WO2003040181A2 - Gene aus corynebacterium glutamicum die für regulatorische proteine codieren - Google Patents

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    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • Certain products and by-products of naturally occurring metabolic processes in cells are used in many industries, including the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries. These molecules, collectively referred to as “fine chemicals", include organic acids, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleotides and nucleosides, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins and cofactors and enzymes. Their production is best accomplished by growing large-scale bacteria that have been developed to produce and secrete large quantities of one or more desired molecules.
  • a particularly suitable organism for this purpose is Corynebacterium glutamic ⁇ m, a gram-positive, non-pathogenic bacterium. Through strain selection, a number of mutant strains have been developed that produce a range of desirable compounds. However, selecting strains that are improved in the production of a particular molecule is a time consuming and difficult process.
  • This invention provides novel nucleic acid molecules that can be used to identify or classify Coryne acterium glutamicum or related types of bacteria.
  • C. glutamicum is a gram-positive, aerobic bacterium which is commonly used in industry for the large-scale production of a number of fine chemicals, and also for the degradation of hydrocarbons (eg when crude oil overflows) and for the oxidation of terpenoids .
  • the nucleic acid molecules can therefore be used to identify microorganisms that can be used for the production of fine chemicals, for example by fermentation processes.
  • glutamicum itself is not pathogenic, but it is related to other Corynebacterium species n, such as Corynebacterium diphtheriae (the causative agent of diphtheria), which are important pathogens in humans.
  • Corynebacterium diphtheriae the causative agent of diphtheria
  • the ability to identify the presence of Corynebacterium species can therefore also be of significant clinical importance, for example in diagnostic applications.
  • These nucleic acid molecules can which serve as reference points for mapping the C. glutamicum genome or genomes of related organisms.
  • MR proteins which are referred to here as metabolically regulatory (MR) proteins.
  • MR proteins can, for example, perform a function which is involved in the transcription, translation or post-translational regulation of proteins which are important for the normal metabolic functioning of cells.
  • cloning vectors for use in Corynebacterium glutamicum such as disclosed in Sinskey et al., U.S. Patent No. 4,649,119, and techniques for genetically manipulating C. glutamicum and the related Brevibacteriu species (e.g. lactofermentum) Yoshiha a et al., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol.
  • nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of this organism in order to make it better and more efficient as a producer of one or more fine chemicals.
  • the improved yield, production and / or efficiency of the production of a fine chemical can be based on a direct or indirect effect of the manipulation of a gene according to the invention.
  • changes in C. glutamicum MR proteins that ordinarily regulate the yield, production, and / or efficiency of production of a fine chemical from a metabolic fine chemical pathway can have a direct impact on the overall production or production rate of one or more of these desired compounds have this organism.
  • Changes in the proteins that are involved in this substance through its own way can also have an indirect effect on the yield, production and / or efficiency of the production of a desired fine chemical.
  • the regulation of metabolism is necessarily complex, and the regulatory mechanisms which accomplish the different pathways can overlap in many places, so that more than one pathway can be set quickly according to a particular cell event.
  • a regulatory protein for one pathway to have an effect on many other pathways, some of which may be involved in the biosynthesis or degradation of a desired fine chemical.
  • modulating the effect of an MR protein can have an impact on the production of a fine chemical that is produced via a metabolic pathway that is different from that which is directly regulated by this MR protein.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can be used to directly improve the yield, production and / or efficiency of the production of one or more desired fine chemicals from Corynebacterium glutamicum.
  • one or more regulatory proteins according to the invention can be manipulated in such a way that their function is modulated.
  • the mutation of an MR protein involved in the repression of the transcription of a gene encoding an enzyme required for the biosynthesis of an amino acid so that it is no longer capable of repression of the transcription causes an increase in the production of this amino acid.
  • changing the activity of an MR protein which brings about increased translation, or activating the post-translational modification of a C. glutamicum protein which is involved in the biosynthesis of a desired fine chemical, can in turn increase the production of this chemical.
  • the opposite situation can also be useful: by increasing the repression of transcription or translation or by post-translational negative modification of a C. glutamicum protein, which is involved in the regulation of the degradation pathway for a compound, the production of this chemical can be increased. In any case, the overall yield or the speed of production of the desired fine chemical can be increased.
  • an MR protein according to the invention which usually suppresses the biosynthesis of nucleosides in response to a suboptimal extracellular nutrient supply (which prevents cell division), so that it has a lower repressive activity, one can do the biosynthesis of nucleosides and perhaps that Increase cell division.
  • Changes in MR-Pro Tones that cause increased cell growth and division in culture, at least due to the increased number of cells that produce the chemical in culture, can increase the yield, production and / or efficiency of production of one or more desired fine chemicals evoke from culture.
  • the invention provides new nucleic acid molecules that encode proteins, which are referred to here as metabolic regulatory (MR) proteins and can, for example, carry out an enzymatic step that is involved in the transcriptional, translational or post-translational regulation of metabolic pathways in C. glutamicum.
  • MR metabolic regulatory
  • Nucleic acid molecules that encode an MR protein are referred to here as MR nucleic acid molecules.
  • the MR protein is involved in the transcription, translation or post-translational regulation of one or more metabolic pathways. Examples of such proteins are those encoded by the genes shown in Table 1.
  • nucleic acid molecules for example cDNAs
  • isolated nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence which encodes an MR protein or biologically active sections thereof, and also nucleic acid fragments which act as primers or hybridization probes for the detection or amplification of MR coding nucleic acid (for example DNA or mRNA) are suitable.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A or the coding region or a complement thereof of one of these nucleotide sequences.
  • the isolated nucleic acid molecule encodes one of the amino acid sequences listed in Appendix B.
  • the preferred MR proteins according to the invention likewise preferably have at least one of the MR activities described here.
  • nucleic acid sequences of the sequence listing together with the sequence changes at the respective position described in Table 1 are defined as Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence from Appendix A.
  • the isolated nucleic acid mo lekül preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid olekül.
  • the isolated nucleic acid more preferably encodes a naturally occurring C. glutamicum MR protein or a biologically active portion thereof.
  • vectors for example recombinant expression vectors which contain the nucleic acid molecules according to the invention and host cells into which these vectors have been introduced.
  • a host cell that is grown in a suitable medium is used to produce an MR protein.
  • the MR protein can then be isolated from the medium or the host cell.
  • Another aspect of the invention relates to a genetically modified microorganism in which an MR gene has been introduced or modified.
  • the genome of the microorganism has been changed by introducing at least one nucleic acid molecule according to the invention which codes the mutated MR sequence as a transgene.
  • an endogenous MR gene in the genome of the microorganism is changed by homologous recombination with an altered MR gene, e.g. functionally disrupted.
  • the microorganism belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium, Corynebacterium glutamicum being particularly preferred.
  • the microorganism is also used to produce a desired compound, such as an amino acid, particularly preferably lysine.
  • host cells that have more than one of the nucleic acid molecules described in Appendix A.
  • Such host cells can be produced in various ways known to those skilled in the art. For example, they can be transfected by vectors which carry several of the nucleic acid molecules according to the invention. However, it is also possible to introduce one nucleic acid molecule according to the invention into the host cell with one vector and therefore to use several vectors either simultaneously or in a staggered manner. Host cells can thus be constructed which carry numerous up to several hundred of the nucleic acid sequences according to the invention. Such an accumulation can often achieve superadditive effects on the host cell with regard to fine chemical productivity.
  • Another aspect of the invention relates to an isolated MR protein or a section, for example a biologically active section thereof.
  • the isolated MR protein or its portion regulates one or more Metabolic pathways in C. glutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally.
  • the isolated MR protein or a portion thereof is sufficiently homologous to an amino acid sequence from Appendix B that the protein or its portion further has the ability to transcriptionally, translationally or post-translationally one or more metabolic pathways in C. glutamicum regulate.
  • the invention also relates to an isolated MR protein preparation.
  • the MR protein comprises an amino acid sequence from Appendix B.
  • the invention relates to an isolated full-length protein which forms a complete amino acid sequence from Appendix B (which is encoded by an open reading frame in Appendix A) is essentially homologous.
  • the MR polypeptide or a biologically active portion thereof can be operably linked to a non-MR polypeptide to form a fusion protein.
  • this fusion protein has a different activity than the MR protein alone and, in other preferred embodiments, regulates one or more metabolic pathways in C. glutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally.
  • the integration of this fusion protein into a host cell modulates the production of a desired compound from the cell in particularly preferred embodiments.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a fine chemical.
  • the method provides for the cultivation of a cell which contains a vector which brings about the expression of an MR nucleic acid molecule according to the invention, so that a fine chemical is produced.
  • this method also comprises the step of obtaining a cell which contains such a vector, the cell being transfected with a vector which brings about the expression of an MR nucleic acid.
  • this method also comprises the step in which the fine chemical is obtained from the culture.
  • the cell belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the production of a molecule from a microorganism. These methods involve contacting the cell with a substance that modulates MR protein activity or MR nucleic acid expression so that cell-associated activity changes compared to the same activity in the absence of the substance. is changed.
  • the cell is modulated in C. glutamicum with regard to one or more regulatory systems for metabolic pathways, so that the yields or the speed at which a desired fine chemical is produced by this microorganism is improved.
  • the substance that modulates the MR protein activity stimulates, for example, the MR protein activity or the MR nucleic acid expression.
  • Examples of substances that stimulate MR protein activity or MR nucleic acid expression include small molecules, active MR proteins and nucleic acids that encode MR proteins and have been introduced into the cell.
  • Examples of substances that inhibit MR activity or expression include small molecules and antisense MR nucleic acid molecules.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the yields of a desired compound from a cell, comprising introducing into a cell an MR wild-type or mutant gene which either remains on a separate plasmid or is integrated into the genome of the host cell.
  • the integration into the genome can be random or by homologous recombination, so that the native gene is replaced by the integrated copy, which causes the production of the desired compound from the cell to be modulated.
  • these yields are increased.
  • the chemical is a fine chemical, which in an especially preferred embodiment is an amino acid. In a particularly preferred embodiment, this amino acid is L-lysine.
  • the present invention provides MR nucleic acid and protein molecules which are involved in the regulation of the Corynebacterium glutamicum metabolism, including the regulation of the fine chemical metabolism.
  • the molecules according to the invention can either be used directly (for example where the modulation of the activity of a regulatory protein of the lysine pathway has a direct effect on the yield, production and / or efficiency of production of lysine from this organism) or indirectly, which still has an increase in the yield, production and / or efficiency of production of the desired compound (e.g.
  • fine chemical is known in the art and includes molecules that are produced by an organism and have applications in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, and cosmetic industries. These compounds include organic acids such as tartaric acid, itaconic acid and dia inopimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides (as described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and re- lated compounds, pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., ed. VCH: Weinheim and the citations contained therein), lipids, saturated and unsaturated fatty acids (e.g.
  • arachidonic acid arachidonic acid
  • diols e.g. propanediol and Butanediol
  • carbohydrates e.g. hyaluronic acid and trehalose
  • aromatic compounds e.g. aromatic amines, vanillin and indigo
  • vitamins and cofactors as described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", p 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for normal cell functions.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 types, serve as structural units for proteins in which they are linked to one another via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) are usually not found in proteins (see Ullmann's Encyclope - dia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim
  • the amino acids can be in the D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type which is found in naturally occurring proteins. Biosynthetic and degradation pathways of each of the 20 proteinogenic amino acids are well characterized in both prokaryotic and eukaryotic cells (see, for example, Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pp. 578-590 (1988)).
  • the "essential" amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine), so called because they have to be included in the diet due to the complexity of their biosynthesis, are identified by simple biosynthetic pathways in the rest
  • non-essential amino acids alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine
  • Lysine is not only an important amino acid for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • Glutamate is most commonly used as a flavor additive (monosodium 5-glutamate, MSG) and is widely used in the food industry, as well as aspartate, phenylalanine, glycine and cysteine.
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetic industries.
  • Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widespread feed additives (euchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim). It has been discovered that these amino acids are also used as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan and others, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry , Vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 are suitable substances. 0
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate, in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentosephosphate pathway, erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate in a 9-step biosynthetic pathway that differs only in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in one
  • Tyrosine can also be produced from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is formed from oxa-acetate, an intermediate of the Ci cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by converting aspartate.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • histidine is formed from 5-phospho ibosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids the amount of which exceeds the cell's protein biosynthesis requirements, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediates are provided for the main metabolic pathways of the cell (for an overview see Stryer, L., Biochemistry, 3rd ed. Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”; S 495-516 (1988)).
  • the cell is able to convert unwanted amino acids into useful metabolic intermediates, the production of amino acids is expensive in terms of energy, precursor molecules and the enzymes required for their synthesis.
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and must therefore absorb them, although they are easily synthesized by other organisms such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds also have a significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and the industrial applications of these compounds, see, for example, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and encompasses nutrients which are required by an organism for normal function, but which cannot be synthesized by this organism itself.
  • the group of vitamins can include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for normal enzyme activity to occur. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic.
  • nutrazeutiku encompasses food additives which are beneficial to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (e.g. polyunsaturated fatty acids).
  • Thiamine is formed by chemical coupling of pyrimidine and thiazole units. Riboflavin (vitamin B) is synthesized from guanosine 5 'triphosphate (GTP) and ribose 5' phosphate. Riboflavin in turn is used to synthesize flavin mononu Kleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD) used.
  • GTP guanosine 5 'triphosphate
  • FMN flavin mononu Kleotide
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • the family of compounds which are collectively referred to as "vitamin B6" are all derivatives of the common structural unit 5-hydroxy-6-methylpyridine.
  • Panthothenate (pantothenic acid, R - (+) - N- (2, 4-dihydroxy-3, 3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanine) can be produced either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the final steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ß-alanine and pantoic acid.
  • the for. the biosynthetic steps for the conversion into pantoic acid, into ß-alanine and for the condensation into pantothenic acid are known enzymes.
  • the metabolically active form of pantothenate is Coenzy A, whose biosynthesis takes place in 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal-5 '-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), Pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • Lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it becomes part of the pyruvate dehydrogenase complex and the oc-ketoglutarate dehydrogenase complex.
  • the folates are a group of substances that are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methylpterine.
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B ⁇
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B ⁇ is sufficiently complex that it has not been fully characterized, but a large part of the enzymes and substrates involved is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, which are also called “niacin”.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • nucleotide includes the basic structural units of the nucleic acid molecules, which comprise a nitrogenous base, a pentose sugar (for RNA the sugar is ribose, for DNA the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside encompasses molecules which serve as precursors of nucleotides, but which, in contrast to the nucleotides, have no phosphoric acid unit.
  • nucleotides that do not form nucleic acid molecules, but that serve as energy stores (i.e. AMP) or as coenzymes (i.e. FAD and NAD).
  • the purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other uses: as intermediates in the biosynthesis of various Fine chemicals (e.g. thiamine, S-adenosyl-methionine, folate or riboflavin), as energy sources for the cell (e.g. ATP or GTP) and for chemicals themselves, are usually used as flavor enhancers (e.g. IMP or GMP) or for many medical see applications (see, for example, Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., ed. VCH: Weinheim, pp. 561-612).
