KR20050044854A - 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소 단백질을 코딩하는유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표 1의 컬럼 2에 각각 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며, 표 1의 컬럼 4에 나타낸 아미노산 위치에서 그와 동일 열에 있는 표 1의 컬럼 5에 나타낸 특정 아미노산이 아닌 단백질원성 아미노산을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.

Description

글루코스-6-포스페이트-탈수소효소 단백질을 코딩하는 유전자 {Genes Coding for Glucose-6-Phosphate-Dehydrogenase Proteins}

세포에서 자연발생적으로 일어나는 대사 과정의 일부 산물 및 부산물은 식품, 사료, 화장품 및 제약 산업을 비롯한 다양한 산업 분야에 사용된다. 총체적으로 "정밀 화학물질"로 불리는 이들 분자로는 유기산, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 및 효소가 있다. 이들은 원하는 각각 특정의 경우에 분자를 대량으로 생산하고 분비하도록 개발된 세균의 대규모 배양을 통해 최고로 생산된다. 이러한 목적에 특히 적합한 유기체는 그람 양성의 비병원성 세균인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)이다. 균주 선별을 통해, 일련의 바람직한 화합물을 생산하는 다수의 돌연변이 균주가 개발되어 있다. 그러나, 특정 분자의 생산을 위해 개량된 균주의 선별은 시간 소모적이고 어려운 과정이다.

<발명의 개요>

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 관련 박테리아 종 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)의 동정 또는 분류를 위해 사용될 수 있는 신규 핵산 분자를 제공한다. 씨. 글루타미쿰은 그람-양성, 호기성 박테리아이고 다양한 정밀 화학물질의 대량 생산, 탄화수소의 분해 (예컨대, 원유 유출 경우) 및 테르페노이드의 산화를 위해 공업적으로 통상 사용된다. 따라서, 핵산 분자는 예를 들어, 발효 공정에 의해 정밀 화학물질을 생산하는 데 이용할 수 있는 미생물을 동정하는 데 사용할 수 있다. 씨. 글루타미쿰 자신이 비병원성이지만, 관련 다른 코리네박테리움 종, 예컨대 코리네박테리움 디프테리아에 (Corynebacterium diphteriae) (디프테리아 병원체)는 인간에서 주요 병원체이다. 따라서, 코리네박테리움 종의 존재의 동정능이 또한 예를 들면 진단 용도에서 임상적으로 상당히 중요할 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자는 씨. 글루타미쿰 게놈 또는 관련 유기체의 게놈의 맵핑하기 위한 기준점으로 제공될 수 있다.

이들 신규 핵산 분자는 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소 단백질이라 칭해지는 단백질을 코딩하고 있다.

코리네박테리아로부터의 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소 유전자는 예를 들면 EP 1108790A2에 기재되어 있다. 그러나, 그 문헌에 기재된 유전자는 본 발명에 따라 본원에 기재된 것보다 짧은 폴리펩티드 서열을 코딩한다. EP 1108790A2에 기재된 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소의 N 말단은 본원에 청구된 폴리펩티드 서열에 비해 30개의 아미노산 차이로 절단되어 있다.

문헌 [Moritz et al., Eur. J. Biochemistry 267, 3442-3452, 2000]에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소의 단리가 기재되어 있다. 그 문헌에 기재된 N-말단 단백질의 서열분석 결과, 폴리펩티드가 세린으로 시작하고, 본 발명의 단백질과는 상이하다.

본 발명은 위치 1 또는 2의 아미노산, 즉 Val 또는 Ser으로 시작하고, 위치 243에 Ala가 아닌 단백질원성 아미노산을 코딩하는, 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소에 대한 신규 유전자에 관한 것이다 (서열 2에 기초하여 넘버링).

위치 1의 아미노산으로 시작하고, 위치 243에 Thr을 코딩하는 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소에 대한 신규 유전자가 특히 바람직하다 (서열 2에 기초하여 넘버링).

본 발명의 핵산 분자는 유기체가 1종 이상의 정밀 화학물질의 더 양호하고 더 효율적인 생산자로 만들기 위한 유기체의 유전학적 조작에 사용될 수 있다. 본 발명의 분자를 변경시켜 1종 이상의 정밀 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 개선시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 분자는 씨. 글루타미쿰으로부터의 1종 이상의 정밀 화학물질의 생산 수율 및(또는) 속도에 영향을 주는 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 관련될 수 있다. 충분한 양의 당이 세포에 존재하는 경우 예를 들면, 세포외 배지로부터의 1종 이상의 당을 이입하기 위해 요구되는 단백질 (예컨대, Hpr, 효소 I 또는 효소 II 복합체의 구성성분)은 빈번하게 번역후 개질되어 더 이상 상기 당을 이입할 수 없다. 수송계가 스위치 오프된 때의 당의 양은 정상 세포 기능을 유지하기에 충분할지라도, 목적하는 정밀 화학물질의 과생산을 제한한다. 따라서, 본 발명의 단백질을 개질하여 이러한 음성 조절에 더 이상 반응하지 않게 하는 것이 추천된다. 그 결과, 1종 이상의 당의 더 높은 세포내 농도 및 연장에 의한 상기 돌연변이 단백질을 함유한 유기체로부터의 1종 이상의 정밀 화학물질의 더 효율적인 생산 또는 더 높은 수율을 달성할 수 있다.

첨부문서 A는 관련 위치의 서열 개질과 함께 서열목록의 핵산 서열을 하기에서 정의하고, 표 1에 기재한다.

첨부문서 B는 관련 위치의 서열 개질과 함께 서열목록의 폴리펩티드 서열을 하기에서 정의하고, 표 1에 기재한다.

추가 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 길이 15개 이상의 뉴클레오티드이고, 엄격한 조건 하에 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화된다. 단리된 핵산 분자는 바람직하게는 자연 발생 핵산 분자에 상응한다. 단리된 핵산은 더 바람직하게는 자연 발생 씨. 글루타미쿰 G6PD 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위를 코딩한다.

본 발명의 추가 측면은 본 발명의 핵산 분자를 함유한 벡터, 예를 들면 재조합 발현 벡터, 및 상기 벡터가 도입되는 숙주 세포에 관한 것이다. 일 실시양태에서, G6PD 단백질은 적합한 배지에서 배양된 이 숙주 세포를 사용하여 생산된다. G6PD 단백질은 이어서 배지 또는 숙주 세포로부터 단리될 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 G6PD 유전자가 도입되거나 또는 G6PD 유전자가 개질된 유전학적으로 개질된 미생물에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 상기 미생물의 게놈은 돌연변이된 G6PD 서열을 전이유전자로서 코딩하는 하나 이상 본 발명의 핵산 분자를 도입시킴으로써 개질된다. 또다른 실시양태에서, 상기 미생물의 게놈의 내생 G6PD 유전자는 개질된 G6PD 유전자를 사용하는 상동성 재조합에 의해 개질, 예를 들면 기능적으로 파괴된다. 바람직한 실시양태에서, 이 미생물은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하며, 코리네박테리아 글루타미쿰이 특히 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 이 미생물은 중요한 화합물, 예컨대 아미노산, 특히 바람직하게는 리신의 생산에도 사용된다.

또다른 바람직한 실시양태는 첨부문서 A에 기재된 하나 이상의 핵산 분자를 갖는 숙주 세포이다. 이러한 숙주 세포는 당업자에게 공지된 각종 방식으로 생산될 수 있다. 이 숙주 세포는 예를 들면, 몇몇 본 발명의 핵산 분자를 갖는 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 그러나, 각각의 경우에 본 발명의 하나의 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입시키기 위해 벡터를 사용할 수도 있고, 따라서 다수의 벡터를 동시에 또는 순차적으로 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다수, 수 백개 이하의 핵산 서열을 갖는 숙주 세포의 작제가 가능하다. 이러한 축적은 정밀 화학물질 생산성에 대해 숙주 세포에 추가 효과를 종종 만들 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 단리된 G6PD 단백질 또는 그의 부분, 예를 들면 생물학적 활성 부위에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 G6PD 단백질 또는 그의 부분은 씨. 글루타미쿰내로의 에너지-풍부 탄소 분자 (예컨대, 글루코스, 프럭토스 또는 수크로스)의 이입 및, 또한, 씨. 글루타미쿰의 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 관련될 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 G6PD 단백질 또는 그의 부분은 이 단백질 또는 그의 부분이 여전히 씨. 글루타미쿰내로의 에너지-풍부 탄소 분자 (예컨대, 글루코스, 프럭토스 또는 수크로스)의 이입 및(또는) 씨. 글루타미쿰의 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 참가할 수 있도록 첨부문서 B의 아미노산 서열에 대해 충분히 상동성이다.

또한, 본 발명은 단리된 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소 단백질 생산에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소 (G6PD) 단백질은 첨부문서 B의 아미노산 서열을 포함한다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 첨부문서 B의 완전 아미노산 서열 (첨부문서 A의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩됨)에 실질적으로 상동성인 단리된 전장 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 추가 측면은 정밀 화학물질의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 핵산 분자를 발현하는 벡터를 포함하는 세포를, 정밀 화학물질이 생산되도록 배양하는 것을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이 방법은 핵산을 발현하는 벡터로 세포를 형질감염시켜 상기 벡터를 함유하는 세포를 수득하는 단계도 포함한다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 추가로 정밀 화학물질을 배양액으로부터 수득하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속한다.

I. 정밀 화학물질

용어 "정밀 화학물질"은 당업계에 잘 인지되어 있고, 제약, 농업 및 화장품 산업과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 산업에 이용되는 유기체에 의해 생산되는 분자를 포함한다. 이러한 화합물로는 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산과 같은 유기산, 단백질원성 및 비단백질원성 아미노산, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드 [예를 들어, 문헌 (Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Editors. VCH: Weinheim 및 그의 참고문헌)에 기재되어 있음), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예컨대, 아라키돈산), 디올 (예를 들어, 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들어, 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들어, 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 [문헌 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim 및 그의 참고문헌; 및 Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research Asia, held Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)에 기재되어 있음], 효소 및 문헌 (Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086) 및 그의 참고문헌에 기재된 다른 모든 화학물질이 있다. 이들 정밀 화학물질의 대사 및 용도는 아래에 더 자세히 기재된다.

