TWI326708B - Recombinant bacillus phytases and uses thereof - Google Patents

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TWI326708B TW091133207A TW91133207A TWI326708B TW I326708 B TWI326708 B TW I326708B TW 091133207 A TW091133207 A TW 091133207A TW 91133207 A TW91133207 A TW 91133207A TW I326708 B TWI326708 B TW I326708B
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Description

1326708 玖、發明說明 1. 發明所屬之技術領域 本發明涉及來自於兩種一般認爲是安全的微生物 (GRAS)地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌168的植酸酶基因 以及它們各自編碼的蛋白産物和蛋白産物的片段、衍生 物、類似物和其變異體。本發明還提供了生産和純化植酸 酶、衍生物、類似物和變異體和抗體的方法，還提供了這 些植酸酶在動物飼料方面的用途；本發明還提供了轉入了 上述兩種在中性pH條件下有活性的植酸酶（中性植酸酶） 和其他中性植酸酶的轉基因植物，這種轉基因植物顯示出 促進生長、開花和果實生長的性能。 2. 先前技術 植酸鹽是植酸（肌-肌醇l，2,3,4,5,6-hexakis二氫碟酸） 的鹽形式，在穀類和豆科類作物中占總磷元素的80%，這 兩種作物和油料種子作物占世界作物收穫面積的90%以上 (Reddy N.R., Pierson M.D., Sathe S.K. and Salunkhe D.K., 1989, Phytases in legumes and cereals. CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida)。儘管植酸鹽是磷元素一種的貯存形 式，但是動物和植物並不易獲得磷元素，這是由於需要一 種特殊的酶才能將植酸鹽水解成無機磷酸鹽。 植酸酶優選植酸鹽作爲底物，催化植酸鹽轉變爲無機磷 酸鹽和肌醇磷酸鹽，釋放出的磷酸鹽能夠被動物和植物利 用，從而增加了磷元素的可利用性。 6 由於植酸酶在經濟和環境方面的重要性，在生物技術和 酶製造産業，酶的過量表達是一個長期和很具競爭性的課 題。硏究人員已經發現了能夠最高活性過量表達該酶的方 法，需進行的純化步驟最少。植酸酶表達的早期硏究集中 在從真菌來源提取和生産該酶，直到現在，其仍是唯一已 知的動·抱飼料的來源。 早在二十世紀80年代，植酸酶已在無花果麯黴/黑色麯 黴（Ullah A.H. and Cummins B.J.，1988, ficuum extracellular pH 6.0 optimum acid phosphatase: purification, N-terminal amino acid sequence, and biochemical characterization. Preparative Biochemistry, 1 8(1): 37-65 )胞外培養介質中得到了表達，同年Ullah等 人對該酶進行了廣泛的硏究。直到現在，來自於A.niger 的植酸酶仍是最重要的商用植酸酶。二十世紀90年代，由 於新的生物技術即重組蛋白在外源菌株中的表達方法的應 用，改進了該酶的生産，新的生物技術已證明確實提高了 異種蛋白的産量。已有報告顯示包括鐮孢venenatum (Berka R.M., Rey M.W., Brown K.M., Byun T. and Klotz A.V., 1998, Molecular characterization and expression of a phytase gene from the thermophilic fungus Fusarium venenatum. Applied and Environmental Microbiology, 64(11): 4423-4427)、黑色麯黴和其他的麯黴（Pasamontes L., Haiker M., Wyss M., Tessier M. and Loon A.P.G., 1997, Gene cloning, purification and characterization of a 1326708
heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus. Applied and Environmental Microbiology, 63(5): 1696-1700; U.S. Patent No.5830733; U.S* Patent No. 5436156 和 U.S. Patent Νο·6153418 )、土壤克雷白氏桿菌（Greiner R·，Haller E” Konietzny U. and Jany K.D., 1997, Purification and characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena. Archives of Biochemistry and Biophysics, 341(2):
201-206)、Thermomyees species ( U.S. Patent No.5866118 ) 種以及西方許旺氏酵母（U.S. PatentNo.5840561 )在內的 真菌菌株能以相當明顯的産量並具有値得重視的活性表達 該酶。已經進行了一些酶法水解植酸鹽的嘗試，其結果是 導致適度增加了飼料的營養價値、動物排泄出的磷元素降 低以及對環境的益處（Pen J.，Verwoerd T.C. and Hoekema A., 1993, Phytase-containing transgenic seeds as novel feed additive for improved phosphorus utilization. Bio/Technology， 11:811-814)。 當利用真菌進行植酸酶的生産還在繼續的時候，其他的 硏究小組已經將他們的注意力轉向用酵母（Mayer A.F.， Hellmuth K., Schlieker H., An expression system matures: A highly efficient and cost-effective process for phytase production by recombinant strains of Hansenula polymorpha. Biotechnology and Bioengineering, 63(3): 373-38 1; Han Y., Wilson D.B. and Lei X.G., 1999, Expression of an Asperigillus niger phytase gene(phyA) in Saccharomyces 8 1326708 ▼
cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 65(5): 1915-1918; Han Y. and Lei X.G., 1999, Role of glycosylation in the functional expression of an Aspergillus phytase(phyA) in Pichia pastoris. Archives of Biochemistry and Biophysics, 364(1): 83-90; Rodriguez E., Mullaney E.J. and Lei X.G., 2000, Expression of the Asperigillus niger phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Biochemical and Biophysical Research Communications，268:373-378 )、植物（Ulah A.H.J.， Sethumadhavan K.，Mullaney E.J.，1999, Characterzation of recombinant fungal phytase(phyA) expressed in tobacco leaves. Biochemical and Biophysical Research Communications, 264:201-206)和腸細菌大腸桿菌（£. co//)
(Dassa J., Marck C. and Boquet P.L., 1990, The complete Nucleotide sequence of the Escherichia co/i'gene appA reveals significant homology between pH2.5 acid phosphatase and glucose-1-phosphatase. Journal of Bacteriology, 1 72(9):5497-5500; Ostanin K., Harms E.H., Stevis P.E., Kuciel R., Zhou M.M. and Van Etten R.L., 1992, Overexpression, site-directed mutagenesis, and mechanism of Escherichia coli acid phosphatase. Journal of Bacteriology, 267(32):22830-22836; Rodriguez E., Han Y. and Lei X.G., 1999, Cloning, sequencing, and expression of an Escherichia coli acid phosphatase/phytase 9 1326708
gene(appA2) isolated from pig colon. Biochemical and Biophysical Research Communications, 257:117-123 )中表 達植酸酶了。對其他來自於植物（Maugenest S. Martinez and Lescure A, 1997, Cloning and characterization of a cDNA encoding a maize seeding phytase. Biochemistry Journal，322:511-5 17)和哺乳動物（Craxton A.，Caffrey J.J·， Burkhart W., Safrany S.T. and Shears S.B., 1997, Molecular cloning and expression of a rat hepatic multiple inositol polyphosphate phosphatase. Biochemistry Journal, 328:75-81 )中的植酸酶也進行了硏究。
已經對存在於α/ί和乳桿菌的幾種植酸酶基因包括 EcAP ( Ostanin K., Harms E.H., Stevis P.E., Kuciel R., Zhou M.M. and Van Etten R.L., 1992, Overexpression, site-directed mutagenesis, and mechanism of Escherichia coli acid phosphatase. Journal of Bacteriology, 267(32):22830-22836 )、appA ( Dassa J., Marck C. and Boquet P.L., 1990, The complete Nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH2.5 acid phosphatase and glucose-1-phosphatase. Journal of Bacteriology, 172(9): 5497-5500)、appA2 (Rodriguez E., Han Y. and Lei X.G., 1999, Cloning, sequencing, and expression of an Escherichia coli acid phosphatase/phytase gene(appA2) isolated from pig colon. Biochemical and Biophysical Research Communications, 10 1326708 257: 117-123 )和植物乳桿菌（Zamudio et al·，2001， Lactobacillus plantarum phytase activity is due to non-specific acid phosphatase, Lett. App. Microbiol. 32: 181-184)進行了鑒定，它們都是在pH低於6.0時表現出 最適酶活性的酸性磷酸酶。其他的來自於co/f-的植酸酶 見美國專利 No. 6183740 和 No. 6190897 » 儘管植酸酶在真菌和[co/i中以相當明顯的量表達， 但這些植酸酶的純化是相當複雜的，而且這些異源表達的 酶常常不能正常折疊，例如，£. co"不能表達來自於真菌 i «ker的有活性的植酸酶，這是由於[C〇//産生了一種 具有大分子量的非糖基化的胞內內涵蛋白（Phillippy B.Q. and Mullaney E.J., 1997, Expression of an Asperigillus niger phytase(phyA) in Escherichia coli. Journal of Agricultural Food Chemistry，45: 3337-3342 )° 此外，五.co/z· 是一種腸內細菌，有感染胃腸組織的危險。 已知幾種桿菌屬菌株是一般認爲是安全的微生物菌 株，編碼植酸酶的基因已從枯草芽孢桿菌菌株VTT E-68013 ( phyC; Kerovuo J., Laurarus M.m Nurminen P.,
Kalkkinen N. and Apajalahti J., 1998, Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology, 64(6):2079-2085,此處全文 引入作爲參考）和枯草芽孢桿菌DS11 ( phyK; Kim Y.O.， Lee J.K., Kim H.K., Yu J.H. and Oh T.K., 1998, Cloning of 11 1326708 the thermostable phytase gene(phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia coli, FEMS Microbiology Letters，162:182-191;和美國專利 No. 6255098，此處二者的全文引入作爲參考）中得到了克隆。 這些報告顯示了桿菌植酸酶與來自於真菌、cdi、植物 和哺乳動物的植酸酶性質區別即桿菌植酸酶不具有在已知 的植酸酶的胺基酸序列中存在的保守序列一RHGXRXP域 (Kerovuo et al.，1 998，上文；Kim et al.，1998，上文）。此 外，硏究顯示凡中的植酸酶的活性具有鈣依賴性 並具熱穩定性（Kerovuo et al.，2000，The metal dependence of Bacillus subtilis phytase, Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:365-369，此處全文引入作爲參考），該特點 在來自於真菌、£. 植物和哺乳動物的植酸酶中還未 發現。而且，枯草芽孢桿菌植酸酶表現活性的最適pH也 不同於來自於真菌和coH的植酸酶。許多報告顯示，真 菌和中的植酸酶是酸性磷酸酶，最適pH從2.5 (Rodriguez et al.，1999，supra;和 Dassa et al.，1 990,上 文）到 5.5 ( Han et al·，1999，上文）。與此對照，Kerovuo 等（1998,上文）報告的結果則是枯草芽孢桿菌植酸酶的 最適pH在pH7。因此，利用一般認爲是安全的微生物菌 株進行植酸酶的生産具有巨大的應用價値，提供了一種新 的安全的商用植酸酶資源。
Maugenest 等(1997, Cloning and characterization of a cDNA encoding a maize seeding phytase. Biochemistry 12 1326708
Journal, 322:51 1-5 17 )報告了玉米種子植酸酶的克隆和鑒 定情況，美國專利No. 6291224公開了來自玉米的植酸酶， 而No. 63 03 766則公開了來自大豆的植酸酶的情況，這兩 種植酸酶均屬酸性植酸酶。但是，一般來說，植物植酸酶 的産量不足以滿足工業化生産，而且，一般來說在未萌發 的種子中僅能檢測到極低的內源植酸酶活性。胞外的植酸 酶活性顯然不足以利用鎖定在土壤中的植酸鹽。 植物能從水和光合作用中獲得碳、氫和氧，而磷、氮、 金屬離子、鈣和微量元素則主要從土壤中獲得。因此，土 壤中的磷和氮的可利用性則成爲植物生長的制約因素。主 要以無機磷酸鹽形式存在的磷元素通過根從土壤中吸收然 後運輸到植物的其他組織以用於各種生命過程，如DNA和 RNA的合成等。然而，大部分的磷元素被鎖定在植物中， 並以植酸鹽的形式儲存起來。對植物來說，以植酸鹽形式 鎖定土壤中的磷元素是不能夠利用的。爲了滿足植物營養 的需要，無機磷酸鹽一般以肥料形式供給植物以促進植物
I 的生長，這樣無機磷酸鹽就成了環境的另外一個污染源。 在植物體內表達植酸酶的努力尙未導致有用的表現型 出現。一種來自於真菌黑色麯黴（phyA)的酸性植酸酶已成 功地在轉基因煙草中得到表達（Ullah et al·, 1999,上 文）。除了最適pH從pH5漂移到pH4，從轉基因煙草中回 收到的重組植酸酶的催化能力與天然植酸酶沒有區別。同 樣的基因在屬植物中也有過量的表達 (Richardson et al., 2000, Extracellular secretion of 13 1326708
Aspergillus phytase from Arabidopsis roots enables plants to obtain phosphorus from phytate. Plant Jourmal, 25(6): 641-649)。美國專利No. 6022846則公開了真菌無花果麯 黴、黑色麯黴、泡盛麯黴和的酸性 植酸酶在各種作物果實、葉和根中的表達情況，（也見美國 專利No. 5900525 )。胞內表達這些真菌酸性植酸酶並沒有 使轉基因植物顯現顯著的表現型變化。 給包括豬和雞在內的許多單胃動物飼餵由大豆食物、榖 類、小麥、大麥、水稻麩皮和canola食物組成的飼料。由 於大部分的磷元素以植酸鹽形式存在，具有低的最適pH 的外源植酸酶又主要來自於真菌，因此它們常常作爲飼料 添加劑加入到飼料中。替代添加外源植酸酶的措施是：將 表達活性植酸酶的轉基因植物引入動物飼料中將增加飼餵 該飼料的動物對植酸鹽的利用能力。因而對用基因工程技 術在植物體內影響和創造植酸鹽利用的生化途徑的方法的 需要和願望依然存在》 3.發明內容 對磷元素的有效利用不僅對植物和動物的生長重要，而 且對於減少因動物廢棄物和肥料引起的環境污染也同等重 要，動物廢棄物和含有以植酸鹽形式未利用的磷元素的肥 料引起了環境污染。爲了利用存在於各種食物資源中的磷 元素，可將來源於各種資源中的植酸酶添加在動物飼料中 以使單胃動物能夠高效利用磷元素，同時也減少了將磷元 14 1326708 素排泄到環境中所造成的污染。而且，如果在中性pH有 活性的植酸酶能在植物體內表達，可使轉基因植物的生長 速率明顯加快，成熟期和/或花期縮短。因此，需要在動物 飼料和植物體內顯示有最大活性並對動植物的健康是安全 的植酸酶存在，更需要大量生産植酸酶以滿足商業需求。 本發明部分地基於兩種新的分別來自於兩種微生物 和枯草芽孢桿菌168的植酸酶基因 (見圖l和2;SEQIDNOS:l，2,3和4)的發現以及對表 達的中性植酸酶能夠增加植物生長、開花和做果的觀察。 因此，本發明涉及到兩種分別來自於一般認爲是安全的微 生物菌株（GRAS )植酸酶基因，編號分別爲phyL和 168phyA的核苷酸序列（SEQ ID NOS: 1和3，分別見圖 1A和2A)和它們所編碼蛋白的胺基酸序列以及這些序列 的片段、衍生物、類似物和變體。爲此，本發明提供了被 分離出的或重組製備的源於菌株5ac⑴Hc/jewi/or/ni·? (phyL，胺基酸序列號是SEQ ID NO: 2 :見圖1B)和枯 草芽孢桿菌168 ( 168phyA，胺基酸序列號是SEQIDNO: 4;見圖2B)的植酸酶及其片段、衍生物、類似物或變異 體，它們在本發明中統稱爲“本發明所述肽”或“本發明 所述蛋白”。更進一步，本發明也提供了編碼本發明所述 多肽的核酸分子，包括cDNA、基因組DNA和RNA，本發 明中統稱爲“本發明的核酸”。 此處用斜體字標明的基因的名字即是指該基因，與此 相對應的是它所編碼的蛋白或多肽産物是以非斜體形式表 15 1326708 示。如，“基因”表示某基因，而“基因”則表示該“基 因”的蛋白或多肽産物。 由此，本發明提供了被分離出的核酸分子，其包含或與 SEQ ID NO: 1核苷酸序列或其互補序列、或SEQ ID NO: 3 核苷酸序列或其互補序列之間的同一性爲等同於下述核苷 酸序歹U ，艮卩約 30%、35%、40%、45%、50%、55% ' 60%、 645%、70%、80%、85%、90%、95%或 98%，並編碼了具 有phyL或168phyA蛋白活性的蛋白或多肽的核苷酸序 列。所述活性包括抗原性、免疫原性、催化活性（即植酸 酶活性）以及其他的易於分析的活性。進一步，該活性還 包括在中性pH起作用，更具體一點還要具有較寬酶活性 的溫度範圍以及在中性pH時在各自的最適溫度時具有最 高的活性（見圖7B和下文的章節6.4)。更進一步，該蛋 白還表現出高的熱穩定性，尤其是在Ca++存在下。在特殊 的實施例中，該核酸分子不包括編碼phyC ( SEQ ID NO:21)、phyK ( SEQ ID NO:23)的核苷酸序列及具有植 酸酶催化活性的，且長度分別爲5、10、15、20、25、30 ' 35、40、45、50、55、60、65、70、750、75、80、90、100、 120 、 140 、 160 、 180 、 200 、 220 、 240 、 260 、 280 、 300 、 3 20、340、360 或 380 個胺基酸殘基的 phyC( SEQ ID NO:22) 和 phyK ( SEQ ID NO:24 )。 本發明進一步提供了被分離出的核酸分子，這些核酸分 子包含或組成了能編碼具有一種或多種phyL或1 68phyA 蛋白活性的蛋白或多肽的來自SEQ ID NO:1或3核苷酸序 16 1326708 列或其互補序列的 25、30、35、40、45、100、150、200、 250、300 ' 350 ' 400、450、500、550 ' 600 ' 650 ' 700、 750、800、850、900、950、1000、1050、1100' 1150、1200、 1250、1300、13 50個或更多個連續的核苷酸。在特定的實 施例中，所述核酸分子不包括編碼phyC ( SEQ ID NO:21 )、phyK ( SEQ ID NO:23)的核苷酸序列及編碼， phyC ( SEQ ID NO:22 )和 phyK ( SEQ ID NO:24 )各自 長度至少爲 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、750、75、80、90、100、120、140、160、 180、200 ' 220 ' 240、260、280、300、320、340 ' 360 或 380個胺基酸殘基的片段的核苷酸序列，且具有植酸酶催 化活性的。 本發明還提供了被分離出的多肽或蛋白，該多肽或蛋白 由與包含或組成了至少約30%、35%、40%、45%、50%、 5 5% ' 60%、65%、70%、80%、85%、90% ' 95%或 98%與 SEQ ID ΝΟ:1核苷酸序列或其互補序列、或者SEQ ID NO:3 核苷酸序列或其互補序列同一性的核苷酸序列的核酸所編 碼，所述多肽或蛋白還至少顯示有本發明多肽的一種結構 和/或功能特徵。所述的本發明多肽的功能特點包括抗原 性、免疫原性、催化活性以及其他的易於分析的活性。在 特殊的實施例中，這些多肽或蛋白不包括分別由基因PhyC (SEQ ID NO:21 )和 phyK ( SEQ ID NO:23 )編碼的多肽 或蛋白，以及長度至少爲25、30、35、40、45、100、150、 200 ' 250、300、350、400、450、500、550、600、650、 17 1326708
700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、 1200、1250 或 1280 個核苷酸的 phyC ( SEQ ID NO:21 ) 片段及長度至少爲 25、30、35、40、45、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、550、600 ' 650、700 ' 750 ' 800、850、900、950、1000、1050、1100' 1150' 1200、 1250、 1300、 1350、 1400、 1450、 1500、 1550、 1600、 1650 或1700核苷酸的phyK (SEQIDNO:23)片段。
本發明還提供了被分離出的多肽或蛋白，該多肽或蛋白 由包括下述核苷酸序列的或由其組成的核酸分子所編碼， 所述核苷酸序列中至少包含來自SEQ ID ΝΟ:1，3核苷酸序 列或其互補序列中的約25、30、35、40、45、100、150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850、900、950、1000、1050 ' 1100、1150、 1200、1250、1300個或更多個連續核苷酸，此處的多肽或 蛋白還至少顯示有本發明多肽的一種功能和/或功能特 點。在特殊的實施例中，這些多肽或蛋白不包括分別由基 因 phyC (SEQIDNO:21)和 phyK (SEQIDNO:23)以 及長度至少爲 15、30、45、60、90、120、180、240、300、 420、540、780、1020、1140、1260 或 1280 核苷酸的 phyC (SEQ ID NO:21 )片段及長度至少爲 15、30、45、60、90、 120、180、240、300、420、540、780、1020、1140、1260、 1280、1300、1350、1400、1450、1500 ' 1550、1600、1650 或1700核苷酸的phyK ( SEQ ID NO:23)片段所編碼的 多肽或蛋白。 18 1326708
本發明的特點還在於被分離出的核酸分子中包含這樣 的核苷酸序列，它編碼與所述的SEQ ID NO:2或4之間的 胺基酸序列同一性至少爲約40%、45%、50%、55%、60%、 65%、70%、80%、85%、90%、95%或 98%的蛋白質或該蛋 白的片段、衍生物、類似物或變體，或者所述的核酸分子 的互補序列，所述蛋白具有與蛋白phyC和phyK —樣的抗 原性、免疫原性、催化活性以及其他的易於分析的活性。 在特殊的實施例中，該核酸分子不包括編碼phyC (SEQID NO:21 )、phyK ( SEQ IDNO:23)、長度至少含有 5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、750、 75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、 260、280、300、320、340 或 360 個胺基酸殘基的phyC(SEQ ID NO:22)的片段或長度至少含有5、10、15、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、 120、140 ' 160 ' 180、200、220、240、260、280 ' 300、
3 20、340 或 3 60 個胺基酸殘基的 phyK ( SEQ ID NO:24) 的片段的核苷酸序列。 本發明進一步還提供了被分離出的核酸分子，或該核酸 分子的互補鏈，該核酸分子中包含的核苷酸序列編碼具有 下述特徵的蛋白或其片段、衍生物、類似物或變體：即該 蛋白的胺基酸序列包含了 SEQ ID NO :2或4至少約10、 15、20' 25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、 250、275、300、325、3 50、375個或更多個連續胺基酸殘 基或由這些殘基組成上述蛋白具有與蛋白phyC和phyK — 19 1326708 樣的抗原性、免疫原性、催化活性以及其他的易於分析的 活性。在特殊的實施例中，該核酸分子不包括編碼phyC (SEQ ID NO:21 )、phyK ( SEQ ID NO:23 )、長度至少含 有 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、 220、240、260、2 80、3 00、3 20、3 40 或 3 60 個胺基酸殘 基的phyC ( SEQ ID NO:22)的片段或長度至少含有5、 10、15、20、25' 30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、 260、280、300、320、340 或 360 個胺基酸殘基的 phyK ( SEQ ID NO:24)的片段的核苷酸序列。.