  • Enzymes which are based on purine, Pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly becoming targets against which crop protection chemicals, including fungicides, herbicides and insecticides, are being developed.
  • the purine nucleotides are synthesized in a series of steps via the intermediate compound inosine 5'-phosphate (IMP) from ribose 5-phosphate, which leads to the production of guanosine 5 'monophosphate (GMP) or adenosine 5' -monophosphate (AMP), from which the triphosphate forms used as nucleotides can be easily produced.
  • IMP inosine 5'-phosphate
  • GMP guanosine 5 'monophosphate
  • AMP adenosine 5' -monophosphate
  • Pyridin biosynthesis takes place via the formation of uridine 5 'monophosphate (UMP) from ribose 5-phosphate. UMP in turn is converted into cytidine 5 'triphosphate (CTP).
  • the deoxy forms of all nucleotides are produced in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules that are linked via an ⁇ , ⁇ -l, 1 bond. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen food and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, e.g., Nishi oto et al., (1998) US Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, CLA and Panek, AD Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; and Shiosaka, MJ Japan 172 (1997) 97-102). Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and is naturally released into the surrounding medium from which it can be obtained by methods known in the art.
  • All living cells have complex catabolic and anabolic abilities with many interconnected metabolic pathways.
  • the cell uses a fine-tuned regulatory network. By regulating enzyme synthesis and enzyme activity, either independently or simultaneously, the cell can regulate the activity of completely different metabolic pathways, so that the changing needs of the cell are satisfied.
  • proteins that bind to the DNA which either increases the expression of a gene (positive regulation, as in the case of the ara operon from E. coli) or decreases (negative regulation, as in the case of the lac operon from E) coli).
  • These expression-modulating transcription factors can themselves be subject to regulation. Their activity can be regulated, for example, by binding small-molecule compounds to the DNA-binding protein, which stimulates the binding of these proteins to the appropriate binding site on the DNA (as in the case of arabinose for the ara operon) or inhibits it ( as in the case of lactose for the lac operon) (see, for example, Helmann, JD and Chamberlin, MJ (1988) "Structure and function of bacterial sigma factors" Ann.
  • Protein synthesis is regulated not only at the level of transcription, but often also at the level of translation. This regulation can be accomplished through many mechanisms, including altering the ability of the ribosome to bind to one or more mRNAs, binding the ribosome to mRNA, maintaining or removing the secondary mRNA structure, using common or less common codons for a particular gene , the degree of abundance of one or more tRNAs and special regulatory mechanisms such as attenuation (see Vellanoweth, RI (1993) Translation and its regulation in Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria, Sonenshein, AL et al. Ed. ASM: Washington, DC , Pp. 699-711 and references cited therein.
  • the transcription and translation regulation can be directed to a single protein (sequential regulation) or simultaneously to several proteins in different metabolic pathways (coordinated regulation). Genes whose expression is regulated in a coordinated manner are often close together in an operon or regulon in the genome.
  • This up- or down-regulation of gene transcription and translation is controlled by the cellular or extracellular amounts of various factors, such as substrates (precursors and intermediate molecules that are used in one or more metabolic pathways), catabolites (molecules that are caused by biochemical metabolic pathways) which are related to the production of energy from the breakdown of complex organic molecules such as sugar) and end products (the molecules obtained at the end of a metabolic pathway).
  • genes that encode enzymes that are necessary for the activity of a particular metabolic pathway is induced by high amounts of substrate molecules for this metabolic pathway. Accordingly, this gene expression is repressed when there are high intracellular amounts of the end product of the route (Snyder, L. and Champness, W. (1977) The Molecular Biology of Bacteria ASM: Washington). Gene expression can also be regulated by other external and internal factors, such as environmental conditions (e.g. heat, oxidative stress, or hunger). These global environmental changes cause changes in the expression of specialized modulating genes that trigger gene expression directly or indirectly (via additional genes or proteins) by binding to DNA and thereby induce or repress transcription (see, for example, Lin, ECC and Lynch, AS Ed. (1995) Regulation of Gene Expression in Escherichia coli, Chapman & Hall: New York).
  • Another mechanism by which cellular metabolism can be regulated is at the level of the protein. This regulation takes place either via the activities of other enzymes or by binding low-molecular components that prevent or enable the normal function of the protein. Examples of the compounds of low molecular weight binding protein regulation by comparison include the binding of 'GTP or NAD. The binding of low molecular weight chemicals is usually reversible as with the GTP-binding proteins. These proteins occur in two states (with bound GTP or GDP), one state being the active form of the protein and the other the inactive form.
  • Regulation of protein activity by the action of other enzymes is usually done by covalent modification of the protein (i.e., phosphorylation of amino acid residues such as histidine or aspartate, or methylation).
  • This covalent modification is usually reversible, which is accomplished by an enzyme with the opposite activity.
  • An example of this is the opposite activity of kinases and phosphorylases in protein phosphorylation: protein kinases phosphorylate specific residues on a target protein (e.g. serine or threonine), whereas protein phosphorylases remove the phosphate groups from these proteins.
  • Enzymes that modulate the activity of other proteins are usually modulated by external stimuli themselves. These stimuli are mediated by proteins that act as sensors.
  • Control systems for downward regulation of the metabolic pathways can be removed or reduced in order to improve the synthesis of desired chemicals, and accordingly those for the upward regulation of the metabolic pathway for a desired product can be constitutively activated or optimized with regard to activity (as shown in Hirose, Y. and Okada, H. (1979) "Microbial Production of Amino Acids", in: Peppler, HJ and Perlman, D. (ed.) Microbial Technology 2nd ed., vol. 1, chap. 7, Academic Press, New York).
  • the present invention is based at least in part on the discovery of new molecules, which are referred to here as MR nucleic acid and protein molecules and which regulate one or more metabolic pathways in C. glutamicum through transcriptional, translational or post-translational measures.
  • the MR molecules regulate a metabolic pathway in C. glutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally.
  • the activity of the MR molecules according to the invention for regulating one or more metabolic pathways in C. glutamicum has an effect on the production of a desired fine chemical by this organism.
  • the MR molecules according to the invention have modulated activity, so that the metabolic pathways of C. glutamicum which regulate the MR proteins according to the invention are modulated in terms of their efficiency or their throughput, which either directly or indirectly affects the Yield, production and / or efficiency of production of a desired fine chemical modulated by C. glutamicum.
  • MR protein or "MR polypeptide” encompasses proteins which regulate a metabolic pathway in C. glutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally.
  • MR proteins include those encoded by the MR genes listed in Table 1 and Appendix A.
  • MR gene or "MR nucleic acid sequence” include 'Nukleinklareseguenzen encoding an MR protein, which comprises a coding region and corresponding untranslated 5' and 3 'consists -Sequenz Symposium Programen. Examples of MR genes are listed in Table 1.
  • production or “productivity” are known in the art and include the concentration of the fermentation product (for example the desired fine chemical which is formed within a defined period of time and a defined fermentation volume (for example kg product per hour per 1)
  • concentration of the fermentation product for example the desired fine chemical which is formed within a defined period of time and a defined fermentation volume (for example kg product per hour per 1)
  • production efficiency encompasses the time it takes to achieve a certain amount of production (for example how long it takes the cell to set up a certain throughput rate of a fine chemical).
  • yield or “product / carbon Yield” is well known in the art and includes the efficiency of converting the carbon source to the product (ie, the fine chemical). For example, this is usually expressed as kg product per kg carbon source.
  • biosynthesis or “biosynthetic pathway” are known in the art and include the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediate compounds, for example in a multi-step or highly regulated process.
  • degradation or “degradation path” are known in the art and include the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), e.g. in a multi-step or highly regulated Process.
  • the term "metabolism” is known in the art and encompasses all of the biochemical reactions that take place in an organism. The metabolism of a certain compound (eg the metabolism of an amino acid, such as glycine) then encompasses all biosynthesis, modification and degradation pathways of this compound in the cell.
  • the term “regulation” is known in the art and encompasses the activity of one protein to control the activity of another protein.
  • transcription regulation is known in the art and includes the activity of a protein to inhibit or activate the conversion of a DNA encoding a target protein into mRNA.
  • transcription regulation is known in the art and includes the activity of a protein to inhibit or activate the conversion of an mRNA encoding a target protein into a protein molecule.
  • post-translational regulation is known in the art "and includes the activity of a protein to inhibit or improve the activity of a target protein by covalently modifying the target protein (for example by methylation, glycosylation or phosphorylation).
  • the MR molecules according to the invention are capable of modulating the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism, such as C. glutamicum.
  • Genre combination techniques can be used to manipulate one or more regulatory proteins according to the invention for metabolic pathways in such a way that their function is modulated.
  • a biosynthesis enzyme can be improved in efficiency or its allosteric control region can be destroyed so that the inhibition of the production of the compound is prevented.
  • a degradation enzyme can be deleted or modified by substitution, deletion or addition in such a way that its degradation activity for the desired compound is reduced without the viability of the cell being impaired. In any case, the total yield or the production rate of one of these desired fine chemicals can be increased.
  • these changes in the protein and nucleotide molecules according to the invention can improve the production of fine chemicals in an indirect manner.
  • the regulatory mechanisms of the metabolic pathways in the cell are necessarily linked, and the activation of one metabolic pathway can cause the repression or activation of another in an accompanying manner.
  • By modulating the activity of one or more proteins of the invention the production or efficiency of the activity of other fine chemical biosynthesis or degradation pathways can be affected.
  • By lowering the ability of an MR protein to repress the transcription of a gene encoding a particular amino acid biosynthetic protein other amino acid biosynthetic pathways can be depressed because these pathways are linked.
  • the growth and division of cells from their extracellular surroundings can be decoupled to a certain degree; by affecting an MR protein that usually represents the biosynthesis of a nucleotide when the extracellular conditions for growth and cell division are suboptimal so that it now lacks this function, growth can be allowed to occur even if the extracellular Conditions are bad. This is particularly important in large-scale fermentation farming, where the conditions in the culture are often suboptimal in terms of temperature, nutrient supply or aeration, but which still promote growth and cell division when the cellular regulatory systems for these factors are eliminated.
  • the genome of a Corynebacterium glutamicum strain which is available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 13032, is suitable as a starting point for the production of the nucleic acid sequences according to the invention.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be produced from these nucleic acid sequences by conventional methods using the changes described in Table 1.
  • the MR protein according to the invention or a biologically active section or fragments thereof can regulate a metabolic pathway in C. srlutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally, or can have one or more of the activities listed in Table 1.
  • a metabolic pathway in C. srlutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally or can have one or more of the activities listed in Table 1.
  • One aspect of the invention relates to isolated nucleic acid molecules which encode MR polypeptides or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which are sufficient for use as hybridization probes or primers for the identification or amplification of nucleic acids coding for MR (e.g. MR-DNA).
  • nucleic acid molecule as used here is intended to encompass DNA molecules (eg cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (eg mRNA) as well as DNA or RNA analogs which are generated by means of nucleotide analogs , This term also includes the untranslated sequence located at the 3 'and 5' ends of the coding region: at least about 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least about 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' end of the coding gene region.
  • the nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably a double-stranded DNA.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • An “isolated” nucleic acid preferably has no sequences which naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (for example sequences which are located at the 5 'or 3' end of the nucleic acid ).
  • the isolated MR nucleic acid molecule can contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of the nucleotide sequences that naturally contain the nucleic acid molecule in the genomic Flank the DNA of the cell from which the nucleic acid originates (for example a C. srlutamicum cell).
  • An "isolated" nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule can also be essentially free of another cellular material or culture medium if it is produced by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals if it is chemically synthesized becomes.
  • a nucleic acid molecule according to the invention for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from Appendix A or a section thereof, can be produced using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • a C. glutaznicum MR cDNA can be isolated from a C. glutaznicum library by using a complete sequence from Appendix A or a portion thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. On1. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence from Annex A or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been prepared on the basis of this sequence (for example a nucleic acid molecule comprising a complete sequence can be used Appendix A, or a portion thereof, can be isolated by polymerase chain reaction using OH gonucleotide primers made from this same sequence from Appendix A).
  • mRNA can be isolated from normal endothelial cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method by Chirgwin et al.
  • cDNA can be converted using reverse transcriptase (for example Moloney-MLV-Reverse Transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL).
  • reverse transcriptase for example Moloney-MLV-Reverse Transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for the amplification via polymerase chain reaction can be created on the basis of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • a nucleic acid according to the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • the nucleic acid so amplified can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to an MR nucleotide sequence can be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises a nucleic acid molecule which is complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A or a portion thereof, which is a nucleic acid molecule which is sufficiently complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A that it is compatible with one of the sequences given in Appendix A can hybridize, resulting in a stable duplex.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a section thereof, the one
  • amino acid sequence that is sufficiently homologous to an amino acid sequence of Appendix B that the protein or a portion of which still has the ability to regulate a metabolic pathway in C. glutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally refers to proteins or portions thereof whose amino acid sequences have a minimal number of identical or equivalent amino acid residues (e.g. an amino acid residue with a side chain similar to an amino acid residue in one of the sequences of Appendix B) to an amino acid sequence from Appendix B, so that the protein or a portion thereof can regulate a metabolic pathway in C. grutamicum transcriptionally, translationally or post-translationally.
  • Protein components of these pathways can regulate the biosynthesis or degradation of one or more fine chemicals. Examples of these activities are also described here.
  • the "function of an MR protein” relates to the overall regulation of one or more metabolic fine chemical pathways. Table 1 shows examples of MR protein activities.
  • Sections of proteins which are encoded by the MR nucleic acid molecules according to the invention are preferably biologically active sections of one of the MR proteins.
  • biologically active section of an MR protein is intended to include a section, for example a domain or a motif, of an MR protein that transcriptionally, translationally or post-translationally a metabolic pathway in C. glutamicum can regulate, or has an activity given in Table 1.
  • a test of the enzymatic activity can be carried out.
  • nucleotide sequence of Appendix A which leads to a change in the amino acid sequence of the encoded MR protein without affecting the functionality of the MR protein.
  • nucleotide substitutions which lead to amino acid substitutions at "non-essential" amino acid residues can be prepared in a sequence from Appendix A.
  • a "non-essential" amino acid residue can be changed in a wild-type sequence from one of the MR proteins (Appendix B) without changing the activity of the MR protein, whereas an "essential" amino acid residue is required for the MR protein activity.
  • other amino acid residues e.g. non-preserved or single Semiconserved amino acid residues in the domain with MR activity cannot be essential for the activity and can therefore probably be changed without changing the MR activity.
  • An isolated nucleic acid molecule encoding an MR protein that is homologous to a protein sequence from Appendix B can be generated by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence from Appendix A so that one or more Amino acid substitutions, additions or deletions are introduced into the encoded protein.
  • the mutations can be introduced into one of the sequences from Appendix A by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • Conservative amino acid substitutions are preferably introduced on one or more of the predicted non-essential amino acid residues. In a "conservative amino acid substitution", the amino acid residue is replaced by an amino acid residue with a similar side chain.
  • Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families do not include amino acids with basic side chains (eg lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine) polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g.