A. 아미노산 대사 및 용도

아미노산은 모든 단백질의 기본 구조 단위를 구성하므로 세포에서 정상적인 세포 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 인지되어 있다. 아미노산 중 단백질원성 아미노산은 20종이고 이들이 펩티드 결합에 의해 결합되어 있는 단백질에 대한 구조 단위로 작용하는 반면, 비단백질원성 아미노산 (수백 종이 공지되어 있음)은 정상적으로는 단백질에서 발견되지 않는다 [문헌 (Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985))을 참조함]. 비록 L-아미노산이 일반적으로 천연 발생 단백질에서 발견되는 유일한 형태일지라도 아미노산은 D 또는 L 구조로 존재할 수 있다. 20종의 단백질원성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로의 특징은 원핵세포 및 진핵세포 둘다에서 잘 규명되어 있다 [예를 들어, 문헌 (Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition, pp. 578-590 (1988))을 참조함]. 생합성의 복잡성으로 인한 일반적인 영양 요구물이기 때문에 "필수" 아미노산이라고 불리는 아미노산 (히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린)은 단순한 생합성 경로에 의해 나머지 11종의 "비필수" 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신)으로 전환된다. 고등동물은 필수 아미노산 중 일부를 합성하는 능력을 보유하지만, 상기 필수 아미노산은 음식물로부터 공급되어야 정상적인 단백질 합성이 일어난다.

단백질 생합성에서의 아미노산의 기능 이외에, 이들 아미노산은 그 자체가 흥미로운 화학물질이고, 다수의 아미노산이 식품, 사료, 화학물질, 화장품, 농업 및 제약 산업에 다양하게 사용될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 리신은 인간 뿐만 아니라 가금 및 돼지와 같은 단위 (monogastric) 동물의 영양에 있어서도 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 향미제 첨가물 (모노소듐 글루타메이트, MSG) 및 그외에 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시스테인도 식품 산업에 가장 흔히 사용된다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약 산업에 사용된다. 글루타민, 발린, 루이신, 이소루이신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 및 화장품 산업 둘다에 사용된다. 트레오닌, 트립토판 및 D/L-메티오닌은 통상적인 사료 첨가제이다 (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acid-technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al. (editors.) Biotechnology Vol. 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim). 또한, 이들 아미노산은 합성 아미노산 및 단백질, 예컨대, N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판, 및 문헌 (Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97, VCH: Weinheim, 1985)에 기재된 다른 것의 합성을 위한 전구체로 추가로 유용하다는 것이 밝혀져 있다.

이들 천연 아미노산을 생산할 수 있는 유기체, 예컨대, 세균에서의 이들 천연 아미노산의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 [세균 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 자세한 것은 문헌 (Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606)을 참조함]. 글루타메이트는 시트르산 사이클의 중간체인 α-케토글루타레이트의 환원 아미노화에 의해 합성된다. 그 다음에 글루타민, 프롤린 및 아르기닌 각각이 글루타메이트로부터 생성된다. 세린의 생합성은 3-포스포글리세레이트 (해당작용의 중간체)에서 시작되며, 산화, 트랜스아민화 및 가수분해 단계 후 세린을 생성하는 3 단계 과정에서 발생한다. 시스테인 및 글리신 둘다 세린으로부터 생성되는데, 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합에 의해 생성되며, 글리신은 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에서 측쇄 β-탄소 원자가 테트라히드로폴레이트로 전달되어 생성된다. 페닐알라닌 및 티로신은 프레페네이트의 합성 후 최종 두 단계에서만 9 단계 생합성 경로에서 해당작용 및 펜토스 포스페이트 경로 전구체, 및 에리쓰로스 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 트립토판도 이들 두 초기 분자로부터 합성되지만, 그의 합성은 11 단계 경로에 의해 합성된다. 티로신은 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 합성될 수도 있다. 알라닌, 발린 및 루이신은 해당작용의 최종 생성물인 피루베이트로부터 유도된 생합성 산물 각각이다. 아스파테이트는 시트르산 사이클의 중간체인 옥살아세테이트로부터 형성된다. 아스파라긴, 메티오닌, 트레오닌 및 리신 각각은 아스파테이트의 전환에 의해 생성된다. 이소루이신은 트레오닌으로부터 형성된다. 복잡한 9 단계 경로에서 활성화된 당인 5-포스포리보실-1-피로포스페이트로부터 히스티딘이 생성된다.

단백질 합성 필요량을 초과하는 아미노산의 양은 세포에 의해 저장될 수 없고, 그 대신에 분해되어 세포의 주요 대사 경로에 대한 중간체로 제공된다 [자세한 것은 문헌 (Stryer, L., Biochemistry, 3^rd edition, Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; pp. 495-516 (1988))을 참조함]. 세포가 불필요한 아미노산을 유용한 대사 중간체로 전환시킬 수 있다 하더라도, 아미노산 생성은 에너지, 전구체 분자, 및 이들 아미노산을 합성하는 데 필요한 효소를 고려할 때 손실이다. 따라서, 특정한 아미노산의 존재가 그 자신의 생성을 서서히 또는 완전히 중지시키는 피드백 억제에 의해 아미노산의 생합성이 조절된다는 것은 놀라운 일이 아니다 [아미노산 생합성 경로의 피드백 기작에 대한 전체적인 내용은 문헌 (Stryer, L., Biochemistry, 3^rd editior Chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988))을 참조함]. 따라서, 임의의 특정 아미노산의 산출량은 세포의 아미노산의 양에 의해 제한된다.

B. 비타민, 보조인자 및 영양제의 대사 및 용도

비타민, 보조인자 및 영양제는 또다른 군의 분자를 포함한다. 이들 분자가 세균과 같은 다른 유기체에 의해 쉽게 합성된다 하더라도 고등동물은 이들 분자를 합성하고 섭취해야 하는 능력을 상실하였다. 이들 분자는 그 자체가 생활성 물질이거나, 다양한 대사 경로에서 전자 담체 또는 중간체로 작용할 수 있는 생물 활성 물질의 전구체이다. 이들의 영양 가치 이외에, 이들 화합물은 색소, 항산화제 및 촉매로서, 또는 다른 과정의 보조제로서 상당한 산업적 가치를 갖는다 (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업적인 용도에 대한 것은 예컨대, 문헌 (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996)을 참조함]. 용어 "비타민"은 당업계에 인지되어 있고, 유기체의 정상적인 기능을 위해서는 필요하지만 유기체가 스스로 합성할 수 없는 영양분을 포함한다. 비타민 군은 보조인자 및 영양제 화합물도 포함할 수 있다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소 활성이 일어나는 데 필요한 비단백질원성 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 유기성 또는 무기성일 수 있고, 본 발명의 보조인자 분자는 유기성인 것이 바람직하다. 용어 "영양제"는 식물 및 동물, 특히 인간에게 건강상 유익한 식이성 보충물을 포함한다. 이러한 분자의 예로는 비타민, 항산화제 및 일부 지질 (예를 들어, 다불포화 지방산)이 있다.

이들을 생성할 수 있는 유기체, 예컨대, 세균에서 일어나는 이들 분자의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S).

티아민 (비타민 B₁)은 피리미딘과 티아졸 잔기의 화학적 커플링에 의해 생성된다. 리보플라빈 (비타민 B₂)는 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP) 및 리보스-5'-포스페이트로부터 합성된다. 그 다음, 리보플라빈은 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMN) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)의 합성에 사용된다. 총칭하여 "비타민 B₆"로 불리는 화합물 족 (예를 들어, 피리독신, 피리독사민, 피리독살-5'-포스페이트 및 시판되는 피리독신 히드로클로라이드)은 모두 통상적인 구조 단위인 5-히드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트 (판토텐산, (R)-(+)-N-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)은 화학적인 합성 또는 발효에 의해 생성될 수 있다. 판토테네이트의 생합성의 최종 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-유도 축합으로 구성된다. 판토산으로 전환하는 생합성 단계, β-알라닌으로 전환하는 생합성 단계 및 판토텐산으로의 축합에 관여하는 효소는 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사 활성 형태는 조효소 A인데, 이 조효소 A를 위한 생합성은 5 단계 효소 반응으로 진행된다. 판토테네이트, 피리독살-5'-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토테네이트의 형성을 촉매할 뿐만 아니라 (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀 (프로비타민 B₅), 판테테인 (및 그의 유도체) 및 조효소 A의 생성도 촉매한다.

미생물에서 전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터 비오틴이 생합성되는 것은 자세히 연구되어 있고 관련된 여러가지 유전자가 확인되어 있다. 상응하는 다수의 단백질이 Fe클러스터 합성에도 관여하는 것으로 밝혀져 있고 이들 단백질은 nifS 클래스 단백질의 구성원이다. 리포산은 옥타노산으로부터 유도되고, 에너지 대사에서 조효소로 작용하는데, 여기서 상기 리포산은 에너지 대사에서 피루베이트 탈수소효소 복합체 및 α-케토글루타레이트 탈수소효소 복합체의 일부이다. 폴레이트는 모두 폴산의 유도체 물질의 군이고, 폴산은 L-글루탐산, p-아미노벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유도된다. 생전환의 대사 중간체 산물인 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP), L-글루탐산 및 p-아미노벤조산으로부터 출발하는, 폴산 및 그의 유도체의 생합성은 특정 미생물에서 상세히 연구되어 있다.

코리노이드 (예컨대, 코발라민 및 특히 비타민 B₁₂) 및 포피린은 테트라피롤 고리계에 의해 특징지워지는 화학물질의 군에 속한다. 비타민 B₁₂의 생합성은 그 특징이 완전히 규명되어 있지는 않지만 다수의 효소 및 기질이 현재 공지되어 있다는 점에서 충분히 복잡하다. 니코틴산 (니코티네이트) 및 니코틴아미드는 "니아신"으로도 불리는 피리딘 유도체이다. 니아신은 중요한 조효소인 NAD (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드), NADP (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트) 및 그들의 환원형의 전구체이다.

이들 화합물의 대량 생산은 비록 이들 화학물질 중 일부, 예를 들어, 리보플라빈, 비타민 B₆, 판토테네이트 및 비오틴이 미생물의 대량 배양에 의해서도 생산된다 하더라도 무세포 화학 합성에 주로 의존한다. 비타민 B₁₂만이 발효에 의해 전적으로 생성되는데, 이는 비타민 B₁₂의 합성의 복잡성 때문이다. 시험관내 방법론은 재료 및 시간, 종종 많은 비용의 상당한 투입을 요구한다.

C. 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 대사 및 용도

퓨린 및 피리미딘 대사 유전자 및 이들의 대응하는 단백질은 종양 질환 및 바이러스 감염의 치료에 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 조효소 및 뉴클레오티드의 구성 성분인 질소 함유 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 질소 함유 염기, 오탄당 (RNA의 경우, 상기 당은 리보스이고; DNA의 경우, 상기 당은 D-데옥시리보스임) 및 인산으로 구성된, 핵산 분자의 기본 구조 단위를 포함한다. 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드의 전구체로 작용하지만 뉴클레오티드가 갖는 인산 잔기가 없는 분자를 포함한다. 이들 분자의 생합성을 억제하거나 핵산 분자를 형성하기 위한 이들 분자의 이동화를 억제함으로써, RNA 및 DNA 합성을 억제하는 것이 가능하고; 암세포에 표적화시키는 방식으로 상기 활성을 억제함으로써 종양 세포의 분열 및 복제 능력을 억제할 수 있다.

