最高活性的酶的超表达的途径。早期对植酸酶表达的研究牵涉到从真菌来源提取和生产该酶。对于动物饲料来说，真菌来源直到现在仍是唯一的已知来源。
早在20世纪80年代，植酸酶就可在无花果曲霉/黑曲霉的细胞外培养基中表达(Ullah A.H.和Cummins B.J.，1988，无花果曲霉细胞外pH6.0最适酸性磷酸酶：纯化，N-末端氨基酸序列及生化特征，Preparative Biochemistry，18(1)：37-65)。Ullah等在同一年对该酶进行了广泛研究。直到现在，来自于黑曲霉的植酸酶仍然是最重要的商用植酸酶。在20世纪90年代，利用新的生物技术，在有望提高异源蛋白收率的外源菌株中表达重组蛋白，提高了该酶的产量。据报道，包括fusarium venenatum(Berka，R.M.，Rey M.W，Brown K.M，Byun T和Klotz A.V.，1998，来源于嗜热真菌fusarium venenatum的植酸酶基因的分子特征及表达，Applied and environmental microbiology，64(11)：4423-4427)、黑曲霉菌及其他曲霉菌(Pasamontes L，Haiker M，WyssM，Tessier M和Loon A.P.G.，1997，一种来源于真菌-烟曲霉菌的热稳定植酸酶的基因克隆、纯化及鉴定，Applied and environmentalmicrobiology，63(5)：1691-1700；NO.5,830,733、5,436,156和6,153,418号美国专利)、土生克雷伯菌(Greiner R.，Haller，E.，Konietzny U.和Jany K.D.，1997，来源于土生克雷伯菌的植酸酶的纯化和鉴定，Archives of Biochemistry and Biophysics，341(2)：201-206)、Thermomyces菌(No.5,866,118号美国专利)及Schwanniomycesoccidentalis(No.5,840,561号美国专利)在内的真菌菌株可表达大量具有明显活性的异源植酸酶。人们做了许多尝试用酶将肌醇六磷酸盐水解，中等程度地改善了饲料的营养价值，减少了动物排泄的磷，从而保护环境(Pen J.Verwoerd T.C.和Hoekema A.，1993，含植酸酶的转基因种子作为改善磷利用的全新饲料添加剂，Bio/Technology，11：811-814)。虽然用真菌生产植酸酶仍在继续，但其他研究团体已将其焦点转到在酵母(Mayer A.F.，Hellmuth，K.，Schlieker H.，UlibarriR.L，Oertel S.，Dahlems U.，Strasser A.W.M.Strasser和Loon A.P.G.M.，1998，一种表达系统成熟：一种利用多形汉森酵母重组菌株高效、低成本生产植酸酶的方法，Biotechnology and Bioengineering，63(3)：373-381；Han Y.，Wilson，D.B.和Lei X.G.，1999，黑曲霉植酸酶基因(phyA)在酿酒酵母中的表达，Applied and Evironmental microbiology.65(5)：1915-1918；Han Y和Lei X.G.，1999，糖基化对曲霉菌植酸酶在巴氏毕赤酵母中功能性表达的作用，Archives of Biochemistry andBiophysics，364(1)：83-90；Rodriguez E.，Mullaney E.J.和Lei X.G，2000，烟曲霉植酸酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及该重组酶的特性，Biochemical and Biophysical Research Communications，268：373-378)、植物(Ullah A.H.J.，Sethumadhavan K.，Mullaney E.J.，1999，表达于烟叶中的重组真菌植酸酶(phyA)的特征，Biochemical andBiophysical Research Communications，264：201-206)和肠道细菌-大肠杆菌(E.Coli)(Dassa J.，Marck C.和Boquet P.L.，1990，大肠杆菌appA基因的全核苷酸序列显示pH2.5酸性磷酸酶和葡萄糖-1-磷酸酶间具有显著的同源性，Journal of Bacteriology，172(9)：5497-5500；Ostanin K.，Harms E.H.，Stevis P.E.，Kuciel R.，Zhou M.M.和Van EttenR.L，1992，大肠杆菌酸性磷酸酶的过度表达、定点诱变及机制，Journalof Bacteriology，267(32)：22830-22836；以及Rodriguez E.，Han Y.和LeiX.G.，1999，从猪结肠分离出来的大肠杆菌酸性磷酸酶/植酸酶基因(appA2)的克隆、测序及表达，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，257：117-123)中表达植酸酶。也研究了其他来源于植物(Maugenest S.，Martinez I和Lescure A，1997，一种编码玉米种子植酸酶cDNA的克隆和鉴定，Biochemistry Journal，322：511-517)和哺乳动物(Craxto A.，Caffrey J.J.，Burkhart W.，Safrany S.T.和ShearsS.B.，1997，大鼠肝中多个肌醇多聚磷酸磷酸酶的分子克隆和表达，Biochemistry Journal，328：75-81)的植酸酶。
大肠杆菌和乳酸杆菌中的数种植酸酶基因，包括EcAP(Ostanin K.，Harms E.H.，Stevis P.E.，Kuciel R.，Zhou M.M.和Van Etten R.L.，1992，大肠杆菌酸性磷酸酶的过度表达、定点诱变及机制，Journal ofBacteriology，267(32)：22830-22836)、appA(Dassa J.，Marck C.和BoquetP.L，1990，大肠杆菌appA基因的全核苷酸序列显示pH2.5酸性磷酸酶和葡萄糖-1-磷酸酶间具有显著的同源性，Journal of Bacteriology，172(9)：5497-5500)、appA2(Rodriguez E.，Han Y.和Lei X.G.，1999，w从猪结肠分离出来的大肠杆菌酸性磷酸酶/植酸酶基因(appA2)的克隆、测序及表达，Biochemical and Biophysical Research Communications，257：117-123)及植物乳杆菌(Zamudio等，2001，植物乳杆菌植酸酶活性归功于其非特异性酸性磷酸酶，Lett.APP.Microbiol.32：181-184)，已识别和全部鉴定为酸性磷酸酶，在pH低于6.0时具有最佳酶活性。NO.6,183,740和6,190,897号美国专利公开了其他来源于大肠杆菌的植酸酶。
尽管真菌和大肠杆菌的植酸酶已经可以表达到具有实际意义的量，但这些酶的纯化方法复杂，另外，这些异源性表达的酶常常不能正确折叠。例如，已发现大肠杆菌不能表达起源于黑曲霉菌的活性植酸酶，因为大肠杆菌产生一种非糖基化的大分子量细胞内包涵体蛋白(Phillippy B.Q.和Mullaney E.J.，1997，黑曲霉菌植酸酶(phyA)在大肠杆菌中的表达，Journal of Agricultural Food Chemistry，45：3337-3342)。而且，大肠杆菌是一种具有感染动物胃肠道危险性的肠道细菌。
已知有数种芽孢杆菌(Bacillus)是GRAS细菌菌株。已从枯草芽孢杆菌菌株VTT E-68013(phyC；Kerovuo J.，Laurarus M.，Nurminen P.，Kalkkinen N.和Apajalahti J.，1998，一种来自于枯草芽孢杆菌的全新植酸酶的分离、鉴定、分子基因克隆及测序，Applied and EnvironmentalMicrobiology，64(6)：2079-2085，将其整体在此引入作为参考)和DS11(phyK；Kim Y.O.，Lee J.K.，Kim H.K.，Yu J.H.和Oh T.K.，1998，从芽孢杆菌DS11克隆热稳定的植酸酶基因(phy)及其大肠杆菌中的超表达，FEMS Microbiology Letters，162：82-191；以及NO.6,255,098号美国专利，在此将其整体引入作为参考)克隆出编码植酸酶的基因。这些报道表明，芽孢杆菌植酸酶与真菌、大肠杆菌、植物及哺乳动物植酸酶的特征性区别在于芽孢杆菌植酸酶不含在已知植酸酶中发现的保守RHGXRXP结构域序列(Kerovuo等，1998，同上；Kim等，1998，同上)。此外，来自于枯草芽孢杆菌的植酸酶的活性和热稳定性特异性地依赖于钙(Kerovuo等，2000，枯草芽孢杆菌植酸酶的金属依赖性，Biochem.Biophys.Res.Commun.268：365-369，将其整体在此引入作为参考)，这一点在任何其他报道的来源于真菌、大肠杆菌、植物和哺乳动物的植酸酶均未发现。而且，枯草芽孢杆菌植酸酶活性的最佳pH也不同于来自于真菌和大肠杆菌的植酸酶。许多报道证明，真菌和大肠杆菌的植酸酶是最佳pH为2.5(Rodriguez等，1999，同上；及Dassa等，1990，同上)到5.5(Han等，1999，同上)的酸性磷酸酶。相反，Kerovuo等(1998，同上)报道的枯草芽孢杆菌植酸酶活性最佳pH为7。因此，利用公认安全(GRAS)的细菌菌株生产植酸酶具有很大的实用性，其可以提供一种新而安全的植酸酶来源补充到商用饲料中。
Maugenest等(1997，一种编码玉米种子植酸酶cDNA的克隆和鉴定，Biochemistry Journal，322：511-517)报道了一种编码玉米种子植酸酶cDNA的克隆和鉴定。NO.6,291,224号美国专利公开了一种来源于玉米的植酸酶，NO.6,303,766号美国专利公开了来源于大豆的植酸酶，两者均已知为酸性植酸酶。但是，一般来说植物植酸酶正常情况下不能产生足够的量以适应产业化需求，而且通常在非发芽种子可检测到非常低的内源活性。细胞外的植酸酶活性明显不足以驱动(mobilizing)封闭(locked up)在土壤中的肌醇六磷酸盐。
植物可从水中获得碳、氢和氧进行光合作用，而磷、氮、金属离子、钙及微量元素主要从土壤获得。因此，土壤中的磷和氮可利用性成为植物生长的限制因子。主要以无机磷酸盐形式存在的磷由根从土壤中吸收，然后无机磷酸盐转运到植物的其他组织用于各种生物合成过程，包括DNA和RNA合成，等等。但是，大部分磷在植物中被封闭并以肌醇六磷酸盐的形式储存下来。对于植物来说，以肌醇六磷酸盐形式封闭的磷像土壤中的肌醇六磷酸盐一样不能为植物所利用。为了供应植物的营养需要，常在肥料中补充无机磷酸盐来促进植物的生长，这样又产生了环境的另一个污染源。
在植物中表达植酸酶的尝试还未产生有用的表型。一种来源于真菌-黑曲霉菌的酸性植酸酶(phyA)已成功在转基因烟草中表达(Ullah等，1999，同上)。从转基因烟草回收的重组植酸酶从催化活性来说与天然的植酸酶没什么差别，仅仅是最佳pH从pH5移到了4。同一基因在阿布属(Arabidopsis)获得超表达(Richardson等，2000，曲霉菌植酸酶从阿布属的根分泌至细胞外，使得植物可从肌醇六磷酸盐获取磷，Plant Journal 25(6)：641-649)。NO.6,022,846号美国专利公开了无花果曲霉、黑曲霉菌、泡盛曲霉、Aspergillus ridulans、及各种农作物果实、叶和根中酸性植酸酶的表达(也参见NO.5,900,525号美国专利)。这些酸性真菌植酸酶的细胞内表达在转化植物内不会产生任何有意义的表型变化。
包括猪和鸡在内的许多单胃动物用由大豆粗粉、玉米、小麦、大麦、米糠和芸苔(canola)粗粉组成的饲料喂养。既然大部分磷均封闭在肌醇六磷酸盐中，常常使用低最佳pH、主要来自真菌的外源植酸酶作为饲料添加剂。在动物饲料中引入表达活性植酸酶的转基因植物来代替外源植酸酶也可增强用此类饲料饲养的动物的磷酸盐利用率。因此，对通过基因工程可在植物中影响和创造生化途径的方法的需求仍继续存在。
3.发明概述
有效利用磷不仅对于植物和动物的生长很重要，对于减少由动物废物及肥料所致的环境污染也很重要，所述动物废物及肥料含有以肌醇六磷酸盐形式存在的不能利用的磷。为了利用各种食物来源中的磷，可将各种来源的植酸酶加入动物饲料中以便单胃动物可有效地利用磷，同时将更少的致污染磷排泄到环境中。如果在中性pH具有活性的植酸酶可以植物中表达，这些转基因植物也可明显提高生长速度，缩短成熟和/或开花时间。因此，需要这样的植酸酶，它在动物饲料和植物中表现出最佳活性，同时对于动物和植物的健康也是安全的。而且，需要生成大量的植酸酶以用于商业应用。
本发明部分地依赖于两种新植酸酶基因的发现(见图1和图2；SEQ ID NOS：1，2，3，4)和中性植酸酶的表达可促进植物生长、开花和结果这一观察结果，所述两种基因分别来自于两种微生物：地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌168。相应地，本发明涉及到来自于两种公认安全(GRAS)的微生物的，被分别命名为phyL和167phyA的两种植酸酶基因的核苷酸序列(分别为SEQ ID NOS：1和3；见图1A和图2A)，及其所编码的蛋白质的氨基酸序列以及其片段、衍生物、类似物和变体。相应地，本发明提供了分离或重组制备的植酸酶，它们分别源自于地衣芽孢杆菌(phyL，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，见图1B)和枯草芽孢杆菌菌株168(168phyA，具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列，见图2B)，及其片段、类似物、衍生物和变体，如本文所定义的，将其总称为“本发明的肽”或“本发明的蛋白质”。另外，本发明提供了编码本发明多肽的核酸分子，在此将其总称为“本发明的核酸”，它包括cDNA、基因组DNA和RNA。
正如本文所用的那样，将基因名字排成斜体指的是基因本身，而基因名字不排成斜体则指的是该基因所编码的蛋白质或多肽产物。例如，“Gene”应该指Gene基因，而“Gene”则指Gene基因所编码的蛋白质或多肽产物。
由此，本发明提供了分离的核酸分子，该核酸分子包括或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列约有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％与SEQID NO：1的核苷酸序列或其互补序列、SEQ ID NO：3或其互补序列相同，并编码具有phyL或168phyA活性的蛋白质或多肽。这些活性包括抗原性、免疫原性、催化活性(如植酸酶活性)及其他易于检测的活性。此外，这些活性还包括可在中性pH下发挥功能，尤其是其酶活性具有宽范围的最适温度，并在中性pH、各自的最适温度下具有最高的活性(见图7B及6.4部分，见下文)。而且应表现出良好的热稳定性，尤其是在Ca2+存在的条件下。在特定的实施方案中，这样的核酸分子不包括编码phyC(SEQ ID NO：21)、phyK(SEQ ID NO：23)以及长度分别为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360或380个氨基酸残基的phyC(SEQ IDNO：22)、phyK(SEQ ID NO：24)并具有植酸酶催化活性的片段的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的核酸分子，该核酸分子包括或由SEQID NO：1、SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其互补序列中约25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多相邻核苷酸组成，其中所述互补序列编码具有一个或更多phyL或168phyA活性的蛋白质或多肽。在特定的实施方案中，这样的核酸分子不包括编码phyC(SEQ ID NO：21)、phyK(SEQ ID NO：23)以及长度分别至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360或380个氨基酸残基的phyC(SEQ ID NO：22)、phyK(SEQ ID NO：24)并具有植酸酶催化活性的片段的核苷酸序列。
本发明提供了分离的多肽或蛋白质，它们由一种核酸序列编码，所述核酸序列包含或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列至少约有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列、SEQ ID NO：3的核苷酸序列或其互补序列相同，其中这些蛋白质或多肽也表现出本发明多肽的至少一个结构和/或功能特性。所述的本发明多肽功能特性包括抗原性、免疫原性、催化活性及其他易于检测的活性。在特定的实施方案中，这样的多肽或蛋白质不包括分别由phyC(SEQ ID NO：21)，phyK(SEQ ID NO：23)的核苷酸序列，以及长度至少为25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1280个核苷酸的phyC(SEQ IDNO：21)片段和长度为至少25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650或1700个核苷酸的phyK(SEQ IDNO：23)片段编码的多肽或蛋白质。
本发明提供了分离的多肽或蛋白质，它们由一种核酸序列编码，所述核酸分子包含或由以下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、3的核苷酸序列或其互补序列中至少约25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多相邻核苷酸，其中这些蛋白质或多肽也至少表现出本发明多肽的一个结构和/或功能特性。在具体的实施方案中，这样的多肽或蛋白质不包括分别由phyC(SEQ ID NO：21)、phyK(SEQ ID NO：23)，长度至少为15、30、45、60、90、120、180、240、300、420、540、780、1020、1140、1260或1280个核酸的phyC(SEQID NO：21)片段，以及长度至少为15、30、45、60、90、120、180、240、300、420、540、780、1020、1140、1260、1280、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650或1700个核酸的phyK(SEQID NO：24)片段编码的多肽或蛋白质。
本发明也提供了分离的核酸分子，它们包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中该蛋白质的氨基酸序列至少有约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％与SEQ ID NO：2或4或该蛋白的片段、衍生物、类似物或变体的氨基酸序列相同，并表现出phyC和phyK的抗原性、免疫原性、催化活性及其他易于检测的活性。在特定的实施方案中，这样的核酸分子不包括编码phyC(SEQ ID NO：21)、phyK(SEQ ID NO：23)以及长度至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基的phyC(SEQ ID NO：22)片段和长度至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基phyK(SEQ ID NO：24)片段的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的核酸分子，或其互补序列，所述核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质的序列包含SEQID NO：2或4或其片段、衍生物、类似物或该蛋白变体中至少约10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或更多相邻氨基酸，或由这些相邻氨基酸组成，并表现出phyC和phyK的抗原性、免疫原性、催化活性及其他易于检测的活性。在特定的实施方案中，这样的核酸分子不包括编码phyC(SEQ ID NO：21)、phyK(SEQ ID NO：23)，以及长度至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基的phyC(SEQ ID NO：22)片段和长度至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基phyK(SEQ ID NO：24)片段的核苷酸序列。
此外，本发明还提供了分离的多肽或蛋白质，它们包含至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％与SEQ ID NO：2或4或该蛋白片段、衍生物、类似物或变体的氨基酸序列相同的的氨基酸序列，其中这些蛋白质或多肽也表现出本发明多肽的至少一个结构和/或功能特性。在特定的实施方案中，这样的多肽或蛋白质不包括分别由phyC(SEQ ID NO：21)、phyK(SEQ ID NO：23)的核苷酸序列编码的多肽或蛋白质，以及长度分别至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基的phyC(SEQ ID NO：22)和phyK(SEQ ID NO：24)片段。
本发明也提供了分离的多肽或蛋白质，它们包含了SEQ ID NO：2或4或其片段、衍生物、类似物或该蛋白变体中至少约10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或更多相邻氨基酸的氨基酸序列，其中这些蛋白质或多肽也表现出本发明多肽的至少一个结构和/或功能特性。在特定的实施方案中，这样的多肽或蛋白质不包括分别由phyC(SEQ IDNO：21)、phyK(SEQ ID NO：23)的核苷酸序列编码的多肽或蛋白质，以及长度分别至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基的phyC(SEQ ID NO：22)和phyK(SEQ ID NO：24)片段。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，该核酸分子在本文定义的严格条件下与具有SEQID NO：1或3序列或其互补序列的核酸杂交，其中该核酸分子编码表现出本发明多肽至少一种结构和/或功能特性的蛋白质或多肽。
此外，本发明也提供了适于用作引物或杂交探针的核酸分子，这些引物或杂交探针用来检测编码本发明多肽或与本发明多肽类似的其他序列的核酸。
本发明的另一方面提供了包含本发明核酸分子的载体，如重组表达载体。而且本发明也提供了包含这样载体或被改造成包含和/或表达本发明核酸分子的宿主细胞，以及包含操纵性连接于异源启动子的本发明核苷酸序列的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为芽孢杆菌，优选枯草芽孢杆菌MU331。在具体实施方案中，这样的异源启动子为强原噬菌体启动子。