  • amino acids with basic side chains eg lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains eg aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains eg glycine, asparagine, glutamine,
  • a predicted non-essential amino acid residue in an MR protein is therefore preferably replaced by another amino acid residue of the same side chain family.
  • the mutations can alternatively be introduced randomly over all or part of the MR coding sequence, for example by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be examined for the MR activity described here in order to identify mutants that maintain MR activity. After mutagenesis of one of the sequences from Appendix A, the encoded protein can be expressed recombinantly, and the activity of the protein can be determined, for example, using the tests described here (see Example 8 of the example section).
  • vectors preferably expression vectors, which contain a nucleic acid which encode an MR protein (or a section thereof).
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is bound.
  • plasmid which stands for a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (e.g. bacterial vectors with bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • vectors eg non-episomal mammalian vectors
  • Other vectors are integrated into the genome of a host cell when it is introduced into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are called "expression vectors".
  • expression vectors usually the expression vectors used in recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other expression vector forms, such as viral vectors (for example replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses), which perform similar functions.
  • the recombinant expression vector according to the invention comprises a nucleic acid according to the invention in a form which is suitable for the expression of the nucleic acid in a host cell, which means that the recombinant expression vectors one or more regulatory sequences, selected on the basis of the host cells to be used for expression, the is operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • “operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible (for example in an in vitro transcription / Translation system or in a host cell if the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to encompass promoters, enhancers and other expression control elements (for example polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells. Those skilled in the art are aware that the design of an expression vector can depend on factors such as the choice of the transforming host cell, the level of expression of the desired protein, etc.
  • the expression vectors of the invention can be introduced into the host cells so that proteins or peptides, including fusion proteins or peptides, which are encoded by the nucleic acids as described herein, are thereby produced (e.g. MR proteins, mutated forms of MR proteins, fusion proteins, etc.).
  • MR genes can be found in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells (with Baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, CAMJJ et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi” in: More Gene Manipulations in Fungi, 'JW Bennet & LL Lasure, ed., Pp.
  • the recombinant expression vector can be transcribed and translated in vitro, for example using T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
  • Proteins are usually expressed in prokaryotes using vectors that contain constitutive or inducible promoters that control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Fusion vectors contribute a number of amino acids to a protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein. These fusion vectors usually have three functions: 1) to increase the expression of recombinant protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein; and 3) supporting the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification.
  • a proteolytic cleavage site is often introduced at the junction of the fusion unit and the recombinant protein, so that the recombinant protein can be separated from the fusion unit after the fusion protein has been purified.
  • These enzymes and their corresponding Detection sequences include factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Common fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which glutathione-S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione-S-transferase
  • the coding sequence of the MR protein is cloned into a pGEX expression vector, so that a vector is generated which encodes a fusion protein, comprising from the N-terminus to the C-terminus, GST - thrombin cleavage site - X- Protein.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography using glutathione-agarose resin.
  • the recombinant MR protein that is not fused to GST can be obtained by cleaving the fusion protein with thrombin.
  • Suitable inducible non-fusion expression vectors from E. coli include pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pETIld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89).
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pETlld vector is based on the transcription from a T7-gnl0-lac fusion promoter, which is mediated by a coexpressed viral RNA polymerase (T7 gnl). This viral polymerase is supplied by the BL 21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ prophage which harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • One strategy to maximize the expression of the recombinant protein is to express the protein in a host bacterium whose ability to proteolytically cleave the recombinant protein is impaired (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 119-128).
  • Another strategy is to change the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be inserted into an expression vector so that the individual codons for each amino acid are those which are preferably used in a bacterium selected for expression, such as C. glutamicum (Wada et al. (1992 ) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118).
  • the MR protein expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 ( Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, JF Peberdy et al., ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • the MR proteins according to the invention can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the MR proteins according to the invention can be expressed in single-cell plant cells (such as algae) or in plant cells of higher plants (for example spermatophytes such as crops).
  • plant expression vectors include those which are described in detail in: Bekker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • a nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells with a mammalian expression vector.
  • mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kauf an et al. (1987 ) EMBO J. 6: 187-195).
  • the control functions of the expression vector are often provided by viral regulatory elements. Commonly used promoters come, for example, from Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus and Simian Virus 40.
  • the recombinant mammalian expression vector can preferably bring about the expression of the nucleic acid in a specific cell type (for example, tissue-specific regulatory elements are used to express the nucleic acid).
  • tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • suitable tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • 10 gnete tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-specific promoters (Cala e and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275 ), in particular promoters of T cell receptors (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) and immunoglobulin
  • milk serum promoter e.g., milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166
  • Development-regulated promoters are also included, for example the mouse hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the ⁇ -fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:
  • the invention also provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule according to the invention which is cloned into the expression vector in the antisense direction.
  • the DNA molecule is operatively linked to a regulatory sequence such that expression (by transcription of the DNA. Molecule) of an RNA molecule that is antisense to MR mRNA is possible. Regulatory sequences can be selected that are functional to an antisense rich
  • the antisense expression vector can be in the form of a recombinant plas ids, phagemid or attenuated virus, in which antisense nucleic acids are produced under the control of a highly effective regulatory region, the activity of which is determined by the cell type into which the vector is introduced.
  • Another aspect of the invention relates to the host cells into which a recombinant expression vector according to the invention has been introduced.
  • the terms "host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably here. It goes without saying that these terms refer not only to a specific target cell, but also to the descendants or potential descendants of this cell. Since certain modifications may occur in successive generations due to mutation or environmental influences, these offspring are not necessarily identical to the parental cell, but are still included in the scope of the term as used here.
  • a host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • an MR protein can be expressed in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells, yeast or mammalian cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells).
  • suitable host cells are known to the person skilled in the art.
  • Microorganisms which are related to Corynebacterium glutamicum and which can be suitably used as host cells for the nucleic acid and protein molecules according to the invention are listed in Table 3.
  • vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • transformation and “transfection” as used here are intended to encompass a large number of methods known in the prior art for introducing foreign nucleic acid (for example DNA) into a host cell, including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection or electroporation. Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals.
  • a gene that encodes a selectable marker (eg resistance to antibiotics) is usually introduced into the host cells together with the gene of interest.
  • selectable markers include those that are resistant to medicinal products. elements such as G418, hygromycin and methotrexate.
  • a nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding an MR protein, or can be introduced on a separate vector. Cells that have been stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified by drug selection (eg cells that have integrated the selectable marker survive, whereas the other cells die).
  • a vector which contains at least a section of an MR gene into which a deletion, addition or substitution has been introduced in order to change the MR gene, for example to functionally disrupt it.
  • This MR gene is preferably a Corynebacterium glutamicum MR gene, but a homologue from a related bacterium or even from a source of mammals, yeasts or insects can be used.
  • the vector is designed in such a way that the endogenous MR gene is functionally disrupted when homologous recombination occurs (ie no longer encodes a functional protein, also referred to as a "knockout" vector).
  • the vector can alternatively be designed in such a way that the endogenous MR gene is mutated or otherwise altered in the case of homologous recombination, but still codes the functional protein (for example the upstream regulatory region can be altered in such a way that the expression of the endogenous MR protein is thereby effected is changed.).
  • the modified portion of the MR gene is flanked in the homologous recombination vector at its 5 'and 3' ends by additional nucleic acid of the MR gene, which is a homologous recombination between the exogenous MR gene carried by the vector. and an endogenous MR gene in a microorganism.
  • the additional flanking MR nucleic acid is long enough for successful homologous recombination with the endogenous gene.
  • the vector usually contains several kilobases flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) (see, for example, Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vectors).
  • the vector is introduced into a microorganism (eg, by electroporation) ', and cells in which the introduced gene MR-MR with the endogenous gene has homologously recombined are selected using art-known procedures.
  • recombinant microorganisms can be produced which contain selected systems which allow regulated expression of the introduced gene.
  • the inclusion of an MR gene in a vector under control of the Lac operon, for example, enables expression of the MR gene only in the presence of IPTG.
  • a host cell according to the invention such as a prokaryotic or eukaryotic host cell in culture, can be used to produce (i.e., express) an MR protein.
  • the invention also provides methods for the production of MR proteins using the host cells according to the invention.
  • the method comprises culturing the host cell according to the invention (into which a recombinant expression vector which encodes an MR protein has been introduced, or into whose genome a gene has been introduced which is a wild-type or modified MR protein encoded) in a suitable medium until the MR protein has been produced.
  • the method comprises isolating the MR proteins from the medium or the host cell.
  • the nucleic acid molecules, proteins, protein hologa, fusion proteins, primers, vectors and host cells described here can be used in one or more of the following methods: identification of C. glutamicum and related organisms, mapping of genomes of organisms that are related to C. glutamicum related, identification and localization of C. grlufcamicum sequences of interest, evolution studies, determination of MR protein areas that are necessary for the function, modulation of the activity of an MR protein; Modulating the activity of an MR path; and modulating the cellular production of a desired compound, such as a fine chemical.
  • the MR nucleic acid molecules according to the invention have a multitude of uses. They can initially be used to identify an organism as Corynebacterium glutamicum or close relatives thereof.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of C. gluta icum genes. By probing the extracted genomic DNA from a culture of a unitary or mixed population of microorganisms under stringent conditions with a probe that spans a region of a C. ermutamicum gene that is unique to that organism, one can determine whether this organism is present is.
  • Corynebacterium glutamicum itself is not pathogenic, but it is associated with pathogenic species such as Corynebacterium diptheriae Wundt. The detection of such an organism is of significant clinical importance.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can serve as markers for specific regions of the genome. This is useful not only when mapping the genome, but also for functional studies of C. grlutamicum proteins.
  • the C. grlutamicum genome can be cleaved, for example, and the fragments incubated with the DNA-binding protein.
  • Those that bind the protein can additionally be probed with the nucleic acid molecules according to the invention, preferably with easily detectable labels; the binding of such a nucleic acid molecule to the genome fragment enables the fragment to be located on the genomic map of C.
  • nucleic acid molecules according to the invention can moreover be sufficiently homologous to the sequences of related species so that these nucleic acid molecules can serve as markers for the construction of a genomic map in related bacteria, such as Brevibacterium lactofermentum.
  • the MR nucleic acid molecules according to the invention are also suitable for evolution and protein structure studies.
  • the metabolic processes in which the molecules according to the invention are involved are used by many prokaryotic and eukaryotic cells;
  • the degree of evolutionary kinship of the organisms can be determined. Accordingly, such a comparison enables the determination of which sequence regions are conserved and which are not, which can be helpful in determining those regions of the protein which are essential for the enzyme function.
  • This type of determination is valuable for protein technology studies and can provide an indication of which protein can tolerate mutagenesis without losing function.
  • the manipulation of the MR nucleic acid molecules according to the invention can bring about the production of MR proteins with functional differences from the wild-type MR proteins. These proteins can be improved in terms of their efficiency or activity, and can be present in the cell in greater numbers than usual. against, or may be weakened in their efficiency or activity.
  • By increasing the yield, production and / or efficiency of production by activating the expression of one or more lysine biosynthesis enzymes one can simultaneously increase the expression of other compounds, such as other amino acids, which the cell usually needs in larger amounts if lysine is needed in larger quantities.
  • the regulation of the metabolism can also be changed in the entire cell in such a way that the cell under the environmental conditions of a fermentative culture (where the nutrient and oxygen supply can be poor and toxic waste products can be present in large quantities in the environment). and can grow or replicate better. For example.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can be used to generate C. glutamicum or related bacterial strains which express mutated MR nucleic acid and protein molecules, so that the yield, production and / or Production efficiency of a desired connection is improved.
  • the desired compound can be a natural product of C. glutamicum, which comprises the end products of the biosynthetic pathways and intermediates of naturally occurring metabolic routes as well as molecules which do not occur naturally in the metabolism of C. glutamicum, but which are derived from a C. glutamicum according to the invention. micum stems are produced.
  • Example 1 Preparation of the entire genomic DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • a culture of Corynebacterium glutamicum was grown overnight at 30 ° C with vigorous shaking in BHI medium (Difco). The cells were harvested by centrifugation, the supernatant was discarded, and the cells were resuspended in 5 ml of buffer I (5% of the original volume of the culture - all stated volumes are calculated for 100 ml of culture volume).
  • buffer I 140.34 g / 1 sucrose, 2.46 g / 1 MgS0 4 • 7 H 2 0, 10 ml / 1 KH 2 P0 4 solution (100 g / l, adjusted to pH with KOH 6.7), 50 ml / 1 M12 concentrate (10 g / 1 (NH 4 ) 2 S ⁇ 4 , 1 g 1 NaCl, 2 g / 1 MgS0 4 • 7 H 2 0, 0.2 g / 1 CaCl 2 , 0.5 g / 1 yeast extract (Difco), 10 ml / 1 trace element mixture (200 mg / 1 FeS0 4 ⁇ H 2 0, 10 mg / 1 ZnS0 4 • 7 H 2 0, 3 mg / 1 MnCl 2 • 4 H 2 0, 30 mg / 1 H 3 B0 3 , 20 mg / 1
  • the cell wall was broken down and the protoplasts obtained were harvested by centrifugation.
  • the pellet was washed once with 5 ml of buffer I and once with 5 ml of TE buffer (10 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8).
  • the pellet was resuspended in 4 ml TE buffer and 0.5 ml SDS solution (10%) and 0.5 ml NaCl solution (5 M) were added.
  • proteinase K at a final concentration of 200 ⁇ g / ml, the suspension was incubated at 37 ° C. for about 18 hours.
  • the DNA was purified by extraction with phenol, phenol-chloroform-isoamyl alcohol and chloroform-isoamyl alcohol using the standard method. Then the DNA was precipitated by adding 1/50 volume of 3 M sodium acetate and 2 volumes of ethanol, followed by incubation for 30 min at -20 ° C and 30 min centrifugation at 12000 rpm in a high-speed centrifuge with an SS34 rotor (Sorvall) , The DNA was dissolved in 1 ml of TE buffer containing 20 ⁇ g / ml RNase A and dialyzed against 1000 ml of TE buffer at 4 ° C. for at least 3 hours. During this time the buffer was exchanged 3 times.
  • Plasmids pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 75: 3737-3741) found particular use; pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmids of the pBS series (pBSSK +, pBSSK- and others; Stratagene, LaJolla, USA) or
  • Cos ide like SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) or Lorist6 (Gibson, TJ Rosenthal, A., and Waterson, RH (1987) Gene 53: 283-286.
  • Genomic banks as described in Example 2, were used for DNA sequencing according to standard methods, in particular the chain termination method with ABI377 sequencing machines (see, for example, Fleischman, RD et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science 269; 496-512)
  • the sequencing primers with the following nucleotide sequences were used: 5 '-GGAAACAGTATGACCATG-3' or 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
  • In vivo mutagenesis of Corynebacterium glutamicum can be carried out by passing a plasmid (or other vector) DNA through E. coli or other microorganisms (eg Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae), which maintain the integrity of their cannot maintain genetic information.