本發明更進一步提供了被分離出的多肽或蛋白，其胺基 酸序列與SEQ ID NO:2或4所示胺基酸序列至少有約 40% ' 45% ' 50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、 90%、95%或98%的序列同一性或這些蛋白的片段、衍生 物、類似物或變體，其中所述的多肽或蛋白還至少具有本 發明多肽或蛋白的一種結構和/或功能特點。在特殊的實施 例中，該多肽或蛋白不包括分別由基因phyC ( SEQ ID NO:21 )和phyK ( SEQ ID NO:23)的核苷酸序列所編碼 的多肽或蛋白、長度至少有5、10、15、20' 25、30、35' 40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、 140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、 340或360個胺基酸殘基的phyC ( SEQ ID NO:22)或phyK (SEQ ID NO:24)的片段。 20 1326708 本發明還提供了這樣一些被分離出的多肽或蛋白，所包 含的胺基酸序列包含SEQ ID NO:2或4蛋白或它們的片 段、衍生物、類似物或變體的至少約10、15、20、25、30、 50、75、100、125、150、175、200、225、250、275' 3 00、 325、350、375個或更多個連續的胺基酸，此處的多肽或 蛋白還至少具有本發明多肽的一種結構和/或功能特點。在 特殊的實施例中，該多肽或蛋白不包括分別由基因phyC (SEQ ID NO:21 )或 phyK ( SEQ ID NO:23 )的核苷酸序 列所編碼的多肽或蛋白、長度至少有5、10、15、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、 120、140 ' 160、180、200、220、240 ' 260、280、300、 3 20、3 40 或 3 60 個胺基酸殘基的 phyC ( SEQ ID NO:22) 或 phyK ( SEQ ID NO:24)的片段。 在一個實施方案中，本發明提供了被分離出的核酸分 子，此處限定爲：該被分離出的核酸分子在嚴謹的條件下 能夠與具有SEQ ID NOS:l或3序列或它們的互補序列的 核酸雜交，其中所指的SEQ ID NOS:l或3序列或它們的 互補序列能夠編碼顯示至少本發明多肽或蛋白的一種結構 和/或功能特點。 更進一步，本發明還提供了能夠用作適合作爲引物或雜 交探針的核酸分子，以用於檢測編碼本發明多肽或其他與 本發明多肽相似的多肽。 另外一方面是，本發明提供了包含有本發明核酸分子的 載體，例如重組表達載體。更進一步，本發明還提供了含 21 1326708 有該載體或含有和/或表達本發明核酸分子的工程載體的 宿主細胞，以及含有與異源啓動子相連的核苷酸序列的宿 主細胞。在一定的實施例中，宿主細胞是芽孢桿菌屬菌種， 優選爲枯草芽孢桿菌MU331。在特殊的實施例中，這種異 源啓動子是一種很強的原噬菌體啓動子。 本發明進一步提供了通過重組DNA技術製備本發明多 肽的方法，該方法包括含有編碼本發明多肽的重組表達載 體或含有與異源啓動子相連的編碼本發明多肽的核苷酸序 列的宿主細胞的培養、本發明多肽的製備和分離。在一定 的實施例中，宿主細胞是芽孢桿菌屬菌種，優選爲枯草芽 孢桿菌MU331。在特殊的實施例中，本發明提供了使用噬 菌體Φ 105的過表達系統快速大量生産本發明多肽的方 法。 另一方面，本發明提供了含有本發明多肽的動物飼料以 及製備該動物飼料的方法，該飼料在植酸酶作用下釋放磷 元素以供給動物利用。 在另外一個實施例中，本發明提供了含有能編碼中性 pH下具有催化活性的植酸酶的核酸分子的轉基因植物。在 一個特殊的實施例中，本發明提供了轉基因植物或能夠編 碼衍生於芽孢桿菌種的植酸酶的核酸分子，該轉基因植物 含有的本發明的核酸分子能夠表達本發明的植酸酶或具有 功能活性的片段、同系物或它們的類似物。在一個優選的 實施例中，植酸酶是胞內表達的。在另一個實施例中，植 酸酶是胞外表達的，例如在轉基因植物的根部，表達的植 22 1326708 酸酶在中性pH是活性的，促使貯存於植物或環境如土壤 中的植酸鹽釋放磷元素。本發明還提供了生産這種轉基因 植物的方法。 本發明進一步提供了具有免疫特異性結合本發明多肽 的抗體，該抗體包括但不侷限於下列抗體：來自於各種動 物的抗體、人源化抗體、嵌合抗體、多克隆抗、單克隆抗、 雙特異性抗體、多特異性抗體、單源鏈抗體、Fab片段、 F(ab’）2片段、二硫鍵連接的Fvs、含有抗體重鏈可變區或 輕鏈可變區的結構域甚至是互補決定區（CDR)的片段， 這些抗體都能免疫特殊性與本發明多肽結合。 在一個實施例中，本發明提供了檢測本發明多肽或其相 似多肽在生物材料中的存在、活性或表達的方法，生物材 料如細胞、培養介質等。相對於對照來說，樣品中多肽活 性或表達的增加或減少能夠通過將生物學材料與能直接或 間接檢測本發明多肽存在、活性或表達情況的試劑接觸來 測定。在一個特殊的實施例中，這種試劑是一種免疫特異 性地與本發明多肽結合的抗體或其片段。在另外一個特殊 的實施例中，這種試劑就是植酸鹽。 在另一個實施例中，本發明提供了包含有生物活性分 子和本發明的多肽或其片段一個或多個結構域的融合蛋 白。優選地，本發明提供了包含有將生物活性分子與本發 明的多肽或其片段一個或多個結構域的重組性融合或化學 偶聯（包括共價和非共價偶聯）得到的融合蛋白。 23 1326708 3.1 定義 此處使用的術語“酸性的”或"酸性pH”指pH低於 6.0、低於5.5、低於5.0和低於4.0。
此處使用的術語“類似物”指的是包含有與phyL或 16 8phyA、phyL或168phyA的片段有相似或相同功能的多 肽，但該多肽不一定包含與phyL或168phyA、phyL或 168phyA片段有相似或相同的胺基酸序列，或者該多肽擁 有phyL或168phyA、抗體或抗體片段的相似或相同的結 構。具有相似的胺基酸序列的多肽指的是能夠至少滿足下 列條件之一的多肽：（i)多肽具有的胺基酸序列有至少 30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少 5 5%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%與phyL 或168phyA、或者是phyL或168phyA的片段的胺基酸序 列一致，其附帶條件是該多肽既不是phyC也不是phyK， 也不是具有至少有 5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、80、90、100、120、140、160、180、 200、220、240、260、280、300、320、340、或 360 個胺 基酸殘基長度的phyC或phyK片段；（ii)該多肽是由核苷 酸序列編碼的，該核苷酸序列有至少30%、至少35%、至 少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至 少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至 少90%、至少95%或至少99%與編碼phyL或168phyA、phyL 或168phyA片段的核苷酸序列一致，其附帶條件是該多肽 24 1326708 既不是phyC也不是phyK，也不是phyC或phyK的片段； (Hi)該多肽是由核苷酸序列編碼的，編碼該多肽的核苷酸 序列在極其嚴格的條件下能夠與編碼phyL或168phyA、或 含有至少10個胺基酸殘基、至少15個胺基酸殘基、至少 20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、至少40個胺基 酸殘基、至少80個胺基酸殘基、至少90個胺基酸殘基、 至少1〇〇個胺基酸殘基、至少125個胺基酸殘基、至少150 個胺基酸殘基、至少175個胺基酸殘基、至少200個胺基 酸殘基、至少225個胺基酸殘基、至少250個胺基酸殘基、 至少275個胺基酸殘基、至少300個胺基酸殘基、至少325 個胺基酸殘基、至少350個胺基酸殘基或至少375個胺基 酸殘基的phyL或168phyA片段的核苷酸雜交，其附帶條 件是該多肽既不是phyC也不是phyK，也不是phyC或phyK 的片段；具有與phyL或1 68phyA、或phyL或1 68phyA片 段有相似結構和功能並顯示有抗原性、免疫原性、催化活 性或其他易分析的活性的多肽指的是具有與phyL或 168phyA、或phyL或168phyA片段有相似的二級、三級或 四級結構的多肽。多肽結構能夠用本領域技術人員所熟知 的方法測定，包括但不侷限於X-射線晶體學、核磁共振、 晶體電子顯微技術等，而多肽的功能則通過多肽的各種生 物學活性的分析來測定。 此處使用的術語“與phyL或168phyA免疫特異性結 合的抗體或抗體片段”指的是該抗體或其片段與phyL或 168phyA或者是phyL或168phyA的片段發生免疫特異性 25 1326708 結合，而與別的多肽不發生特異性結合。與phyL或 168phyA或者是phyL或168phyA的片段發生免疫特異性 結合的抗體或其片段也可能與別的抗原發生交叉反應。優 選地，與phyL或1 68phyA或者是phyL或1 68phyA的片段 發生免疫特異性結合的抗體或片段不與別的抗原發生交叉 反應。與phyL或168phyA或者是來自於phyL或168phyA 的片段發生免疫特異性結合的抗體或其片段是能夠鑒定 的，例如通過免疫分析或其他本領域技術人員熟知的技 術。與phyL或168phyA免疫特異性結合的抗體或抗體片 段可以分別互換稱爲抗phyL抗體或抗168phyA抗體。 此處使用的術語“衍生物”是指給定的已被修飾的肽 或蛋白質，例如在優先保證生物活性的前提下通過共價連 接在肽或蛋白質上連接了其他類型的分子，該類分子包括 非天然的胺基酸。這類處理的結果保留了肽或蛋白的一種 或多種生物活性。 此處使用的術語“片段”指的是至少含有大約25、 30、35、40 ' 45、100、150、200、250、300、350、400 ' 450 、 500 、 550 、 600 、 650 、 700 、 750 、 800 、 850 、 900 、 950、 1000、 1050、 1100' 1150、 1200、 1250、 1300、 1350 個核苷酸、或其他在長度上與該核酸分子相接近的核酸片 段而且至少具有該核酸分子一種功能特點（或編碼的蛋白 具有該核酸分子所編碼蛋白的特點）：“片段”或者指的是 在長度上含有相關蛋白或多肽的至少5、10、15、20、25、 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、 26 1326708 120、140 ' 160、180、200、220、240、260、280、300、 320、340或360個胺基酸殘基的多肽或蛋白片段而且它至 少具有蛋白或多肽的一種功能特點。 此處使用的術語“一般認爲是安全的（GRAS)”指的是 某些物質在特定用途時被美國食品藥品管理局（FDA)歸類 爲“GRAS”。假如這種成分有良好的生産實踐，便能夠用 於食品生産。基於現有的文件，“GRAS”可以用於酶製備 是經過FDA授權的。從植物和動物以及微生物來製備酶作 爲酶的來源已有很長時間了，“GRAS”所製備的酶用於人用 沒有引起嚴重的健康問題。 術語“被分離出的”或“純化的”肽或蛋白指的是基 本上不含有細胞成分或産生該蛋白的細胞或組織中的其他 的污染蛋白；當化學合成時，這些“被分離出的”或“純 化的”肽或蛋白基本上不含化學前體或其他的化學試劑。 上述“基本上不含有細胞成分”包括多肽/蛋白的製備，在 此過程中多肽/蛋白與細胞組分分離。因此，基本上不含有 細胞成分的多肽/蛋白包括污染蛋白少於約30%、20%、 10%、5%或1% (乾重）的多肽/蛋白的製備。當該多肽/蛋 白通過重組法産生時，它還優選基本不含有培養介質即培 養介質占蛋白製備物的體積少於約20%、10%或5%。當多 肽/蛋白通過化學法合成時，它優選基本不含有化學前體或 其他的化學試劑即它是與參與到蛋白合成的化學前體或化 學試劑被分離出的。爲此，除了該有益多肽/蛋白片段之 外，這種多肽/蛋白的製備物含有少於約3 0%、20%、10%、 27 1326708 5% (乾重）的化學前體或化合物。在本發明的一個優選的 實施例中，該多肽/蛋白是被分離出的或純化的。 此處的“被分離出的”核酸分子是一種與其他天然來 源核酸分子分開的核酸分子庫。而且，該“被分離出的” 核酸分子如cDNA分子基本上是不含其他的細胞成分的， 或者說是當來自於重組法生産時，它不含培養介質，當來 自於化學法合成時，它不含有化學前體或其他的化學試 劑，但當該核酸分子存在於重組DNA文庫時，情況例外。 在本發明的優選的一個實施例中，編碼本發明的多肽/蛋白 的核酸分子是被分離出的或純化的。 此處使用的術語“中性pH”指的是pH値在約5.5和約 8.5之間，優選爲約6.0至約8.0，更優選爲約6.5至約7.5 以及最優選爲約7.0。 此處使用的術語“可操作鏈結”指的是在該“可操作 鏈結”啓動子的控制下，在轉錄時能夠産生功能性 mRNA，而翻譯貝丨J導致與該啓動子鏈結的DNA編碼的多肽 的産生。 此處使用的術語“在嚴格的條件下”指的是雜交和淸 洗條件，在此條件下，核苷酸序列之間具有至少70%、 75%、80%、85%、90%或95%的一致性時，能保持相互之 間的雜交。這種雜交條件在“ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.; Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986), pp.75-78, and 28 1326708 84-87;和 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y. (1992)，pp.387-389，” 以及其他本領域技
術人員熟知的資料中有詳細描述，但也不侷限於這些資 料。優選的非限制性的嚴格的雜交條件的例子是：6倍 NaCl/檸檬酸鈉（SSC)，0.5%SDS，68〇C，然後於室溫下， 用2倍SSC和0.5%SDS溶液淸洗一次或多次。另一個優選 的非限制性的嚴格的雜交條件的例子是：6倍NaCl/檸檬酸 鈉（SSC)，約45°C，然後於約50-65°C，用0.2倍SSC和 0.1 %SDS溶液淸洗一次或多次。 此處使用的術語“變體”指的是一種給定肽的天然産 生的同位性變體或給定多肽/或蛋白的重組製備的變體，其 中一個或多個胺基酸殘基被取代、添加或缺失。 5.實施方式
5.1 PhyL 和或 168phyA 在5. 168的基因組中發現了與枯草芽孢桿菌 中的兩個已公開的植酸酶基因具有高度序列同源性的閱讀 框架（ORF)。如6.3節描述的那樣，克隆基因168phyA 表達出成熟的植酸酶16 8phyA，通過SDS-PAGE測定其分 子量（MW)爲44kDa(見圖5A)。基於蛋白168phyA、PhyK (Kim Y.O., et al., 1998, Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia coli. FEMS Microbiology Letter, 162:1 82-191 )和 phyC ( Kerovuo J.，et al.，1998， 29 1326708
Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis. Applied and Environmental Microbiology, 64(6):2079-2085 )中的保守的胺基酸序列，應用變性寡聚 核音酸通過變性PCR反應從5α£^7/Μ·ϊ/ί·£?/ΐβ«Ζ·/·〇Γ/«!·5·中克隆 得到基因PhyL。從核苷酸序列推斷出的胺基酸序列顯示該 蛋白含有381個胺基酸殘基，像蛋白168phyA和其他的5. 植酸酶一樣，該胺基酸序列中不包含一般在真菌和 £. coH的植酸酶中存在的高度保守的RHGXRXP序列。由 SDS-PAGE測定PhyL的分子量（MW)爲47kDa(見圖5B)。 按照 Engelen A.J.等（1994，Simple and rapid determination of phytase activity. Journal of AOAC International, 77(3): 760-764 )介紹的分析方法測定本發明 的兩種植酸酶的酶活性。結果顯示，對與它們的酶活性來 說，168phyA和phyL二者都具有寬的溫度最適値，phyL 的溫度最適値是65°C，168phyA是55°C (見圖7A和下文 6.4節）。另外，在中性pH下，本發明的兩種酶在各自的 最適溫度點均顯示最高的酶活性（見圖7B和下文6.4節）。 更進一步，本發明的兩種酶尤其在Ca2 +存在時均顯示高的 熱穩定性（見6.4節）。本發明多肽的這些特點即寬的最適 溫度範圍、高的熱穩定性以及在中性pH時最適酶活性都 指出了在5.10節所討論的該多肽的巨大的商業應用價値。 因此，本發明提供了序列爲SEQ ID NOS:l和3的核酸 分子、即分別爲基因phyL和168phyA，以及由此各自編碼 30 1326708 序列爲SEQ ID NOS:2和4的多肽，phyL和168phyA。 5.2 phyL和1 68phyA的類似物、衍生物和變體
除了上述描述的核酸分子和多肽之外，本發明的核酸分 子和多肽也包括那些核酸分子和多肽，它們與上述本發明 描述的核酸分子和多肽一樣具有一般的生物學活性、相似 或相同的結構域和/或具有足夠的核苷酸序列或胺基酸一 致性（類似物）。 這種本發明多肽的一般生物學活性包括抗原性、免疫原 性、尤其是在中性pH時催化活性和本領域技術人員易於 分析的其他活性。
具有相似的胺基酸序列的多肽指的是至少滿足下列條 件的一個：（i )多肽具有的胺基酸序列是至少30%、至少 35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少 60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%或至少99%與phyL ( SEQ ID NO:2)或 168phyA( SEQ ID NO:4)、或者是 phyL 或 168phyA 的片段的胺基酸序列一致，其附帶條件是該多肽既不是 phyC或phyK，也不是phyC或phyK的片段：（ii )該多 肽就是phyL或168phyA的片段，編碼該多肽的核苷酸序 列有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、 至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%與 編碼 phyL ( SEQ ID ΝΟ:1 )或 168phyA ( SEQ ID NO:3 )、 31 1326708 或者是phyL或168phyA的片段的核苷酸序列一致，而且 至少具有本發明多肽的一種結構和/功能，其附帶條件是該 多肽既不是phyC也不是phyK，也不是phyC或phyK的片 段；（iii)編碼該多肽的核苷酸在極其嚴格的條件下能夠與 編碼基因 phyC ( SEQ ID ΝΟ:1 )或 168phyA( SEQ ID NO:3 ) 的核苷酸雜交，而且至少具有本發明多肽的一種結構和/ 功能特點以及含有至少10個胺基酸殘基、至少15個胺基 酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、 至少40個胺基酸殘基、至少80個胺基酸殘基、至少90 個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基、至少125個胺基 酸殘基、至少150個胺基酸殘基、至少175個胺基酸殘基、 至少200個胺基酸殘基、至少225個胺基酸殘基、至少250 個胺基酸殘基、至少275個胺基酸殘基、至少300個胺基 酸殘基 '至少325個胺基酸殘基、至少350個胺基酸殘基 或至少375個胺基酸殘基，其附帶條件是該多肽既不是 phyC也不是phyK，也不是phyC或phyK的片段。具有與 phyL或168phyA、或是phyL或168phyA的片段類似的 結構的多肽指的是該多肽具有與phyL或168phyA、或是 phyL或168phyA的片段類似的二級、三級或四級結構的 多肽，而且具有至少一種本發明多肽的功能特點。多肽結 構的能夠用本領域技術人員所熟知的方法測定，包括但不 侷限於X-射線晶體學、核磁共振、晶體電子顯微技術等。 在一個優選的實施例中，本發明的多肽衍生自一般認爲是 安全的芽孢桿菌菌株。 32 1326708 本發明還包括本發明多肽的衍生物。如，但不限於，該 衍生物可以包括修飾後的多肽或蛋白，這種如糖基化、醯 基化、PEG化、磷酸化、胺化、通過已知的保護/阻斷基團 的衍生、蛋白水解酶的切割、與細胞中配基或其他蛋白的 交聯等。通過已知的技術包括但不侷限於特異性化學切 割、醯基化、甲醯基化等來進行任何一種化學修飾，衍生 物分子中可能含有一個或多個非典型的胺基酸。 另一方面，本發明的多肽變體是由本發明中所述的被分 離出的核酸分子所編碼的，該多肽變體的胺基酸序列已通 過基因工程技術進行了修飾以便增加或降低該多肽的生物 活性，或者是在沒有顯著改變其生物學活性的情況下改變 了其局部結構。一方面，該多肽變體能夠用作激動劑或拮 抗劑。激發劑能夠基本上保持本發明多肽的相同或部分的 生物學活性，而抗激發劑則能抑制本發明多肽的一種或多 種物學活性。這種修飾包括胺基酸的取代、缺失、和/或插 入。胺基酸的修飾方法可以通過本領域已知的任何方法和 本領域技術人員所例行的各種可以應用的方法和路線。 如，根據本領域的任何技術所進行的誘變，包括但不侷 限於合成具有一個或多個修飾位點的寡核苷酸，由此也就 修飾了給定的多肽。通過使用含有所需突變體的核苷酸序 列的特異性的寡核苷酸序列可以誘發定點.誘變，還在編碼 該多肽的核苷酸序列中有充足的相鄰核苷酸的數目。這種 寡核苷酸能夠充當引物，在刪除聯接的核苷酸序列的兩端 能夠形成穩定的雙螺旋。典型地，優選的核苷酸引物的長 33 1326708 度約17-75個核苷酸，序列接頭處兩側約10到約25個或 更多個殘基被替換。使用大量這種能在一個或多個位點引 入不同突變的引物可用來製備突變文庫。 如像各種出版物中所描述的那樣（例如，Kunkeletal.， Methods Enzymol.，1 54: 367-382, 1987，在此引入其全文 作爲參考），定點誘變技術在本領域是爲大家所熟知的。一 般來說，定向誘變的進行是首先獲得單鏈載體或雙鏈載體 解開後的兩條鏈，這些鏈的序列中包含有編碼所需肽的 cDNA序列，由此即可製備出産生所需突變序列的寡核苷 酸引物，一般是人工合成的。然後，該引物連同單鏈載體 —起退火，該過程受DNA聚合酶如T7DNA聚合酶所控 制，以便完成産生突變的鏈的合成。因而，異型雙鏈産生 了，一個鏈編碼原始的非突變的序列，另一個鏈産生所需 的突變序列。然後用該異型雙鏈載體進行轉導或轉染合適 的細胞，如細胞，選擇包含能産生突變序列的重組 載體的克隆。應該感激的是，該技術典型地應用了存在有 單鏈和雙鏈形態的噬菌體載體。在定向誘變方面典型的可 用載體包括載體如Μ13噬菌體等。這些噬菌體易於商業化 應用，而且它們的應用對本領域的技術人員來說是熟知 的。在定向誘變方面，雙鏈質體也是常規使用的載體，它 能減少將目的基因從質體轉移到噬菌體的步驟。 另一方面，商業上有可利用性的熱穩定性酶如Taq DNA 聚合酶的PCR技術也可以將誘變的寡核苷酸引物引入到擴 增DNA片段中，然後克隆到合適的克隆系或表達載體中。 34 1326708 見，例如 Tomic 等（Nucleic Acids Res.，18(6):1656, 1987) 和 Upender 等（Biotechniques，18(1):29-30, 32，1995 )所 述的PCR介導的誘變程式，在此引入它們的全文作爲參 考。使用熱穩定連接酶以及熱穩定聚合酶的PCR技術也可 以將磷酸化的誘變的寡核苷酸並入擴增的DNA片段，然後 克隆到合適的克隆系或表達載體中（見，例如Michael， Biotechniques，16(3): 410·412，1994,在此引入全文作爲參 考）。 其他的對於本領域技術人員所知的産生給定多肽或其 片段的突變序列的方法均能應用，如編碼多肽或其片段的 胺基酸序列的重組載體可用誘變劑如羥胺處理以獲得序列 突變體。 優選地，被修飾的胺基酸殘基是暴露於表面的殘基。而 且，在進行胺基酸取代時，優選的是保守性胺基酸取代， 如極性殘基用極性殘基替代，親水性殘基用親水性殘基替 代，疏水性殘基用疏水性殘基替代，帶正電荷的殘基用帶 正電荷的殘基替代，帶負電荷的殘基用帶負電荷的殘基替 代。此外還優選被修飾的胺基酸殘基並非是株系或種間高 度保守或完全保守的和/或對於保持蛋白的生物活性卻是 關鍵的。 據此，編碼本發明多肽的核酸也包含在本發明範圍之 內，編碼的多肽中所含的胺基酸修飾對於其生物學活性不 是關鍵的。 35 1326708 5.3通過噬菌體Φ105的過表達系統進行的酶的生産 報道的植酸酶過表達的誘導方法包括由IPTG介導的來 自於 5. DS11 的基因 phyK 在 £. co/z·中表達（Kim