本发明还提供了利用重组DNA技术制备本发明多肽的方法，该方法包括培养宿主细胞，产生和分离本发明的多肽，其中所述宿主细胞包含编码本发明多肽的重组表达载体，或操纵性连接于异源启动子的编码本发明多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞为芽孢杆菌，优选枯草芽孢杆菌MU331。在具体实施方案中，本发明提供了一种利用105噬菌体超表达系统快速生产大量本发明多肽的方法。
本发明的另一方面是提供包含本发明多肽的动物饲料及其制备方法，其中本发明多肽将磷从肌醇六磷酸盐中释放出来，供动物利用。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含一种核酸分子的转基因植物，其中所述核酸编码在中性pH具有催化活性的植酸酶。在一个特定的实施方案中，本发明提供了包含本发明核酸分子的转基因植物，所述核酸分子表达本发明的植酸酶或其具有功能活性的片段、同系物(homolog)或类似物，或编码来源于芽孢杆菌的植酸酶。在优选实施方案中，植酸酶在细胞内表达。在另一个优选实施方案中，植酸酶在细胞外表达，例如从转基因植物的根部表达。所表达的植酸酶在中性pH下具有活性，并使植物将磷从储存于植物或环境(如土壤)中的肌醇六磷酸盐释放出来。本发明也提供了生成此类转基因植物的方法。
本发明还提供了与本发明多肽免疫特异性结合的抗体。这样的抗体包括但不局限于可与本发明多肽免疫特异性结合、来源于各种动物的抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fvs，包含VL或VH结构域或包含补体决定区(CDR)的片段。
在一个实施方案中，本发明提供了检测诸如细胞、培养基等生物材料中本发明多肽或类似多肽存在与否、活性或表达的方法。将生物材料与可直接或间接检测本发明多肽存在与否、活性或表达的试剂接触，可以测定与对照样品相比样品中多肽的活性或表达水平的升高或降低。在具体实施方案中，这样的试剂是免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段。在另一具体实施方案中，这样的试剂是肌醇六磷酸盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含生物活性分子及本发明多肽一个或多个结构域或其片段的融合蛋白。特别地，本发明提供了包含与本发明多肽一个或多个结构域或其片段进行重组融合或化学结合(包括共价及非共价结合)的生物活性分子的融合蛋白。
3.1定义
术语“酸性的”或“酸性pH”在这里指小于6.0、小于5.5、小于5.0及小于4.0的pH值。
术语“类似物”在这里指具有与phyL或168phyA、phyL或168phyA片段类似或相同功能的多肽，但不一定包含与phyL或168phyA、phyL或168phyA片段类似或相同的氨基酸序列或与phyL或168phyA、phyL或168phyA片段类似或相同的结构，也不一定是抗体或抗体片段。含有类似氨基酸序列的多肽指至少满足下列条件中其中一条的多肽：(i)多肽含有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％与phyL或168phyA、phyL或168phyA片段氨基酸序列相同的氨基酸序列，而且该多肽不是phyC，也不是phyK，也不是长度至少为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基的phyC或phyK片段；(ii)由至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％与编码phyL或168phyA、phyL或168phyA片段之核苷酸序列相同的核苷酸序列所编码的多肽，而且该多肽不是phyC，也不是phyK，也不是phyC或phyK的片段；(iii)由在严格条件下与核苷酸序列杂交的核苷酸所编码的多肽，其中所杂交的核苷酸编码phyL或168phyA，phyL或168phyA片段，或其中的至少10个氨基酸残基、15个氨基酸残基、20个氨基酸残基、25个氨基酸残基、40个氨基酸残基、80个氨基酸残基、90个氨基酸残基、100个氨基酸残基、125个氨基酸残基、150个氨基酸残基、175个氨基酸残基、200个氨基酸残基、225个氨基酸残基、250个氨基酸残基、275个氨基酸残基、300个氨基酸残基、325个氨基酸残基、350个氨基酸残基、375个氨基酸残基，而且该多肽不是phyL或168phyA，phyL或168phyA片段。表现出与phyL或168phyA，phyL或168phyA片段相似的抗原性、免疫原性、催化活性及其他易于检测的活性，具有相似结构和功能的多肽，是指具有与phyL或168phyA，phyL或168phyA片段类似的二级、三级或四级结构的多肽。多肽的结构可用本领域内熟练技术人员所知的方法来测定，这些方法包括但不限于X射线晶体学、核磁共振及晶体成像电子显微镜，多肽的功能可用各种分析测定其生物学活性而确定。
术语“与phyL或168phyA免疫性特异性结合的抗体或抗体片段”在这里指与phyL或168phyA，phyL或168phyA片段免疫性特异性结合而不与其他多肽发生非特异性结合的多肽及其片段。优选的与phyL或168phyA，phyL或168phyA片段免疫性特异性结合的抗体及其片段不与其他抗原发生交叉反应。可用诸如免疫测定或其他本邻域内熟练技术人员已知的方法来鉴定与phyL或168phyA，phyL或168phyA片段免疫性特异性结合的抗体及其片段。与phyL或168phyA免疫性特异性结合的抗体及其片段也可分别称为“抗phyL抗体”或“抗168phyA抗体”。
术语“衍生物”在这里指对给定肽或蛋白修饰后的肽或蛋白质，如将任意类型分子共价粘附到肽或蛋白上，包括导入非天然生成的氨基酸，优选具生物活性的物质。所得的生物活性保留原有肽或蛋白的一个或多个生物活性。
术语“片段”在这里指含有相关核酸分子中至少约25、30、35、40、45、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个或更多相邻核苷酸的核酸分子片段，并含有该核酸分子至少一种功能特性(或所编码的蛋白含有该核酸分子所编码蛋白的一种功能特性)；或指含有长度为相关蛋白质或多肽中至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340或360个氨基酸残基的蛋白质片段或多肽，并含有该蛋白或多肽的至少一种功能特性。
术语“公认安全(GRAS)”在这里指某一物质的特性就其计划用途来说被食品和药品监督管理局(FDA)归属于“公认安全”。只要执行“生产质量管理规范”，这样的物质就可以用于食物生产。酶制品的GRAS状态可在提交文档的基础上由FDA授予。GRAS状态与那些来自于植物及动物的酶相称，也与那些来自于已长期用作人用酶源而不导致严重健康问题的微生物的酶相称。
“分离的”或“纯化的”肽或蛋白基本上不含细胞材料或来源于该蛋白来源之细胞或组织的其他污染蛋白，或者化学合成时不含化学前体或其他化学物质。“基本上不含细胞材料”这一措辞包括从细胞组分分离的多肽或蛋白制品，其中细胞组分来自所述细胞。因此，基本上不含细胞材料的多肽或蛋白质包括含有少于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(以干重计算)污染蛋白的多肽或蛋白质。当多肽或蛋白为重组生成时，也优选为基本上不含培养基，即培养基的含量约少于蛋白制品的20％、10％、5％。当多肽或蛋白通过化学合成生成时，优选为基本上不含化学前体或其他化学物质，即它与参加该蛋白合成的化学前体或其他化学物质是分开的。相应地，这样的多肽/蛋白质制品，除了目的多肽/蛋白质片段之外的化学前体或其他化合物含量少于约30％、20％、10％、5％(以干重计算)。在本发明的一个优选实施方案中，多肽/蛋白质是分离或纯化的。
“分离”的核酸分子是与其他存在于该核酸分中天然来源的核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离”的核酸分子如cDNA分子，用重组技术生成时也可基本上不含其他细胞材料或培养基，化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质，但存在于重组DNA文库的核酸分子除外。在一个优选实施方案中，编码本发明多肽/蛋白质的核酸分子是分离或纯化的。
“中性pH”在这里指值介于约5.55至8.5间的pH值，优选的中性pH为约6.0～约8.0，更优选的中性pH为约6.5～约7.5，最优选约为7.0。
术语“操纵性连接”在这里指当转录在“操纵性连接”启动子控制下产生一条具有功能的信使RNA，其翻译的结果是产生了与该启动子操纵性连接的DNA所编码的多肽。
术语“在严格条件下”指彼此之间至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％相同的核苷酸序列相互杂交的杂交和洗脱条件。例如，这样的杂交条件可见：当代分子生物学方案，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6；分子生物学基础方法，ElsevierScience Publishing Co.，Inc.，N.Y.(1986)，75-78页及84-87页；分子克隆，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)，387-389页，这些均为本领域内熟练技术人员所熟知，但并不局限于这些。一个优选的、非限制性严格杂交条件的实例是在6X氯化钠/枸橼酸钠(SSC)、0.5％SDS中于约68℃的温度下杂交，然后在2X SSC、0.5％SDS中于室温洗涤一次或多次。另一个优选的、非限制性严格杂交条件的实例是在6X氯化钠/枸橼酸钠(SSC)中于约45℃的温度下杂交，然后在0.2X SSC、0.1％SDS中于50～65℃洗涤一次或多次。
术语“变体”在这里指给定肽天然存在的等位基因变体，或给定肽或蛋白中一个或多个氨基酸残基经过氨基酸替换、插入或缺失等修饰的重组制备变体。
4.附图简述
下面的图阐明了本发明的实施方案，并不限制权利要求书包括的本发明范围。
图1A和图1B分别显示phyL(SEQ ID NO：1)的序列和phyL(SEQID NO：2)的氨基酸序列。
图2A和图2B分别显示168phyA(SEQ ID NO：3)的序列和168phyA(SEQ ID NO：4)的氨基酸序列。
图3描绘了PCR克隆phyL的策略。DP代表用于兼并PCR的兼并引物，IP代表反向PCR引物。先进行兼并PCR然后进行反向PCR来克隆phyL基因。反向PCR的片段与从该基因上游区域(5’至ATG翻译启始密码子)至终止密码子之间克隆的全长基因进行对比。
图4A和图4B显示用于植酸酶过生产的表达载体的构建体。(A)显示了用于枯草芽孢杆菌168植酸酶超表达的表达质粒。构建体携带有105启动子，后面接有一段Shine-Delgarno(SD)序列、天然168phyA基因及其天然终止子。(B)显示了用于地衣芽孢杆菌植酸酶超表达的表达质粒。构建体携带有105启动子，后面接有一段SD序列、天然phyL基因及来自于地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶终止子。
图5A和5B显示了两种植酸酶的表达水平。样品直接取自细菌培养物，离心后装入10％SDS-聚丙烯酰胺柱。细菌培养物于孵育前及热孵育0至5小时后收集。可发现热孵育后随着时间的增加酶的产量增加。LRM为含参考蛋白质大小的低分子量标记(BIO-RAD，香港)，在梯度的左边标记。(A)显示了168phyA所编码酶的表达。(B)显示了phyL所编码酶的表达。
图6A和6B显示两种植酸酶的酶活性。(A)根据每毫升所收集培养基中的酶单位评估酶活性，(B)根据各单独反应中所用每毫克酶中的酶单位来表示酶活性。
图7A和7B描绘了本发明中酶的温度和pH情况。根据Engelen等(1994，植酸酶活性的简便、快速测定，Journal of AOAC International，77(3)：760-764)所述方法测定植酸酶的活性，只是将检测的量减至1毫升。通过测定405nm处的光密度来进行比色。孵育时间定为30分钟。所有反应均补充5mM的CaCl2以确保其酶活性。
图8为植物表达载体的构建策略。将去除了天然信号肽序列的168phyA基因克隆入pBI221载体的BamHI和SacI位点，取代了大肠杆菌β-D-葡萄糖醛酸甙酶(GUS)基因。携带168phyA基因表达盒的HindIII/EcoRI片段从质粒pBI221释放出来并亚克隆入pCAMBIA1300双链载体的BamHI和SacI位点，以生成重组克隆pCX0168phA。
图9是pCX168phA表达载体的示意图。168phA：来自于枯草芽孢杆菌168株的植酸酶基因；CaMV：菜花样花叶病毒的35S启动子；CaMV35S多聚腺苷酸信号：来自于菜花样花叶病毒3’UTR的多聚腺苷酸信号；KanR：卡那霉素耐药性；NOS：胭脂碱合酶基因；pBR322ori：来自于pBR322的复制起点；pVS1-REP：来自于pVS1的复制起点；pVS1-STA：来自于pVS1质粒的STA区；T-border(R)：T-DNA重复序列的右侧边界。来自于pVS1的rep和sta区存在(Ajdukiewicz等，1994，Plant Molecular Biology，25：989-994)可增强这些载体在土壤杆菌中的稳定性，即使其生长于非选择性培养基中。
图10A和10B分别显示潮霉素基因(A)和168phA基因(B)在转基因烟草中的筛选。(A)泳道1：1KB加(plus)DNA梯度；泳道2：作为阴性对照的未转化烟草；泳道3-4：仅用pCAMBIA 1300载体转化的转基因烟草(对照)；泳道5-8：004的转基因烟草系(0041、0042、0043、0044)；泳道9-12：013的转基因烟草系(0131、0132、0133、0134)。(B)泳道1：1KB标记物；泳道2-3：作为阳性对照的pCX-168phA对照质粒；泳道4：作为阴性对照的未转化烟草；泳道5-6：仅用pCAMBIA 1300载体转化的转基因烟草(对照)；泳道7-10：004的转基因烟草系(0041、0042、0043、0044)；泳道11-14：013的转基因烟草系(0131、0132、0133、0134)。
图11显示了F0转基因烟草的RNA分析。从植物提取的总RNA取20μg进行1％(w/v)琼脂糖电泳。用DIG-PCR试剂盒(RocheDiagnostics，香港)标记的168phA cDNA作为探针。在转基因系中(0042、0043和0134)检测到了mRNA信号，但在对照系中未检测到。
图12显示了转基因烟草的蛋白质分析。每孔加入30μL从烟草叶中分离的可溶性蛋白。在转基因烟草样品0042、0043和0134中检测到了植酸酶，但在对照植物中未检测到。
图13显示了转基因烟草植物(图13b-13d)和对照植物(仅用载体转化的转基因植物，图13a)开花茎的数目。
图14显示了转基因烟草植物(图14a-14c)和对照植物(图14d)主茎的数目。
图15显示了F1转基因烟草的DNA印迹分析。各泳道加入10μg来自于各种F1系基因组DNA的HindIII限制性消化产物。用PCR试剂盒进行放射性标记的168phyA cDNA作为探针。在转基因系(0042和0134)中检测到了特异性的条带，但在对照系中未检测到。来自于0042的F1系(42-1和42-2)包含单拷贝的基因，而来自于0134的F1系(134-1)则含有两个拷贝。
图16显示了F1转基因烟草的RNA分析。从植物提取的总RNA取20μg进行1％(w/v)琼脂糖电泳。用DIG-PCR试剂盒(RocheDiagnostics，香港)标记的168phA cDNA作为探针。在转基因系中(0042和0134)检测到了mRNA信号，但在对照系中未检测到。
图17显示了F1转基因烟草的蛋白质分析。每孔加入10μg从烟草叶中分离的可溶性蛋白。在来自于0042的F1样品中检测到了植酸酶，但在对照系的F1样品中未检测到。
图18显示了在磷酸盐缺乏条件下F2转基因烟草幼苗的生长情况。F2幼苗在MS培养基(含1.25mM磷酸盐和30g/L蔗糖)中生长15天，然后转移到修正MS培养基(不含磷酸盐，蔗糖浓度降至5g/L)继续生长17天。发现转基因系的生物量多于对照系。
图19显示了低磷酸盐条件下转基因烟草幼苗在琼脂中的生长情况。幼苗先在含10-3M或10-5M磷酸盐的MS琼脂培养基生长20天，然后在含10-3M、10-4M或10-5M磷酸盐的MS琼脂培养基再生长30天。将植物干燥，各自称重。各柱为18棵个体植物的平均值(N＝18)。
图20显示了低磷酸盐条件下转基因烟草幼苗在流体培养基中的生长情况。幼苗先在含1.25mM磷酸盐的MS0培养基生长10天，然后在含0.01mM或0.1mM磷酸盐的MS流体培养基中再生长20天。将植物干燥，各自称重。各柱为25棵个体植物的平均值(N＝25)。在低磷酸盐条件下，转基因系(0042和0134)所得干重比对照系要重。
图21显示转基因植物中的内源植酸酶活性升高。将提取的叶蛋白(200μg)与外源IP6(400μg)一起37℃孵育4、6和8小时。然后用阴离子交换层析纯化肌醇磷酸盐(IP6、IP5、IP4和IP3)，用HPLC分析并用屈光指数检测器测定各自的IP6及IP5峰。如图所示，42系的植物提取物(N＝4)所得IP6/IP5比值比对照植物的比值(N＝4)低，说明转基因植物具有比对照植物更高的内源性植酸酶活性。
5.发明详述
5.1 PhyL和168phyA
现已在枯草芽孢杆菌168的基因组中发现与枯草芽孢杆菌中两种已公开植酸酶具有高度序列同源性的开放阅读框(ORF)。如第6.3部分所述，表达的克隆168phyA表现为分子量(MW)为44kDa的成熟植酸酶168phyA，分子量由SDS-PAGE测定(见图5A)。利用基于168phyA、phyK(Kim Y.O.等，1998，从Baillus sp.DS11从克隆热稳定的植酸酶基因(phy)及其在大肠杆菌中的超表达，FEMSMicrobiology Letters：162：182-191)和phyC(Kerovuo J.等，1998，一种来自于枯草芽孢杆菌的全新植酸酶的分离、鉴定、分子基因克隆及测序，Applied and Environmental Microbiology，64(6)：2079-2085)之间保守氨基酸序列的兼并寡核苷酸，通过兼并PCR从地衣芽孢杆菌克隆了phyL。从核苷酸序列推断出的氨基酸序列表明它是一种381个氨基酸残基的蛋白，并且象168phyA和其他枯草芽孢杆菌植酸酶一样没有真菌及大肠杆菌植酸酶中发现的高度保守RHGXRXP序列基序。SDS-PAGE测定的phyL分子量约为47kDa(见图5B)。
本发明两种植酸酶的活性用Engelen A.J.等所述检测方法(1994，植酸酶活性的简便、快速测定，Journal of AOAC International，77(3)：760-764)测定。结果表明，对于酶活性来说，168phyA和phyL均有着宽的最佳温度范围，phyL在65℃、168phyA在55℃达到峰值(见图7B和下文的第6.4部分)。而且，本发明的两种酶均展现出良好的热稳定性，尤其是在有Ca2+存在时(见第6.4部分)。本发明多肽的这些特征，即宽最适温度范围、良好热稳定性及中性pH下具有最佳酶活性，提示这些多肽如5.10部分讨论的那样具有很大的商业用途。
因此，本发明提供了分别具有SEQ ID NOS：1和3、phyL和16phyA序列的核酸分子，及其所编码分别含有SEQ ID NOS：2和4、phyL和168phyA的多肽。
5.2 phyL和168phyA的类似物、衍生物及变体
除了上述核酸分子及多肽之外，本发明的核酸分子和多肽还包括那些具有与本发明上述核酸分子及多肽相同生物活性、类似或相同结构域和/或足够多核苷酸序列或氨基酸相同(类似物)的核酸分子和多肽。
本发明多肽的共同生物活性包括抗原性、免疫原性、催化活性尤其是中性pH下的催化活性及其他熟练技术人员易于检测的活性。
含有类似氨基酸序列的多肽指至少满足下列条件中的一条的多肽：(i)具有与phyL(SEQ ID NO：2)或168phyA(SEQ ID NO：4)、phyL或168phyA片段氨基酸序列有至少30％、至少3 5％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列的多肽，并且具有本发明多肽的至少一个功能特性，而且该多肽不是phyC，也不是phyK，也不是phyC或phyK的片段；(ii)由与编码phyL(SEQ ID NO：1)或168phyA(SEQ ID NO：3)、phyL或168phyA片段的核苷酸序列有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的核苷酸序列所编码的多肽，并且具有本发明多肽的至少一个功能特性，而且该多肽不是phyC，也不是phyK，也不是phyC或phyK的片段；(iii)由本文所定义严格条件下与核苷酸序列杂交的核苷酸所编码的多肽，其中所杂交的核苷酸编码phyL(SEQ ID NO：1)或168phyA(SEQ ID NO：3)，或编码具有本发明多肽至少一个功能特性的phyL或168phyA片段，或编码其中的至少10个氨基酸残基、15个氨基酸残基、20个氨基酸残基、25个氨基酸残基、40个氨基酸残基、80个氨基酸残基、90个氨基酸残基、100个氨基酸残基、125个氨基酸残基、150个氨基酸残基、175个氨基酸残基、200个氨基酸残基、225个氨基酸残基、250个氨基酸残基、275个氨基酸残基、300个氨基酸残基、325个氨基酸残基、350个氨基酸残基、375个氨基酸残基，而且该多肽既不是phyL或168phyA也不是phyL或168phyA片段。具有与phyL或168phyA，phyL或168phyA片段类似结构的多肽，是指具有与phyL或168phyA，phyL或168phyA片段类似的二级、三级或四级结构的多肽。多肽的结构可用本领域内熟练技术人员所知的方法来测定，这些方法包括但不限于X射线晶体学、核磁共振及晶体成像电子显微镜。在一优选实施方案中，本发明的多肽来源于芽孢杆菌细胞的GRAS菌株。
本发明也包括本发明多肽的衍生物。例如，衍生物可包括经过修饰的肽或蛋白质，如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化，使用已知的保护/封闭基团、蛋白裂解、连接上细胞配基或其他蛋白等来使其衍生化，但并不局限于此。可利用已知的技术实施大量化学修饰，这些技术包括但不局限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰基化，等等。此外，衍生物可包含一个或多个非经典氨基酸。
另一方面，本发明分离的核酸分子编码本发明多肽的变体，其中氨基酸序列经基因工程修饰，使该肽的活性升高或降低或其局部结构发生改变而不明显改变其生物活性。一方面，这些变体可作为激动剂或拮抗剂。激动剂可基本保持与本发明多肽相同或其部分生物活性，而拮抗剂可抑制本发明多肽的一个或多个活性。这样的修饰包括氨基酸替换、删除和/或插入。氨基酸修饰可用本领域内任何已知方法完成，各方法对于那些本领域内熟练技术人员来说便于使用并常规。
例如，可根据本领域内任何已知的技术完成诱变，包括但不限于合成指定需修饰多肽中一个或多个修饰的寡核苷酸。定点诱变可用特异的寡核苷酸序列完成，其中寡核苷酸序列除了多肽中足够数量邻近核酸之外还编码包含所需要突变的核苷酸序列。这样的寡核苷酸序列可以充当能在横断(traversed)的缺失连接处两端均形成稳定双链结构的引物。典型地，优选长约为17至75个核苷酸或更长的引物，其中序列的连接处两端约有10至25个或更多残基发生改变。在一个或多个位置引入大量不同突变的许多引物都可用于生成突变体文库。
