FR2851256A1 - Procede de criblage et d'evolution dirigee de souches produisant de la methionine par nouvelle voie metabolique - Google Patents

Procede de criblage et d'evolution dirigee de souches produisant de la methionine par nouvelle voie metabolique Download PDF

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Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode d'obtention d'un microorganisme génétiquement modifié produisant de l'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)butyrique à partir d'acylhomosérine et de d'alkyl-mercaptan. En particulier, ledit microorganisme produit la L-méthionine, par métabolisme d'une source de carbone simple et de méthyl-mercaptan. L'invention se rapporte également au microorganisme modifié.

Description

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La présente invention se rapporte au domaine de la bioconversion, et d'obtention d'acides aminés par fermentation de microorganismes. Elle se rapporte à une méthode de criblage et d'évolution dirigée permettant d'identifier une souche de microorganisme, éventuellement génétiquement modifié, possédant une enzyme cystathionine-y-synthase et/ou O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase améliorées, ladite souche produisant de l'acide 2-Amino-4-(alkylmercapto)butyrique, en particulier de la L-méthionine (acide 2-Amino-4-(méthylmercapto)butyrique), par métabolisme d'une source de carbone simple et d'alkyl-mercaptan ou d'alkylmercaptide de sodium, en particulier de méthyl-mercaptan ou sodium-mercaptide.
L'invention se rapporte également à cette souche de microorganisme.
Dans la suite, on considérera la seule terminologie alkyl-mercaptan pour désigner l'alkyl-mercaptan ou l'alkyl-mercaptide de sodium.
La DL-Methionine est produite industriellement par synthèse chimique. Le méthyl-mercaptan réagit avec l'acroléine pour produire le (3-méthyl thiopropionaldéhyde, qui réagit avec l'hydrogène cyanide pour produire l'a- hydroxy-y-méthyl-thio-butyro-nitrile. Après traitement avec l'ammoniac, et une hydrolyse, on obtient la méthionine.
Tous les producteurs industriels de la DL-methionine utilisent les mêmes matières premières à savoir l'acroléine, le méthane thiol (méthyl-mercaptan), l'hydrogène cyanide et l'ammoniac ou l'ammonium carbonate. Le procédé de synthèse du mélange racémique peut être conduit en batch ou en continu.
Un procédé industriel combine à la synthèse chimique de la biocatalyse par l'utilisant l'amino acylase, enzyme produite par Aspergillus oryzas pour obtenir uniquement la L-méthionine à partir de la DL-méthionine.
Les brevets US 6,379,934 et EP 1 055 730 se rapportent à la production d'acides aminés en utilisant une souche de bactéries corynéformes, dans laquelle le gène accBC est amplifié. La méthionine est mentionnée, mais seule la préparation de L-lysine est exemplifiée.
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Par contre, aucun procédé de bioconversion n'est utilisé de façon routinière en industrie alors que la plus grande partie des acides aminés (acide glutamique, lysine, thréonine...) sont produits industriellement par ce type de procédé.
En effet, le métabolisme de la méthionine, acide aminé soufré, est fortement régulé et cette régulation ne permet pas l'obtention de rendements susceptibles de concurrencer les rendements obtenus par synthèse organique. La régulation du métabolisme de la méthionine se fait à plusieurs niveaux (Weissbach et al., 1991, Mol. Microbiol., 5, 1593-1597) : - métabolisme carboné pour la fabrication de la L-sérine à partir du glycerate3P, de la L-homosérine à partir de l'aspartate et de l'acétyl-CoA - métabolisme du soufre pour la fabrication de la L-cystéine à partir de la L-sérine, de l'acétyl-CoA et du sulfate du milieu de culture - synthèse de la méthionine (Fig. 1) à partir de la L-homosérine, de la cystéine et d'acétyl-CoA ou succinyl-CoA.
La présente invention se rapporte à des souches de microorganismes en particulier des bactéries, notamment E. coli et les corynébactéries, produisant l'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)butyrique, en particulier de la L-méthionine, par métabolisme d'une source de carbone simple et d'alkylmercaptan. De préférence l'alkylmercaptan est constitué de 1 à 18 atomes de carbones, en particulier de 1 à 4 atomes, et on utilisera préférentiellement du méthylmercaptan. Les souches de microorganismes selon l'invention possèdent une enzyme cystathionine-y-synthase et/ou l'acylhomoserine sulfhydrylase ; elles sont de préférence sélectionnées et améliorées par un procédé de criblage et d'évolution, qui est aussi un objet de l'invention. Les souches selon l'invention peuvent également être génétiquement modifiées (c'est-à-dire présenter une inactivation, une mutation et/ou la suractivation d'au moins un gène endogène), la modification étant effectuée préalablement ou non à la mise en #uvre du procédé de criblage.