等，1998，上文），甲醇介導的來自於的基因 phyA在巴氏德比赤氏酵母^ίΐίίο/w··?中表達（Han & Lei，1999，上文）以及在[co/i中使用底物植酸鹽作誘 導劑來誘導來自於幻ierri'gena的植酸酶基因 (Greiner等，1997 )和編碼植酸酶的phyC以生産植酸酶。 使用植酸鹽作誘導劑是基於底物特異性理論。
在以前用枯草芽孢桿菌建立的Φ 105系統中 (Thornewell, S.J., Ease A.K., Errington J., 1993, An efficient expression and secretion system based on Bacillus subtilis phageO 105 and its use for the production of B. cereus S-lactamase I. Gene, 1 3 3 :47-53,在此引入全文作 爲參考），一種有缺陷型原噬菌體載體即Φ 105MU3 31用來 在β. ίΜίί/Ζί中構建高水準的蛋白過表達系統（Leung Y.C. and Erington J., 1995, Characterization of an insertion in the phageO 105 genome that blocks host Bacillus subtilis lysis and provides strong expression of heterologous genes. Gene，154:1-6，在此引入全文作爲參考）。在該衍生系統 中，lacZ報告基因（即來自於質體PSG23的lacZ-cat盒； Erington J., 1986, A general method for fusion of the Escherichia coli lacZ gene to chromosomal genes in Bacillus subtilis, J. Gen. Microbiolo. 132: 2953-2966 )插 36 1326708 入到該區中，類似於各種噬菌體如6噬菌體的水解盒。這 種系統不僅提供了有效地誘導（熱誘導）基因的轉錄，而 且也提供阻止了宿主細胞的水解該酶的系統。因而在培養 介質中産生的酶在不破碎細胞的情況下很易分離，因此純 化步驟大大簡化。而且，不像co/ί那樣，桿菌屬細菌一 般認爲是安全的細菌而且它們的蛋白産物對動物包括人來 說也一般是安全的。 據此，將本發明的核酸分子插入到表達載體pSG以構 建pSGt-pL用於phyL的表達而構建pSG-ρΑ以用於 168phyA的表達。通過PCR技術擴增編碼成熟phyL的片 段，在使用的引物的兩側有從翻譯密碼子ATG到基因的終 止密碼子的phyL基因的編碼區，然後將該擴增片段亞克 隆進入表達載體pSGt，後者是將β· 的έ激粉 酶基因的終止子亞克隆到pSG表達載體構建而成（見圖4Β 和下文6.2節）。在pSGt-pL構建體中，phyL蛋白的基因 受制於Φ 105原噬菌體的啓動子。構建體pSG-ρΑ是通過將 PCR産物亞克隆到表達載體pSG中而製備的，PCR産物是 通過使用基因168phyA的開放的閱讀框架（ORF)而獲得 的。在該構建體中，基因168phyA的兩側是Φ 105啓動子 和原始基因168phyA的終止子（見圖A和6.3節）》這些 質體引入到株系JM109中以用於擴增和抗生素抗性 克隆系的飾選，然後再引入到宿主株系如5. iwftizU MU331以用於酶的生産。因此，本發明進一步包括載體' 宿主細胞以及重組生産植酸酶的方法（詳見6.2和6.3 37 1326708 節）。在一定的實施例中，宿主細胞是芽孢桿菌種，優選 爲枯草芽孢桿菌MU331 ^ 5.4融合蛋白 本發明進一步包括融合蛋白，在該融合蛋白中本發明的 多肽或其片段重組性地融合到或者化學性偶聯（如共價和 非共價偶聯）到異源多肽（即非相關多肽或其部分，優選 是該多肽的至少10個、至少20個、至少30個、至少40 個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至 少90個、至少100個胺基酸殘基）上從而生成融合蛋白。 這種融合可以是直接的，但也可能通過連接序列進行。 一方面，融合蛋白包含本發明的多肽，在該多肽的N 末段融合了異源信號序列。如本來就存在於本發明多肽中 的信號序列能夠被衍生於異種起源的信號序列取代。各種 信號序列均有商品銷售，如phoA分泌信號（Sambrook等， 詳見前述：和 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.，eds·，John Wiley &Sons，1992)和蛋白的分 泌信號（Pharmacia Biotech; Piscataway，NJ)就像原核的 異源信號序列一樣均有商品銷售。 在另一個實施例中，本發明的多肽能夠與標記序列融 合，如含六個織胺酸的肽，PQE載體（QIAGEN, Inc·，9Μ9 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)提供了該標記，在 其他已商業化的載體中也有。如Gentz ( 1989, Proc. Acad. Sci. USA, 86:821-824 )等所描述的那樣，六織胺酸肽爲融 38 1326708 合蛋白的純化提供了便利。其他的肽標記的例子是血球凝 集素蛋白“HA”標記物，它對應於來自於流感血球凝集素 蛋白的表位（Wilson et al·，1984, Cell, 37:767 )和“旗型” 標記物（Knappik et al·，1994，Biotechniques，17(4): 754-761 )。這些標記物對於本發明的重組多肽的純化很有 幫助。 通過標準的重組DNA技術或蛋白合成技術如使用肽合 成儀能夠生産融合蛋白，如編碼融合蛋白的核酸分子可通 過包括自動化的DNA合成儀在內的傳統技術合成。換句話 說，PCR擴增基因片段可通過使用錨定引物進行，該錨定 引物讓兩個連續的基因片段互補延伸，隨後退火以及再擴 增從而生成嵌合的基因序列（見，例如，Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley &Sons，1992 )。 編碼融合蛋白的核苷酸序列中能夠插入適當的表達載 體，即載體含有用於插入蛋白的轉錄和翻譯的必要元件。 在一個特殊的實施例中，融合蛋白的表達是通過可誘導 的啓動子調節的。 5.5重組蛋白的純化 一旦本發明的多肽由上述的方法産生，該重組蛋白可以 用本領域所熟知的任何一純化重組蛋白的方法來純化，如 下述方法但不侷限於它們，層析（如離子交換層析、親和 層析具體爲特異性抗體親和、凝膠過濾層析）、離心沈澱、 39 1326708 溶解性差異、或其他任何的蛋白純化的標準技術。進一步， 本發明的多肽或其片段能夠融合成在此所述的異源性多肽 序列，或者用本領域所已知的技術純化。 在一個特殊的實施例中，由枯草芽孢桿菌表達的蛋白 phyL或168phyA的純化是，將來自於細胞培養液的上淸部 分，先經乙醇沈澱、然後離心沈澱和對上述沈澱的溶解物 進行凝膠過濾（見6.2節和6.3節）。 5.6動物飼料的製備 如上面5.1節-5.5節所製備的本發明的多肽，在中性pH 下具有植酸酶活性，能夠用於提供動物飼料，使得餵養該 飼料的動物能夠有效地利用磷元素。因而，本發明的另一 項內容就是提供含有本發明多肽的動物飼料以便從植酸鹽 中釋放可利用的磷元素供給動物。例如，這種動物飼料在 造粒之前可借助與本發明的植酸酶酶粉混合來製備混合的 重量比爲一噸飼料約lkg酶粉，其酶活性爲 | 200000-400000EU/kg。爲了徹底混合，酶粉可先與少量的 飼料如10kg混合，然後再與飼料的剩餘部分混合。飼料中 的酶劑量至少是200酶單位（EU) /kg飼料，優選爲至少 250EU/kg飼料，最優選爲至少300EU/kg飼料。一個酶活 性單位是在37°C和pH7.0時，在1分鐘內從5.1mM植酸鈉 鹽釋放lg mole正磷酸鹽所需的酶量。飼料中包含有玉 米、榖物、小麥、大麥、水稻麩皮、食用大豆和食用canola、 或者是其他用作動物飼料的材料》 40 1326708 5.7轉基因植物的製備 植物生長需要的元素包括碳、氫、氧、磷、氮、金屬離 子和痕量元素。植物通過水和光合作用獲取碳、氫和氧， 而磷、氮、金屬離子和痕量元素則主要是從土壤獲得。因 此，土壤中的磷元素和氮元素的可利用能力則成爲植物生 長的限制因數。 本發明基於如下發現：如果不考慮兩種生物的植酸酶在 基因和蛋白序列及其結構的廣泛差異，來自於一種生物體 的植酸酶能夠以該植物體中基本的生物途徑組成在另外一 種植物中有效地起作用。因此，本發明涉及到在植物體內 一種新的生化途徑的創建，它能將從不可利用磷元素提升 到可利用的無機磷酸鹽，因而增加了植物的生長，就像例 子中所述的那樣，增加了側芽的數目。由於在開花和做果 時也需要磷酸鹽，爲此本發明也提供了經過改良後的開花 植物（如開花早以及增加了芽/花的數目）和做果植物（如 增加果實數量）。 由此，本發明提供了含有編碼和表達植酸酶的核酸分子 的轉基因植物，表達的植酸酶在中性pH時有最佳的催化 活性。本發明的轉基因植物相對於可比的非工程植物即同 種（株）來說，改進了植物的生長、開花和做果。在一個 特殊的實施例中，這種植酸酶來自於芽孢桿菌菌株，在中 性pH時有最佳的催化活性。在一個優選的實施例中，本 發明的轉基因植物包含有本發明的核酸分子並表達蛋白 41 1326708
PhyL ( SEQ ID NO:2)或 168phyA ( SEQ ID NO:4 )， 兩種蛋白在中性pH時是有活性的而且具有寬的溫度範 圍，如對於PhyL來說是37°C到70°C，對於168phyA是37 它到65°C »在一個優選的實施例中，該植酸酶不是以可檢 測量分泌的或者分泌量不是很明顯（即不超過總植酸酶的 1%、2%、5%或10%)。儘管SEQ ID NO:2和4具有原始的 信號肽，但對蛋白的分泌卻不盡如人意。在另一個優選的 實施例中，植酸酶是胞外表達的，如可以從轉基因植物的 根部分泌。在植物體內，這種胞外表達的中性蛋白能夠通 過融合的方法獲得，即將異源核苷酸序列融合到編碼植物 信號肽的N末端或用於取代編碼植酸酶基因的原始信號肽 的核苷酸序列（對phyL ( SEQ ID NO:2 )來說，即胺基酸 殘基1-80的全部或部分尤其是N末端部分，優選的是胺基 酸殘基1·20的全部或部分；或者對168phyA ( SEQ ID NO:4)來說，即胺基酸殘基卜80的全部或部分尤其是N 末端部分，優選的是胺基酸殘基1-26的全部或部分），該 異源核苷酸序列編碼的信號肽能使給定植物細胞翻譯後的 植酸酶有效的分泌出來。植物信號肽的例子包括但不侷限 於來自於伸展蛋白或與伸展蛋白根關多肽的信號肽 (Richardson et al., 2001，Plant Journal, 25:641-649 )、 酸性磷酸酶（Haran，-S; Logendra，-S; Seskar，-M; Bratanova, -M; Raskin, -I., Oct., 2000, Characterization of Arabidopsis acid phosphatase promoter and regulation of acid phosphatase expression, Plant-Physiol. 42 1326708
124(2):615-626 )、內質網信號肽（Borisjuk，-N-V; Borisjuk， -L-G; Logendra, -S; Petersen, -F; Gleba, -Y; Raskin, -I., May, 1 999，Production of recombinant proteins in plant root exudates，Nat-Biotechnol. 17(5):466-469 )、a _源粉酶（Park CS, Chang CC, Kim JY, Ogrydziak DM, Ryu DD., 1997, Expression, secretion, and processing of rice alpha-amylase in the yeast Yarrowia lipolytica, J Biol Chem, 272:6876-6881 )以及 PVR3 ( Choi, -D-W; Song, -J-Y;. Oh,-M-H; Lee, -J-S; Moon, -J; Suh, -S-W; Kim, -S-G., Mar., 1996, Isolation of a root-specific cDNA encoding a ns-LTP-like protein from the roots of bean (Phaseolus vulgaris L.) seedings, Plant-Mol-Biol. 30(5): 1059-1066 )° 由此，在另外一個優選實施例中，本發明的轉基因植物包 含有本發明的核酸序而且表達蛋白PhyL (SEQIDNO:2) 或168phyA ( SEQ ID NO:4)，但通過基因工程的方法用 異源植物信號肽取代了蛋白的N末端部分，對SEQ ID NO:2 來說，即胺基酸殘基1-80的全部或部分尤其是N末端部 分，優選的是胺基酸殘基1-20的全部或部分；或者對SEQ ID NO:4來說，即胺基酸殘基1-80的全部或部分尤其是N 末端部分，優選的是胺基酸殘基1-26的全部或部分。在這 種轉基因植物中，中性植酸酶分泌到土壤中，將土壤植酸 鹽轉化爲無機磷酸鹽供植物吸收。在另外一個優選的實施 例中，本發明的轉基因植物至少包含兩種本發明的核酸分 子，其中一種核酸分子編碼蛋白PhyL (SEQIDNO:2)， 43 1326708 而另一種核酸儘管也編碼蛋白PhyL，但用異源植物信號肽 取代了 SEQ ID NO:2的N末端部分，即N末端胺基酸殘基 1-80的全部或部分，優選的是胺基酸殘基1-20的全部或部 分。在另外一個優選的實施例中，本發明的轉基因植物至 少包含兩種本發明的核酸分子，其中一種核酸分子編碼蛋 白168PhyA ( SEQ ID NO:4)，而另一種核酸儘管也編碼 蛋白168PhyA，但用異源植物信號肽取代了 SEQIDNO:4 的N末端部分，即N末端胺基酸殘基1-80的全部或部分， 優選的是胺基酸殘基1-20的全部或部分。這種轉基因植物 可以表達胞內和胞外兩種植酸酶》在另外一個優選的實施 例中，本發明的轉基因植物包含本發明的核酸分子並表達 本發明多肽的類似物、衍生物和/或它們的片段，後者至少 具有一種本發明多肽的功能特點和/或結構特點。還是在另 外一個優選的實施例中，本發明的轉基因植物包含本發明 的核酸分子在極其嚴格的條件下能夠與具有SEQ ID ΝΟ:1 或3的序列、或它們的互補鏈雜交並編碼至少具有本發明 多肽的一種結構和/功能特點的蛋白或多肽。本發明還特別 提供了能夠産生中性植酸酶的轉基因煙草和轉基因水稻的 生産，産生的中性植酸酶有益於改善植物生理如植物生長 速率和特性，例如在改善開花反應方面。而且，當這些植 物産生的中性植酸酶供應給動物時，這種植酸酶能夠作用 於存在動物飼料中的其他的植酸鹽資源以水解植酸鹽，釋 放的無機磷酸鹽用於動物的同化作用》這就降低或排除了 動物飼料中補加植酸酶或無機磷酸鹽的需求，也減少了動 44 1326708 物分泌磷元素的，而帶來的環境污染問題。因此，本發明 進一步提供了包含本發明的轉基因植物（尤其來自於這些 轉基因植物的種子或果實）的動物飼料。 因此，本發明還提供了用於對植物遺傳修飾的嵌合基因 構建體，增加磷元素可利用，從而提高了植物的生長速率 和縮短了開花所需的時間。嵌合基因構建體中包含率的基 因序列基本上僅僅編碼植酸酶，該酶在中性pH條件下催 化植酸鹽的水解。優選的植酸酶衍生於芽孢桿菌屬菌株。 在一個特殊的實施例中，嵌合基因構建體中包含具有序列 SEQIDNO:l或3的核酸。在另一個實施例中，嵌合基因 構建體中包含具有序列SEQ ID ΝΟ:1和/或SEQ ID NO:3 的核酸，但對於序列SEQ ID ΝΟ:1來說，241至480核苷 酸序列的全部或部分優選是241至300核苷酸序列的全部 或部分被編碼植物信號肽的異源核苷酸序列所取代，和/ 或對於序列SEQ ID NO:3來說，100至339核苷酸序列的 全部或部分優選是1〇〇至177核苷酸序列的全部或部分被 編碼植物信號肽的異源核苷酸序列所取代。在另外一個優 選的實施例中，嵌合基因構建體中包含的核酸分子編碼至 少具有一種本發明多肽的功能特點和/或結構特點的多肽 的類似物或它們的片段。在另外一個特殊的實施例中，嵌 合基因構建體中包含的核苷酸序列能夠與具有序列SEQ ID ΝΟ:1或3的序列、或它們的互補鏈雜交的核酸雜交， 該序列編碼的蛋白或多肽顯示至少具有本發明多肽的一種 結構和/功能特點。更進一步，由本發明的嵌合基因構建體 45 1326708 中包含的核酸分子編碼的植酸酶可以是任何其他的在中性 pH條件下有最佳催化活性的植酸酶，而且具有任意相似的 結構特性如對於本發明的植酸酶而言的多鈣結合位點。這 種植酸酶包括但不侷限於下列多肽： 來自於芽孢桿菌種的植酸酶（接受序列號：AAC38573, AAC3 1775,7767024 );來自於枯草芽孢桿菌的植酸酶（接 受序列號：AAC3 1 775, AAG17903，AAB72078， AAA87722);來自於解澱粉芽孢桿菌的植酸酶（接受序列 號：7246002, 7245653);來自於新月柄桿菌的植酸酶（接 受序列號：AAK23276)以及來自於天藍色鏈黴菌（接受序 列號：CAC17 528 )。 編碼植酸酶的序列任選地連接到調節組分的上游和下 游，優選用異源性植酸酶序列；如CMV35S啓動子促使植 物細胞中基因（産生酶的基因）的表達（見6.5.1-6.5.4節）。 根據本發明，用傳統的轉形方法將含有植酸酶基因的構建 體引入植物細胞時，如微粒轟擊法、農桿菌感染法或顯微 注射法，在調節序列的控制下這種基因在細胞內表達。成 功表達的植酸酶與天然存在於植物細胞中的生物合成機制 相互作用，在中性pH下催化植酸鹽以釋放無機磷酸鹽。 通過增加無機磷酸鹽的可利用性，本發明也就有益於生長 速率的提高，促進開花和做果。因而，縮短了植物成熟和 開花的時間。由此，本發明還提供了具有低水平植酸鈉鹽 植物細胞和植物整株，在此種植物的細胞中含有根據本發 明的嵌合基因構建體。本發明還提供了增加存在於植物細 46 1326708 胞和整株植物的無機磷酸鹽的可利用性的方法，它包含在 這種植物細胞或這種整株植物的細胞中插入根據本發明的 假想基因的步驟》 在特殊的實施例中，採用水稻（見6.5.3節）和煙草（見 6.5.4節）作爲兩種模型系統。含有編碼植酸酶的基因的兩 種假想的構建體引入到這兩種植物中。 在本發明的一個優選的實施例中，應用了來自於枯草芽 孢桿菌的植酸酶。當這種植酸酶含有用於分泌的信號肽 時，它能從細胞中分泌出來。在中性pH下這種酶能從植 酸鹽中釋放出無機磷酸鹽，而且該酶具有高溫穩定性。因 此，已經發現，如果不考慮兩種生物的植酸酶在基因和蛋 白序列及其結構的廣泛差異，來自於一種生物體的植酸酶 能夠以該植物體中基本的生物途徑組成在另外一種植物體 中有效地起作用。因此，本發明也涉及到植物體中生化途 徑的創建，創建的途徑提高了磷從植酸鹽形式到無機磷酸 鹽形式的轉化。根據本發明所得到的結果說明了新型的生 化途徑增加了植物的生長速率（見6.5.9節和圖12和13)。 已經觀察到植物的開花需要磷，因而，本發明還提供了 轉基因開花植物，由於中性植酸酶的轉基因的表達，增加 了磷的可利用性，從而縮短了開花所需的時間。 任何的植物種用本發明的表達盒和方法修飾時，優選包 括但不侷限於下列各屬植物及括弧內的各自的種： 單子葉植物：天門冬屬Asparagus (天門冬）、雀麥 屬（雀麥）、萱草屬（Daylily萱草）、大麥屬（大麥）、黑麥草 47 1326708 屬（黑麥草）、稻屬（水稻）、黍屬（witchgrass黍）、狼尾草 屬（Fountaingrass狼尾草）、蜀黍、崩蘆巴屬（fenu grass 葫蘆巴）、小麥屬（小麥）、玉蜀黍屬（玉米）和
雙子植物：金魚草屬（flower sp. )、擬南芥 屬（thaliana)、Arachis (落花生）、顛茄屬（顛茄）、芥屬 (油菜）、Browallia，辣椒屬（胡椒），Carthamus紅花屬 (紅花），菊苣屬（菊苣），Citrus桔屬（柑橘、檸檬），菊 屬，Cucumiss黃瓜屬（黃瓜），曼佗羅屬（thorn apple)， 胡蘿蔔屬（胡蘿蔔），毛地黃屬（毛地黃），草莓屬（草莓）’ 老鸛草屬（flower sp.)，大豆屬（大豆），向日葵屬（向日 葵），Hyscyam，Ipomoea(牽牛花），latuca 高苣屬（高宦）， 亞麻屬（亞麻），百脈根屬（flower sp. )，Lycopersicon，番 茄屬（番茄），茉喬樂那（擬），錦葵屬（棉花），木薯屬，
Medicago(苜蓿），龍面花屬，Nicotiana (煙草），驢喜豆屬， 天竺莫屬（citrosa)，矮牽牛屬（flower sp.)，毛莨屬（flower 3口.），蘿蔔屬（蘿蔔），8&1卩丨§1〇83丨3，千里光屬（打0^4^3?.)’
