CN1316027C - 编码葡萄糖－6－磷酸脱氢酶蛋白的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了分离的核酸分子，其编码具有在每种情况下表1/第二列中所指的氨基酸序列的多肽，其中该核酸分子在表1/第4列所示氨基酸位置中编码与表1/第5列相同行中所示的特定氨基酸不同的蛋白原性氨基酸。

Description

编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶蛋白的基因
发明背景
细胞中天然进行的代谢过程所产生的特定产物和副产物可以用于工业的许多分支中，包括食品工业、动物饲料工业、化妆品工业及制药工业。这些分子合起来称为“精细化学品”，其包括有机酸、蛋白原性(protainogenic)和非蛋白原性氨基酸、核苷酸和核苷、脂类和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素和辅因子、以及酶。它们的最好的产生途径是大规模培养细菌，针对不同的特定情况，这些细菌被开发出来以产生并分泌大量的期望分子。一种对此目的尤其适用的生物体是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其为革兰氏阳性的非致病细菌。通过菌株选择，已开发了许多突变菌株，它们产生各种期望化合物。但是，对具有提高的特定分子产量的菌株的筛选是一种费时且困难的方法。
发明简述
本发明提供了新的可用于谷氨酸棒状杆菌或相关菌种的鉴定或分类的核酸分子。谷氨酸棒状杆菌为革兰氏阳性需氧细菌，其广泛地用在工业上用于大规模产生多种精细化学品，也用于降解碳氢化合物(如在原油泄漏物中)，以及用于氧化萜类化合物。本发明的核酸分子因此可用于鉴定能如通过发酵法用来产生精细化学品的微生物。虽然谷氨酸棒状杆菌自身为非致病的，但它与作为人类的主要病原体的其它谷氨酸棒状杆菌菌种，如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉的致病因子)有亲缘关系。所以能够鉴定棒状杆菌的存在也具有显著的临床重要性，例如诊断应用。而且，所述核酸分子可作为谷氨酸棒状杆菌或相关生物基因组作图的参考点。
这些新的核酸分子编码称作葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶蛋白的蛋白。
棒状杆菌的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因在例如EP 1108790A2中描述。然而，其中描述的基因编码的多肽序列比根据本发明在此描述的序列要短。与本文要求的多肽序列相比，EP 1108790A2中描述的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的N末端被截去30个氨基酸。
Moritz等(Eur.J.Biochemistry 267，3442-3452，2000)描述了谷氨酸棒状杆菌葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的分离。其中公开的N-末端蛋白质测序表明该多肽从丝氨酸开始，与本发明的蛋白不同。
本发明涉及编码葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的新基因，其从第1位或第2位氨基酸(即Val或Ser)开始，并且在243位编码一个非Ala的蛋白原性氨基酸(根据SEQ ID NO：2编号)。
尤其优选从1位氨基酸开始并且在243位编码Thr的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的新基因(根据SEQ ID NO：2编号)。
本发明的核酸分子可以用于生物的遗传操作，以便使该生物成为更好的、更有效的一种或多种精细化学品的生产者。可以修饰本发明的分子以提高一种或多种精细化学品的产率、产量和/或生产效率。
此外，本发明的分子可参与一种或多种影响谷氨酸棒状杆菌中一种或多种精细化学品的产率和/或生产速率的胞内信号转导途径。例如，对于从胞外培养基向胞内输入一种或多种糖所必需的蛋白质(例如Hpr、酶I或酶II复合体的成分)，当细胞中存在足量糖时其经常被翻译后修饰从而不再能够输入所述糖。虽然运输系统被切断时糖的量足够维持正常细胞功能，但是其将限制目标精细化学品的过量生产。所以建议修饰本发明的蛋白从而使它们不再应答这种负调节。结果，一种或多种糖可能达到更高的胞内浓度，并延及到含有所述突变蛋白的生物可以更有效率或更高产率地生产一种或多种精细化学品。
以下将序列表中的核酸序列以及下表1中描述的在相关位置处的序列修饰一起定义为集合A。
以下将序列表中的多肽序列以及下表1中描述的在相关位置处的序列修饰一起定义为集合B。
在另一个实施方案中，分离的核酸分子长度至少15个核苷酸开且在严紧条件下与含有集合A的核苷酸序列的核酸分子杂交。分离的核酸分子优选与天然发生的核酸分子对应。分离的核酸更优选编码天然发生的谷氨酸棒状杆菌G6PD蛋白或其生物活性部分。
本发明的另一个方面涉及载体(例如重组表达载体)，其含有本发明的核酸分子，还涉及所述载体导入的宿主细胞。在一个实施方案中，通过使用在合适的培养基中培养的宿主细胞制备G6PD蛋白。可以从培养基或宿主细胞中分离该G6PD蛋白。
本发明的另一个方面涉及其中导入了G6PD基因或其中的G6PD基因被修饰的遗传修饰的微生物。在一个实施方案中，通过导入至少一个编码突变G6PD序列的本发明核酸分子作为转基因，修饰所述微生物的基因组。在另一个实施方案中，通过与修饰的G6PD基因同源重组，修饰(例如破坏功能)所述微生物基因组中的内源性G6PD基因。在一个优选的实施方案中，微生物属于棒状杆菌或短杆菌(Brevibacterium)属，尤其优选谷氨酸棒状杆菌。在一个优选的实施方案中，该微生物也被用于制备目标化合物，如氨基酸、尤其优选赖氨酸。
另一个优选的实施方案是具有一种以上集合A中描述的核酸分子的宿主细胞。可用各种技术人员已知的方法制备这些宿主细胞。例如，可通过携带几种本发明核酸分子的载体转染这些细胞。然而，也可以使用每次导入一个本发明的核酸分子的载体并由此同时或相继使用多个载体。从而可能构建携带多个乃至高达数百个的本发明核酸序列的宿主细胞。这种积累通常能够对宿主细胞的精细化学品的生产力产生超加性效应。
本发明的另一个方面涉及分离的G6PD蛋白或其部分，例如具有生物学活性的部分。在一个优选的实施方案中，该分离的G6PD蛋白或其部分可参与输入富含能量的碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)到谷氨酸棒状杆菌中，而且还可参与谷氨酸棒状杆菌的一种或多种细胞内信号转导途径。在另一个优选的实施方案中，该分离的G6PD蛋白或其部分与集合B的一条氨基酸序列充分同源以至该蛋白或其部分仍然能够参与输入富含能量的碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)到谷氨酸棒状杆菌中和/或参与谷氨酸棒状杆菌的一种或多种细胞内信号转导途径。
此外，本发明提供了一种分离的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶蛋白制品。在优选的实施方案中，该葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶蛋白(G6PD)含有一段集合B的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及分离的完整长度的蛋白，其和集合B的完整氨基酸序列(其由集合A中的可读框编码)基本同源。
本发明的另一个方面涉及制备精细化学品的制备方法。该方法涉及培养含有可以导致本发明核酸分子表达的载体的细胞从而生产精细化学品。在优选的实施方案中，该方法还包括得到含有载体的细胞的步骤，其中所述细胞被可以导致核酸表达的载体转染。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括从培养物中得到精细化学品的步骤。在一个优选的实施方案中，该细胞属于棒状杆菌属或短杆菌属。
I.精细化学品
术语“精细化学品”为本领域所认知，其包括已用于多种工业的由生物体产生的分子，其中所述工业例如但不限于制药工业、农业工业和化妆品工业。此类化合物包括有机酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白原的和非蛋白原的氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸(如在Rehm等人编辑的生物技术(Biotechnology)第6卷中Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相关化合物(Nucleotides and related compounds)，561-612页，VCH：Weinheim及其中所含参考文献中所述)、脂类、饱和和不饱和脂肪酸(如花生四烯酸)、二醇(如丙二醇和丁二醇)、碳水化合物(如透明质酸和海藻糖)、芳香化合物(如芳香胺、香草醛和靛蓝)、维生素和辅因子(参见如Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A27卷，“维生素”(“Vitamins”)，443-613页(1996)VCH：Weinheim及其中的参考文献；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病“论文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings ofthe UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行，AOCS Press，(1995))、酶以及在Gutcho(1983)通过发酵的化学品(Chemicals by Fermentation)，Noyes DataCorporation，ISBN：0818805086和其中的参考文献中所述的所有其它化学品。这些精细化学品中的某些化学品的代谢和用途进一步阐述如下。
A.氨基酸代谢和用途
氨基酸包含所有蛋白质的基本结构单元，由此为正常细胞功能所必需。术语“氨基酸”为本领域所认知。蛋白原性氨基酸有20种，为蛋白质的结构单元，在蛋白质中它们通过肽键连接，非蛋白原性氨基酸(已知成百种非蛋白原的氨基酸)在蛋白质中通常不存在(参见Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry))，A2卷，57-97页，VCH：Weinheim(1985))。氨基酸可为D-或L-构型，尽管在天然存在的蛋白质中发现的唯一类型通常为L-氨基酸。已充分说明了20种蛋白原性氨基酸中每一种在原核和真核细胞中的生物合成和降解途径(参见例如，Stryer，L.生物化学(Biochemistry)，第三版，578-590页(1988))。“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)，这样称呼是因为由于它们生物合成的复杂性，通常必须从食物中摄取它们，它们被简单的生物合成途径转化为其余11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)。高等动物能够合成这些氨基酸中的一部分氨基酸，但必需氨基酸必须从食物中摄取，以进行正常的蛋白质合成。
除了它们在蛋白质生物合成中的功能外，这些氨基酸本身还是令人感兴趣的化学品，并且许多已发现在人类食品、动物饲料、化学品、化妆品、农业和药学工业中具有多种应用。赖氨酸不仅对人的营养而且对单胃动物如禽和猪都是一种重要的氨基酸。谷氨酸盐是最常用的调味添加剂(谷氨酸单钠盐，MSG)，并且还用于食品工业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于药学工业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于药学工业和化妆品工业。苏氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是广泛使用的动物饲料添加剂。(Rehm等人(编辑)，生物技术(Biotechnology)，第6卷，第14a章中的Leuchtenberger，W.(1996)Amino aids-technicalproduction and use，466-502页，VCH：Weinheim)。还发现这些氨基酸适用作前体，用于合成合成的氨基酸和蛋白质，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨以及在Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，A2卷，57-97页，VCH：Weinheim，1985中所述的其它物质。