Par source de carbone simple, selon la présente invention, on entend des sources de carbone utilisables par l'homme du métier pour la croissance normale d'un microorganisme, d'une bactérie en particulier. On entend désigner notamment
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les différents sucres assimilables, tels le glucose, le galactose, le saccharose, ou les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres. Une source de carbone simple tout particulièrement préférée est le glucose. Une autre source de carbone simple préférée est le saccharose.
L'utilisation d'une source de carbone simple et du méthyl-mercaptan pour la production de méthionine par bioconversion présente a priori plusieurs avantages, notamment : - la synthèse de la méthionine devient indépendante de la synthèse de la cystéine, ainsi que du cycle du tétrahydrofolate.
- une matière première toxique issue de la pétrochimie est valorisée par la biosynthèse d'un acide aminé à valeur ajoutée par un procédé biotechnologique.
- la méthionine est synthétisée en une unique étape à partir de l'O- succinyl-L-homosérine (ou de l'O-acétyl-L-homosérine) et du méthyl- mercaptan (ou méthyl-mercaptide de sodium) sachant que de façon naturelle cette biosynthèse met enjeux 3 réactions enzymatiques (Fig. 1 et 2).
L'invention est basée sur le fait que l'on peut obtenir, de façon dirigée, une amélioration de l'activité méthionine-synthase de la cystationine-y-synthase (EC 4.2.99.9 ; GenBank AAN83320) en présence de méthyl-mercaptan. Cette enzyme de la voie de biosynthèse de méthionine, codée par le gène metB chez E. coli (Fig. 2. A) et C. glutamicum (Fig. 2. B), présente une activité pour un large spectre de substrats.
L'invention est aussi basée sur le fait que l'on peut obtenir, de façon dirigée, une amélioration de l'activité méthionine-synthase de l'O-acétyl-L-homosérine sulfhydrolase (ou O-acétyl-L-homosérine sulfhydrylase, C 4. 2.99.10) en présence de méthylmercaptan. Cette enzyme (Fig. 2. C) de la voie de biosynthèse de méthionine, codée par le gène metY (metZ) chez C. glutamicum (Genbank AF220150), présente une activité pour un large spectre de substrats.
Dans la suite de ce document, on utilisera la notion d'activité méthioninesynthase pour désigner plus largement l'activité qui permet l'obtention d'acide 2-
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amino-4- (alkylmercapto)butyrique, en particulier de la L-méthionine, à partir d'Oacyl-L-homosérine et d'alkyl mercaptan.
Dans un mode particulier et préféré, on produit la L-méthionine à partir d'Oacyl-L-homosérine et de méthylmercaptan. Dans ce mode particulier l'O-acyl-Lhomosérine est l'O-acétyl-L-homosérine ou l'O-succinyl-L-homosérine.
Une activité méthionine synthase est améliorée dans la souche (A) de microorganisme par rapport à la souche (I) initiale lorsque la production de méthionine dans les mêmes conditions de culture (dans un milieu contenant une quantité efficace de méthylmercaptan ou méthylmercaptide de sodium) est supérieure pour la souche (A) que pour la souche (I). Cette amélioration est préférentiellement observée par étude de la quantité de méthionine produite. Dans certains cas, on peut observer cette amélioration par l'augmentation du taux de croissance de la bactérie (A) par rapport au taux de croissance de la bactérie (I), dans un milieu minimum ne contenant pas de méthionine.
Afin d'accélérer la sélection et l'évolution dirigée des souches pour la production de méthionine en présence de méthylmercaptan on peut : a. Coupler la biosynthèse de la molécule d'intérêt à la croissance du microorganisme de telle sorte que la production de cette molécule est nécessaire pour une bonne croissance du microorganisme
Pour cette raison on peut faire le choix de détruire le gène metE codant la méthionine-synthase qui produit la méthionine à partir d'homocystéine. Ce faisant la souche devient auxotrophe pour la méthionine.
Le microorganisme, pour vivre en milieu minimum contenant une source de carbone simple et du méthylmercaptan ou méthylmercaptide de sodium, doit donc optimiser la voie de synthèse de la L-méthionine à partir de l'O-acyl-L-homosérine et du méthylmercaptan ou méthylmercaptide de sodium. Une modélisation informatique montre que dans ces conditions il est possible de doubler les rendements théoriques en méthionine (Tableau 1).