  • E. coli or other microorganisms eg Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae
  • Common mutator strains have mutations in the genes for the DNA repair system (eg, utHLS, utD, mutT, etc., for comparison see Rupp, WD (1996) DNA repair mechanisms in Escher i-coli and Salmonella, p. 2277- 2294, ASM: Washington). These strains are known to the person skilled in the art. The use of these strains is, for example, in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 illustrates.
  • Example 5 DNA transfer between Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum
  • Corynebacterium and Brevibacterium species contain endogenous plasmids (such as pHMl519 or pBLl) which replicate autonomously (for an overview see, for example, Martin, JF et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146).
  • Shuttle vectors for Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum can easily be constructed using standard vectors for E. coli (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel , FM et al.
  • C. glutamicum can be carried out by protoplast transformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), electroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters , 53: 399-303) and, in cases in which special vectors are used, can also be achieved by conjugation (as described, for example, in Schaefer, A., et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666). It is also possible to transfer the shuttle vectors for C. glutamicum to E. coli by preparing plasmid DNA from C.
  • Example 6 Determination of the expression of the mutated protein
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the mutated gene is to carry out a Northern blot (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Bio-logy, Wiley: New York), wherein a primer which is designed in such a way that it binds to the gene of interest is provided with a detectable (usually radioactive or chemiluminescent) label so that - if the total RNA of a culture of the organism is extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe - the binding and the quantity of binding of the probe indicate the presence and also the amount of mRNA for this gene.
  • Total cell RNA can be isolated from Corynebacterium glutamicum by various methods known in the art, as described in Bormann, ER et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • Standard techniques such as Western blot, can be used to determine the presence or the relative amount of protein that is translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York).
  • total cell proteins are extracted, separated by gel electrophoresis, transferred to a matrix, such as nitrocellulose, and incubated with a probe, such as an antibody, which specifically binds to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easy to detect. The presence and amount of label observed indicates the presence and amount of the mutant protein sought in the cell.
  • Example 7 Growth of genetically modified Corynebacterium glutamicum media and growing conditions
  • corynebacteria are grown in synthetic or natural growth media.
  • a number of different growth media for Corynebakterian are known and readily available (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Vol. II, Balows, A., et al., Ed. Springer-Verlag).
  • These media consist of one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds such as molasses or other by-products from sugar refining. It can also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible carbon sources are alcohols and organic acids such as methanol, ethanol, acetic acid or lactic acid.
  • Sources of nitrogen are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds.
  • Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts, such as NH 4 CI or (NH 4 ) SO 4 , NH 4 OH, nitrates, urea, amino acids or complex nitrogen sources, such as maize spring water, soy flour, soy protein, yeast extracts, meat extracts and others.
  • ammonia gas or ammonium salts such as NH 4 CI or (NH 4 ) SO 4 , NH 4 OH, nitrates, urea
  • amino acids or complex nitrogen sources such as maize spring water, soy flour, soy protein, yeast extracts, meat extracts and others.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus, or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols such as catechol or protocatechuate or organic acids such as citric acid.
  • the media usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts often come from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like.
  • the exact composition of the media connections depends heavily on the respective experiment and is decided individually for each case. Information about media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (ed. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized, either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can be sterilized either together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or can be added continuously or in batches.
  • the growing conditions are defined separately for each experiment.
  • the temperature should be between 15 ° C and 45 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0, and can be maintained by adding buffers to the media.
  • An exemplary buffer for this purpose is a potassium phosphate buffer.
  • Synthetic buffers such as MOPS, HEPES; ACES etc. can be used alternatively or simultaneously.
  • the cultivation pH can also be kept constant during the cultivation by adding NaOH or NH 4 OH. If complex media components such as yeast extract are used, the need for additional buffers is reduced, since many complex compounds have a high buffer capacity.
  • the pH value can also be regulated with gaseous ammonia.
  • the incubation period is usually in the range of several hours to several days. This time is selected so that the maximum amount of product accumulates in the broth.
  • the growth experiments disclosed can be carried out in a variety of containers, such as microtiter plates, glass tubes, glass flasks or glass or metal fermenters of different sizes.
  • the microorganisms should be grown in microtiter plates, glass tubes or shake flasks with or without baffles. Preferably 100 ml shake flasks are used, which contain 10%
  • the flasks should be shaken on a rotary shaker (amplitude 25 mm) at a speed in the range of 100-300 rpm. Evaporation losses can be reduced by maintaining a humid atmosphere; alternatively, a mathematical correction should be made for the evaporation losses.
  • the medium is inoculated to an OD ß oo of 0.5-1.5 using cells grown on agar plates, such as CM plates (10 g / 1 glucose, 2.5 g / 1 NaCl, 2 g / 1 urea, 10 g / 1 polypeptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 meat extract, 22 g / 1 agar pH 6.8 with 2 M NaOH), which have been incubated at 30 ° C.
  • the inoculation of the media is carried out either by introducing a saline solution of C. srlutamicuzn cells from CM plates or by adding a liquid preculture of this bacterium.
  • DNA band shift assays also referred to as gel retardation assays
  • reporter gene assays as described in Kol ar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 and the references cited therein. Reporter gene test systems are well known and established for use in pro- and eukaryotic cells using enzymes such as beta-galactosidase, green fluorescent protein and several others.
  • membrane transport proteins The activity of membrane transport proteins can be determined according to the techniques described in Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biome branes, Molecular
  • Example 9 Analysis of the influence of mutated protein on the production of the desired product
  • the effect of the genetic modification in C. glutamicum on the production of a desired compound can be determined by growing the modified microorganisms under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cellular components are examined for the increased production of the desired product (ie an amino acid).
  • suitable conditions such as those described above
  • Such analysis techniques are well known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 89-90 and pp.
  • the analytical methods include measurements of the amount of nutrients in the medium (e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of common metabolites from biosynthetic pathways and measurements of gases that are generated during fermentation. Standard methods for these measurements are in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, ed. IRL Press, pp. 103-129; 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and the literature references specified therein.
  • nutrients in the medium e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions
  • Example 10 Purification of the desired product from a C. glutamicum culture
  • the desired product can be obtained from C. glutamicum cells or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, and the cells can be lysed using standard techniques such as mechanical force or ultrasound. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted by the C. ⁇ rlutam ⁇ cum cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is retained for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification procedures is subjected to chromatography with an appropriate resin, either with the desired molecule retained on the chromatography resin but not with many contaminants in the sample, or with the contaminants remaining on the resin but not the sample. If necessary, these chromatography steps can be repeated using the same or different chromatography resins.
  • the specialist is in training choose the appropriate chromatography resins and the most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is at a maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by standard techniques in the art. These include

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuremoleküle, deren Verwendung zur Konstruktion von gentechnisch verbesserten Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Aminosäuren mit Hilfe dieser gentechnisch verbesserten Mikroorganismen.

Description

Gene die für regulatorische Proteine codieren
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich-vorkommenden Stof wechselprozessen in Zellen werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die ge- meinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Co- faktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen von einem oder mehreren gewünschten Molekülen zu produzieren und sezemieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus ist Corynebacterium glutamicυm, ein gram-positives, nicht-pathogenes Bakterium. Über Stammselektion ist eine Reihe von Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt neuartige Nukleins uremoleküle bereit, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Coryne acterium glutamicum oder verwandten Bakterienarten verwenden lassen. C. glutamicum ist ein gram-positives, aerobes Bakterium, das in der Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von Feinchemikalien, und auch zum Abbau von Kohlenwasserstoffen (bspw. beim Überlaufen von Rohöl) und zur Oxidation von Terpenoiden ge- meinhin verwendet wird. Die Nukleinsäuremoleküle können daher zum Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch Fermentationsverfahren, verwenden lassen. C. glutamicum selbst ist zwar nicht-pa- thogen, jedoch ist es mit anderen Corynebacterium-Art n, wie Co- rynebacterium diphtheriae (dem Erreger der Diphtherie) verwandt, die bedeutende Pathogene beim Menschen sind. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Corynebacterium-Arten zu identifizieren, kann daher auch eine signifikante klinische Bedeutung haben, z.B. bei diagnostischen Anwendungen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zu- dem als Bezugspunkte zur Kartierung des C. glutamicum-Genoms oder von Genomen verwandter Organismen dienen.
Diese neuen Nukleinsäuremoleküle codieren Proteine, die hier als Stoffwechselregulatorische (MR) Proteine bezeichnet werden. Diese MR-Proteine können bspw. eine Funktion ausüben, die an der Transkriptions-, Translations- oder posttranslationalen Regulation von Proteinen beteiligt ist, die für das normale metabolische Funktionieren von Zellen wichtig sind. Aufgrund der Verfügbarkeit von Klonierungsvektoren zur Verwendung in Corynebacterium glutamicum, wie bspw. offenbart in Sinskey et al., US-Patent Nr. 4 649 119 , und Techniken zur genetischen Manipulation von C. glutamicum und den verwandten Brevibacteriu -Arten (z.B. lactofermentum) Yoshiha a et al., J. Bacteriol. 162 (1985) 591-597; Katsumata et al., J. Bacteriol. 159 (1984) 306-311; und Santa aria et al. J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 2237-2246), lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieses Organismus verwenden, um es als Produzenten von einer oder mehreren Feinchemikalien besser und effizienter zu machen.
Die verbesserte Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie kann auf einer direkten oder indirekten Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens beruhen. Speziell können Veränderungen in C. glutamicum-MR-Protei- nen, die die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie eines metabolischen Feinchemikalienwegs gewöhnlich regulieren, können eine direkte Auswirkung auf die Gesamtproduktion oder Produktionsgeschwindigkeit von einer oder mehreren dieser gewünschten Verbindungen aus diesem Organismus haben. Veränderungen in den Proteinen, die an diesen Stoff ech- selwegen beteiligt sind, können auch eine indirekte Auswirkung auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie haben. Die Metabolismus-Regulation ist notwendigerweise komplex, und die regulatorischen Mecha- nismen, die die unterschiedlichen Wege bewerkstelligen, können sich an vielen Stellen überschneiden, so daß sich mehr als ein S off echselweg rasch gemäß einem bestimmten Zellereignis einstellen läßt. Dies ermöglicht, daß die Modifikation eines regulatorischen Proteins für einen Stoffwechselweg auch eine Auswirkung auf viele andere Stoffwechselwege ausübt, von denen einige an der Biosynthese oder am Abbau einer gewünschten Feinchemikalie beteiligt sein können. In dieser indirekten Weise kann die Modulation der Wirkung eines MR-Proteins eine Auswirkung auf die Produktion einer Feinchemikalie haben, die über einen Stoff echselweg produ- ziert wird, der sich von dem unterscheidet, der von diesem MR- Protein direkt reguliert wird. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können verwendet werden, um die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von einer oder mehreren gewünschten Feinchemikalien aus Corynebacterium glutamicum direkt zu verbessern. Mittels im Fachgebiet bekannter Genrekombinationstechniken können ein oder mehrere erfindungsgemäße regulatσrische Proteine derart manipuliert werden, daß ihre Funktion moduliert ist. Die Mutation eines MR-Proteins, das an der Repression der Transkription eines Gens beteiligt ist, das ein Enzym codiert, das für die Biosynt- hese einer Aminosäure erforderlich ist, so daß sie nicht länger zur Repression der Transkription fähig ist, kann bspw. einen Anstieg der Produktion dieser Aminosäure bewirken. Entsprechend kann die Veränderung der Aktivität eines MR-Proteins, die eine gesteigerte Translation bewirkt oder die posttranslationale Modi- fikation eines C. glutamicum-Proteins, das an der Biosynthese einer gewünschten Feinchemikalie beteiligt ist, aktiviert, die Produktion dieser Chemikalie wiederum erhöhen. Die entgegengesetzte Situation kann ebenfalls von Nutzen sein: durch Vergrößern der Repression der Transkription oder Translation oder durch post- translationale Negativmodifikation eines C. glutamicum-Proteins , das an der Regulation des Abbauweges für eine Verbindung beteiligt ist, kann man die Produktion dieser Chemikalie steigern. In jedem Fall kann die Gesamtausbeute oder die Geschwindigkeit der Produktion der gewünschten Feinchemikalie vergrößert sein.
Es ist ebenfalls möglich, daß diese Veränderungen in den erfindungsgemäßen Protein- und Nukleotidmolekülen die Aubeute, Produktion und/oder Effizient der Produktion von Feinchemikalien durch indirekte Mechanismen verbessern können. Der Metabolismus einer bestimmten Verbindung ist notwendigerweise mit anderen Biosynthese- und Abbauwegen innerhalb der Zelle verstrickt, und notwendige Cofaktoren, Zwischenprodukte oder Substrate in einem Stoff- wechselweg werden wahrscheinlich von einem anderen Stoffwechselweg bereitgestellt oder eingeschränkt. Durch Modulieren von einem. oder mehreren erfindungsgemäßen regulatorischen Proteinen kann daher die Effizienz der Anktivität anderer Feinchemikalien-Biosynthese oder -Abbauwege beeinflußt werden. Die Manipulation von einem oder mehreren regulatorischen Proteinen kann überdies die Gesamtfähigkeit der Zelle, zu wachsen und sich in Kultur, beson- ders in fermentativen Großkulturen, wo die Wachstumsbedingungen unteroptimal sein können, zu vermehren, steigern. Bspw. durch Mutieren eines erfindungsgemäßen MR-Proteins, das gewöhnlich eine Repression der Biosynthese von Nukleosiden in Reaktion auf ein unteroptimales extrazelluläres Nährstoffangebot (wodurch die Zellteilung verhinder wird) , so daß es eine geringere Repressora- kivität aufweist, kann man die Biosynthese von Nukleosiden und vielleicht die Zellteilung steigern. Veränderungen in den MR-Pro- teinen, die ein verstärktes Zellwachstum und eine verstärkte Teilung in Kultur bewirken, können zumindest aufgrund der erhöhten Zahl an Zellen, die die Chemikalie in Kultur produzieren, eine Steigerung der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Pro- duktion von einer oder mehreren gewünschten Feinchemikalien aus der Kultur hervorrufen.
Die Erfindung stellt neue Nukleinsäuremoleküle bereit, die Proteine codieren, welche hier als metabolische regulatorische (MR) Proteine bezeichnet werden und bspw. einen enzymatischen Schritt durchführen können, der an der Transkriptions-, Translationsoder posttranslationalen Regulation von Stoffwechselwegen in C. glutamicum beteiligt sind. Nukleinsäuremoleküle, die ein MR-Pro- tein codieren, werden hier als MR-Nukleinsäure oleküle bezeich- net. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das MR-Protein an der Transkriptions-, Translations- oder posttranslationalen Regulation von einem oder mehreren Stoff echselwegen beteiligt. Beispiele für solche Proteine sind diejenigen, die von den in Tabelle 1 angegebenen Genen codiert werden.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich isolierte Nukleinsäuremoleküle (bspw. cDNAs) , umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein MR-Protein oder biologisch aktive Abschnitte davon codiert, sowie Nukleinsäurefrag ente, die sich als Primer oder Hybridisie- rungssonden zum Nachweisen oder zur Amplifikation von MR-codie- render Nukleinsäure (bspw. DNA oder mRNA) eignen. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das isolierte Nukleinsäure- molekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen oder den codierenden Bereich oder ein Komplement davon von einer die- ser Nukleotidsequenzen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang B aufgeführten Aminosäuresequenzen. Die bevorzugten erfindungsgemäßen MR-Proteine besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen MR-Aktivitäten.
