EP1448779A1 - Gene die für glucose-6-phosphat-dehydrogenase proteine codieren - Google Patents

Gene die für glucose-6-phosphat-dehydrogenase proteine codieren

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Publication number
EP1448779A1
EP1448779A1 EP02779545A EP02779545A EP1448779A1 EP 1448779 A1 EP1448779 A1 EP 1448779A1 EP 02779545 A EP02779545 A EP 02779545A EP 02779545 A EP02779545 A EP 02779545A EP 1448779 A1 EP1448779 A1 EP 1448779A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
g6pd
protein
amino acid
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02779545A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oskar Zelder
Markus Pompejus
Hartwig Schröder
Burkhard Kröger
Corinna Klopprogge
Gregor Haberhauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paik Kwang Industrial Co Ltd
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7705466&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EP1448779(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP07123951.1A priority Critical patent/EP1911846B1/de
Publication of EP1448779A1 publication Critical patent/EP1448779A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • This invention provides novel nucleic acid molecules that can be used to identify or classify Corynebacterium glutamicum or related types of bacteria.
  • C. glutamicum is a gram-positive, aerobic bacterium that is commonly used in industry for the large-scale production of a number of fine chemicals, and also for the degradation of hydrocarbons (for example, when overflowing crude oil) and for the oxidation of terpenoids .
  • the nucleic acid molecules can therefore be used to identify microorganisms that can be used for the production of fine chemicals, for example by fermentation processes.
  • Corynebacterium diphtheriae the causative agent of diphtheria
  • the ability to identify the presence of Corynebacterium species can therefore also be of significant clinical importance, for example in diagnostic applications.
  • These nucleic acid molecules can also serve as reference points for mapping the C. glutamicum genome or organisms related to genomes. These new nucleic acid molecules encode proteins called glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • Glucose-6-phosphate dehydrogenase genes from Corynebacteria are described, for example, in EP 1108790A2. However, the genes described therein code for polypeptide sequences that are shorter than those described here according to the invention. The glucose-6-phosphate dehydrogenase described in EP 1108790A2 is shortened at the N-terminus by 30 amino acids compared to the polypeptide sequence claimed here.
  • the invention relates to new genes for glucose-6-phosphate dehydrogenase which are linked to the amino acid in position 1 or 2, i.e. Val or Ser, start and code at position 243 a proteinogenic amino acid that is not Ala (numbering based on SEQ ID NO: 2).
  • New genes for glucose-6-phosphate are particularly preferred.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of an organism in order to make it better and more efficient as a producer of one or more fine chemicals.
  • the molecules of the invention can be modified so that the yield, production and / or efficiency of production of one or more fine chemicals is improved.
  • the molecules of the invention may also participate in one or more intracellular signal transduction pathways that affect the yields and / or the rate of production of one or more fine chemicals from C. glutamicum.
  • Proteins that are necessary, for example, for the import of one or more sugars from the extracellular medium are produced in the cell if there is a sufficient amount of sugar often modified post-translationally so that they can no longer import this sugar.
  • the amount of sugar at which the transport Switching off the system is sufficient to maintain normal cell functions, but it limits the overproduction of the desired fine chemical. It is therefore advisable to modify the proteins according to the invention so that they no longer respond to such a negative regulation. This allows higher intracellular concentrations of one or more sugars and, by extension, more efficient production or higher yields of one or more fine chemicals from organisms that contain these mutant proteins.
  • nucleic acid sequences of the sequence listing together with the sequence changes at the respective position described in Table 1 are defined as Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence from Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule.
  • the isolated nucleic acid more preferably encodes a naturally occurring C. g2ufcamicum G6PD protein or a biologically active portion thereof.
  • Another aspect of the invention relates to vectors, for example recombinant expression vectors, which contain the nucleic acid molecules according to the invention, and host cells, into which these vectors have been introduced.
  • a host cell is used to produce a G6PD protein, which is grown in a suitable medium.
  • the G6PD protein can then be isolated from the medium or the host cell.
  • Another aspect of the invention relates to a genetically modified microorganism in which a G6PD gene has been introduced or modified.
  • the genome of the microorganism has been changed by introducing at least one nucleic acid molecule according to the invention which codes the mutated G6PD sequence as a transgene.
  • an endogenous G6PD gene in the genome of the microorganism has been changed, for example functionally disrupted, by homologous recombination with an altered G6PD gene.
  • the microorganism belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, Corynebacterium glutamicum being particularly preferred.
  • the microorganism is preferred embodiment also used to produce a desired compound, such as an amino acid, particularly preferably ysin.
  • host cells that have more than one of the nucleic acid molecules described in Appendix A.
  • Such host cells can be produced in various ways known to those skilled in the art. For example, they can be transfected by vectors which carry several of the nucleic acid molecules according to the invention. However, it is also possible to use one vector to introduce a nucleic acid molecule according to the invention into the host cell and therefore to use several vectors either simultaneously or in a staggered manner. Host cells can thus be constructed which carry numerous up to several hundred of the nucleic acid sequences according to the invention. Such an accumulation can often achieve superadditive effects on the host cell with regard to fine chemical productivity.
  • an isolated G6PD protein or a section for example a biologically active section thereof.
  • the isolated G6PD protein or its section can be involved in the import of high-energy carbon molecules (for example glucose, fructose or sucrose) into C. glutamicum and also be involved in one or more intracellular signal transduction pathways of C. glutamicum.
  • the isolated G6PD protein or a portion thereof is sufficiently homologous to an amino acid sequence from Appendix B, so that the protein or its portion continues to import high-energy carbon molecules (e.g. glucose, fructose or sucrose) into C. can participate in one or more intracellular signal transduction pathways of C. glutamicum.
  • the invention also relates to an isolated Glu-6-phosphate dehydrogenase protein preparation.
  • the Glu-6-phosphate dehydrogenase G6PD protein comprises an amino acid sequence from Appendix B.
  • the invention relates to an isolated full-length protein which forms a complete amino acid sequence from Appendix B (which is from an open reading frame in Appendix A is encoded) is essentially homologous.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a fine chemical.
  • the method provides for the cultivation of a cell which contains a vector which brings about the expression of a nucleic acid molecule according to the invention, so that a Fine chemical is produced.
  • this method also comprises the step of obtaining a cell which contains such a vector, the cell being transfected with a vector which brings about the expression of a nucleic acid.
  • this method also comprises the step in which the fine chemical is obtained from the culture.
  • the cell belongs to the genus Corynebacterium or Breviba ct eri.
  • fine chemical is known in the art and includes molecules that are produced by an organism and have applications in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, and cosmetic industries. These compounds include organic acids such as tartaric acid, itaconic acid and diamino-pimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides (as described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, Pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Ed. VCH: Weinheim and the citations contained therein), lipids, saturated and unsaturated fatty acids (e.g.
  • arachidonic acid arachidonic acid
  • diols e.g. propanediol and butanediol
  • Carbohydrates e.g. hyaluronic acid and trehalose
  • aromatic compounds e.g. aromatic amines, vanillin and indigo
  • vitamins and cofactors as described in Ulimann's Encyclopedia of Industrial Kitchen, Vol. A27, "Vitamins", p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for normal cell functions.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 types, serve as structural units for proteins in which they are linked to one another via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) are usually not found in proteins (see Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p 57-97 VCH: Weinheim (1985)).
  • the amino acids can be in the D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins.
  • Biosynthetic and degradation pathways of each of the 20 proteinogenic amino acids are well characterized in both prokaryotic and eukaryotic cells (see, for example, Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pp. 578-590 (1988)).
  • the "essential" amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • the "essential” amino acids are converted into the remaining 11 by simple biosynthetic pathways
  • "Nonessential” amino acids alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine
  • Higher animals have the ability to synthesize some of these amino acids, but the essential amino acids must be ingested with food for normal protein synthesis to take place.
  • Lysine is not only an important amino acid for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • Glutamate is most commonly used as a flavor additive (monosodium glutamate, MSG) and is widely used in the food industry, as well as aspartate, phenylalanine, glycine and cysteine.
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetic industries. Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widespread feed additives (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim).
  • amino acids are also used as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan and others, in Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 are suitable substances.
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate, in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentose phosphate pathways, erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate in a 9-step biosynthetic pathway that differs only in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step process.
  • Tyrosine can also be produced from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is made from oxaloacetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by converting aspartate.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids the amount of which exceeds the cell's protein biosynthesis requirement, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediates are provided for the main metabolic pathways of the cell (for an overview see Stryer, L., Biochemistry, 3rd ed. Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”; S 495-516 (1988)).
  • the cell is able to convert undesired amino acids into useful metabolic intermediates, the production of amino acids is expensive in terms of energy, precursor molecules and the enzymes required for their synthesis.
  • amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, the presence of a particular amino acid slowing or stopping its own production (for an overview of the feedback mechanism in amino acid biosynthetic pathways, see Stryer, L., Biochemistry, 3rd ed., chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme ", pp. 575-600 (1988)).
  • the output of a certain amino acid is therefore restricted by the amount of this amino acid in the cell.
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and must therefore absorb them, although they are easily synthesized by other organisms such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds also have a significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and the industrial applications of these compounds, see, for example, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and encompasses nutrients which are required by an organism for normal function, but which cannot be synthesized by this organism itself.
  • the group of vitamins can include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for normal enzyme activity to occur. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic.
  • nutraceutical encompasses food additives which are beneficial to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (e.g. polyunsaturated fatty acids).
  • Thiamine (vitamin Bi) is formed by chemical coupling of pyrimidine and thiazole units.
  • Riboflavin (vitamin B) is synthesized from guanosine 5 'triphosphate (GTP) and ribose 5' phosphate. Riboflavin in turn is used to synthesize flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • the family of compounds commonly referred to as "Vitamin B6" e.g. pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal 5 'phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Vitamin B6 e.g. pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal 5 'phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Panthothenate (pantothenic acid, R- (+) -N- (2, 4-dihydroxy-3, 3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanine) can be produced either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the final steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ß-alanine and pantoic acid.
  • the enzymes responsible for the biosynthetic steps for the conversion into pantoic acid, into ß-alanine and for the condensation into pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis takes place over 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal-5 '-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), Pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • Lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it becomes part of the pyruvate dehydrogenase complex and the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase complex.
  • the folates are a group of substances that are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methylpterine.
  • guanosine 5'-triphosphate GTP
  • L-glutamic acid L-glutamic acid
  • p-aminobenzoic acid The biosynthesis of folic acid and its derivatives, starting from the metabolic intermediates guanosine 5'-triphosphate (GTP), L-glutamic acid and p-aminobenzoic acid, has been extensively investigated in certain microorganisms.