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Figure img00050001
<tb>
<tb> Rendements <SEP> Rendements <SEP> Rendements
<tb> biomasse <SEP> méthioninea <SEP> méthionineb
<tb> YX/S <SEP> (g.g-1) <SEP> YP/s(g.g-1) <SEP> YP/s(g.g-1)
<tb> 0 <SEP> 0,36 <SEP> 0,74
<tb> 0,11 <SEP> 0,30 <SEP> 0,62
<tb> 0,28 <SEP> 0,21 <SEP> 0,42
<tb> 0,44 <SEP> 0,12 <SEP> 0,24
<tb> 0.61 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Tableau 1 : théoriques maximums pour la production de méthionine (g de produit/g de glucose) par E. coli dans le cas d'une fermentation sur glucose (a) et d'une fermentation sur glucose et méthyl-mercaptan (b) avec un rendement en biomasse constant (cultures continues).
Cependant, lorsque l'on souhaite produire un acide 2-amino-4- (alkylmercapto) butyrique différent de la L-méthionine, il est nécessaire de supplémenter le milieu en méthionine pour permettre la croissance du microorganisme. b. Supprimer les régulations, notamment les rétro-inhibitions soit au niveau des enzymes, soit au niveau des gènes afin que la voie de biosynthèse principale soit potentialisée
On peut ainsi supprimer le gène metJ codant une protéine répresseur. Par ailleurs, il a été montré que l'homosérine trans-succinylase, codée par le gène metA, était rétro-inhibée par la méthionine et la S-adénosylméthionine (Taylor et al., 1966, J. Biol. Chem., 241 : 3641-3642). Il est donc souhaitable de remplacer cette enzyme par une enzyme insensible à la rétro-inhibition (Chater et al, 1970, J. Gen.
Microbiol. 63 : 121-131).
Un objet de l'invention est donc un microorganisme produisant de l'acide 2amino-4- (alkylmercapto)butyrique, par métabolisme d'une source de carbone simple et d'alkyl-mercaptan, et présentant une mutation dans une enzyme induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkylmercaptan, par rapport au microorganisme ne présentant pas ladite mutation.
Un objet de l'invention est donc un microorganisme produisant de l'acide 2amino-4- (alkylmercapto)butyrique, par métabolisme d'une source de carbone simple et d'alkyl-mercaptan, et présentant une mutation dans l'enzyme
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cystathionine y-synthase induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan, par rapport au microorganisme ne présentant pas ladite mutation.
Un autre objet de l'invention est un microorganisme produisant de l'acide 2amino-4- (alkylmercapto)butyrique, par métabolisme d'une source de carbone simple et d'alkyl-mercaptan, et présentant une mutation dans l'enzyme O-acyl-Lhomosérine sulfhydrolase induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan, par rapport au microorganisme ne présentant pas ladite mutation.
De préférence, l'alkyl-mercaptan est le méthyl-mercaptan ou sodium- mercaptide et l'acide 2-amino-4- (alkylmercapto)butyrique la L-méthionine.
Dans un cas particulier, ledit microorganisme est obtenu par criblage et sélection à partir d'une souche initiale, éventuellement génétiquement modifiée, permettant d'obtenir une évolution forcée de l'enzyme considérée pour augmenter son activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan.
Un autre objet de l'invention est un test de criblage-identification permettant d'obtenir un microorganisme produisant de l'acide 2-amino-4- (alkylmercapto) butyrique, notamment la L-méthionine, en métabolisant un alkylmercaptan, notamment le méthyl-mercaptan.
Ainsi, la présente invention permet d'identifier des souches présentant des mutations dans leur génome, lesdites mutations permettant l'assimilation d'un alkyl-mercpatan par ladite souche, et la production dudit acide. Lesdites modifications induisent donc une augmentation de l'activité méthionine synthase de ladite souche. On peut alors accélérer la production de la souche produisant de la méthionine de façon autonome à partir d'une source de carbone simple et de méthyl-mercaptan.
Un premier objet de l'invention est donc un procédé de criblage d'une souche bactérienne initiale, éventuellement génétiquement modifiée, possédant une enzyme cystathionine-y-synthase, en vue d'obtenir une souche bactérienne génétiquement modifiée produisant de la L-méthionine, et présentant une modification dans le gène de ladite enzyme cystathionine-y-synthase, induisant une
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augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan, présentant l'étape consistant à : - soumettre ladite souche bactérienne à une pression de sélection en présence d'alkyl-mercaptan, afin de diriger une évolution du gène codant pour ladite enzyme cystathionine-y-synthase, dans ladite souche bactérienne, ladite souche bactérienne initiale présentant éventuellement une inactivation et/ou une suractivation, notamment par insertion d'un promoteur fort constitutif, d'au moins un gène endogène.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention se rapporte à un procédé de criblage d'une souche bactérienne initiale, éventuellement génétiquement modifiée, possédant une enzyme O-acétyl-L-homosérine sulfhydrolase, en vue d'obtenir une souche bactérienne génétiquement modifiée produisant de la L-méthionine, et présentant une modification dans le gène de ladite enzyme O-acétyl-L-homosérine sulfhydrolase, induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan, présentant l'étape consistant à : - soumettre ladite souche bactérienne à une pression de sélection en présence d'alkyl-mercaptan, afin de diriger une évolution du gène codant pour ladite enzyme cystathionine-y-synthase, dans ladite souche bactérienne, ladite souche bactérienne présentant éventuellement une inactivation et/ou une suractivation, notamment par insertion d'un promoteur fort constitutif, d'au moins un gène endogène.