Sinapis(albae semen),前屬（土豆），Trifolium(clovers 三葉 草），SI豆屬（mungbean綠豆，fababean)，葡萄屬（葡萄）° 植物的基因構建可以通過幾種方式獲得成功，最常用的 方法是土壤農桿菌介導的轉形。在該方法中，對土壤農桿 菌的根癌農桿菌種進行了處理，該種通過將致腫瘤基因插 入植物基因組中從而感染植物。在實驗室條件下，將選擇 的基因轉入丄iwwe/flciew·?的Ti質體的T-DNA中，通過細 菌自身的內部轉移機制將其T-DNA轉入植物體內，從而使 48 1326708 該基因整合到植物的染色體中。Τ-DNA的唯一基本部分是 它的兩個小的（25個鹼基對）端部重復序列，至少其中之 一是用於植物轉形的。編碼用於啓動腫瘤生長的植物激素 的細菌基因從Τ-DNA中除去，取而代之的DN A序列，通 常包括：選擇性標記物（如抗生素抗性基因，常用卡那黴 素抗性）、限制性酶切位點一該點具有特殊的核苷酸序列， 限制性內切酶可以切割該DN A該位點以及待引入植物體 內的目的基因（B. Tinland，1996. The integration of T-DNA into plant genomes. Trends in Plant Sciencel, 178-184; D. Grieson(ed.) 1991. Plant Genetic Engineering. Blackie, Glasgow )。將土壤農桿菌加入到培養物中植物原生質體（去 掉細胞壁的植物細胞）然後允許再生出細胞壁，當使用抗 生素時未轉形的植物細胞被殺死而轉形的植物則授予了抗 生素抗性基因。之後用標準的植物組織培養技術從生還的 轉形細胞中再生出植物幼苗。另一個技術是，將植物營養 體的片段或其他的無菌部分在液體培養介質中和土壤農桿 菌一同培養，然後在選擇性培養介質中加入激素以誘導生 根，從再生出植物幼苗。對於一些植物如而 言，第三個傳遞基因的技術是可行的土壤農桿菌或甚至裸 DNA能夠通過種子包衣融合到植物細胞內而導致轉形 (Clough SJ and Bent AF, 1998. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16:735-743 ) 最近用於植基因工程的生物法得到了發展而且受到了 49 1326708
廣泛的應用。在這種方法中，包裹有生物活性DNA的非常 小的鎢或金顆粒（微射彈），用電脈衝、氣壓或散彈槍將其 高速擠入植物細胞。由於顆粒穿過細胞，DNA可溶解其中 然後整合到細胞或其後代的基因組中。已有的結果顯示該 方法能産生穩定的轉形植物（〇：11|481〇11,1>.，6131.，1988· Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold particles, Plant Physiology, 87: 671-674)° 該方法可 以用於整株植物，尤其對分生組織有效。該方法還能傳遞 DNA 到核或線粒體（Johnston SA·，et al·，1988. Mitochondrial transformation in yeast by bombardment with microprojectiles. Science，240:1538-1541 )和葉綠體（Svab Z., et al., 1990. Stable transformation of plastids in higher plants, Proc Natl Acad Sci. USA 87, 8526-8530 ) °
植物基因工程的電穿孔法成功不多，在該技術中，當用 一定的膜-活化劑或用電穿孔法即一種高壓直流電的脈衝 處理培養中的原生質體時，它可以吸收純的DNA。一旦 DNA進入原生質體內，它可以整合到細胞的染色體組中， 然後用標準化的組織培養技術即可再生出轉基因植株》 植物基因工程的顯微注射法可能是最困難的，在該方法 中，應用非常細的玻璃針將DNA顯微注射到植物靶細胞 中，該法相似於在動物中的應用。對於大量轉基因植物的 生産來說，該法是辛苦的、無效的和不實用的工作。 用於基因工程植物的方法的遴選常常主要取決於靶植 物的種和業已證明的有效方法。 50 1326708 5.8抗體的製備 特異性識別本發明多肽或其片段的抗體能夠用於本發 明多肽或其片段或編碼來自於其他生物的相似酶的相似序 列的檢測、篩選以及分離。如，在一個特殊的實施例中， 能夠免疫特異性結合PhyL或168phyA或其片段的抗體可 用於進行各種體外檢測分析，包括酶聯免疫吸附 (ELISA)、放射免疫分析、West印跡等，以檢測本發明多 肽或片段、衍生物、類似物或其變體、或在樣品中同本發 明肽具有相似酶活性的相似分子，如生物材料，包括細胞、 細胞培養介質（如細菌培養介質、哺乳類細胞培養介質、 昆蟲細胞培養介質、酵母細胞培養介質）、血液、血漿、血 淸、組織等。 本發明多肽的特異性抗體可通過任何本領域已知的方 法産生。對於有益抗原的多抗可用本領域所熟知的各種工 藝産生。如將來自於本發明多肽的衍生的抗原用於各種宿 主動物，包括但不侷限於兔、小鼠、大鼠等，誘導含有對 抗原有特異性的多抗的抗血淸。各種佐劑可用以增加免疫 反應，這取決於宿主的種類，佐劑包括但不侷限於弗氏佐 劑（完全和不完全）、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質如 溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、 血銅蛋白輔基鑰孔血藍素、二硝基苯酚以及潛在的可用於 人的佐劑如BCG (卡介菌）和小棒桿菌。這些佐劑在本領域 也是熟知的。 51 1326708 單克隆抗體的製備可通過本領域已知的多種技術進 行，包括使用雜交瘤、重組體以及噬菌體展示技術’，或者 這幾種技術的組合。例如，單抗的製備可通過雜交瘤技術 所産生，包括本領域已知的且用於教學的方法，如在下列 書籍中的方法，Harlow 等，Antibodies: A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling 等：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-68 1 (Elsevier NY, 1981)(此處引入 二者的全文作爲參考）。此處使用的術語“單克隆抗體”不 侷限於通過雜交瘤技術産生的抗體。術語“單克隆抗體” 指的是衍生自單克隆系的抗體，包括任何的真核細胞、原 核細胞或噬菌體的克隆，而不是指生産單克隆抗體的方法》 應用雜交瘤技術製備和篩選特異性抗體的方法在該領 域已經是常規和熟知的，在一個非限制性的例子中，小鼠 可以用目的抗原或者用表達這種抗原的細胞免疫。一旦檢 測到免疫應答，如在鼠血淸中檢測到對應於抗原的特異性 抗體，收集脾臟並分離出脾臟細胞。然後用熟知的技術將 該脾臟細胞與合適的骨髓瘤細胞融合。通過有限稀釋篩選 出雜交瘤並克隆。用本領域已知的方法分析雜交瘤克隆 系，分泌抗體的細胞具有結合抗原的能力。腹腔積液可以 用陽性雜交瘤克隆腹膜內接種小鼠來製備通常含高水準抗 體的腹水。 識別特異性表位的抗體片段可借助已知的技術製備，如 Fab和F(ab’ ）2片段可通過免疫球蛋白分子的蛋白水解作 52 1326708 用的切割來實現，使用的酶如木瓜蛋白酶（産生Fab片段） 或胃蛋白酶（産生F(ab’ ）2片段）》F(ab’）2片段含有完整 的輕鏈以及重鏈的可變區、CH1區和轉折區。 本發明的抗體或其片段由本領域已知的合成抗體的方 法來製備，具體是通過化學合成法，優選的是重組體的表 達技術。 編碼抗體的核苷酸序列可來自於對本領域技術人員來 說能夠利用的任何來源（即來自於Genbank、文庫或通過 ® 常規克隆方法）。如果無法獲得含有編碼特異抗體或其表 位結合片段的核酸克隆，但抗體分子或其表位結合片段的 序列是已知的，則可以化學合成編碼免疫球蛋白的核酸或 借助PCR擴增方法從合適的來源（如抗體的cDNA文庫，或 從核酸産生出的cDNA文庫，優選借助polyA + RNA，從任何 表達抗體的組織或細胞中分離出的，如表達抗體的雜交瘤） 獲得，使用的合成引物能夠與核酸的3’端序列和5’端雜 交，或通過使用對特殊基因序列有特異性的寡聚核苷酸探 針來克隆與來自於cDNA文庫能夠編碼抗體的cDNA克隆來 ® 獲得相一致的核苷酸序列。PCR擴增産生的核酸可借助本 領域任何已知的方法克隆到可以複製的克隆載體中。 一旦抗體的核苷酸序列確定，可用本領域任何熟知的核 苷酸序列處理方法來處理該抗體的核苷酸，如重組DN A技 術、定點誘變、PCR等（例如，見前述Sambrook等所描述 的技術以及 Ausubel 等編著，1998 ’ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY，此處引入二者 53 1326708 的全文作爲參考）以産生具有不同的胺基酸序列的抗體， 如引入了胺基酸替換、刪除和/或在抗體或其部分的特異性 抗原決定部位插入胺基酸，增加或降低抗體的生物學活性。 抗體的重組表達需要構建表達載體，該表達載體中含有 編碼抗體的核苷酸的序列。一旦獲得編碼抗體分子或其重 鏈或輕鏈或其部分的核苷酸序列*周於抗體産生的載體可 通過重組DNA技術來産生，這些本領域所熟知的技術在以 前的章節中已經討論過。這些對本領域技術人員所熟知的 ® 方法常用於構建表達載體，所構建的表達載體中含有編碼 抗體的序列以及合適的轉錄和翻譯的控制信號。例如，這 些方法包括體外重組DNA技術、合成技術和體內基因重 組。編碼抗體重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈可變區和輕 鏈可變區、重鏈和/或輕鏈可變區中的表位結合片段、或抗 體的一個或多個互補決定區（CDRs )的核苷酸序列均能克 隆到這種表達載體中。這種製備好的表達載體可隨後引入 合適的宿主細胞中以表達抗體。因此，本發明包括含有多 聚核苷酸的宿主細胞，該多聚核苷酸編碼了對本發明多肽 ® 或其片段有特異性的抗體。在一定的實施例中，宿主細胞 是芽孢桿菌種，優選枯草芽孢桿菌MU331。 宿主細胞可用兩個本發明的表達載體共同轉染，第一個 載體是編碼重衍生多肽鏈，第二個載體編碼輕衍生多肽 鏈。兩個載體可含有相同的可選擇性的標記，從而使重鏈 和輕鏈有相同的表達，兩個載體也可以含有不同的可選擇 性的標記以確保兩個質體的穩定。作爲替換，也可使用能 54 1326708 夠編碼和表達重鏈和輕鏈多肽的單一載體。在此種情況 下，輕鏈應該放到重鏈之前以避免毒性的游離重鏈的過量 表達（Proudfoot，1986，Nature，322:52;和 Kohler，1980, Proc. Natl. Acad· Sci. USA, 77:2197 )。用於編碼重鏈和輕 鏈的序列可以包含cDNA或基因組DN A。
在另一個實施例中，抗體也可通過使用本領域已知的各 種噬菌體展示方法來産生。在噬菌體展示方法中，功能性 的抗體域位於噬菌體顆粒的表面，該噬菌體攜帶有編碼抗 體的多聚核苷酸序列。在一個特殊的實施例中，這種噬菌 體可用於展示與域結合的抗原，此處的域指Fab和Fv或二 硫鍵穩定的Fvs，它們來自於全組份的或重組配的抗體文庫 (如人或鼠表達能夠與目的抗原結合的抗原結合域的 噬菌體能夠用於抗原的篩選或者鑒定，如使用標記的抗原 或者被結合或捕獲在固相表面或小珠上的抗原結合物。這 些方法中使用的噬菌體是典型的絲狀噬菌體，包括fd和 M13。抗原結合域以該蛋白與噬菌體基因皿或基因ΥΙΠ蛋白 融合形式的表達。噬菌體展示方法例子可用於製造本發明 的免疫球蛋白或其片段，包括以下公開的文獻中免疫球蛋 白或其片段，Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50 ' Ames et al., 1995, Immunol. Methods, 184:177-186 ' Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al‘，1997, Gene, 187:9-18、Burton et al·，1994，Advances in Immunology, 57:191-280、PCT applications No. PCT/GB9 1/011 34 ' PCT applications WO 55 1326708 90/02809、WO 91/10737、WO 92/02047、WO 92/1 8619、 WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401 和 U.S· Patent Nos. 5698426 、 5223409 、 5403484 、 5580717 、 5427908 、 5750753、5821047、5571698、5427908 ' 5516637' 5780225、 5 65 8 727、5733743和5969108，在此引入作爲參考。
如上述參考文獻所述，噬菌體篩選後，來自於噬菌體的 抗體編碼區能夠分離出來並用於製備完整的抗體，包括人 抗體，或其他任何目的片段，以及能在任何需要的宿主包 括哺乳類細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌中表達， 如下面祥述的那樣。例如，用於製備重組Fab、Fab’和 F(ab’）2的技術也可使用，這些在本領域已知的方法如 PCT 公開文本 WO 92/22324、Mullinaxetal·，1992， BioTechiques，12(6):864-869 和 Sawai et al.，1995，AJRI， 34:26-34、Better et al.，1988, Science, 240:1041-1043 (在 此引入它們的全部作爲參考）》用於産生單鏈Fvs和抗體的 例子包括如下文獻：美國專利Nos. 4946778和5258498、 Huston et al., 1991, Methods in Enzymology, 203:46-88 ' Shu et al·，1993, PNAS, 90:7995-7999和 Skerra et al·，1988, Science, 240:1038-1040 ° 一旦本發明的抗體分子按照上述的方法産生，隨後用本 領域已知的純化免疫球蛋白分子的方法來純化該抗體分 子，如用層析法（如離子交換層析、親和層析、尤其蛋白 A或蛋白G純化後對特異性抗原的親和層析和凝膠排阻層 析）、沈澱法、溶解度差異法或其他任何蛋白純化的標準 56 1326708 技術。更進一步，可將本發明的抗體或其片段融合到本發 明所述的或其他本領域已知的實現純化的異源性多肽序列 上。 就一些用途而言，包括抗體的人體內應用和體外檢測分 析，優選使用嵌合抗體、人源化的抗體或人抗體。嵌合抗 體是這樣一種分子，該抗體的不同部分衍生自不同的動物 種，如該抗體具有衍生自鼠單克隆抗體的可變區和衍生自 人免疫球蛋白的不變區。用於産生嵌合抗體的方法在本領 域是已知的，例如見：Morrison，1985，Science, 229: 1202、 Oi et al_, 1986，Bio Technique, 4:214、Gillies et al·，1989, J. Immunol. Methods, 125:191-202 ' U.S.Patent Nos. 5 8 07715、481 6567以及48 163 97,在此引入它們的全部作爲 參考。人源化的抗體是能夠結合目標抗原的非人源抗體， 其具有1個或多個非人來源的互補決定區（CDRs)，以及 來源於人免疫球蛋白的框架結構區和恒定區。在人框架結 構區中的框架殘基常常被來自於CDRs供體抗體的對應胺 基酸殘基所取代，以改變優選提高對抗原的結合性。所述 框架取代由本領域所熟知的方法測定，如通過類比CDR與 框架中胺基酸殘基的相互作用以確定框架中殘基對抗原結 合的重要性以及序列的比較以確定在特殊位置的非同一般 的胺基酸殘基。例如見Queen et al.，U.S. Patent No. 5585089、Riechmann et al.，1988，Nature, 332: 323，在此 引入它們的全部作爲參考。本領域的已知的多種技術都能 夠使抗體人源化，如這種技術包括CDR稼接（EP 239400、 57 1326708 PCT publication WQ 91/09967、U.S. Patent Nos. 5225539、 5530101 和 5585 08 9)、表面修飾或整理（EP 5 92106、 EP5 1 9596 以及 Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5): 489-498、 Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6): 805-814 ' Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973 )和鏈拖動（Patent Nos. 5565332 )，所有這些文獻在此全文引入作爲參考。 完全的人抗體尤其適合於對人患者的治療處理》人抗體 能夠通過本領域已知多種方法來製備，包括上述的噬菌體 展示方法，該方法使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗體文 庫。見 U.S. Patent Nos. 4444887和 4716111、PCT Publications WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、 WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和 WO 91/10741，所有這些文獻在此全文引入作爲參考。 應用轉基因小鼠也可獲得人抗體，該鼠不能再表達功能 性的內源免疫球蛋白，而能表達人免疫球蛋白的基因。回 顧製備人抗體的技術，見Lonberg and Huszar，995, Int. Rev. Immunol., 13:65-93。關於製備人抗體和人單克隆抗體及其 製備這種抗體的方法的詳盡的描述祥見，如PCT公開號 WO 98/24893、WO 96/34096、WO 96/3 3 73 5、European Patent No. 05 98 877、US Patent Nos. 5413 923、5 625126、5633425、 5569825、 5661016、 5545806、 5814318、 5885793、 5916771 和5939598，所有這些文獻在此全文引入作爲參考。另外， 像 Abgenix，Inc. (Fremont, CA) ' Medarex (NJ)和 Genpharm 58 1326708 (San Jose，CA)等公司利用上述相似的技術均可提供對選 擇性抗原有針對性的人抗體。 用一項被稱作“指導選擇”的技術能夠製備出可識別 選擇表位的完整人抗體。在該方法中，用選擇性的非人源 單克隆抗體如鼠抗體來指導識別同一表位的完整人抗體的 選擇（Jespers et ai·，1988，Bio/Technology，12:899-903)。 融合或交聯到異源性多肽上的抗體可用於體外的免疫 分析和本領域所熟知的純化方法（如親和層析）中。例如 β 見 PCT publication Number WO 93/21232、ΕΡ 439095、
Naramura et al·，1994，Immunol. Lett.，39: 91-99、US Patent 5474981、Gillies et al·，1992, PNAS，89: 1428-1432和 Fell et al.，1991，J· Immunol.，146: 2446-2452，所有這些文獻 在此全文引入作爲參考。 抗體也可以同固相支援物連接，尤其適合於本發明多肽 或其片段、衍生物、類似物或其變體、或具有本發明多肽 相似酶活性的相似分子的免疫分析或純化。這種固相支援 物包括但不侷限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚 β 苯乙烯聚氯乙烯或聚丙烯。 5.9檢測分析 用於檢測本發明多肽或核酸存在與否的示範性方法包 括從各種來源中獲得生物樣品並使之與能夠檢測本發明所 述多肽或核酸（如mRNA、基因組DNA)的化合物或試劑 接觸，從而檢測了樣品中本發明多肽或核酸的存在。優選 59 1326708 的用於檢測編碼本發明多肽的mRN A或基因組DN A的試劑 是標記的核酸探針，它能夠與編碼本發明多肽的mRN A或 基因組DNA雜交。例如，該核酸探針可以是全長的cdnA 如核酸SEQ ID ΝΟ:1或3,或者其中的一部分如長度至少有 15、20、25、30、50、100、250、500個或更多個連續核苷 酸的寡聚核苷酸，確保在嚴格的條件下與編碼本發明多肽 的mRN A或基因組DN A特異性雜交。 優選的用於檢測本發明多肽的試劑是能與本發明多肽 ® 結合的抗體，優選抗體上連有可探測的標記物。抗體可以 是多克隆，更優選爲單克隆。完整的抗體或其片段（如Fab 或F(ab’）2)均可使用。見5.5節中有關抗體的詳盡描述。 此處術語“標記的”主要是針對於探針或抗體而言 的，意指對探針或抗體的直接標記和間接標記，直接標記 是指在探針或抗體上耦合（如物理性連接）了可檢測的物 質，間接標記是指通過探針或抗體與可直接標記的試劑的 反應活性來實現的。間接性標記的實例包括用螢光標記二 抗來檢測一抗以及在DN A末端標記上生物素從而使得能用 ® 螢光標記鏈黴素來檢測。本發明的檢測方法可用於檢測體 外或體內樣品中的mRNA、蛋白質或基因組DNA *例如’ 體外檢測mRN A的技術包括Northern雜交和原位雜交。體外 檢測本發明多肽的技術包括酶聯免疫吸附（ELISAs)、
Western印記s、免疫沈澱和免疫螢光。體外檢測基因組 DNA的技術包括Southern雜交。更進一步，體內檢測本發 明多肽的技術包括直接將抗多肽的抗體引入目標生物體 60 1326708 內。例如，抗體可用放射性標記物標記，它在目標生物體 內的存在和位置可用包括放射自顯影在內的標準成像技術 檢測。 在一個特殊的實施例中，該方法進一步涉及從對照體中 獲得對照樣品、將對照樣品與可檢測本發明多肽或編碼本 發明多肽的mRN A或基因組DNA的化合物或試劑接觸，