正如各种出版物所述，定点诱变的技术在本领域内众所周知(如Keunkel等，Methods Enzymol.，154：367-82，1987，在此将其整体引入作为参考)。一般地，定点诱变的完成首先要获得单链载体或双链载体中两条链的解旋部分，其中载体的序列包括编码所需肽的DNA序列。通常通过合成来制备含所需突变序列的寡核苷酸引物。将引物与单链一起退火，然后与DNA聚合酶如T7 DNA聚合酶接触，以完成含突变链的合成。这样就形成异源双链，其中一条链编码原始的非突变序列，第二条链含有所需的突变。然后将些异源双链用于转化或转染适当的细胞如大肠杆菌，并挑选包括重组载体的克隆，其中该重组载体带有突变的序列排列。正如可理解的那样，该技术一般采用既存在单链形态也存在双链形态的噬菌体载体。可在定点诱变中应用的典型载体包括诸如M13噬菌体之类的载体。这些噬菌体易于从商业途径获得，其用法通常也为本领域内熟练技术人员所知。取消了将目的基因从质粒转移到噬菌体这一步骤的双链质粒也可常规用于定点诱变。
另外，利用商用热稳定酶如Taq DNA聚合酶的PCR方法，将致突变的寡核苷酸引物引入可克隆入合适克隆载体或表达载体的扩增片段。例如，关于PCR介导的突变程序，可参见Tomic等，Nucleic AcidsRes.，18(6)：1656，1987；及Upender等，Biotechniques，18(1)：29-30，32，1995，将其整体在此引入作为参考。还通过利用热稳定连接酶和热稳定聚合酶的PCR，将磷酸化的突变寡核苷酸引入可克隆入合适克隆载体或表达载体的扩增片段(例如可见Michael，Biotechinques，16(3)：410-2，1994，在此将其整体引入作为参考)。还可以使用其他本领域内熟练技术人员已知的、生成给定多肽或其片段变体的方法。例如，编码所述多肽或其片段氨基酸序列的重组载体可以用突变试剂如羟胺加以处理，获得序列变体。
待修饰的氨基酸残基优选为暴露于表面的残基。另外，在进行氨基酸替换时优选的待替换氨基酸为保守氨基酸替换，例如，用极性残基替换极性残基，用亲水残基替换亲水残基，用疏水残基替换疏水残基，用带阳性电荷的残基替换带阳性电荷的残基，或用带阴性电荷的残基替换带阴性电荷的残基。而且，待修饰的氨基酸残基优选非高度或完全保守的交叉(across)株或种，和/或对于维持该蛋白的生物学活性来说是非决定性的。
相应的，编码本发明多肽的核酸分子属于本发明的范围，其中该多肽含有对于其生物活性来说非决定性的氨基酸修饰。
5.3利用噬菌体105超表达系统生产酶
已报道的植酸酶超表达诱导系统包括IPTG诱导来自于枯草芽孢杆菌DS11的phyK基因在大肠杆菌中表达(Kim等，1998，同上)、甲醇诱导曲菌菌phyA基因在酵母菌巴氏毕赤酵母表达(Han&Lei，1999，同上)及以底物肌醇六磷酸为诱导剂在大肠杆菌中生成来自于Klebsiella terrigena的phytase(Greiner等，1997)和phyC编码的植酸酶。用肌醇六磷酸作为诱导剂是以底物特异性的理论为基础。
在以前建立的枯草芽孢杆菌105系统中(Thornewell，S.J.，EaseA.K.，Errington J.，1993，一种基于枯草芽孢杆菌105的高效表达及分泌系统及其在蜡样芽孢杆菌β-内酰胺酶I生产中的用途，Gene，133：47-53，将其整体在此引入作为参考)，将一种有缺陷的原噬菌体载体105 MU331加以衍生，用于枯草芽孢杆菌的高水平蛋白超表达(Leung Y.C.和Erington J.，1995，阻断宿主枯草芽孢杆菌裂解并提供异源基因强表达的噬菌体105基因中插入的鉴定，Gene，154：1-6，将其整体在此引入作为参考)。在此衍生系统中，将lacZ报告基因(即来源于pSG23质粒的lacZ-cat盒；Errington，J.，1986，一种将大肠杆菌lacZ基因与枯草芽孢杆菌中染色体基因融合的通用方法.J.Gen.Microbiolo.132：2953-2966)插入与各种噬菌体如λ噬菌体裂解表达盒相似的区域。该系统不仅提供了基因的可高效诱导(通过加热)转录产物，而且还防止该系统的宿主细胞裂解。因此，培养基中产生的酶易于分离，而不破坏细胞，因而纯化步聚可以大大简化。另外，与大肠杆菌不同，芽孢杆菌是GRAS细菌，其蛋白产物对于包括人在内的动物也是公认安全的。
相应地，将本发明的核酸分子插入表达载体pSG以构建用于表达phyL的pSGt-pL构建体和用于表达168phyA的pSGt-pA构建体。用自phyL基因启始密码子到终止密码子之间编码区旁侧的引物，PCR扩增编码成熟phyL的基因片段，然后亚克隆入pSGt表达载体，其中该载体由地衣芽孢杆菌α-淀粉酶终止子插入pSG表达载体而构建(见图4B和6.2部分，同上)。因此，pSGt-pL构建体中phyL基因处于原噬菌体105启动子的控制下。将用168phyA开放阅读框(ORF)旁侧引物所得PCR产物亚克隆入pSG载体，构建PSG-pA构建体。在该构建体中，168phyA基因的两侧是105启动子和168phyA基因天然启动子(图4A和6.3部分)。将这些质粒导入用于抗生素抗性基因扩增和选择的大肠杆菌JM109株，然后导入宿主菌株如枯草芽孢杆菌MU331，用于酶的生产。相应地，本发明还包括植酸酶的载体、宿主细胞和重组生产方法(详见6.2部分和6.3部分)。在一些实施方案中，宿主细胞为芽孢杆菌，优选枯草芽孢杆菌MU331。
5.4融合蛋白
本发明进一步包括了融合蛋白，其中本发明多肽或其片段与异源多肽以重组或化学的方式融合(即一段不相关的多肽或其部分，优选该多肽的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个氨基酸)，生成融合蛋白。融合可以是直接的，但也可通过接头序列融合。
一方面，融合蛋白包括在N端与异源信号序列融合的本发明多肽。例如，本发明多肽中存在的天然信号序列可由异源的信号肽所取代。各种信号序列可从商业途径获得。例如，phoA分泌信号(Sambrook等，同上；当代分子生物学方案，Ausubel等编，john Wiley&Sons，1992)和蛋白A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，NJ)可作为原核异源信号序列。
在另一个实施方案中，本发明的多肽可与其他多肽中的标记序列如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Avenue，Chatsworth，Ca，91311)中提供的标记如六组氨酸多肽融合，其中许多可从商业途径获得。例如，如Gentz等，1989，proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824，六组氨酸为融合蛋白的纯化提供了方便。其他肽标记的例子包括与来源于流感血细胞凝集素蛋白表位相对应的血细胞凝集素“HA”标记(Wilson等，1984，Cell，37：767)和“旗标(flag)”标记(Knappik等，1994，Biotechniques，17(4)：754-761)。这些标记对于重组所产生本发明多肽蛋白的纯化非常有用。
融合蛋白可用标准的重组DNA技术或蛋白质合成技术，如使用肽合成仪生成。例如，编码融合蛋白的核酸分子可用包括自动化DNA合成仪在内的常规技术合成。此外，可利用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，其中该锚定引物可在两个连续的基因片段间产生互补突出部分，随后退火，重新扩增并产生嵌合基因序列(例如参见：当代分子生物学方案，Ausubel等编，John Wiley&Sons，1992)。
编码融合蛋白的核酸分子可引入合适的表达载体中，该载体包含插入编码蛋白序列的转录和翻译所必需的元件。
在一个具体的实施方案中，融合蛋白的表达载体由一个诱导性启动子调控。
5.5重组蛋白的纯化
一旦本发明的多肽由上述方法生成，即可利用重组蛋白纯化领域内任何已知的方法加以纯化，例如层析(如离子交换层析，亲和层析尤其是特异性抗体的亲和层析，凝胶过滤层析)、离心、溶解度差异等，但并不限于此，还可用纯化蛋白的其他标准技术。而且，本发明的多肽或其片段可以和此处或别处所述的异源多肽序列融合，以便于纯化。
在一个具体的实施方案中，从细菌培养上清中纯化枯草芽孢杆菌表达的phyL或168phyA的方法包括：用乙醇沉淀，然后离心，将沉淀重悬进行凝胶过滤柱层析(见第6.2和6.3部分)。
5.6动物饲料的制备
如上文第5.1-5.5部分中所述制备的本发明多肽，在中性pH下具有植酸酶活性，可用于提供动物饲料，此饲料中的磷可被以此饲料饲养的动物高效利用。因此，本发明的另一方面是提供含本发明多肽的动物饲料，其中本发明多肽可使磷从肌醇六磷酸盐中释放出来，供动物利用。例如，这样的动物饲料制备方法可以是：饲料与本发明的植酸酶粉末混合并制成小丸，其中酶粉末在约每吨饲料1公斤粉末的重量比的条件下酶活性为200,000-400,000EU/kg。为混合均匀，酶粉末可先与小量饲料如10公斤混合，然后与剩余的饲料混合。酶在饲料中的用量至少为200酶单位(EU)/kg饲料，优选至少250EU/kg饲料，最优选300EU/kg饲料。一个酶单位(EU)能够在37℃和pH7.0条件下，于1分钟内使5.1mM肌醇六磷酸钠释放出1μmol正-磷酸盐。饲料可以是玉米、谷物、小麦、大麦、米糠、大豆粗粉及芸苔粗粉或其他用于动物饲料的任意普通材料。
5.7转基因植物的制备
植物的生长需要碳、氢、氧、磷、氮、金属离子和微量元素等元素。尽管植物可从水和光合作用获得，而磷、氮、金属离子、钙及微量元素主要从土壤获得。因此，土壤中的磷和氮可利用性成为植物生长的限制因子。
即使两个领域的植酸酶基因和蛋白序列及结构存在具大的差异，来自于另一实验领域中生物体的植酸酶可以在一植物中利用基本的生物信号组件有效发挥功能，本发明即基于这一发现。因此，本发明涉及在植物内产生新的生化信号途径，使磷从不能利用的肌醇六磷酸转化成可利用的无机磷酸盐，从而增强植物的生长能力，例如以侧芽数目增加来衡量的植物生长能力。因为磷酸盐也是开花和结果所必需的，本发明也提供了开花(如开花更早，花/芽的数目增加)和结果(如果实的数目增加)改善了的开花植物。
相应地，本发明提供了转基因植物，其中该植物含有编码和表达植酸酶的核酸分子，该植酸酶在中性pH下具有最佳的催化活性。本发明的转基因植物与相当的未改造植物即同一种属(株)相比具有改良的生长、开花和结果。在一个具体实施方案中，此种植酸酶来自在中性pH时具有最佳催化活性的芽孢杆菌种属。在一个优选实施方案中，本发明的转基因植物包含本发明的核酸分子，并表达在中性pH具有活性并具有广谱温度范围的phyL(SEQ ID NO：2)或168phyA(SEQ ID NO：4)，phyL的温度范围为约37℃至约70℃，168phyA的温度范围为约37℃至约65℃。在一个优选实施方案中，植酸酶的分泌量检测不到或检测不到有意义的量(即不超过总植酸酶的1％、2％、5％或10％)。SEQ ID NOS：2和4具有天然信号肽，但蛋白并无一点分泌。在另一个优选实施方案中，植酸酶表达至细胞外，例如从转基因植物的根部分泌出来。植物中这种中性植酸酶细胞外表达可用异源核苷酸序列融合到或取代编码植酸酶基因信号肽的核苷酸序列的N-末端(即对于phyL(SEQ ID NO：2)来说是1～80个氨基酸残基的全部或一部分，优选全序列或1～20氨基酸残基部分；对于168phyA(SEQ ID NO：4)来说是说是1～80个氨基酸残基的全部或一部分，优选全序列或1～26氨基酸残基部分)，其中此异源序列编码可使该植酸酶从特定植物中细胞有效分泌出来的植物信号肽。植物信号肽的例子包括但不局限于来自于延伸多肽或延伸多肽相关的信号肽(Richardson等，2001，Plant Journal 25：641-649)、酸性磷酸酶(Haran，-S；Logendra，-S；Seskar，-M；Bratanova，-M；Raskin，-I.，oct.，2000，Arabidopsis酸性磷酸酶启动子的鉴定及酸性磷酸酶表达的调控，Plant-Physiol.125(2)：615-626)、内质网信号肽(Borisjuk，-N-V；Borisjuk，-L-G；Logendra，-S；Petersen，-F；Gleba，-Y；Raskin，-I.，May，1999，重组蛋白在植物根分泌液中的生成，Nat-Biotechnol.17(5)：466-9)、α-淀粉酶(Park CS，Chang CC，Kim JY，Ogrydziak DM，RyuDD.，1997，高丰度α-淀粉酶在酵母Yarrowia lipolytica中的表达、分泌和加工，J Biol Chem 272：6876-6881)和PVR3(Choi，-D-W；Song，-J-Y；Oh，-M-H；Lee，-J-S；Moon，-J；Suh，-S-W；Kim，-S-G.，Mar.，1996，一种编码来自于豆幼苗根ns-LTP样蛋白的选择性cDNA的分离，Plant-Mol-Bil.30(5)：1059-66)。相应地，在另一个优选实施方案中，本发明的转基因植物包含本发明的核酸分子并表达phyL(SEQ IDNO：2)或168phyA(SEQ ID NO：4)，只是SEQ ID NO：2的1～80个氨基酸残基的全部或一部分尤其是N端部分，优选全序列或1～20氨基酸残基部分，或SEQ ID NO：2的1～80个氨基酸残基的全部或一部分尤其是N端部分，优选全序列或1～26氨基酸残基部分，由异源植物信号肽通过基因工程加以取代。在这样的转基因植物中，中性植酸酶分泌入土壤中并将土壤中的肌醇六磷酸转化成植物可以摄取的无机磷酸盐。在另一个优选实施方案中，本发明的转基因植物至少包含本发明的两个核酸分子，其中一个核酸分子编码phyL(SEQ ID NO：2)，另一个编码SEQ ID NO：21～80个氨基酸残基的全部或一部分尤其是N端部分，优选全序列或1～20氨基酸残基部分由异源植物信号肽取代的phyL。在另一优选实施方案中，本发明的转基因植物至少包含本发明的两个核酸分子，其中一个核酸分子编码168phyA(SEQ IDNO：4)，另一个编码SEQ ID NO：41～80个氨基酸残基的全部或一部分尤其是N端部分，优选全序列或1～26氨基酸残基部分由异源植物信号肽取代的168phyA。这样的转基因植物可同时在细胞内和细胞外表达植酸酶。在另一个优选实施方案中，本发明的转基因植物包含本发明的核酸分子，并表达与本发明多肽功能或结构特性至少一项相同的类似物、衍生物及或其片段。在另一个优选实施方案中，本发明的转基因植物包含本发明的核酸分子，该核酸分子可在本文定义的严格条件下与具有SEQ ID NO：1或3或其互补序列的核酸分子杂交，并编码表现出至少与本发明多肽相同的结构和/或功能特性的蛋白或多肽。特定地，本发明提供了可生成中性植酸酶的转基因烟草和稻谷的生产，该植酸酶有助于改善植物生理如植物生长速度和特征，例如改善开花反应。而且，当这些生成中性植酸酶的植物喂给动物时，植酸酶可作用于动物食物中其他来源的肌醇六磷酸盐，水解肌醇六磷酸盐从而为动物消化释放无机磷酸盐。这样就减少或排除了将植酸酶或无机磷酸盐补充到动物饲料中的必要性，并减少了因动物排泄磷而导致的环境污染问题。相应地，本发明还提供了包含本发明转基因植物(特别是来自于这些转基因植物的种子或果实)的动物饲料。
相应地，本发明也提供了植物基因修饰的嵌合基因构建体，以便通过提高磷的利用率来提高其生长速度、缩短开花所需要的时间。嵌合基因构建体包含一段基本上全部编码植酸酶的序列，其中该植酸酶在中性pH时可催化肌醇六磷酸盐水解。优选植酸酶来源于芽孢杆菌细菌。在一个特定的实施方案中，嵌合基因构建体包含具有SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：3序列的核酸分子。在另一个实施方案中，嵌合基因构建体包含具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3序列的核酸分子，SEQ ID NO：1中核苷酸241～480的全部或一部分，尤其是241～300核苷酸的全部或一部分由编码植物信号肽的异源核酸分子所取代，和/或SEQ ID NO：3中核苷酸100～339的全部或一部分，尤其是核苷酸100～177的全部或一部分由编码植物信号肽的异源核酸分子所取代。在另一个优选实施方案中，嵌合基因构建体包含编码本发明多肽的类似物或其片段的核酸，其中，类似物或其片段与本发明多肽具有相同的至少一个结构或功能特性。在另一个特定的实施方案中，嵌合基因构建体包含一段在本文定义严格条件下与具有SEQ ID NO：1或3序列之核酸杂交的序列，其中该序列编码具有与本发明多肽相同的至少一个结构或功能特性的蛋白或多肽。而且，嵌合基因构建体中包含的核酸分子其所编码的植酸酶可以是其他任意植酸酶，只要在中性pH具有最佳催化活性，具有与本发明植酸酶类似的结构特征，如多个钙结合点。这样的植酸酶包括但不限于下列多肽：来自于芽孢杆菌的植酸酶(登记号为：AAC38573、AAC31775、7767024)、来自于枯草芽孢杆菌的植酸酶(登记号为：AAC31775、AAG17903、AAB72078、AAA87722)、来自于液化淀粉芽孢杆菌的植酸酶(登记号为：7246002、7245653)、来自于Caulobacter crescentus的植酸酶(登记号为：AAK23276)和来自于蓝色链霉菌的植酸酶(登记号为：CAC17528)。
编码植酸酶的序列的上游和下游操作性地连接调控组件，优选与该植酸酶异源的组件；例如在植物细胞细胞中使该基因表达(酶生成)的CMV 35S启动子(见6.5.1-6.5.4部分)。当用常规转化方法，如微粒轰击、土壤杆菌感染、微注射等将含有本发明植酸酶基因的构建体导入植物细胞中时，该基因在调控序列控制下在细胞中表达。表达的植酸酶成功地与天然存在于植物中的生物合成器官相互作用，催化无机磷酸盐在中性pH下从肌酸六磷酸盐释放出来。本发明也可通过提高无机磷酸盐的利用率来促进植物的生长，从而改善开花和结果。这样，植物成熟和开花所需的时间就缩短了。相应地，本发明也提供了肌酸六磷酸盐水平降低的植物细胞及完整植株，植物细胞含本发明的嵌合基因构建体。也提供了提高植物细胞及完整植株中无机磷酸盐利用率的方法，包括将与本发明一致的嵌合基因构建体导入该植物细胞或该完整植株的细胞中这一步聚。
在一个特定的实施方案中，采用稻谷(见6.5.3部分)及烟草的植物(见6.5.4部分)作为两种模型系统。将两个编码植酸酶嵌合构建体导入这两种植物中。
在本发明的一个优选实施方案中，使用来自于枯草芽孢杆菌的植酸酶。它含有用于分泌的信号肽，因而植酸酶从细胞中分泌出来。此酶能使无机磷酸盐在中性pH下从肌酸六磷酸盐释放出来，并具有高温稳定性。至此已发现即使两个领域的植酸酶基因和蛋白序列及结构存在巨大的差异，来自于另一实验领域中生物体的植酸酶可以在一植物中利用基本的生物信号组件有效发挥功能。因此，涉及在植物中生成可使肌酸六磷酸中的磷转化成无机磷酸盐形式的新生化信号途径。本发明所获得的结果表明该新生化途径可提高植物的生长速度(见6.5.9部分及图12和图13)。
还观察到开花也需要磷。因此，本发明也提供了转基因开花植物，其开花所需的时间因中性植酸酶基因表达使磷利用率上升而得以缩短。尽管任何植物均可用本发明的表达盒和方法加以修饰，优选的是来自于下列各类的物种(括号内为代表性物种)但并不局限于此：
单子叶植物：天冬属(芦笋)、雀麦属(cheatgrass)、萱草属(萱草)、大麦属(大麦)、黑麦草属(黑麦草)、稻属(稻)、黍属(毛线稷草)、狼尾草属(狼尾草)、蜀黍属、trigonella(fenu grass)、小麦属(小麦)、玉蜀黍属(玉米)，和：
双子叶植物：金鱼草属(flower sp.)、Arabidopsis(拟南芥)、花生属(花生)、茄属(颠茄)、芸苔属(油菜(rapeseed))、长管弯头花、辣椒属(胡椒)、红花属(番红花)、菊苣属(菊苣)、橙属(桔、柠檬)、菊花、香瓜属(黄瓜)、曼陀罗属(曼陀罗)、萝卜属(胡萝卜)、毛地黄属(毛地黄)、草莓属(草莓)、老鹳草属(flower sp.)、大豆属(大豆)、向日葵属(向日葵)、hyscyamus、番薯属(牵牛花)、莴苣属(莴苣)、百脉根属(flower sp.)、番茄属(番茄)、majorana、锦葵属(棉)、木薯属、苜蓿属(苜蓿)、nemesia、烟草属(烟草)、onobrychis、天竺葵属(驱蚊香草)、牵牛属(flower sp.)、毛茛属(flower sp.)、莱服属(萝卜)、salpiglossis、千里光属(flower sp.)、芥属(白芥子)、茄属(土豆)、红花草属(红花)、豇豆属(绿豆、蚕豆)、葡萄属(葡萄)。
可通过数种途径对植物进行基因改造。最常用的方法是土壤杆菌介导的转化。在此方法中，在天然感染植物中根瘤土壤杆菌的植物基因组中插入致癌基因，使之发生改变。在实验条件下，将选择的基因加入根土壤杆菌Ti(肿瘤诱导的)细菌质粒的T-DNA中，使得T-DNA通过细胞自身内部转移机制转移到植物中时该基因整合到植物的染色体中。T-DNA的唯一必要部分是其两小段(25个碱基对)边界重复序列，其中至少有一段是植物转化所必须。编码促进植物生长之植物激素的细菌基因从T-DNA切除并用一段DNA序列取代，一般地，该序列包含：选择标记(如抗生素抗性基因，通常是卡那霉素抗性)、一个限制性酶切位点——含有限制性酶可切割DNA的特异核苷酸序列的位点，以及需要导入植物的目标基因(B.Tinland，1996.T-DNA整合入植物基因组中，Trends in Plant Science 1，178-184；D.Grierson(ed.)1991.植物基因工程，Blackie，Glasgow)。土壤杆菌可加到培养的植物原生质体(去掉细胞壁的植物细胞)中，使之可以重新生成细胞壁，此时未转化细胞被抗生素杀死，而转化的细胞则产生抗性基因。然后利用标准的植物组织培养技术将存活的转化细胞再生成植物。在另一种替代技术中，将无菌皿或植物利于生长部分的片段与土壤杆菌一起置于流体培养基中，然后用激素诱导根再生从而使长在选择培养基的苗再生。用于传送基因的第三种技术可能可以用于诸如拟南芥的一些植物中，该方法中土壤杆菌或“裸露”的DNA可融入种皮促使其转化(Clough SJ和Bent AF，1998，植物的浸润：一种用于土壤杆菌介导阿拉伯芥转化的简便方法.Plant J 16：735-43)
近来一种用于植物基因工程的基因枪方法有了进一步的发展，开始广泛应用。此方法中，利用电子脉冲、气压或火药撞击将非常小生物活性DNA包被的钨或金颗粒(微发射体)高速推进植物细胞中。当颗粒穿过细胞时，DNA溶解并整合入该细胞及其子代的基因组中。已证明此方法可以生成稳定的转化体(Christou，P.等，1988，用DNA包被的金颗粒稳定转化大豆愈伤组织，Plant Physiology 87：671-674)。此方法可应用于完整植株，尤其是在分生组织特别有效。它也能将DNA输送到核或线粒体(Johnston，S.A.等，1988，用微发射体通过轰击的方法将酵母中的线粒体转化，Science 240，1538-41)和叶绿体(Svab，Z.等，1990，高等植物中质体的稳定转化，Proc Natl Acad Sci.USA 87，8526-8530)。
植物基因工程的电穿孔方法获得的成功就少一些。这种方法中，当用膜活性剂或高压直流电快速脉冲的电穿孔处理时，培养的原生质体摄取纯DNA。一旦DNA进入原生质体即可整合入细胞的基因组中。然后用标准的组织培养技术再生转基因植物。
植物基因工程的微注射方法可能是最困难的。在此方法中，用非常细的玻璃针以在动物中所用的类似方法将DNA微注射入靶植物细胞中。这种技术费力低效，而且对于大量转基因植物来说不实用。
选择基因改造植物的方法常常取决于靶植物的种属和哪种方法已证明是有效的。
5.8抗体的制备
可使用特异性识别本发明多肽或其片段的抗体来检测、筛选和分离本发明多肽或其片段，或编码来自于其他生物体类似酶的类似序列。例如，在一特定的实施方案中，能与phyL或168phyA或其片段特异性结合的抗体可用于各种体外检测分析，包括酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定、蛋白质印迹等，来检测生物材料如细胞、细胞培养基(如细菌培养基、哺乳动物细胞培养基、昆虫细胞培养基、酵母细胞培养基等)以及血液、血浆、血清、组织等样品中的本发明多肽或其片段、衍生物、类似物或变体，或具有与本发明多肽类似酶活性的类似分子。