L'homme du métier connaît des promoteurs forts constitutifs chez les microorganismes. De préférence, le promoteur fort constitutif est choisi parmi pTAC-0 (SEQ ID N 1), pLAC-0 (SEQ ID N 2), pTRC-0 (SEQ ID N 3), pTHLA (SEQ ID N 4), promoteurs forts pour lesquels l'opérateur lac a été délété pour les rendre constitutifs.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite souche bactérienne comprend une inactivation d'au moins un gène endogène choisi parmi metJ, metC, metE, metH.
Dans un mode de réalisation, l'inactivation concerne le gène metJ.
Dans un mode de réalisation, l'inactivation concerne le gène metC.
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Dans un mode de réalisation, l'inactivation concerne le gène metE.
Dans un mode de réalisation, l'inactivation concerne le gène metH.
Une mutation du gène metJ a été proposée dans JP 2000157267-A/3, pour produire une quantité supérieure de méthionine (voir aussi GenBank E35587). Ce gène code pour une protéine de répression des gènes met B, E, L, J et R (chez Salmonella typhimurium). Son inactivation ou sa modification permet de diminuer le rétrocontrôle par la méthionine.
Le gène metC (GenBank M12858), code pour la cystathionine-p-lyase (EC 4. 4.1.8), les gènes metE (GenBank AE000458) et metH (GenBank J04975) codent pour la méthionine synthase (EC 2. 1.1.13). La méthionine est un acide aminé essentiel à la vie cellulaire. L'inactivation d'un ou plusieurs de ces gènes revient à supprimer la voie habituelle de biosynthèse de la méthionine.
Ceci permet de sélectionner les souches qui ont développé le métabolisme du méthyl-mercaptan pour la production de méthionine. Il est à noter que l'on obtient alors des souches auxotrophes pour la méthionine, qui survivent en raison de leur possibilité à produire cet acide aminé par une voie alternative. Il est donc important, dans le test de criblage selon l'invention que de la méthionine soit présente initialement dans le milieu de culture, afin de permettre une première croissance des microorganismes.
En utilisant les références données sur GenBank pour ces gènes qui sont bien connus, l'homme du métier est capable de déterminer les gènes équivalents dans d'autres souches bactériennes qu'E. coli. Ce travail de routine est avantageusement effectué en utilisant les séquences consensus pouvant être déterminées du fait de la synthèse de ces gènes pour d'autres microorganismes, et en dessinant des sondes dégénérées permettant de cloner le gène correspondant dans un autre organisme. Ces techniques de routine de biologie moléculaire sont bien connues dans l'art et sont décrites par exemple dans Sambrook et al. (1989 Molecular cloning : laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.).
Dans un mode de réalisation, ladite souche bactérienne peut comprendre également une modification de l'activité homosérine O-acyltransférase porté par le gène metA afin de lui conférer au choix une activité homosérine 0succinyltransférase (EC 2. 3.1.46) ou homosérine O-acétyltransférase (EC 2.3.1.11).
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Dans un mode particulier, on pourra remplacer ou modifier le gène metA de E. coli, codant l'enzyme possédant l'activité homosérine O-succinyltransférase (Genbank AAN83396), afin d'obtenir une activité homosérine O-acétyltransférase. Il est connu de l'homme du métier que cette activité est codée par le gène metA de C. glutamicum (Genbank AF052652). Les protocoles permettant de remplacer le gène metA de E. coli par le gène metA de C. glutamicum, ou de modifier la séquence de metA de E. coli afin d'obtenir une activité homosérine 0acetyltransferase au lieu d'une activité homosérine O-succinyltransférase sont connus de l'homme du métier.
De manière similaire on peut remplacer ou modifier le gène metA de C. glutamicum, codant une activité homosérine O-acetyltransférase, afin d'obtenir une activité homosérine O-succinyltransférase.