또한, 핵산 분자를 형성하기 보다는 에너지 저장물 (즉, AMP) 또는 조효소 (즉, FAD 및 NAD)로 작용하는 뉴클레오티드도 있다.

이들 화학물질이 퓨린 및(또는) 피리미딘 대사에 영향을 줌으로써 상기 의학적 증상에 사용될 수 있다는 것은 여러 가지 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, Christopherson, R.I. and Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents. "Med. Res. Reviews 10: 505-548). 퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 효소의 연구는 예를 들어, 면역억제제 또는 항증식제로 사용할 수 있는 신약의 개발에 초점을 두고 있다 (Smith, J.L., (1995) "Enzymes in Nucleotide Synthesis." Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 752-757; Simmonds, H.A. (1995) Biochem Soc. Transact. 23: 877-902). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 여러 가지 정밀 화학물질 (예를 들어, 티아민, S-아데노실메티오닌, 폴레이트 또는 리보플라빈)의 생합성에 있어서 중간체로서의 용도, 세포를 위한 에너지 캐리어 (예를 들어, ATP 또는 GTP)로서의 용도, 및 통상적으로 향 상승제 (예를 들어, IMP 또는 GMP)로 사용되는 화학물질 자체를 위한 용도 또는 여러 가지 의학 용도를 갖는다 [예를 들어, 문헌 (Kuninaka, A. (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology" Vol. 6, Rehm et al., Editors. VCH: Weinheim, pp. 561-612)을 참조함]. 또한, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 효소를 표적으로 사용하여 살진균제, 제초제 및 살충제를 비롯한, 농작물 보호용 화학물질을 개발하는 연구가 증가하고 있다.

세균에 있어서 이들 화합물의 대사의 특징은 규명되어 있다 (예를 들어, 자세한 내용은 문헌 (Zalkin, H. and Dixon, J.E. (1992) "De novo purine nucleotide biosynthesis", in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol. 42, Academic Press:, pp. 259-287; 및 Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides", Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York)을 참조함). 퓨린의 대사는 집중적인 연구의 대상이고, 세포의 정상적인 기능에 필수적이다. 고등 동물의 손상된 퓨린 대사는 통풍과 같은 심각한 질환을 초래할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP) 또는 아데노신-5'-모노포스페이트 (AMP)를 생성시키는 중간체 화합물인 이노신-5'-포스페이트 (IMP)를 통해 일련의 단계에서 리보스-5-포스페이트로부터 합성되고, 이들 GMP 또는 AMP로부터 뉴클레오티드로 사용되는 트리포스페이트가 용이하게 생성된다. 이들 화합물은 에너지 저장물로도 사용되므로, 이들의 분해는 세포에서 다수의 상이한 생합성 과정을 위한 에너지를 공급한다. 피리미딘 생합성은 리보스-5-포스페이트로부터의 우리딘 5'-모노포스페이트 (UMP)의 형성에 의해 진행된다. 그 다음, UMP가 시티딘 5'-트리포스페이트 (CTP)로 전환된다. 이들 모든 뉴클레오티드의 데옥시 형태는 뉴클레오티드의 디포스페이트 리보스 형태가 뉴클레오티드의 디포스페이트 데옥시리보스 형태로 전환되는 1 단계 환원 반응에서 생성된다. 인산화 후, 이들 분자는 DNA 합성에 관여할 수 있다.

D. 트레할로스의 대사 및 용도

트레할로스는 α,α-1,1 결합에 의해 결합된 두 가지 당 분자로 구성된다. 트레할로스는 감미료, 건조 또는 동결 식품용 첨가제로서 식품 산업, 및 음료 산업에 통상적으로 사용된다. 그러나, 제약, 화장품 및 생물공학 산업에도 사용된다 [예를 들어, 문헌 (Nishimoto et al., (1998) 미국 특허 제5,759,610호; Singer, M. A. and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. Biotech. Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; 및 Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102)을 참조함]. 트레할로스는 다수의 미생물로부터 효소에 의해 생성되고 주위 배지내로 자연적으로 방출되는데, 트레할로스는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 상기 배지로부터 단리할 수 있다.

II. 본 발명의 요소 및 방법

본 발명은 G6PD 핵산 및 G6PD-단백질 분자로 본원에 칭해지고, 씨. 글루타미쿰 내로의 에너지-풍부 탄소 분자 (예컨대, 글루코스, 수크로스 및 프럭토스)의 흡수와 관련되고, 이 미생물에서의 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로와 관련될 수도 있는 신규 분자의 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 일 실시양태에서, G6PD 분자는 그의 분해에 의해 생성되는 에너지가 에너지적으로 덜 선호되는 생화학 반응을 유도하는데 사용되는 세포 내로 에너지-풍부 탄소 분자를 이입시킨다. 그의 분해 산물은 다수의 다른 대사 경로에 대한 중간체 또는 전구체로서 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, G6PD 분자는 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 참여할 수 있고, 개질된 형태의 G6PD 분자 (예컨대, 인산화된 G6PD 단백질)의 존재는 하나 이상의 세포 과정을 조절하는 신호 전달 캐스케이드에 참여할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 G6PD 분자의 활성은 상기 유기체에 의한 목적하는 정밀 화학물질의 생산에 영향을 미친다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 G6PD 분자의 활성을 조정하여 씨. 글루타미쿰로부터의 1종 이상의 정밀 화학물질의 수율, 생산 또는 생산 효율을 마찬가지로 조정한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 G6PD 분자는 목적하는 분자, 예컨대 정밀 화학물질의 생산을 미생물, 예컨대 씨. 글루타미쿰에서 조정할 수 있다. 유전자 재조합 기술의 도움에 의해 본 발명의 하나 이상의 G6PD 단백질을 그의 기능이 조정되는 이러한 방식으로 조작할 수 있다. 예를 들면, 글루코스의 G6PD-매개 이입에 관련된 단백질을 개질시켜 최적 활성을 갖게 할 수 있고, 따라서 글루코스의 이입을 위한 G6PD 시스템은 더 많은 양의 글루코스를 세포에 전달할 수 있다. 글루코스 분자는 에너지적으로 비선호적인 생화학 반응, 예컨대 정밀 화학물질의 생합성에 대한 에너지원 뿐만 아니라 정밀 화학물질의 다수의 생합성 경로에서 전구체 및 중간체 (예를 들면, 세린은 3-포스포글리세라이트로부터 합성됨)로서 사용된다. 임의의 경우에, 일어나는 상기 생산에 사용가능한 에너지를 증가시키거나 또는 일어나는 상기 생산에 요구되는 화합물의 이용가능성을 증가시킴으로써 목적하는 이들 정밀 화학물질의 전체적인 수율 또는 속도를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 핵산 서열 제조에 대한 적합한 개시점은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 ATCC 13032로 입수할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 게놈이다.

본 발명의 핵산 서열은 통상의 방법을 사용하며 개질을 통해 표 1에 기재된 이들 핵산 서열로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 G6PD 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분 또는 단편은 씨. 글루타미쿰 내로의 에너지-풍부 탄소-함유 분자, 예컨대 글루코스의 전달 또는 이 미생물에서의 세포내 신호 전달에 관련될 수 있거나, 또는 표 1에 열거된 하나 이상의 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 다양한 측면은 하기 소단락에 보다 상세히 기재되어 있다.

A. 단리된 핵산 분자

본 발명의 한 측면은 G6PD 폴리펩티드 또는 그의 생물학적으로 활성인 일부를 코딩하는 단리된 핵산 분자 뿐만 아니라 G6PD-코딩 핵산 (예를 들어, G6PD DNA) 확인 또는 증폭을 위한 혼성화 프로브 또는 프라이머로 사용하기에 충분한 핵산 단편에 관한 것이다. 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예를 들어, mRNA), 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성되는 DNA 또는 RNA 유사체를 포함하는 의미이다. 이 용어에는 또한 유전자의 코딩 영역의 3' 및 5' 말단의 둘 다에 위치하는 비번역 서열, 코딩 영역의 5' 말단으로부터 상류의 약 100개 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 이 유전자의 코딩 영역의 3' 말단으로부터 하류의 약 20개 이상의 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되는 것이다. 바람직하게는, "단리된" 핵산은 이 핵산이 유도되는 생물의 게놈 DNA에서 본래 핵산의 양측면에 있는 서열 (즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)을 가지고 있지 않다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 단리된 G6PD 핵산 분자는 이 핵산이 유도되는 세포 (예를 들어, 씨. 글루타미쿰 세포)의 게놈 DNA에서 본래 핵산 분자의 양측면에 있는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 보다 작은 크기의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 게다가, "단리된" 핵산 분자, 예를 들어, cDNA 분자는, 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 또다른 세포 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.

표준 분자 생물학 기술 및 본원에 제공되는 서열 정보를 이용하여, 본 발명의 핵산 분자, 예를 들어, 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 일부를 단리할 수 있다. 예를 들어, 첨부문서 A로부터의 완전 서열 또는 그의 일부를 혼성화 프로브로 사용하고 표준 혼성화 기술 (예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같음)을 사용하여 씨. 글루타미쿰 뱅크로부터 씨. 글루타미쿰 G6PD cDNA를 단리할 수 있다. 더우기, 첨부문서 A로부터의 완전 서열 또는 그의 일부를 포함하는 핵산 서열을 기초로 하여 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 상기 핵산 분자를 단리할 수 있다 (예를 들면, 첨부문서 A의 이 동일 서열을 기초로하여 생산한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 통해 첨부문서 A로부터의 완전 서열 또는 그의 부분를 포함하는 핵산 분자를 단리할 수 있음). 예를 들어, mRNA는 정상 내피세포로부터 (예를 들어, 문헌[Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299]의 구아니디늄-티오시아네이트 추출 방법에 의해) 단리할 수 있고, cDNA는 역전사효소(예를 들어, Gibco/BRL(Bethesda, MD)로부터 입수가능한 몰로니(Moloney) MLV 역전사효소; 또는 세이까가꾸 아메리카, 인크.(Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL)로부터 입수가능한 AMV 역전사효소)를 사용하여 제조할 수 있다. 첨부문서 A에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나를 기초로 하여 중합효소 연쇄반응 증폭을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 생산할 수 있다. 본 발명의 핵산은 cDNA 또는, 별법으로, 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 표준 PCR 증폭 기술에 따라 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산을 적절한 벡터내에 클로닝하고 DNA 서열 분석에 의해 특성화할 수 있다. 또한, G6PD 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 표준 합성 기술, 예를 들어, 자동 DNA 합성기를 사용하여 제조할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 첨부문서 A에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함한다.

추가로 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 첨부문서 A에 나타낸 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분에 상보성인 핵산 분자를 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자는 첨부문서 A에 나타낸 임의의 서열과 혼성화되어 안정한 이중나선을 생성하기에 첨부문서 A에 나타낸 임의의 뉴클레오티드 서열에 대해 충분히 상보성이다.