可用本领域内任何合适的已知方法生产本发明多肽的特异性抗体。针对目标抗原的多克隆抗体可用本领内已知的各种方法产生。例如，可将来源于本发明多肽的抗原施用于包括但不限于兔、小鼠、大鼠等在内各种宿主动物，以诱导生成含该抗原特异性多克隆抗体的抗血清。根据宿主种属的不同，可用各种佐剂来增强免疫应答，包括但不限于弗氏(完全及不完全)佐剂、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂、pluronic polyols、聚阴离子、肽、油性乳剂、钥孔嘁血蓝蛋白、二硝基苯酚以及用于人类的潜在性有用佐剂如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌。此类佐剂在本领域内亦是众所周知。
可利用本内域内已知的各种技术制备单克隆抗体，包括杂交瘤、重组及噬菌体显示技术或其组合。例如，单克隆抗体可用杂交瘤技术产生，这些杂交瘤技术包括本领域已知的技术及Harlow等《抗体：实验手册》(Cold Spring harbor laboratory press，第二版，1988)及Hammerling等在《单克隆抗体与T细胞杂交瘤》563-681页(Elsevier，N.Y.，1981，在此将两者整体均引入作为参考)所述技术。这里所用术语“单克隆抗体”并不限于由杂交技术所产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来源于单克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而非指产生这些抗体的方法。
利用杂交瘤技术生成和筛选特异性抗体的方法是常规方法，在本领域内众所周知。在一非限制性的实施例中，可用目标抗原或表达该抗原的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫应答如在小鼠血清中检测到该抗原的特异性抗体，就收集小鼠脾并将脾细胞分离出来。然后用熟知的方法将脾细胞与适当的骨髓瘤细胞融合。用限制性稀释法筛选和克隆杂交瘤。然后用本领域内已知方法分析可产生与该抗原结合的杂交瘤克隆。用阳性杂交瘤克隆在小鼠腹腔内接种，产生腹水，它通常含有高水平的抗体。
识别特异表位的抗体片段可用已知的技术生成。例如，Fab和F(ab’)2片段可利用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)的酶通过免疫球蛋白分子的蛋白裂解产生。F(ab’)2片段包含完整的轻链及重链的CH1区和铰链区。
本发明的抗体或其片段也可用本领域内任何已知的抗体合成方法生成，尤其是用化学合成或优选重组表达技术生成。
编码抗体的核苷酸序列可由本领域内熟练技术人员可利用的任何信息所获得(即从Genbank、文献或常规克隆获得)。如果一个含编码特定抗体或其结合表位片段的核酸分子的克隆，但特定抗体或其结合表位片段的序列是已知的，则编码该免疫球蛋白的核酸分子可以化学合成，或从适当的来源用可与3’及5’端杂交的合成引物通过PCR扩增获得(如抗体cDNA文库或表达该抗体的任意细胞或组织如选择性表达抗体的杂交瘤细胞所产生的cDNA文库，或是从这些细胞或组织分离的核酸分子，优选含poly A的RNA)，或利用需鉴定基因如来自于cDNA文库、编码该抗体的cDNA克隆的特异性寡核苷酸探针进行克隆获得。PCR扩增产生的扩增核酸分子可利用本领域内任何已知的方法进一步克隆入可复制克隆载体中。
一旦抗体的核苷酸序列得以测定，即可用本领域内控制核苷酸序列的熟知方法如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(例如，可见Sambrook等，同上；及Ausebel等编，1998，当代分子生物学方案，John Wiley&Sons，NY所描述的技术，在此将两者的整体引入作为参考)，对抗体的核苷酸序列加以调节，以产生含有不同氨基酸序列的抗体，例如通过在抗体的表位结合区域或可增强或减弱抗体生物活性的任何抗体部分引入氨基酸替代、删除和/或插入。抗体的重组表达需要构建含编码抗体的核苷酸序列的表达载体。得知编码抗体或其轻链或重链或其中一部分的核苷酸序列之后，可用如前面章节所述、本领域内众所周知的方法通过重组DNA技术生成产生该抗体分子的载体。可使用本领域内熟练技术人员所熟知的方法，构建含编码抗体序列及适当转录和翻译控制信号的表达载体。例如，这些方法包括体外DNA重组技术、合成技术以及体内基因重组。然后将编码抗体重链可变区、轻链可变区以及同时编码重链可变区和轻链可变区、重链和/或轻链可变区中表位结合片段或抗体中的一个或多个抗原决定簇(CDRs)的核苷酸序列导入用于表达该抗体的适当宿主细胞。相应的，本发明包括了含聚核苷酸的宿主细胞，其中该聚核苷酸编码本发明多肽或其片段的特异性抗体。在一些实施方案中，宿主细胞为芽孢杆菌，优选枯草芽孢杆菌MU331。
宿主细胞可与本发明的两个表达载体共转染，其中第一个载体编码重链衍生多肽，第二个载体编码轻链衍生多肽。这两个载体可含有相同的选择标记使重链及轻链多肽的表达水平相等，也可含有不同的选择标记以确保两质粒的维持。此外，可使用同时编码并表达重链及轻链多肽的单个载体。在这种情况下，轻链应置于重链之前以避免具有毒性的游离重链过量生成(Proudfoot，1986，Nature，322：52；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，77：2197)。重链及轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
在另一实施方案中，抗体也可用本领域内已知的各种噬菌体显示方法生成。在噬菌体显示方法中，抗体功能结构域在噬菌体颗粒的表面上显示出来，其中该颗粒携带有编码抗体的聚核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，此类噬菌体可用于显示从所有组成部分或组合抗体文库(如人或鼠的文库)表达的抗原结合域，如Fab及Fv或二硫键稳定的Fvs。然后对表达与目标抗原结合之结构域的噬菌体加以筛选或鉴定，例如可使用标记抗原或固定或捕获于固体表面或珠子的抗原。在这些方法中所用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合域以与噬菌体基因III或基因VIII蛋白的重组融合蛋白方式表达。可用于制造本发明免疫球蛋白或其片段的噬菌体显示方法实例包括Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.，24：952-958；Persic等，1997，Gene，187：9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57：191-280；NO.PCT/GF91/01134号PCT申请；WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401号PCT公告；及5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108号美国专利等公开的方法，并将其各自的整体在此引入作为参考。
正如上述文献所述，来自于噬菌体的抗休编码区可加以分离，并用于产生包括人类抗体的完整抗体或其他任何所需的片段，并可在任意需要的宿主细胞如哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、细菌中表达，详情如下所述。例如，重组生成Fab、Fab’和(Fab’)2片段的技术也可用本领域内已知的方法如WO 92/22324号PCT公告、Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6)：864-869和Swai等，1995，AJRI 34：26-34及Better等，Science，240：1041-1043，1988(将其各自的整体在此引入作为参考)所公开的方法来实施。可用于生成单链Fvs和抗体的技术包括4,946,778和5,258,498号美国专利；Huston等，1991，Methods in Enzymology 203：46-88；Shu等，1993，PNAS 90：7995-7999和Skerra等，1988，Science 240：1038-1040所公开的方法。
一旦本发明的抗体分子已用上述的任意方法生成，即可用本领域内任何已知的免疫球蛋白分子纯化方法加以纯化，例如层析(如离子交换层析，亲和层析尤其是A蛋白或G蛋白纯化后特异性抗原的亲和层析，凝胶过滤层析)、离心、溶解度差异等，或纯化蛋白的其他任意标准技术。而且，本发明的抗体或其片段可与本文所述或本领域内其他已知异源多肽序列融合，便于纯化。
就某些用途包括在人体内使用抗体及体外检测分析来说，优选使用嵌合的人源化或人类抗体。嵌合抗体是分子中不同部分来源于不同物种的分子，如含有来源于鼠单克隆抗体的可变区及来源于人免疫球蛋白的恒定区的抗体。生成嵌合抗体的方法在本领域内是已知的。例如参见Morrison，Science，229：1202，1985；Oi等，Biotechniques，4：214，1986；gillies等，J.Immunol.Methods，125：191-202，1989；5,807,715、4,816,567和4,816,397号美国专利，将其各自整体在此引入作为参考。人源化抗体是来自于非人类的抗体分子，它与含有一个或多个非人类来源抗原决定簇、人免疫球蛋白框架区及恒定区的抗原结合。人框架区中的框架残基常常用来源于供体CDR的抗体中相应的残基所取代，以改变优选改善抗原结合。可用本领域内的熟知方法对框架替换进行鉴定，如模拟CDR和框架残基的相互作用来鉴别抗原结合中的重要框架残基，进行序列比较以鉴别特定位置中的不常见框架残基。例如，可参见Queen等的5,585,089号美国专利；Riechmann等，1988，Nature，332：323，将各自的整体在此引作作为参考。可用本领域内各种已知技术将抗体人源化，包括CDR-移植(EP 239,400；WO 91/09967号PCT公告；5,225,539、5,530,101和5,585,089号美国专利)和链替换(5,565,332号美国专利)，在此将各自的整体引入作为参考。
完整的人类抗体对于人类患者的治疗性处置来说特别理想。人类抗体可用本领域内各种已知的方法制造，包括前面所述、使用来源于人类免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体显示方法。参见4,444,887和4,716,111号美国专利及WO 98/46645、WO 98/50433、WO98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 9633735、WO 91/10741号PCT公告，在此将各自的整体引入作为参考。
人类抗体也可用不能表达内源性功能免疫球蛋白、但其可表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠生成。用于生成人类抗体的此类技术概貌参见Longerg和Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93。用于生成人类抗体、人类单克隆抗体及生成这些抗体的方案的此类技术详细讨论可见WO 98/24893、WO 92/01047、WO 96/34096、WO96/33735号PCT公告，0 598 877号欧洲专利，5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771和5,939,598号美国专利，在此将各自的整体引入作为参考。此外，诸如Abgenix，Inc.(Fremont，CA)、Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)之类的公司可负责用与上述方法类似的技术提供直接针对选定抗原的人类抗体。
识别选定表位的完整人类抗体可用一种称为“导向选择”的技术生成。在此途径中，选定的非人类单克隆抗体如小鼠抗体用于指导识别同样表位的完整人类抗体选择(Jespers等，1988，Bio/Technology12：899-903)。
与异源多肽融合或结合的抗体可在本领域内众所周知的体外免疫测定及纯化方法(如亲和层析)中使用。可参见WO 03/21232号PCT公告；EP 439,095欧洲专利；Naramura等，1994，Immunol.Lett.39：91-99；5,474,981号美国专利；Gillies等，1992，PNAS 89：1428-1432和Fell等，1991，J.Immunol.146：2445-2452；在此将各自的整体引入作为参考。
抗体也可粘附到固体支持物上，这对本发明多肽或其片段、衍生物、变体或具有本发明多肽类似酶学活性的类似分子进行免疫测定或纯化时特别有用。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚氯乙烯或聚丙烯。
5.9检测分析
检测生物样品中本发明多肽或核酸分子的示例性方法涉及：从各种来源获得生物样品，并使样品与一种能检测本发明多肽或核酸(如mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，以检测样品中是否存在本发明多肽或核酸。用于检测编码本发明多肽的mRNA或基因组DNA的优选试剂为标记的、可与编码本发明多肽之mRNA或基因组DNA杂交的核酸探针。例如，核酸探针可以是全长cDNA如SEQ IDNO：1或3的核酸序列，也可以是其中一部分如长度上至少含有15、20、25、30、50、100、250、500或更多个连续核苷酸、可在严格条件下充分与编码本发明多肽之mRNA或基因组DNA杂交的寡核苷酸。
用于检测本发明多肽的优选试剂是能与本发明多肽结合的抗体，尤其是带有可检测标签的抗体。抗体可以是多克隆抗体，优选单克隆抗体。可使用完整抗体或其片段(即Fab或F(ab’)2)。关于抗体的详细描述也可参见5.5部分。
就探针或抗体来说，术语“标记的”包括可检测物质与该探针或抗体偶合(即物理连接)的探针或抗体直接标记，以及该探针或抗体通过反应与其他直接标记的试剂相连接的探针或抗体间接标记。间接标记的例子包括用荧光标记的第二抗体检测第一抗体和用生物素标记DNA探针的末端以便其可用荧光标记的链霉蛋白抗生素检测。本发明的检测方法可用于在体外和体内检测样品中的mRNA、蛋白或基因组。例如，mRNA的体外检测技术包括RNA杂交及原位杂交。本发明多肽的体外检测技术包括酶联免疫测定(ELISA)、蛋白质Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光法。体外检测基因组DNA的技术包括DNA杂交。而且，在体内检测本发明多肽的技术包括将针对该多肽的标记抗体引入受试生物体中。例如，抗体可用放射性标记物标记，其在受试生物体中的存在与否及存在的位置可用包括放射自显影在内的标准成像技术检测。
在一个特定的实施方案中，这些方法还包括从对照受试者获取对照样品，使对照样品与能检测本发明多肽或编码本发明多肽的mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，检测样品中多肽及编码该多肽的mRNA或基因组DNA存在与否，并将对照样品中本发明多肽或编码本发明多肽的mRNA或基因组DNA的存在度与待测样品中本发明多肽或编码本发明多肽的mRNA或基因组DNA的存在度相比较。
本发明还包括检测待测样品中本发明多肽或核酸的试剂盒。
例如试剂盒可包含能检测样品中本发明多肽或编码该多肽的mRNA的标记化合物及测定样品中多肽或mRNA含量的工具(例如与该多肽或寡核苷酸探针结合的抗体，其中该探针与编码该多肽的DNA或mRNA结合)。试剂盒也包括使用指南。
对于基于抗体的试剂盒来说，它可以包含：(1)第一抗体(如粘附于固定支持物的抗体)，与本发明多及结合，有时还可包括(2)不同的第二抗体，与多肽或第一抗体结合，并与可检测试剂相连。
对于基于寡核苷酸的试剂盒来说，它可以包含：(1)可与编码本发明多肽的核酸序列相杂交的的寡核苷酸，如可检测的标记寡核苷酸，或(2)一对用于扩增编码本发明多肽之核酸的引物。试剂盒还包括缓冲试剂、防腐剂或蛋白稳定试剂。试剂盒也可包括检测该可检测试剂的组分(如酶或底物)。试剂盒也可包括一种对照样品或一系列的对照样品，它们可以加以测定并与待测样品相比较。该试剂盒的每一组分通常密封于单独的容器里，这些各种各样的容器与使用指南置于单一的包装中。
5.10植酸酶及转基因植物的商业应用
正如前面所陈述的那样，肌醇六磷酸盐作为动物膳食的主要组成成分大量存在于食物来源中。但是，包括家禽动物和鱼在内的单胃动物不能利用此磷源，而且当它排入外界环境中时肌醇六磷酸盐导致大量对生态系统的污染问题。环境的改变可能不是马上就能发现，因为它们主要发生于食物链的最下游，但随着污染的继续，这些改变的效应将累积起来并向整个生态系统渗透，从而导致整个生态系统的永久损伤。因此，本发明的多肽对单胃动物没有毒性，利用本发明多肽的超表达系统大量生产本发明的多肽并制备含有本发明多肽的动物饲料，具有极大的商业价值。本发明的多肽作为动物饲料为单胃动物所用将减少未利用磷排泄入环境中，从而使环境污染降至最低。
而且，为了促进植物的生长，肥料中常常加入磷酸盐，从而进一步加重环境污染。尽管土壤中确实存在磷来源，但它以肌醇六磷酸形态被封闭住并不能为植物所用。因此，带有与本发明一致的嵌合基因构建体的转基因植物，在细胞内和/或细胞外表达植酸酶，在磷的利用方面具有很大的优势，否则这些磷既不能为植物本身所用也不能被动物利用。也就是说，转基因植物的高效利用磷不仅有助于减少磷带来的环境污染，而且可增强植物的生长，包括开花及结果行为，这意味着在农业和园艺业有着重要的应用。而且，在动物饲料中引入带有本发明自身表达的细胞内植酸酶的转基因植物，有助于动物利用磷，使其排泄物给环境带来的污染减少。
6.实施例
下面的实施例讲解了所述植酸酶及抗体的克隆、生成、分离和鉴定。这些实施例不具有限制性。
6.1 phyL基因的分子克隆
来自于地衣芽孢杆菌的phyL基因克隆策略如图3所示。地衣芽孢杆菌细胞从商业途径获得(ATCC号：10716)。细菌细胞于37℃在营养琼脂板(2.5％[w/v]营养肉汤粉末，1.5％[w/v]细菌学琼脂)上生长，并作为兼并PCR反应的模板。兼并寡核苷酸(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)根据PhyK(Kim Y.O.，Lee J.K.，Kim H.K.，Yu J.H.和Oh T.K.，1998，从芽孢杆菌DS11克隆热稳定的植酸酶基因(phy)及其大肠杆菌中的超表达，FEMS Microbiology Letters，162：182-191)、PhyC(Kerovuo J.，Laurarus M.，Nurminen P.，Kalkkinen N.和Apajalahti J.，1998，一种来自于枯草芽孢杆菌的全新植酸酶的分离、鉴定、分子基因克隆及测序，Applied and Environmental Microbiology，64(6)：2079-2085)和168phyA(SEQ ID NO：4)间的保守氨基酸序列设计，并作为PCR反应的引物。扩增在PCR机器(Robocycler gradient40，Stratagene，USA)中以{94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 2分30秒}的条件进行30个循环。将目标PCR产物从2％(w/v)琼脂糖凝胶切下来，并用Geneclean III试剂盒(Qbiogene，Inc，CA)纯化。将纯化产物克隆入pBSSK，用X-gal/IPTG诱导，进行氨苄青霉素抗性选择。在补充有100μg/mL氨苄青霉素的LB肉汤中培养的阳性克隆质粒用Quantum mini-prep试剂盒(Bio-Rad，香港)提取，并进行测序(MWGBiotech AG，德国)。
用基因组纯化试剂盒(Promega，香港)提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA，并用紫外分光光度计于260nm测定DNA浓度。两组基因组DNA(各20μg)分别用10单位Hae III(Boehringer Mannhem，香港)和10单位Sau3 AI(Boehringer Mannhem，香港)部分限制性酶消化1小时。消化的DNA纯化并稀释到1μg/mL，然后用T4 DNA连接酶(Life Technologies，香港)环化。环化DNA用酚-氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化。
正义和反义寡核苷酸(SEQ ID NOS：7-12)从兼并PCR所产生序列和5’和3’末端旁侧设计。反向PCR以部分消化的基因组DNA为模板，在{94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃两分钟}条件下进行30个循环。阳性PCR产物用乙醇沉淀并用相应的限制性酶(BoehringerMannhem，香港)消化，然后亚克隆入pBSSK的EcoRI和Bam HI位点。筛选出阳性克隆并如上所述提取出来。对克隆进行测序，将序列数据汇总并用包括MAC DNASIS(Hitachi，日本)和DNA Strider(Christian Marck，Sevice de Biochimie，Deparment de Biologie，Instituede Recherche Fondamentale，CEA，法国)在内的DNA处理软件分析。用GeneWorks forMac(Intelligenetics，Mountain View，CA)完成种类分析。
phyL的DNA序列及推导出的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS：1和2所示。在起始密码子ATG上游12bp处发现一个带有共有序列GGAGG的假想核糖体结合位点。从核苷酸序列所推导的氨基酸序列显示为一个381个氨基酸残基的蛋白，比其他三种枯草芽孢杆菌植酸酶要短。用BLAST检索将DNA序列及其推导出的氨基酸序列与NCBI数据库相比。发现在蛋白水平上phyL有64％与phyK相同，有65％与phyC相同，有69％与168phyA相同，有64％与phyK相同，而在DNA水平上有79％与phyX相同，有79％与phyC相同，有90％与168phyA相同。与这三种枯草芽孢杆菌植酸酶类似，phyL编码的植酸酶不具备高度保守的RHGXRXP序列基序，而该基序在所有的真菌及大肠杆菌植酸酶中均可鉴定出来。
6.2 phyL所编码植酸酶的超表达
PCR引物(SEQ ID NOS：13和14)设计从phyL基因翻译起始密码子ATG和终止密码子之间的编码区旁侧设计。编码成熟酶的基因片段用Pfu聚合酶(Promega，WI)扩增并亚克隆入pSGt表达载体中，其中pSGt通过将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的终止子亚克隆入pSG载体而得以构建。这样，phyL基因处于(105原噬菌体载体记启动子的调控之下。此载体命名为pSGt-pL(图4B)。
通过电穿孔将质粒导入大肠杆菌JM109株中。用氨苄青霉素抗性筛选菌落，并用Quautum Mini-prep试剂盒(BIO-RAD，香港)将阳性克隆加以提取、纯化。
为了将重组质粒转化入用于酶生产的宿主株，用Osborne等人所述方法(Osborne M.S.，Craig R.J和Rothstein D.M.，1985，可利用温和噬菌体105调控元件的枯草芽孢杆菌热诱导转录系统，J.ofBacteriology 16：1101-1108)制备枯草芽孢杆菌MU331活性细胞。将转化体分开种在补充有氯霉素和红霉素的琼脂上，筛选转化体。对两种抗生素均有抗性的克隆进一步用105特异性引物和phyL特异性引物(SEQ ID NO：14)通过PCR进行筛选。以此方式建造用于酶特征研究中使用的重组株pL-01，在30％(v/v)甘油中于-80℃冻存。