在可产生这些天然氨基酸的生物体如细菌中已充分描述了它们的生物合成(细菌氨基酸生物合成及其调节的综述，见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47：533-606)。谷氨酸通过还原胺化α-酮戊二酸(柠檬酸循环中的中间体)而合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸接下来由谷氨酸产生。丝氨酸的生物合成为三步，由3-磷酸甘油(糖酵解中间体)开始，在氧化、氨基转移和水解步骤后产生该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸两者均产生自丝氨酸；具体地，前者通过高半胱氨酸与丝氨酸缩合，后者在丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中通过侧链β-碳原子转移至四氢叶酸上合成。苯丙氨酸和酪氨酸在9步的生物合成途径中合成自糖酵解和磷酸戊糖途径的前体赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸，它们的不同仅在预苯酸合成后的最后两步。色氨酸也从这两种起始分子产生，但其合成为11步的途径。酪氨酸也可在苯丙氨酸羟化酶催化的反应中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸均为来自丙酮酸盐(糖酵解的终产物)的生物合成产物。天冬氨酸形成自草酰乙酸(柠檬酸循环的中间体)。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸均通过转化天冬氨酸而形成。异亮氨酸从苏氨酸形成。组氨酸在一个复杂的9步途径中从一种活化糖-5-磷酸核糖-1-焦磷酸形成。
超过细胞蛋白质生物合成所需的量的氨基酸不能被贮藏，并被降解以提供用于细胞主要代谢途径的中间体(综述参见Stryer，L.生物化学(Biochemistry)第三版，21章，“氨基酸降解和尿素循环”495-516页(1988))。虽然细胞可将不想要的氨基酸转化为有用的代谢中间体，但从所需用于合成氨基酸的能量、前体分子和酶来说，氨基酸的产生是昂贵的。因此对于氨基酸的生物合成受到反馈抑制调节并不让人吃惊，其中特定氨基酸的存在起到减缓或完全终止其自身产生的作用(关于氨基酸生物合成途径中的反馈机制的综述参见Stryer，L.生物化学(Biochemistry)第三版，24章：”氨基酸和血红素的生物合成”575-600页(1988))。因此，特定氨基酸的输出受到细胞中存在的该氨基酸的量的限制。
B.维生素、辅因子和营养成分的代谢和用途
维生素、辅因子和营养成分包含高等动物不能合成且必须摄取的另一类分子，虽然它们易于被其它生物体如细菌合成。这些分子自身为生物活性物质或为在多种代谢途径中作为电子载体或中间体的生物活性物质的前体。除了它们的营养价值外，这些化合物作为着色剂、抗氧化剂和催化剂或其它操作辅助剂也具有重要的工业价值(这些化合物的结构、活性和工业应用的概述参见例如，Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry)，“维生素”A27卷，443-613页，VCH：Weinheim，1996)。术语”维生素”为本领域认知，包括生物体行使正常功能所需的营养素，且该生物体自身不能合成它们。维生素组可以包括辅因子和营养性化合物。术语“辅因子”包括进行正常酶促活性所需的非蛋白质性化合物。此类化合物可为有机的或无机的，本发明的辅因子优选有机的。术语“营养成分”包括促进植物和动物尤其是人的健康的食物添加剂。此类分子的实例为维生素、抗氧化剂和某些脂类(如多不饱和脂肪酸)。
已大量描述了这些分子在可产生它们的生物体如细菌中的生物合成(Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，“维生素”A27卷，443-613页，VCH：Weinheim，1996；Michal，G.(1999)生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology)，John Wiley&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病“论文集(“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia，and the Society for Free Radical Research-Asia)，1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行，AOCS Press：Champaign，IL X，374 S)。
硫胺素(维生素B1)由嘧啶和噻唑部分通过化学偶联产生。核黄素(维生素B2)由鸟苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黄素接下来用于合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合起来称为‘维生素B6’的化合物类(例如，吡哆素、吡哆胺、5’-磷酸吡哆醛和商业上使用的维生素B6盐酸盐)均为共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸(R)-(+)-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可通过化学合成或发酵产生。泛酸生物合成的最后步骤由ATP-驱动的β-丙氨酸和泛解酸的缩合组成。负责转化为泛解酸和β-丙氨酸及泛酸缩合生物合成步骤的酶是已知的。泛酸盐的代谢活性形式为辅酶A，其生物合成由5步酶促步骤进行。泛酸盐、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸盐的形成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(维生素B5原)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)和辅酶A的产生。
已详细研究了微生物中生物素从前体分子庚二酰辅酶A的生物合成，并鉴定了几种所涉及的基因。发现许多相应的蛋白质也参与Fe-簇合成，属于蛋白质nifS类。硫辛酸衍生自辛酸，并在能量代谢中作为辅酶，此时其成为丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体的一部分。叶酸盐为一组这样的物质，其均为叶酸衍生物，而叶酸来自于L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已详细研究了某些微生物中始于鸟苷-5’-三磷酸(GTP)的生物转化的代谢中间体、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸的叶酸及其衍生物的生物合成。
类可啉(如钴胺素且尤其是维生素B12)和卟啉属于一组特征在于四吡咯环体系的化学品。维生素B12的生物合成太复杂，目前尚未彻底解释清楚，但许多涉及的酶和底物现已知。烟酸(烟酸盐)和烟酰胺为吡啶衍生物，也称为‘烟酸(niacin)’。烟酸为重要的辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和它们的还原形式的前体。
这些化合物的工业规模的生产基本上依赖于无细胞的化学合成，虽然这些化学品中的一些如核黄素、维生素B6、泛酸盐和生物素也已通过微生物的大规模培养物产生。只有维生素B12因为其合成的复杂性是仅通过发酵产生的。体外方法需要支出相当大量的材料和时间，并常常代价很高。
C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代谢和用途
嘌呤和嘧啶代谢基因及它们相应的蛋白质为治疗肿瘤和病毒感染的重要靶标。术语“嘌呤”或“嘧啶”包括构成核酸、辅酶和核苷酸的含氮碱基。术语“核苷酸”包括核酸分子的基本结构单元，其包括含氮碱基、戊糖(对RNA而言，该糖为核糖，对DNA而言，该糖为D-脱氧核糖)和磷酸。术语“核苷”包括作为核苷酸前体的分子，但其不合核苷酸所具有的磷酸单元。通过抑制这些分子的生物合成，或抑制它们形成核酸分子的代谢，可抑制RNA和DNA合成；通过以靶向癌细胞的方式抑制这种活性，可抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。
此外，有不形成核酸分子但作为能量贮存体(即AMP)或作为辅酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
一些出版物已描述了这些化学品在嘌呤和/或嘧啶代谢受到影响的医学适应症中的用途(例如Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)”作为化学治疗剂的嘧啶和嘌呤从头生物合成的强力抑制剂”医学研究述评(Med.Res.Reviews)10：505-548)。对参与嘌呤和嘧啶代谢的酶的研究集中在研发可用作如免疫抑制剂或抗增生剂的新药上(Smith，J.L.，(1995)”核苷酸合成中的酶”结构生物学最新观点(Curr.Opin.Struct.Biol.)5：752-757；(1995)Biochem Soc.Transact.23：877-902)。但是，嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸具有其它可能应用：用作多种精细化学品(例如，硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、叶酸盐或核黄素)生物合成的中间体，作为细胞的能量载体(例如，ATP或GTP)，和本身作为化学品，通常用作增味剂(例如，IMP或GMP)或用于一些医药用途(参见例如，Kuninaka，A.(1996)生物技术中的核苷酸和相关化合物(Nucleotides and Related Compounds inBiotechnology)第6卷，Rehm等人编辑.VCH：Weinheim，561-612页)。同样，参与嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代谢的酶越来越多地用作靶，研发用于作物保护的抗这些酶的化学品包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。
已阐释了这些化合物在细菌中的代谢(综述参见例如，核酸研究和分子生物学进展(Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology)，第42卷，Academic Press中的Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)”嘌呤核苷酸的从头生物合成”，259-287页；和生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistry and MolecularBiology)，Wiley：纽约一书中的Michal，G.(1999)”核苷酸和核苷”，第8章)。嘌呤代谢已是深入研究的主题，其对细胞的正常功能是必需的。高等动物中受损的嘌呤代谢可引起严重疾病，如痛风。嘌呤核苷酸从核糖-5-磷酸开始，经过一系列步骤，通过中间体化合物次黄苷-5’-磷酸(IMP)，产生鸟苷-5’-单磷酸(GMP)或腺苷-5’-单磷酸(AMP)，由此可以容易地形成用作核苷酸的三磷酸形式。这些化合物也用作能量贮存体，这样它们的降解可为细胞内许多不同生物化学过程提供能量。嘧啶的生物合成由核糖-5-磷酸形成尿苷-5’-单磷酸(UMP)而进行。UMP接下来转化为胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有这些核苷酸的脱氧形式通过一步还原步骤从核苷酸的二磷酸核糖形式产生为核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。通过磷酸化后，这些分子可参与DNA合成。
D.海藻糖的代谢和用途
海藻糖由两个葡萄糖分子通过α、α-1，1键连接组成。它通常作为甜味剂用于食品工业，或作为干的或冷冻食品和饮料中的添加剂。但它也用于药学、化妆品和生物技术工业(参见例如，Nishimoto等人(1998)美国专利号5,759,610；Singer，M.A.和Lindquist，S.生物技术趋势(TrendsBiotech.)16(1998)：460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.Biotech.Ann.Rev.2(1996)：293-314；和Shiosaka，M.J.Japan 172：(1997)97-102)。海藻糖可以通过许多微生物的酶产生，并天然释放入环境介质中，从中可用本领域公知的方法收集海藻糖。
II.本发明的元素和方法
本发明至少部分是基于新分子的发现，它们在本文中被称作G6PD核酸分子和G6PD蛋白分子，并且它们参与摄取富含能量的碳分子(例如葡萄糖、蔗糖和果糖)到谷氨酸棒状杆菌中，并且还可能参与该微生物中一种或多种细胞内信号转导途径。在一个实施方案中，G6PD分子将富含能量的碳分子输入到细胞中，在细胞中这些分子降解产生的能量被用于驱动能量上较不利的生化反应。它们的降解产物可被用作许多其他代谢途径的中间体或前体。在另一个实施方案中，G6PD分子可参与一种或多种胞内信号转导途径，并且修饰形式的G6PD分子(例如磷酸化的G6PD蛋白)可参与调节一种或多种细胞过程的信号转导级联。在一个优选的实施方案中，本发明的G6PD分子的活性影响所述生物对目标精细化学品的生产。在一个尤其优选的实施方案中，本发明的G6PD分子的活性受到调节，从而谷氨酸棒状杆菌生产一种或多种精细化学品的产率、产量或生产效率也受到调节。