일 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 씨. 글루타미쿰 내로의 에너지-풍부 탄소 분자 (예컨대, 글루코스)의 전달 및 또한 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 여전히 참여할 수 있는 단백질 또는 그의 부분에 대한, 첨부문서 B의 아미노산 서열에 충분히 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그의 부분을 코딩한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "충분히 상동성인"이란 첨부문서 B의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 서열이 동일 또는 동등한 최소 수의 아미노산 잔기 (예를 들어, 첨부문서 B의 서열 중 하나의 서열에서의 하나의 아미노산 잔기와 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)를 가져서 단백질 또는 그의 부분이 씨. 글루타미쿰 내로 에너지-풍부 탄소 분자, 예컨대 글루코스를 전달하고, 또한 이 미생물에서의 세포내 신호 전달에 참여할 수 있는 단백질 또는 그의 부분에 관한 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 대사 경로의 단백질 성분은 씨. 글루타미쿰 내로 에너지-풍부 탄소-함유 분자, 예컨대 글루코스를 전달하고, 이 미생물에서의 세포내 신호 전달에 관련될 수도 있다. 따라서, "G6PD 단백질의 기능"은 포스포에놀피루베이트를 기재로 하는 1종 이상의 당 전달 경로의 완전한 기능 및(또는) 조절에 관한 것이다. 표 1은 G6PD 단백질 활성의 실례를 열거한다.

본 발명의 G6PD 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질의 부분은 바람직하게는 G6PD 단백질 중 하나의 생물학적으로 활성인 부분이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "G6PD 단백질의 생물학적으로 활성인 부분"은 씨. 글루타미쿰 내로 에너지-풍부 탄소-함유 분자, 예컨대 글루코스를 전달하거나 또는 이 미생물에서의 세포내 신호 전달에 관련될 수 있거나, 또는 표 1에 나타낸 활성을 갖는 G6PD 단백질의 부분, 예를 들어, 도메인 또는 모티프를 포함한다. G6PD 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위가 씨. 글루타미쿰 내로의 에너지-풍부 탄소-함유 분자 예컨대 글루코스의 전달 또는 이 미생물에서의 세포내 신호 전달에 관련될 수 있는지를 결정하기 위해, 효소 활성 분석을 수행할 수 있다. 실시예 8에 상세히 기개된 바와 같이 이들 분석 방법은 당업자에게 친숙하다.

개체에 존재할 수 있는 G6PD 서열의 자연 발생 변이체 외에, 당업자는 마찬가지로 상기 G6PD 단백질의 기능의 손상 없이 돌연변이로 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열을 변화시켜서, 코딩된 G6PD 단백질의 아미노산 서열 변화를 유도할 수 있다는 사실을 인식하고 있다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 일으키는 뉴클레오티드 치환이 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열에서 일어날 수 있다. "비필수 아미노산" 잔기가 상기 G6PD 단백질의 활성을 변화시키지 않으면서 G6PD 단백질 (첨부문서 B) 중 하나의 야생형 서열로부터 개질될 수 있는 잔기인 반면 "필수" 아미노산 잔기는 G6PD 단백질 활성에 요구된다. 그러나, 다른 아미노산 잔기 (예를 들어, G6PD 활성을 갖는 도메인에서 보존되지 않거나 또는 반보존된 아미노산 잔기)는 활성에 필요하지 않을 수도 있으며, 따라서 G6PD 활성을 변화시키지 않으면서도 변화시킬 수 있다.

코딩된 단백질 내에 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 도입되도록 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가 또는 결실을 도입시킴으로써, 첨부문서 B의 단백질 서열과 상동성인 G6PD 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 생성시킬 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법과 같은 표준 기술에 의해 첨부문서 A의 서열 중 하나에 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 예상되는 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 보존된 아미노산 치환을 수행할 수 있다. "보존된 아미노산 치환"이란 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 군에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, G6PD 단백질에서 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 군으로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 또다른 실시양태에서, 돌연변이는, 예를 들어, 포화 돌연변이유발법에 의해 G6PD 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 도입될 수 있으며, G6PD 활성을 보유하는 변이체를 동정하기 위해, 생성된 변이체를 본원에 기재된 G6PD 활성에 대하여 시험할 수 있다. 첨부문서 A의 임의의 서열을 돌연변이 유발시킨 다음, 코딩된 단백질을 재조합적으로 발현시킬 수 있고, 예를 들어 본원에 기재된 분석법을 이용하여 상기 단백질의 활성을 측정할 수 있다 (실시예 8 참조).

B. 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포

본 발명의 다른 측면은 G6PD 단백질 (또는 그의 부분)을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다. 본원에서 사용하는 용어 "벡터"는 그에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자에 관한 것이다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"란 추가의 DNA 단편이 라이게이션될 수 있는 환형 이중쇄 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터이고 추가의 DNA 단편을 바이러스 게놈 내로 라이게이션시킬 수 있다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제 능력이 있다 (예, 세균 복제 개시점을 가진 세균 벡터 및 포유류의 에피솜 벡터). 다른 벡터 (예, 포유류의 비-에피솜 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 게놈 내로 삽입되고, 이렇게 함으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 본 명세서에서는 그러한 벡터를 "발현 벡터"로 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용하는 발현 벡터는 플라스미드의 형태를 갖는다. 플라스미드는 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에, 본 명세서에서는 "플라스미드"와 "벡터"를 혼용할 수 있다. 본 발명에는 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터 (예, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노 바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함된다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 핵산의 발현에 적합한 형태인 본 발명의 핵산을 포함하며, 즉 적합한 형태란 상기 재조합 발현 벡터가 발현용 숙주 세포를 기준으로 선택된 하나 이상의 조절 서열 (발현되는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결됨)을 함유하고 있음을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"이란 목적하는 뉴클레오티드 서열이 발현 가능하도록 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미한다 (예, 시험관내 전사/번역 시스템 내 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내). 용어 "조절 서열"이란 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소 (예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것이다. 그러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열에는 다수의 숙주 세포 유형 내에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 것과 단지 특정 숙주 세포 내에서의 뉴클레오티드 서열을 발현하는 것이 포함된다. 당업자는 발현 벡터 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 정도 등과 같은 인자들에 따라 다를 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입됨으로써 본 명세서에 기술된 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 비롯한 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다 (예, G6PD 단백질, G6PD 단백질의 돌연변이형, 융합 단백질 등).

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서의 G6PD 단백질 발현용으로 설계될 수 있다. 예를 들어, G6PD 유전자는 씨. 글루타미쿰과 같은 세균 세포, 곤충 세포 (바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 및 다른 진균류 세포 (문헌 [Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet ＆ L.L. Lasure, Editors, pp. 396-428: Academic Press: San Diego; 및 van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Editors, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 참조), 조류 및 다세포 식물 세포 (문헌 [Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefactiens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.:583-586] 참조) 또는 포유류 세포 내에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 더 기술되어 있다. 별법으로, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 재조합 발현 벡터를 시험관 내에서 전사 및 번역시킬 수 있다.

원핵 세포 내에서 단백질을 발현시키는 것은 대체로 융합 또는 비-융합 단백질이 발현되도록 하는 구성적 또는 유도적 프로모터 함유 벡터로 수행한다. 융합 벡터는 그의 코딩되는 단백질에, 일반적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단에 다수의 아미노산을 조절한다. 그러한 융합 벡터는 전형적으로 세 가지 목적: 1) 재조합 단백질의 발현 증가, 2) 재조합 단백질의 가용성 증가 및 3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함에 의한 재조합 단백질 정제 상의 용이함을 위한 것이다. 대개 융합 발현 벡터 내에서는 융합 단위와 재조합 단백질의 접합부에 단백질 절단 부위가 도입되어 있어서 융합 단백질을 정제한 후 융합 단위로부터 재조합 단백질을 분리하는 것이 가능하다. 그러한 효소 및 그의 상응하는 인식 서열에는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제가 포함된다.

전형적인 융합 발현 벡터에는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; 문헌 [Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40] 참조), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)가 포함되며, 이들은 각각 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E-결합 단백질 또는 단백질 A를 재조합 표적 단백질에 융합시킨다. 한 실시양태에서는 G6PD 단백질의 코딩 서열을 pGEX 발현 벡터 내로 클로닝하여 N-말단 내지 C-말단에 GST-트롬빈 절단 부위-X 단백질을 함유하는 융합 단백질 코딩 벡터를 생성하였다. 상기 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 수지를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. GST에 융합되지 않은 재조합 G6PD 단백질은 융합 단백질을 트롬빈으로 절단함으로써 얻을 수 있다.

적합한 유도적 비-융합 대장균 발현 벡터의 예로는 pTrc (문헌 [Amann et al.,(1988) Gene 69:301-315] 참조) 및 pET 11d (문헌 [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89]가 있다. pTrc로부터 표적 유전자가 발현되는 것은 혼성 trp-lac 융합 프로모터를 통한 숙주의 RNA 중합효소 전사에 의한 것이다. pET 11d 벡터로부터 표적 유전자가 발현되는 것은 T7-gn10-lac 융합 프로모터를 통한 동시 발현된 바이러스 RNA 중합효소 (T7 gn1)로 매개되는 전사에 의한 것이다. 이 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 조절 하에 T7 gn1 유전자를 함유하는 상재 λ프로파지로부터 숙주 균주 BL 21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다.

재조합 단백질의 발현을 극대화하는 전략의 일환으로 재조합 단백질을 단백질 분해에 의해 절단하는 능력을 감소시킨 숙주 세균 내에서 상기 단백질을 발현시키는 것이 있다 (문헌 [Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128] 참조). 다른 전략으로는 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변형하여 각각의 아미노산에 대한 개별적인 코돈이 발현을 위해 선택된 세균 (예를 들어, 씨. 글루타미쿰)가 선호하는 코돈이 되도록 하는 것이 있다 (문헌 [Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118] 참조). 본 발명의 핵산 서열을 변형하는 것은 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행될 수 있다.

다른 실시양태에서, G6PD 단백질 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스. 세레비지애의 발현 벡터의 예로는 pYepSec1 (문헌 [Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (문헌 [Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30:933-943] 참조), pJRY88 (문헌 [Shultz et al. (1987) Gene 54:113-123] 참조) 및 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)가 포함된다. 사상 진균류와 같은 다른 진균류용으로 적절한 벡터 및 벡터의 제조 방법으로는 문헌 [van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Editors, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]에 상술된 것들이 포함된다.

별법으로, 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 G6PD 단백질을 곤충 세포 내에서 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포 (예, Sf9 세포)에서의 단백질 발현용 바큘로바이러스 벡터에는 pAc계 (문헌 [Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 참조) 및 pVL계 (문헌 [Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39] 참조)가 포함된다.

다른 실시양태에서는 단세포 식물 세포 (예를 들어, 조류) 또는 고등 식물 (예, 작물 식물과 같은 종자 식물)로부터의 세포 내에서 본 발명의 G6PD 단백질을 발현시킬 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 문헌 [Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197], 문헌 [Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721]에 상술된 것들이 포함된다.