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B ⁇ 2
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of Vitamin B ⁇ is sufficiently complex that it has not been fully characterized, but a large part of the enzymes and substrates involved is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, which are also called “niacin”.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • purine and pyrimidine metabolism and their corresponding proteins are important targets for the therapy of tumor diseases and viral infections.
  • purine or pyrimidine encompasses nitrogen-containing bases which are part of the nucleic acids, coenzymes and nucleotides.
  • Nucleotide contains the basic structural units of the nucleic acid molecules, which include a nitrogenous base, a penose sugar (for RNA, the sugar is ribose, for DNA, the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • the term “nucleoside” encompasses molecules which serve as precursors of nucleotides, but which, in contrast to the nucleotides, have no phosphoric acid unit.
  • nucleotides that do not form nucleic acid molecules, but that serve as energy stores (i.e. AMP) or as coenzymes (i.e. FAD and NAD).
  • nucleotides also have other possible uses: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (eg thiamine, S-adenosyl-methionine, folate or riboflavin), as energy sources for the cell (eg ATP or GTP) and for chemicals themselves, are becoming common used as a flavor enhancer (for example IMP or GMP) or for many medical applications (see for example Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., ed. VCH: Weinheim, S 561-612).
  • Enzymes involved in purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly becoming targets against which crop protection chemicals, including fungicides, herbicides and insecticides, are being developed.
  • the purine nucleotides are synthesized from ribose 5-phosphate via a series of steps via the intermediate compound inosine 5 'phosphate (IMP), which leads to the production of guanosine 5' monophosphate (GMP) or adenosine 5 'monophosphate (AMP ) leads from which the triphosphate forms used as nucleotides can be easily produced. These compounds are also used as energy stores, so that their degradation provides energy for many different biochemical processes in the cell. Pyrimidine biosynthesis takes place via the formation of uridine 5 'monophosphate (UMP) from ribose 5-phosphate. UMP in turn is converted to cytidine 5 'triphosphate (CTP).
  • IMP intermediate compound inosine 5 'phosphate
  • AMP adenosine 5 'monophosphate
  • the deoxy forms of all nucleotides are produced in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After Phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules that are linked by an ⁇ , ⁇ -l, l bond. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen foods, and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, e.g., Nishimoto et al., (1998) US Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, CLA and Panek, AD Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; and Shiosaka, MJ Japan 172 (1997) 97-102). Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and is naturally released into the surrounding medium from which it can be obtained by methods known in the art.
  • the present invention is based at least in part on the discovery of new molecules, which are referred to here as G6PD nucleic acid and protein molecules and which are involved in the absorption of high-energy carbon molecules (eg glucose, sucrose and fructose) in C. glutamicum and can also be involved in one or more intracellular signal transduction pathways in these microorganisms.
  • the G6PD molecules import high-energy carbon molecules into the cell, where the energy generated by their degradation is used to drive less energetic biochemical reactions. Your breakdown products can be used as intermediates or precursors for a number of other metabolic pathways.
  • the G6PD molecules can participate in one or more intracellular signal transduction pathways, and the presence of a modified form of a G6PD molecule (e.g., a phosphorylated G6PD protein) can participate in a signal transduction cascade that regulates one or more cellular processes.
  • a modified form of a G6PD molecule e.g., a phosphorylated G6PD protein
  • the activity of the G6PD molecules according to the invention has an effect on the production of a desired fine chemical by this organism.
  • the G6PD molecules according to the invention have a modulated activity, so that the yield, production or efficiency in the production of one or more fine chemicals from C. glutamicum are also modulated.
  • the G6PD molecules according to the invention are capable of modulating the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism, such as C. glutamicum.
  • a desired molecule such as a fine chemical
  • a microorganism such as C. glutamicum.
  • one or more G6PD proteins according to the invention can be manipulated in such a way that their function is modulated. For example.
  • a protein involved in the G6PD-mediated import of glucose can be altered to have optimal activity, and the G6PD system for the import of glucose can thus deliver large amounts of glucose into the cell.
  • Glucose molecules are not only used as an energy source for energetically unfavorable biochemical reactions, such as the biosynthesis of fine chemicals, but also as precursors and intermediates in a number of fine chemical biosynthetic pathways (e.g. serine is synthesized from 3-phosphoglycerate).
  • the overall yield or rate of production of any of these desired fine chemicals can be increased by increasing the energy available for this production to take place or by increasing the availability of the compounds necessary for this production to take place.
  • the genome of a Corynebacterium glutamicum strain which is available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 13032, is suitable as a starting point for the production of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be produced from these nucleic acid sequences by conventional methods using the changes described in Table 1.
  • the G6PD protein according to the invention or a biologically active section or fragments thereof can be involved in the transport of high-energy carbon-containing molecules, such as glucose, in C. glutamicum or in an intracellular signal transduction in this microorganism, or one or more of those in Table 1 activities listed.
  • One aspect of the invention relates to isolated nucleic acid molecules which encode G6PD polypeptides or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which are for use as
  • Hybridization probes or primers for the identification or amplification of G6PD-coding nucleic acids pass.
  • nucleic acid molecule is intended to encompass DNA molecules (for example cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (for example RNA) as well as DNA or RNA analogs which are generated by means of nucleotide analogs. This term also includes the untranslated sequence located at the 3 'and 5' ends of the coding region: at least about 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least about' 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3 '- End of the coding gene region.
  • the nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably a double-stranded DNA.
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • An “isolated” nucleic acid preferably has no sequences which naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (for example sequences which are located at the 5 'or 3' end of the nucleic acid).
  • the isolated G6PD nucleic acid molecule can contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of the nucleotide sequences that naturally comprise the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the Flank the cell from which the nucleic acid originates (for example a C. glutamicum cell).
  • An "isolated" nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule may also be substantially free of any other cellular material or culture medium when made by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals if it is chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from Appendix A or a section thereof, can be produced using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • a C. glutamicum G6PD cDNA can be isolated from a C. gluta icum bank by using a complete sequence from Appendix A or a section thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J ., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence from Annex A or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been created on the basis of this sequence (for example a nucleic acid molecule comprising a complete sequence can be used Appendix A, or a portion thereof, can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers based on the Based on this same sequence from Appendix A).
  • mRNA can be isolated from normal endothelial cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al.
  • cDNA can be converted using reverse transcriptase (for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL).
  • reverse transcriptase for example Moloney-MLV reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for the amplification via polymerase chain reaction can be created on the basis of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • a nucleic acid according to the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to a G6PD nucleotide sequence can be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises a nucleic acid molecule which is complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A or a portion thereof, which is a nucleic acid molecule which is sufficiently complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A. it can hybridize to one of the sequences given in Appendix A, creating a stable duplex.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a section thereof, the one
  • high-energy carbon molecules such as glucose
  • the term "sufficiently homologous" refers to proteins or portions thereof whose amino acid sequences have a minimal number of identical or equivalent amino acid residues (for example an amino acid residue with a side chain similar to an amino acid residue in one of the sequences from Appendix B) to an amino acid sequence from Appendix B, so that the protein or a portion thereof contains high-energy carbon cool, such as glucose, can be transported in C.
  • G6PD protein thus relates to the complete functioning and / or the regulation of one or more sugar transport routes based on phosphoenolpyruvate. Table 1 shows examples of G6PD protein activities.
  • Sections of proteins which are encoded by the G6PD nucleic acid molecules according to the invention are preferably biologically active sections of one of the G6PD proteins.
  • biologically active portion of a G6PD protein is intended to include a portion, e.g., a domain or motif, of a G6PD protein that contains high-energy carbon-containing molecules such as glucose in C. glutamicum can transport, or can be involved in the intracellular signal transduction in this microorganism, or has an activity given in Table 1.
  • a test of the enzymatic activity can be carried out. These test methods, as described in detail in Example 8 of the example part, are familiar to the person skilled in the art.
  • nucleotide sequence of Appendix A which leads to a change in the amino acid sequence of the encoded G6PD protein without affecting the functionality of the G6PD protein.
  • nucleotide substitutions which lead to amino acid substitutions at "non-essential" amino acid residues can be produced in a sequence from Appendix A.
  • a "non-essential" amino acid residue in a wild-type sequence can be changed by one of the G6PD proteins (Appendix B) without changing the activity of the G6PD protein, whereas an "essential" amino acid residue is required for the G6PD protein activity ,
  • other amino acid residues e.g. non-conserved or only semi-preserved amino acid residues in the domain with G6PD activity
  • An isolated nucleic acid molecule encoding a G6PD protein that is homologous to a protein sequence from Appendix B can be generated by incorporating one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence from Appendix A so that one or more Amino acid substitutions, additions or deletions can be introduced into the encoded protein.
  • the mutations can be introduced into one of the sequences from Appendix A by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • conservative amino acid substitutions are introduced on one or more of the predicted non-essential amino acid residues.
  • the amino acid residue is replaced by an amino acid residue with a similar side chain.
  • Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g.
  • glycine asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • non-polar Side chains for example alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains for example threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains for example tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine.
  • a predicted non-essential amino acid residue in a G6PD protein is thus preferably replaced by another amino acid residue of the same side chain family.
  • the mutations can alternatively be introduced randomly over all or part of the G6PD coding sequence, for example by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be examined for the G6PD activity described here in order to identify mutants, that maintain G6PD activity.
  • the encoded protein can be expressed in a recombinant manner, and the activity of the protein can be determined, for example, using the tests described here (see Example 8 of the example part).
  • vectors preferably expression vectors, containing a nucleic acid encoding a G6PD protein (or a portion thereof).
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is is bound.
  • plasmid which is a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (for example, bacterial vectors with a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • vectors eg non-episomal mammalian vectors
  • Other vectors are integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are called "expression vectors".
  • the expression vectors used in recombinant DNA techniques are usually in the form of plasmids.
  • plasmid and vector can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other expression vector forms, such as viral vectors (e.g. replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses), which perform similar functions.
  • the recombinant expression vector according to the invention comprises a nucleic acid according to the invention in a form which is suitable for the expression of the nucleic acid in a host cell, which means that the recombinant expression vectors one or more regulatory sequences, selected on the basis of the host cells to be used for expression, the is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • “operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible (for example in an in vitro transcription / Translation system or in a host cell if the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to encompass promoters, enhancers and other expression control elements (for example polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells. The person skilled in the art is aware that the design of an expression vector can depend on factors such as the choice of the host cell to be transformed, the extent of expression of the desired protein, etc.