從而在檢測樣品中多肽或編碼多肽的mRNA或基因組DNA 的存在，然後將對照樣品中與待測樣品中多肽或編碼多肽 ® 的mRNA或基因組DN A的存在情況進行比較。 本發明也包括檢測待測樣品中有無本發明多肽或核酸 存在的試劑盒。 例如，該試劑盒可以包括標記化合物或試劑，它能夠檢 測同一樣品中多肽或編碼多肽的mRNA的的存在並包括確 定樣品中多肽或mRNA量的方法（如與多肽結合的抗體或 與編碼該多肽的DN A或mRNA結合的寡聚核苷酸）。檢測 試劑盒包括有使用說明。 對基於抗體的試劑盒來說，該試劑盒包括，如：（1)能 ® 夠與本發明所述多肽結合的一抗（如與固體支援物相連） 以及可以選擇的（2)二抗，其中一種能夠與多肽結合或者與 一抗結合的不同抗體並且偶聯有一可檢測標記物。 對基於寡聚核苷酸的試劑盒來說，該試劑盒包括，如： (1)寡聚核苷酸，如可探測的標記核苷酸，它可以與編碼本 發明多肽的核酸序列雜交或（2)用於擴增編碼本發明多肽 的核酸分子的一對引物。該試劑盒還可以包括，如緩衝試 61 1326708 劑、防腐劑或蛋白穩定劑。該試劑盒還可以包括用於檢測 可檢測試劑的的必須組分（如酶或底物）。該試劑盒還可以 含有對照樣品或一系列對照樣品，以便分析和與實驗樣品 相比較。試劑盒的每一組分常用單一容器包裝並且各種容 器在同一包裝盒內並附有說明書。 5.10植酸酶和轉基因植物的商業應用 如上所述，植酸酶大量存在於食物資源中，充當動物食 ® 物的主要組成部分。但是對於包括家禽和魚在內的單胃動 物來說，是不能利用磷元素的，而且當它分泌到環境中時， 植酸鹽又對生態系統造成了嚴重的污染問題。由於這種反 應發生在食物鏈的低層，環境更換的不會很快看到，但是 污染一直在持續，所以這種更換造成的影響將會累積並滲 透到所有的生態系統，從而對整個生態系統造成永久性傷 害。 基於本發明多肽對單胃動物的無毒以及可通過本發明 所述多肽的過量表達系統可以大量生産，通過製備含有本 ® 發明多肽的動物飼料使得本發明的多肽具有巨大的商業用 途。本發明多肽被單胃動物利用從而減少了不被利用磷元 素的環境排放量，因而減輕了環境污染。 另外，常常將磷酸鹽加入到肥料中以促進植物生長，但 這同時也增加了環境污染。雖然磷元素資源存在於土壤 中，但卻是以植酸鹽的形式而不能被植物所利用。因此， 根據帶有本發明嵌合基因構件體的轉基因植物能夠表達胞 62 1326708 內植酸酶和胞外植酸酶，這些植酸酶作用巨大能夠利用其 他情況下植物本身及動物無法獲得的磷元素。也就是說， 轉基因植物對磷元素的有效利用的貢獻不僅體現在減少了 磷元素的環境污染，同時也體現在促進了植物的生長，包 括開花和做果，顯示了明顯的農業和園藝方面的應用前 景。而且，將具有胞內表達本發明植酸酶的轉基因植物的 引入到動物飼料中進一步提高動物對磷元素的利用能 力。減少了環境污染。 # 眚施例 下列實施例說明了植酸酶及其抗體的克隆、生産、分 離和鑒定過程，這些實施例不能看作是對本發明的限制。 基因PhvL的分子克隆 從5. 克隆基因PhyL的策略顯示在圖3 中，5βί；Ζ·//ί/·ϊ//£；/ΐβ«//〇Α·/«Ζ·ί 細胞能夠購買到 (ATCC# 10716 )。該細菌細胞於37 °C生長在營養瓊脂板上 ® (含2.5% (重量/體積）的肉湯粉，1.5% (重量/體積）的 微生物學用瓊脂），並作爲變性PCR反應用的模板。根據 PhyK ( Kim YO, Lee JK, Kim HK, Yu JH, Oh TK, 1998,
Cloning of the thermostable phytase gene(phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia co/z·，FEMS Microbiology Letters，162:182-191 )和 Phy C (Kerovuo September 25，2002，J·，Laurarus M·，Nurminen 63 1326708 P., Kalkkinen N., Aapajalahti J., 1998, Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis, Applied and Environmental Microbiology, 64(6):2079-2085 )以及 168phyA ( SEQ ID No: 4)的保守胺基酸序列來設計變性 的寡聚核苷酸鏈（SEQ ID NO:5和或SEQ ID NO:6)以作 爲PCR反應的引物》擴增反應在PCR儀（Robercycler gradient 40, Stratagene，USA)上進行，在磷酸化的寡聚物 存在下進行30次迴圈（94°C下45秒、50°C下45秒、72 °C下2分30秒）。從2% (重量/體積）瓊脂糖凝膠上切取 需要的PCR産物並用GenecleanUI試劑盒（Qbiogene，Inc, CA)純化。純化的産物經X-gal/IPTG誘導克隆到pBSSK 中並篩選抗青黴素菌株。培養在補加有100 M g/ml青黴素 的LB肉湯培養基上的具有抗青黴素的質體用Quantum mini-prep 試劑盒（Bio-Rad，Hong Kong)提取並測序 (MWG Biotech AG，Germany)。 使用基因組DNA純化試劑盒（Promega，HongKong) 提取出的基因組DNA並在260nm下用光 密度分析法確定DNA的濃度。兩組基因組DNA ( 20 /z g/ 組）分別用 10 單位 Hae ΠΙ 酶（Boehringer Mannhem，Hong Kong)或 10 單位 SAU3AI 酶（Boehringer Mannhem，Hong Kong )進行限制性酶解1小時。酶解後的DN A經純化和 稀釋到1 # g/ml後，用T4DNA連接酶環化（Life Technologies, Hong Kong )。環化後的DNA用苯酚-氯仿抽 64 1326708 提並用乙醇沈澱。 正向及反向寡聚核苷酸（SEQIDNOS:7-12)設計爲與 變性PCR獲得的序列的5’端和3’端的序列側面連接。使用 部分消化的基因組DNA作模版，反向PCR進行30次迴圈 (94°C 下 45 秒、55°C 下 45 秒、72°C 下 2 分）。陰性 PCR 産物用乙醇沈澱並用相應的限制性內切酶處理，之後亞克 隆到質體pBSSK的Eco RI和Bam HI的酶切位點。選擇所 需的陰性克隆並用上述方法提取。對所得克隆進行測序並 用DNA處理軟體對序列資料進行評估和分析，這些軟體包 括 MAC DNASIS ( Hitachi，Japan)和 DNA Strider (Christian Marck, Service de Biochimie, Department de Biologie, Institut de Recherche Fondamentale, CEA,
Frande )在內的。用 Geneworks for Mac ( Intelligenetics, Mountain View, CA)軟體進行系統發育分析。 DNA和根據基因PhyL推測出的胺基酸序列分別展示 在SEQ ID NOS:l和2中。發現在推測的核糖體結合位點 有相應的序列GGAGG，在起始密碼ATG的上游有12個鹼 基對》從該核苷酸序列推測出的胺基酸表明是一個具有 381個胺基酸殘基的蛋白質，該鏈的長度短於其他的三種 植酸酶。該DNA序列和由其推測出的胺基酸序 列用BLAST檢測在NCBI資料庫中對比，結果表明在蛋 白水平phyL與phyK有64%的一致性，phyL與phyC有65% 的一致性，phyL與168phyA有69%的一致性，而在DNA 水平與基因PhyK有79%的一致性，與基因phyC有79%的 65 1326708 —致性，與基因168phyA有90%的一致性。與其他三種5· 植酸酶相類似，基因phyL編碼的植酸酶不含有高 度保守的RHGXRXP序列的基本框架，而該基本框架在所 有的真菌和i co/i的植酸酶中均是存在的。 某因DhvL編碼的植酸醃的渦量表達
根據從基因phyL翻譯起始密碼子ATG到終止密碼子兩 端的編碼區來設計PCR引物（SEQ ID NOS:13和14)。編 碼成熟酶的基因片段通過pfu聚合酶（Promega，WI)擴增 並亞克隆到表達載體pSGt中，該表達載體是通過將反 Hc/iewf/ormb的έ-澱粉酶基因的終止子克隆到表達載體 pSG中而成。因此，基因phyL是在Φ 105原噬菌體的啓動 子的控制之下。
通過電穿孔法將質體引入到[cWi JM109菌株中。篩 選出抗青黴素的菌落，提取到陰性克隆系並用Quantum Mini-prepKit 試劑盒（BIO-RAD, Hong Kong)純化。 爲了將重組質體轉形到宿主菌株內以生産該酶，按 Osburne 等（Osburne MS, Craig RJ and Rothstein DM，1985,
Thermoinducible transcription system for Bacillus subtilis that utilizes control elements from temperate ρΗα§βΦ 105, J ofBacteriology, 16:1101-1108)描述的方法，製備枯草芽 孢桿菌MU331感受整細胞。通過將轉形體分別鋪在加有 氯黴素紅黴素的瓊脂上對其進行篩選，對兩種抗生素的均 有抗性菌落進一步用含有噬菌體Φ 105特異引物和特異於 66 1326708 phyL ( SEQ ID NO:14)的引物PCR擴增篩選。按此方式 建立了在酶性質硏究中使用的重組體菌株pL-01並於-80 °C在3 0% (v/v)甘油中凍存。 細菌培養和酶製備用培養基如下： 腦心浸液肉湯包含： 小牛腦浸液固形物 12.5% 牛心浸液固形物 5% 蛋白酶腺 10% 葡萄糖 2% NaCl 5% Na2P〇4 2.5% 中性pH時的酵母提取物 2.5% 將菌株pL-01在補加有5 μ g/ml氯黴素的LB瓊脂培養 基上劃線培養。在以後的數天內，挑選出單個菌落並轉移 到補加有5 # g/ml氯黴素的細菌培養介質中培養。該細菌 細胞在280rpm搖動下培養至溶液的光密度値〇D6G0到 7.0。然後將lml培養液轉入15ml不含抗生素的細菌培養 基中，使細胞生長到溶液的光密度値〇D6QG到4.5 ’在劇烈 搖動的情況下用50°C水浴進行熱誘導5min。誘導後不同時 間採樣。 除非特別說明，酶純化的所有步驟均在〇-4°C進行。用 3000rpm離心30min的方法收集生長在培養介質中的細 67 1326708 菌。收集的上淸液與3倍體積的冷（-2(TC )乙醇混合並將 沈澱於攪拌過夜。6000rpm離心30min以收集溶液中 的沈澱部分，然後將沈澱用空氣乾燥並再重新懸浮於含有 5mM CaCl2的lOOmM Tris-HCl中，pH7 »重懸後的酶通過 NAP-10 Sephadex 凝膠過濾柱（Marsha Pharmacia, Hong Kong)以交換緩衝液。用預先設計好的分析緩衝液將酶洗 脫出來並於-20°C保存直到用於酶分析。 由SDS-PAGE法測定的基因phyL編碼的成熟的植酸酶 # 的分子量約爲47kDa (圖5B)。在5hrs熱誘導後的收集液 中，基因phyL編碼的植酸酶産物的量達1 75mg/L。酶活性 達4.1單位/ml培養基以及23.6單位/mg酶，其中酶活性單 位定義爲：在給定的分析條件下，在1分鐘內釋放1# mol 無機磷酸鹽所需要的酶量（圖6)。當與曾經硏究過的芽孢 桿菌植酸酶活性相比時發現，本發明的新的phyL酶在培 養時間縮短14倍的情況下，其酶活性卻增加了 17倍。由 雙向SDS-PAGE法測定的酶的等電點大約爲5.1。 某因168phvA編碼的植酸酷的牛産及其活件 對枯草芽孢桿菌基因組的序列同源性的硏究表明，在 168的基因組中發現的讀框架（ORF)與枯草芽 孢桿菌中兩種已公開的植酸酶具有高度的序列同源性。設 計PCR引物（SEQ ID NOS:15和16)以擴增具有該ORF 的基因片段並將PCR産物亞克隆到表達載體PSG中以創建 pSG-pA。在該構建體中，基因1 68phyA的兩端連有噬菌體 68 1326708 Φ105的啓動子和基因168phyA的天然終止子（圖4A)。 如上述6.2節所述，將質體轉入到適合的枯草芽孢桿菌 MU331菌株中以構建重組體菌株pA-01。用噬菌體φ 105 的特異引物和基因168phyA(SEQIDNO:16)的特異引物 在PCR上掃描顯性克隆，然後上述6.2節所述的方法進行 酶生産。 由SDS-PAGE法知基因168phyA編碼的成熟的植酸酶 的分子量是44kDa(圖5A)，從胺基酸序列（SEQ ID NO:4) 的計算値也可以肯定這一點。在4hrs熱誘導的收集液中， 基因168phyA編碼的植酸酶産物的量達246.2mg/L。酶活 性達5.3單位/ml培養基以及36.8單位/mg酶。當與曾經硏 究過的芽孢桿菌植酸酶活性（Powar and Jagannathan，1982, 上述）相比時發現，本發明的新的168phyA酶在培養時間 縮短18倍的情況下，其酶活性卻增加了 22倍》酶的等電 點大約爲5。 爲了增加酶産量，用菌株pA-01進行了 2L量的發酵。 在該發酵過程中，通過pH-stat方法控制了碳源（葡萄糖） 和氮源（胰蛋白腺）的添加量。在6hrs誘導後，酶活性增 加到28單位/ml培養基，與上述描述的簡單的搖瓶培養法 相比，活性增加了 5倍。 植酸酶活件的測宙 在不同的pH和溫度條件下，在特定的緩衝液中進行酶 活性分析。在pH試驗中使用的緩衝液包括100mM檸檬酸 69 1326708 鈉-HCl，ρΗ3·5 和 6.5 ; lOOmM 醋酸鈉-HCl，pH4.5-6.0 ; lOOmM Tris-HCl，pH7-8.5 ; lOOmM 甘胺酸-NaOH，pH9 ' 9.5和10.5。上述所列舉的緩衝液均補加有5mM CaCl2。 在微量分析範圍內，酶濃度按標準Bradford蛋白分析法測 定（BIO-RAD, Hong Kong)。純化後的酶稀釋到分析緩衝 液中，按Engel en等描述的方法（1994，上已述及）進行 比色分析，除了分析範圍降至lml 〇簡要來說，將該酶用 不同的緩衝液稀釋到總體積爲200〆1。在酶活性分析中， · 0.4 ml植酸鈉稀釋到雙蒸水中到10 mM，酶和植酸鈉的混 合溶液對於基因168phyA-和基因phyL編碼的植酸酶來說 分別於55°C或65°C保溫30min。爲了終止酶活性，在反應 液中加入0.4 ml的新鮮製備的終止溶液。5min後，200# 1 終止後的混合液轉入96孔酶聯免疫吸附板中（Nunc，
Denmark)，在405nm進行光密度測定。 溫度試驗在中性pH下進行（圖7A)，結果顯示基因 168phyA_和基因phyL編碼的植酸酶具有寬的最適溫度範 圍，對於基因phyL編碼的植酸酶來說，其活性峰在65°C ® 而對於基因168phyA編碼的植酸酶來說，其活性峰在55 °C。圖7B顯示了在限定的分析緩衝液（如上所述）中， 在兩種酶各自的最適pH時，pH對植酸酶活性的影響。在 中性pH時，兩種酶均顯示最高的酶活性。 對於酶穩定性試驗來說，不同的酶稀釋等份分別培養在 不同的高溫下lOmin，溫度範圍是70-90°C，然後冷卻至室 溫lhr以使蛋白重新折疊，之後進行酶活性實驗。 70 1326708 硏究表明，在高溫變性後，甚至在低Ca2 +濃度（ImM) 情況下，基因phyL編碼的植酸酶能夠恢復原始活性的 60-70%。該酶甚至能耐受高達951的變性處理，此時仍能 保留原始活性的50%以上。 在高溫下變性後，在高Ca2+濃度（5mM)情況下，5. 的基因l68phyA編碼的植酸酶能夠恢復原始活性 的50-60%。該酶甚至能耐受高達95°C的變性處理，此時 仍能保留原始活性的46.7%。儘管如此，酶168phyA在低 Φ
Ca2+濃度（ImM)情況比高Ca2+濃度（5mM)情況，其活 性保留量減少20%。 轉基因植物的産牛 水稻是一種重要的世界性的農作物，尤其在亞洲更爲重 要》在中國，水稻産量占總作物産量的42%，占總種植面 積的29%。水稻是單子葉植物，依賴於氣候和生長條件， —些熱帶變種能在一年中完成三個生命周期。當溫度在24 t以上且光期長於14 hrs時，從幼苗到開花需要60天。 ® 從開花到收穫種子需要另外30天的時間。一般來說，一粒 種子在完成一個生命周期後能産生500粒種子。 由於煙草的高轉形速率和組織培養中易於繁殖的特 性，所以在植物轉形中，煙草是一個良好的模型系統。從 其寬闊的葉子就可以識別出來，煙草是一種雙子葉植物， 具有高的商業價値。煙草是一種一年生植物，完成其生命 周期需要120天。當溫度在24t以上且光期長於14 hrs 71 1326708 時，從育秧到開花需要60天，從幼苗到第一次開花需要 96-100天。在一棵煙草上能收穫20-3〇個果實，每個果實 重0.3-0.4克，至少有1000粒種子。一般來說，煙草在第 一次盛花後，需要30天才能産生有生命力的種子。 通過在植物如水稻和煙草細胞中引入含有含有本發明 植酸酶基因的嵌合構建體，由於增加了對植物體內和/或土 壤中無機磷的可利用性，這類植物加快了生長速度’因而 縮短了成熟和開花的時間。 植物表達載體的構建 構建植物表達載體的策略顯示在圖8中。應用位於基因 (SEQIDNOS:17和18)兩端的一對引物用PCR對基因 168phyA ( SEQ ID NO:3 )進行擴增。£. coH 的 pBI221 載 體（Clontech laboratories )中，在 BamH I 和 SacI 的酶切 位點內的a-D-葡糖苷酸酶（GUS)基因被基因168phyA取 代以獲得含有pliyA-221的inter-載體。雙價載體 pCAMBIAl 300 ( Genebank accession number AF234296 ) 上帶有被對植物有選擇性的CAMV35S啓動子所驅動的抗 潮黴素基因，用限制性內切酶Hind III和EcoR I消化該載 體並將其與用Hind III/EcoR I線性化後的phyA-221的載 體連接，從而得到新的表達構建體pCX-〇168phyA(圖9)。 A probacterium培養和轉形 採用Hdfgen和Willmitzer介紹的冰凍轉形方法（1988, 72 1326708
Storage of competent cells for agrobacterium transformation，Nucleic Acids Res，16:9877)將兩個單獨的 pCX -168phyA 克隆（克隆 04 和 13)轉入 Agrobacterium tumefaciens EHA105菌株中。取單個菌落在含有50# g/ml 卡那黴素、25 // g/ml氯黴素和50/z g/ml利福平的20ml LB 液體培養基中孵育，28°C快速振蕩培養2天，直到培養液 的上淸部分的OD600nm約爲0.8-1.0。然後將培養液 4000rpm離心1 Omin，將沈激重懸於20ml AAM介質（見 β 下述表1)以用於植物轉形。 轉某因水稲的産牛 使用日本水稻Oryza sativa L栽培系“Zhonghuall 號”進行實驗。成熟的種子消毒後在N6D培養基上萌發2 周。從小盾片誘導出來的愈傷組織亞接種到N6D培養基上 再培養1周。3周齡的愈傷組織浸泡在細菌懸液中20min 後，用無菌濾紙吸去多餘的菌液，接著將帶有細菌的愈傷 組織轉移到濾紙片上，將該濾紙放在N6DC培養基的上 ® 面，暗室中於25°C共培養3天。共培養後，感染的愈傷組 織用含有500mg/L羧苄青黴素的ADD培養基（見下文表 1)淸洗，用無菌濾紙吸乾，最後轉移到N6DS1培養基（見 下文表1)上培養。 上述愈傷組織在N6DS1培養基上培養2周後轉移到 N6DS2培養基（見下文表1)上進一步選擇性培養3_4周。 有抗性的愈傷組織再轉移到HIGROW培養基（見下文表1) 73 1326708 在暗室中進行預分化10天，之後單個轉入盛有MSRS培養 基（見下文表1)的生長小室在24-26°C進行苗再生，16hrs 光期，螢光燈光照強度爲120 μ molnr2^1光通量。再生 的植株轉入MSCN培養基（見下文表1)進一步生長。當 具有抗性的植株大約高l〇cm時，轉至溫室的土壤中生長， 直至成熟。 轉基因煙草的産牛 · 栽培系煙草變種 “ Gexin 1 號 ” （Nicotiana tobacum ) 的種子用30%(v/v)Clorox消毒15min，無菌水淸洗5次後 在Murashige和Skoog基本培養基（MS培養基，Sigma M-9274, St. Louis，M0)上萌發。籽苗在同樣的培養基上 體外培養，22°C下，16hrs光期/8hrs暗期的光周期，螢光 燈光照強度爲120 ；umolnr2s_1光通量。 將含有所需基因的農桿菌EHA105的單菌落接種到含 有50 y g/ml卡那黴素、25 /z g/ml氯黴素和50 a g/ml利福 平的20ml LB液體培養基中，28 °C快速振蕩培養2天。上 β 述煙草葉子切割成lcm2見方，然後浸入上述20ml細菌懸 液中2-3min。用無菌濾紙吸去多餘的菌液後，該外植體轉 入補加有2mg/L 6-BA ( MSB medium)的MS培養基（見 下文表1)上暗室中培養2天，25-26°C »共培養2天後， 外植體轉入補加有30mg/Lhydromycin和500mg/L竣节青 黴素的MSB培養基以進行苗再生，26°C，3-4周，標準光 照條件。當具有抗性的幼苗約lcm時，將其切除並轉移到 74 1326708 補加有25mg/Lhydromycin和200mg/L翔予青黴素的MS 培養基上生根。當該抗性植株生長至約8cm高時，將其轉 入溫室的土壤中生長至成熟。每個pCX-168phyA克隆（004 和013)各製備了 4個植株，分別命名爲0041、0042、0043、 0044 以及 0131、0132、0133 和 0134。 表1
用於細織培養和植物轉形的培養某 培養基 組成 N6D N61，500mg/L 酪蛋白，30g/L 蔗糖，2.5 mg/L2,4-D，2.5 g/^Lphytagel， pH5.7 N6DC N6D 培養基+10 g/L 葡萄糖+100 β mol/L acetosyringone, pH5.2 AAM AA2，500mg/L 酪蛋白，68.5g/L蔗糖，36g/L 葡萄糖，200/zmol/L Acetosyringone, pH5.2 AAD AA，30 g/L 蔗糖，2 mg/L 2,4-D，pH5.7 N6DS1 N0D 培養基+500mg/L 頭孢噻脂 +25mg/Lhydromycin N6DS2 N6D 培養基+300 mg/L 頭抱噻脂 + 50 mg/Lhydromycin HIGROQ 培養基(Gibcco BRL 10924-017) + 2.5 g/L phytagel MSRS MS 培養基 'Sigma M-9274) + 2 mg/L ό-ΒΑ + 0.2 mg/L NAA + 0.5 mg/L ZT + 200 mg/L 頭抱噻聘 + 50 mg/L hydromycin，pH5.8 MSCN MS 培養基 + 0.2 mg/L NAA + 0.5 mg/L 矮壯素（CCC ) 注：1 Zhu Z-Q，Wang J-J，Sun J-S，Xu Z，Yin G-C，Zhu Z-Y，Bi F-Y，1975,