또 다른 실시양태에서는 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포 내에서 본 발명의 핵산을 발현시킨다. 포유류 발현 벡터의 예로는 pCDM8 (문헌 [Seed, B. (1987) Nature 329:840] 참조) 및 pMT2PC (문헌 [Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195] 참조)가 포함된다. 포유류 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 대개 바이러스 조절 요소에 의한 것이다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된 것이다. 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에 적합한 다른 발현계에 대해서는 문헌 [Chapters 16 and 17 of Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. Edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]을 참조한다.

다른 실시양태에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 바람직하게는 특정 세포 유형에서 핵산의 발현을 가능하게 한다 (예, 조직-특이적 조절 요소가 핵산을 발현시키는데 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적 프로모터에 대한 제한되지 않는 예로는 알부민 프로모터 (간-특이적; 문헌 [Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277] 참조), 림프양-특이적 프로모터 (문헌 [Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275] 참조), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (문헌 [Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733] 참조)와 이뮤노글로불린의 프로모터 (문헌 [Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740], 문헌 [Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748] 참조), 뉴런-특이적 프로모터 (예, 뉴로필라멘트 프로모터; 문헌 [Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477] 참조), 췌장-특이적 프로모터 (문헌 [Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916] 참조) 및 유선-특이적 프로모터 (예, 유청 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 번호 제264,166호 참조)가 포함된다. 또한, 발생-조절 프로모터, 예를 들어 쥐의 hox 프로모터 (문헌 [Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379] 참조) 및 α-페토프로테인 프로모터 (문헌 [Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546] 참조)도 포함된다.

본 발명은 안티센스 방향으로 발현 벡터 내에서 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 함유하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다. 즉, 상기 DNA 분자는 G6PD mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 (상기 DNA 분자의 전사에 의한) 발현이 가능하도록 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 작동 가능하게 연결되고 다양한 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자의 연속 발현을 조절하는 조절 서열을 선택할 수 있는데, 예를 들어 바이러스 프로모터 및(또는) 인핸서, 또는 안티센스 RNA의 구성적, 조직-특이적 또는 세포형 특이적 발현을 조절하는 조절 서열을 선택할 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 고효율의 조절 영역의 조절 하에서 안티센스 핵산을 생산하는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화 바이러스의 형태일 수 있으며, 그 활성은 상기 벡터가 도입된 세포 유형에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하여 유전자 발현을 조절하는 것에 대해서는 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참조한다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 혼용되고 있다. 그러한 용어는 특정 대상 세포를 지칭할 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손도 의미하는 것으로 이해한다. 세대를 지나면서 돌연변이나 환경의 영향으로 인해 특정 변형이 나타날 수 있기 때문에, 사실 그러한 자손은 부모 세포와 동일하지 않지만, 여전히 본 명세서에서 사용하는 용어의 범위에 포함된다.

숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, G6PD 단백질은 씨. 글루타미쿰과 같은 세균 세포, 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포 (예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 COS 세포) 내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질 분자를 위한 숙주 세포로서 적합한 방식으로 사용할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 관련 미생물이 표 3에 기재되어 있다.

벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "형질전환", "형질감염", "접합" 및 "형질도입"이란 이종 핵산 (예, DNA)을 숙주 세포 내에 도입하는 다양한 공지 기술을 의미하는 것이며, 천연 수용법 (natural competence), 화학적 매개 전달법, 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 동시 침전법, DEAE-덱스트란-경유 형질감염법, 리포펙션법 (lipofection) 또는 전기천공법이 포함된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 적합한 방법은 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)] 및 다른 실험 안내서에서 찾을 수 있다.

포유류 세포의 안정적 형질감염에 대해서는, 사용된 발현 벡터와 이용된 형질감염 기술에 따라, 단지 일부 소수 세포만이 그의 게놈 내로 이종 DNA를 삽입할 수 있다는 것이 알려져 있다. 이들 통합체를 확인하고 선별하기 위해, 일반적으로 선별 가능 표지 (예, 항생제 내성)를 코딩하는 유전자를 목적 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입시킨다. 바람직한 선별 가능 표지에는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선별 가능 표지를 코딩하는 핵산은 G6PD 단백질을 코딩하는 그 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 또는 별도의 벡터 상에서 도입될 수도 있다. 도입된 핵산이 안정적으로 형질감염된 세포는, 예를 들어 약물 선별을 통해 동정할 수 있다 (예, 선별 가능 표지 유전자가 혼입된 세포는 생존할 것이나, 그렇지 않은 다른 세포는 사멸함).

상동성 재조합 미생물을 제조하기 위해서, 결실, 부가 또는 치환을 도입시켜 G6PD 유전자를 변형 (예, 기능을 파괴)시킨 하나 이상의 G6PD 유전자를 함유하는 벡터를 제조한다. 바람직하게는 이 G6PD 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 G6PD 유전자이지만, 관련 세균으로부터의 상동체, 또는 포유류, 효모 또는 곤충 기원의 상동체도 사용할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 상동성 재조합에 의해 내생성 G6PD 유전자가 기능적으로 파괴 (즉, 더이상 기능적 단백질을 코딩하지 않음, "녹 아웃 (knock-out)" 벡터로도 지칭함)되도록 설계된다. 별법으로, 상기 벡터는 상동성 재조합에 의해 내생성 G6PD 유전자가 돌연변이되거나 달리 변형되었지만 여전히 기능적 단백질을 코딩 (즉, 상류 조절 영역이 변형되어 내생성 G6PD 단백질의 발현이 변형될 수 있음)하도록 설계된다. 상동성 재조합 벡터에는 변형된 G6PD 유전자 단편의 5' 및 3' 말단의 측면에 G6PD 유전자의 추가적인 핵산이 자리하여 벡터에 의해 운반된 외래 G6PD 유전자와 미생물 내의 내생성 G6PD 유전자 사이에 상동성 재조합이 일어날 수 있다. 추가된 측면 G6PD 핵산은 내생성 유전자와 성공적으로 상동성 재조합 되기에 충분한 길이를 갖는다. 전형적으로, 수 킬로베이스 미만의 측면 DNA (5' 및 3' 말단 둘 다)가 상기 벡터 내에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해 기술하는 문헌 [Thomas, K.R., and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503] 참조). 상기 벡터는 (예, 전기천공법에 의해) 미생물 내로 도입되고, 도입된 G6PD 유전자와 내생성 G6PD 유전자가 상동성 재조합된 세포를 당업계에 공지된 기술에 의해 선별한다.

또다른 실시양태에서, 도입된 유전자의 발현을 조절할 수 있도록 선별된 시스템을 함유하는 재조합 미생물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 벡터에 lac 오페론의 조절 하의 G6PD 유전자의 삽입은 오직 IPTG의 존재 하에서만 G6PD-유전자를 발현되게 할 수 있다. 이들 조절 시스템은 당업계에 공지되어 있다.

배양된 원핵 또는 진핵 숙주 세포와 같은 본 발명의 숙주 세포는 G6PD 단백질을 생산 (즉, 발현)에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 이용한 G6PD 단백질의 생산 방법을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 (G6PD 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되거나, 야생형 또는 변형된 G6PD 단백질을 코딩하는 유전자가 게놈 내로 도입된) 숙주 세포를 G6PD 단백질이 생산될 때까지 적합한 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 상기 배지 또는 숙주 세포로부터 G6PD 단백질을 단리하는 것을 추가로 포함한다.

C. 본 발명의 용도 및 방법

본원에 기재한 핵산 분자, 단백질, 단백질 상동체, 융합 단백질, 프라이머, 벡터 및 숙주 세포는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 관련된 유기체의 동정, 씨. 글루타미쿰과 관련된 유기체의 게놈 맵핑, 씨. 글루타미쿰의 목적 서열의 동정 및 위치 확인, 진화 연구, 기능에 필요한 G6PD 단백질 부위의 결정, G6PD 단백질의 활성 조절, G6PD 대사 경로의 활성 조절 및 정밀 화학 물질과 같은 목적 화합물의 세포 생산 조절 등의 방법 중 하나 이상에 사용할 수 있다. 본 발명의 G6PD 핵산 분자는 다수의 용도를 가진다. 첫 번째, 본 발명의 G6PD 핵산 분자는 유기체를 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 가까운 관계물로서 동정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 G6PD 핵산 분자는 미생물의 혼합된 개체들 중에서 씨. 글루타미쿰 또는 그의 관계물의 존재를 동정하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명은 다수의 씨. 글루타미쿰 유전자의 핵산 서열을 제공한다. 이 유기체에 특이적인 씨. 글루타미쿰 유전자의 영역을 포함하는 프로프를 사용하여 엄격한 조건 하에 미생물의 동질 또는 혼합된 개체의 배양의 추출된 게놈 DNA를 탐침함으로써 상기 유기체의 존재를 결정하는 것이 가능하다. 코리네박테리움 글루타미쿰 자신이 비병원성이지만, 병원성 종, 예컨대 코리네박테리움 디프테리아에 관련된다. 이러한 유기체의 탐지는 실질적으로 임상상 중요하다.

본 발명의 핵산 및 단백질 분자는 게놈의 특정 영역에 대한 마커로서 제공될 수 있다. 이는 게놈의 맵핑 뿐만 아니라 씨. 글루타미쿰 단백질의 기능 연구에 유용하다. 특정 씨. 글루타미쿰 DNA-결합 단백질이 결합하는 게놈 영역을 예를 들면 씨. 글루타미쿰 게놈을 절단하고 단편을 DNA-결합 단백질과 단편과 인큐베이션하여 동정할 수 있다. 이 단백질이 결합하는 이들 단편을 본 발명의 핵산 분자로, 바람직하게는 즉석 탐지가능한 표지를 사용하여 추가로 탐지할 수 있으며; 게놈 단편에 대한 이러한 핵산 분자의 결합은 씨. 글루타미쿰 게놈의 맵 상에 단편을 위치화시킬 수 있게 하고, 상이한 효소를 사용하는 과정을 수회 수행하는 경우 단백질이 결합하는 핵산 서열의 순간적인 결정을 쉽게 한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자는 이들 핵산 분자에 대한 관련 종의 서열에 충분히 상동성이어서 관련된 박테리아, 예컨대 브레비박테리움 락토페르멘툼의 게놈 맵을 작제하기 위한 마커를 제공할 수 있다.