  • Vectors can be introduced into the host cells so as to produce proteins or peptides, including fusion proteins or peptides, encoded by the nucleic acids as described herein (e.g. G6PD proteins, mutant forms of G6PD proteins, fusion proteins , etc.).
  • proteins or peptides including fusion proteins or peptides, encoded by the nucleic acids as described herein (e.g. G6PD proteins, mutant forms of G6PD proteins, fusion proteins , etc.).
  • the recombinant expression vectors according to the invention can be designed for the expression of G6PD proteins in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • G6PD genes can be found in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells (with baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, CAMJJ et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi” in: More Gene Manipulations in Fungi, JW Bennet & LL Lasure,
  • the recombinant expression vector can be transcribed and translated in vitro, for example using T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
  • Proteins are usually expressed in prokaryotes using vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Fusion vectors contribute a number of amino acids to a protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein. These fusion vectors usually have three functions: 1) to increase the expression of recombinant. Protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein; and 3) supporting the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification.
  • a proteolytic cleavage site is often introduced at the junction of the fusion unit and the recombinant protein, so that the recombinant protein can be separated from the fusion unit after the fusion protein has been purified.
  • These enzymes and their corresponding recognition sequences include factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Common fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which glutathione-S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the coding sequence of the G6PD protein is cloned into a pGEX expression vector so that a vector is generated which encodes a fusion protein comprising from the N-terminus to the C-terminus, GST - thrombin cleavage site - X- Protein.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography using glutathione-agarose resin.
  • the recombinant G6PD protein that is not fused to GST can be obtained by cleaving the fusion protein with thrombin.
  • Suitable inducible non-fusion expression vectors from E. coli include pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pETIld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89).
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pETlld vector is based on the transcription from a T7-gnl0-lac fusion promoter, which is mediated by a coexpressed viral RNA polymerase (T7 gnl). This viral polymerase is supplied by the BL 21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ prophage which harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • One strategy to maximize the expression of the recombinant protein is to express the protein in a host bacterium whose ability to proteolytically cleave the recombinant protein is impaired (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 119-128).
  • Another strategy is to change the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be inserted into an expression vector, so that the individual codons for each amino acid are those which are preferably used in a bacterium selected for expression, such as C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118).
  • the G6PD protein expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 ( Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, JF Peberdy et al., Ed., Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • the G6PD proteins of the invention can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the G6PD proteins according to the invention can be expressed in single-cell plant cells (such as algae) or in plant cells of higher plants (for example spermatophytes, such as crops).
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • a nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells with a mammalian expression vector.
  • mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • the control functions of the expression vector are often provided by viral regulatory elements. Commonly used promoters come, for example, from Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus and Simian Virus 40.
  • the recombinant mammalian expression vector can preferably bring about the expression of the nucleic acid in a specific cell type (for example, tissue-specific regulatory elements are used to express the nucleic acid).
  • tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • suitable tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • 10 gnete tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-specific promoters (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), in particular Promoters of T cell receptors (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) and immune
  • milk serum promoter e.g., milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166
  • Development-regulated promoters are also included, for example the mouse hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the ⁇ -fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:
  • the invention also provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule according to the invention which is cloned into the expression vector in the antisense direction.
  • the DNA molecule is operatively linked to a regulatory sequence such that expression (by transcription of the DNA-.Molecule) of an RNA molecule that is antisense to the G6PD mRNA is possible.
  • Regulatory sequences can be selected that are functional to an antisense rich
  • Viral promoters and / or enhancers or regulatory sequences can be selected which are constitutive, tissue-specific or cell-type-specific expression
  • the antisense expression vector can be in the form of a recombinant plasmid, phagemid or attenuated virus in which antisense nucleic acids are produced under the control of a highly effective regulatory region, the activity of which is determined by the cell type in which
  • Another aspect of the invention relates to the host cells into which a recombinant expression vector according to the invention has been introduced.
  • the terms "host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably here. It goes without saying that these terms refer not only to a specific target cell, but also to the descendants or potential descendants of this cell. Since certain modifications may occur in successive generations due to mutation or environmental influences, these offspring are not necessarily identical to the parental cell, but are still included in the scope of the term as used here.
  • a host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • a G6PD protein can be expressed in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells, yeast or mammalian cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells).
  • suitable host cells are known to the person skilled in the art.
  • Microorganisms which are related to Corynebacterium glutamicum and which can be suitably used as host cells for the nucleic acid and protein molecules according to the invention are listed in Table 3.
  • vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • transformation and “transfection” as used here are intended to encompass a large number of methods known in the prior art for introducing foreign nucleic acid (for example DNA) into a host cell, including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection or electroporation. Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals.
  • a gene that encodes a selectable marker (eg resistance to antibiotics) is usually introduced into the host cells together with the gene of interest.
  • selectable markers include those that are resistant to medicinal products. elements such as G418, hygro ycin and methotrexate.
  • a nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding a G6PD protein, or can be introduced on a separate vector. Cells that have been stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (eg cells that have integrated the selectable marker survive, whereas the other cells die).
  • a vector which contains at least a section of a G6PD gene into which a deletion, addition or substitution has been introduced in order to change, for example functionally disrupt, the G6PD gene.
  • This G6PD gene is preferably a Corynebacterium glutamicum G6PD gene, but a homologue from a related bacterium or even from a mammalian, yeast, or insect source can be used.
  • the vector is designed such that the endogenous G6PD gene is functionally disrupted when homologous recombination occurs (i.e. no longer encodes a functional protein, also referred to as a "knockout" vector).
  • the vector can be designed in such a way that the endogenous G6PD gene is mutated or otherwise altered in the case of homologous recombination, but still codes the functional protein (for example the upstream regulatory region can be altered in such a way that the expression of the endogenous G6PD protein is thereby effected is changed.).
  • the modified portion of the G6PD gene is flanked in the homologous recombination vector at its 5 'and 3' ends by additional nucleic acid of the G6PD gene, which is a homologous recombination between the exogenous G6PD gene carried by the vector. and an endogenous G6PD gene in a microorganism.
  • the additional flanking G6PD nucleic acid is long enough for successful homologous recombination with the endogenous gene.
  • the vector usually contains several kilobases of flanking DNA (at both the 5 'and 3' ends) (see e.g. Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vectors).
  • the vector is introduced into a microorganism (e.g., by electroporation), and cells in which the introduced G6PD gene is homologously recombined with the endogenous G6PD gene are selected using methods known in the art.
  • recombinant microorganisms can be produced which contain selected systems which allow regulated expression of the introduced gene.
  • a host cell according to the invention such as a prokaryotic or eukaryotic host cell in culture, can be used to produce (i.e., express) a G6PD protein.
  • the invention also provides methods for producing G6PD proteins using the host cells of the invention.
  • the method comprises culturing the host cell according to the invention (into which a recombinant expression vector encoding a G6PD protein has been introduced, or into whose genome a gene encoding a wild-type or modified G6PD protein has been introduced) in a suitable medium until the G6PD protein has been produced.
  • the method comprises isolating the G6PD proteins from the medium or the host cell.
  • the nucleic acid molecules, proteins, protein homologs, fusion proteins, primers, vectors and host cells described here can be used in one or more of the following methods: identification of C. glutamicum and related organisms, mapping of genomes of organisms that are related to C. glutamicum related, identification and localization of C. glu amicum sequences of interest, evolution studies, determination of G6PD protein regions which are necessary for the function, modulation of the activity of a G6PD protein; Modulating the activity of a G6PD pathway; and modulating the cellular production of a desired compound, such as a fine chemical.
  • the G6PD nucleic acid molecules according to the invention have a multitude of uses.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of C. gl u tamicum genes. By probing the extracted genomic DNA of a culture of a uniform or mixed population of microorganisms under stringent conditions with a probe comprising a region of a C. glu amicum gene that is unique to that organism, one can determine whether this organism is present , Corynebacterium glutamicum itself is not pathogenic, but it is with pathogenic species such as Corynebacterium dipthe riae, related. The detection of such an organism is of significant clinical importance.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can serve as markers for specific regions of the genome. This is useful not only when mapping the genome, but also for functional studies of C. glu amicum proteins.
  • the C. glu amicum geno can be cleaved, for example, and the fragments incubated with the DNA-binding protein.
  • Those that bind the protein can additionally be probed with the nucleic acid molecules according to the invention, preferably with easily detectable labels; the binding of such a nucleic acid molecule to the genome fragment enables the fragment to be located on the genomic map of C.
  • nucleic acid molecules according to the invention can moreover be sufficiently homologous to the sequences of related species so that these nucleic acid molecules can serve as markers for the construction of a genomic map in related bacteria, such as BrevJ-bacterer u lactofermentum.
  • the G6PD nucleic acid molecules according to the invention are also suitable for evolution and protein structure studies.
  • the sugar intake system in which the molecules according to the invention are involved is used by many bacteria;
  • the degree of evolutionary kinship of the organisms can be determined. Accordingly, such a comparison enables the determination of which sequence regions are conserved and which are not, which can be helpful in determining those regions of the protein which are essential for the enzyme function.
  • This type of determination is valuable for protein technology studies and can provide an indication of which protein can tolerate mutagenesis without losing function.
  • the manipulation of the G6PD nucleic acid molecules according to the invention can bring about the production of G6PD proteins with functional differences from the wild-type G6PD proteins. These proteins can be improved in their efficiency or activity, can be present in the cell in larger numbers than usual, or can be weakened in their efficiency or activity.
  • the G6PD molecules according to the invention can be modified in such a way that the yield, production and / or efficiency of production of one or more fine chemicals is improved. By modifying a G6PD protein involved in glucose uptake to have optimal activity, the extent of glucose uptake or the rate at which glucose is delivered into the cell can be increased.
  • the breakdown of glucose and other sugars within the cell provides the energy that can be used to drive energetically unfavorable biochemical reactions, such as those involved in the biosynthesis of fine chemicals. This degradation also provides intermediate and precursor molecules for the biosynthesis of certain fine chemicals, such as amino acids, vitamins and cofactors.
  • the G6PD molecules according to the invention can be involved in one or more intracellular signal transduction pathways which influence the yields and / or production rate of one or more fine chemicals from C. glutamicum.
  • proteins that are necessary for the import of one or more sugars from the extracellular medium eg HPr, enzyme 1 or a building block of an enzyme-II complex
  • HPr high intracellular fructose-1,6-bisphosphate levels cause the phosphorylation of HPr on serine-46, whereupon this molecule can no longer participate in the transport of a sugar.