Establishment of an efficent medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources，Sci Sin, 18:659-668. (English abstract) 2 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro X, 1994, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, Plant J, 6:271-282 3 Murashige T. and Skoog F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture, Plant Physiol. 15:473-479. 75 1326708 下列章節對轉基因煙草克隆進行鑒定和描述。 DNA製備和PCR分析 用PCR檢測hydromycin B抗性基因的DNA序列。按 如下方法製備來自於轉形和非轉形（對照）植物葉子的基 因組DN A :植物葉子稱重和液氮冷凍後進行勻漿處理， 5 0mg組織中加入600/z 1抽提緩衝液（100 mM Tris-HCl， pH8.0, 5 00mM NaCl和10 mM a-毓基乙醇），將混合液煮沸 Φ lOmin。煮沸後的混合液於冰上冷卻後16000g離心15min。 存在於上淸部分的植物基因組DNA用0.1體積的10 mM 醋酸銨和2體積的-20°C的冷無水乙醇沈澱2hrs，16000g 離心30min以收集基因組DNA的沈澱物。所得的DNA的 沈澱在重新溶於水之前需用75%乙醇淸洗。通常，0.1 g植 物組織中能夠獲得50/zg植物基因組DNA。 PCR反應包括30個迴圈（94°C變性30秒、56°C退火 40秒、72°C延伸60秒）。Hydromycin抗性基因正向前引物 和反向引物分別是 ^ 5，-CTACCAATGCGGAG-GATCGTTATCGGCA-3’（SEQ ID NO:19)和 5’-AGACCAATGCGGAG-CATATACG-3’（SEQ ID NO:20)，其中hydromycin抗性基因（E00287)的序列中從 162到803共641個鹼基對被擴增。正向引物和反向引物 (SEQ IDNO:17 和 18)用於擴增基因 168phyA。用 PCR 篩選轉基因煙草的結果顯示在圖10中。如圖10A所示， 抗hydromycin抗性基因（E00287)的PCR産物可以從所 76 1326708 有轉形的煙草中産生，包括用pCAMBIA1300轉形的植物。 與此相比，基因168phyA的PCR産物僅可以從由 pCX-1 68PhyA轉形的植物中産生而不能從由 PCAMBIA1300轉形的植物中産生。該結果表明，按上述方 法，載體pCX-168PhyA和pCAMBIA1300成功地導入到相 應的煙草植株了。
Northern 印娜 從植物葉子中抽提出的總RNA作模板用於Northern印 跡檢測。不同單個轉基因植物的RNA加樣於瓊脂糖凝膠 上，很好分離之後，依靠毛細管作用過夜轉到尼龍膜上。 去掉細菌信號肽的基因168phyA的DI0標記的cDNA用作 Northern雜交的探針。所用的所有的試劑從Roche Diagnostics公司（Hong Kong)購得，所有的步驟按照産 品使用指南進行。轉基因煙草系的F0和F1代的Northern 印跡的結果分別展示在圖11和圖16中。對來自於F0系的 0042、0043和0134的蛋白提取物中的植酸酶活性進行了 檢測。如圖16所示，mRNA的表達情況遺傳到了 F1系的 0042 和 0134。
Western 印跡 提取於煙草葉子的總蛋白用於Western印跡實驗》單個 蛋白樣品用10%濃度的丙烯醯胺凝膠在SDS-PAGE上很好 的分離後，在4t，100V的條件下將蛋白轉移到硝基纖維 77 1326708 素膜上。用在枯草芽孢桿菌中過量表達的基因168phyA編 碼的植酸酶免疫兔後，制得抗168phyA的多克隆抗體。在 作爲探針添加於樣品蛋白之前先用野生型煙草對多克隆克 體吸附。NBT/BCIP底物用於信號檢測，操作程式參照産 品使用說明進行。 F0和F1轉基因煙草的Western印跡實驗結果展示分別 在圖12和圖17中。來自於F0品系的0042、0043和0134 樣品的蛋白提取物中檢測到了植酸酶。如圖17所示，植酸 酶的表達情況遺傳到了 F1品系的0042中。通常，由於轉 基因蛋白在轉基因植物物的低水平表達，所以能在轉基因 植物提取物中檢測出來。例如，在煙草葉中表達的重組的 真菌植酸酶（phyA )在層析純化後，在Western印跡中僅 能給出信號（Ullah等，1999，上文）。因此，如圖12和圖 17所示Western印跡中有可見植酸酶，該結果說明植酸酶 在轉基因植物中的表達量是很高的。
Southern E卩跡 從植物葉子抽提出的基因組DNA用於Southern分析。 基因組DNA在RNA酶活性作用下限制性內切酶Hind瓜酶 切。不同轉基因植物的DNA經酶解後裝到0.7%瓊脂糖凝 膠上並很好的分離，之後依靠毛細管作用過夜轉到尼龍膜 上。去掉細菌信號肽的基因168phyA的放射性標記的cDNA 用作Southern雜交的探針。所用的所有試劑從Roche Diagnostics公司（Hong Kong)購得，所有的步驟按産品 78 1326708 使用指南進行。 如圖15所示，在F01系（0042和0134)中檢測到了特 異性條帶，在對照系中沒有檢測到。來自於0042 ( 42-1和 42-2)的F1系顯示含有單拷貝的基因，而來自於0134 (134-1)的F1品系顯示含有兩個拷貝的基因。 對照燁草和轉某闵煙草的表現型 由於煙草的高轉形速率和組織培養中易於繁殖的特 性，所以在植物轉形中，煙草是一個良好的模型系統。從 其寬闊的葉子就可以識別出來，煙草是一種雙子葉植物， 具有高的商業價値。煙草是一種一年生植物，完成其生命 周期需要120天。當溫度在22°C以上且光期長於14 hrs 時，從幼苗到第一次開花需要96-1 00天。在一棵煙草上能 收穫20-30個果實，每個果實重0.3-0.4克，至少有1000 粒種子。一般來說，煙草在第一次盛花後，需要30天就能 産生有生命力的種子。 煙草轉形後接著進行表現型測定並列於表2中。一般來 說，用植酸酶基因轉形後的煙草生長到101-130 cm時出現 第一次盛花，該高度短於用載體轉形的植物的第一次盛花 時的高度（ 13 5-1 58 cm)。開花後，用植酸酶基因轉形後的 煙草高度（142-168 cm)仍然短於用載體轉形的植物的高 度（182-206 cm)。儘管用植酸酶基因轉形後的煙草一般較 短，但它們常常比用載體轉形的植物（6枝/株）擁有更多 的花枝（8-10枝/株）（見表2和圖13)。從形態學看，煙 79 1326708 草常常具有單個主莖。但4株用植酸酶基因轉形後的煙草 卻發育成具有至少一個側枝（圖14)。從花芽的數量看， 用植酸酶基因轉形後的煙草與用載體轉形的煙草的單個花 芽相比，增加了花芽數量（見表2)。從花期來看，用植酸 酶基因轉形後的煙草顯示有較長的花期（50-超過88天）， 而對照則僅有35-37天的花期（見表2)。 在磷酸鹽缺芝情況下轉某闶煙草幼苗的牛長 · 對照和轉基因（品系42-1)煙草的種子用30%(v/v)
Clorox消毒15min，無菌水淸洗5次後在MS培養基（含 1.25 mM磷酸鹽和30g/L蔗糖）上萌發。15天後，幼苗轉 入修改過的MS培養基（不含磷酸鹽且蔗糖濃度降至 5g/L)再生長17天。在磷酸鹽饑餓實驗中，與對照幼苗相 比，轉基因的幼苗具有更多的生物量（圖18)。 在磷酸鹽不足情況下縳某闵煙草幼苗的生長 表面消毒的對照和轉基因煙草的種子種植在盛有20ml ® 修改過的MS瓊脂糖培養基（標準MS培養基，除了加入 l〇g/L蔗糖，10·3或1〇-5Μ磷酸鹽）的培養皿中（60粒/9-crn 盤）。20天後，從高濃度（10-3M)或低濃度（1〇_5Μ)磷 酸鹽培養平板上取出9粒種子轉入每個含有不同濃度磷酸 鹽（1(Γ3、10·4 或 lCr5M )的組織培養盒（7cmX 7cm，50ml 修飾後的MS瓊脂糖）中。繼續生長30天後’收穫並稱重。 每株幼苗分別稱重。每組稱重18株煙草幼苗’其平均重量 80 1326708 顯示在圖19中。轉基因品系0042的重量明顯重於對照， 這一點具有統計學特徵，尤其是在磷酸鹽受限的情況下。 而且，也進行了幼苗在液體培養基上的生長實驗。簡而言 之，煙草種子在MSO培養基（10g蔗糖，1.25mM磷酸鹽） 萌發10天，然後轉入液體MS培養基（30g蔗糖，〇.〇1或 0.1 mM磷酸鹽）中生長20天。每個品系的25株植物分成 5組並測定每組的乾重。如圖20所示，在低濃度磷酸鹽的 情況下，轉基因植株（0042和0134)比對照能獲得更多的 乾重》 HPLC對植酸醃活件的體外分析 5g幼葉組織放入預冷的l〇ml提取緩衝液中（0.1 Μ Tris-HCl，pH7.0，lmM苯基甲磺基氟化物 (phenylmethylsulfonyl fluoride)和 0.1 mM CaCl2 )。1 ?000g 離心20min後收集水相中的可溶性蛋白，蛋白濃度按 Bradford蛋白分析法（Bio-Rad)定量。爲了評價植物提取 物中的植酸酶活性，來自於對照和轉基因植物的200 植物蛋白分別與400 /z gIP6 ( Sigma，P9910)於37°C保溫。 在4、6和8hrs之後，加入1體積的0.05 M HC1以終止酶 反應。爲了比較植物提取物中的植酸酶活性，用陰離子交 換層析純化了肌醇磷酸（ΙΡ6、ΙΡ5、ΙΡ4、ΙΡ3) ( Sandberg and Ahderinne, 1986, HPLC method for determination of inositol Tri-, Tetea, Penta- and Hexaphosphates in foods and instestine contentss, Journal of Food Science, 51(3): 81 1326708
547-550 )。簡而言之，0.5ml酶混合物裝入2ml的AG-1X8 陰離子柱（Bio-Rad)中，用10體積的0.025M HC1將雜 質淋洗出去。接著用3MHC1將肌醇磷酸一同洗脫出來。 洗脫所得的樣品經冰凍乾燥後再重新懸浮到ΙΟΟμΙ流動 相中[50% (ν/ν)甲醇、0.1% (ν/ν)甲酸、1.5% (ν/ν)四丁基 胺氣氧化物（tetrabutylammonium hydroxide)和 0.05Μ EDTA]後進行 HPLC(Waters 600)分析（Sandberg and Ahderinne，1986，上述）。20#1 樣品注射到 C18 柱（Alltech Alltima C18)中以測定肌醇磷酸。IP6和IP5的各自的峰 由折射率檢測器測量（Shimadzu R1D-10A，Shimadzu Corporation，Japan)並校對IP6/IP5比率。迅速混合植物 提取物，植酸底物中IP6/IP5比率是3.61±0.14 (n=4)。在 保溫期間，IP6漸漸降解成低分子量的肌醇磷酸（IP5、IP4 和IP3)，因而，IP6/IP5比率隨時間的延長而降低。如圖 21所示，來自於品系42 (N=4)的植物提取物與對照植物 (N = 4)相比，有低的IP6HP5比率。
總之，用植酸酶基因轉形的煙草具有如下表現型：（1) 增加了花枝數量；（2)增加了主莖數目；（3)增加了芽的 數量以及（4)延長了花期（見表2)。由於在用植酸酶基 因轉形的煙草中花芽數量增加了，故植酸酶基因轉形的植 物與對照相比將會産生更多的果實。 82 1326708 志？蟪形的煙草植株的表現型 植物 品系 轉移到土 壤中生長 的時間 第一枝 花盛開 的時間 第一枝 花盛開 時的植 株高度 開花後 的植株 高度 主花枝 的數量 主莖 數目 * 花芽 數目 * 花期 0042 6月8號 έ月25號 102 142 10 3 74 >88+ 0043 6月8號 9月8號 101 142 9# 3 31# 58 0131 6月8號 9月12號 125 160 8 1 33 3 0133 6月8號 9月1〇號 130 168 8# 3 47# 44 0134 6月8號 9月4號 120 150 9# 2 36# 50 載體 對照1 6月8號 9月4號 135 182 6 1 30 36 載體對 照2 6月8號 9月16號 158 206 6 1 37 34 非轉基 因對照 6月8號 9月22號 150 185 6 1 32 35 *資料獲取曰期2001年10月4號； #只有主莖上的花芽才計算在內。位於側枝上的花芽 因不完全成熟而不計算在內。 +直到2001年11月20號》 新花在2001年11月18號。 等同方案 本領域技術人員能夠認識到或確信，使用的常規實驗可 以得到與本文所述的本發明特定技術方案的等同方案。因 而這些等同方案也包含在以下的如申請專利範圍第項中。 本發明申請書所提到的所有的出版物、專利和專利申請 在此引入作爲參考，其範圍如同每一出版物、專利和專利 申請專門並單獨引入作爲參考一樣。 83 1326708 本發明中參考文獻的引述或討論並不等於該文獻就視 作本發明的現有技術。 4.圖式簡單說明 下列圖是爲了闡述本發明的實施方案，而並非對申請專 利範圍包括的本發明的範圍搆成限制》 圖1A和1B分別顯示了基因phyL(SEQ ID ΝΟ:1)的核苷 酸序列和蛋白phyL(SEQ ID NO:2)的胺基酸序列。 ® 圖2人和28分別顯示了基因168?1^入(8£(5 10 1^0:3)的 核苷酸序列和蛋白168phyA(SEQ ID NO:4)的胺基酸序列。 圖3代表了 PCR克隆基因phyL的設計路線。DP代表 用於變性PCR的變性過的引物，IP代表反義PCR引物。 基因PhyL通過先進行變性PCR然後用反義PCR法克隆得 到。來自於反義PCR的片段對齊，全基因是從上游區域（5’ 端到ATG翻譯起始密碼子）克隆到基因終止密碼子。 圖4A和4B顯示了用於過量生産植酸酶的表達載體的 構建。圖4A表示用於凡168菌株過量表達植酸酶 ® 的表達質體，該構建體中攜帶有Φ1 05啓動子、之後是 Shine-Delgarno (SD)序列、天然的基因168phyA和它的天 然終止子。圖4B表示用於5. //c/ieni/ormb菌株過量表達 植酸酶的表達質體，該構建體中攜帶有Φ啓動子、之後是 SD序列、天然的基因phyL和來自於5. 的 έ-澱粉酶的終止子。 圖5Α和5Β顯示了兩種芽孢桿菌屬菌株植酸酶的表達 84 1326708 水平。樣品直接來自於細菌培養物，在進SDS-PAG電泳之 前離心沈澱。預熱誘導後0-5小時，收集細菌培養物。從 該圖中可以看到，在熱誘導後，隨著時間的延長，酶産生 量增加。LRW是低分子量標準蛋白（BIO-RAD公司，香 港），作爲蛋白大小的參照位於圖的左側。圖5A顯示由基 因i 68phyA編碼的酶的表達情況，圖5B則顯示由基因phyL 編碼的酶的表達情況。 圖6A和6B顯示了兩種植酸酶的酶活性。圖6A顯示的 是收集的培養液的酶活性（酶活性單位/ml培養物），圖6B 顯示的是實際用於每單個反應中的酶活性（酶活性單位/mg 酶）。 圖7A和7B分別顯示了溫度和pH對包括本發明在內的 植酸酶的酶活性的影響。植酸酶酶活性的測定是根據 Engelen 等描述的方法（1994，Simple and rapid determination of phytase activity. Journal of AOAC International，77(3):760-764 )，除了 將反應液降至 lm卜比 色測定是檢測405nm處的光密度値。保溫時間設定爲30 分。所有的反應均補加5mM CaCl2以保證酶活性。 圖8表示植物表達載體的構建路線。將刪除天然信號肽 之後的基因168phyA克隆入載體pBI221中的限制性內切 酶BamH I和SacI位點處，以取代co/i的a-D-葡糖苷 酸酶（GUS)基因。攜帶有168phyA基因盒的Hind III/EcoRI 片段即可從質體PBU21中釋放出來，之後通過亞克隆技術 進入雙載體PCAMBIA13 00的Hind III和EcoR I位點，從 85 1326708 而産生重組克隆pCX0168phyA。 圖9是表達載體pCX168phyA的框架圖。168phyA :來 自於5. 168菌株的植酸酶基因；CaMV :花椰菜的 花葉病毒的35S啓動子；CaMV35S多聚腺苷信號：來自於 花椰菜的花葉病毒的3’UTR端的多聚腺苷信號；
卡那黴素抗性；NOS :胭脂鹼合成酶基因；pBR322起始 位點：來自於PBR322的複製起始點；pVSl-REP :來自於 pVSl的複製起始點；pVSl-STA:來自於質體pVSl的STA 區；T-邊界（L):左邊界T-DNA重復序列；T-邊界（R ):右 邊界T-DNA重復序列。來自於pVSl的rep和sta區 (Hajdukiewicz et al., 1994, Plant Molecular Biology, 25:989-994 )的出現增加了這些載體在土壤農感菌的穩定 性，即使是在非選擇性培養基中。
圖10A和10B分別顯示在轉基因煙草中基因 hygromycin (圖 10A)和基因 168phyA (圖 10B)的飾選 結果。（圖A) 1道：1KB加DNA梯度：2道：未轉形的煙 草，作爲陰性對照；3-4道：僅用PCAMBIA1300轉形的轉 基因煙草（對照）；5-8道：轉基因煙草004品系（0041、 0042、0043、0044); 9· 12 道：轉基因煙草 013 品系（〇131、 0132、0133、0134)。（圖 B) 1 道：1KB 標記物；2-3 道： 作爲陽性對照的質體pCX-168phyA對照；4道：未轉形的 煙草，作爲陰性對照；5-6道：僅用pCAMBIA13〇〇轉形的 轉基因煙草（對照）；7-10道：轉基因煙草004品系（〇〇41、 0042、0043、0044); 11-14 道：轉基因煙草 013 品系（013卜 86 1326708 0132、0133、0134 ) ° 圖11顯示F0轉基因煙草的Northern雜交分析結果。 從植物組織中抽提出20// g的總RNA上樣於1% (重量/ 體積）瓊脂糖凝膠中，由DIG-PCR試劑盒標記的168phyA cDNA 用作探針。（Roche Diagnostics，Hong Kong)。mRN A 信號在轉基因品系（0042、0043和0134)中檢測到，在對 照中沒有。 圖12顯示轉基因煙草的Western雜交分析。每個樣品 ® 孔中加入從煙草葉子中抽提出30//1可溶性蛋白。在轉基 因煙草樣品0042、0043和0134中檢測到了植酸酶，在對 照植物中未檢測則沒有。 圖13顯示轉基因煙草（圖13b-13d)和對照煙草（僅 用空載體轉基因的煙草；圖13a)的花莖的數量。 圖14顯示轉基因煙草（圖I4a-14c)和對照煙草（圖 14d)的主莖數目。 圖15顯示F1代轉基因煙草的Southern雜交分析。每 道加入l〇Wg從不同的F1品系得到的限制性酶Hind III ® 酶切得到的基因組DNA，PCR試劑盒放射性標記的 168phyA cDNA用作探針。在轉基因品系（0042和0134) 檢測到特殊的帶存在，而在對照品系中未檢到。來自於 0042 ( 42-1和42·2)的F1代顯示出含有單拷貝基因，而 來自於0134(1 34-1)的F1代顯示出含有兩個基因拷貝。 圖16顯示F1代轉基因煙草的Northern雜交分析結果。 從植物組織中抽提出20// g的總RNA上樣於1 % (重量/ 87 1326708 體積）瓊脂糖凝膠中，由DIG-PCR試劑盒放射性標記的 168phyA cDNA 用作探針。（R〇che Diagnostics，Hong Kong)。在轉基因品系（0042和0134)中檢測到mRN A信 號，在對照中沒有。 圖17顯示F1代轉基因煙草的Western雜交分析結果。 每個樣品孔中加入從煙草葉子中抽提出10^g可溶性蛋 白。在轉基因品系0042的F1代中檢測到了植酸酶，在對 照品系的F 1代中未檢測。 · 圖18顯示轉基因煙草F2代幼苗在磷酸鹽缺乏的條件時 的生長情況。F2代煙草的種子在MS培養基（包含有 1.25mM磷酸鹽和30g/L蔗糖）上生長15天後，幼苗轉入 修改過的MS培養基（去掉磷酸鹽並減少蔗糖的濃度到 5g/L )上繼續生長1 7天。與對照品系相比，在轉基因品系 中能觀察到更多的生物量。 圖19顯示轉基因煙草幼苗在低濃度磷酸鹽條件中生長 在瓊脂介質上的情況。幼苗先在含1(Γ3Μ或1〇·5Μ磷酸鹽 的MS瓊脂糖培養基上生長20天，然後再在含1〇·3Μ、1(Γ4Μ ^ 或10_5Μ磷酸鹽的MS瓊脂糖培養基上生長30天，然後乾 燥植物並分別稱重。每根柱代表18棵單個植株的平均値 (N=18)。 圖20顯示轉基因煙草幼苗在低濃度磷酸鹽條件中生長 在液體培養基中的情況。幼苗先在含1.2 5mM磷酸鹽的MS0 培養基上生長1〇天’然後再在含0.01或0.1 mM磷酸鹽的 MS液體培養基上生長20天，最後乾燥植物並分別稱重。 88 1326708 每根柱代表25棵單個植株的平均値（N = 25)。在低濃度磷 酸鹽條件下，在轉基因品系（0042和0134)中得到的乾重 髙於對照品系。 圖21顯示在轉基因植物中增加內源性植酸酶活性的情 況。從葉中抽提出的蛋白（200从g)與外源性IP6 ( 400以 g ) —起於37°C保溫4、6和8小時。然後通過陰離子交換 層析純化肌醇磷酸鹽（IP6、IP5、IP4、IP3)並用HPLC 分析，IP6和IP5的各自的峰由折射率檢測器測量。如圖 φ 所示，與對照植物提取物相比，來自於品系42 ( N=4 )的 植物抽提物（N = 4 )産生較低的IP6/IP5比率，這表明，與 對照相比，轉基因植物具有較高的內源植酸酶活性。 89 1326708 序列表 <110〉林文量 <120>麵體讎酶及其應用 <130> 9661-020-888 <140>TW91133207 <141> 2002-11-12 <150> 60/332,060 <151> 2001-11-21 <160> 24 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1390 <212> DNA <213>地衣芽孢桿菌 <220>
<221> CDS <222> (241)...(1390) <400> 1 ttttacccga tggatgggga cttaaacgaa cttgcgtttg agatatacat tccgattcat 60 tgagagatag cgatgttaaa ggcagccccc ggaaaaaatt ccgggggttt tctttgggtt 120 tcgtactcta gagtatcggc ggtctttttt agccatcact tttaacaaaa gtttacatac 180 cctcaaatga taattttcat tggtttgcta ggataaatgt tatgaaaagg aggttaatat 240 atgaactttt acaaaacgct cgctttatca acactcgcag catccttatg gtctccctca 300 tggagcagtc tcccccataa cgaagctgcg gctcacaaag aattcacggt gactgccgat 360 gcagagacag agccggtgga tacccctgac gacgcggcag atgacccggc gatttgggtt 420 catccgaagc agcctgaaaa aagcaggctc atcaccacaa acaaaaagtc gggcttaatc 480 gtctatgatt tgaagggaaa acagcttgcg gcctatccgt ttggcaaatt aaacaatgtc 540 gacctgcgct acaattttcc gctcgatggc aaaaaaattg atattgccgg ggcctcaaac 600 cggtcagacg gcaaaaacac ggttgaaatt tacgcctttg acggcgaaaa aagcaagctg 660 aagaacatcg tcaatcctca aaaacctatt caaaccgata tccaggaggt atatggcttc 720 agcctgtatc acagccagaa aaccggcaag ttctacgcca tg^gaccgg aaagaacgga 780 gaattcgagc aatatgaact gtttgacaac ggaaaaggac aagtcgaggg caaaaaggtc 840 cgctcattca aaatgagctc tcaaacagaa gggcttgcgg cagatgatga atacggcaaa 900 atgtacatcg ccgaagaaga cgttgcgatt tggtctttca gcgccgagcc ggacggcgga 960 gataaaggaa aaatcgtcga tcgtgccgac ggaccgcatc taacttctga tattgaaggg 1020 ctgacgattt actacggaga agacggagaa gggtatttga tcgcgtccag tcagggcgat 1080 aaccgctatg ccatctatga ccggcgcggg aaaaacgact acgtcactgc tttttcaatt 1140 gaggacggca aagaaatcga cgggacaagc gataccgatg gaatcgacgt catcggcttc 1200 ggcctcggca aaacatatcc atacggcatc tttgtcgccc aagacggcga aaatacggaa 1260 aatggacaac cggccaatca gaacttcaaa attgtctcct gggaaaaaat cgccgacgcg 1320 ctggacgaca aacctgatat cgatgatcag gtcgatcccc gaaaactgaa aaaccgagcc 1380 aaataaggac 1390 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <2i3> <400> 2