본 발명의 G6PD 핵산 분자는 마찬가지로 진화 연구 및 단백질 구조 연구에 적합하다. 본 발명의 분자가 관련된 당 흡수에 관한 시스템은 다수의 박테리아에 의해 사용되며; 본 발명의 핵산 분자의 서열을 다른 유기체의 유사한 효소를 코딩하는 것과 비교하여 상기 유기체의 진화 관련성 정도를 결정할 수 있게 한다. 상응하게, 이러한 비교는 서열 영역이 보존되거나 되지 않은 것을 결정할 수 있게 하고, 이는 효소 기능이 필수인 이들 단백질 영역의 결정을 도울 수 있다. 이 유형의 결정은 단백질 가공 연구에 대해 가치있고, 상기 단백질이 그의 기능 손실 없이 허용될 수 있는 돌연변이유발 정도를 나타낼 수 있다.

본 발명의 G6PD 핵산 분자의 조작은 야생형 G6PD 단백질과 기능적으로 상이한 G6PD 단백질을 생성할 수 있다. 그의 효율 또는 활성과 관련하여 개선될 수 있는 이들 단백질은 보통 세포보다 더 많은 양으로 세포에 존재할 수 있거나 또는 그의 효율 또는 활성과 관련하여 약화될 수 있다.

본 발명의 G6PD 분자는 1종 이상의 정밀 화학물질의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율이 개선되는 이러한 방식으로 개질될 수 있다. 그에 대한 글루코스의 흡수와 관련된 G6PD 단백질을 개질하여 최적 활성을 가져서 글루코스 흡수의 정도 또는 글루코스가 세포 내로 전달되는 속도를 증가시킬 수 있다. 세포 내부에서의 글루코스 및 다른 당의 분해는 에너지적으로 비선호적인 생화학 반응, 예컨대 정밀 화학물질의 생합성에 관련된 것을 유도하는데 사용될 수 있는 에너지를 제공한다. 상기 분해는 마찬가지로 특정 정밀 화학물질, 예컨대 아미노산, 비타민 및 보조인자의 생합성에 대한 중간체 및 전구체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 G6PD 분자의 개질을 통해 세포내 에너지-풍부 탄소 분자의 양을 증가시켜 1종 이상의 정밀 화학물질 및 또한 상기 생산에 요구되는 대사의 세포내 풀의 생산에 요구되는 대사 경로의 수행에 사용가능한 에너지를 증가시킬 수 있다. 거꾸로, 목적하는 정밀 화학물질의 생산하기 위한 대사 경로를 갖는 효소, 보조인자 또는 중간체와 경쟁하는 대사 경로에서만 사용되는 화합물을 포함하는 당의 이입을 더 저하시켜 상기 대사 경로를 하향조절하므로 목적하는 생합성 경로에 의해 생산을 아마 증가시킬 수 있다.

본 발명의 G6PD 분자는 씨. 글루타미쿰으로부터의 1종 이상의 정밀 화학물질의 수율 및(또는) 속도에 영향을 주는 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 관련될 수 있다. 예를 들면, 세포외 배지로부터의 1종 이상의 당의 이입에 요구되는 단백질 (예컨대, HPr, 효소 I 또는 효소 II 복합체의 구성성분)은 세포에 충분한 양의 상기 당의 존재시에 빈번하게 번역후 개질되어 더 이상 상기 당을 이입할 수 없다. 이 실례는 대장균에서 일어나며, 이 대장균에서 세포내 프럭토스 1,6-비스포스페이트의 고수준이 HPr의 세린 46을 인산화시킨 후에 상기 분자는 더 이상 당의 전달에 참여할 수 없다. 수송계가 스위치 오프된 때에 이 세포내 당 수준이 정상 세포 기능을 유지하기에 충분할지라도 목적하는 정밀 화학물질의 과생산은 제한된다. 따라서, 이러한 음성 조절이 더 이상 가능하지 않게 본 발명의 G6PD 단백질을 개질하는 것이 바람직하다. 그 결과, 1종 이상의 당의 더 높은 세포내 농도 및 연장에 의한 이들 돌연변이 G6PD 단백질을 함유하는 유기체로부터의 1종 이상의 정밀 화학물질의 더 효율적인 생산 또는 더 높은 수율이 달성된다.

목적하는 화학물의 수율을 증가시켜야 하는, G6PD 단백질의 돌연변이유발에 대한 상술된 방법들은 제한되지 않으며, 이들 돌연변이유발 방법의 변형도 당업자에게 매우 자명하다. 이들 메카니즘은 돌연변이된 G6PD 핵산 및 단백질 분자를 발현하는 씨. 글루타미쿰 또는 관련된 박테리아 균주를 생산하기 위해 본 발명의 핵산 및 단백질 분자를 사용하여 목적하는 화합물의 수율, 생산 및(또는) 생산 효율을 개선할 수 있게 한다. 목적하는 화합물은 생합성 경로의 최종 산물 및 자연 발생 대사 경로의 중간체 및 또한 씨. 글루타미쿰 대사에서 자연 발생되지 않지만 본 발명의 씨. 글루타미쿰 균주에 의해 생산되는 분자를 포함하는 씨. 글루타미쿰 산물일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되나, 이에 한정되는 것으로 해석해서는 안된다. 본원에 인용된 모든 참고 문헌, 특허 출원, 특허, 공개된 특허 출원의 모든 내용은 참고로 본원에 인용된다.

실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 전체 게놈 DNA의 제조

BHI 배지 (디프코 (Difco) 제품) 중의 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032) 배양물을 30℃에서 격렬히 진탕시키면서 밤새 배양하였다. 원심분리하여 세포를 회수하여 상층액은 버리고, 세포를 완충액-I 5 mL (배양물 처음 부피의 5％에 해당함-언급한 모든 부피는 배양 부피 100 mL에 대해 계산한 값임) 중에 재현탁했다. 완충액-I의 조성은 다음과 같았다: 140.34 g/L 수크로스, 2.46 g/L MgS0₄ ×7 H₂O, 10 mL/L KH₂PO₄ 용액 (100 g/L, KOH를 사용하여 pH 6.7로 조정함), 50 mL/L M12 농축물 (10 g/L (NH₄)₂SO₄, 1 g/L NaCl, 2 g/L MgSO₄ ×7 H₂O, 0.2 g/L CaCl₂, 0.5 g/L 효모 추출물 (디프코 제품), 10 mL/L 미량 원소 혼합물 (200 mg/L FeSO₄ ×H₂O, 10 mg/L ZnSO₄ ×7 H₂O, 3 mg/L MnCl₂ ×4 H₂O, 30 mg/L H₃BO₃, 20 mg/L CoCl₂ ×6 H₂O, 1 mg/L NiCl₂ ×6 H₂O, 3 mg/L Na₂MoO₄ ×2 H₂O), 500 mg/L 착화제 (EDTA 또는 시트르산), 100 mL/L 비타민 혼합물 (0.2 mg/L 비오틴, 0.2 mg/L 엽산, 20 mg/L p-아미노 벤조산, 20 mg/L 리보플라빈, 40 mg/L Ca 판토테네이트, 140 mg/L 니코틴산, 40 mg/L 피리독살 히드로클로라이드, 200 mg/L 미오이노시톨). 상기 현탁액에 리소짐을 최종 농도 2.5 mg/mL로 첨가했다. 37℃에서 대략 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포벽을 파괴하고 원심분리하여 원형질체를 수거했다. 펠렛을 완충액-I 5 mL로 1회 세척하고, TE 완충액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) 5 mL로 1회 세척했다. 펠렛을 TE 완충액 4 mL 중에 재현탁하고, SDS 용액 (10％) 0.5 mL 및 NaCl 용액 (5 M) 0.5 mL을 첨가했다. 프로테이나제 K를 최종 농도 200 ㎍/mL로 첨가한 후, 상기 현탁액을 37℃에서 대략 18시간 동안 인큐베이션시켰다. 표준 방법에 따라 DNA를 페놀, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 및 클로로포름/이소아밀 알콜로 추출하여 정제했다. 이어서, 1/50배 부피의 3 M 아세트산나트륨 및 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킨 후, -20℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, SS34 회전자 (소르발 (Sorvall) 제품)를 사용한 고속 원심분리기에서 12,000 rpm로 30분 동안 원심분리했다. DNA를 20 ㎍/mL RNaseA를 함유하는 TE 완충액 1 mL 중에 용해시키고, 4℃에서 3시간 이상 동안 TE 완충액 1000 mL 중에 투석했다. 투석 동안, 상기 완충액을 3회 교환하였다. 투석된 DNA 용액을 0.4 mL씩 분취하여, 2 M LiCl 0.4 mL 및 에탄올 0.8 mL을 첨가했다. -20℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 원심분리 (13,000 rpm, 독일 하나우 헤래우스에 소재하는 바이오퓨지 프레스코 (Biofuge Fresco) 제품)하여 DNA를 수집했다. DNA 펠렛을 TE 완충액 중에 용해했다. 이 방법으로 제조된 DNA를 서던 블롯팅 또는 게놈 뱅크 제작 등의 모든 목적에 이용했다.

실시예 2: 대장균에서 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC13032)의 게놈 뱅크 제작

실시예 1에 기재한 바와 같이 제조된 DNA를 사용하여, 공지되고 확립되어 있는 방법 (예를 들어 문헌 [Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons] 참조)에 따라 코스미드 및 플라스미드 뱅크를 제작했다.

임의의 플라스미드 또는 코스미드를 사용할 수 있었다. 특히, 플라스미드 pBR322 [Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741]; pACYC177 [Change ＆ Cohen (1978) J. Bacteriol 134:1141-1156], pBS 계열의 플라스미드 (pBSSK+, pBSSK- 등; 미국 라졸라에 소재하는 스트라타진 (Stratagene) 제품) 또는 SuperCos I (미국 라졸라에 소재하는 스트라타진 제품) 또는 Lorist6 [Gibson, T.J., Rosenthal A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53:283-286] 등의 코스미드를 사용하는 것이 바람직했다.

실시예 3: DNA 서열분석 및 컴퓨터를 이용한 기능 분석

실시예 2에 기재한 바와 같은 게놈 뱅크를 사용하여, 표준 방법, 특히 ABI377 서열 분석기를 사용한 쇄 종결 방법 (예를 들어 문헌 [Fleischman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.", Science, 269:496-512])에 따른 DNA 서열분석을 수행했다. 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열분석 프라이머를 사용했다: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' 또는 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.

실시예 4: 생체내 돌연변이유발

코리네박테리움 글루타미쿰의 생체내 돌연변이유발은 유전 정보의 통합성을 유지할 수 없는 대장균 또는 다른 미생물 (예를 들면, 바실러스 종 또는 사카로마이세스 세레비지애 등의 효모)에 플라스미드 (또는 다른 벡터) DNA를 계대배양하여 수행할 수 있다. 전형적인 돌연변이유발 균주는 DNA 복구 시스템에 관한 유전자 (예를 들면, mutHLS, mutD, mutT 등; 비교하기 위해서는 문헌 [Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in Escherichia coli and Salmonella, pp. 2277-2294, ASM: Washington] 참조)에 돌연변이가 있다. 이러한 균주들은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 균주의 사용법은 예를 들어 문헌 [Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34]에 예시되어 있다.