  • This intracellular sugar level, at which the transport system is switched off, may be sufficient to maintain the normal functioning of the cell, but is restrictive for the overproduction of the desired fine chemical. It is therefore desirable to modify the G6PD proteins of the invention so that they no longer support such negative regulation are receptive. This results in larger intracellular concentrations of one or more sugars, and by extension, more efficient production or greater yields of one or more fine chemicals from organisms that contain these mutant G6PD proteins.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can be used to generate C. glutamicum or related bacterial strains which express mutant G6PD nucleic acid and protein molecules, so that the yield, production and / or efficiency of the production of a desired one Connection is improved.
  • the desired compound can be a natural product of C. glutamicum which comprises the end products of the biosynthetic pathways and intermediates of naturally occurring metabolic pathways as well as molecules which do not occur naturally in the metabolism of C. glutamicum but which are produced by a C. glutamicum strain according to the invention become.
  • Example 1 Preparation of the entire genomic DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • a culture of Corynebacterium glutamicum was grown overnight at 30 ° C with vigorous shaking in BHI medium (Difco). The cells were harvested by centrifugation, the supernatant was discarded, and the cells were placed in 5 ml of buffer I (5% of the original volume of the culture - all stated
  • the composition of buffer I 140.34 g / 1 sucrose, 2.46 g / 1 MgS0 4 • 7 H 2 0, 10 ml / 1 KH 2 P0 4 solution (100 g / l, adjusted to pH with KOH 6.7), 50 ml / 1 M12 concentrate (10 g / 1 (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / 1 NaCl, 2 g / 1 MgS0 • 7 H0, 0.2 g / 1 CaCl 2 , 0 , 5 g / 1 yeast extract (Difco), 10 ml / 1 trace element mixture (200 mg / 1 FeS0 4 ⁇ H 2 0, 10 mg / 1 ZnS0 4 • 7 H 2 0, 3 mg / 1 MnCl 2 • 4 H 2 0, 30 mg / 1 H 3 B0 3 , 20 mg / 1 CoCl 2 • 6 H 2 0, 1 mg / 1 NiC
  • Lysozyme was added to the suspension at a final concentration of 2.5 mg / ml. After about 4 hours of incubation at 37 ° C, the cell wall was broken down and the protoplasts obtained were harvested by centrifugation. The pellet was washed once with 5 ml of buffer
  • the DNA was purified by extraction with phenol, phenol-chloroform-isoamyl alcohol and chloroform-isoamyl alcohol using standard procedures. The DNA was then extracted by adding 1/50 volume of 3 M sodium acetate and 2 volumes of ethanol, followed by incubation for 30 min at -20 ° C. and centrifugation for 20 min at 12,000 rpm in a high-speed centrifuge with an SS34 rotor (Sorvall). The DNA was dissolved in 1 ml of TE buffer containing 20 ⁇ g / ml RNase A and dialyzed against 1000 ml of TE buffer for at least 3 hours at 4 ° C. During this time, the buffer was exchanged 3 times To 0.4 ml aliquots of the
  • 30 can be used, including Southern blotting or to construct genomic libraries.
  • Plasmids of the pBS series pBSSK +, pBSSK- and others; Stratagene, LaJolla, USA
  • Cos- mide such as SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) or Lorist6 (Gibson, TJ Rosenthal, A., and Waterson, RH (1987) Gene 53: 283-286.
  • Genomic banks as described in Example 2, were used for DNA sequencing according to standard methods, in particular the chain termination method with ABI377 sequencing machines (see eg Fleischman, RD et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd. , Science 269; 496-512)
  • the sequencing primers with the following nucleotide sequences were used: 5 '-GGAAACAGTATGACCATG-3' or
  • In vivo mutagenesis of Corynebacterium glutamicum can be performed by passing a plasmid (or other vector) DNA through E. coli or other microorganisms (e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae) that maintain the integrity of their genetic information cannot maintain.
  • E. coli or other microorganisms e.g. Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae
  • Common mutator strains have mutations in the genes for the DNA repair system (eg, mutHLS, mutD, mutT, etc., for comparison see Rupp, WD (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, pp. 2277-2294, ASM : Washington). These strains are known to the person skilled in the art. The use of these strains is, for example, in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 illustrates.
  • Example 5 DNA transfer between Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum
  • Corynebacterium and BreviJbacterium species contain endogenous plasmids (such as pHM1519 or pBLl) that replicate autonomously (for an overview, see, for example, Martin, JF et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146).
  • Shuttle vectors for Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum can easily be constructed using standard vectors for E. coli (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, FM et al.
  • origins of replication are preferably taken from endogenous plasmids isolated from Corynebacterium and BreviJbactertium species.
  • transformation markers for these species are genes for kanamycin resistance (such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon) or for chloramphenicol (Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Techno- logy, VCH, Weinheim)
  • kanamycin resistance such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon
  • chloramphenicol Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Techno- logy, VCH, Weinheim
  • glutamicum and which can be used for various purposes, including gene overexpression (see, e.g., Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, JF et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 and Eikmanns, BJ et al. ( 1992) Gene 102: 93-98).
  • C. glutamicum can be carried out by protoplast transformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), electroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters , 53: 399-303) and, in cases where special vectors are used, can also be achieved by conjugation (as described, for example, in Schaefer, A., et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666).
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the mutant gene is to carry out a Northern blot (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols) in Molecular Biology, Wiley: New York), wherein a primer that is designed to bind to the gene of interest is provided with a detectable (usually radioactive or chemiluminescent) label so that - if the total RNA is one Culture of the organism extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe - the binding and the quantity of binding of the probe are present and also indicates the amount of mRNA for that gene.
  • a detectable label usually radioactive or chemiluminescent
  • Total cell RNA can be isolated from Corynebacterium glutamicum by various methods known in the art, as described in Bormann, ER et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • This probe 15 bodies, incubated, which binds specifically to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easy to detect. The presence and the observed amount of label shows the presence and the amount of the mutant product sought.
  • Example 7 Growth of genetically modified Corynebacterium glutamicum media and growing conditions
  • sugars such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials 5, containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts, such as NH 4 C1 or (NH 4 ) S0 4 , NH 4 OH, nitrates, urine Substance, amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, yeast extracts, meat extracts and others.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus, or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the media usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, ribofavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts often come from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like.
  • the exact composition of the media connections depends heavily on the respective experiment and is decided individually for each case. Information on media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized, either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can either be sterilized together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or can be added continuously or in batches.
  • the growing conditions are defined separately for each experiment.
  • the temperature should be between 15 ° C and 45 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0, and can be maintained by adding buffers to the media.
  • An exemplary buffer for this purpose is a potassium phosphate buffer.
  • Synthetic buffers such as MOPS, HEPES; ACES etc. can be used alternatively or simultaneously.
  • the cultivation pH can also be kept constant during the cultivation by adding NaOH or NH 4 OH. If complex media components such as yeast extract are used, the need for additional buffers is reduced, since many complex compounds have a high buffer capacity.
  • a Fermenters for the cultivation of microorganisms can also regulate the pH value with gaseous ammonia.
  • the incubation period is usually in the range of several hours to several days. This time is selected so that the maximum amount of product accumulates in the broth.
  • the disclosed growth experiments can be carried out in a variety of containers, such as microtiter plates, glass tubes, glass flasks or glass or metal fermenters of different sizes.
  • the microorganisms should be grown in microtiter plates, glass tubes or shake flasks with or without baffles.
  • 100 ml shake flasks are used, which are filled with 10% (by volume) of the required growth medium.
  • the flasks should be shaken on a rotary shaker (amplitude 25 mm) at a speed in the range of 100-300 rpm. Evaporation losses can be reduced by maintaining a humid atmosphere; alternatively, a mathematical correction should be carried out for the evaporation losses.
  • the medium is seeded to an OD 6 oo of 0/5-1.5 using cells grown on agar plates, such as CM plates (10 g / 1 glucose, 2.5 g / 1 NaCl, 2 g / 1 urea, 10 g / 1 polypeptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 meat extract, 22 g / 1 agar pH 6.8 with 2 M NaOH), which have been incubated at 30 ° C.
  • the inoculation of the media is carried out either by introducing a saline solution of C. glutamicum cells from CM plates or by adding a liquid preculture of this bacterium.
  • DNA band shift assays also referred to as gel retardation assays
  • reporter gene assays as described in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 and the references cited therein. Reporter gene test systems are well known and established for use in pro- and eukaryotic cells using enzymes such as beta-galactosidase, green fluorescent protein and several others.
  • membrane transport proteins The activity of membrane transport proteins can be determined according to the techniques described in Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 85-137; 199-234; and 270-322.
  • the effect of the genetic modification in C. glutamicum on the production of a desired compound can be determined by growing the modified microorganisms under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cell - Lular components is examined for the increased production of the desired product (ie an amino acid).
  • suitable conditions such as those described above
  • Such analysis techniques are well known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p. A2). 89-90 and pp.
  • the analysis methods include measurements of the amounts of nutrients in the medium (e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of common metabolites from biosynthetic pathways and measurements of gases that are produced during fermentation - 0 be fathered. Standard methods for these measurements are in
  • Example 10 Purification of the desired product from C. glutamicum culture
  • the desired product can be obtained from C. glutamicum cells or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted from the cells, the cells from the culture can be harvested by low-speed centrifugation, the cells can by standard techniques, such as 5 mechanical force or sonication are lysed. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted from the C. glutamicum cells Zel- be * ⁇ len by slow centrifugation from the culture removed and the supernatant fraction is retained for further purification.
  • the supernatant fraction from either purification method is subjected to chromatography with a suitable resin, the desired 5 molecule is either retained on the chromatography resin while many contaminants but not, or the contaminants remaining in the sample on the resin, the However, no rehearsal.
  • chromatography steps can be repeated if necessary using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and the most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is at a maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by standard techniques in the art. These include high-performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin-layer chromatography, NIRS, enzyme test or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • NIRS enzyme test or microbiological tests.

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Abstract

Isoliertes Nukleinsäuremolekül codierend für ein Polypeptid mit der jeweils in Tabelle1/Spalte2 in Bezug genommenen Aminosäuresequenz wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Tabelle1/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition eine andere proteinogene Aminosäure codiert als die jeweilige in Tabelle1/Spalte5 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure.