在另一个优选的实施方案中，本发明的G6PD分子能够调节微生物如谷氨酸棒状杆菌中目标分子如精细化学品的生产。在基因重组技术的帮助下，可以操作一种或多种本发明的G6PD蛋白使它们的功能受到调节。例如，可以修饰参与G6PD介导的葡萄糖输入的蛋白使其具有最佳活性，从而用于输入葡萄糖的G6PD系统能够运输更大量的葡萄糖到细胞中。葡萄糖不仅被用作能量上不利的生化反应(如精细化学品的生物合成)的能源，而且被用作许多精细化学品的生物合成途径中的前体和中间体(例如，丝氨酸从3-磷酸甘油酸合成)。总之，通过增加可用于目标精细化学品生产的能量或者通过增加所述生产所需的化合物的可用量，可以增加这些目标精细化学品的任何一种的总产率或生产速率。
制备本发明的核酸序列的一个适宜的起点是谷氨酸棒状杆菌菌株的基因组，该菌株可以从美国典型培养物保藏中心获得，其保藏号是ATCC13032。
可以使用常用方法通过表1中所示的修饰从这些核酸序列制备本发明的核酸序列。
本发明的G6PD蛋白或其生物学活性部分或片段可以参与运输富含能量的含碳分子如葡萄糖到谷氨酸棒状杆菌中或者参与该微生物中胞内信号转导，或者它们可以具有表1中列出的一种或多种活性。
下面的小章节更详细地描述了本发明的各个方面：
A.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及编码G6PD多肽或其生物活性部分的分离核酸分子及核酸分子片段，其中所述核酸分子片段足以用作杂交探针或引物，用来鉴定或扩增编码G6PD的核酸(例如G6PD DNA)。如此处所用，术语“核酸分子”是指包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该术语也包括位于基因编码区3’和5’端的非翻译区：基因编码区5’端上游的至少约100个核苷酸的序列和基因编码区3’端下游的至少约20个核苷酸的序列。核酸分子可为单链或双链，但优选地为双链DNA。“分离的”核酸分子为从存在于此核酸的天然源中的其它核酸分子中取出的核酸分子。优选地，“分离的”核酸不具有在该核酸所来自的生物体基因组DNA中天然存在于该核酸侧翼的序列(例如，位于该核酸5’或3’端的序列)。例如，在不同实施方案中，该分离的G6PD核酸分子可包含少于约5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb在该核酸所来自的细胞(如谷氨酸棒状杆菌细胞)基因组DNA中天然存在于该核酸分子侧翼的核苷酸序列。而且，“分离的”核酸分子如cDNA分子当通过重组技术产生时可基本上不含有其它细胞物质或培养基，当通过化学合成产生时，可基本上不含有化学前体或其它化学品。
本发明的核酸分子，如具有集合A的核苷酸序列的核酸分子或其部分可用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息制备。例如，使用集合A的完整或部分序列作为杂交探针和标准的杂交技术(例如，在Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual).第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989中所述)，可自谷氨酸棒状杆菌文库分离谷氨酸棒状杆菌G6PD DNA。而且，包含集合A的完整序列或其部分的核酸分子可使用根据该序列设计的寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应分离(例如，包含集合A的完整或部分序列的核酸分子可使用根据该同样序列设计的寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应分离)。例如，可从正常的内皮细胞分离mRNA(例如，通过Chirgwin等人(1979)生物化学(Biochemistry)18：5294-5299的硫氰酸胍提取法)并用反转录酶(例如，莫洛尼鼠类白血病病毒反转录酶，可从Gibco/BRL，Bethesda，MD获得；或AMV反转录酶，可从SeikagakuAmerica，Inc.，St.Petersburg，FL获得)制备cDNA。用于聚合酶链反应扩增的合成寡核苷酸引物可根据集合A所述的核苷酸序列之一设计。本发明的核酸可用cDNA或用基因组DNA作为模板、使用合适的寡核苷酸引物按照标准的PCR扩增技术来扩增。这样扩增的核酸可克隆入合适的载体并通过DNA序列分析鉴定。对应于G6PD核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准的合成技术制备，例如用DNA自动合成仪制备。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离核酸分子包含集合A中所示的核苷酸序列之一。
在另一个优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子含有与集合A中所示核酸序列之任一互补的核酸分子或其部分，所述核酸分子与集合A中所示核酸序列之任一足够互补以致其与集合A中所示序列之一能杂交而得到稳定双链体。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码这样的蛋白质或其部分，其包括的氨基酸序列充分同源于集合B的一个氨基酸序列，以至于该蛋白质或其部分仍然能够参与运输富含能量的碳分子(如葡萄糖)到谷氨酸棒状杆菌中和参与一种或多种胞内信号转导途径。如此处所用，术语“充分同源”是指蛋白质或其部分所具有的氨基酸序列包括最小数目的与集合B的氨基酸序列相同或等同的氨基酸残基(例如，氨基酸残基具有与集合B中序列之一的氨基酸残基相似的侧链)，以至于该蛋白质或其部分能够运输富含能量的碳分子(如葡萄糖)到谷氨酸棒状杆菌中和参与该微生物中的胞内信号转导。如此处所述，这些代谢途径的蛋白组分运输富含能量的碳分子(如葡萄糖)到谷氨酸棒状杆菌中并可能参与该微生物中的胞内信号转导。此类活性的实例也在此进行了描述。因此，“G6PD蛋白的功能”涉及到一种或多种基于磷酸烯醇丙酮酸的糖运输途径的整个运行和/或调节。G6PD蛋白活性的实例在表1中给出。
本发明G6PD核酸分子编码的蛋白的部分优选是任何G6PD蛋白的具生物学活性的部分。文中所用术语“G6PD蛋白的生物学活性部分”包括G6PD蛋白的一部分，例如结构域或基元，其能够运输富含能量的含碳分子如葡萄糖到谷氨酸棒状杆菌中或者能够参与该微生物中细胞内信号转导或者具有表1中所示活性。为了确定G6PD蛋白或者其生物学活性部分能否参与运输富含能量的含碳分子如葡萄糖到谷氨酸棒状杆菌中或者能够参与该微生物中细胞内信号转导，可以进行酶活性分析。这些分析方法在实施例部分的实施例8中详细描述，且技术人员熟知这些方法。
除了群体中可能存在的G6PD序列的天然变体外，技术人员还理解可通过突变向集合A的核苷酸序列中导入变化，由此导致所编码的G6PD蛋白的氨基酸序列改变，但不损害G6PD蛋白的功能。例如，可在集合A的核苷酸序列中进行在“非必需”氨基酸残基处导致氨基酸替换的核苷酸替换。“非必需”氨基酸残基是任一个G6PD蛋白野生型序列(集合B)中可被修饰而不改变所述G6PD蛋白的活性的残基，但“必需”氨基酸残基为G6PD蛋白活性所需。然而，其它氨基酸残基(例如，在具有G6PD活性的结构域中不保守或仅为半保守的那些氨基酸残基)对活性可能为非必需的，并因此可能被改变而不导致G6PD活性的改变。
编码同源于集合B的蛋白质序列的G6PD蛋白的分离核酸分子可通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失导入集合A的核苷酸序列中以使一个或多个氨基酸替换、添加或缺失导入所编码的蛋白质中而产生。可通过标准技术将突变导入集合A的核苷酸序列之一，如定点诱变和PCR-介导的诱变。优选地，在一处或多处预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”为将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域定义过。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选地在G6PD蛋白中预测的非必需氨基酸残基用来自同一侧链家族的另一氨基酸残基替换。或者，在另一实施方案中，可通过如饱和诱变沿着全部或部分G6PD编码序列随机导入突变，并根据文中所述的G6PD活性对所得突变体进行筛选，以鉴定保留G6PD活性的突变体。对集合A序列之任一诱变后，可重组表达编码蛋白，并用例如文中所述的试验(参见实施例部分的实施例8)确定所述蛋白质的活性。
B.重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一方面涉及包含编码G6PD蛋白(或其部分)的核酸的载体，优选表达载体。如此处所用，术语”载体”是指这样的核酸分子，其可转运与其连接的另一核酸。一种类型的载体为”质粒”，是指其中可连接额外DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA片段连接入病毒基因组。某些载体可在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，并因此随着宿主基因组而复制。而且，某些载体可指导与它们操作性连接的基因的表达。此类载体此处称为”表达载体”。一般，用于重组DNA技术中的表达载体为质粒形式。在本说明书中，”质粒”和”载体”可互换使用，因为质粒是最经常使用的载体形式。但是，本发明旨在包括其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们起到类似的作用。
本发明的重组表达载体包含以适于在宿主细胞中表达的形式存在的本发明的核酸，这就是说重组表达载体包括一个或多个调节序列，这些调节序列基于表达所用的宿主细胞进行选择并功能性地与待表达的核酸序列连接。在重组表达载体中，术语“功能性连接”是指目的核苷酸序列与调节序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中表达)的方式连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达调控元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。此类调节序列如在Goeddel；基因表达技术：酶学方法(GeneExpression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中描述。调节序列包括控制核苷酸序列在许多类型宿主细胞中组成型表达的调节序列和控制核苷酸序列仅在特定宿主细胞中表达的调节序列。本领域普通技术人员了解，表达载体的设计可取决于如对欲转化宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达程度等因素。本发明的表达载体可导入宿主细胞，以产生由此处所述核酸所编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或融合肽(例如，G6PD蛋白、G6PD蛋白的突变形式、融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达G6PD蛋白。例如，G6PD基因可在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞和其它真菌细胞(参见Romanos，M.A.等人(1992)“在酵母中外源基因的表达：综述”(”Foreign gene Expression inyeast：a review”)，酵母(Yeast)8：423-488；J.W.Bennet&L.L.Lasure编辑的《更多的用于真菌的基因操作》(More Gene Manipulations inFungi)，Academic Press：San Diego一书中的van den Hondel，C.A.M.J.J.等人(1991)“丝状真菌中的异源基因表达”(”Heterologous geneExpression in filamentous fungi”)，396-428页；以及Peberdy，J.F.等人编辑的《真菌的应用分子遗传学》(Applied Molecular Genetics of Fungi)，Cambridge University Press：Cambridge一书中的van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)“丝状真菌的基因转移体系和载体开发”(”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi)，1-28页)、藻类和单细胞植物细胞(参见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)，根癌农杆菌介导的拟南芥叶和子叶外植体的高效转化，植物细胞报道(Plant Cell Rep.)：583-586)、或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步进行了讨论。另外，可体外转录并翻译重组表达载体，如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
在原核生物中蛋白质的表达主要用含有组成型或诱导型启动子的载体进行，以控制融合或非融合蛋白的表达。融合载体将一些氨基酸添加至其中编码的蛋白质上，通常添加至重组蛋白的氨基末端。此类融合载体一般具有三个任务：1)用于增强重组蛋白的表达；2)用于增加重组蛋白的溶解性；和3)在亲和层析中作为配体而利于重组蛋白的纯化。通常，于融合单元和重组蛋白的连接处导入蛋白酶剪切位点到融合表达载体中，这使得在该融合蛋白纯化后，可将重组蛋白与融合单元分离。这些酶和它们的对应识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