실시예 5: 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰 사이의 DNA 전달

여러 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종은 자율적으로 복제되는 내인성 플라스미드 (예를 들면, pHM1519 또는 pBL1 등)를 함유하고 있다 (이에 관해 검토하기 위해서는 예를 들어 문헌 [Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146] 참조). 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 셔틀 벡터는 대장균의 경우에 사용하는 표준 벡터 (문헌 [Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons])에 코리네박테리움 글루타미쿰의 복제 기점 및 적당한 마커를 부가하여 사용함으로써 쉽게 제작될 수 있다. 이러한 복제 기점은 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종에서 단리한 내인성 플라스미드로부터 얻는 것이 바람직하다. 이들 종에 특히 유용한 형질전환 마커는 카나마이신 내성 유전자 (예를 들면, Tn5 또는 Tn903 트란스포손에서 유래함) 또는 클로람페니콜 내성 유전자 [Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology", VCH, Weinheim]이다. 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제되고 유전자 과다발현을 비롯한 각종 목적에 사용할 수 있는 매우 다양한 셔틀 벡터의 제조법에 관한 문헌들이 많이 있다 (예를 들어 [Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162:591-597], [Martin J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146] 및 [Eikmanns, B.J. et al. (1991) Gene, 102:93-98] 참조).

표준 방법을 이용하여, 관심 유전자를 상기 기재한 셔틀 벡터들 중 하나에 클로닝하고 이러한 하이브리드 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 원형질체 형질전환법 [Kastsumata, R. et al. (1984) J. Bacteriol. 159:306-311], 전기천공법 [Liebl, E. et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53:399-303]을 이용하고 특정 벡터가 사용되는 경우에는 접합법 (예를 들어 문헌 [Schaefer, A et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1663-1666]에 기재된 바와 같음)도 이용하여 형질전환시킬 수 있다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 플라스미드 DNA를 제조 (당업계에 공지된 표준 방법을 사용함)하고, 이것으로 대장균을 형질전환시켜 코리네박테리움 글루타미쿰의 셔틀 벡터를 대장균에 전달할 수도 있다. 이러한 형질전환 단계는 표준 방법으로 수행할 수 있지만, NM522 [Gough ＆ Murray (1983) J. Mol. Biol. 166:1-19] 등과 같은 Mcr-결핍 대장균 균주를 사용하는 것이 유리하다.

실시예 6: 돌연변이된 단백질의 발현 측정

형질전환된 숙주 세포에서 돌연변이된 단백질의 활성 관찰은 상기 돌연변이 단백질이 야생형 단백질과 유사한 방식 및 유사한 양으로 발현된다는 사실을 바탕으로 한다. 돌연변이된 유전자의 전사량 (유전자 생성물의 번역에 이용가능한 mRNA 양에 관한 지표) 측정에 적합한 방법은 관심 유전자에 결합하도록 고안되어 검출가능한 표지 (통상적으로 방사성 표지 또는 화학발광 표지)가 부착된 프라이머를 사용하여 노던 블롯팅 (예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York] 참조)을 수행하는 것인데, 이는 유기체 배양물의 전체 RNA를 추출하고 겔상에서 분리하여 안정한 매트릭스에 옮긴 후에 상기 프로브와 인큐베이션시켜, 프로브의 결합 및 그 결합 활성이 상기 유전자에 대한 mRNA의 존재 여부 및 또한 그 존재량을 지시하는 방법이다. 이러한 정보는 돌연변이된 유전자의 전사 정도에 관한 지표가 된다. 예를 들어 문헌 [Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326]에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 각종 방법들을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포내 전체 RNA를 단리할 수 있다.

상기 mRNA로부터 번역된 단백질의 존재 여부 또는 그 상대량은 웨스턴 블롯팅과 같은 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York] 참조). 이 방법에서는, 세포내 전체 단백질을 추출하여 겔 전기영동법으로 분리한 후에 이를 니트로셀룰로스 등과 같은 매트릭스에 옮겨서 관심 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 등과 같은 프로브와 함께 인큐베이션시킨다. 통상적으로, 이 프로브에는 쉽게 검출될 수 있는 화학발광 표지 또는 비색 표지가 부착되어 있다. 표지의 존재 여부 및 그의 관찰된 양은 그 세포 내에서 원하는 돌연변이 단백질의 존재 여부 및 그 존재량을 지시한다.

실시예 7: 유전자 변형된 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 - 배지 및 배양 조건

유전자 변형된 코리네박테리움을 합성 또는 천연 성장 배지에서 배양한다. 코리네박테리움을 위한 여러 다양한 성장 배지는 당업계에 공지되어 있으며 쉽게 입수가능하다 (문헌 [Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:205-210], [von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16], 독일 특허 제4,120,867호, [Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., Editors. Springer-Verlag]). 이들 배지는 1종 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 미량 원소로 구성된다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등의 당이다. 매우 훌륭한 탄소 공급원의 예로는 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 녹말 및 셀룰로스 등이 있다. 또한, 당 정제시 생성되는 당밀 또는 기타 부산물 등과 같은 복합 화합물 등으로서 배지에 당을 공급할 수도 있다. 또한, 각종 탄소 공급원들의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수도 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 락트산 등의 알콜 및 유기산이다. 질소 공급원은 통상적으로 유기 또는 무기 질소 화합물이거나 이러한 화합물을 함유하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는 암모니아 기체 및 NH₄Cl 또는 (NH₄)₂SO₄, NH₄0H 등의 암모늄염, 질산염, 우레아, 아미노산 또는 옥수수 침지액, 대두 가루, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등과 같은 복합 질소 공급원 등이 있다.

배지에 함유시킬 수 있는 무기 염 화합물로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염산염, 인산염 또는 황산염 등이 있다. 킬레이팅제를 배지에 첨가하여 금속 이온을 용액 중에 유지할 수 있다. 특히 적합한 킬레이팅제로는 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트 등과 같은 디히드록시페놀 또는 시트르산 등의 유기산 등이 있다. 또한, 배지에는 통상적으로 비타민 또는 성장 촉진제 등의 다른 성장 인자가 함유되어 있고, 이들의 예로는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신 등이 있다. 성장 인자 및 염은 흔히 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침유 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 생성된다. 배지의 정확한 조성은 특정 실험마다 크게 달라지고, 각 경우마다 따로 결정된다. 배지의 최적화에 관한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp.53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 찾을 수 있다. 또한, 스탠다드 1 (Standard 1) (머크 (Merck) 제품) 또는 BHI (Brain Heart Infusion, 디프코 제품) 등과 같이 제조 회사가 시판하는 것을 구입할 수도 있다.

모든 배지 성분들을 열처리 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과로 멸균시킨다. 이 성분들은 한꺼번에 멸균시킬 수도 있고 필요에 따라서는 따로 멸균시킬 수도 있다. 모든 배지 성분들은 배양 초기부터 함유시킬 수도 있고, 원한다면 연속적으로 또는 배치식으로 첨가할 수도 있다.

배양 조건은 각 실험마다 따로 정의된다. 온도는 15℃와 45℃ 사이의 범위이어야 하고, 실험하는 동안 일정하게 유지시키거나 변경시킬 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 약 7.0 정도이어야 하며, 배지에 완충액을 첨가하여 유지시킬 수 있다. 이러한 목적으로 사용할 수 있는 완충액의 예로는 인산칼륨 완충액 등이 있다. MOPS, HEPES, ACES 등과 같은 합성 완충액을 대안적으로 사용하거나 동시에 사용할 수 있다. 또한, 배양하는 동안 NaOH 또는 NH₄OH를 첨가하여 pH를 일정하게 유지시킬 수도 있다. 효모 추출물 등의 복합 배지 성분이 사용되는 경우, 많은 복합 화합물들은 완충 성능이 높기 때문에 추가 완충액에 대한 요구를 감소시킬 수 있다. 미생물 배양에 발효기를 사용하는 경우, pH는 암모니아 기체를 사용하여 조절할 수도 있다.

인큐베이션 기간은 통상적으로 수 시간 내지 수 일이다. 이 시간은 브로쓰에 축적되는 생성물의 양이 최대가 되도록 선택한다. 개시한 성장 실험을 다양한 크기의 미량역가 플레이트, 유리관, 유리 플라스크 또는 유리 또는 금속 발효기 등의 각종 용기에서 수행할 수 있다. 다수의 클론을 스크리닝하기 위해서는, 미생물을 배플이 있거나 없는 미량역가 플레이트, 유리관 또는 진탕 플라스크에서 배양해야 한다. 요구되는 성장 배지를 100 mL 진탕 플라스크에 10％ (부피 기준) 채워 사용하는 것이 바람직하다. 이 플라스크들은 100 내지 300 rpm 속력 범위의 회전 진탕기 상에서 진탕 (진폭 25 mm)되어야 한다. 대기를 습하게 유지함으로써 증발로 인한 손실량을 감소시키거나, 별법으로는 증발로 인한 손실량을 정확하게 보정해야 한다.

유전자 변형된 클론을 연구하는 경우, 변형되지 않은 대조 클론 또는 인서트가 없는 원래의 플라스미드를 함유하는 대조 클론도 분석해야 한다. CM 플레이트 (10 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaCl, 2 g/L 우레아, 10 g/L 폴리펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L 육류 추출물, 22 g/L 아가, 2 M NaOH을 사용하여 pH 6.8로 조정) 등과 같은 아가 플레이트 상에서 30℃에서 인큐베이션하여 성장시킨 세포를 OD₆₀₀이 0.5 내지 1.5가 되도록 배지에 접종한다. 배지 접종은 CM 플레이트로부터의 코리네박테리움 글루타미쿰 세포의 염수 용액을 도입하거나, 상기 박테리아의 예비배양액을 첨가하여 수행한다.

실시예 8: 돌연변이된 단백질의 기능에 관한 시험관내 분석

효소의 활성 및 반응 속도 (kinetics) 측정법은 당업계에 공지되어 있다. 특정하게 변형된 효소의 활성 측정 실험은 야생형 효소의 비활성에 맞추어야 하며, 당업자라면 이를 잘 수행할 수 있다. 효소에 관한 일반적인 개요 뿐만 아니라 효소의 구조, 반응 속도, 원리, 방법, 적용에 관한 구체적인 세부사항 및 많은 효소들의 활성 측정 방법의 예는 예를 들어 하기의 참고문헌에서 찾을 수 있다: [Dixon, M., and Webb, E.C.: (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman, New York], [Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco], [Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford], [Boyer, P.D., editors (1983) The Enzymes, 3rd edition. Academic Press: New York], [Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2nd edition. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325)], [Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M., editors (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd edition, Vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim] 및 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Vol. A9, "Enzymes". VCH: Weinheim, pp. 352-363].