Description

Gene die für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Proteine codieren
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich-vorkommenden Stoffwechselprozessen in Zellen werden in vielen Industriezweigen* verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, ipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Co- faktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen des jeweils gewünschten Moleküls zu produzieren und sezernieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus ist Corynebacteriim glutamicum, ein gram-positives, nicht-patho- genes Bakterium. Über Stammselektion ist eine Reihe von Mutanten- stammen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter
Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt neuartige Nukleinsäuremoleküle bereit, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Corynebacterium glutamicum oder verwandten Bakterienarten verwenden lassen. C. glutamicum ist ein gram-positives, aerobes Bakterium, das in der Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von Feinchemikalien, und auch zum Abbau von Kohlenwasserstoffen (bspw. beim Überlaufen von Rohöl) und zur Oxidation von Terpenoi- den gemeinhin verwendet wird. Die Nukleinsäuremoleküle können da- her zum Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch Fermentationsverfahren, verwenden lassen. C. gJutaιr.icuπ. selbst ist zwar nicht-pathogen, jedoch ist es mit anderen Corynebacterium-Arten, wie Corynebacterium diphtheriae (dem Erreger der Diphtherie) ver- wandt, die bedeutende Pathogene beim Menschen sind. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Corynebacterium-Arten zu identifizieren, kann daher auch eine signifikante klinische Bedeutung haben, z.B. bei diagnostischen Anwendungen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zudem als Bezugspunkte zur Kartierung des C. glutamicum- Genoms oder von Genomen verwandter Organismen dienen. Diese neuen Nukleinsäuremoleküle codieren Proteine, die als Glu- cose-6-Phosphat-Dehydrogenase bezeichnet werden.
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Gene aus Corynebakterien sind beispielsweise in EP 1108790A2 beschrieben. Allerdings codieren die dort beschriebenen Gene für Polypeptidsequenzen, die kürzer als die hier erfindungsgemäß beschriebenen sind. Die in EP 1108790A2 beschriebene Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ist am N-Terminus um 30 Aminosäuren verkürzt gegenüber der hier bean- spruchten Polypeptidsequenz .
Von Moritz et al. (Eur. J. Biochemistry 267, 3442-3452, 2000) wird die Isolierung einer Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum beschrieben. Die dort beschriebene N-Terminale Proteinsequenzierung ergibt ein Polypeptid, das mit einem Serin startet und verschieden von dem erfindungsgemäßen Protein ist.
Gegenstand der Erfindung sind neue Gene für Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase, die mit der Aminosäure in Position 1 oder 2, d.h. Val oder Ser, starten und an der Position 243 eine proteinogene Aminosäure codieren, die nicht Ala ist (Nummerierung bezogen auf SEQ ID NO:2) .
Besonders bevorzugt sind neue Gene für Glucose-6-Phosphat-
Dehydrogenase, die mit der Aminosäure in Position 1 starten und an der Position 243 Thr codieren (Nummerierung bezogen auf SEQ ID NO: 2) .
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle lassen sich zur genetischen Manipulation eines Organismus verwenden, um ihn als Produzenten von einer oder mehreren Feinchemikalien besser und effizienter zu machen. Die erfindungsgemäßen Moleküle lassen sich so modifizieren, daß die Ausbeute, Produktion und/oder die Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien verbessert wird.
Die erfindungsgemäßen Moleküle können ferner an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sein, die die Ausbeuten und/oder die Geschwindigkeit der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien von C. glutamicum beeinflussen. Proteine, die bspw. für den Import von einem oder mehreren Zuk- kern aus dem extrazellulären Medium nötig sind (bspw. Hpr, Enzym I, oder ein Bestandteil des Enzym-II-Komplexes) , werden bei Vorhandensein einer hinreichenden Menge Zucker in der Zelle häufig posttranslational modifiziert, so daß sie diesen Zucker nicht mehr importieren können. Die Zuckermenge, bei der das Transport- System abgeschaltet wird, reicht zwar zur Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktionen aus, jedoch schränkt sie die Überproduktion der gewünschten Feinchemikalie ein. Es empfiehlt sich daher, die erfindungsgemäßen Proteine zu modifizieren, so daß sie auf > eine solche negative Regulation nicht mehr ansprechen. Dadurch lassen sich höhere intrazelluläre Konzentrationen eines oder mehrerer Zucker und durch Extension eine effizientere Produktion oder höhere Ausbeuten von einer oder mehreren Feinchemikalien aus Organismen erzielen, die diese mutanten Proteine enthalten.
Als Anhang A werden im folgenden die Nukleinsäuresequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Als Anhang B werden im folgenden die Polypeptidsequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das isolierte Nuklein- säuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsauremolekul, das eine Nukleotidsequenz aus Anhang A umfaßt . Das isolierte Nukleinsauremolekul entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nukleinsauremolekul . Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker bevorzugt ein natürlich vorkommendes C. g2ufcamicum-G6PD-Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw. rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, und Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird zur Herstellung eines G6PD-Proteins eine Wirtszelle verwendet, die in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das G6PD-Protein kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch veränderten Mikroorganismus, bei dem ein G6PD-Gen eingebracht oder verändert worden ist. Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer Ausführungsform durch Einbringen mindestens eines erfindungs- gemäßen Nukleinsäuremoleküls verändert worden, das die mutierte G6PD-Sequenz als Transgen codiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes G6PD-Gen im Genom des Mikroorganismus durch homologe Rekombination mit einem veränderten G6PD-Gen verändert, z.B. funktionell disruptiert, worden. Der Mikroorganismus gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, wobei Corynebacterium glutamicum besonders bevorzugt ist. Der Mikroorganismus wird in einer bevor- zugten Ausführungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung, wie einer Aminosäure, besonders bevorzugt ysin, verwendet .
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Wirtszellen, die mehr als eine der in Anhang A beschriebenen Nukleinsäuremoleküle besitzen. Solche Wirtszellen lassen sich auf verschiedene dem Fachmann bekannte Wege herstellen. Beispielsweise können sie durch Vektoren, die mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäure o- leküle tragen, transfiziert werden. Es ist aber auch möglich mit einem Vektor jeweils ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul in die Wirtszelle einzubringen und deshalb mehrere Vektoren entweder gleichzeitig oder zeitlich abgestuft einzusetzen. Es können somit Wirtszellen konstruiert werden, die zahlreiche, bis zu mehreren Hundert der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen tragen. Durch eine solche Akkumulation lassen sich häufig überadditive Effekte auf die Wirtszelle hinsichtlich der Feinchemikalien-Produktivität erzielen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes G6PD- Protein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven Abschnitt davon. Das isolierte G6PD-Protein oder sein Abschnitt kann in einer bevorzugten Ausführungsform am Import von energiereichen Kohlenstoff-Molekülen (bspw. Glucose, Fructose oder Sac- charose) in C. glutamicum und zudem an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen von C. glutamicum beteiligt sein. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte G6PD-Protein oder ein Abschnitt davon hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B, so daß das Protein oder sein Abschnitt weiterhin am Import von energiereichen Kohlenstoff-Molekülen (bspw. Glucose, Fructose oder Saccharose) in C. glutamicum und/oder an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen von C. glutamicum teilnehmen kann.
Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes Glu-6-Phosphat-Dehy- drogenaseProteinpräparat. Das Glu-6-Phosphat-DehydrogenaseG6PD- Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängenprotein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird) im wesentlichen homolog ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- Stellung einer Feinchemikalie . Das Verfahren sieht die Anzucht einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer Nuklein- säure bewirkt . Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt, bei dem die Feinchemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei einer * bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder Breviba c t eri um .
I. Feinchemikalien
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, und Kosmetik-Industrie. Diese Verbindungen umfassen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und Diamino- pimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidon- säure) , Diole (bspw. Propandiol und Butandiol) , Kohlenhydrate (bspw. Hyaluronsäure und Trehalose) , aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo) , Vitamine und Co- faktoren (wie beschrieben in Ulimann's Encyclopedia of Industrial Che istry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Techno- logical Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
A. Aminosäure-Metaiolismus und Verwendungen
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht- proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ulimann' s Ency- clopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin) , so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Biosyntheseswege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähig- keit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschaftsund pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Amino- säure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mononatriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin,
Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threonin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim) . Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S) -5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533 - 606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat , einem Zwischenprodukt im Citronensäure- Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse) , und ergibt nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homo- cystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seiten- ketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und Pentose- phosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt-Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangs- molekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhy- droxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-l-pyrophosphat, einem aktivier- ten Zucker.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die Haupt-StoffWechsel- wege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel- Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure-Biosynthesewegen, siehe Stryer, L. , Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
B. Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwendungen
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nähr- wert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfs- stoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbin- düngen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nah- rungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren).
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecu- lar Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associa- tions in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) .
Thiamin (Vitamin Bi) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B ) wird aus Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) und Ribose-5 ' -phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavinmono- nukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5 ' -phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid) , sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6-methyl- pyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R- (+) -N- (2 , 4-Dihydroxy- 3 , 3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-ge- triebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure . Die für die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5 '-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R) -Pantoinsäure, (R) -Pantolacton, (R) -Panthenol (Provitamin B5) , Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster- Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekom.plexes und des α-Ketoglutaratdehydro- genasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechselzwischenprodukten Guanosin- 5 ' -triphosphat (GTP), L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin Bι2) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin Bι ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinami- dadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größten- teils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin Bβ, Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin Bχ wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vi- tro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
C. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff
"Nukleotid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pen- tose-Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zuk- ker D-Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekü- len ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzerogenen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikations-Fähigkeit von Tumorzellen hemmen.
Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw.
Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res . Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Syn- thesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiede- ner Feinchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin) , als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als Geschmacksverstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A. , (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al . , Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612). Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleo- sides"; Kap. 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York) . Der Purin- Metabolismus, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabo- lismus in höheren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5 ' -phosphat (IMP) aus Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5 ' -monophosphat (GMP) oder Adenosin-5 ' -monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle lie- fert . Die Pyrimidinbiosynthese erfolgt über die Bildung von Uri- din-5 ' -monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat . UMP wiederum wird in Cytidin-5 ' -triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyfor- men sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktions- reaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyriboseform des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
D. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über α,α-l,l- Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet . Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; und Shiosaka, M.J. Japan 172 (1997) 97-102) . Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
II. Erfindunσsσemäße Elemente und Verfahren
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung von neuen Molekülen, die hier als G6PD-Nukleinsäure- und -Protein-Moleküle bezeichnet werden und an der Aufnahme energie- reicher Kohlenstoffmoleküle (z.B. Glucose, Saccharose und Fructose) in C. glutamicum beteiligt sind und auch an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen in diesen Mikroorganismen beteiligt sein können. Bei einer Ausführungsform importieren die G6PD-Moleküle energiereiche Kohlenstoffmoleküle in die Zelle, wo die durch ihren Abbau erzeugte Energie zum Antreiben energetisch weniger begünstigter biochemischer Reaktionen eingesetzt wird. Ihre Abbauprodukte können als Zwischenprodukte oder Vorstufen für eine Reihe anderer Stoffwechselwege eingesetzt werden. Bei einer anderen Ausführungsform können die G6PD-Moleküle an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen teilnehmen, wobei die Gegenwart einer modifizierten Form eines G6PD-Moleküls (z.B. ein phosphoryliertes G6PD-Protein) an einer Signaltransduktionskaskade teilnehmen kann, die einen oder mehrere Zellvorgänge reguliert. Die Aktivität der erfindungsgemäßen G6PD-Moleküle hat bei einer bevorzugten Ausführungsform eine Auswirkung auf die Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform haben die erfindungsgemäßen G6PD-Moleküle eine modulierte Aktivität, so daß die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien aus C. glutamicum ebenfalls moduliert sind. Die erfindungsgemäßen G6PD-Moleküle sind in einer anderen Ausführungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie C. glutamicum, zu modulieren. Mit Hilfe von Genrekombinationstechniken lassen sich ein oder mehrere erfindungsgemäße G6PD-Proteine derart manipulieren, daß ihre Funktion moduliert ist. Bspw. kann ein Protein, das am G6PD-vermittelten Import von Glucose beteiligt ist, so verändert werden, daß es optimale Aktivität aufweist, und das G6PD-System für den Import von Glucose kann somit größere Mengen Glucose in die Zelle befördern. Glucosemoleküle werden nicht nur als Energiequelle für energetisch ungünstige biochemische Reaktionen, wie die Biosynthese von Feinchemikalien verwendet, sondern auch als Vorstufen und Zwischenprodukte bei einer Reihe von Feinchemikalien-Biosynthesewegen (bspw. wird Serin aus 3-Phosphoglycerat synthetisiert) . In jedem Fall läßt sich die Gesamtausbeute oder die Produktionsrate einer dieser gewünschten Feinchemikalien erhöhen, und zwar durch Erhöhen der Energie, die verfügbar ist, damit diese Produktion stattfindet, oder durch Vergrößern der Verfügbarkeit der Verbindungen, die nötig sind, damit diese Produktion stattfindet.
Als Ausgangspunkt zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nuklein- säuresequenzen eignet sich das Genom eines Corynebacterium gluta- micum-Stammes, der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist.
Von diesen Nukleinsäuresequenzen lassen sich durch die in Tabelle 1 bezeichneten Veränderungen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit üblichen Verfahren herstellen.
Das erfindungsgemäße G6PD-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragmente davon können am Transport von energiereichen kohlenstoffhaltigen Molekülen, wie Glucose, in C. glutamicum oder an einer intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikro- Organismus beteiligt sein, oder können eine oder mehrere der in Tabelle 1 aufgeführten Aktivitäten aufweisen.
In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben:
A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die G6PD-Polypeptide oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als
Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Ampli- fizierung von G6PD-codierenden Nukleinsäuren (z.B. G6PD-DNA) hin- reichen. Der Begriff "Nukleinsauremolekul" soll DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. RNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5 '-Ende des codierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 ' -Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa ' 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 '-Endes des codierenden Genbereichs . Das Nukleinsauremolekul kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise eine doppelsträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsauremolekul wird aus anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw. 3 '-Ende der Nukleinsäure befinden). In verschiedenen Ausführungsformen kann bspw. das isolierte G6PD-Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsauremolekul in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (bspw. eine C. glutamicum-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsauremolekul, wie ein cDNA-Molekül kann überdies im wesentlichen frei von einem anderen zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsauremolekul, bspw. eine Nukleinsäu- remolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation hergestellt werden. Bspw. kann eine C. glutamicum-G6PD-cDNA aus einer C. gluta icum-Bank isoliert werden, indem eine vollständige Se- quenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungs- sonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw. beschrieben in Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsauremolekul, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremo- lekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isoliert werden, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt worden sind) . Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen isolieren (bspw. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) und die cDNA kann mittels reverser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV-Reverse-Trans- kriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Re- verse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via Polymerasekettereaktion las- sen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß PCR-Standard-Amplifikations- techniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer G6PD-Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard-Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsauremolekul eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsauremolekul ein zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen komplementäres Nukleinsauremolekul oder einen Abschnitt davon, wobei es sich um ein Nukleinsauremolekul handelt, das zu einer der in Anhang A gezeig- ten Nukleotidsequenzen hinreichend komplementär ist, daß es mit einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex entsteht.
Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nuklein- säuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine
Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt davon weiterhin am Transport von energiereichen Kohlenstoffmolekülen (wie Glucose) in C. glutamicum und auch an einem oder meh- reren intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sein kann. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog" Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste (bspw. ein Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seiten- kette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweisen, so daß das Protein oder ein Abschnitt davon energiereiche Kohlenstoffmole- küle, wie Glucose, in C. glutamicum transportieren kann und zudem an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein kann. Proteinbestandteile dieser Stoffwechselwege transportieren, wie hier beschrieben, energiereiche kohlen- stoffhaltige Moleküle wie Glucose in C. glutamicum und können auch an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein. Beispiele dieser Aktivitäten sind ebenfalls hier beschrieben. Somit betrifft die "Funktion eines G6PD-Proteins" das vollständige Funktionieren und/oder die Regu- lation von einem oder mehreren Zuckertransport-Wegen auf Phospho- enolpyruvat-Basis. In Tabelle 1 sind Beispiele der G6PD-Protei- naktivitäten angegeben.
Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen G6PD- Nukleinsäuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der G6PD-Proteine . Der Begriff "biologisch aktiver Abschnitt eines G6PD-Proteins" , wie er hier verwendet wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne oder ein Motiv, eines G6PD-Proteins umfassen, die/das energiereiche kohlenstoffhaltige Moleküle, wie Glucose, in C. glutamicum transportieren kann, oder an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein kann, oder eine in Tabelle 1 angegebene Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob ein G6PD-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon am Transport von energiereichen kohlenstoffhaltigen Molekülen, wie Glucose, in C. glutamicum oder an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend beschrieben in Beispiel 8 des Bei- spielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der G6PD-Sequenz, die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich ebenfalls dessen bewußt, daß Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur Änderung der Aminosäuresequenz des codierten G6PD-Proteins führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit des G6PD-Proteins beeinträchtigt wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nichtessentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen füh- ren, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest läßt sich in einer Wildtypsequenz von einem der G6PD-Proteine (Anhang B) verändern, ohne daß die Aktivität des G6PD-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die G6PD-Proteinaktivität erfor- derlich ist. Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht-konser- vierte oder lediglich semikonservierte Aminosäurereste in der Domäne mit G6PD-Aktivität) können für die Aktivität nicht essen- tiell sein und lassen sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die GδPD-Aktivität verändert wird.
Ein isoliertes Nukleinsauremolekul, das ein G6PD-Protein codiert, das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz aus Anhang ' A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein einge- bracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen aus Anhang A durch Standard-Techniken eingebracht werden, wie stellengerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparagin- säure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein) , nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan) , beta-ver- zweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einem G6PD-Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der G6PD-codieren- den Sequenz eingebracht werden, bspw. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf die hier beschriebene G6PD-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine G6PD-Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte Protein rekom- binant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel 8 des Beispielteils) bestimmt werden.
B. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein G6PD-Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier verwendet betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsauremolekul, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (bspw. Bakterienvektoren, mit bakteriellem Replikationsur- sprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expres- sionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren) , die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor umfaßt eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur Expres- sion der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu expriπu.erenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfaßt. In einem rekombinanten Exprtessionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden" , daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die regulatorische (n) Sequenz (en) gebunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem In-vitro-Tran- skriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) . Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (bspw. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese regulatorischen Sequenzen sind bspw beschrieben in Goeddel : Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw. Die erfindungsgemäßen Expressions- Vektoren können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -peptiden, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden, hergestellt werden (bspw. G6PD-Proteine, mutante Formen von G6PD-Proteinen, Fusionsproteine, usw.).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von G6PD-Proteinen in prokaryotischen oder euka- ryotischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können G6PD-Gene in bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit Bacu- lovirus-Expressionsvektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al . (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure,
Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Hrsg, S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen- und vielzelligen Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High effi- ciency AgroJbac erium tumefaciens-mediated transformation of Ara- bidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep. : 583-586) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirts- zellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, bspw. mit T7-Promotorregulatorischen Sequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Proteins, bei. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekombinanten. Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins ; und 3 ) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist . Diese Enzyme und ihre entsprechenden ErkennungsSequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Bio- tech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die codie- rende Sequenz des G6PD-Proteins in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus, GST - Thrombin- Spaltstelle - X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt werden. Das rekombinante G6PD-Protein, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions-Expressionsvek- toren aus E. coli umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301 - 315) und pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89) . Die Zielgenexpression aus dem pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pETlld-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnl0-lac- Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten viralen RNA- Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem re- sidenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128) . Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserieren- den Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression ausgewählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111 - 2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese uenzen erfolgt durch Stan- dard-DNA-Synthesetechniken. Bei einer weiteren Ausführungsform ist der G6PD-Proteinexpres- sionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Baldari et al . , (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al . (1987) Gene 54: 113 - 123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentö- sen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrie- ben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können die erfindungsgemäßen G6PD-Proteine in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen G6PD-Proteine in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen) oder in Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie Feldfrüchte) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D. , Kemper, E. , Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einem Säugetier-Expressionsvektor exprimiert.. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kauf- man et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt. Gemeinhin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Für weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen, siehe die Kapitel 16 und 17 aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante Säuge- 5 tier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zeiltyp bewirken (bspw. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet) . Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele für geei-
10 gnete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezepto- ren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) und Immun-
15 globulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren (bspw. Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., (1985) Science 230: 912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren
20 (bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166) . Entwicklungs- regulierte Promoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox- Pro otoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:
25 537-546) .
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Anti- sense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. Dies bedeu-
30 tet, daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch Transkription des DNA-.Moleküls) eines RNA-Moleküls , das zur G6PD-mRNA antisense ist, möglich ist. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in Antisense-Rich-
35 tung klonierte Nukleinsäure gebunden sind und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder Enhan- cer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die kon- stitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression
40 von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den
45 der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen, siehe Weintraub, H. et al . , Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Bspw. kann ein G6PD-Protein in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Ovarzel- len des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Mikroorganismen, die mit Corynebacterium glutamicum verwandt sind und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren läßt sich Vektor-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", wie sie hier verwendet werden, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Calcium- phosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszel- len lassen sich nachlesen in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern.
Für die stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, daß je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfekti- onstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integriert. Zur Identifizierung und Selektion dieser Inte- granten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selek- tier-bare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen Medika- mente, wie G418, Hygro ycin und Methotrexat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der ein G6PD-Protein codiert, oder kann auf einem ge- sonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z.B. Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, überleben, wohingegen die anderen Zellen sterben) .
Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines G6PD- Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um das G6PD-Gen zu verändern, bspw. funk- tionell zu disrumpieren. Dieses G6PD-Gen ist vorzugsweise ein Corynebacterium glutamicum-G6PD-Gen, jedoch kann ein Homologon von einem verwandten Bakterium oder sogar von einer Säugetier-, Hefeoder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene G6PD-Gen bei homologer Rekombination funktionell disrumpiert ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert, ebenfalls bezeichnet als "Knockout"-Vektor) . Der Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene G6PD-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen G6PD-Proteins verändert wird. ) . Der veränderte Abschnitt des G6PD-Gens ist im homologen Rekombinati- onsvektor an seinem 5'- und 3 '-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des G6PD-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen G6PD-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen G6PD-Gen in einem Mikroorganismus, ermöglicht. Die zusätzliche flankierende G6PD-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinrei- chend lang. Gewöhnlich enthält der Vektor mehrere Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3 '-Ende) (siehe z.B. Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren) . Der Vektor wird in einen Mikroorganismus (z.B. durch Elektroporation) einge- bracht, und Zellen, in denen das eingebrachte G6PD-Gen mit dem endogenen G6PD-Gen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Verfahren selektiert .
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorga- nis en produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines G6PD-Gens in einem Vektor unter der Kontrolle des Lac-Operons ermöglicht z.B. die Expression des G6PD-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Diese regulatorischen Systeme sind im Fachgebiet bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) eines G6PD-Proteins verwendet werden. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Produktion von G6PD-Proteinen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein G6PD-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder verändertes G6PD-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis das G6PD-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der G6PD-Proteine aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinho- mologa, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren nachstehenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von C. glutamicum und verwandten Organismen, Kar- tierung von Genomen von Organismen, die mit C. glutamicum verwandt sind, Identifikation und Lokalisation von C. glu amicum-Se- quenzen von Interesse, Evolutionsstudien, Bestimmung von G6PD- Proteinbereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation der Aktivität eines G6PD-Proteins ; Modulation der Aktivität eines G6PD-Wegs; und Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die erfindungsgemäßen G6PD-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Corynebacterium glutamicum oder naher Verwandten davon verwendet werden. Sie können zudem zur Identifikation von C. glutamicum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nu- kleinsäuresequenzen einer Reihe von C. gl u tamicum-Genen bereit. Durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einheitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines C. glu amicum-Gens umfaßt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus zugegen ist. Corynebacterium glutamicum selbst ist zwar nicht pathogen, jedoch ist es mit pathogenen Arten, wie Corynebacterium dipthe- riae, verwandt. Der Nachweis eines solchen Organismus ist von signifikanter klinischer Bedeutung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren des Genoms, sondern auch für funktioneile Studien von C. glu amicum-Proteinen nützlich. Zur Identifi-' kation des Genombereichs, an den ein bestimmtes C. glutamicum- DNA-bindendes Protein bindet, kann das C. glu amicum-Geno bspw. gespalten werden, und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genom- fragment ermöglicht die Lokalisation des Fragmentes auf der genomischen Karte von C. glutamicum, und wenn dies mehrmals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem hinreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Bakterien, wie BrevJ-bacte- r u lactofermentum, dienen können.
Die erfindungsgemäßen G6PD-Nukleinsäuremoleküle eignen sich ebenfalls für Evolutions- und Proteinstrukturuntersuchungen. Das Zuk- keraufnahmesystem, an dem die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, wird von vielen Bakterien ausgenutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit sol- chen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, welches Protein Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen G6PD-Nukleinsäuremoleküle kann die Produktion von G6PD-Proteinen mit funktioneilen Unterschieden zu den Wildtyp-G6PD-Proteinen bewirken. Diese Proteine können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle zu- gegen sein, oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität geschwächt sein. Die erfindungsgemäßen G6PD-Moleküle können derart modifiziert sein, daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien verbessert ist. Durch derartige Modifikation eines an der Glucoseaufnahme betei- ligten G6PD-Proteins, daß es optimale Aktivität aufweist, kann das Ausmaß der Glucoseaufnahme oder die Geschwindigkeit, mit der die Glucose in die Zelle befördert wird, vergrößert werden. Der ' Abbau von Glucose und anderen Zuckern innerhalb der Zelle stellt die Energie bereit, die zum Antrieb energetisch ungünstiger bio- chemischer Reaktionen, wie solchen, die an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt sind, verwendet werden kann. Dieser Abbau stellt ebenfalls Zwischen- und Vorstufenmoleküle für die Biosynthese bestimmter Feinchemikalien, wie Aminosäuren, Vitamine und Cofactoren, bereit. Durch Erhöhung der Menge an intrazellulä- ren energiereichen Kohlenstoffmolekülen durch Modifikation der erfindungsgemäßen G6PD-Moleküle kann man daher die Energie, die zur Durchführung von Stoffwechselwegen, die zur Produktion von ein oder mehreren Feinchemikalien notwendig sind, verfügbar ist, und auch die intrazellulären Pools von Metaboliten, die für eine solche Produktion notwendig sind, vergrößern. Umgekehrt kann man durch Senken des Imports eines Zuckers, dessen Abbauprodukte eine Verbindung umfassen, die nur in Stoffwechselwegen verwendet werden, die mit Stoffwechselwegen zur Produktion einer gewünschten Feinchemikalie um Enzyme, Cofaktoren oder Zwischenprodukte kon- kurrieren, diesen Stoffwechselweg herunterregulieren und somit vielleicht die Produktion durch den gewünschten Biosyntheseweg vergrößern.
Die erfindungsgemäßen G6PD-Moleküle können an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen, die die Ausbeuten und/ oder Produktionsrate von einer oder mehreren Feinchemikalien aus C. glutamicum beeinflussen, beteiligt sein. Bspw. werden Proteine, die für den Import von einem oder mehreren Zuckern aus dem extrazellulären Medium notwendig sind, (z.B. HPr, Enzym 1 oder ein Baustein eines Enzym-II-Komplexes) bei Anwesenheit einer hinreichenden Menge des Zuckers in der Zelle häufig posttranslatio- nal modifiziert, so daß sie nicht länger zum Import dieses Zuk- kers befähigt sind. Ein Beispiel hierfür erfolgt in E. coli , wo hohe intrazelluläre Fructose-1, 6-bisphosphatspiegel die Phospho- rylierung von HPr an Serin-46 bewirken, woraufhin dieses Molekül nicht länger am Transport eines Zuckers teilnehmen kann. Dieser intrazelluläre Zuckerspiegel, bei dem das Transportsystem abgeschaltet wird, kann zwar hinreichend sein, um die normale Funktion der Zelle aufrechtzuerhalten, ist jedoch für die Überproduk- tion der gewünschten Feinchemikalie einschränkend. Es ist daher wünschenswert, die erfindungsgemäßen G6PD-Proteine zu modifizieren, so daß sie nicht länger für eine solche negative Regulation empfänglich sind. Dadurch werden größere intrazelluläre Konzentrationen von einem oder mehreren Zuckern, und durch Extension, eine effizientere Produktion oder größere Ausbeuten von einer oder mehreren Feinchemikalien aus Organismen, die diese mutanten G6PD-Proteine enthalten, erzielt.
Diese vorstehend genannte Liste von Mutagenesestrategien für G6PD-Proteine, die erhöhte Ausbeuten einer gewünschten Verbindung bewirken sollen, soll nicht einschränkend sein; Variationen die- ser Mutagenesestrategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Durch diese Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um C. glutamicum oder verwandte Bakterienstämme, die mutierte G6PD-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so daß die Aus- beute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Die gewünschte Verbindung kann ein natürliches Produkt von C. glutamicum sein, welches die Endprodukte der Biosynthesewege und Zwischenprodukte natürlich vorkommender metabolischer Wege sowie Moleküle umfaßt, die im Metabolismus von C. glutamicum nicht natürlich vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen C. glutamicum-Stamm produziert werden.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung zitierter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1: Präparation der gesamten genomischen DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Eine Kultur von Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wurde über Nacht bei 30°C unter starkem Schütteln in BHI-Medium (Difco) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 5ml Puffer I (5% des Ursprungsvolumens der Kultur - sämtliche angegebenen
Volumina sind für 100 ml Kulturvolumen berechnet) resuspendiert. Die Zusammensetzung von Puffer I: 140,34 g/1 Saccharose, 2,46 g/1 MgS04 • 7 H20, 10 ml/1 KH2P04-Lösung (100g/l, mit KOH eingestellt auf pH-Wert 6,7), 50 ml/1 M12-Konzentrat (10 g/1 (NH4)2S04, 1 g/1 NaCl, 2 g/1 MgS0 • 7 H0, 0,2 g/1 CaCl2, 0,5 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) , 10 ml/1 Spurenelemente-Mischung (200 mg/1 FeS04 ■ H20, 10 mg/1 ZnS04 • 7 H20, 3 mg/1 MnCl2 • 4 H20, 30 mg/1 H3B03, 20 mg/1 CoCl2 • 6 H20, 1 mg/1 NiCl2 • 6 H20, 3 mg/1 Na2Mo0 • 2 H20, 500 mg/1 Komplexbildner (EDTA oder Citronensäure) , 100 ml/1 Vitamingemisch (0,2 ml/1 Biotin, 0,2 mg/1 Folsäure, 20 mg/1 p-Aminobenzoesäure, 20 mg/1 Riboflavin, 40 mg/1 Ca-Panthothenat, 140 mg/1 Nikotin- 5 säure, 40 mg/1 Pyridoxolhydrochlorid, 200 mg/1 Myoinositol) .
Lysozym wurde in einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml zur Suspension gegeben. Nach etwa 4 Std. Inkubation bei 37°C wurde die Zellwand abgebaut, und die erhaltenen Protoplasten wurden durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml Puffer
10 I und einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH- Wert 8) gewaschen. Das Pellet wurde in 4 ml TE-Puffer resuspendiert, und 0,5 ml SDS-Lösung (10%) und 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) wurden zugegeben. Nach Zugabe von Proteinase K in einer Endkonzentration von 200 oeg/ml wurde die Suspension etwa 18 Std. bei
15 37°C inkubiert. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol, Phenol- Chloroform-Isoamylalkohol und Chloroform-Isoamylalkohol mittels Standard-Verfahren gereinigt. Dann wurde die DNA durch Zugabe von 1/50 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol, anschließender Inkubation für 30 min bei -20°C und 30 min Zentrifugation "20 bei 12000 U/min in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit einem SS34-Rotor (Sorvall) gefällt. Die DNA wurde in 1 ml TE-Puffer gelöst, der 20 «g/ml RNase A enthielt, und für mindestens 3 Std. bei 4°C gegen 1000 ml TE-Puffer dialysiert. Während dieser Zeit wurde der Puffer 3mal ausgetauscht. Zu Aliquots von 0,4 ml der
25 dialysierten DNA-Lösung wurden 0,4 ml 2 M LiCl und 0,8 ml Ethanol zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei -20°C wurde die DNA durch Zentrifugation gesammelt (13000 U/min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland). Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer gelöst. Durch dieses Verfahren hergestellte DNA konnte für alle Zwecke
30 verwendet werden, einschließlich Southern-Blotting oder zur Konstruktion genomischer Banken.