细菌培养和酶生产的培养基如下：
脑心浸渍肉汤由下列成分组成：
    小牛脑浸渍固体        12.5％
    牛心浸渍固体          5％
    蛋白酶胨              10％
    葡萄糖                2％
    氯化钠                5％
    磷酸氢二钠            2.5％
    酵母中性pH提取物      2.5％
将pL-01株以划线方式接种到补充有5μg/mL氯霉素的LB琼脂板上。第二天，挑出单个克隆并转移到补充有5μg/mL氯霉素的细菌培养基中。细胞以280rpm转速摇动培养直到OD600读数达到7.0。取1mL培养物转移到15mL不含抗生素的细菌培养基中。让细胞长到OD600读数为4.5，然后在50℃水浴中轻轻振摇5分钟进行热诱导。诱导后于不同时间点采样。
如无其他说明，所有的酶纯化步骤均在0℃-4℃进行。收集生长于细菌培养基中的细菌，于3000rpm离心30分钟。将收集上清与三倍体积的冰乙醇(-20℃)混合，于4℃搅拌沉淀过夜。6000rpm离心30分钟收集沉淀，自然干燥，重悬于100mM的pH7、含5mM CaCl2的Tris-HCl中。重悬的酶过NAP-10葡聚糖凝胶过滤柱(MarshaPharmacia，香港)进行缓冲液交换。在酶分析之前将用预设分析缓冲液洗脱的酶于-20℃保存。
phyL所编码成熟植酸酶用SDS-PAGE测定的分子量约为47kDa(图5B)。热诱导后5小时的引集液所产生的phyL所编码植酸酶的产量可达175mg/L。酶活性达到每mL培养基4.1单位和每毫克所用酶23.6单位，其中1个单位酶活性定义为在指定条件下释放1μmol无机磷酸盐所需要的酶用量(图6)。与以前研究中所测定的芽孢杆菌植酸酶活性(Powar和Jagannathan，1982，来自于枯草芽孢杆菌的肌醇六磷酸特异性磷酸酶的纯化和性质，J.of Bacteriology 151(3)：1102-1108)相比，本发明的新phyL酶在培养时间缩短14倍的同时其活性提高了17倍。该酶用双向SDS-PAGE测定的等电点约为5.1。
6.3 168phyA所编码植酸酶的生产及其活性
通过检索枯草芽孢杆菌基因组的序列同源性发现枯草芽孢杆菌168的基因组中有一个与两种已公开的枯草芽孢杆菌植酸酶具有高度序列同源的开放阅读框(ORF)。设计PCR引物(SEQ ID NOS：15和16)扩增此ORF旁侧的基因片段，将PCR产物亚克隆入pSG表达载体，构建pSG-pA。在此构建体中，168phyA基因的旁侧为105启动子和168phyA基因的天然终止子(图4A)。按前文第6.2部分所述将pSG-pA质粒转化入枯草芽孢杆菌MU331株组件中，构建重组株pA-01。阳性克隆用105特异性引物和168phyA特异性引物(SEQID NO：16)通过PCR进行筛选。然后将其用于前文第6.2部分的酶生产。
168phyA所编码成熟植酸酶用SDS-PAGE测定的分子量约为44kDa(图5A)，进一步确认了从氨基酸序列(SEQ ID NO：4)计算的分了量。热诱导后4小时的引集液所产生的168phyA所编码植酸酶的产量可达246.2mg/L。酶活性达到每mL培养基5.3单位和每毫克所用酶36.8单位(图6)。与以前研究中所测定的芽孢杆菌植酸酶活性(Powar和Jagannathan，1982，同上)相比，本发明的新168phyA酶在培养时间缩短18倍的同时其活性提高了22倍。该酶用双向SDS-PAGE测定的等电点约为5.0。
为了提高酶生产的收率，用pA-01进行2升(2-L)规模的原料分批发酵。在此发酵过程中，用pH-状态法控制碳源(葡萄糖)和氮源(胰胨)的加入。诱导后6小时的酶活性达到28EU/mL培养物，与产述简单振摇所产生的酶活性相比提高了5倍。
6.4植酸酶活性的测定
在不同的pH和温度下测定指定缓冲液中的酶活性。用于pH试验的缓冲液包括100mM柠檬酸-HCl，pH为3.5和6.5；100mM醋酸-HCl，pH为4.5～6.0；100mM Tris-HCl，pH为7～8.5，100mM甘氨酸-NaOH，pH为9、9.5和10.5。上述所列缓冲液均添加5mM CaCl2。用标准Bradford蛋白测定法(BIO-RAD，香港)测定酶的浓度。纯化后的酶用测定缓冲液稀释，按Engelen等所述方法(1994，同上)进行比色测定，只是将测定降到1mL。简单地说，将酶用各种指定的测定缓冲液稀释到200μL总体积。将4mL用蒸馏水稀释到10mM的肌醇六磷酸钠加到该酶中，将168phyA及phyL所编码植酸酶的混合物分别于55℃和65℃孵育30分钟。在反应液中加入0.4mL新鲜配制的终止液以猝灭酶活性。5分钟后，取200μL已猝灭的混合物转到96孔ELISA板(Nunc，丹麦)于405nm处进行光密度测定。
中性pH下进行的温度试验(图7A)表明168phyA及phyL所编码的植酸酶均表现出宽的最佳温度范围，phyL所编码的植酸酶在65℃、168phyA所编码的植酸酶在55℃达到峰值。图7B显示了各个最佳温度下pH对植酸酶在指定测定缓冲液(如上所述)中活性的影响。两种植酸酶均在中性pH时表现出最高活性。
至于热稳定性试验，将稀释的酶等分，在70℃-90℃之间的不同高温下孵育10分钟，室温冷却1小时使蛋白重新折叠，然后进行活性实验。
结果发现，phyL所编码的植酸酶即使在低Ca2+浓度(1mM)的条件下高温变性后可恢复60-70％的正常活性。它甚至可以经受高到95℃的变性，此时仍保持超过50％的原始活性。
枯草芽孢杆菌168phyA所编码的植酸酶即使在高Ca2+浓度(5mM)的条件下高温变性后可恢复60％-60％的原始活性。它甚至可以经受高到95℃的变性，此时仍保持超过46.7％的原始活性。但是，168phyA在低Ca2+浓度(1mM)所保持的活性比高Ca2+浓度(5mM)少20％。
6.5转基因植物的产生
稻是全世界尤其是亚洲的重要农作物。在中国，稻在总农作物谷类产量中占42％，种植面积占了29％。稻是单子叶植物，并依气侯及生长条件的不同，一些热带变种可在一年内完成三次生命周期。当在24℃以上温度，光周期长于14小时生长时，从秧苗到开花需要60天。从开花到收割种子还需要30天。一棵稻在完成一个生命周期时一般可产500粒种子。
烟草是植物转化中很好的模型系统，因为它的转化率高，在组织培养中易于繁殖。烟草因其阔叶被认为是双子叶植物，其阔叶具有很高的商业价值。烟草为一年生植物，可在120天内完成其生命周期。当在22℃以上温度，光周期长于14小时生长时，从秧苗到第一次开花需要96～100天。从一棵烟草植物可获得20-30粒果实，每粒果实重约0.3～0.4克，含1000粒以上的种子。一般地，一棵烟草植物在第一朵花盛开30天后产生能发芽的种子。
在植物细胞如稻和烟草细胞中导入含编码本发明植酸酶的基因的嵌合构建体，由于提高了储存于植物和/或土壤中的无机磷酸盐的利用率，可以提高植物的生长速度，从而缩短成熟及开花所需的时间。
6.5.1植物表达载体的构建
构建植物表达载体的的策略如图8所示。用一对该基因旁侧的引物(SEQ ID NOS：17和18)通过PCR扩增168phyA基因。用168phyA基因在BamHI及SacI限制位点取代pBI221载体的大肠杆菌β-D-葡萄糖醛酸甙酶(GUS)基因，以获得phyA-221中间载体。用HindIII和EcoRI消化含有用于筛选、由CaMV 35S启动子驱动的潮霉素抗生基因的pCAMBIA1300双链载体(GeneBank登记号为AF234296)，与经HindIII/EcoRI线性化的phyA-221中间载体连接，生成新的表达载体pCX-168phyA(图9)
6.5.2土壤杆菌培养和转化
用Hofgen和Willmitzer所述方法(1988，用于土壤杆菌转化的活性细胞储存，Nucleic Acids Res.16：9877)将两个单独的pCX-168phyA克隆(克隆04和13)转化入EHA 105根瘤土壤杆菌。将一个集落接种到含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的20mL LB液体培养基中，于28℃快速振摇孵育2天，直到培养悬液的OD600约为0.8～0.1。培养物于4000rpm离心10分钟，沉淀重悬于20mL的AMM培养基(见表1，见下文)中用于植物转化。
6.5.3转基因稻的产生
用日本稻Oryza sativa L.的驯化品系之一中华11号实施试验。将成熟的种子消毒，在N6D培养基上发芽两周。将鳞部的愈伤组织在N6D培养基上再传代培养一周。三周龄的愈伤组织在细胞悬液中浸泡20分子，用无菌滤纸将过量的细菌吸去。与细胞粘附的愈伤组织转移到置于N6DC培养基上的滤纸上，于25℃避光共培养3天。共培养后，用含500mg/mL AAD羧苄西林的培养基(见表1，下文)洗涤受感染的愈伤组织3次，用无菌滤纸干燥，然后转移到N6DS1培养基上(见表1，下文)。
愈伤组织在N6DS1培养基上培养2周，然后转移到N6DS2培养基上(见表1，下文)进行3～4周的进一步选择。耐受的愈伤组织转移到HIGROW培养基上(见表1，下文)进行10天避光预分化，然后各自转移到MSRS培养基(见表1，下文)中在生长小室中于24℃～26℃进行发芽再生，期间用来自荧光灯管、光通量密度为120μmol·m-2·s-1的光线照射16小时。再生植物转移到MSCN培养基上(见表1，下文)进一步生长。当耐受植物约10cm高时，将其转移到温室的土壤中，直到生长成熟。
6.5.4转基因烟草的产生
烟草驯化品种“GeXin NO 1”(红花烟草)的种子用30％(v/v)的Clorox消毒15分钟，用无菌水洗5次，在Murashige和Skoog基础培养基(MS培养基，Sigma M-9274，St.Louis，MO)发芽。秧苗在相同的培养基上于22℃进行16小时光/8小时暗期培养，光线为来自荧光灯管、光通量密度为50μmol·m-2·s-1的光线。
将一个含目标基因的EHA 105根瘤土壤杆菌集落接种到含50μg/mL卡那霉素、25μg/mL氯霉素和50μg/mL利复霉素的20mL LB液体培养基中，于28℃快速振摇孵育2天。将烟草的叶切成约1平方厘米的小片，在20mL细胞悬液中浸泡2～3分钟。用无菌滤纸将过量的细菌吸去，将外植体转到补充有2mg/L 6-BA(MSB培养基)的MS培养基上(见表1，下文)于避光于25～26℃培养2天。两天的共培养后，外植体转到含30mg/L潮霉素及500mg/L羧苄西林的MSB培养基在标准光照条件下于26℃发芽再生3～4周。当长到约1cm长时将耐受的芽切下来，转移到含25mg/L潮霉素及500mg/L羧苄西林的MS培养基中让其生根。当耐受植物约8cm高时，转移到温室的土壤中，直到生长成熟。每个pCX-168phyA克隆(004和013)可生成4棵植物，分别命名为0041、0042、0043、0044和0131、0132、0133、0134。
              表1用于组织培养和植物转化的培养基
培养基  成分
 N6D  N61，500mg/L酪蛋白，30g/L蔗糖，2.5mg/L 2，4-D，2.5g/L phytagel，pH5.7
 N6DC  N6D培养基加10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2
 AAM  AA2，500mg/L酪蛋白，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，200μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2
 AAD  AA，30g/L蔗糖，2，4-双氯苯氧乙酸(2，4-D)，pH5.7
 N6DS1  N6D培养基加500mg/L头孢噻肟及50mg/L潮霉素
 N6DS2  N6D培养基加300mg/L头孢噻肟及50mg/L潮霉素
 HIGROW  培养基(Gibco BRL 10924-017)加2.5g/L phytagel
 MSRS  MS培养基3(sigma M-9274)加2mg/L 6-苄氨基嘌呤
 (6-BA)，0.2mg/Lα-萘酸(NAA)，0.5mg/L玉米素(ZT)，200mg/L头孢噻肟及50mg/L潮霉素，pH5.8
 MSCN  MS培养基加0.2mg/L NAA及0.5mg/L矮壮素(氯化氯胆碱(CCC)
1Zhu Z-Q，Wang J-J，Sun J-S，Xu Z，Yin G-C，Zhu-Y，Bi F-Y，1975，通过氮来源比较试验建立稻的花药培养的高效培养基，Sci Sin 18：659-668(英文摘要)。
2Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T.，1994，土壤杆菌介导的高效稻(Oryza sativa L.)转化及T-DNA的边界序列分析，Plant J 6：271-282。
3Murashige T.和Skoog F.，1962，一种用于烟草组织培养快速速生长及生物测定的修正培养基，Plant Pysiol.15：473-479。
这些转基因烟草的克隆如下部分所述进行鉴定和描述。
6.5.5 DNA制备及PCR分析
用PCR检测特异的潮霉素B抗性基因DNA序列。用下面的方法从已转化和未转化(对照)的植物制备基因组DNA：植物叶称重，匀浆前于液氮中冷冻。50mg植物组织中加入600μL提取缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0，50mM EDTA，500mM NaCl和10mMβ-巯基乙醇)，混合物煮沸10分钟。混合物置冰上冷却，以16000g离心15分钟。然后将上清中的植物基因组DNA用0.1倍体积的10M醋酸铵和2.0倍体积的无水乙醇于-20℃沉淀2小时。以16000g离心30分钟将基因组DNA沉淀下来。DNA沉淀用75％(v/v)洗涤，重新溶于水中。一般地，0.1g植物组织可得50μg植物基因组DNA。
PCR反应由{94℃变性30秒，56℃退火40秒，72℃延伸60秒}的条件循环30次构成。潮霉素B抗性基因的正义和反义引物分别为：5’-CTACAAA-GATCGTTATGTTTATCGGCA-3’(SEQ ID NO：19)和5’-AGACCAATGCGGAG-CATATACG-3’(SEQ ID NO：20)，并扩增出一个潮霉素B抗性基因(E00287)序列162～803之间的641bp片段。正义及反义引物(SEQ ID NOS：17和18)用于扩增168phyA基因。转基因烟草的PCR筛选结果如图10所示。如图10A所示，所有转基因烟草均产生了潮霉素B抗性基因的PCR产物，包括用pCAMBIA 1300转化的植物。相反，用pCX-168phyA而不是用pCAMBIA 1300转化的植物产生了168phyA基因pCR产物。这些结果表明，pCX-168phyA和pCAMBIA 1300成功地用上述方法导入了相应烟草的基因组中。
6.5.6 RNA印迹(Northern blotting)
用从植物叶提取的总RNA作为RNA印迹检测的模板。不同转基因植物个体的RNA上样到1％琼脂糖凝胶适当地分离开来，通过毛细管样作用过夜转移到尼龙膜上。以不含细菌信号肽、DIG标记的168phyA基因cDNA的探针进行RNA杂交。所有涉及试剂均购自RocheDiagnostics(香港)，所有程序均按厂商的手册操作。转基因烟草系F0及F1的RNA印迹结果分别如图11和16所示。F0系0042、0043及0134的蛋白提取物中检测到了植酸酶。如图16所示，mRNA表达遗传到了0042和0134的F1系。
6.5.7蛋白质印迹(Western blotting)
用烟草叶提取的总蛋白进行蛋白质印迹试验。用SDS-PAGE在10％丙烯酰胺凝胶上适当分离各个蛋白质样品，于4℃以100V电压转膜1小时，转到硝化纤维素膜上。用枯草芽孢杆菌中超表达的168phyA基因所编码植酸酶免疫兔产生多克隆抗-168phyA抗体。多克隆抗体用野生型烟草吸附，然后作为探针加到样品蛋白。用NBT/BCIP底物根据厂商的方案进行信号检测。
F0和F1转基因烟草的蛋白质印迹结果分别如图12和17所示。从F0系0042、0043和0134的蛋白提取物中检测到了植酸酶。如图17所示，植酸酶的表达遗传到的0042的F1系。一般地，转基因蛋白在转基因植物提取物中检测不到，因为其表达水平太低。例如，烟草叶中表达的重组真菌植酸酶(phyA)经过层析纯化(Ullah等，1999，同上)后仅能达到蛋白质印迹的信号。因此，图12和图17所示蛋白质印迹中植酸酶显影表明转基因植物中的植酸酶表达水平很高。
6.5.8 DNA印迹(Southern blotting)
使用植物叶提取的基因组DNA进行DNA印迹。在RNase活性存在的条件下用HindIII限制性内切酶切割基因组DNA。不同转基因植物个体的消化DNA上样到0.7％琼脂糖凝胶，进行适当分离，通过毛细管样作用过夜转移到尼龙膜上。以不含细菌信号肽、DIG标记的168phyA基因cDNA的探针进行RNA杂交。所有涉及试剂均购自RocheDiagnostics(香港)，所有程序均按厂商的手册操作。
如图15所示，在F1系(0042和0134)中检测到了特异性条带，但在对照系中未检测到。0042的F1系(42-1和42-2)含单个拷贝的基因，而0134(134-1)的F1系则有两个基因拷贝。
6.5.9对照烟草及转基因烟草的表型
烟草是植物转化中很好的模型系统，因为它的转化率高，在组织培养中易于繁殖。烟草因其阔叶被认为是双子叶植物，其阔叶具有很高的商业价值。烟草为一年生植物，可在120天内完成其生命周期。当在22℃以上温度，光周期长于14小时生长时，从秧苗到第一次开花需要96～100天。从一棵烟草植物可获得20-30粒果实，每粒果实重约0.3～0.4克，含1000粒以上的种子。一般地，一棵烟草植物在第一朵花盛开30天后产生能发芽的种子。
转化后转基因植物的表型也继承下来了，其表型如表2所示。一般地，用植酸酶基因转化的植物在第一朵花盛开时高101～130cm，比用载体转化的植物第一朵花盛开时的高度(138～158cm)矮。开花后，用植酸酶基因转化的植物其高度(142～168cm)仍比用载体转化的植物(182-206)矮。即使用植酸酶基因转化的植物一般要矮一些，其通常比用载体转化的植物(6枝)具有更多的花枝(每棵植物8～10枝)(见表2及图13)。从形态学上看，植酸酶转化的植物中有4种发育成不止一个侧枝(图14)。至于花蕾的数目，用植酸酶基因转化的植物其花蕾数比仅用载体转化的植物多(见表2)。至于花期，用植酸酶基因转化的植物其花期(50到超过88天)比仅用载体转化的植物(35～37天)长(见表2)
6.5.10转基因烟草幼苗在磷酸盐缺乏条件下生长
对照及转基因(42-1系)F2烟草种子用33％(v/v)的Clorox消毒15分钟，用无菌水洗5次，接种到MS培养基(包括1.25mM磷酸盐和30g/L蔗糖)中。15天后，幼苗转移到改进MS培养基(不含磷酸盐，蔗糖浓度降到5g/L)中再培养17天。发现在磷酸盐饥饿试验中，与对照幼苗相比，转基因系的生物量多于对照系(图18)。
6.5.11转基因烟草幼苗在低磷酸盐条件下生长
表面消毒的对照种子及转基因烟草种子种到含20mL改进MS琼脂培养基(标准MS培养基，另外加入10g/L蔗糖、10-3M或10-5M磷酸盐)的petri皿(每个9cm皿60粒种子)中。20天后，从高磷酸盐(10-3M)或低磷酸盐(10-5M)板中的9棵幼苗转移到含不同浓度磷酸盐(10-3M、10-4M或10-5M)的组织培养盒(7cm×7cm，50mL改进MS琼脂)中。在收获、测定干重前幼苗再生长30天。每棵植物单独称重。每组称18棵，其平均值如图19所示。转基因系0042比对照系长得粗，尤其是磷的利用受到限制时，两者的差别具有统计学意义。另外，也完成了幼苗在液体培养基中生长的试验。简单地说，烟草种子种到MS0基质中(30g蔗糖，1.25mM磷)培养10天。每个系的25棵植物分成5组，每组测定干重。如图20所示，在低磷酸盐条件下转基因系(0042和0134)的干重比对照系重。
6.5.12用HPLC分析植酸酶的体外活性
5g嫩叶组织浸入10mL预冷的提取缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH7.0，1mM苯甲磺酰氟及0.1mM CaCl2)。以12000g离心20分钟收集水相中的可溶蛋白，用Bradford蛋白质测定法(Bio-Rad)定量蛋白浓度。为了评价植物提取物中的植酸酶活性，取对照系及转基因植物的200μg蛋白与400μg IP6(Sigma，P8810)于37℃孵育。在4、6及8小时时，加入一倍体积的0.05M HCl终止酶反应。为了比较植物提取物的植酸酶活性，用阴离子交换层析(Sandberg和Ahdernne，1986，测定食物及小肠内容物中肌醇三磷酸盐、肌醇四磷酸盐、肌醇五磷酸盐和肌醇六磷酸盐的HPLC方法，Journal of Food Science 51(3)：547-550)纯化肌醇磷酸盐(IP6、IP5、IP4和IP3)。简单地说，0.5mL酶混合物上样到2mL AG-1X8阴离子交换柱(Bio-Rad)，用10倍柱体积的0.025M HCl洗去杂质。随后，用3M HCl洗脱肌醇磷酸盐。洗脱样品冻干，重悬于100μL移动相[50％(v/v)甲醇，0.1％(v/v)甲酸]，1.5％(v/v)盐酸四丁铵及0.05M EDTA进行HPLC(waters 600)分析(Sandberg和Ahdernne，1986，同上)。在C18柱(Alltech Alltima C18)中注入20μL进行肌醇磷酸盐测定。用屈光指数检测器(Shimadzu R1D-10A，Shimadzu Corporation，日本)衡量IP6和IP5各自的峰值，并计算IP6/IP5比值。与植物提取物刚混合时，肌醇六磷酸底物的IP6/IP5比值为3.61±0.14(n＝4)。在孵育过程中，IP6逐渐降解成低磷酸化的磷酸盐(IP5、IP4和IP3)，因而随着时间的推移IP6/IP5比值也下降。如图21所示，42系(N＝4)的植物提取特获得的IP6/IP5比值比从对照植物(N＝4)获得的比值低。
总而言之，用植酸酶基因转化的烟草植物具有下列表型：(1)开花茎增多；(2)主干茎增多；(3)蕾数增多，及(4)花期延长(见表2)。可以预料的是植酸酶基因转化的烟草植物将比对照植物具有更多的果实，因为前者的花蕾数增加了。
                                                   表2
                                           转基因烟草植物的表型
植物系 转移至土壤的时间 第一朵花开的时间  第一朵花开时的植物高度(cm)   开花后的植物高度(cm) 主要花茎数 主干茎数* 花蕾数* 开花天数
    0042   6月8日   8月25日     102     142     10     3     74     ＞88+
    0043   6月8日   9月8日     101     142     9#     3     31#     58
    0131   6月8日   9月12日     125     160     8     1     33     3
    0133   6月8日   9月10日     130     168     8#     3     47#     44
    0134   6月8日   9月4日     120     150     9#     2     36#     50^
  载体对照1   6月8日   9月4日     135     182     6     1     30     36