Toutes les modifications mentionnées ci-dessus peuvent être effectuées directement sur la souche objet de la pression de sélection, lorsque le procédé selon l'invention est mis en #uvre. Alternativement, il est préférable de mettre en #uvre le procédé de criblage selon l'invention sur une souche ne présentant qu'un nombre restreint de modifications, d'obtenir une souche présentant une activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan, en particulier de méthylmercaptan, et d'effectuer alors d'autres modifications telles que mentionnées, afin d'augmenter le 'bypass' de la voie classique de synthèse de la méthionine.
L'homme du métier connaît les protocoles permettant de modifier le caractère génétique de microorganismes. La surexpression d'un gène peut être effectuée par changement du promoteur de ce gène in situ, par un promoteur fort ou inductible. De façon alternative, on introduit, dans la cellule, un plasmide réplicatif (simple ou multicopies) dans lequel le gène que l'on désire surexprimer est sous le contrôle du promoteur adéquat.
L'inactivation d'un gène se fait préférentiellement par recombinaison homologue. Le principe d'un protocole en est rappelé brièvement : on introduit dans la cellule un fragment linéaire, obtenu in vitro, comprenant les deux régions flanquant le gène, et au moins un gène de sélection entre ces deux régions (généralement un gène de résistance à un antibiotique), ledit fragment linéaire présentant donc un gène inactivé. On sélectionne les cellules ayant subi un
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événement de recombinaison et ayant intégré le fragment introduit par étalement sur milieu sélectif. On sélectionne ensuite les cellules ayant subi un événement de double recombinaison, dans lesquelles le gène natif a été remplacé par le gène inactivé. Ce protocole peut être amélioré en utilisant des systèmes de sélections positive et négative, afin d'accélérer la détection des événements de double recombinaison.
Dans un mode de réalisation préféré, ladite souche bactérienne est une souche d'E. coli.
Dans un autre mode de réalisation, ladite souche bactérienne est une souche de Corynebacterium, en particulier C. glutamicum.
L'invention se rapporte également à une souche bactérienne présentant une modification dans le gène de l'enzyme cystathionine-y-synthase et/ou dans le gène de l'enzyme O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase, induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase de ladite de ladite enzyme en présence d'alkylmercaptan, en particulier de méthyl-mercaptan. Une telle souche peut également présenter au moins une autre modification génétique, (inactivation, mutation ou surexpression d'un gène endogène), telle que mentionnée ci-dessus.
La souche selon l'invention est de préférence susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention, et en particulier est obtenue par le procédé selon l'invention.
L'invention se rapporte plus particulièrement à l'utilisation d'une souche bactérienne selon l'invention, et notamment obtenue par un procédé de sélection selon l'invention, dans un procédé de préparation d'acide 2-amino-4- (alkylmercapto) butyrique, ledit procédé comprenant les étapes de fermentation de ladite souche bactérienne en présence d'une source de carbone simple et d'alkylmercaptan, et de récupération de l'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)butyrique produit, ladite souche présentant une mutation dans le gène de la cystathionine-ysynthase et/ou de l'O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase, induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan. De préférence, ladite souche présente une autre modification génétique, (inactivation ou surexpression d'un gène endogène), telle que mentionnée ci-dessus.
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De préférence, le procédé permet de préparer la méthionine, et la souche est fermentée en présence de méthyl-mercaptan.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'une souche bactérienne présentant une modification dans le gène de la cystathionine-y-synthase et/ou de l'O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase, induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan, ladite modification étant identifiée dans une souche obtenue par un procédé selon l'invention, dans un procédé de préparation d'acide 2-amino-4- (alkylmercapto)butyrique, procédé comprenant les étapes de fermentation de ladite souche bactérienne en présence d'une source de carbone simple et d'alkyl-mercaptan, et de récupération de l'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)butyrique produit.
De préférence, on produit de la méthionine, en fermentant en présence de méthyl-mercaptan.
L'invention se rapporte également à un procédé de préparation d'un acide 2amino-4(alkylmercapto)butyrique, utilisant une souche selon l'invention, ou une souche présentant une mutation dans le gène de la cystathionine-y-synthase et/ou de l'O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase, induisant une augmentation de l'activité méthionine synthase de ladite enzyme cystathionine-y-synthase et/ou O-acyl-Lhomosérine sulfhydrolase en présence d'alkyl-mercaptan, ladite modification étant identifiée dans une souche obtenue par un procédé selon l'invention, ledit procédé comprenant les étapes de fermentation de ladite souche en présence d'alkylmercaptan et d'une source de carbone simple, et de récupération de l'acide ainsi produit. De préférence, ledit acide est la méthionine, et ledit alkyl-mercaptan est le méthyl-mercaptan.