Als Anhang A werden im folgenden die Nukleinsäuresequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Als Anhang B werden im folgenden die Polypeptidsequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäu- remolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. Das isolierte Nukleinsäuremo- lekül entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nu- kleinsäure olekül . Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker bevorzugt ein natürlich vorkommendes C. glutamicum-MR-Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw. rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten und .Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird zur Herstellung eines MR-Proteins eine Wirtszelle verwendet, die in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das MR-Protein kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch verän- derten Mikroorganismus, bei dem ein MR-Gen eingebracht oder verändert worden ist . Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer Ausführungsform durch Einbringen mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls verändert worden, das die mutierte MR- Sequenz als Transgen codiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes MR-Gen im Genom des Mikroorganismus durch homologe Rekombination mit einem veränderten MR-Gen verändert, z.B. funktioneil disruptiert, worden. Der Mikroorganismus gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, wobei Corynebacterium glutamicum besonders bevorzugt ist . Der Mikroorganismus wird in einer bevorzugten Ausführungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung, wie einer Aminosäure, besonders bevorzugt Lysin, verwendet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Wirtszellen, die mehr als eine der in Anhang A beschriebenen Nukleinsäuremoleküle besitzen. Solche Wirtszellen lassen sich auf verschiedene dem Fachmann bekannte Wege herstellen. Beispielsweise können sie durch Vektoren, die mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle tragen, transfiziert werden. Es ist aber auch möglich mit einem Vektor jeweils ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in die Wirtszelle einzubringen und deshalb mehrere Vektoren entweder gleichzeitig oder zeitlich abgestuft einzusetzen. Es können somit Wirtszellen konstruiert werden, die zahlreiche, bis zu mehreren Hundert der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen tragen. Durch eine solche Akkumulation lassen sich häufig überadditive Effekte auf die Wirtszelle hinsichtlich der Feinchemikalien-Produktivität erzielen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes MR-Pro- tein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven Abschnitt davon. Das isolierte MR-Protein oder sein Abschnitt reguliert in einer bevorzugten Ausführungsform einen oder mehrere Stoffwechselwege in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte MR-Protein oder ein Abschnitt davon hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B, so daß das Protein oder sein Abschnitt weiterhin die Fähigkeit hat, einen oder mehrere Stoffwechselwege in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational zu regulieren.
Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes MR-Proteinpräparat . Das MR-Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten Aus- führungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängenpro- tein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird) im wesentlichen homolog ist.
Das MR-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann mit einem Nicht-MR-Polypeptid funktionsfähig verbunden werden, damit ein Fusionsprotein entsteht. Dieses Fusionsprotein hat bei bevorzugten Ausführungsformen eine andere Aktivität als das MR-Protein allein und reguliert bei anderen bevorzugten Ausführungsformen einen oder mehrer Stoffwechselweg in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational. Die Integration dieses Fusionsproteins in eine Wirtszelle moduliert bei besonders bevorzugten Ausführungsformen die Produktion einer gewünschten Verbindung von der Zelle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie. Das Verfahren sieht die Anzucht einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression eines erfindungsgemäßen MR-Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer MR- Nukleinsäure bewirkt. Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt, bei dem die Feinchemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Produktion eines Moleküls aus einem Mikroorganismus. Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz, die die MR-Proteinaktivität oder die MR-Nukleinsäure- Expression moduliert, so daß eine zellassoziierte Aktivität verglichen mit der gleichen Aktivität bei Fehlen der Substanz verän- dert wird. Die Zelle wird bei einer bevorzugten Ausführungsform hinsichtlich eines oder mehrerer regulatorischer Systeme für Stoffwechselwege in C. glutamicum moduliert, so daß die Ausbeuten oder die Geschwindigkeit der Produktion einer gewünschten Fein- chemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert wird. Die Substanz, die die MR-Proteinaktivität moduliert, stimuliert bspw. die MR-Proteinaktivität oder die MR-Nukleinsäure-Expression. Beispiele von Substanzen, die die MR-Proteinaktivität oder die MR- Nukleinsäureexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, ak- tive MR-Proteine und Nukleinsäuren, die MR-Proteine codieren und in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele von Substanzen, die die MR-Aktivität oder -Expression hemmen, umfassen kleine Moleküle und Antisense-MR-Nukleinsäuremoleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines MR-Wildtyp- oder -Mutantengens in eine Zelle, das entweder auf einem gesonderten Plasmid bleibt oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Die Integration in das Genom kann zufallsgemäß oder durch homologe Rekombination erfolgen, so daß das native Gen durch die integrierte Kopie ersetzt wird, was die Produktion der gewünschten Verbindung aus der zu modulierenden Zelle hervorruft. Diese Ausbeuten sind bei einer bevorzugten Ausführungsform erhöht. Bei einer weiteren bevorzug- ten Ausführungsform ist die Chemikalie eine Feinchemikalie, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Aminosäure ist. Diese Aminosäure ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform L-Lysin.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt MR-Nukleinsäure- und -Proteinmoleküle bereit, die an der Regulation des Corynebacterium glutami- cum-Metabolismus, einschließlich der Regulation des Feinchemika- lien-Metabolismus, beteiligt sind. Die erfindungsgemäßen Moleküle lassen sich bei der Modulation der Produktion von Feinchemikalien von Mikroorganismen, wie C. glutamicum, entweder direkt (z.B. wo die Modulation der Aktivität eines regulatorischen Proteins des Lysin-Stoffwechselwegs eine direkte Auswirkung auf die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Lysin von diesem Organismus hat) oder indirekt verwenden, was trotzdem einen Anstieg der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der gewünschten Verbindung hat (z.B. wo die Modulation der Regulation eines Nukleotid-Biosyntheseproteins eine Auswirkung auf die Produktion einer organischen Säure oder einer Fettsäure aus dem Bakterium hat, möglicherweise aufgrund der damit einhergehenden regulatorischen Veränderungen bei den Biosynthese- oder Ab- bauwegen für diese Chemiklaien als Reaktion auf die veränderte Regulation der Nukleotid-Biosynthese) . Die erfindungsgemäßen Aspekte werden nachstehend weiter erläutert.
I. Feinchemikalien
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, und Kosmetik-Industrie. Diese Verbindungen umfassen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und Dia ino- pimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and re- lated compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten) , Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure) , Diole (bspw. Propandiol und Butandiol), Kohlenhydrate (bspw. Hya- luronsäure und Trehalose) , aromatische Verbindungen (bspw. aromatische A ine, Vanillin und Indigo) , Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemi- cals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
A. Aminosäure-Metabolismus und Verwendungen
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet be- kannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Pep- tidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht- proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's Encyclope- dia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim
(1985)) . Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von eder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auf- 5 läge, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Hist- idin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threo- nin, Tryptophan und Valin) , so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Biosyntheseswege in die übrigen
10 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit
15 eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nah-
20 rungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts- und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mononatrium- 5 glutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharma- 0 zeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threo- nin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze ( euchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechno- logy Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim). Man hat entdeckt, daß 5 sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S) -5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen. 0
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. 5 Bioche . 47: 533 - 606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zy- klus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphog- lycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse) , und ergibt nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenket- ten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serin- transhydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und Pentosephosp- hatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt-Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet . Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekü- len produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem
11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhy- droxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxa- lacetat, einem Zwischenprodukt des Ci ratzyklus, gebildet. Aspa- ragin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phospho ibosyl-1-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker .
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die Haupt-Stoffwechsel- wege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäure- Produktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure-Bio- synthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt. B. Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwendungen
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfs- stoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutiku " umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach unge- sättigte Fettsäuren) .
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Bioche ical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) .
Thiamin (Vitamin B ) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B ) wird aus Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) und Ribose-5 ' -phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavinmononu- kleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5 ' -phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid) , sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6-methylpyri- din. Panthothenat (Pantothensäure, R-(+)-N- (2, 4-Dihydroxy-3 , 3-di- methyl-l-oxobutyl)-ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-ge- triebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure. Die für. die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzy A, dessen Biosynthese über 5 enzy atische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5 ' -phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R) -Pantoinsäure, (R) -Pantolacton, (R) -Panthenol (Provitamin B5) , Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster- Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des oc-Ketoglutaratdehydro- genasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechselzwischenprodukten Guano- sin-5 ' -triphosphat (GTP) , L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin Bχ ) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin Bι ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinami- dadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen. Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin Bg, Panto- thenat und Biotin. Nur Vitamin Bχ wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vi- tro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
C. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tu o- rerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleo- tid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose- Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder ih- rer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzerogenen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikations-Fähigkeit von Tumorzellen hemmen.
Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemika- lien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent Inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res . Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an Enzy- men, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Biochem. Soc. Trans- act. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleo- side und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin) , als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als Geschmacksverstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele edizini- sehe Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A. , (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612) . Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleo- sides"; Kap. 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York) . Der Purin-Metabolis- mus, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell . Ein gestörter Purin-Metabolis us in höheren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5'-phosphat (IMP) aus Ri- bose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guano- sin-5 ' -monophosphat (GMP) oder Adenosin-5' -monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphat- formen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Py- ri idinbiosynthese erfolgt über die Bildung von Uridin-5 ' -monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat. UMP wiederum wird in Cyti- din-5 ' -triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyribo- seform des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
Trehalose-Metabolis us und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über α,α-l, 1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken ver- wendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishi oto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; und Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102). Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
II. Mechanismen der metabolischen Regulation
Alle lebenden Zellen haben komplexe katabolisσhe und anabolische Fähigkeiten mit vielen untereinander vernetzten Stoffwechselwegen. Zur Aufrechterhaltung eines Gleichgewichtes zwischen den verschiedenen Teilen dieses extrem komplexen metabolischen Netzwerks, setzt die Zelle ein fein abgestimmtes regulatorisches Netzwerk ein. Durch Regulation der Enzymsynthese und Enzymaktivität, entweder unabhängig oder simultan, kann die Zelle die Aktivität völlig verschiedener Stoffwechselwege regulieren, so daß der wechselnde Bedarf der Zelle befriedigt wird.
Die Induktion oder Repression der Enzymsynthese kann entweder auf Transkriptions- oder Translations-Niveau oder auf beiden erfolgen (für einen Überblick, siehe Lewin, B. (1990) Genes IV, Teil 3: "Controlling prokaryotic genes by transcription" , Oxford Univer- sity Press, Oxford, S. 213-301, und darin angegebenen Literatur- stellen, und Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons) . All diese bekannten regulatorischen Prozesse werden durch zusätzliche Gene vermittelt, die selbst auf verschiedene externe Einflüsse reagieren (bspw. Temperatur, Nährstoffangebot, oder Licht) . Beispiel- hafte Proteinfaktoren, die an diesem Regulationstyp beteiligt sind, umfassen die Transkriptionsfaktoren. Dies sind Proteine, die an die DNA binden, wodurch entweder die Expression eines Gens steigt (positive Regulation, wie im Fall des ara-Operons aus E. coli ) oder sinkt (negative Regulation, wie im Fall des lac-Ope- rons aus E. coli) . Diese expressionsmodulierenden Transkriptions- faktoren können selbst einer Regulation unterliegen. Ihre Aktivität kann bspw. durch Bindung niedermolekularer Verbindungen an das DNA-bindende Protein reguliert werden, wodurch die Bindung dieser Proteine an die geeignete Bindungsstelle auf der DNA sti- muliert, (wie im Fall der Arabinose für das ara-Operon) oder inhibiert wird (wie im Fall der Lactose für das lac-Operon) (s . bspw. Helmann, J.D. und Chamberlin, M.J. (1988) "Structure and function of bacterial sigma factors" Ann. Rev. Biochem. 57: 839-872; Adhya, S. (1995) "The lac and gal operons today" und Boos, W. et al . , "The maitose system", beide in Regulation of Gene Expression in Escherichia coli (Lin, E.C.C. und Lynch, A.S. Hrsg.) Chapman & Hall: New York, S. 181-200 und 201-229; und Moran, C.P. (1993) "RNA polymerase and transcription factors" in: Bacillus subtilis and other gram-positiv bacteria, Sonenshein, A.L. Hrs. ASM: Washington, D.C. S. 653-667).
Die Proteinsynthese wird nicht nur auf dem Transkriptionsniveau, sondern oft auch auf dem Translationniveau reguliert. Diese Regulation kann über viele Mechanismen erfolgen, einschließlich Veränderung der Fähigkeit des Ribosoms, an eine oder mehrere mRNAs zu binden, Binden des Ribosoms an mRNA, die Aufrechterhaltung - oder Entfernung der mRNA-SekundärStruktur, die Verwendung gebräuchlicher oder weniger gebräuchlicher Codons für ein bestimmtes Gen, der Abundanzgrad von einer oder mehreren tRNAs und spezielle Regulationsmechanismen, wie Attenuierung (s. Vellanoweth, R.I. (1993) Translation and its regulation in Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria, Sonenshein, A.L. et al. Hrsg. ASM: Washington, D.C, S. 699-711 und darin zitierte Literaturstellen.
Die Transkriptions- und Translationsregulation kann auf ein ein- ziges Protein (nacheinanderfolgende Regulation) oder gleichzeitig auf mehrere Proteine in verschiedenen Stoffwechselwegen (koordinierte Regulation) gerichtet sein. Gene, deren Expression koordiniert reguliert wird, liegen im Genom oft nahe beieinander in einem Operon oder Regulon. Diese Up- oder Down-Regulation der Gen- transkription und -translation wird durch die zellulären oder extrazellulären Mengen verschiedener Faktoren gesteuert, wie Substrate (Vorstufen und Zwischenmoleküle, die in einem oder mehreren Stoffwechselweg verwendet werden) , Katabolite (Moleküle, die durch biochemischen Stoffwechselwege produziert werden, die mit der Produktion von Energie aus dem Abbau von komplexen organischen Molekülen, wie Zucker, zusammenhängen) und Endprodukte (die Moleküle, die am Ende eines Stoffwechselweges erhalten werden) . Die Expression von Genen, die Enzyme codieren, die für die Aktivität eines bestimmten Stoffwechselweges notwendig sind, wird durch hohe Mengen an Substratmolekülen für diesen Stoffwechselweg induziert. Entsprechend wird diese Genexpression reprimiert, wenn hohe intrazelluläre Mengen des Endproduktes des Wegs vorliegen (Snyder, L. und Champness, W. (1977) The Molecular Biology of Bacteria ASM: Washington) . Die Genexpression kann ebenfalls durch andere externe und interne Faktoren reguliert werden, wie Umweltbedingungen (z.B. Hitze, oxidativer Streß, oder Hunger). Diese globalen Umweltänderungen verursachen Veränderungen bei der Expression spezialisierter modulierender Gene, die die Genexpression direkt oder indirekt (über zusätzliche Gene oder Proteine) durch Bindung an DNA triggern und dadurch die Transkription induzieren oder reprimieren (s. bspw. Lin, E.C.C. und Lynch, A.S. Hrsg (1995) Regulation of Gene Expression in Escherichia coli , Chapman & Hall: New York) .