  载体对照2   6月15日   9月16日     158     206     6     1     37     34
  非转基因对照   6月8日   9月22日     150     185     6     1     32     35
*数据于2001年10月4日采集
#仅计算第一主茎上的花蕾。侧枝上的花蕾还未成熟到用于计算。
+至2001年11月20日
^新花于2001年11月8日开。
7.等效物
本领域内的熟练技术人员将认识到，或仅使用常规试验能确定本文所述本发明特定实施方案的许多等效物。此类等效物也属于后面权利要求所包含的范围。
本说明书中提到的所有出版物、专利及专利申请均被引入说明书作为参考，如同每一单独出版物、专利或专利申请具体地、单独地指出将其引入作为参考一样。
在本文中引用或讨论的参考文献不应解释为承认它是本发明的现有技术。
                      序列表
<110>香港大学
<120>重组芽孢杆菌植酸酶及其用途
<130>9661-020-888
<140>60/332,060
<141>2001-11-21
<160>24
<170>FastSEQ for Windowa Version 4.0
<210>1
<211>1390
<212>DNA
<213>Bacillus licheniformis
<220>
<221>CDS
<222>(241)...(1390)
<400>1
ttttacccga tggatgggga cttaaacgaa cttgcgtttg agatatacat tccgattcat 60
tgagagatag cgatgttaaa ggcagccccc ggaaaaaatt ccgggggttt tctttgggtt 120
tcgtactcta gagtatcggc ggtctttttt agccatcact tttaacaaaa gtttacatac 180
cctcaaatga taattttcat tggtttgcta ggataaatgt tatgaaaagg aggttaatat 240
atgaactttt acaaaacgct cgctttatca acactcgcag catccttatg gtctccctca 300
tggagcagtc tcccccataa cgaagctgcg gctcacaaag aattcacggt gactgccgat 360
gcagagacag agccggtgga tacccctgac gacgcggcag atgacccggc gatttgggtt 420
catccgaagc agcctgaaaa aagcaggctc atcaccacaa acaaaaagtc gggcttaatc 480
gtctatgatt tgaagggaaa acagcttgcg gcctatccgt ttggcaaatt aaacaatgtc 540
gacctgcgct acaattttcc gctcgatggc aaaaaaattg atattgccgg ggcctcaaac 600
cggtcagacg gcaaaaacac ggttgaaatt tacgcctttg acggcgaaaa aagcaagctg 660
aagaacatcg tcaatcctca aaaacctatt caaaccgata tccaggaggt atatggcttc 720
agcctgtatc acagccagaa aaccggcaag ttctacgcca tggtgaccgg aaagaacgga 780
gaattcgagc aatatgaact gtttgacaac ggaaaaggac aagtcgaggg caaaaaggtc 840
cgctcattca aaatgagctc tcaascagaa gggcttgcgg cagatgatga atacggcaaa 900
atgtacatcg ccgaagaaga cgttgcgatt tggtctttca gcgccgagcc ggacggcgga 960
gataaaggaa aaatcgtcga tcgtgccgac ggaccgcatc taacttctga tattgaaggg 1020
ctgacgattt actacggaga agacggagaa gggtatttga tcgcgtccag tcagggcgat 1080
aaccgctatg ccatctatga ccggcgcggg aaaaacgact acgtaactgc tttttcaatt 1140
gaggacggca aagaaatcga cgggacaagc gataccgatg gaatcgacgt catcggcttc 1200
ggcctcggca aaacatatcc atacggcatc tttgtcgacc aagacggcga aaatacggaa 1260
aatggacaac cggccaatca gaacttcaaa attgtctcct gggaaaaaat cgccgacgcg 1320
ctggacgaca aacctgatat cgatgatcag gtcgatcccc gaaaactgaa aaaccgagcc 1380
aaataaggac                                                        1390
<210>2
<211>381
<212>PRT
<213>Bacillus licheniformis
<400>2
Met Asn Phe TyL Lys Thr Leu Ala Leu Ser Thr Leu Ala Ala Ser Leu
 1               5                  10                  15
Trp Ser Pro Ser Trp Ser Ser Leu Pro His Asn Glu Ala Ala Ala His
            20                  25                  30
Lys Glu Phe Thr Val Thr Ala Asp Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp Thr
        35                  40                  45
Pro Asp Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala Ile Trp Val His Pro Lys Gln
    50                  55                  60
Pro Glu Lys Ser Arg Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Ile
65                   70                  75                  80
Val Tyr Asp Leu Lys Gly Lys Gln Leu Ala Ala Tyr Pro Phe Gly Lys
                 85                  90                  95
Leu Asn Asn Val Asp Leu Arg Tyr Asn Phe Pro Leu Asp Gly Lys Lys
            100                 105                 110
Ile Asp Ile Ala Gly Ala Ser Asn Arg Ser Asp Gly Lys Asn Thr Val
        115                 120                 125
Glu Ile Tyr Ala Phe Asp Gly Glu Lys Ser Lys Leu Lys Asn Ile Val
    130                 135                 140
Asn Pro Gln Lys Pro Ile Gln Thr Asp Ile Gln Glu Val Tyr Gly Phe
145                 150                 155                 160
Ser Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Lys Phe Tyr Ala Met Val Thr
                165                 170                 175
Gly Lys Asn Gly Glu Phe Glu Gln Tyr Glu Leu Phe Asp Asn Gly Lys
            180                 185                 190
Gly Gln Val Glu Gly Lys Lys Val Arg Ser Phe Lys Met Ser Ser Gln
        195                 200                 205
Thr Glu Gly Leu Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Lys Met Tyr Ile Ala
    210                 215                 220
Glu Glu Asp Val Ala Ile Trp Ser Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly Gly
225                 230                 235                 240
Asp Lys Gly Lys Ile Val Asp Arg Ala Asp Gly Pro His Leu Thr Ser
                245                 250                 255
Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Gly Glu Asp Gly Glu Gly Tyr
            260                 265                 270
Leu Ile Ala Ser Ser Gln Gly Asp Asn Arg Tyr Ala Ile Tyr Asp Arg
        275                 280                 285
Arg Gly Lys Asn Asp Tyr Val Thr Ala Phe Ser Ile Glu Asp Gly Lys
    290                 295                 300
Glu Ile Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Ile Gly Phe
305                 310                 315                 320
Gly Leu Gly Lys Thr Tyr Pro Tyr Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp Gly
                325                 330                 335
Glu Asn Thr Glu Asn Gly Gln Pro Ala Asn Gln Aan Phe Lys Ile Val
            340                 345                 350
Ser Trp Glu Lys Ile Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Pro Asp Ile Asp
        355                 360                 365
Asp Gln Val Asp Pro Arg Lys Leu Lys Asn Arg Ala Lys
    370                 375                 380
<210>3
<211>1380
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<220>
<221>CDS
<222>(100)...(1248)
<400>3
gagtcagaaa ccctataaaa aaaggttcat tttcctcacg gtaatcacct gtatatattt 60
tacaatagta gtgttagtga taaaagagga gggtaccaa atg aag gtt cca aaa    114
                                           Met Lys Val Pro Lys
                                            1               5
aca atg ctg cta agc act gcc gcg ggt tta ttg ctt agc ctg aca gca   162
Thr Met Leu Leu Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu Leu Ser Leu Thr Ala
                 10                  15                  20
acc tcg gtg tcg gct cat tat gtg aat gag gaa cat cat ttc aaa gtg   210
Thr Ser Val Ser Ala His Tyr Val Asn Glu Glu His His Phe Lys Val
             25                  30                  35
act gca cac acg gag aca gat ccg gtc gca tct ggc gat gat gca gca   258
Thr Ala His Thr Glu Thr Asp Pro Val Ala Ser Gly Asp Asp Ala Ala
         40                  45                  50
gat gac ccg gcc att tgg gtt cat gaa aaa cac ccg gaa aaa agc aag   306
Asp Asp Pro Ala Ile Trp Val His Glu Lys His Pro Glu Lys Ser Lys
     55                  60                  65
ttg att aca aca aat aag aag tca ggg ctc gtt gtg tat gat tta gac   354
Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Val Val Tyr Asp Leu Asp
 70                  75                  80                  85
gga aaa cag ctt cat tct tat gag ttt ggc aag ctc aat aat gtc gat   402
Gly Lys Gln Leu His Ser Tyr Glu Phe Gly Lys Leu Asn Asn Val Asp
                 90                  95                 100
ctg cgc tat gat ttt cca ttg aac ggc gaa aaa att gat att gct gcc   450
Leu Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Glu Lys Ile Asp Ile Ala Ala
            105                 110                 115
gca tcc aac cgg tcc gaa gga aaa aat aca att gaa gta tat gca ata   498
Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr Ile Glu Val Tyr Ala Ile
        120                 125                 130
gac ggg gat aaa gga aaa ttg aaa agc att aca gat ccg aac cat cct   546
Asp Gly Asp Lys Gly Lys Leu Lys Ser Ile Thr Asp Pro Asn His Pro
    135                 140                 145
att tcc acc aat att tct gag gtt tat gga ttc agc ttg tat cac agc   594
Ile Ser Thr Asn Tle Ser Glu Val Tyr Gly Phe Ser Leu Tyr His Ser
150                 155                 160                 165
cag aaa aca gga gca ttt tac gca tta gtg aca ggc aaa caa ggg gaa   642
Gln Lys Thr Gly Ala Phe Tyr Ala Leu Val Thr Gly Lys Gln Gly Glu
                170                 175                 180
ttt gag cag tat gaa att gtt gat ggt gga aag ggt tat gta aca ggg   690
Phe Glu Gln Tyr Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys Gly Tyr Val Thr Gly
            185                 190                 195
aaa aag gtg cgt gaa ttt aag ttg aat tct cag acc gaa ggc ctt gtt   738
Lys Lys Val Arg Glu Phe Lys Leu Asn Ser Gln Thr Glu Gly Leu Val
        200                 205                 210
gcg gat gat gag tac gga aac cta tac ata gca gag gaa gat gag gcc   786
Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr Ile Ala Glu Glu Asp Glu Ala
    215                 220                 225
atc tgg aaa ttt aac gct gag ccc ggc gga ggg tca aag ggg cag gtt   834
Ile Trp Lys Phe Asn Ala Glu Pro Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gln Val
230                 235                 240                 245
gtt gac cgt gcg aca gga gat cat ttg aca gct gat att gaa gga ctg   882
Val Asp Arg Ala Thr Gly Asp His Leu Thr Ala Asp Ile Glu Gly Leu
                250                 255                 260
aca atc tat tat gca cca aat ggc aaa gga tat ctc atg gct tca agt   930
Thr Ile Tyr Tyr Ala Pro Asn Gly Lys Gly Tyr Leu Met Ala Ser Ser
            265                 270                 275
caa gga aat aac agc tat gca atg tat gaa cgg cag ggg aaa aat cgc   978
Gln Gly Asn Asn Ser Tyr Ala Met Tyr Glu Arg Gln Gly Lys Asn Arg
        280                 285                 290
tat gta gcc aac ttt gag att aca gat ggc gag aag ata gac ggt act   1026
Tyr Val Ala Asn Phe Glu Ile Thr Asp Gly Glu Lys Ile Asp Gly Thr
    295                 300                 305
agt gac acg gat ggt att gat gtt ctc ggt ttc gga ctt ggc cca aaa   1074
Sar Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly Phe Gly Leu Gly Pro Lys
310                 315                 320                 325
tat ccg tac ggg att ttt gtg gcg cag gac ggc gaa aat att gat aac   1122
Tyr Pro Tyr Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp Gly Glu Asn Ile Asp Asn
                330                 335                 340
gga caa gcc gtc aat caa aat ttc aaa att gta tcg tgg gaa caa att   1170
Gly Gln Ala Val Asn Gln Asn Phe Lys Ila Val Ser Trp Glu Gln Ile
            345                 350                 355
gca cag cat ctc ggc gaa atg cct gat ctt cat aaa cag gta aat ccg   1218
Ala Gln His Leu Gly Glu Met Pro Asp Leu His Lys Gln Val Asn Pro
        360                 365                 370