La définition des conditions de fermentation est du ressort de l'homme du métier. On fermente notamment les bactéries à une température comprise entre 20 C et 55 C, de préférence entre 25 C et 40 C, plus particulièrement d'environ 30 C pour C. glutamicum et d'environ 37 C pour E. coli.
La fermentation est conduite en fermenteurs avec un milieu minéral de culture de composition connu défini et adapté en fonction des bactéries utilisées, contenant au moins une source de carbone simple ainsi que de l'alkyl-mercaptan.
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En particulier, le milieu minéral de culture pour E. coli pourra ainsi être de composition identique ou similaire à un milieu M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 32:120-128), un milieu M63 (Miller, 1992 ; A Short Course in Bacterial Genetics : Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ou un milieu tel que défini par Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270 : 88-96), les milieux pouvant être supplémentés pour compenser les auxotrophies, notamment l'éventuelle auxotrophie initiale à la méthionine.
De manière analogue, le milieu minéral de culture pour C. glutamicum pourra ainsi être de composition identique ou similaire au milieu BMCG (Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32 : 205-210) à un milieu tel que défini par Riedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 : 573-583). Les milieux contiennent une concentration en carbone simple jusqu'à 30 g/1, plus particulièrement entre 5 et 20 g/1, ainsi que de l'alkyl-mercaptan jusqu'à 590 mM, plus particulièrement entre 5 et 40 mM.
DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : synthèse de la méthionine à partir de l'homosérine, chez les bactéries.
Figure 2 : stratégies envisagées pour obtenir une synthèse de méthionine à partir de méthyl-mercaptan et de O-succinyl-L-homosérine (A) ou d'O-acétyl-homosérine (B, C). Les réactions représentées par les flèches à gauche de la figure représentent les réactions métaboliques classiquement trouvées chez E. coli (A) ou chez C. glutamicum (B, C) permettant la synthèse de la méthionine en trois étapes à partir de la O-succinyl-L-homosérine (A) ou d'O-acétyl-homosérine (B, C). Les flèches épaisses à droite représentent la stratégie selon l'invention, dans laquelle la méthionine est produite en une étape à partir de la O-succinyl-L-homosérine (A) ou d'O-acetylhomoserine (B, C) en co-utilisation avec du méthyl-mercaptan. La réaction nécessite l'activité méthionine synthase de la cystathionine-y-synthase (A, B), ou l'activité méthionine synthase de l'acétylhomosérine sulfhydrylase (C). Le détail de la réaction catalysé par metA est donné dans la Figure 1. La molécule de cystathionine apparaît en traits légers dans la figure C, pour mieux appréhender la différence de cette stratégie avec A ou B.
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Figure 3 : représentation d'un mécanisme de fermentation continue pour la sélection dirigée des souches selon l'invention.
Figure 4 : Comparaison de spectres de 13C-RMN, correspondant au carbone 5 de la méthionine, obtenus par HSQC sur un hydrolysat de la souche sauvage (haut) ou de la souche Kla-F optimisée (bas). On observe que le carbone 5 de la souche Kla-F n'est pas marqué au carbone 13 ce qui confirme qu'il provient du méthylmercaptide de sodium
EXEMPLES Exemple 1
Pour optimiser E. coli pour la production de méthionine à partir du méthylmercaptan, on effectue une sélection dirigée en flacons.
La souche E. coliK12 est préalablement rendue auxotrophe pour la méthionine en inactivant le gène metE, et ne peut donc croître qu'en fabriquant sa propre méthionine, par l'utilisation du méthyl-mercaptan.
La mise en #uvre de cette technique permet la sélection d'une souche de Escherichia coli dont une enzyme, et très probablement la cystathionine-y-synthase (EC 4. 2.99.9) a développé une activité méthionine-synthase améliorée en présence de méthyl-mercaptan.
La sélection dirigée est conduite en flacon en verre hermétiquement fermé contenant 50 mL de milieu minéral (Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270 : 88- 96) en présence de 33 mM glucose, et du chloramphénicol à une concentration finale de 25 mg/1.
Les milieux de culture sont ensemencés avec la souche E. coli K12 AmetE à DO600nm définie. On ensemence avec une population de bactéries suffisamment importante pour que certaines bactéries possèdent potentiellement des mutations spontanées intéressantes dans le gène metB, permettant d'assimiler le méthylmercaptan. Cette population a été obtenue par culture de la souche auxotrophe en méthionine sur milieu minimum supplémenté en méthionine.
Trois flacons reçoivent alors 100 uL d'une solution à 400 mg/L de sodium mercaptide, tandis qu'un quatrième flacon ne reçoit pas de sodium mercaptide. Les cultures sont réalisées sous agitation, à 37 C, pendant 6 jours, puis la DO600nm est mesurée. Les résultats sont résumés dans le tableau N 3.