通常的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)基因(Gene)67：31-40)、pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A融合至重组靶蛋白。在一个实施方案中，将G6PD蛋白的编码序列克隆入pGEX表达载体，以产生编码融合蛋白的载体，该蛋白从N-末端至C-末端包含GST-凝血酶切割位点-X蛋白。该融合蛋白可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析纯化。通过将该融合蛋白用凝血酶切割可得到不与GST融合的重组G6PD蛋白。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人(1988)基因(Gene)69：301-315)和pET 11d(Studier等人，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。pTrc载体中目标基因的表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂合的trp-lac融合启动子的转录。pET 11d载体中目标基因的表达依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的从T7-gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶可以由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)中居住的、具有位于lacUV 5启动子转录调控下的T7 gn1基因的λ原噬菌体提供。
最大化重组蛋白表达的一个策略是将该蛋白质在对所述重组蛋白进行蛋白酶切割的能力被破坏的宿主细菌中表达(Gottesman，S.，基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology：Methods in Enzymology)185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一策略是改变欲插入表达载体的核酸的核酸序列，以使编码每一氨基酸的各密码子为选择用于表达的细菌如谷氨酸棒状杆菌所优选使用的密码子(Wada等人(1992)核酸研究(Nucleic Acids Res.)20：2111-2118)。本发明核酸序列的此改变可应用标准的DNA合成技术实施。
在另一实施方案中，G6PD蛋白表达载体为酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体包括pYepSec1(Baldari，等人(1987)Embo J.6：229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)细胞(Cell)30：933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987)基因(Gene)54：113-123)，和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。适用于其它真菌如丝状真菌的载体和用于构建载体的方法包括在：J.F.Peberdy等人编辑的《真菌的应用分子遗传学》(Applied Molecular Genetics of Fungi)，Cambridge UniversityPress：Cambridge一书中的van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)“丝状真菌的基因转移体系和载体开发”(”Gene transfer systems andvector development for filamentous fungi)，1-28页中详述的那些。
作为另一可选择方案，本发明的G6PD蛋白可使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)病毒学(Virology)170：31-39)。
在另一实施方案中，本发明的G6PD蛋白可在单细胞植物细胞(如藻类)或在来自高等植物(如种子植物，诸如作物)的植物细胞中表达。植物表达载体的实例包括在：Becker，D.，KemPer，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“具有靠近左边界的选择性标记的新植物双元载体(”New plantbinary vectors with selectable markers located proximal to the leftborder”)，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的双元农杆菌载体”(”Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation”)，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)12：8711-8721中详述的那些。
又在另一实施方案中，本发明的核酸用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)自然(Nature)329：840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的调控功能通常由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。用于原核和真核细胞的其它合适表达系统参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中的第16和17章。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体优选地可以指导核酸在特定细胞类型中表达(例如，使用组织-特异性调控元件来表达核酸)。组织-特异性调控元件为本领域公知。合适的组织-特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人(1987)基因进展(Genes Dev.)1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame and Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人(1983)细胞(Cell)33：729-740；Queen和Baltimore(1983)细胞(Cell)33：741-748)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS86：5473-5477)、胰特异性启动子(Edlund等人(1985)科学(Science)230：912-916)、以及乳腺特异性启动子(例如，milk serum启动子；美国专利号4,873,316和欧洲专利申请文件号264,166)。此外，还包括发育调节的启动子，如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)科学(Science)249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)基因进展(Genes Dev.)3：537-546)。
本发明还提供了含本发明的DNA分子的重组表达载体，其中该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是，DNA分子功能性连接到调控序列上，该连接方式使得可以表达(通过转录该DNA分子)产生与G6PDmRNA反义的RNA分子。可以对功能性连接反义方向克隆的核酸的调控序列进行选择以控制反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达，例如，可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列以控制反义RNA实现组成型组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，其中在高效调控区域的控制下产生反义核酸，而所述调控区域的活性由载体所导入的细胞的类型决定。关于利用反义基因实施基因表达调控的讨论见Weintraub，H.等人，反义RNA作为遗传分析的分子工具，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986。
本发明的另一方面涉及已导入本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可互换使用。当然，该术语不仅指特定的靶细胞，也指该细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境因素细胞在传代过程中可发生某些改变，这样，后代实际上可能并不一定与亲代细胞相同，但其仍包括在此处所用术语的范围之内。
宿主细胞可为原核或真核细胞。例如，G6PD蛋白可在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞为技术人员公知。与谷氨酸棒状杆菌有关的、可以以适宜方式用作本发明核酸和蛋白质分子的宿主细胞的微生物如表3所示。
载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用，术语“转化”和“转染”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人(分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual).第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它的实验室手册中找到。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所用的表达载体和所用的转染技术，仅一小部分的细胞可将外源DNA整合到基因组中。一般将编码选择标记的基因(如抗生素抗性基因)与目的基因一同导入宿主细胞以鉴定和筛选整合体。优选的选择标记包括那些可赋予药物抗性的基因，所述药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可与编码G6PD蛋白质的基因位于同一载体上被导入宿主细胞或可以位于不同的载体上导入。被导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物筛选进行鉴定(例如，掺入了选择标志基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
通过制备出含至少部分G6PD基因的载体——所述部分G6PD基因中已经导入缺失、添加或替代因而可以改变G6PD基因(如功能性破坏)——可以生成同源重组微生物。优选地该G6PD基因为谷氨酸棒状杆菌G6PD基因，但也可为来自相关细菌或甚至来自哺乳动物、酵母或昆虫的同系物。在一个优选的实施方案中，载体设计为在同源重组后可功能性破坏内源G6PD基因(即，该基因不再编码功能蛋白质；也称为“敲除”载体)。另外，载体可设计为在同源重组后使内源G6PD基因发生突变或改变但仍编码功能蛋白质(例如，可改变上游调控区域由此改变内源G6PD蛋白的表达)。在此同源重组载体中，改变的G6PD基因部分在其5′和3′端侧翼为G6PD基因的其它核酸，从而使得载体所携带的外源G6PD基因和微生物中的内源G6PD基因之间可以发生同源重组。此额外的两翼G6PD核酸的长度应足以使与内源基因的同源重组成功进行。通常，载体内包括几千碱基的侧翼DNA(5′及3′端)(参见例如，Thomas，K.R.，和Capecchi，M.R.(1987)细胞(Cell)51：503中对同源重组载体的描述)。使用本领域公知的方法，将该载体导入微生物(例如，通过电穿孔)，并筛选内源G6PD基因已与导入的G6PD基因同源重组的细胞。
在另一实施方案中，产生的重组微生物含有可调控导入的基因的表达的选定系统。例如，将G6PD基因插入载体中位于乳糖操纵子的控制下，可以使G6PD基因仅在存在IPTG时表达。此类调控系统为本领域熟知。
本发明的宿主细胞如培养的原核或真核宿主细胞可用于产生(即表达)G6PD蛋白。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞来产生G6PD蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码G6PD蛋白的重组表达载体，或其基因组中已导入了编码野生型或改变的G6PD蛋白的基因)，直至产生G6PD蛋白。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞分离G6PD蛋白。
C.本发明的用途和方法