agg aag ctg aaa gac cgt tct gac ggc tag aatagaaagc agcttgtgca     1268
Arg Lys Leu Lys Asp Arg Ser Asp Gly  *
    375                 380
gctgcttttt tctatgaata aaaaaatcgt tcatagcaat gaacgatttt tcaagaaagc 1328
gccagatgaa tcgcttttag ttttgcagga agctcatcaa acgtaaatgc gg         1380
<210>4
<211>382
<212>PRT
<213>Bacillus subtilis
<400>4
Met Lys Val Pro Lys Thr Met Leu Leu Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu
 1               5                  10                  15
Leu Ser Leu Thr Ala Thr Ser Val Ser Ala His Tyr Val Asn Glu Glu
            20                  25                  30
His His Phe Lys Val Thr Ala His Thr Glu Thr Asp Pro Val Ala Ser
        35                  40                  45
Gly Asp Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ale Ile Trp Val His Glu Lys His
    50                  55                  60
Pro Glu Lys Ser Lys Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Val
65                  70                  75                  80
Val Tyr Asp Leu Asp Gly Lys Gln Leu His Ser Tyr Glu Phe Gly Lys
                85                  90                  95
Leu Asn Asn Val Asp Leu Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Glu Lys
            100                 105                 110
Ile Asp Ile Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr Ile
        115                 120                 125
Glu Val Tyr Ala Ile Asp Gly Asp Lys Gly Lys Leu Lys Ser Ile Thr
    130                 135                 140
Asp Pro Asn His Pro Ile Ser Thr Asn Ile Ser Glu Val Tyr Gly Phe
145                 150                 155                 160
Ser Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Ala Phe Tyr Ala Leu Val Thr
                165                 170                 175
Gly Lys Gln Gly Glu Phe Glu Gln Tyr Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys
            180                 185                 190
Gly Tyr Val Thr Gly Lys Lys Val Arg Glu Phe Lys Leu Asn Ser Gln
        195                 200                 205
Thr Glu Gly Leu Val Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr Ile Ala
    210                 215                 220
Glu Glu Asp Glu Ala Ile Trp Lys Phe Asn Ala Glu Pro Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ser Lys Gly Gln Val Val Asp Arg Ala Thr Gly Asp His Leu Thr Ala
                245                 250                 255
Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Ala Pro Asn Gly Lys Gly Tyr
            260                 265                 270
Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly Asn Asn Ser Tyr Ala Met Tyr Glu Arg
        275                 280                 285
Gln Gly Lys Asn Arg Tyr Val Ala Asn Phe Glu Ile Thr Asp Gly Glu
    290                 295                 300
Lys Ile Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly Phe
305                 310                 315                 320
Gly Leu Gly Pro Lys Tyr Pro Tyr Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp Gly
                325                 330                 335
Glu Asn Ile Asp Asn Gly Gln Ala Val Asn Gln Asn Phe Lys Ile Val
            340                 345                 350
Ser Trp Glu Gln Ile Ala Gln His Leu Gly Glu Met Pro Asp Leu His
        355                 360                 365
Lys Gln Val Asn Pro Arg Lys Leu Lys Asp Arg Ser Asp Gly
    370                 375                 380
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>6，9，18
<223>n＝.deoxyincsine
<400>5
gaygcngcng aygayccngc                                             20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>18
<223>n＝deoxyinosine
<400>6
tcrtaytgyt craaytcncc                                             20
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>7
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<210>8
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
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atggatcctc aggctgcttc ggatgaa                                     27
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>9
atgaattcat ggcttcagcc gtatcac                                     27
<210>10
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>10
atggatccgt gtttttgccg tctgacc                                     27
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
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<211>27
<212>DNA
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<220>
<223>引物
<400>12
atggatcctc atagatggca tagcggt                                     27
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>13
atttaacata tgaactttta caaaacgctc                                  30
<210>14
<211>26
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<213>Artificial sequence
<220>
<223>引物
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atggatccgt ccttatttgg ctcggt                                      26
<210>15
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>15
aggaattcca tatgaaggtt ccaaaaacaa tgc                              33
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<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>16
taggatcctc atctggcgct ttcttgt                                     27
<210>17
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>17
atggatccat ggctcattat gtgaatgagg aacat                            35
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>18
attagagctc ctagccgtca gaacggtctt                                  30
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>19
ctacaaagat cgttatgttt atcggca                                     27
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>引物
<400>20
agaccaatgc ggagcatata cg                                          22
<210>21
<211>1290
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>21
cacatttgac aattttcaca aaaacttaac actgacaatc atgtatatat gttacaattg 60
aagtgcacgt tcataaaagg aggaagtaaa atgaatcatt caaaaacact tttgttaacc 120
gcggcggccg gactgatgct cacatgcggt gcggtgtctt cccaggcaaa gcataagctg 180
tccgatcctt atcattttac cgtgaatgca gcggcggaaa cggaaccggt tgatacggcc 240
ggtgacgcgg ctgatgatcc tgcgatttgg ctggacccca agactcctca gaacagcaaa 300
ttgattacga ccaataaaaa atcaggttta gtcgtttaca gccttgatgg taagatgctt 360
cattcctata ataccgggaa gctgaacaat gtcgatatcc gttatgattt tccgttgaac 420
ggcaaaaaag tcgatatcgc ggcagcatcc aatcggtctg aaggaaaaaa taccattgag 480
atttacgcta ttgatggaaa aaacggcaca ttacaaagca tgacagatcc agaccatccg 540
attgcaacag caattaatga ggtatacggt tttaccttat accacagtca aaaaacagga 600
aaatattacg cgatggtgac aggaaaagag ggtgaatttg aacaatacga attaaaggcg 660
gacaaaaatg gatacatatc cggcaaaaag gtacgggcgt ttaaaatgaa ttcccagacg 720
gaagggatgg cagcagacga tgaatacggc aggctttata tcgcagaaga agatgaggcc 780
atttggaagt tcagcgccga gccggacggc ggcagtaacg gaacggttat cgaccgtgcc 840
gacggcaggc atttaactcg tgatattgaa ggattgacga tttactacgc tgctgacggg 900
aaaggctatc tgatggcatc aagccaggga aacagcagct acgccattta tgacagacaa 960
ggaaagaaca aatatgttgc ggattttcgc ataacagacg gtcctgaaac agacgggaca 1020
agcgatacag acggaattga cgttctgggt ttcggactgg ggcctgaata tccgttcggt 1080
atttttgtcg cacaggacgg tgaaaatata gatcacggcc aaaaggccaa tcaaaatttt 1140
aaaatcgtgc catgggaaag aattgctgat caaatcggtt tccgcccgct ggcaaatgaa 1200
caggttgacc cgagaaaact gaccgacaga agcggaaaat aaacatgcaa aaagcagctt 1260
atacaagctg ctttttgcat gtgaagaacg                                  1290
<210>22
<211>383
<212>PRT
<213>Bacillus subtilis
<400> 22
Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser Gln Ala Lys His Lys Leu Ser Asp
            20                  25                  30
Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp
        35                  40                  45
Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala Ils Trp Leu Asp Pro Lys
    50                  55                  60
Thr Pro Gln Asn Ser Lys Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Val Val Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Met Leu His Ser Tyr Asn Thr Gly
                85                  90                  95
Lys Leu Asn Asn Val Asp Ile Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys
            100                 105                 110
Lys Val Asp Tle Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr
        115                 120                 125
Ile Glu Ile Tyr Ala Ile Asp Gly Lys Asn Gly Thr Leu Gln Ser Met
    130                 135                 140
Thr Asp Pro Asp His Pro Ile Ala Thr Ala Ile Asn Glu Val Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Phe Thr Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Val
                165                 170                 175
Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Glu Gln Tyr Glu Leu Lys Ala Asp Lys
            180                 185                 190
Asn Gly Tyr Ile Ser Gly Lys Lys Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser
        195                 200                 205
Gln Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Leu Tyr Ile
    210                 215                 220
Ala Glu Glu Asp Glu Ala Ile Trp Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly
225                 230                 235                 240
Gly Ser Asn Gly Thr Val Ile Asp Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr
                245                 250                 255
Arg Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly
            260                 265                 270
Tyr Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly Asn Ser Ser Tyr Ala Ile Tyr Asp
        275                 280                 285
Arg Gln Gly Lys Asn Lys Tyr Val Ala Asp Phe Arg Ile Thr Asp Gly
    290                 295                 300
Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly
305                 310                 315                 320
Phs Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro Phe Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp
                325                 330                 335
Gly Glu Asn Ile Asp His Gly Gln Lys Ala Asn Gln Asn Phe Lys Ile
            340                 345                 350
Val Pro Trp Glu Arg Ile Ala Asp Gln Ile Gly Phe Arg Pro Leu Ala
        355                 360                 365
Asn Glu Gln Val Asp Pro Arg Lys Leu Thr Asp Arg Ser Gly Lys
    370                 375                 380
<210>23
<211>1724
<212>DNA
<213>Bacillus sp.