Met Asn Phe Tyr Lys Thr Leu Ala Leu Ser Thr Leu Ala Ala Ser Leu 15 10 15
Trp Ser Pro Ser Trp Ser Ser Leu Pro His Asn Glu Ala Ala Ala His 20 25 30 1
Lys Glu Phe Thr Val Thr Ala Asp Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp Thr 35 40 45
Pro Asp Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala lie Trp Val His Pro Lys Gin 50 55 60
Pro Glu Lys Ser Arg Leu lie Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu lie 65 70 75 80
Val Tyr Asp Leu Lys Gly Lys Gin Leu Ala Ala Tyr Pro Phe Gly Lys 85 90 95
Leu Asn Asn Val Asp Leu Arg Tyr Asn Phe Pro Leu Asp Gly Lys Lys 100 105 110 lie Asp lie Ala Gly Ala Ser Asn Arg Ser Asp Gly Lys Asn Thr Val 115 120 125
Glu lie Tyr Ala Phe Asp Gly Glu Lys Ser Lys Leu Lys Asn lie Val 130 135 140
Asn Pro Gin Lys Pro lie Gin Thr Asp lie Gin Glu Val Tyr Gly Phe 145 150 155 160
Ser Leu Tyr His Ser Gin Lys Thr Gly Lys Phe Tyr Ala Met Val Thr 165 170 175
Gly Lys Asn Gly Glu Phe Glu Gin Tyr Glu Leu Phe Asp Asn Gly Lys 180 185 190
Gly Gin Val Glu Gly Lys Lys Val Arg Ser Phe Lys Met Ser Ser Gin 195 200 205
Thr Glu Gly Leu Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Lys Met Tyr lie Ala 210 215 220
Glu Glu Asp Val Ala He Trp Ser Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly Gly 225 230 235 240
Asp Lys Gly Lys lie Val Asp Arg Ala Asp Gly Pro His Leu Thr Ser 245 250 255
Asp lie Glu Gly Leu Thr lie Tyr Tyr Gly Glu Asp Gly Glu Gly Tyr 260 265 270
Leu lie Ala Ser Ser Gin Gly Asp Asn Arg Tyr Ala lie Tyr Asp Arg 275 280 285
Arg Gly Lys Asn Asp Tyr Val Thr Ala Phe Ser lie Glu Asp Gly Lys 290 295 300
Glu lie Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly lie Asp Val lie Gly Phe 305 310 315 320
Gly Leu Gly Lys Thr Tyr Pro Tyr Gly lie Phe Val Ala Gin Asp Gly 325 330 335
Glu Asn Thr Glu Asn Gly Gin Pro Ala Asn Gin Asn Phe Lys lie Val 340 345 350
Ser Trp Glu Lys lie Ala Asp Ala Leu Asp Asp Lys Pro Asp lie Asp 355 360 365
Asp Gin Val Asp Pro Arg Lys Leu Lys Asn Arg Ala Lys 370 375 380 <210> 3 <211> 1380 <212> DNA <2i3> <220>
<221> CDS <222> (100)...(1248) <400> 3 gagtcagaaa ccctataaaa aaaggttcat tttcctcacg gtaatcacct gtatatattt 60 tacaatagta gtgttagtga taaaagagga gggtaccaa atg aag gtt cca aaa 114
Met Lys Val Pro Lys 1 5 aca atg ctg eta age act gcc geg ggt tta ttg ett age ctg aca gca 162 1326708
Thr Met Leu Leu Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu Leu Ser Leu Thr Ala 10 15 20 acc teg gtg teg get cat tat gtg aat gag gaa cat cat ttc aaa gtg 210
Thr Ser Val Ser Ala His Tyr Val Asn Glu Glu His His Phe Lys Val 25 30 35 act gca cac aeg gag aca gat ccg gtc gca tet ggc gat gat gca gca 258
Thr Ala His Thr Glu Thr Asp Pro Val Ala Ser Gly Asp Asp Ala Ala 40 45 50 gat gac ccg gcc att tgg gtt cat gaa aaa cac ccg gaa aaa age aag 306
Asp Asp Pro Ala lie Trp Val His Glu Lys His Pro Glu Lys Ser Lys 55 60 65 ttg att aca aca aat aag aag tea ggg etc gtt gtg tat gat tta gac 354
Leu lie Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Val Val Tyr Asp Leu Asp 70 75 80 85
gga aaa cag ett cat tet tat gag ttt ggc aag etc aat aat gtc gat 402
Gly Lys Gin Leu His Ser Tyr Glu Phe Gly Lys Leu Asn Asn Val Asp 90 95 100 ctg ege tat gat ttt cca ttg aac ggc gaa aaa att gat att get gcc 450
Leu Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Glu Lys lie Asp lie Ala Ala 105 110 115 gca tee aac egg tee gaa gga aaa aat aca att gaa gta tat gca ata 498
Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr lie Glu Val Tyr Ala He 120 125 130 gac ggg gat aaa gga aaa ttg aaa age att aca gat ccg aac cat cct 546
Asp Gly Asp Lys Gly Lys Leu Lys Ser lie Thr Asp Pro Asn His Pro 135 140 145 att tee acc aat att tet gag gtt tat gga ttc age ttg tat cac age 594 lie Ser Thr Asn lie Ser Glu Val Tyr Gly Phe Ser Leu Tyr Hi3 Ser 150 155 160 165 cag aaa aca gga gca ttt tac gca tta gtg aca ggc aaa caa ggg gaa 642
Gin Lys Thr Gly Ala Phe Tyr Ala Leu Val Thr Gly Lys Gin Gly Glu
170 175 180 ttt gag cag tat gaa att gtt gat ggt gga aag ggt tat gta aca ggg 690
Phe Glu Gin Tyr Glu lie Val Asp Gly Gly Lys Gly Tyr Val Thr Gly 185 190 195 aaa aag gtg cgt gaa ttt aag ttg aat tet cag acc gaa ggc ett gtt 738
Lys Lys Val Arg Glu Phe Lys Leu Asn Ser Gin Thr Glu Gly Leu Val 200 205 210 geg gat gat gag tac gga aac eta tac ata gca gag gaa gat gag gcc 786
Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr lie Ala Glu Glu Asp Glu Ala 215 220 225 ate tgg aaa ttt aac get gag ccc ggc gga ggg tea aag ggg cag gtt 834 lie Trp Lys Phe Asn Ala Glu Pro Gly Gly Gly Ser Lys Gly Gin Val 230 235 240 245 gtt gac cgt geg aca gga gat cat ttg aca get gat att gaa gga ctg 882
Val Asp Arg Ala Thr Gly Asp His Leu Thr Ala Asp lie Glu Gly Leu 250 255 260 3 930 aca ate tat. tat gca cca aat ggc aaa gga tat etc atg get tea agt
Thr lie Tyr Tyr Ala Pro Asn Gly Lys Gly Tyr Leu Met Ala Ser Ser 265 270 275 caa gga aat aac age tat gca atg tat gaa egg cag ggg aaa aat ege
Gin Gly Asn Asn Ser Tyr Ala Met Tyr Glu Arg Gin Gly Lys Asn Arg 280 285 290 tat gta gee aac ttt gag att aca gat ggc gag aag ata gac ggt act
Tyr Val Ala Asn Phe Glu lie Thr Asp Gly Glu Lys lie Asp Gly Thr 295 300 305 agt gac aeg gat ggt att gat gtt etc ggt ttc gga ett ggc cca aaa
Ser Asp Thr Asp Gly lie Asp Val Leu Gly Phe Gly Leu Gly Pro Lys 310 315 320 325 tat ccg tac ggg att ttt gtg geg cag gac ggc gaa aat att gat aac
Tyr Pro Tyr Gly lie Phe Val Ala Gin Asp GXy Glu Asn lie Asp Asn 330 335 340 gga caa gee gtc aat caa aat ttc aaa att gta teg tgg gaa caa att
Gly Gin Ala Val Asn Gin Asn Phe Lys lie Val Ser Trp Glu Gin lie 345 350 355 gca cag cat etc ggc gaa atg cct gat ett cat aaa cag gta aat ccg
Ala Gin His Leu Gly Glu Met Pro Asp Leu His Lys Gin Val Asn Pro 360 365 370 agg aag ctg aaa gac cgt tet gac ggc tag aatagaaagc agcttgtgca Arg Lys Leu Lys Asp Arg Ser Asp Gly * 375 380 gctgcttttt tetatgaata aaaaaatcgt tcatagcaat gaacgatttt tcaagaaagc gccagatgaa tcgcttttag ttttgcagga agctcatcaa acgtaaatgc gg <210> 4 <211> 382 <212> PRT <2i3> <400> 4
Met Lys Val Pro Lys Thr Met Leu Leu Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu 15 10 15
Leu Ser Leu Thr Ala Thr Ser Val Ser Ala His Tyr Val Asn Glu Glu 20 25 30
His His Phe Lys Val Thr Ala His Thr Glu Thr Asp Pro Val Ala Ser 35 40 45
Gly Asp Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala He Trp Val His Glu Lys His 50 55 60
Pro Glu Lys Ser Lys Leu lie Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Val 65 70 75 80
Val Tyr Asp Leu Asp Gly Lys Gin Leu His Ser Tyr Glu Phe Gly Lys 85 90 95
Leu Asn Asn Val Asp Leu Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Glu Lys 100 105 110 lie Asp He Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr lie 115 120 125
Glu Val Tyr Ala lie Asp Gly Asp Lys Gly Lys Leu Lys Ser lie Thr 130 135 140
Asp Pro Asn His Pro lie Ser Thr Asn lie Ser Glu Val Tyr Gly Phe 145 150 155 160 978 1026 1074 1122 1170 1218 1268 1328 1380 1326708
Ser Leu Tyr His Ser Gin Lys Thr 165
Gly Lys Gin Gly Glu Phe Glu Gin 180
Gly Tyr Val Thr Gly Lys Lys Val 195 200
Thr Glu Gly Leu Val Ala Asp Asp 210 215
Glu Glu Asp Glu Ala lie Trp Lys 225 230
Ser Lys Gly Gin Val Val Asp Arg 245
Asp lie Glu Gly Leu Thr lie Tyr 260
Leu Met Ala Ser Ser Gin Gly Asn 275 280
Gin Gly Lys Asn Arg Tyr Val Ala 290 295
Lys lie Asp Gly Thr Ser Asp Thr 305 310
Gly Leu Gly Pro Lys Tyr Pro Tyr 325
Glu Asn lie Asp Asn Gly Gin Ala 340
Ser Trp Glu Gin lie Ala Gin His 355 360
Lys Gin Val Asn Pro Arg Lys Leu 370 375
Gly Ala Phe Tyr Ala Leu Val Thr 170 175
Tyr Glu lie Val Asp Gly Gly Lys 185 190
Arg Glu Phe Lys Leu Asn Ser Gin 205
Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr lie Ala 220
Phe Asn Ala Glu Pro Gly Gly Gly 235 240
Ala Thr Gly Asp His Leu Thr Ala 250 255
Tyr Ala Pro Asn Gly Lys Gly Tyr 265 270
Asn Ser Tyr Ala Met Tyr Glu Arg 285
Asn Phe Glu lie Thr Asp Gly Glu 300
Asp Gly lie Asp Val Leu Gly Phe 315 320
Gly lie Phe Val Ala Gin Asp Gly 330 335
Val Asn Gin Asn Phe Lys lie Val 345 350
Leu Gly Glu Met Pro Asp Leu His 365
Lys Asp Arg Ser Asp Gly 380
DNA ΛΧ序列 <210> 5 <211> 20 <212〉 <213> <220> <223>引物 <220> <221> misc—feature <222> 6, 97 18 <223> a «.deoxyinosine <400> 5 gaygcngcng aygayccngc <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> AX獅 <220> <223>引物 <220> <221> misc 一feature <222> 18 <223> n = deoxyinosine <400〉 6 tcrtaytgyt craaytcncc