文中所述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同系物、融合蛋白、引物、载体和宿主细胞可用于下述一种或多种方法中：鉴定谷氨酸棒状杆菌及相关生物体；绘制与谷氨酸棒状杆菌相关的生物体的基因组图谱；鉴定并定位目标谷氨酸棒状杆菌序列；进化研究；确定G6PD蛋白的功能和活性调节所需的G6PD蛋白区域；调节G6PD途径的活性；调节目标化合物如精细化学品的细胞生产。本发明的G6PD核酸分子具有多种用途。首先，它们可用于鉴定生物体是否为谷氨酸棒状杆菌或其近亲。它们也可用于在混合的微生物群体中鉴定谷氨酸棒状杆菌或其相关菌。本发明提供了许多谷氨酸棒状杆菌基因的核酸序列。通过将从微生物单一群体或混合群体的培养物提取的基因组DNA在严格条件下用包含对谷氨酸棒状杆菌而言独特的谷氨酸棒状杆菌基因区域的探针来探测，可确定该生物体是否存在。虽然谷氨酸棒状杆菌自身为非致病的，但它与致病种如白喉棒状杆菌有亲缘关系。这种生物体的检测具有实质上的临床重要性。
本发明的核酸和蛋白质分子也可用作基因组特定区域的标记。这不仅可用于绘制基因组图谱，也可用于谷氨酸棒状杆菌蛋白质的功能研究。例如，可切割谷氨酸棒状杆菌基因组，并将片段与DNA-结合蛋白孵育来确定与特定的谷氨酸棒状杆菌DNA-结合蛋白结合的基因组区域。另外，那些结合蛋白的片段可用本发明的核酸分子探测，优选地用具有易于检测的标记物实施探测；此核酸分子与基因组片段的结合可将片段定位于谷氨酸棒状杆菌的基因组图谱中，并且当用不同的酶重复此过程几次时，将有利于快速确定蛋白质结合的核酸序列。而且，本发明的核酸分子充分同源于亲缘种的序列，这样这些核酸分子可用作在亲缘菌如乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium Lactofermentum)中构建基因组图谱的标记。
本发明的G6PD核酸分子也适用于进化研究和蛋白质结构研究。许多细胞应用本发明分子参与的糖摄取系统；通过将本发明核酸分子的序列与那些来自其它生物体的编码类似酶的序列比较，可确定所述生物体的进化关系。由此，此比较使得可确定哪些区域保守和哪些区域不保守，这有利于确定那些对酶功能所必需的蛋白质区域。这种确定对蛋白质工程研究有价值，并可指出蛋白质可耐受哪种诱变且不丢失其功能。
对本发明G6PD核酸分子的操作可导致产生与野生型G6PD蛋白功能不同的G6PD蛋白。这些蛋白质可在功效或活性上提高，可以在细胞内以比通常多的量存在，或可以在功效或活性上降低。
操作本发明的G6PD核酸分子可以使一种或多种精细化学品的产率、产量和/或生产效率得到提高。通过修饰参与葡萄糖摄取的G6PD蛋白使其具有最佳活性，可以增加葡萄糖摄入程度或者葡萄糖被转运到细胞中的速度。细胞中葡萄糖和其他糖降解提供的能量可被用于驱动能量上不利的生化反应(如那些参与精细化学品生物合成的生化反应)。所述降解同样为特定精细化学品如氨基酸、维生素和辅因子的生物合成提供了中间体和前体。所以，通过修饰本发明的G6PD分子而增加胞内富含能量的碳分子的量，可以增加能用于代谢途径——生产一种或多种精细化学品时所需的代谢途径——中的能量，而且还可以增加所述生产所需的代谢物的胞内库。相反地，通过降低糖的输入——该糖的降解产物包括仅仅在与产生目标精细化学品的代谢途径竞争酶、辅因子或中间体的代谢途径中使用的化合物，则有可能下调所述代谢途径，从而可能增加目标生物合成途径的产量。
本发明的G6PD分子可参与影响谷氨酸棒状杆菌生产一种或多种精细化学品的产率和/或生产速率的一种或多种细胞内信号转导途径。例如，从细胞外介质输入一种或多种糖时所需的蛋白(例如HPr、酶I或酶II复合体的成分)在细胞中存在足量所述糖时经常被翻译后修饰，以至于它们不再能够输入所述糖。一个例子见于大肠杆菌，其中高的胞内果糖1，6-二磷酸水平导致Hpr在丝氨酸46位磷酸化，此后所述分子不再能够参与糖的运输。虽然运输系统关闭时的胞内糖水平可能足够保持正常细胞功能，但是其将限制目标精细化学品的过量生产。所以，需要修饰本发明的G6PD蛋白使得它们不再对这种负调节敏感。结果，可以得到一种或多种糖的更高的胞内浓度，并延及到含有这些突变G6PD蛋白的生物生产一种或多种精细化学品时更有效率或产率更高。
这些上面提到的突变G6PD蛋白以增加目标化合物的产率的策略并不旨在限制；这些突变策略的变通方案对技术人员是相当明显的。这些机制使得可以使用本发明的核酸和蛋白质分子产生表达突变的G6PD核酸和蛋白质分子的谷氨酸棒状杆菌或者相关细菌菌株，从而提高目标化合物的产率、产量和/或生产效率。目标化合物可以是谷氨酸棒状杆菌的产物，包括生物合成途径的终产物和天然代谢途径的中间产物以及非天然存在于谷氨酸棒状杆菌代谢中的但是被本发明谷氨酸棒状杆菌生产的分子。
对本发明通过如下实施例进一步阐述，但不应将下面的实施例理解为限制性的。在本专利申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利、公开的专利申请的全部内容特此引用作为参考。
实施例
实施例1：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的总基因组DNA的制备
谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)的培养物在30℃于BHI培养基(Difco)中剧烈振摇过夜。离心收获细胞，弃上清并将细胞重悬于5ml缓冲液-I(培养物原初体积的5％—所有显示的体积为按100ml培养物体积计算所得)。缓冲液-I的组成：140.34g/l蔗糖，2.46g/l MgSO4·7H2O，10ml/l KH2PO4溶液(100g/l，用KOH调节至pH6.7)，50ml/l M12浓缩物(10g/l(NH4)2SO4，1g/lNaCl，2g/l MgSO4·7H2O，0.2g/l CaCl2，0.5g/l酵母提取物(Difco)，10ml/l痕量元素混合物(200mg/l FeSO4·H2O，10mg/l ZnSO4·7H2O，3mg/lMnCl2·4H2O，30mg/l H3BO3，20mg/l CoCl2·6H2O，1mg/l NiCl2·6H2O，3mg/l Na2MoO4·2H2O，500mg/l络合剂(EDTA或柠檬酸)，100ml/l维生素-混合物(0.2mg/l生物素，0.2mg/l叶酸，20mg/l对氨基苯甲酸，20mg/l核黄素，40mg/l泛酸钙，140mg/l烟酸，40mg/l维生素B6盐酸盐，200mg/l肌醇)。向悬液中加入溶菌酶至终浓度2.5mg/ml。在37℃孵育约4小时后，细胞壁降解，离心收获所得的原生质体。沉淀用5ml缓冲液-I洗一次并用5ml TE-缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8)洗一次。将沉淀重悬于4mlTE-缓冲液，并加入0.5ml SDS溶液(10％)和0.5ml NaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至终浓度200μg/ml后，将悬液在37℃孵育约18小时。使用标准方法用酚、酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇提取而纯化DNA。然后，加入1/50体积的3M醋酸钠和2体积的乙醇，于-20℃孵育30分钟，并在高速离心机上使用SS34转子(Sorvall)于12,000转/分离心30分钟，沉淀DNA。将该DNA溶于含20μg/ml RNaseA的1ml TE-缓冲液中，并用1000ml TE-缓冲液于4℃透析至少3小时。在此期间，更换缓冲液3次。向分装的0.4ml透析过的DNA溶液中加入0.4ml 2M LiCl和0.8ml乙醇。于-20℃孵育30分钟后，离心(13,000转/分，Biofuge Fresco，Heraeus，Hanau，德国)收集DNA。将该DNA沉淀溶于TE-缓冲液。用此方法制备的DNA可用于所有目的，包括southern印迹或构建基因组文库。
实施例2：在大肠杆菌中构建谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)的基因组文库
使用如实施例1所述制备的DNA，按照公知的且已建立的方法(参见例如，Sambrook，J.等人(1989)“分子克隆：实验室手册”，Cold Spring HarborLaboratory Press，或Ausubel，F.M.等人(1994)“分子生物学最新方法”，John Wiley&Sons.)构建粘粒和质粒文库。
可以使用任何质粒或粘粒。特别优选使用的是质粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75：3737-3741)；pACYC177(Change&Cohen(1978)细菌学杂志(J.Bacteriol)134：1141-1156)、pBS系列的质粒(pBSSK+，pBSSK-及其它；Stratagene，LaJolla，USA)、或粘粒如SuperCos1(Stratagene，LaJolla，USA)或Lorist6(Gibson，T.J.，Rosenthal A.和Waterson，R.H.(1987)基因(Gene)53：283-286。
实施例3：DNA序列测定和计算机功能分析
如实施例2所述的基因组文库按照标准方法用于DNA序列测定，尤其是使用ABI377序列测定仪通过链终止法测定(参见例如，Fleischman，R.D.等人(1995)“流感嗜血菌(Haemophilus Influenzae)Rd的全基因组随机序列测定和组装”，科学(Science)，269：496-512)。使用具有以下核苷酸序列的测序引物：5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’或5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。
实施例4：体内诱变
谷氨酸棒状杆菌的体内诱变可通过将质粒(或其它载体)DNA在不能维持其遗传信息完整性的大肠杆菌或其它微生物(例如芽孢杆菌属种或酵母如酿酒酵母)中传代而实施。通常的增变菌株在用于DNA修复系统的基因中有突变(例如mutHLS，mutD，mutT等；参考文献见Rupp，W.D.(1996)，大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella)中的DNA修复机制，ASM：Washington一书中的2277-2294页)。此类菌株为技术人员熟知。此类菌株的用途在例如Greener，A.和Callahan，M.(1994)Strategies 7：32-34中进行了阐述。
实施例5：在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌之间的DNA转移
几种棒状杆菌和短杆菌物种含有自主复制的内源质粒(例如pHM1519或pBL1)(综述参见例如，Martin，J.F.等人(1987)生物技术(Biotechnology)，5：137-146)。使用标准的大肠杆菌载体可以容易地构建用于大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体(Sambrook，J.等人(1989)，“分子克隆：实验室手册”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，或Ausubel，F.M.等人(1994)“分子生物学最新方法”(”Current Protocols in Molecular Biology”)，JohnWiley&Sons)，其中加入用于谷氨酸棒状杆菌中的复制起点和来自谷氨酸棒状杆菌的适当标记。此类复制起点优选取自从棒状杆菌和短杆菌分离的内源质粒。对于这些物种，作为转化标记尤其有用的是卡那霉素抗性基因(如源自Tn5或Tn903转座子的基因)或氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)”From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology，VCH，Weinheim)。在文献中有许多在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中均复制的多种穿梭载体的构建例子，这些载体可用于多种目的，包括基因过表达(参见例如，Yoshihama，M.等人(1985)细菌学杂志(J.Bacteriol.)162：591-597，Martin J.F.等人(1987)生物技术(Biotechnology)，5：137-146和Eikmanns，B.J.等人(1991)基因(Gene)，102：93-98)。
使用标准技术，可将目的基因克隆入上述的穿梭载体之一中并可将此杂合载体导入谷氨酸棒状杆菌菌株。谷氨酸棒状杆菌的转化可通过原生质体转化(Kastsumata，R.等人(1984)细菌学杂志(J.Bacteriol.)159，306-311)、电穿孔(Liebl，E.等人(1989)FEMS Microbiol.Letters，53：399-303)以及当使用特别的载体时，也可通过接合(如在Schfer，A等人(1990)细菌学杂志(J.Bacteriol.)172：1663-1666中所述)来完成。也可通过制备谷氨酸棒状杆菌的质粒DNA(使用本领域熟知的标准方法)并将其转化至大肠杆菌，将谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体转移至大肠杆菌中。该转化步骤可使用标准方法进行，但有利的是使用Mcr-缺陷的大肠杆菌菌株，如NM522(Gough&Murray(1983)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166：1-19)。