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Figure img00140001
<tb>
<tb>
Flacon <SEP> 1 <SEP> Flacon <SEP> 2 <SEP> Flacon <SEP> 3 <SEP> Flacon <SEP> Témoin
<tb> DO600nm <SEP> à <SEP> T=0 <SEP> 0.34 <SEP> 0.34 <SEP> 0.34 <SEP> 0.34
<tb> DO600nm <SEP> à <SEP> T=6 <SEP> jours <SEP> 0.23 <SEP> 1.14 <SEP> 0.79 <SEP> 0. <SEP> 32
<tb>
Tableau 3. Mesure de la densité optique de milieux de cultures pour E. coli en présence (flacons 1-3) ou absence (flacon témoin) de sodium mercaptide.
Ces résultats montrent que les flacons 2 et 3 ont permis de multiplier une souche capable d'utiliser le méthyl-mercaptan pour produire la méthionine nécessaire à sa croissance (augmentation de la densité optique).
Il est probable que l'activité méthionine synthase améliorée observée provienne d'une modification dans el gène de la cystathionine y-synthase de la souche E. coli K12 AmetE, contenue dans les flacons 2 et 3.
La population bactérienne du Flacon 2 peut alors être utilisée pour améliorer davantage l'activité méthionine synthase en présence de méthyl-mercaptan, en utilisant un procédé de criblage et amélioration par fermentation en étage (exemple 2), ou en recommençant le procédé en flacon tel qu'il vient d'être décrit.
Exemple 2
Pour optimiser E. coli pour la production de méthionine à partir du méthylmercaptan, on effectue une sélection.
La souche E. coliKl2 est préalablement rendue auxotrophe pour la méthionine en inactivant le gène metE, et ne peut donc croître qu'en fabriquant sa propre méthionine, par l'utilisation du méthyl-mercaptan.
La mise en #uvre de cette technique permet la sélection d'une souche de Escherichia coli dont une enzyme, et très probablement la cystathionine-y-synthase (EC 4. 2.99.9) a développé une activité méthionine-synthase améliorée en présence de méthyl-mercaptan.
Alternativement, on peut utiliser une souche obtenue selon l'exemple 1.
La sélection dirigée est conduite dans un système en continu en étage (Figure 3).
Le premier fermenteur produit les bactéries à une vitesse proche du taux de croissance maximum. Les bactéries passent en continu de ce fermenteur dans un
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second fermenteur caractérisé par un taux de dilution plus faible et un milieu avec le crible de sélection (ici, le méthyl-mercaptan).
La pression de sélection, imposée à la bactérie dans le second fermenteur, est établie par la concentration en méthyl-mercaptan. Des cycles successifs de sélection permettent d'appliquer aux bactéries des cribles de plus en plus fort par des concentrations croissantes en méthyl-mercaptan.
Pour chaque concentration, la souche sélectionnée dans le second fermenteur est celle qui a évolué pour métaboliser la totalité du méthyl-mercaptan (méthyl-mercaptan résiduel nul dans le fermenteur).
Dans ce cas, on recommence la sélection en utilisant le fermenteur n 2 comme fermenteur de croissance et le fermenteur n 1 comme fermenteur de crible, présentant du méthyl-mercaptan de concentration plus forte qu'à l'étape précédente.
On effectue différents cycles de sélection pour obtenir une souche fermentant le méthyl-mercaptan avec une vitesse élevée. L'analyse de cette souche permet de définir les mutations dans le gène de la cystathionine-y-synthase.
Exemple 3
La population d'E. coli K12 AmetE issue du flacon 2 de l'exemple 1 a subit des repiquages successifs en flacon. La nouvelle population obtenue Kla-F est mise en culture dans un milieu minimum (Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270 : 88- 96) contenant 2,5 g.l-1 de glucose entièrement marqué au carbone 13 et du méthylmercaptide de sodium (200 ppm) non enrichi en carbone 13. Cette population est auxotrophe pour la méthionine en l'absence de méthylmercaptide de sodium.
Après la culture, les cellules sont récupérées, lavées puis hydrolysées par HC1 6N pendant 24 heures à 107 C. Une analyse par RMN bidimensionnelle est alors réalisée (HSQC). Cette analyse permet d'étudier le carbone 5 de la méthionine, qui provient, soit de la L-cystéine, produite à partir du glucose présent dans la solution (voie classique), soit du méthylmercaptide de sodium lorsque la nouvelle voie métabolique selon l'invention est utilisée.
L'expérience est conduite de manière similaire avec la souche sauvage E. coli K12 (produisant la méthionine à partir du glucose), en absence de méthylmercaptide de sodium.