20 20 1326708 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> ΛΧ序列 <220> <223>引物 <400> 7 atgaattcgt cgggcttaat cgtctatg <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213>人工㈣ <220> <223>引物 <400> 8 atggatcctc aggctgcttc ggatgaa <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> AX^J <220> <223>引物 <400> 9 atgaattcat ggcttcagcc gtatcac <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> <220> <223〉弓|物 <400> 10 atggatccgt gtttttgccg tctgacc <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> ΛΧ序列 <220> <223>引物 <400> 11 gcgaattcga taccgatgga atcgacg 28 27 27 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> ΛΙ序列 <220> <223>引物 6 27 271326708 <400> 12 atggatcctc atagatggca tagcggt <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 13 atttaacata tgaactttta caaaacgctc <210> 14 <211〉 26 <212> DNA <213> AX序列- <220> <223>引物 <400> 14 atggatccgt ccttatttgg ctcggt <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引物 <400> 15 aggaattcca tatgaaggtt ccaaaaacaa tgc <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 16 taggatcctc atctggcgct ttcttgt <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Αχ顔 <220> <223>引物 <400> 17 atggatccat ggctcattat gtgaatgagg aacat <210> 18 <211> 30 <212> DNA<213> ΛΧ序列 30 26 33 27 7 35 1326708 <220> <223>引物 <400> 18 attagagctc ctagccgtca gaacggtctt 30 <210> 19 <211〉 27 <212> DNA <213〉ΛΧ賴 <220〉 <223>引物 <400> 19 ctacaaagat cgttatgttt atcggca 27 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引物 <400> 20 agaccaatgc ggagcatata eg 22 <210> 21 <211> 1290 <212> DNA <213>枯草芽孢桿菌 <400> 21 cacatttgac aattttcaca aaaacttaac actgacaatc atgtatatat gttacaattg 60 aagtgcacgt tcataaaagg aggaagtaaa atgaatcatt caaaaacact tttgttaacc 120 gcggcggccg gactgatgct cacatgcggt gcggtgtctt cccaggcaaa gcataagctg 180 tccgatcctt atcattttac cgtgaatgca geggeggaaa cggaaccggt tgataeggee 240 ggtgacgcgg ctgatgatcc tgcgatttgg ctggacccca agactcctca gaacagcaaa 300 ttgattaega ccaataaaaa atcaggttta gtcgtttaca geettgatgg taagatgett 360 cattcctata ataccgggaa gctgaacaat gtcgatatcc gttatgattt tccgttgaac 420 ggcaaaaaag tegatatege ggcagcatcc aatcggtctg aaggaaaaaa taccattgag 480 atttaegeta ttgatggaaa aaacggcaca ttacaaagca tgacagatcc agaccatccg 540 attgcaacag caattaatga ggtatacggt tttaccttat accacagtca aaaaacagga 600 aaatattacg cgatggtgac aggaaaagag ggtgaatttg aacaatacga attaaaggcg 660 gacaaaaatg gatacatatc cggcaaaaag gtacgggcgt ttaaaatgaa ttcccagacg 720 gaagggatgg cagcagacga tgaataegge aggetttata tcgcagaaga agatgaggee 780 atttggaagt tcagcgccga gccggacggc ggcagtaacg gaacggttat cgaccgtgcc 840 gaeggeagge atttaactcg tgatattgaa ggattgaega tttactacgc tgctgacggg 900 aaaggetate tgatggcatc aagccaggga aacagcagct acgccattta tgacagacaa 960 ggaaagaaca aatatgttgc ggattttcgc ataacagacg gtcctgaaac agacgggaca 1020 agcgatacag aeggaattga cgttctgggt ttcggactgg ggcctgaata tccgttcggt 1080 atttttgtcg cacaggacgg tgaaaatata gatcacggcc aaaaggccaa tcaaaatttt 1140 aaaatcgtgc catgggaaag aattgctgat caaatcggtt tccgcccgct ggcaaatgaa 1200 caggttgacc cgagaaaact gaccgacaga agcggaaaat aaacatgcaa aaageagett 1260 atacaagctg ctttttgcat gtgaagaacg 1290 <210> 22 <211> 383 <212> PRT <213>枯草芽孢桿菌 1326708 <400> 22
Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met 1 5 10 15
Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser Gin Ala Lys His Lys Leu Ser Asp 20 25 30
Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp 35 40 45
Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala lie Trp Leu Asp Pro Lys 50 55 60
Thr Pro Gin Asn Ser Lys Leu lie Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu 65 70 75 80
Val Val Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Met Leu His Ser Tyr Asn Thr Gly 85 90 95
Lys Leu Asn Asn Val Asp lie Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys 100 105 110
Lys Val Asp lie Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr 115 120 125 lie Glu lie Tyr Ala lie Asp Gly Lya Asn Gly Thr Leu Gin Ser Met 130 135 140
Thr Asp Pro Asp His Pro lie Ala Thr Ala lie Asn Glu Val Tyr Gly 145 150 155 160
Phe Thr Leu Tyr His Ser Gin Lys Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Val 165 170 175
Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Glu Gin Tyr Glu Leu Lys Ala Asp Lys ISO 185 190
Asn Gly Tyr lie Ser Gly Lys Lys Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser 195 200 205
Gin Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Leu Tyr He 210 215 220
Ala Glu Glu Asp Glu Ala lie Trp Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly 225 230 235 240
Gly Ser Asn Gly Thr Val lie Asp Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr 245 250 255
Arg Asp lie Glu Gly Leu Thr lie Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly 260 265 270
Tyr Leu Met Ala Ser Ser Gin Gly Asn Ser Ser Tyr Ala lie Tyr Asp 275 280 285
Arg Gin Gly Lys Asn Lys Tyr Val Ala Asp Phe Arg lie Thr Asp Gly 290 295 300
Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly lie Asp Val Leu Gly 305 310 315 320
Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro Phe Gly lie Phe Val Ala Gin Asp 325 330 335
Gly Glu Asn lie Asp His Gly Gin Lys Ala Asn Gin Asn Phe Lys lie 340 345 350
Val Pro Trp Glu Arg lie Ala Asp Gin lie Gly Phe Arg Pro Leu Ala 355 360 365
Asn Glu Gin Val Asp Pro Arg Lys Leu Thr Asp Arg Ser Gly Lys 370 375 380 <210> 23 <211> 1724 <212> DNA <213>枯^0桿菌種 <400> 23 catatcfttga acaatttcag cgagttaatg aaagaaacca ataaatcaaa aattagagaa 60 aaacattaat ctgatgcgct ttcatatcgc gttacccgat taatagaata gaaattacaa 120 ataaaacatt gtactaaata ttcattttaa atatttgctc acgtcaattt tttctcttca 180 taaatcctca cattcggaca atcttcacaa aaacttaaca ctgaacttcc tgtatgtatt 240 ttacaattaa agtgcacgtt cataaaagga ggatggaaaa tgaatcattc aaaaacactt 300 9 1326708 ttgttaaccg cggcagccgg attgatgctc acatgcggtg cggtttcttc tcaggccaaa 360 cataagctgt ctgatcctta tcattttacc gtgaatgcgg cggcggaaac ggagccggtt 420 gatacagccg gtgatgcagc tgatgatcct gcgatttggc tggaccccaa gaatcctcag 480 aacagcaaat tgatcacaac caataaaaaa tcaggcttag ccgtgtacag cctagaggga 540 aagatgcttc attcctatca taccgggaag ctgaacaatg ttgatatccg atatgatttt 600 ccgttgaacg gaaaaaaagt cgatattgcg gcggcatcca atcggtctga aggaaagaat 660 accattgaga tttacgccat tgacgggaaa aacggcacat tacaaagcat tacggatcca 720 aaccgcccga ttgcatcagc aattgatgaa gtatacggtt tcagcttgta ccacagtcaa 780 aaaacaggaa aatattacgc gatggtgaca ggaaaagaag gcgaatttga acaatacgaa 840 ttaaatgcgg ataaaaatgg atacatatcc ggcaaaaagg taagggcgtt taaaatgaat 900 tctcagacag aagggatggc agcagacgat gaatacggca gtctttatat cgcagaagaa 960 gatgaggcca tctggaagtt cagcgctgag ccggacggcg gcagtaacgg aacggttatc 1020 gatcgtgccg atggcaggca tttaacccct gatattgaag gactgacgat ttactacgct 1080 gctgacggga aaggctatct gcttgcctca agccagggta acagcagcta tgcgatttat 1140 gaaagacagg gacagaacaa atatgttgcg gactttcaga taacagacgg gcctgaaaca 1200 gacggcacaa gcgatacaga cggaattgac gttctgggtt tcgggctggg gcctgaatat 1260 ccgttcggtc tttttgtcgc acaggacgga gagaatatag atcacggcca aaaggccaat 1320 caaaatttta aaatggtgcc atgggaaaga atcgctgata aaatcggctt tcacccgcag 1380 gtcaataaac aggtcgaccc gagaaaaatg accgacagaa gcggaaaata aacatgaaaa 1440 aagcagctta tccaagctgc tttttgatgt gaagagcgtt tcatgagaaa gtcttggaac 1500 ggatagccgt aagcacagcc ggcagccggt catacgtgta cgccggtact gtctcttgat 1560 aattaagcgc cgcgatttgt ttacgttcac ccgggtttgt catataaaaa tggatcttat 1620 ccggaaaatc cgcaaacccg ctgtaagaaa caaatgttga aaacgggggc gcgggagaaa 1680 ggtctgtcag ctgaaaggcc tgacaagccg caatgtctaa gctt 1724
<210> 24 <211> 383 <212> PRT <213>.枯草芽孢桿菌種 <400> 24
Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met 15 10 15
Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser Gin Ala Lys His Lys Leu Ser Asp 20 25 30
Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp 35 40 45
Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala lie Trp Leu Asp Pro Lys 50 55 60
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Ala Val Tyr Ser Leu Glu Gly Lys Met Leu His Ser Tyr His Thr Gly 85 90 95
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Lys Val Asp lie Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr 115 120 125 lie Glu lie Tyr Ala lie Asp Gly Ly9 Asn Gly Thr Leu Gin Ser lie 130 135 140
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Gin Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Ser Leu Tyr lie 210 215 220
Ala Glu Glu Asp Glu Ala lie Trp Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly 225 230 235 240
Gly Ser Asn Gly Thr Val lie Asp Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr 10 1326708 245 250 255
Pro Asp lie Glu Gly Leu Thr lie Tyr Tyr Ala 2Vla Asp Gly Lys Gly 260 265 270
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Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro Phe Gly Leu Phe Val Ala Gin Asp 325 330 335
Gly Glu Asn lie Asp His Gly Gin Lys Ala Asn Gin Asn Phe Lys Met 340 345 350
Val Pro Trp Glu Arg lie Ala Asp Lys lie Gly Phe His Pro Gin Val 355 360 365
Asn Lys Gin vai Asp Pro Arg Lys Met Thr Asp Arg Ser Gly Lys 370 375 380 11

Claims (1)

1326708 申請專利範圍
>]日修(更)正本 (2〇啦年2月修正) 1. 一種嵌合表現匣，其包含（1)能編碼植酸酶的DNA分 子，其中所述的植酸酶來自於芽孢桿菌株系，以及（2)調控 核苷酸序列，其中所述的DNA分子係功能性地連接所述之 調控序列，且其中所述之調控序列可刺激所述之植酸酶在 植物細胞中表達，以及所述之DNA分子係選自（a) SEQ ID ΝΟ:1或NO:3所示的DNA分子；（b)於核苷酸序列能保持 相互之間的雜交之高度嚴格的條件下可與SEQ ID NO: 1或 NO:3所示的核酸分子雜交之DNA分子；以及（c)可編碼出 SEQ ID NO:2或NO:4所示之序列之DNA分子。 2. 如申請專利範圍第1項所述的嵌合表現匣，其中所述 的植酸酶是胞内表現的。 3. 如申請專利範圍第2項所述的嵌合表現匣，其中所述 的植酸酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的胺基酸 序列。 4. 如申請專利範圍第2項所述的嵌合表現匣，其中所述 的核苷酸序列是SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:3。 5.如申請專利範圍第1項所述的嵌合表現匣，其中所述 的植酸酶除了具有上述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的胺 基酸序列外，亦包含SEQ ID NO:2中第1-80胺基酸殘基的 1326708 (2010年2月修正) 全部或N•末端部分或者SEQ ID NO:4中第mo胺基酸殘 基的全部或N-末端部分被植物信號肽所取代的胺基酸序 列’以便所述的植酸酶能從植物細胞中分泌出來。 6.如申請專利範圍第1項所述的嵌合表現匣，所述的植 酸酶除了具有上述SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的胺基酸 序列外’亦包含SEQ ID NO:2中第1-20胺基酸殘基的全部 或N-末端部分或者seQ ID NO:4中第1-26胺基酸殘基的 全部或N-末端部分被植物信號肽所取代的胺基酸序列，以 便所述的植酸酶能從植物細胞中分泌出來。 7_如申請專利範圍第1項所述的嵌合表現匣，所述的核 苷酸序列除了具有上述SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:3的核 苷酸序列外’亦包含SEq id ΝΟ:1中的第241-480核苷酸 的全部或部分，或者SEQ ID NO:3中的第100-339核苷酸 序列的全部或部分被編碼的植物信號序列肽之核苷酸序列 所取代者’以便所述的植酸酶能從植物細胞中分泌出來。 8,如申請專利範圍第1項所述的嵌合表現匣，其中所述 的核苷酸序列除了具有SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:3的核 苷酸序列外，亦包含SEQ ID ΝΟ:1中的第241-300核苷酸 的全部或部分或者SEQ ID NO:3中的第100-177核苷酸序 列的全部或部分被編碼的植物信號肽序列之核苷酸序列所 取代者，以便所述的植酸酶能從植物細胞中分泌出來。 1326708 (2010年2月修正) 9. 如申請專利範圍第1項所述的嵌合表現]£，其中包含 有編碼在中性pH下具有催化活性的植酸酶的核普酸序 列，其中所述的核苷酸序列在高度嚴格的條件下可以與 SEQIDNO:l和/或SEQIDNO:3核苷酸序列雜交並可操作 地與調控核苷酸序列相連，這種調控核苷酸序列促使該核 酸序列在植物細胞中的表現’而且該調控核苷酸序列對於 該核苷酸序列來說是異源性的。 10. —種表現載體，其中包含如申請專利範圍第1_9項 中任一項所述的嵌合表現匣。 11· 一種轉形後的植物細胞’其中包含有如申請專利範 圍第10項所述的表現載體，其中所述的植物細胞表達所述 植酸酶。 12. 如申請專利範圍第11項所述的轉形後的植物細 胞，該細胞是一種單子葉植物細胞。 13. 如申請專利範圍第12項所述的轉形後的植物細 胞’其中所述的單子葉植物細胞選自玉米、高粱、小麥、 棕摘樹和水稻。 14·如申請專利範圍第11項所述的轉形後的植物細 3 1326708 (2010年2月修正) 胞，該細胞是一種雙子葉植物細胞。 15·如申請專利範圍第14項所述的轉形後的植物細 胞，其中所述的雙子葉植物細胞選自大豆、油菜種子加 州希蒙得木（jojoba)、中國白蠟樹、煙草、紅花、花生和向 曰葵。 16. —種體外培養物，其中含有如申請專利範圍第12項 所述的轉形後的植物細胞。 17. —種體外培養物，其中含有如申請專利範圍第“項 所述的轉形後的植物細胞。 18. —種從植物細胞的植物植酸鹽中移動無機磷酸以促 進植物生長、開花和/或做果的方法，該方法包括在所述的 植物細胞中引入核酸分子以産生轉形的植物細胞，該核酸 分子包括如申請專利範圍第丨_9項中任一項所述的嵌合表 現S ’其中轉形後的植物細胞表現了所述植酸酶，該酶從 植物的植酸鹽中移動了所述的無機磷酸。 19·如申請專利範圍第18項所述的方法，該方法進一步 還包括從轉形的植物細胞製備出完整植株，其中所述的植 物包含表現所述的植酸酶的細胞。 1326708 (2010年2月修正) 20. 如申請專利範圍第19項所述的方法，該方法進一步 還包括通過有性或克隆再生所述的完整植株的步驟，此處 所述的完整植株的後代中含有表現所述的植酸酶的細胞。 21. 如申請專利範圍第18項所述的方法，其中所述的表 現S是通過電穿孔方法引入所述的植物細胞的。 22. 如申請專利範圍第18項所述的方法，其中所述的表 現匣是通過微粒子散射方法引入所述的植物細胞的。 23. 如申請專利範圍第is項所述的方法，其中所述的表 現匣是通過顯微注射的方法引入所述的植物細胞的。 24. —種在易感染土壤農桿菌的單子葉植物中從植物的 植酸鹽中移動無機磷酸以促進植物生長、開花和/或做果的 方法，該方法包括用包含有如申請專利範圍第19項中任 一項所述的後合表輕的±壤農#菌感染所述的植物的細 胞’其中所述的感染的植物細胞表現了所述的能夠移動無 機磷酸鹽的植酸酶。
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