实施例6：测定突变蛋白质的表达
在转化的宿主细胞中对突变蛋白质活性的观察依赖于突变蛋白质与野生型蛋白质以相似的方式和相似的量表达的事实。确定突变基因的转录水平(指示可用于翻译为基因产物的mRNA量)的适宜方法是进行Northern印迹(参考文献见例如，Ausubel等人(1988)分子生物学最新方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Wiley：New York)，其中设计为与目的基因结合的引物用可检测标志(通常为放射性的或化学发光的)标记，这样当提取生物体培养物的总RNA、在凝胶上分级分离、转移至稳定的基质上并与该探针孵育后，探针的结合和结合量将指示该基因的mRN的存在和存在量。该信息指示了突变基因的转录程度。通过多种方法可从谷氨酸棒状杆菌中制备总细胞RNA，这些方法均为本领域熟知，如在Bormann，E.R.等人(1992)分子微生物学(Mol.Microbiol.)6：317-326中所描述的。
为了测定从该mRNA翻译的蛋白质的存在或相对量，可使用标准技术如Western印迹(参见例如，Ausubel等人(1988)分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley：New York)。在该方法中，提取细胞总蛋白质、通过凝胶电泳分离、转移至基质如硝化纤维素上并与能和目标蛋白质特异性结合的探针一起孵育，其中所述探针如抗体。该探针通常用易于检测到的化学发光或显色标记物标记。所观察到的标记物的存在和量将指示在细胞中目标突变蛋白质的存在和量。
实施例7：遗传改变的谷氨酸棒状杆菌的生长—培养基和培养条件
遗传修饰的棒状杆菌培养在合成或天然的生长培养基中。用于棒状杆菌的许多种不同生长培养基为人们熟知并易于获得(Lieb等人(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32：205-210；von der Osten等人(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；Patent DE 4,120,867；在《原核生物》(The Procaryotes)，Volume II，Balows，A.等人编辑.Springer-Verlag一书中的Liebl(1992)“棒状杆菌属”(“The Genus Corynebacteria”))。这些培养基由一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和痕量元素组成。优选的碳源是糖类，如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉和纤维素。也可通过复杂化合物如糖蜜或其它来自糖加工的副产品向培养基中提供糖。加入不同碳源的混合物也可能是有利的。其它可能的碳源为醇类和有机酸，如甲醇、乙醇、醋酸或乳酸。氮源通常为有机或无机氮化合物，或为包含这些化合物的物质。示例性氮源包括氨气和胺盐如NH4Cl或(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸盐、尿素、氨基酸和复杂氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏等。
可包括在培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、亚磷酸盐或硫酸盐。可向培养基中加入螯合物以维持溶液中的金属离子。尤其有用的螯合物包括二羟基酚，如儿茶酚或原儿茶酸盐，和有机酸如柠檬酸。培养基一般也包括其它生长因子如维生素或生长促进剂，其实例包括生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐和维生素B6。生长因子和盐常来自复杂的培养基组分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。培养基的确切组成强烈取决于具体实验并在每一具体情况下单独确定。有关培养基优化的信息在教科书“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury编辑，IRLPress(1997)53-73页，ISBN 0 19 9635773)中可找到。也可从供应商处得到生长培养基，如Standard1(Merck)或BHI(Brain heart infusion，DIFCO)等。
通过加热(1.5巴，121℃加热20分钟)或过滤除菌对所有的培养基组成成份进行灭菌。组成成份可一起灭菌，或需要的话分开灭菌。所有的培养基组成成份可在培养开始时存在，或它们可按需要连续加入或分批加入。
对每一实验分别确定培养条件。温度应在15℃和45℃的范围之间。在实验中温度可保持恒定或可改变。培养基的pH应在5至8.5的范围之间，优选地在7.0附近，可通过向培养基中添加缓冲液而维持。用于此目的的示例性缓冲液为磷酸钾缓冲液。可备选地或同时地使用合成的缓冲液如MOPS、HEPES、ACES和其它。在生长过程中通过加入NaOH或NH4OH也可维持恒定的培养pH。如果使用复杂的培养基组分如酵母提取物，可减轻对额外的缓冲液的需要，因为许多复杂化合物具有高缓冲容量。如果使用发酵罐培养微生物，用气态氨也可控制pH。
培养时间通常在几小时到几天之间。选择培养时间以允许肉汤中累积最大量的产物。可在多种容器如不同规格的微滴定板、玻璃管、玻璃烧瓶或玻璃或金属发酵罐中实施公开的生长实验。对于筛选大量的克隆，应在微滴定板、玻璃管或在有或没有挡板的摇瓶中培养微生物。优选地使用100ml摇瓶，其中装有10％(体积)的所需生长培养基。该烧瓶应在旋转振荡器(振幅25mm)上以100-300转/分摇动。可通过维持潮湿环境减少蒸发损失；备选地，对蒸发损失应进行数学上的校正。
如果研究经遗传修饰后的克隆，也应分析未修饰的对照克隆或含有无任何插入的基本质粒的对照克隆。使用已于30℃孵育的在琼脂板上生长的细胞接种培养基至OD600 0.5-1.5，其中所述琼脂板如CM板(10g/l葡萄糖，2.5g/l NaCl，2g/l尿素，10g/l聚胨，5g/l酵母抽取物，5g/l肉膏，22g/l琼脂，用2M NaOH调节至pH6.8)。培养基的接种通过导入来自CM板的谷氨酸棒状杆菌细胞的盐水溶液或添加该细菌的液体预培养物而完成。
实施例8：突变蛋白质功能的体外分析
本领域已建立了对酶活性和动力学参数的确定方法。为了确定特定的修饰的酶的活性，实验应加以修改以适应野生型酶的比活性，这在本领域普通技术人员的能力范围内。例如可在下列参考文献中找到对酶的一般性总结以及有关结构、动力学、原理、方法、应用和多种酶活性的测定例子的具体细节：Dixon，M.和Webb，E.C.，(1979)酶(Enzymes).Longmans：伦敦；Fersht，(1985)酶结构和机制(Enzyme Structure and Mechanism).Freeman：纽约；Walsh，(1979)酶促反应机制(Enzymatic ReactionMechanisms).Freeman：San Francisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)酶学基础(Fundamentals of Enzymology).Oxford Univ.Press：Oxford；Boyer，P.D.编辑(1983)酶(The Enzymes)，第三版，Academic Press：纽约；Bisswanger，H.，(1994)酶动力学(Enzymkinetik)，第二版.VCH：Weinheim(ISBN 3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.编辑(1983-1986)酶分析方法(Methods of Enzymatic Analysis)，第三版，I-XII卷，Verlag Chemie：Weinheim；以及Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)(1987)A9卷，”酶”.VCH：Weinheim，352-363页。
可通过几种已建立的方法测定结合DNA的蛋白质的活性，如DNA条带移位分析(也称为凝胶阻滞试验)。此类蛋白质对其它分子表达的影响可使用报告基因试验测定(如在Kolmar，H.等人(1995) EMBO J.14：3895-3904及其中所引用的参考文献中所述)。报告基因测试系统为人们所熟知，并被建立以应用于原核和真核细胞，其中使用酶如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和几种其它的酶。
可根据如在《生物膜，分子结构和功能》(Biomembranes，MolecularStructure and Function)，Springer：Heidelberg一书中的Gennis，R.B.(1989)”孔、通道和转运蛋白”，85-137；199-234和270-322页中所述的技术进行膜转运蛋白活性的测定。
实施例9：分析突变蛋白质对目标产物产生的影响
谷氨酸棒状杆菌中的遗传修饰对目标化合物(如氨基酸)产生的影响可通过如下方式评估：将经修饰的微生物在合适的条件(如上文中所描述的那些条件)下生长，并针对目标产物(即氨基酸)产生的增加来分析培养基和/或细胞成分。此类分析技术为本领域普通技术人员熟知，包括光谱学、薄层色谱法、多种显色法、酶学和微生物学方法、以及分析色谱法如高效液相色谱法(参见例如，Ullman工业化学百科全书(Ullman，Encyclopediaof Industrial Chemistry)，A2卷，89-90和443-613页，VCH：Weinheim(1985)；Fallon，A.等人(1987)《生物化学和分子生物学实验室技术》(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology)中的“HPLC在生物化学中的应用”，17卷；Rehm等人(1993)生物技术(Biotechnology)，3卷，III章“产物回收和纯化”，469-714页，VCH：Weinheim；Belter，P.A.等人(1988)生物分离：生物技术中的下游加工(Bioseparations：downstreamprocessing for Biotechnotogy)，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)生物物质的回收方法(Recovery processes forbiological materials)，John Wiley and Sons；在《Ulmann工业化学百科全书》一书中的Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化学分离，B3卷，11章，1-27页，VCH：Weinheim；以及Dechow，F.J.(1989)生物技术中的分离和纯化技术(Separation and purification techniques in biotechnology)，Noyes Publications.)。
除了测定发酵终产物外，还可分析用于产生目标化合物的代谢途径的其它成分如中间体和副产物来确定生物体的总体生产力和/或化合物的产率和/或生产效率。分析方法包括测定培养基中的营养素水平(例如，糖类、碳氢化合物、氮源、磷酸盐和其它离子)、测定生物量组成和生长、分析生物合成途径中共同代谢物的产生及测定发酵过程中产生的气体。这些测定的标准方法在《应用微生物生理学，实用方法》(Applied MicrobialPhysiology，A Practical Approach)，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury编辑，IRL Press，103-129；131-163和165-192页(ISBN：0199635773)及其引用的参考文献中描述。
实施例10：从谷氨酸棒状杆菌培养物中纯化目标产物
可通过多种本领域熟知的方法从谷氨酸棒状杆菌细胞或上述培养物上清回收目标产物。如果目标产物不从细胞向外分泌，可低速离心从培养物中收获细胞、用标准技术如机械力或超声裂解细胞。离心去除细胞碎片，保留含有可溶蛋白质的上清级分用于进一步纯化目标化合物。如果产物从谷氨酸棒状杆菌细胞分泌，则低速离心从培养物中去除细胞，并保留上清级分用于进一步纯化。
将来自任一种纯化方法的上清级分用合适的树脂进行层析，其中目标分子保留在层析树脂上而样本中的许多杂质不保留在层析树脂上，或者杂质保留在层析树脂上而样本不保留。此层析步骤必需时可使用相同或不同的层析树脂重复。本领域普通技术人员在选择合适的层析树脂以及将它们最有效地用于特定的待纯化分子方面是很精通的。可通过过滤或超滤浓缩纯化产物，并贮存在产物稳定性最大的温度下。
有大量的纯化方法为本领域公知，上述纯化方法为非限制性的。此类纯化技术例如在Bailey，J.E.和Ollis，D.F。生物化学工程基础(BiochemicalEngineering Fundamentals)，McGraw-Hill：纽约(1986)中描述。