Beispiel 2 : Konstruktion genomischer Corynebacterium glutamicum
(ATCC13032) -Banken in Escherichia coli 35
Ausgehend von DNA, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. 40 et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) Cosmid- und Plasmid-Banken hergestellt.
Es ließ sich jedes Plasmid oder Cosmid einsetzen. Besondere Verwendung fanden die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. 45 Natl Acad. Sei. USA, 75: 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe (pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder Cos- mide, wie SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) oder Lorist6 (Gibson, T.J. Rosenthal, A. , und Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286.
Beispiel 3: DNA-Sequenzierung und Computer-Funktionsanalyse
Genomische Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zur DNA- Sequenzierung gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem Kettenabbruchverfahren mit ABI377-Sequenziermaschinen (s. z.B. Fleischman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd. , Science 269; 496-512) verwendet. Die Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet: 5 ' -GGAAACAGTATGACCATG-3 ' oder
5 ' -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ' .
Beispiel 4 : In-vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) geleitet wird, die die Integrität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten können. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem auf (z.B., mutHLS, mutD, mutT, usw., zum Vergleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington). Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strate- gies 7; 32-34 veranschaulicht.
Beispiel 5: DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum
Mehrere Corynebacterium- und BreviJbacterium-Arten enthalten endogene Plasmide (wie bspw. pHM1519 oder pBLl) die autonom replizieren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146). Shuttle-Vektoren für Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum lassen sich leicht mittels Stan- dard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al . , (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus Corynebac- terium glutamicum beigegeben wird. Solche Replikationsursprünge werden vorzugsweise von endogenen Plasmiden entnommen, die aus Corynebacterium- und BreviJbactertium-Arten isoliert worden sind. Besondere Verwendung als Transformationsmarker für diese Arten sind Gene für Kanamycin-Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder Tn-903-Transposon stammen) oder für Chloramphenicol (Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Techno- logy, VCH, Weinheim) . Es gibt zahlreiche Beispiele in der Literatur zur Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren, die in E. coli und C. glutamicum repliziert werden, und die für verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen- Überexpression (siehe bspw. Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bac- teriol. 162: 591-597, Martin, J.F. et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 und Eikmanns, B.J. et al . (1992) Gene 102: 93-98).
Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu klonie- ren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum- Stämme einzubringen. Die Transformation von C. glutamicum läßt sich durch Protoplastentransformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), Elektroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) und in Fällen, bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch Konjugation erzielen (wie z.B. beschrieben in Schäfer, A. , et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die Shuttle-Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen, indem Plasmid-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet bekann- ter Standard-Verfahren) präpariert wird und in E. coli transformiert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit Standard-Verfahren erfolgen, jedoch wird vorteilhafterweise ein Mcr-defizien- ter E. coli-Stamm verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19) .
Beispiel 6 : Bestimmung der Expression des mutanten Proteins
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten Proteins in einer transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, daß das mu- tante Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge exprimiert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutanten Gens (ein Anzeichen für die mRNA-Menge, die für die Translation des Genprodukts verfügbar ist) ist die Durchführung eines Northern-Blots (s. bspw. Ausubel et al . , (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) , wobei ein Primer, der so ausgestaltet ist, daß er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden) Markierung versehen wird, so daß - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird - die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge von mRNA für dieses Gen anzeigt . Diese Information ist ein Nachweis für das Ausmaß der Transkription des mutanten Gens . Gesamt-Zell-RNA läßt sich durch verschiedene Verfahren aus Corynebacterium glutamicum isolieren, die im Fachgebiet 5 bekannt sind, wie beschrieben in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge von Protein, das aus dieser mRNA translatiert wird, können Standard-
10 Techniken, wie Western-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York) . Bei diesem Verfahren werden Gesamt-Zellproteine extrahiert, durch Gelelektrophorese getrennt, auf eine Matrix, wie Nitrocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Anti-
15 körper, inkubiert, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszierenden oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen läßt. Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutantenpro-
20 teins in der Zelle an.
Beispiel 7 : Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
" Genetisch veränderte Corynebakterien werden in synthetischen oder natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien für Corynebakterian sind bekannt und leicht erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol . 32: 205-210; von der Osten et al . (1998) Biotechnology Letters 11:
30 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A. , et al., Hrsg. Springer-Verlag) . Diese Medien bestehen aus einer oder mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind
35 Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffi- nose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte aus der
4^ Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und organische Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoff- quellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoff- 5 Verbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie NH4C1 oder (NH4) S04, NH4OH, Nitrate, Harn- Stoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakte, Fleischextrakte und andere.
Anorganische SalzVerbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor-, oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders ge- eignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat oder organische Säuren, wie Citronensäure . Die Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin, Ribo- flavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyrid- oxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden Fall individuell entschieden. Information über die Medien- Optimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stan- bury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten sind sterilisiert, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls ge- trennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert definiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer, wie MOPS, HEPES; ACES usw., können alternativ oder gleichzeitig verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert läßt sich während der Anzucht auch durch Zugabe von NaOH oder NH4OH konstant halten. Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt verwendet, sinkt der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe Verbindungen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines Fermenters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch mit gasförmigem Ammoniak reguliert werden.
Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von mehre- ren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt, daß sich die maximale Menge Produkt in der Brühe ansammelt. Die offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von Be-' hältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder Schüttelkolben entweder mit oder ohne Schikanen gezüchtet werden. Vorzugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10% (bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums ge- füllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler (Amplitude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 100-300 U/ min geschüttelt werden. Verdampfungsverluste können durch Aufrechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden; alternativ sollte für die Verdampfungsverluste eine mathematische Kor- rektur durchgeführt werden.
Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollten auch ein unmodifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet werden, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Das Medium wird auf eine OD6oo von 0/5 - 1,5 angeimpft, wobei Zellen verwendet werden, die auf Agarplatten gezüchtet wurden, wie CM-Platten (10 g/1 Glucose, 2,5 g/1 NaCl, 2 g/1 Harnstoff, 10 g/1 Polypep- ton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 Fleischextrakt, 22 g/1 Agar pH-Wert 6,8 mit 2 M NaOH) , die bei 30°C inkubiert worden sind. Das Animpfen der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung von C. glutamicum-Zellen von CM-Platten oder durch Zugabe einer flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 8 : In-vitro-Analyse der Funktion mutanter Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was in- nerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über Enzyme im Allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Dixon, M. , und Webb, E.C: (1979) Enzymes, Longmans, London;
Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Fran- cisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D: Hrsg. (1983) The En- zymes, 3. Aufl. Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Berg- eyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift- Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden) . Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann mit Reportergenassays (wie beschrieben in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 und den darin zitierten Literaturstellen) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotischen Zellen etabliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün-Fluoreszenz-Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann gemäß den Techniken, wie beschrieben in Gennis, R.B. (1989) "Po- res, Channels and Transporters", in Biomembranes , Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234; und 270-322, erfolgen.
Beispiel 9 : Analyse des Einflusses von imitiertem Protein auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen (wie solchen, die vorstehend beschrieben sind) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zel- lulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. einer Aminosäure) untersucht wird. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie, DünnschichtChromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analyti- sehe Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatogra- phie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. , et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification" , S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al . (1988) Bioseparations: downstream processing for Bio- technology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5 Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications) .
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es eben- 0 falls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt-Produkti- vität des Organismus, die Ausbeute und/oder die Effizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren um- 5 fassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen) , Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gewöhnlicher Metabolite aus Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation er- 0 zeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in
Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrieben. 5
Beispiel 10: Reinigung des gewünschten Produktes aus C. glutami- cum-Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus C. glutamicum-Zellen ° oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie 5 mechanische Kraft oder Ultrabeschallung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den C. glutamicum-Zellen sezerniert, werden die Zel- *ϊ len durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das 5 gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder wobei die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und der wirksamsten An- Wendung für ein bestimmtes, zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der ' die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, die nicht auf das vorhergehende Reinigungsverfahren eingeschränkt sind. Diese sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) .
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Standard-Techniken des Fachgebiets bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; und Schmidt et al . (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich Routinever- fahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein.
Die Angaben in Tabelle 1 sind folgendermassen zu verstehen:
In Spalte 1"DNA-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "5" in der Spalte "DNA-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 5. In Spalte 2"AS-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "6" in der Spalte "AS-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 6.
In Spalte 3"Identifikation" wird eine eindeutige interne Bezeichnung für jede Sequenz aufgeführt.
In Spalte 4 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition der Polypeptidsequenz "AS-ID" in der gleichen Zeile. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen Polypeptidsequenz. Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.
In Spalte 5 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Wildtyp-Stamm.
In Spalte 6 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 7"Funktion" wird die physiologische Funktion der entsprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt .
Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Phenylalanin
G Glycin
H His
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin Tabelle 1
Gene die für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Proteine codieren
DNA AS Identifikation: AS AS AS Funktion:

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nukleinsauremolekul codierend für ein Polypeptid mit der jeweils in Tabellel/Spalte2 in Bezug genommenen Aminosäuresequenz wobei das Nukleinsauremolekul in der in Ta- bellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition eine andere proteinogene Aminosäure codiert als die jeweilige in Ta- bellel/Spalte5 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure.
2. Isoliertes Nukleinsauremolekul nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsauremolekul in der in Tabellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition die in Tabellel/Spalteδ in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure codiert.
3. Ein Vektor, der wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 enthält.
4. Eine Wirtszelle, die mit wenigstens einem Vektor nach Anspruch 3 transfiziert ist.
5. Eine Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls zur Modulation der Produktion einer Feinchemikalie aus besagter Zelle führt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie welches die Kultivierung einer Zelle beinhaltet, die mit wenigstens einen Vektor nach Anspruch 3 transfiziert worden ist, so dass die Feinchemikalie produziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Feinchemikalie eine Aminosäure ist .
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Lysin ist.
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