DNA에 결합하는 단백질의 활성은 DNA 밴드쉬프트 분석법 (겔 지연 분석법이라고 지칭하기도 함) 등과 같이 잘 확립되어 있는 여러 방법들을 사용하여 측정할 수 있다. 상기 단백질들이 다른 분자들의 발현에 미치는 영향은 리포터 유전자 분석법 (예를 들어 문헌 [Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14:3895-3904]과 그의 참고문헌에 기재된 바와 같음)을 사용하여 측정할 수 있다. β-갈락토시다제 등의 효소, 녹색 형광 단백질 및 여러가지 기타 효소가 사용되는 리포터 유전자 시험 시스템은 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에의 적용에 대해 공지되어 있으며 잘 확립되어 있다.

막 수송 단백질의 활성은 문헌 [Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 85-137, 199-234 및 270-322]에 기재된 기술에 따라 측정할 수 있다.

실시예 9: 돌연변이된 단백질이 관심 생성물의 생산에 미치는 영향의 분석

코리네박테리움 글루타미쿰에서의 유전자 변형이 관심 화합물 (예컨대 아미노산)의 생산에 미치는 영향은 변형된 미생물을 적합한 조건 (예를 들어 상기 기재한 조건)하에서 성장시키고, 관심 생성물 (즉, 아미노산)의 생산 증가에 관여한 배지 성분 및(또는) 세포내 성분을 시험하여 결정할 수 있다. 이러한 분석 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 분광분석법, 박층 크로마토그래피법, 각종 유형의 착색법, 효소적 및 미생물학적 방법 및 고성능 액체 크로마토그래피법 등과 같은 분석용 크로마토그래피법 등이 있다 (예를 들어 문헌 ([Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 및 pp. 443-613, VCH: Weinheim (1985)], [Fallon, A. et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17], [Rehm et al. (1993) Biotechnology, Vol. 3, Chapter III: "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH: Weinheim], [Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons], [Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons], [Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3, Chapter 11, pp. 1-27, VCH: Weinheim] 및 [Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications]) 참조).

최종 발효 생성물의 측정 뿐만 아니라, 중간체 및 부산물 등과 같이 관심 화합물의 생산에 이용된 대사 경로 중의 다른 성분들을 분석함으로써 전반적인 화합물 생산 효율을 측정할 수도 있다. 분석 방법으로는 배지 내의 영양분 (예컨대 당, 탄화수소, 질소 공급원, 인산염 및 기타 이온) 함량 측정, 바이오매스의 조성 및 성장 측정, 생합성 경로의 공통 대사물질의 생산 분석 및 발효 동안에 생성된 기체의 측정 등이 있다. 이러한 측정을 위한 표준 방법은 문헌 [Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M.Rhodes and P.F.Stanbury, eds., IRL Press, pp. 103-129, 131-163 및 165-192 (ISBN:0199635773)과 그의 참고문헌]에 기재되어 있다.

실시예 10: 코리네박테리움 글루타미쿰 배양물로부터의 관심 생성물의 정제

당업계에 공지된 여러가지 방법을 사용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 또는 상기 기재한 배양물의 상층액으로부터 관심 생성물을 수득할 수 있다. 세포가 관심 생성물을 분비하지 않는 경우에는 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 수거하고 기계적인 힘이나 초음파 등과 같은 표준 기술로 세포를 용균시킬 수 있다. 원심분리로 세포 잔해를 제거하여 가용성 단백질을 함유하는 상층액 분획물을 수득하고, 이를 사용하여 관심 화합물을 추가로 정제한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 세포가 생성물을 분비하는 경우에는 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 제거하고, 수득한 상층액 분획물을 추가로 정제한다.

상기 두 가지 정제 방법 모두의 경우에서 수득한 상층액 분획물을 적합한 수지를 사용한 크로마토그래피에 적용하여 관심 분자는 크로마토그래피 수지 상에 남지만 샘플 중의 많은 오염물질들은 남지 않게 하거나, 오염물질들은 수지에 남지만 원하는 분자는 남지 않게 한다. 필요에 따라서는, 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 사용하여 이러한 크로마토그래피 단계를 반복할 수 있다. 당업자라면, 적합한 크로마토그래피 수지를 선택하고 정제할 특정 분자에 대해 가장 효과적으로 이를 적용하는 것에 숙달되어 있을 것이다. 정제된 생성물을 여과 또는 한외여과사켜 농축시키고, 생성물의 안정성이 최대가 되는 온도에 저장할 수 있다.

당업계에는 상기 기재한 정제법 및 예를 들어 문헌 [Bailey, J.E. ＆ Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)]에 기재된 정제법 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러가지 정제법들이 공지되어 있다.

단리된 화합물의 확인 및 순도는 당업계의 기술로 측정할 수 있다. 이러한 기술로는 고성능 액체 크로마토그래피법 (HPLC), 분광분석법, 착색법, 박층 크로마토그래피법, NIRS법, 효소 분석법 또는 미생물학적 분석법 등이 있다. 이러한 분석 방법은 하기 문헌에서 고찰된다: [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140], [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32], [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70], [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, pp. 575-581 및 pp. 581-587], [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons] 및 [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17].

등가물

당업자라면, 단순한 통상의 방법을 이용하여 본 발명의 특정 실시양태의 수많은 등가물을 알아내거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기한 청구의 범위에 포함된다.

표 1의 정보는 다음과 같이 이해되어야 한다:

컬럼 1에서, "DNA 서열 번호"의 해당 번호는 첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 각각을 지칭하는 것이다. 따라서, 컬럼 "DNA 서열 번호"의 "5"는 서열 5를 지칭한다.

컬럼 2에서, "아미노산 서열 번호"의 해당 번호는 첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 각각을 지칭하는 것이다. 따라서, 컬럼 "아미노산 서열 번호"의 "6"은 서열 6을 지칭한다.

컬럼 3에서, "확인"은 각 서열에 대한 명확한 내부 명칭을 기재한 것이다.

컬럼 4에서, "아미노산 위치"의 해당 번호는 각 경우에서 동일 열에 있는 "아미노산 서열 번호"에 기재된 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 위치를 지칭한다. 따라서, 컬럼 "아미노산 위치"의 "26"은 해당 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 26이다. 위치 번호는 N 말단을 +1로 하여 출발한다.

컬럼 5에서, "아미노산 야생형"의 해당 문자는 각 경우의 컬럼 4에 표시한 야생형 서열에서 해당 위치에 존재하는 아미노산을 지칭하며, 1문자 코드로 나타내었다.

컬럼 6에서, "아미노산 돌연변이체"의 해당 문자는 각 경우의 컬럼 4에 표시한 돌연변이체 서열에서 해당 위치에 존재하는 아미노산을 지칭하며, 1문자 코드로 나타내었다.

컬럼 7에서, "기능"은 해당 폴리펩티드 서열의 생리적 기능을 기재한 것이다.

단백질원성 아미노산의 1문자 코드는 다음과 같다:

A 알라닌

C 시스테인

D 아스파르트산

E 글루탐산

F 페닐알라닌

G 글리신

H 히스티딘

I 이소루이신

K 리신

L 루이신

M 메티오닌

N 아스파라긴

P 프롤린

Q 글루타민

R 아르기닌

S 세린

T 트레오닌

V 발린

W 트립토판

Y 티로신

글루코스-6-포스페이트-탈수소효소 단백질을 코딩하는 유전자
DNA서열번호	아미노산서열번호	확인	아미노산위치	아미노산야생형	아미노산돌연변이체	기능
1	2	RXA02737	243	A	T	글루코스-6-포스페이트 탈수소효소

SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Glucose-6-phosphate dehydrogenase <130> OZ0050/53030 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1672 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> 5’UTR <222> (1)..(100) <220> <221> CDS <222> (101)..(1645) <220> <221> 3’UTR <222> (1646)..(1672) <400> 1 agcacgctgc atcagtaacg gcgacatgaa atcgaattag ttcgatctta tgtggccgtt 60 acacatcttt cattaaagaa aggatcgtga cactaccatc gtg agc aca aac acg 115 Val Ser Thr Asn Thr 1 5 acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac ccg cag gat aaa cga 163 Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp Pro Gln Asp Lys Arg 10 15 20 ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg atc ttc ggt gtc act 211 Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val Ile Phe Gly Val Thr 25 30 35 ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca 259 Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala 40 45 50 aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc 307 Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg 55 60 65 cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca 355 Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala 70 75 80 85 agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc 403 Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu 90 95 100 gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct 451 Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala 105 110 115 ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc 499 Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly 120 125 130 acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc 547 Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe 135 140 145 aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc 595 Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr 150 155 160 165 gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac 643 Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn 170 175 180 ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca 691 Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro 185 190 195 gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt 739 Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val 200 205 210 caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg 787 Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu 215 220 225 tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg gct gaa gat 835 Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp 230 235 240 245 att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc 883 Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala 250 255 260 cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc 931 Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala 265 270 275 atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag 979 Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys 280 285 290 atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc 1027 Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr 295 300 305 tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc 1075 Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val 310 315 320 325 aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag 1123 Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu 330 335 340 act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt 1171 Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly 345 350 355 gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act 1219 Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr 360 365 370 gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc 1267 Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly 375 380 385 gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag 1315 Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln 390 395 400 405 cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct 1363 Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser 410 415 420 gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc 1411 Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser 425 430 435 ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctc att ttg gat gcg 1459 Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala 440 445 450 ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg 1507 Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu 455 460 465 agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga 1555 Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly 470 475 480 485 gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat 1603 Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp 490 495 500 gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taa 1645 Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro 505 510 515 tttaggggca aaaaatgatc tttgaac 1672 <210> 2 <211> 514 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 1 5 10 15 Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val 20 25 30 Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45 Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60 Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn 85 90 95 Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe 100 105 110 Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile 115 120 125 Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile 130 135 140 Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly 145 150 155 160 Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys 165 170 175 Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val 180 185 190 Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu 195 200 205 Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln 210 215 220 Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile 225 230 235 240 Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp 245 250 255 Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu 260 265 270 Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln 275 280 285 Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300 Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335 Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365 Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380 Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400 Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415 Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430 Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445 Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460 Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480 Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495 Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510 Arg Pro

Claims (8)

1. 표 1의 컬럼 2에 각각 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며, 표 1의 컬럼 4에 나타낸 아미노산 위치에서 그와 동일 열에 있는 표 1의 컬럼 5에 나타낸 특정 아미노산이 아닌 단백질원성 아미노산을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 표 1의 컬럼 4에 나타낸 아미노산 위치에서 그와 동일 열에 있는 표 1의 컬럼 6에 나타낸 아미노산을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
3. 제1항에 따른 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
4. 제3항에 따른 하나 이상의 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 분자의 발현에 의해 상기 세포로부터의 정밀 화학물질 (fine chemical) 생산이 조정되는 숙주 세포.
6. 제3항에 따른 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포를 배양하여 정밀 화학물질이 생산되도록 하는 단계를 포함하는, 정밀 화학물질의 제조 방법.
7. 제6항에 있어서, 정밀 화학물질이 아미노산인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 아미노산이 리신인 방법.