Ein weiterer Mechanismus, durch den der zelluläre Metabolismus reguliert werden kann, er olgt auf dem Niveau des Proteins . Diese Regulation erfolgt entweder über die Aktivitäten von anderen Enzymen oder durch Bindung miedermolekularer Komponenten, die die normale Funktion des Proteins verhindern oder ermöglichen. Beispiele der Proteinregulation durch Bindung niedermolekularer Ver- bindungen umfassen die Bindung von'GTP oder NAD. Die Bindung niedermolekularer Chemikalien ist gewöhnlich reversibel wie bei den GTP-bindenden Proteinen. Diese Proteine kommen in zwei Zuständen vor (mit gebundenen GTP oder GDP) , wobei ein Zustand die aktive Form des Proteins und die andere die inaktive Form ist.
Die Regulation der Proteinaktivität durch die Wirkung anderer Enzyme erfolgt gewöhnlich durch kovalente Modifikation des Proteins (d. h. Phosphorylierung der Aminosäurereste, wie Histidin oder Aspartat, oder Methylierung) . Diese kovalente Modifikation ist gewöhnlich reversibel, was durch ein Enzym mit der entgegengesetzten Aktivität bewerkstelligt wird. Ein Beispiel dafür ist die entgegengesetzte Aktivität von Kinasen und Phosphorylasen bei der Proteinphosphorylierung: Proteinkinasen phosphorylieren spezifische Reste auf einem Zielprotein (z.B. Serin oder Threonin), wo- hingegen Proteinphosphorylasen die Phosphatgruppen aus diesen Proteinen entfernen. Enzyme, die die Aktivität anderen Proteine modulieren werden gewöhnlich selbst durch externe Stimuli moduliert. Diese Stimuli werden durch Proteine vermittelt, die als Sensoren wirken. Ein wohlbekannter Mechanismus, durch den diese Sensorproteine diese externen Signale vermittel ist durch Dimeri- sierung, jedoch sind auch andere bekannt (s. bspw. Msadek, T. et. al. (1993) "Two-component Regulatory-Systems" in: Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonenshein, A.L. et al-, Hrsg., ASM: Washington, S. 729-745 und darin zitierte Literaturstellen) .
Ein eingehendes Verständnis der regulatorischen Netzwerke, die den Zellmetabolismus in Mikroorganismen steuern, ist für die Produktion von Chemikalien in hoher Ausbeute durch Fermentation ent- scheidend. Kontrollsysteme für die Abwärtsregulation der Stoffwechselwege können entfernt oder verringert werden, um die Synthese gewünschter Chemikalien zu verbessern, und entsprechend können diejenigen für die Aufwärts-Regulation des Stoff echselwe- ges für ein gewünschtes Produkt konstitutiv aktiviert oder hin- sichtlich der Aktivität optimiert werden (wie gezeigt in Hirose, Y. und Okada, H. (1979) "Microbial Production of Amino Acids", in: Peppler, H.J. und Perlman, D. (Hrsg.) Microbial Technology 2. Aufl., Bd. 1, Kap. 7, Academic Press, New York) .
III. Erfinduncrsgemäße Elemente und Verfahren
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung neuer Moleküle, die hier als MR-Nukleinsäure- und -Protein-Moleküle bezeichnet werden und durch transkriptionale, translationale oder posttranslationale Maßnahmen einen oder eh- rere Stoffwechselwege in C. glutamicum regulieren. Bei einer Ausführungsform regulieren die MR-Moleküle einen Stoffwechselweg in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational. Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aktivität der erfindungsgemäßen MR-Moleküle zur Regulation eines oder mehrerer Stoffwechselwege in C. glutamicum eine Auswirkung auf die Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus . Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform haben die erfindungsgemäßen MR-Moleküle modulierte Aktivität, so daß die Stoff- wechselwege von C. glutamicum, die die erfindungsgemäßen MR-Pro- teine regulieren, hinsichtlich ihrer Effizienz oder ihres Durchsatzes moduliert werden, was entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch C. glutamicum moduliert.
Der Begriff "MR-Protein" oder "MR-Polypeptid" umfaßt Proteine, die einen Stoffwechselweg in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational regulieren. Beispiele für MR-Proteine umfassen solche, die von den in Tabelle 1 und Anhang A aufgeführten MR-Genen codiert werden. Die Ausdrücke "MR-Gen" oder "MR-Nukleinsäuresequenz" umfassen' Nukleinsäureseguenzen, die ein MR-Protein codieren, das aus einem codierenden Bereich und entsprechenden untranslatierten 5'- und 3 '-Sequenzbereichen besteht . Beispiele für MR-Gene sind in Tabelle 1 aufgelistet . Die Begriffe "Produktion" oder "Produktivität" sind im Fachgebiet be- kannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (bspw. der gewünschten Feinchemikalie, die innerhalb einer festgelegten Zeitspanne und eines festgelegten Fermentationsvolumens gebildet werden (bspw. kg Produkt pro Std. pro 1) . Der Begriff "Effizienz der Produktion" umfaßt die Zeit, die zur Erzielung ei- ner bestimmten Produktionsmenge nötig ist (bspw. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt) . Der Begriff "Ausbeute" oder "Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoff uelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie) . Dies wird bspw. gewöhnlich ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Vergrößern der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewönne- nen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe "Biosynthese" oder "Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Ver- bindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Die Begriffe "Abbau" oder "Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) , bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Der Begriff "Metabolismus" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Metabolismus einer bestimm- ten Verbindung (z.B. der Metabolismus einer Aminosäure, wie Glycin) umfaßt dann sämtliche Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Verbindung in der Zelle. Der Begriff "Regulation" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Aktivität eines Proteins zur Steuerung der Aktivität eines anderen Proteins. Der Begriff "Transkriptions-Regulation" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Aktivität eines Proteins zur Hemmung oder Aktivierung der Umwandlung einer DNA, die ein Zielprotein codiert, in mRNA. Der Begriff "Translations-Regulation" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Aktivität eines Proteins zur Hemmung oder Aktivierung der Umwandlung einer mRNA, die ein Zielprotein codiert, zu einem Proteinmolekül. Der Begriff "posttranslationale Regulation" ist im Fachgebiet bekannt" und umfaßt die Aktivität eines Proteins zur Hemmung oder Verbesserung der Aktivität eines Zielproteins durch kovalentes Modifizieren des Zielproteins (z.B. durch Methy- lierung, Glycosylierung oder Phosphorylierung) .
Die erfindungsgemäßen MR-Moleküle sind in einer anderen Ausfüh- rungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie C. gluta- micum, zu modulieren. Mit Hilfe von Genrekombinationstechniken lassen sich ein oder mehrere erfindungsgemäße regulatorische Proteine für Stoffwechselwege derart manipulieren, daß ihre Funktion moduliert ist. Bspw. kann ein Biosynthese-Enzym hinsichtlich der Effizienz verbessert werden oder seine allosterische Kontrollre- gion kann zerstört werden, so daß die Rückkopplungshemmung der Produktion der Verbindung verhindert wird. Entsprechend kann ein Abbauenzym deletiert oder durch Substitution, Deletion oder Addition derart modifiziert werden, daß seine Abbauaktivität für die gewünschte Verbindung verringert wird, ohne daß die Lebensfähig- keit der Zelle beeinträchtigt wird. In jedem Fall kann die Ge- samtausbeute oder die Produktionsrate einer dieser gewünschten Feinchemikalien erhöht werden.
Es ist auch möglich, daß diese Veränderungen bei den erfindungs- gemäßen Protein- und Nukleotidmolekülen die Produktion von Feinchemikalien in indirekter Weise verbessern können. Die regulatorischen Mechanismen der Stoffwechselwege in der Zelle sind notwendigerweise verknüpft, und die Aktivierung eines Stoffwechselweges kann die Repression oder Aktivierung eines anderen in be- gleitender Weise bewirken. Durch Modulieren der Aktivität von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Proteinen kann die Produktion oder Effizienz der Aktivität anderer Feinchemikalien-Biosyntheseoder -Abbauwege beeinflußt werden. Durch Senken der Fähigkeit eines MR-Proteins, die Transkription eines Gens zu reprimieren, das ein bestimmtes Aminosäure-Biosynthese-Proteins codiert, kann man gleichzeitig andere Aminosäure-Biosynthesewege dereprimieren, da diese Stoffwechselwege miteinander verknüpft sind. Durch Modifizieren der erfindungsgemäßen MR-Proteine kann man das Wachstum und die Teilung von Zellen aus ihren extrazellulären Umgebungen zu einem bestimmten Grad entkoppeln; durch Beeinflussen eines MR- Proteins, das gewöhnlich die Biosynthese eines Nukleotids repri- miert, wenn die extrazellulären Bedingungen für das Wachstum und die Zellteilung suboptimal sind, so daß ihr nun diese Funktion fehlt, kann man ermöglichen, daß Wachstum erfolgt, selbst wenn die extrazellulären Bedingungen schlecht sind. Dies ist bei Fer- menteranzucht im Großmaßstab von besonderer Bedeutung, wo die Bedingungen in der Kultur bezüglich Temperatur, Nährstoffangebot oder Belüftung oft suboptimal sind, die aber noch das Wachstum und die Zellteilung fördern, wenn die zellulären regulatorischen Syte e für diese Faktoren eliminiert sind.
Als Ausgangspunkt zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nuklein- säuresequenzen eignet sich das Genom eines Corynebacterium gluta- micum-Stammes, der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist.
Von diesen Nukleinsäuresequenzen lassen sich durch die in Tabelle 1 bezeichneten Veränderungen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit üblichen Verfahren herstellen.
Das erfindungsgemäße MR-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragmente davon können einen Stoffwechselweg in C. srlutamicum transkriptional, translational, oder posttranslational regulieren, oder können eine oder mehrere der in Tabelle 1 aufge- führten Aktivitäten aufweisen. In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben:
A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die MR-Polypeptide oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als Hybridi- sierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizie- rung von MR-codierenden Nukleinsäuren (z.B. MR-DNA) hinreichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" , wie er hier verwendet wird, soll DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Mole- küle (z.B. mRNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleo- tidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5 '-Ende des codierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 '-Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 ' -Endes des codierenden Genbereichs. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise eine doppeisträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäure olekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nuklein- säure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw. 3 '-Ende der Nukleinsäure befinden). In verschiedenen Ausführungsformen kann bspw. das isolierte MR-Nukleinsäure- molekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (bspw. eine C. srlutamicum-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül , kann überdies im wesentlichen frei von einem anderen zellulären Mate- rial oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, bspw. eine Nukleinsäu- remolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der hier bereitgestellten SequenzInformation hergestellt werden. Bspw. kann eine C. glutaznicum-MR-cDNA aus einer C. glutaznicum-Bahk isoliert werden, indem eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw. beschrieben in Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2. Auf1. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligo- nukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isoliert werden, indem OHgonukleotidprimer verwendet werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt worden sind) . Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen isolieren (bspw. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverf hren von Chirgwin et al . (1979) Biochemistry 18: 5294-5299), und die cDNA kann mittels re- verser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Trans- kriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonu- kleotidprimern gemäß PCR-Standard-Amplifikationstechniken ampli- fiziert werden. Die so a plifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer MR-Nukleotid- sequenz entsprechen, können durch Standard-Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen komplementäres Nukleinsäuremolekül oder einen Abschnitt davon, wobei es sich um ein Nukleinsäuremolekül handelt, das zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen hinreichend komplementär ist, daß es mit einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex entsteht.
Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nuklein- Säuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine
Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt davon weiterhin die Fähigkeit behält, einen Stoffwechselweg in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational zu regulieren. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog" Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäure- Sequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste (bspw. ein Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweisen, so daß das Protein oder ein Abschnitt davon einen Stoffwechselweg in C. grlu- tamicum transkriptional, translational oder posttranslational regulieren kann. Protein-Bestandteile dieser Stoffwechselwege, wie hier beschrieben, können die Biosynthese oder den Abbau von einem oder mehreren Feinchemikalien regulieren. Beispiele dieser Aktivitäten sind ebenfalls hier beschrieben. Somit betrifft die "Funktion eines MR-Proteins" die Gesamtregulation von einem oder mehreren metabolischen Feinchemikalien-Wegen. In Tabelle 1 sind Beispiele der MR-Proteinaktivitäten angegeben.
Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen MR-Nu- kleinsäuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der MR-Proteine. Der Begriff "biologisch aktiver Abschnitt eines MR-Proteins", wie er hier verwendet wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne oder ein Motiv, eines MR-Proteins umfassen, die/das einen Stoffwechselweg in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational regulieren kann, oder eine in Tabelle 1 angegebene Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob ein MR-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon einen Stoffwechselweg in C. glutamicum transkriptional, translational oder posttranslational regulieren kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend beschrieben in Beispiel 8 des Beispielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der MR-Sequenz, die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich ebenfalls dessen bewußt, daß Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur Änderung der Aminosäuresequenz des codierten MR-Proteins führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit des MR-Proteins beeinträchtigt wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nichtessentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest läßt sich in einer Wildtypse uenz von einem der MR-Proteine (Anhang B) verändern, ohne daß die Aktivität des MR-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die MR-Proteinaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht-konservierte oder ledig- lieh semikonservierte Aminosäurereste in der Domäne mit MR-Akti- vit t) können für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die MR-Aktivität verändert wird.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein MR-Protein codiert, das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidse uenz aus Anhang A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen aus Anhang A durch Standard-Techniken eingebracht werden, wie stellengerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese. Vor- zugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin) , sauren Seitenketten (z.B. Aspa- raginsäure, Glutaminsäure) , ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cy- stein) , nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan) , betaverzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller A inosäu- rerest in einem MR-Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. In einer weiteren Aus ührungsform können die Mutationen alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der MR- codierenden Sequenz eingebracht werden, bspw. durch Sättigungsmu- tagenese, und die resultierenden Mutanten können auf die hier beschriebene MR-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine MR-Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel 8 des Beispielteils) bestimmt werden.
B. Rekombinant Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein MR- Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier verwendet betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppeisträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (bspw. Bakterienvektoren, mit bakteriellem Replikationsursprung und episomale Säugetiervektoren) . Andere Vektoren (z.B. nicht- episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expressionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden, die Form von Plas- miden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw. re- plikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren) , die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor umfaßt eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Ex- pression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu expri ieren- den Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfaßt. In einem rekombinanten Exprtessionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden" , daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die regulatorische (n) Sequenz (en) gebunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem In-vitro-Tran- skriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) . Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (bspw. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese regulatorischen Sequenzen sind bspw beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -pepti- den, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden, hergestellt werden (bspw. MR-Proteine, mutierte Formen von MR-Proteinen, Fusionsproteine, usw.).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von MR-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryo- tischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können MR-Gene in bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit Baculovi- rus-Expressionsvektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, 'J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Hrsg, S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge) , Algen- und vielzelligen Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Ägrobacterium tumefaciens-mediated tr nsformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell
Rep. : 583-586) oder Säugetierzellen expri iert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Der rekobinante Expressionsvektor kann alternativ, bspw. mit T7-Promotorregulatorischen Sequenzen und T7-Polyme ase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthal- ten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Proteins, bei. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekom- binantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine proteolyti- sche Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entspre- chenden Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase .
Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Bio- tech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die codie- rende Sequenz des MR-Proteins in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus, GST - Thrombin- Spaltstelle - X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt wer- den. Das rekombinante MR-Protein, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions-Expressionsvek- toren aus E. coli umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69 : 301 - 315) und pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Zielgenexpression aus dem pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pETlld-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnl0-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten vira- len RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt .
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128) . Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserierenden Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression ausgewählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111 - 2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäureseguenzen erfolgt durch Standard-DNA-Synthesetechniken. Bei einer weiteren Ausführungsform ist der MR-Proteinexpressions- vektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113 - 123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie fila entösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können die erfindungsgemäßen MR-Proteine in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren ex- primiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen MR-Proteine in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen) oder in Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie Feldfrüchte) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Bek- ker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" , Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nu- kleinsäure in Säugetierzellen mit einem Säugetier-Expressionsvektor exprimiert.. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kauf an et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt. Gemeinhin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Für weitere geeignete ExpressionsSysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen, siehe die Kapitel 16 und 17 aus Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante Säuge- 5 tier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp bewirken (bspw. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet) . Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele für geei-
10 gnete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-spezifische Promotoren (Cala e und Eaton (1988) Adv. Im- munol. 43: 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) und Immunglobu-
15 linen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren (bspw. Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al . , (1985) Science 230: 912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren
20 (bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166) . Entwicklungs- regulierte Promotoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox- Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:
25 537-546) .
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Anti- sense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. Dies bedeu-
30 tet, daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch Transkription des DNA-.Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur MR-mRNA antisense ist, möglich ist. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in Antisense-Rich-
35 tung klonierte Nukleinsäure gebunden sind und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zeiltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder Enhan- cer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die kon- stitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression 0 von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plas ids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den 5 der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen, siehe Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Bspw. kann ein MR-Protein in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert wer- den. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Mikroorganismen, die mit Corynebacterium glutamicum verwandt sind und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle 3 aufgeführ .
Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren läßt sich Vektor-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", wie sie hier verwendet werden, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Calcium- phosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-ver- mittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirts- zellen lassen sich nachlesen in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern.
Für die stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, daß je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfekti- onstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integriert. Zur Identifizierung und Selektion dieser Inte- granten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen Medika- mente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der ein MR-Protein codiert, oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z.B. Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, überleben, wohingegen die anderen Zellen sterben) .
Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines MR- Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um das MR-Gen zu verändern, bspw. funk- tionell zu disrumpieren. Dieses MR-Gen ist vorzugsweise ein Corynebacterium glutamicum-MR-Gen, jedoch kann ein Homologon von einem verwandten Bakterium oder sogar von einer Säugetier-, Hefeoder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene MR-Gen bei homologer Rekombination funktioneil disrupiert ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert, ebenfalls bezeichnet als "Knockout"-Vektor) . Der Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene MR-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktioneile Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen MR-Proteins verändert wird. ) . Der veränderte Abschnitt des MR-Gens ist im homologen Rekombinations- vektor an seinem 5'- und 3 '-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des MR-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen MR-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen MR-Gen in einem Mikroorganismus, ermöglicht. Die zusätzliche flankierende MR-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich enthält der Vektor mehrere Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) (siehe z.B. Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren) . Der Vektor wird in einen Mikroorganismus (z.B. durch Elektroporation) ' eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte MR-Gen mit dem endogenen MR-Gen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Verfahren selektiert.
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorga- nismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines MR-Gens in einem Vektor unter der Kontrolle des Lac-Operons ermöglicht z.B. die Expression des MR-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Diese regulatorisehen Systeme sind im Fachgebiet bekannt .
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) eines MR-Proteins verwendet werden. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Produktion von MR-Proteinen unter Verwendung der er indungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Aus- führungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein MR-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder verändertes MR-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis das MR-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der MR-Proteine aus dem Medium oder der Wirtszelle.
C. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinho- ologa, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren nachstehenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von C. glutamicum und verwandten Organismen, Kar- tierung von Genomen von Organismen, die mit C. glutamicum verwandt sind, Identifikation und Lokalisation von C. grlufcamicum-Se- quenzen von Interesse, Evolutionsstudien, Bestimmung von MR-Pro- teinbereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation der Aktivität eines MR-Proteins ; Modulation der Aktivität eines MR-Wegs; und Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die erfindungsgemäßen MR-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Corynebacterium glutamicum oder naher Verwandten davon verwendet wer- den. Sie können zudem zur Identifikation von C. glutamicum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäurese- quenzen einer Reihe von C. gluta icum-Genen bereit. Durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einheit- liehen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines C. erlutamicum-Gens umfaßt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus zugegen ist. Corynebacterium glutamicum selbst ist zwar nicht pathogen, jedoch ist es mit pathogenen Arten, wie Corynebacterium diptheriae, ver- wandt. Der Nachweis eines solchen Organismus ist von signifikanter klinischer Bedeutung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren des Genoms, sondern auch für funktioneile Studien von C. grlutamicum-Proteinen nützlich. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes C. glutamicum- DNA-bindendes Protein bindet, kann das C. grlutamicum-Genom bspw. gespalten werden, und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfrag- ment ermöglicht die Lokalisation des Fragmentes auf der genomischen Karte von C. glutamicum, und wenn dies mehrmals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem hin- reichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Bakterien, wie Brevibacterium lactofermentum, dienen können.
Die erfindungsgemäßen MR-Nukleinsäuremoleküle eignen sich ebenfalls für Evolutions- und Proteinstrukturuntersuchungen. Die metabolischen Prozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von vielen prokaryotischen und eukaryoti- schen Zellen ausgenutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, welches Protein Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen MR-Nukleinsäuremoleküle kann die Produktion von MR-Proteinen mit funktioneilen Unterschieden zu den Wildtyp-MR-Proteinen bewirken. Diese Proteine können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle zu- gegen sein, oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität geschwächt sein.
Diese Aktivitätsänderungen können derart sein, daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien von C. glutamicum verbessert ist. Durch Optimieren der Aktivität eines MR-Proteins, das die Transkription oder Translation eines Gens aktiviert, das ein Biosynthese-Protein für eine gewünschte Feinchemikalie codiert, oder durch Be- einflussen oder Aufheben der Aktivität eines MR-Proteins, das die Transkription oder Translation eines solchen Gens reprimiert, kann man die Aktivität oder Aktivitätsrate dieses Biosynthesewegs aufgrund des Vorliegens erhöhter Mengen eines bspw. einschränkenden Enzyms erhöhen. Entsprechend kann man durch Verändern der Ak- tivität eines MR-Proteins, so daß es konstitutiv posttranslational ein Protein inaktiviert, das am Abbauweg für eine gewünschte Feinchemikalie beteiligt ist, oder durch Verändern der Aktivität eines MR-Proteins, so daß es konstitutiv die Transkription oder Translation eines solchen Gens reprimiert, die Ausbeute und/oder Produktionsrate der Feinchemikalie von der Zelle aufgrund des herabgesetzten Abbaus der Verbindung steigern.
Durch Modulieren der Aktivität von einem oder mehreren MR-Proteinen kann man indirekt die Produktion stimulieren oder die Produk- tionsrate von einer oder mehreren Feinchemikalien von der Zelle aufgrund der Verknüpfung verschiedener Stoffwechselwege verbessern. Bspw. kann man durch Steigern der Aubeute, Produktion und/ oder Effizienz der Produktion durch Aktivieren der Expression von einem oder mehreren Lysin-Biosynthese-Enzymen gleichzeitig die Expression anderer Verbindungen, wie anderer Aminosäuren, steigern, die die Zelle gewöhnlich in größeren Mengen braucht, wenn Lysin in größeren Mengen benötigt wird. Auch kann die Regulation des Metabolismus durch in der gesamten Zelle derart verändert werden, daß die Zelle unter den Umweltbedingungen einer fermenta- tiven Kultur (wo das Nährstoff- und Sauerstoffangebot schlecht sein kann und möglicherweise toxische Abf llprodukte in der Umgebung in hohen Mengen vorliegen können) und besser wachsen oder repliezieren kann. Bspw. kann man durch Mutagenisieren eines MR- Proteins, das die Synthese von Molekülen, die für die Zellmem- branproduktion notwenig sind, in Reaktion auf hohe Abfallproduktmengen im extrazellulären Medium reprimiert (um Zellwachstum und -teilung in suboptimalen Wachstumsbedingungen zu blockieren) , so daß es nicht länger zur Repression dieser Synthese befähigt ist, das Wachstum und die Vermehrung der Zellen in Kulturen steigern, selbst wenn die Wachstumsbedingungen suboptimal sind. Ein solches verstärktes Wachstum oder eine solche verstärkte Lebensfähigkeit sollte ebenfalls die Ausbeuten und/oder die Produktionsrate einer gewünschten Feinchemikalie aus einer fermentativen Kultur aufgrund der relativ großen Zahl von Zellen, die diese Verbindung in der Kultur produzieren, steigern.
Die vorstehend genannten Mutagenesestrategien für MR-Proteine, die erhöhte Ausbeuten einer gewünschten Feinchemikalie in C. glutamicum bewirken sollen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen dieser Strategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Durch diese Strategien und die hier offenbarten Mechanismen kön- nen die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um C. glutamicum oder verwandte Bakterienstämme, die mutierte MR-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Die ge- wünschte Verbindung kann ein natürliches Produkt von C. glutamicum sein, welches die Endprodukte der Biosynthesewege und Zwischenprodukte natürlich vorkommender etabolischer Wege sowie Moleküle umfaßt, die im Metabolismus von C. glutamicum nicht natürlich vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen C. gluta- micum-St amm produziert werden.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung zitier- ter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1 : Präparation der gesamten genomischen DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Eine Kultur von Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wurde über Nacht bei 30°C unter starkem Schütteln in BHI-Medium (Difco) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 5ml Puffer I (5% des Ursprungsvolumens der Kultur - sämtliche angegebenen Volumina sind für 100 ml Kulturvolumen berechnet) resuspendiert. Die Zusammensetzung von Puffer I: 140,34 g/1 Saccharose, 2,46 g/1 MgS04 • 7 H20, 10 ml/1 KH2P04-Lösung (100g/l, mit KOH eingestellt auf pH-Wert 6,7), 50 ml/1 M12-Konzentrat (10 g/1 (NH4)2Sθ4, 1 g 1 NaCl, 2 g/1 MgS04 • 7 H20, 0,2 g/1 CaCl2, 0,5 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) , 10 ml/1 Spurenelemente-Mischung (200 mg/1 FeS04 ■ H20, 10 mg/1 ZnS04 • 7 H20, 3 mg/1 MnCl2 • 4 H20, 30 mg/1 H3B03, 20 mg/1
CoCl2 • 6 H20, 1 mg/1 NiCl2 • 6 H20, 3 mg/1 Na2Mo04 • 2 H20, 500 mg/1 Komplexbildner (EDTA oder Citronensäure) , 100 ml/1 Vitamingemisch (0,2 ml/1 Biotin, 0,2 mg/1 Folsäure, 20 mg/1 p-Aminobenzoesäure, 20 mg/1 Riboflavin, 40 mg/1 Ca-Panthothenat , 140 mg/1 Nikotinsäure, 40 mg/1 Pyridoxolhydrochlorid, 200 mg/1 Myoinositol) . Ly- sozym wurde in einer Endkonzentration von 2 , 5 mg/ml zur Suspen- sion gegeben. Nach etwa 4 Std. Inkubation bei 37°C wurde die Zellwand abgebaut, und die erhaltenen Protoplasten wurden durch Zen- trifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml Puffer I und einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8) gewaschen. Das Pellet wurde in 4 ml TE-Puffer resuspendiert, und 0,5 ml SDS-LÖsung (10%) und 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) wurden zugegeben. Nach Zugabe von Proteinase K in einer Endkonzentration von 200 μg/ml wurde die Suspension etwa 18 Std. bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol, Phenol-Chloro- form-Isoamylalkohol und Chloroform-Isoamylalkohol mittels Stan- dard-Verfahren gereinigt. Dann wurde die DNA durch Zugabe von 1/50 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol, anschließender Inkubation für 30 min bei -20°C und 30 min Zentrifugation bei 12000 U/min in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit einem SS34-Rotor (Sorvall) gefällt. Die DNA wurde in 1 ml TE-Puffer ge- löst, der 20 μg/ml RNase A enthielt, und für mindestens 3 Std. bei 4°C gegen 1000 ml TE-Puffer dialysiert. Während dieser Zeit wurde der Puffer 3mal ausgetauscht. Zu Aliquots von 0,4 ml der dialysierten DNA-Lösung wurden 0,4 ml 2 M LiCl und 0,8 ml Ethanol zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei -20°C wurde die DNA durch Zentrifugation gesammelt (13000 U/min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland) . Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer gelöst. Durch dieses Verfahren hergestellte DNA konnte für alle Zwecke verwendet werden, einschließlich Southern-Blotting oder zur Konstruktion genomischer Banken.
Beispiel 2 : Konstruktion genomischer Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) -Banken in Escherichia coli
Ausgehend von DNA, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wi- ley & Sons) Cosmid- und Plasmid-Banken hergestellt.
Es ließ sich jedes Plasmid oder Cosmid einsetzen. Besondere Verwendung fanden die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Acad. Sei. USA, 75: 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe (pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder
Cos ide, wie SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) oder Lorist6 (Gibson, T.J. Rosenthal, A. , und Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286.
Beispiel 3 : DNA-Sequenzierung und Computer-Funktionsanalyse
Genomische Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zur DNA- Sequenzierung gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem Kettenabbruchverfahren mit ABI377-Sequenziermaschinen (s. z.B. Flei- schman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd. , Science 269; 496-512) verwendet. Die Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet: 5 ' -GGAAACAGTATGACCATG-3 ' oder 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT-3 ' .
Beispiel 4: In-vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder He- fen, wie Saccharomyces cerevisiae) geleitet wird, die die Integrität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten können. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-ReparaturSystem auf (z.B., utHLS, utD, mutT, usw., zum Vergleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms in Escher i- c a coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington) . Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 veranschaulicht.
Beispiel 5: DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum
Mehrere Corynebacterium- und Brevibacterium-Arten enthalten endogene Plasmide (wie bspw. pHMl519 oder pBLl) die autonom replizie- ren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146). Shuttle-Vektoren für Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum lassen sich leicht mittels Standard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus Corynebacterium glutamicum beigegeben wird. Solche ReplikationsurSprünge werden vorzugsweise von endogenen Plasmiden entnommen, die aus Corynebacterium- und Breviba et erfcium-Arten isoliert worden sind. Besondere Verwendung als Trans ormationsmarker für diese Arten sind Gene für Kanamycin-Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder Tn- 03-Transposon stammen) oder für Chloramphenicol (Winnacker, E.L. (1987) "Fro Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim) . Es gibt zahlreiche Beispiele in der Literatur zur Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren, 5 die in E. coli und C. glutamicum repliziert werden, und die für verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen- Überexpression (siehe bspw. Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, . Martin, . J.F. et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 und Eikmanns, B.J. et al. (1992) Gene 10 102: 93-98) .
Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu klonie- ren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum-
15 Stämme einzubringen. Die Transformation von C. glutamicum läßt sich durch Protoplastentransformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), Elektroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) und in Fällen, bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch Konju- 0 gation erzielen (wie z.B. beschrieben in Schäfer, A. , et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die Shuttle-Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen, indem Plasmid-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet bekannter Standard-Verfahren) präpariert wird und in E. coli transfor- 5 miert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit Standard-Verfahren erfolgen, jedoch wird vorteilhafterweise ein Mcr-defizien- ter E. coli-Stamm verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19) .
0 Beispiel 6: Bestimmung der Expression des mutierten Proteins
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten Proteins in einer transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, daß das mutierte Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge expri- 5 miert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutierten Gens (ein Anzeichen für die mRNA-Menge, die für die Translation des Genprodukts verfügbar ist) ist die Durchführung eines Northern-Blots (s. bspw. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Bio- 0 logy, Wiley: New York) , wobei ein Primer, der so ausgestaltet ist, daß er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden) Markierung versehen wird, so daß - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine 5 stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird - die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge von mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Infor- mation ist ein Nachweis für das Ausmaß der Transkription des mutierten Gens . Gesamt-Zell-RNA läßt sich durch verschiedene Verfahren aus Corynebacterium glutamicum isolieren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie beschrieben in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge von Protein, das aus dieser mRNA translatiert wird, können Standard- Techniken, wie Western-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York) . Bei diesem Verfahren werden Gesamt-Zellproteine extrahiert, durch Gelelektrophorese getrennt, auf eine Matrix, wie Ni- trocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, inkubiert, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszierenden oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen läßt. Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutantenproteins in der Zelle an.
Beispiel 7 : Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
Genetisch veränderte Corynebakte ien werden in synthetischen oder natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien für Corynebakterian sind bekannt und leicht erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A. , et al., Hrsg. Springer-Verlag) . Diese Medien bestehen aus einer oder mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte Kohlenstoff- quellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte aus der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und organische Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische StickstoffVerbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie NH4CI oder (NH4) Sθ4, NH4OH, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoff uellen, wie Mais- quellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakte, Fleischextrakte und andere.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor-, oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat oder organische Säuren, wie Citronensäure. Die Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin, Ribofla- vin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten sind sterilisiert, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert definiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer, wie MOPS, HEPES; ACES usw., können alternativ oder gleichzeitig verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert läßt sich während der Anzucht auch durch Zugabe von NaOH oder NH4OH konstant halten. Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt verwendet, sinkt der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe Verbindungen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines Fer- menters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch mit gasförmigem Ammoniak reguliert werden. Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt, daß sich die maximale Menge Produkt in der Brühe ansammelt. Die offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von Be- hältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder Schüttelkolben entweder mit oder ohne Schikanen gezüchtet werden. Vor- zugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10%
(bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums gefüllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler (Amplitude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 100-300 U/ min geschüttelt werden. Verdampfungsverluste können durch Auf- rechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden; alternativ sollte für die Verdampfungsverluste eine mathematische Korrektur durchgeführt werden.
Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollten auch ein unmodifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet werden, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Das Medium wird auf eine ODßoo von 0,5 - 1,5 angeimpft, wobei Zellen verwendet werden, die auf Agarplatten gezüchtet wurden, wie CM-Platten (10 g/1 Glucose, 2,5 g/1 NaCl, 2 g/1 Harnstoff, 10 g/1 Polypepton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 Fleischextrakt, 22 g/1 Agar pH-Wert 6,8 mit 2 M NaOH) , die bei 30°C inkubiert worden sind. Das Animpfen der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung von C. srlutamicuzn-Zellen von CM-Platten oder durch Zugabe einer flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 8 : In-vitro- nalyse der Funktion imitierter Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt . Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt . Überblicke über Enzyme im Allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Bei- spiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Di- xon, M. , und Webb, E.C: (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzy atic Reaction Mechanis s. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology.
Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D: Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Aufl. Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J. , Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift- Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden) . Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann mit Reportergenassays (wie beschrieben in Kol ar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 und den darin zitierten Literaturstellen) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotisehen Zellen eta- bliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün-Fluoreszenz- Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann gemäß den Techniken, wie beschrieben in Gennis, R.B. (1989) "Po- res, Channels and Transporters", in Biome branes, Molecular
Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234; und 270-322, erfolgen.
Beispiel 9 : Analyse des Einflusses von mutiertem Protein auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen un- ter geeigneten Bedingungen (wie solchen, die vorstehend beschrieben sind) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. einer Aminosäure) untersucht wird. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie, Dünn- Schichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzyma- tische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. , et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Reh et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification" , S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992)
Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publica- tions) .
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es ebenfalls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt-Produkti- vität des Organismus, die Ausbeute und/oder die Effizienz der. Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen) , Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gewöhnlicher Metabolite aus Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Mi- crobial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Beispiel 10: Reinigung des gewünschten Produktes aus einer C. glu- tamicum-Rultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus C. glutamicum-Zellen oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, kön- nen die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultrabeschallung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur wei- teren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den C. ≤rlutamϊcum-Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die ÜberStandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder wobei die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chro- matographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Aus- wähl der geeigneten Chromatographieharze und der wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes , zu reinigendes Molekül bewandert . Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der 5 die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, die nicht auf das vorhergehende Reinigungsverfahren eingeschränkt sind. Diese sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. 10 Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) .
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Standard-Techniken des Fachgebiets bestimmt werden. Diese umfas-
15 sen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya
20 11: 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons;
25 Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Äquivalente
30
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich Routineverfahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein. 5
Die Angaben in Tabelle 1 sind folgendermassen zu verstehen:
In Spalte 1"DNA-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "5" in der Spalte 0 "DNA-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 5.
In Spalte 2"AS-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "6" in der Spalte "AS-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 6. 5 In Spalte 3"Identifikation" wird eine eindeutige interne Bezeichnung für jede Sequenz aufgeführt.
In Spalte 4 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Ami- nosäureposition der Polypeptidse uenz "AS-ID" in der gleichen Zeile. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen Polypeptidsequenz . Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.
In Spalte 5 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Wildtyp-Stamm.
In Spalte 6 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 7"Funktion" wird die physiologische Funktion der entsprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt.
Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Pheny1al nin
G Glycin
H His
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin Tabelle 1
Gene die für regulatorische Proteine codieren
DNA AS Identifikation: AS AS AS Funktion:
ID: ID: Pos: Wildtyp utai
1 2 RXA00205 220 G D RIBOSE OPERON REPRESSOR
3 4 RXA00253 177 T I TETRACYCLINE REPRESSOR PROTEIN CLASS E
5 6 RXA00291 219 E K SENSOR KINASE DPIB (EC 2.7.3.-)
7 8 RXA00319 63 A V OW MOLECULAR WEIGHT PHOSPHOTYROSINE PROTEIN PHOSPHATASE (EC 3.1.3.48)
9 10 RXA00486 80 R H TRANSCRIPTIONAL REGULATORY PROTEIN, LYSR FAMILY
11 12 RXA00593 18 A V CELL DIVISION TRANSCRIPTION FACTOR, WHMD
13 14 RXA00609 107 A T TRANSCRIPTIONAL REGULATORY PROTEIN
15 16 RXA00651 374 Q D Sensory Transduction Protein Kinase (EC 2.7.3.-)
17 18 RXA00719 306 D N GTP-BINDING PROTEIN
468 A τ GTP-BINDING PROTEIN
19 20 RXA00813 340 Q D SECRETORY PROTEIN KINASE
21 22 RXA01081 102 R C TRANSCRIPTIONAL REGULATORY PROTEIN
23 24 RXA01315 20 A τ TRANSCRIPTIONAL REGULATOR, TETR FAMILY
101 G D TRANSCRIPTIONAL REGULATOR, TETR FAMILY
25 26 RXA01573 474 P S 2',3'-CYCLIC-NUCLEOTIDE 2'-PHOSPHODIESTERASE (EC 3.1.4.16)
28 RXA01607 142 R W TRANSCRIPTIONAL REGULATORY PROTEIN
179 A T TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN
30 RXA01759 63 S F TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN GLTC
191 P S TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN GLTC
32 RXA01826 603 P S SERINEtTHREONINE PROTEIN KINASE (EC 2,7.1.37)
34 RXA02097 28 A V TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
427 G R TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
36 RXA02210 4 A V TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR, TETR FAMILY
38 RXA02362 525 M I TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
40 RXA02376 150 H R GTP-BINDING PROTEIN
42 RXA02627 338 E K DTXR IRON-REGUUTED LIPOPROTEIN PRECURSOR
44 RXA02667 193 G D TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
46 RXA02758 110 G E PHOSPHOSERINE PHOSPHATASE (EC 3.1.3.3)
48 RXA02910 186 D N TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN, LYSR FAMILY
50 RXA03100 170 R C AMIDE-UREA BINDING PROTEIN PRECURSOR
176 S F AMIDE-UREA BINDING PROTEIN PRECURSOR
52 RXA03127 142 E K TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN
54 RXA03136 205 P S TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR, LUXR FAMILY
385 D N TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR, LUXR FAMILY
56 RXA03201 206 D N UDP-GLUCOSE 4-EPIMERASE (EC 5.1.3.2)
58 RXA03407 70 A V TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
60 RXA03629 36 S N TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
62 RXA03928 170 E R TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
171 A S TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
172 M H TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR
64 RXA04129 54 A V TRANSCRIPTIONAL REGUUTOR, ARSR FAMILY
66 RXA04350 150 R H TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN
68 RXA04363 81 S F TRANSCRIPTIONAL REPRESSOR
70 RXA04620 260 R H TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN
72 RXA06017 33 A V PROBABLE HYDROGEN PEROXIDE-INDUCIBLE GENES ACTIVATOR
74 RXA07002 158 P S SENSOR PROTEIN BAES (EC 2.7.3.-)
76 RXA07003 126 L F TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN
195 R K TRANSCRIPTIONAL REGUUTORY PROTEIN

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül codierend für ein Polypeptid mit der jeweils in Tabellel/Spalte2 in Bezug genommenen
Aminosäuresequenz wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Ta- bellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition eine andere proteinogene Aminosäure codiert als die jeweilige in Ta- bellel/Spalte5 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure.
2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Tabellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition die in Tabellel/Spalte6 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure codiert .
3. Ein Vektor, der wenigstens eine NukleinsäureSequenz nach Anspruch 1 enthält.
4. Eine Wirtszelle, die mit wenigstens einem Vektor nach An- spruch 3 transfiziert ist.
5. Eine Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls zur Modulation der Produktion einer Feinchemikalie aus besagter Zelle führt.
6. Verf hren zur Herstellung einer Feinchemikalie welches die Kultivierung einer Zelle beinhaltet, die mit wenigstens einen Vektor nach Anspruch 3 transfiziert worden ist, so dass die Feinchemikalie produziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6 , dadurch gekennzeichnet, daß die Feinchemikalie eine Aminosäure ist .
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Lysin ist.
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WO (1) WO2003040181A2 (de)
ZA (1) ZA200404417B (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7205144B2 (en) * 2000-08-31 2007-04-17 Degussa Ag Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from Corynebacterium glutamicum
US7566557B2 (en) 2003-12-18 2009-07-28 Paik Kwang Industrial Co., Ltd. Gene variants coding for proteins from the metabolic pathway of fine chemicals
EP3061828A4 (de) * 2013-10-23 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur herstellung einer zielsubstanz
EP3660158A1 (de) 2018-11-29 2020-06-03 Evonik Operations GmbH Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101640711B1 (ko) * 2015-04-20 2016-07-19 씨제이제일제당 (주) 글루코네이트 리프레서 변이체, 이를 포함하는 l-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신 생산방법
KR101947945B1 (ko) 2018-01-25 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법
CN108753810B (zh) * 2018-05-22 2021-06-18 昆明理工大学 一种转录调节蛋白基因orf2的用途
CN108753861B (zh) * 2018-06-08 2022-02-01 福建省微生物研究所 一种毒三素链霉菌发酵产利普司他汀的培养基及方法
CN109207418B (zh) * 2018-11-19 2020-05-08 南京工业大学 一株过表达三磷酸腺苷酶的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
KR102306009B1 (ko) * 2021-04-07 2021-09-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 WhiB 계열 전사 조절자 WhcA 변이체 및 이를 이용한 L-발린 생산 방법
CN114107144B (zh) * 2021-11-04 2023-09-12 清华大学 一种副产物少、高产1,3-丙二醇的重组微生物及其应用
CN115028694A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 内蒙古伊品生物科技有限公司 与l-谷氨酸产量相关的蛋白及其相关生物材料和应用
CN117209573A (zh) * 2023-09-06 2023-12-12 宜兴食品与生物技术研究院有限公司 一种转录因子NCgl0581突变体及其在L-丝氨酸检测中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1108790A2 (de) * 1999-12-16 2001-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Neue Polynukleotide
WO2002018419A2 (en) * 2000-08-26 2002-03-07 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the ccpa1 gene

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10039044A1 (de) * 2000-08-10 2002-02-21 Degussa Neue für das IysR1-Gen kodierende Nukleotidsequenzen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1108790A2 (de) * 1999-12-16 2001-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Neue Polynukleotide
WO2002018419A2 (en) * 2000-08-26 2002-03-07 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the ccpa1 gene

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CREMER J ET AL: "CONTROL OF THE LYSINE BIOSYNTHESIS SEQUENCE IN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM AS ANALYZED BY OVEREXPRESSION OF THE INDIVIDUAL CORRESPONDING GENES" APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON,DC, US, Bd. 57, Nr. 6, 1. Juni 1991 (1991-06-01), Seiten 1746-1752, XP000616281 ISSN: 0099-2240 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7205144B2 (en) * 2000-08-31 2007-04-17 Degussa Ag Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from Corynebacterium glutamicum
US7566557B2 (en) 2003-12-18 2009-07-28 Paik Kwang Industrial Co., Ltd. Gene variants coding for proteins from the metabolic pathway of fine chemicals
EP3061828A4 (de) * 2013-10-23 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur herstellung einer zielsubstanz
US10155952B2 (en) 2013-10-23 2018-12-18 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance
EP3660158A1 (de) 2018-11-29 2020-06-03 Evonik Operations GmbH Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin
WO2020109367A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 Evonik Operations Gmbh Method for the fermentative production of l-lysine using an l-lysine excreting bacterium of the species corynebacterium glutamicum having a completely or partly deleted whib4 gene
US11198895B2 (en) 2018-11-29 2021-12-14 Evonik Operations Gmbh Method for the fermentative production of L-lysine using an L-lysine excreting bacterium of the species Corynebacterium glutamicum having a completely or partly deleted WHIB4 gene

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