分离的化合物的身份和纯度可通过本领域的标准技术评定。这些技术包括高效液相色谱(HPLC)、光谱法、显色法、薄层色谱法、NIRS、酶学试验或微生物学方法。此类分析方法编纂于：Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60：133-140；Malakhova等人(1996)生物技术(Biotekhnologiya)11：27-32；和Schmidt等人(1998)生物加工工程(Bioprocess Engineer)19：67-70；Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)(1996)A27卷，VCH：Weinheim，89-90页，521-540页，540-547页，559-566页，575-581页和581-587页；Michal，G.(1999)生物化学途径：生物化学和分子生物学图集(BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology)，John Wileyand Sons；《生物化学和分子生物学中的实验室技术》17卷中的Fallon，A.等人(1987)HPLC在生物化学中的应用。
等价方案
技术人员知道可通过简单地使用常规的实验确定本发明具体实施方案的大量等价方案。此类等价方案旨在包括在下面的权利要求书中。
表1中信息的理解如下：
在第1列“DNA ID”中，每种情况下相关数字指所附序列表的SEQID NO。所以，“DNA ID”列中的“5”指SEQ ID NO：5。
在第2列“AA ID”中，每种情况下相关数字指所附序列表的SEQ IDNO。因此，“AA ID”列中的“6”指SEQ ID NO：6。
在第3列“标识”中，列出了每个序列的明确的内部名称。
在第4列“AA pos”中，每种情况下相关数字指相同行中多肽序列“AAID”的氨基酸位置。所以，“AA pos”列中“26”是相应所示的多肽序列的氨基酸位置26。位置计算从N末端为+1开始。
在第5列“AA野生型”中，每种情况下相关字母指相应野生型菌株中位于第4列中所示的位置处的氨基酸(用单字母码表示)。
在第6列“AA突变”中，每种情况下相关字母指相应突变菌株中位于第4列中所示的位置处的氨基酸(用单字母码表示)。
在第7列“功能”中，列出了相应多肽序列的生理学功能。
蛋白原性氨基酸的单字母码：
A丙氨酸
C半胱氨酸
D天冬氨酸
E谷氨酸
F苯丙氨酸
G甘氨酸
H组氨酸
I异亮氨酸
K赖氨酸
L亮氨酸
M甲硫氨酸
N天冬酰胺
P脯氨酸
Q谷氨酰胺
R精氨酸
S丝氨酸
T苏氨酸
V缬氨酸
W色氨酸
Y酪氨酸
表1
编码葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶蛋白的基因
DNA ID：    AA ID：      标识      AA位置：    AA野生型    AA突变体       功能：
1           2          RXA02737    243         A           T           葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
序列表
<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)
<120>编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶蛋白的基因
<130>OZ0050/53030
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>1672
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221>5′UTR
<222>(1)..(100)
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(1645)
<220>
<221>3′UTR
<222>(1646)..(1672)
<400>1
agcacgctgc atcagtaacg gcgacatgaa atcgaattag ttcgatctta tgtggccgtt  60
acacatcttt cattaaagaa aggatcgtga cactaccatc gtg agc aca aac acg   l15
                                            Val Ser Thr Asn Thr
                                              1               5
acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac ccg cag gat aaa cga   163
Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp Pro Gln Asp Lys Arg
                 10                  15                  20
ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg atc ttc ggt gtc act   211
Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val Ile Phe Gly Val Thr
             25                  30                  35
ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca   259
Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala
         40                  45                  50
aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc   307
Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg
     55                  60                  65
cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca   355
Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala
 70                  75                  80                  85
agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc   403
Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu
                 90                  95                 100
gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct    451
Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala
            105                 110                 115
ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc    499
Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly
        120                 125                 130
acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc    547
Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe
    135                 140                 145
aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc    595
Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr
150                 155                 160                 165
gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac    643
Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn
                170                 175                 180
ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca    691
Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro
            185                 190                 195
gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt    739
Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val
        200                 205                 210
caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg    787
Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu
    215                 220                 225
tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg gct gaa gat    835
Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp
230                 235                 240                 245
att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc    883
Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala
                250                 255                 260
cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc    931
Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala
            265                 270                 275
atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag    979
Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys
        280                 285                 290
atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc   1027
Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr
    295                 300                 305
tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc   1075
Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val
310                 315                 320                 325
aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag   1123
Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu
                330                 335                 340
act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt    1171
Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly
            345                 350                 355
gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act    1219
Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr
        360                 365                 370
gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc    1267
Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly
    375                 380                 385
gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag     1315
Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln
390                 395                 400                 405
cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct    1363
Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser
                410                 415                 420
gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc    1411
Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser
            425                 430                 435
ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctc att ttg gat gcg    1459
Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala
        440                 445                 450
ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg    1507
Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu
    455                 460                 465
agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga    1555
Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly
470                 475                 480                 485
gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat    1603
Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp
                490                 495                 500
gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taa            1645
Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro
            505                 510                 515
tttaggggca aaaaatgatc tttgaac                                      1672
<210>2
<211>514
<212>PRT
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>2
Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp
  1               5                  10                  15
Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val
             20                  25                  30
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
         35                  40                  45
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
     50                  55                  60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
 65                  70                  75                  80
Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn
                 85                  90                  95
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
            100                 105                 110
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile
        115                 120                 125
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile
    130                 135                 140
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly
145                 150                 155                 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys
                165                 170                 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val
            180                 185                 190
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu
        195                 200                 205
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln
    210                 215                 220
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile
225                 230                 235                 240
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
                245                 250                 255
Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu
            260                 265                 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln
        275                 280                 285
Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
    290                 295                 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln
305                 310                 315                 320
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
                325                 330                 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser
            340                 345                 350
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
        355                 360                 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
    370                 375                 380
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser
                405                 4l0                 415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
            420                 425                 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
        435                 440                 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn
    450                 455                 460
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala
465                 470                 475             480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly
                485                 490             495
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
            500                 505             510
Arg Pro

Claims (8)

1.分离的核酸分子，其编码具有G6PD活性，并具有在每种情况下表1/第二列中所示的氨基酸序列的多肽，其中该核酸分子在表1/第4列所示氨基酸位置处编码与表1/第5列相同行中所示的特定氨基酸不同的蛋白原性氨基酸。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子在表1/第4列中所示的氨基酸位置处编码表1/第6列相同行中所示的氨基酸。
3.一种载体，其含有至少一种如权利要求1的核酸序列。
4.一种宿主细胞，其被至少一种如权利要求3的载体转染。
5.权利要求4的宿主细胞，其中所述核酸分子的表达调节所述细胞中精细化学品的生产。
6.一种生产精细化学品的方法，其包括培养用至少一种权利要求3的载体转染的细胞从而生产该精细化学品。
7.权利要求6的方法，其中精细化学品是氨基酸。
8.权利要求7的方法，其中所述氨基酸是赖氨酸。
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