<400>23
catatgttga acaatttcag cgagttaatg aaagaaacca ataaatcaaa aattagagaa 60
aaacattaat ctgatgcgct ttcatatcgc gttacccgat taatagaata gaaattacaa 120
ataaaacatt gtactaaata ttcattttaa atatttgctc acgtcaattt tttctcttca 180
taaatcctca cattcggaca atcttcacaa aaacttaaca ctgaacttcc tgtatgtatt 240
ttacaattaa agtgcacgtt cataaaagga ggatggaaaa tgaatcattc aaaaacactt 300
ttgttaaccg cggcagccgg attgatgctc acatgcggtg cggtttcttc tcaggccaaa 360
cataagctgt ctgatcctta tcattttacc gtgaatgcgg cggcggaaac ggagccggtt 420
gatacagccg gtgatgcagc tgatgatcct gcgatttggc tggaccccaa gaatcctcag 480
aacagcaaat tgatcacaac caataaaaaa tcaggcttag ccgtgtacag cctagaggga 540
aagatgcttc attcctatca taccgggaag ctgaacaatg ttgatatccg atatgatttt 600
ccgttgaacg gaaaaaaagt cgatattgcg gcggcatcca atcggtctga aggaaagaat 660
accattgaga tttacgccat tgacgggaaa aacggcacat tacaaagcat tacggatcca 720
aaccgcccga ttgcatcagc aattgatgaa gtatacggtt tcagcttgta ccacagtcaa 780
aaaacaggaa aatattacgc gatggtgaca ggaaaagaag gcgaatttga acaatacgaa 840
ttaaatgcgg ataaaaatgg atacatatcc ggcaaaaagg taagggcgtt taaaatgaat 900
tctcagacag aagggatggc agcagacgat gaatacggca gtctttatat cgcagaagaa 960
gatgaggcca tctggaagtt cagcgctgag ccggacggcg gcagtaacgg aacggttatc 1020
gatcgtgccg atggcaggca tttaacccct gatattgaag gactgacgat ttactacgct 1080
gctgacggga aaggctatct gcttgcctca agccagggta acagcagcta tgcgatttat 1140
gaaagacagg gacagaacaa atatgttgcg gactttcaga taacagacgg gcctgaaaca 1200
gacggcacaa gcgatacaga cggaattgac gttctgggtt tcgggctggg gcctgaatat 1260
ccgttcggtc tttttgtcgc acaggacgga gagaatatag atcacggcca aaaggccaat 1320
caaaatttta aaatggtgcc atgggaaaga atcgctgata aaatcggctt tcacccgcag 1380
gtcaataaac aggtcgaccc gagaaaaatg accgacagaa gcggaaaata aacatgaaaa 1440
aagcagctta tccaagctgc tttttgatgt gaagagcgtt tcatgagaaa gtcttggaac 1500
ggatagccgt aagcacagcc ggcagccggt catacgtgta cgccggtact gtctcttgat 1560
aattaagcgc cgcgatttgt ttacgttcac ccgggtttgt catataaaaa tggatcttat 1620
ccggaaaatc cgcaaacccg ctgtaagaaa caaatgttga aaacgggggc gcgggagaaa 1680
ggtctgtcag ctgaaaggcc tgacaagccg caatgtctaa gctt                  1724
<210>24
<211>383
<212>PRT
<213>Bacillus sp.
<400>24
Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met
 1               5                  10                  15
Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser Gln Ala Lys His Lys Leu Ser Asp
            20                  25                  30
Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp
        35                  40                  45
Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala Ile Trp Leu Asp Pro Lys
    50                  55                  60
Asn Pro Gln Asn Ser Lys Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Ala Val Tyr Ser Leu Glu Gly Lys Met Leu His Ser Tyr His Thr Gly
                85                  90                  95
Lys Leu Asn Asn Val Asp Ile Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys
            100                 105                 110
Lys Val Asp Ile Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr
        115                 120                 125
Ile Glu Ile Tyr Ala Ile Asp Gly Lys Asn Gly Thr Leu Gln Ser Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Pro Asn Arg Pro Ile Ala Ser Ala Ile Asp Glu Val Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Phe Ser Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Lys Tyr Tyr Als Met Val
                165                 170                 175
Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Glu Gln Tyr Glu Leu Asn Ala Asp Lys
            180                 185                 190
Asn Gly Tyr Ile Ser Gly Lys Lys Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser
        195                 200                 205
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225                 230                 235                 240
Gly Ser Asn Gly Thr Val Ile Asp Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr
                245                 250                 255
Pro Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly
            260                 265                 270
Tyr Leu Leu Ala Ser Ser Gln Gly Asn Ser Ser Tyr Ala Ile Tyr Glu
        275                 280                 285
Arg Gln Gly Gln Asn Lys Tyr Val Ala Asp Phe Gln Ile Thr Asp Gly
    290                 295                 300
Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly
305                 310                 315                 320
Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro Phe Gly Leu Phe Val Ala Gln Asp
                325                 330                 335
Gly Glu Asn Ile Asp His Gly Gln Lys Ala Asn Gln Asn Phe Lys Met
            340                 345                 350
Val Pro Trp Glu Arg Ile Ala Asp Lys Ile Gly Phe His Pro Gln Val
        355                 360                 365
Asn Lys Gln Val Asp Pro Arg Lys Met Thr Asp Arg Ser Gly Lys
    370                 375                 380

Claims (80)

1.一种分离的核酸分子，其包含编码phyL多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
2.权利要求1中的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列为SEQID NO：1。
3.权利要求1中的分离的核酸分子，其中该分子为DNA。
4.权利要求1中的分离的核酸分子，其中该分子为RNA。
5.包含权利要求3中核酸分子的载体。
6.包含权利要求5中载体的宿主细胞。
7.包含权利要求3中核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子与异源启动子操纵性连接。
8.权利要求7中的宿主细胞，其中异源启动子为105原噬菌体启动子。
9.权利要求6、7或8的宿主细胞，它是芽孢杆菌。
10.权利要求9的宿主细胞，它是枯草芽孢杆菌MU331。
11.一种生产phyL多肽的方法，包括表达由权利要求6、7或8的宿主细胞的核酸所编码的多肽，以及回收phyL多肽。
12.权利要求11的方法，其中宿主细胞为芽孢杆菌。
13.权利要求12的方法，其中宿主细胞为枯草芽孢杆菌MU331。
14.一种制备能表达phyL多肽的细胞或其子代的方法，该方法包括用权利要求6的载体转染所述细胞。
15.权利要求14的方法，其中细胞为芽孢杆菌。
16.权利要求15的方法，其中细胞为枯草芽孢杆菌MU331。
17.一种分离的核酸分子，其可在严格条件下与权利要求1或2中核酸分子或其互补分子杂交，其中所述核酸分子编码在中性pH下催化肌醇六磷酸盐转化成无机磷酸盐和肌-肌醇磷酸盐的氨基酸序列。
18.一种分离的多肽，其由权利要求17中的核酸分子所编码。
19.一种分离的phyL多肽，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其能催化肌醇六磷酸盐转化成无机磷酸盐和肌-肌醇磷酸盐的至少20个氨基酸的片段。
20.包含核苷酸序列的分离的核酸分子，其中该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的168phyA多肽。
21.权利要求20的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列为SEQID NO：3。
22.权利要求20的分离的核酸分子，其中所述分子为DNA
23.权利要求20的分离的核酸分子，其中所述分子为RNA
24.包含权利要求22中核酸分子的载体。
25.包含权利要求24中载体的宿主细胞。
26.包含权利要求22中的核酸分子的宿主细胞，所述核酸分子与异源启动子操纵性连接。
27.权利要求26中的宿主细胞，其中异源启动子为105原噬菌体启动子。
28.权利要求25、26或27的宿主细胞，它是芽孢杆菌。
29.权利要求28的宿主细胞，它是枯草芽孢杆菌MU331。
30.一种生产168phyA多肽的方法，包括表达由权利要求25、26或27的宿主细胞的核酸所编码的多肽，以及回收168phyA多肽。
31.权利要求30的方法，其中宿主细胞为芽孢杆菌。
32.权利要求31的方法，其中宿主细胞为枯草芽孢杆菌MU331。
33.一种制备能表达168phyA多肽的细胞或其子代的方法，该方法包括用权利要求24的载体转染所述细胞。
34.权利要求33的方法，其中细胞为芽孢杆菌。
35.权利要求34的方法，其中细胞为枯草芽孢杆菌MU331。
36.一种分离的核酸分子，其可在严格条件下与权利要求20或21中核酸分子或其互补分子杂交，其中所述核酸分子编码在中性pH下催化肌醇六磷酸盐转化成无机磷酸盐和肌-肌醇磷酸盐的氨基酸序列。
37.一种分离的多肽，其由权利要求36中核酸分子所编码。
38.一种分离的168phyA多肽，其具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其能催化肌醇六磷酸盐转化成无机磷酸盐和肌-肌醇磷酸盐的至少20个氨基酸的片段。
39.包含权利要求18中多肽的动物饲料。
40.包含权利要求19中多肽的动物饲料。
41.包含权利要求31中多肽的动物饲料。
42.包含权利要求32中多肽的动物饲料。
43.包含权利要求6、7、8、25、26及27中任一项的宿主细胞的动物饲料。
44.包含权利要求9中宿主细胞的动物饲料。
45.包含权利要求10中宿主细胞的动物饲料。
46.包含权利要求28中宿主细胞的动物饲料。
47.包含权利要求29中宿主细胞的动物饲料。
48.包含编码植酸酶的核苷酸序列的嵌合表达盒，其中所述植酸酶来自于芽孢杆菌菌株，并且所述核苷酸序列与调控性核苷酸序列操纵性连接以使所述调控性核苷酸序列能导致所述核苷酸序列在植物细胞中表达，其中调控性核苷酸序列与所述核苷酸序列异源。
49.权利要求48的嵌合表达盒，其中所述植酸酶在细胞内表达。
50.权利要求49的嵌合表达盒，其中所述植酸酶具有SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
51.权利要求49的嵌合表达盒，其中所述植酸酶具有SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
52.权利要求49的嵌合表达盒，其中所述核苷酸序列为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3。
53.权利要求49的嵌合表达盒，其中所述核苷酸序列为SEQ IDNO：21或SEQ ID NO：23。
54.权利要求48的嵌合表达盒，其中所述植酸酶具有SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列，但是SEQ ID NO：2的氨基酸残基1～80的全部或N-端的一部分，或SEQ ID NO：4的氨基酸残基1～80的全部或N-端的一部分由一段植物信号肽所取代以便使所述植酸酶从植物细胞中分泌。
55.权利要求48的嵌合表达盒，其中所述植酸酶具有SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列，但是SEQ ID NO：2中氨基酸残基1～20的全部或N-端的一部分，或SEQ ID NO：4中氨基酸残基1～26的全部或N-端的一部分由一段植物信号肽所取代以便使所述植酸酶从植物细胞中分泌。
56.权利要求48的嵌合表达盒，其中所述核苷酸序列为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3，但是SEQ ID NO：1中核苷酸241～480序列的全部或部分，或是SEQ ID NO：3中核苷酸100～339序列的全部或部分由一段植物信号序列所取代以便使该植酸酶从植物细胞中分泌。
57.权利要求48的嵌合表达盒，其中所述核苷酸序列为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3，但是SEQ ID NO：1中核苷酸241～300序列[请注意，核苷酸241～300，与核苷酸241～323相对，相应于SEQ ID NO：1的氨基酸残基1～20]的全部或部分，或是SEQ ID NO：3中核苷酸100～177序列的全部或部分由一段植物信号序列所取代以便使所述植酸酶从植物细胞中分泌。
58.一种嵌合表达盒，其包含编码在中性pH下具有催化活性的植酸酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在严格条件下与SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：3的核苷酸序列杂交，并与调控性核苷酸序列操纵性连接，以使所述调控性核苷酸序列能导致该核苷酸序列在植物细胞中表达，其中调控性核苷酸序列与所述核苷酸序列异源。
59.包含权利要求48～58中任一项的表达盒的表达载体。
60.包含权利要求54中表达载体的转化植物细胞，其中该植物细胞表达所述植酸酶。
61.权利要求60的转化植物细胞，其中所述细胞为单子叶物种。
62.权利要求61的转化植物细胞，其中所述单子叶物种选自玉米、高粱、小麦、棕榈及稻。
63.权利要求60的转化植物细胞，其中所述细胞为双子叶物种。
64.权利要求63的转化植物细胞，其中所述双子叶物种选自大豆、油菜、加州希蒙得木、中国脂树、烟草、番红花、花生及向日葵。
65.包含权利要求61转化植物细胞的体外培养物。
66.包含权利要求63转化植物细胞的体外培养物。
67.一种转化植物，其中所述植物的细胞包含权利要求48-58中任一项的表达盒，并表达所述植酸酶。
68.权利要求67的转化植物，其中所述植物为稻。
69.权利要求67的转化植物，其中所述植物为油菜。
70.权利要求67的转化植物，其中所述植物为向日葵。
71.权利要求67的转化植物，其中所述植物为番红花。
72.权利要求67的转化植物，其中所述植物为花生。
73.从植物细胞中的植物肌醇六磷酸盐转移无机磷酸盐以改善植物生长、开花和/或结果的方法，该方法包括将包含权利要求48-58中任一项的嵌合表达盒的核酸分子导入所述植物细胞以产生转化植物细胞，由此所述转化植物细胞可表达可从植物肌醇六磷酸盐转移无机磷酸盐的所述植酸酶。
74.权利要求73的的方法，还包括从转化植物细胞生成完整植株的步骤，其中所述植物包含表达所述植酸酶的细胞。
75.权利要求74的的方法，还包括有性繁殖或克隆繁殖所述完整植株的步骤，其中所述完整植株的子代包含表达所述植酸酶的细胞。
76.权利要求73的的方法，其中所述表达盒用电穿孔法导入所述植物细胞中。
77.权利要求73的的方法，其中所述表达盒用微粒轰击法导入所述植物细胞中。
78.权利要求73的的方法，其中所述表达盒用微注射法导入所述植物细胞中。
79.从植物肌醇六磷酸盐转移无机磷酸盐以在土壤杆菌敏感性双子叶植物中改善植物生长、开花和/或结果的方法，该方法包括用含包含权利要求48-58中任一项的表达盒的土壤杆菌感染所述植物的植物细胞以产生转化植物细胞，由此所述感染植物细胞表达可转移无机磷酸盐的所述植酸酶。
80.包含权利要求67中转化植物的动物饲料。
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