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La figure 4 montre deux spectres 1D, issus de deux acquisitions distinctes, superposés pour une meilleure lecture. Ces spectres 1D sont extraits de spectres RMN à deux dimension type HSQC (corrélation entre protons et carbone 13). Les spectres RMN à deux dimensions ont été obtenu sur un hydrolysat acide des bactéries.
L'échantillon analysé est un hydrolysat total ; cependant du fait de la sensibilité de la RMN et des temps d'acquisition utilisés, on détecte essentiellement les acides aminés, les sucres, les bases et le glycérol. Chaque carbone (couplé à un proton) de chaque acide aminé donne une résonance magnétique nucléaire.
Le carbone 5 de la méthionine (c'est à dire le groupe méthyl terminal) présente un déplacement chimique d'environ 14,7 ppm. La figure 4 présente la zone de déplacement chimique centrée autour de 14,7 ppm pour les deux souches.
On remarque que dans le cas du spectre supérieur, le signal du carbone 5 est fort, indiquant que le carbone 5 est marqué au carbone 13. En conséquence, ce carbone 5 provient du glucose marqué introduit comme substrat dans le milieu de culture.
On remarque par contre que le même signal est très faible dans le spectre inférieur (souche Kla-F). Cela signifie que le carbone 5 n'est pratiquement pas marqué. Pourtant les autres carbones de la molécule sont fortement marqués (résultats non présentés). Le carbone 5 non marqué ne provient donc pas du glucose mais du méthyl-mercaptan.
On peut donc conclure que la souche Kla-F produit de la méthionine à partir de succinyl-L-homosérine et de méthylmercaptide de sodium.

Claims (14)

  1. O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase, dans ladite souche bactérienne, vers un gène à activité méthionine synthase améliorée.
    Revendications 1. Procédé d'obtention, à partir d'une souche bactérienne initiale, d'une souche bactérienne génétiquement modifiée présentant une modification dans un gène codant pour une enzyme, présentant une activité méthionine synthase améliorée par rapport à ladite souche bactérienne initiale, ladite souche bactérienne génétiquement modifiée produisant de l'acide 2-amino-4- (alkylmercapto) butyrique en présence d'alkyl-mercaptan, ledit procédé présentant l'étape consistant à : soumettre ladite souche bactérienne initiale à une pression de sélection en présence d'alkyl-mercaptan, afin de diriger une évolution du gène codant pour la cystathionine-y-synthase ou l'
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne initiale présente au moins une modification génétique d'au moins un gène endogène choisie dans le groupe constitué d'une inactivation, une mutation et une suractivation, notamment par insertion d'un promoteur fort constitutif.
  3. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne initiale comprend une disruption d'au moins un gène endogène choisi parmi metJ, metC, metE, metH.
  4. 4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne initiale présente une modification du gène metA, lui conférant une activité acyltranférase différente de l'activité acyltranférase originelle.
  5. 5. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne initiale comprend une surexpression du produit du gène metA.
  6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne initiale est une souche d'E. coli.
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  7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite souche bactérienne initiale est une souche de Corynebacterium, en particulier
    C. glutamicum.
  8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ledit acide
    2-amino-4- (alkylmercapto)butyrique est la L-méthionine, et que ledit alkyl- mercaptan est le méthyl-mercaptan.
  9. 9. Souche bactérienne obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à
    8.
  10. 10. Souche bactérienne susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 8, présentant une modification génétique dans une enzyme, notamment la cystathionine-y-synthase et/ou l'O-acyl-L-homosérine sulfhydrolase, présentant une augmentation de l'activité méthionine synthase en présence d'alkyl-mercaptan, par rapport à une souche pour laquelle ladite enzyme n'est pas modifiée.
  11. 11. Souche bactérienne selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisée en ce qu'elle présente en outre au moins une autre modification génétique d'au moins un gène endogène choisie dans le groupe constitué d'une inactivation, une mutation et une suractivation, notamment par insertion d'un promoteur fort constitutif.
  12. 12. Utilisation d'une souche bactérienne selon l'une des revendications 9 à 11, dans un procédé de préparation d'acide 2-amino-4-(alkylmercapto)butyrique, comprenant les étapes de fermentation de ladite souche bactérienne en présence d'une source de carbone simple et d' alkyl-mercaptan, et de récupération de l'acide produit.
  13. 13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit acide 2- amino-4-(alkylmercapto)butyrique est la L-méthionine, et que ledit alkyl- mercaptan est le méthyl-mercaptan.
  14. 14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que ladite source de carbone simple est choisie dans le groupe constitué du glucose et du saccharose.
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