CN117209573A - 一种转录因子NCgl0581突变体及其在L-丝氨酸检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转录因子NCgl0581突变体及其在L‑丝氨酸检测中的应用，属于生物检测技术领域。本发明通过分子对接，获得转录因子NCgl0581与L‑丝氨酸的关键结合位点，进一步进行模型分析及虚拟筛选，获得L‑丝氨酸生物传感器突变体NCgl0581E136P。经实验验证，基于突变体NCgl0581E136P构建的生物传感器可响应25mM丝氨酸，比突变前的响应浓度降低1倍。本发明通过突变降低了生物传感器的检测下限，为低浓度L‑丝氨酸的检测奠定基础，具有很好的应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种转录因子NCgl0581突变体及其在L-丝氨酸检测中的应用，属于生物检测技术领域。
背景技术
L-丝氨酸参与细胞内多种重要活动，在医药、食品以及化妆品等多领域有着广阔的应用前景。近期有研究表明L-丝氨酸对多种类型的细胞存在刺激增殖作用，其合成代谢途径与肿瘤细胞的生成和增殖等有密切的联系，极可能成为重要的肿瘤标记物，探索高效便利的L-丝氨酸检测方法十分重要。生物传感器能够实现目标化合物的特异性响应，因而已被广泛用于代谢物的浓度检测。但基于野生型转录因子NCgl0581构建的L-丝氨酸生物传感器具有检测下限较高等问题，难以应用于低浓度L-丝氨酸的分析检测。
生物传感器主要由生物敏感膜和换能器两个重要元件组成。当待分析物通过一定的渗透或流动等作用进入生物敏感膜后经分子识别作用与其发生特异性结合，所产生的物理化学或生物信号可以通过换能器转化为光、电等信号，从而对被测物进行分析检测。生物传感器主要包括FRET传感器、核糖开关传感器和转录因子(TF)传感器等。近年来，生物传感器已被广泛应用于生物合成途径的优化和代谢物的实时监测中，在高产菌株和高效能酶的构建与筛选中具有巨大的潜力。
其中基于转录因子的生物传感器应用最为广泛。当目标代谢物达到一定浓度时，转录因子通过改变自身蛋白构象以实现响应特性并将目标代谢物的浓度信号转化为荧光等信号输出。NCgl0581是谷氨酸棒杆菌中的内源性转录调控因子，属于LysR型转录家族调节因子，信号分子是L-丝氨酸，用于调节启动子PSerE。基于转录因子NCgl0581的生物传感器可用于L-丝氨酸浓度的检测及L-丝氨酸生产菌株的筛选等，然而野生型L-丝氨酸生物传感器的检测下限较高，难以应用于低浓度L-丝氨酸的分析检测。通常可通过调节启动子强度、RBS等传统策略对生物传感器的性能进行改造，但传统的静态改造方法存在数据量少、通用型差等问题，而结合计算机辅助设计，借助数学模型等理性设计方式对生物传感器的性能进行可预测改造，实现智能化调控。因此提出本发明。
发明内容
为解决上述问题，本发明以L-丝氨酸生物传感器野生型转录因子NCgl0581为研究对象，通过分析对接获得其与信号分子L-丝氨酸关键结合位点，进一步进行模型分析及虚拟筛选，获得L-丝氨酸生物传感器突变体NCgl0581E136P，降低了生物传感器的检测下限，提高了灵敏度，为低浓度L-丝氨酸检测奠定基础。
本发明的第一个目的是提供一种转录因子NCgl0581突变体，所述突变体通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第136位谷氨酸突变为脯氨酸得到(NCgl0581E136P)。
本发明的第二个目的是提供编码上述转录因子NCgl0581突变体的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供携带上述核酸分子的表达载体。
本发明的第四个目的是提供表达上述转录因子NCgl0581突变体的宿主细胞。
进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
本发明的第五个目的是提供上述转录因子NCgl0581突变体、核酸分子、表达载体或宿主细胞在制备L-丝氨酸检测产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种L-丝氨酸检测产品，所述检测产品中含有上述转录因子NCgl0581突变体、核酸分子、表达载体或宿主细胞。
进一步地，所述检测产品为生物传感器，生物传感器包括：转录因子NCgl0581突变体编码基因、启动所述转录因子NCgl0581突变体编码基因表达的启动子、启动子PSerE以及由其启动表达的报告基因，所述启动子PSerE位于转录因子NCgl0581突变体编码基因的下游。
以L-丝氨酸为检测靶标为例，本发明构建的生物传感器的检测原理如下：启动子启动NCgl0581基因表达，NCgl0581蛋白与L-丝氨酸分子结合改变自身蛋白构象，进而启动下游启动子PSerE，从而表达报告基因，输出荧光等信号，并根据荧光信号的强弱实现L-丝氨酸分子的定量检测，当然，本发明所构建的生物传感器能够响应25mM L-丝氨酸，为低浓度L-丝氨酸样品的检测奠定基础，这是本发明的优势所在。
进一步地，启动所述转录因子NCgl0581突变体编码基因表达的启动子可为诱导型启动子，也可为组成型启动子，包括但不限于PNCgl0581、PB6、Pe、Pa16等。
进一步地，所述报告基因可为任何可识别的信号，如荧光基因、抗性基因等。
进一步地，上述元件位于同一质粒载体上，并导入宿主细胞中进行目标物的检测，本发明一实施例所使用的载体为pDXW-11。
本发明的第七个目的是提供一种L-丝氨酸的检测方法，包括以下步骤：
定性检测：将待测样品与含有上述生物传感器的宿主细胞共孵育，孵育完成后检测报告基因信号，根据信号的有无判断待测样品中是否含有目标物；
定量检测：
S1、将含有不同浓度目标物的样品与含有上述生物传感器的宿主细胞共孵育，孵育完成后检测报告基因信号强弱；
S2、建立报告基因信号与目标物浓度的关系曲线；
S3、将实际待测样品重复步骤S1，代入S2的关系曲线中计算目标物的含量。
本发明的有益效果：
本发明通过对转录因子NCgl0581与L-丝氨酸进行分子对接，将获得的结合关键位点进行突变得到NCgl0581E136P突变体，并基于转录因子NCgl0581的E136P突变体构建一种生物传感器，该传感器包含E136P突变体编码基因及其启动子PNCgl0581、启动子PSerE及报告基因。其中，转录因子NCgl0581可受L-丝氨酸的诱导，通过改变自身结构与L-丝氨酸结合，进而启动下游启动子PSerE，从而表达报告基因。将上述生物传感器转化至大肠杆菌后，通过外源添加不同浓度梯度L-丝氨酸验证NCgl0581突变体对L-丝氨酸的响应浓度，发现基于NCgl0581E136P突变体构建的生物传感器检测下限降低1倍，其L-丝氨酸响应浓度低至25mM，表明突变体NCgl0581E136P在低浓度L-丝氨酸浓度检测方面的优越性，为低浓度L-丝氨酸的分析检测奠定基础。
附图说明
图1为本发明生物传感器的构建示意图。
图2为野生型NCgl0581生物传感器及突变体响应L-丝氨酸的情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明涉及的方案如下：
如何通过突变技术来改变L-丝氨酸的检测范围，难点在于突变位点的选择。本发明通过对野生型转录调控因子NCgl0581蛋白与L-丝氨酸进行三维结构搭建，使用MOE-Dock软件模拟分子对接，确定L-丝氨酸与NCgl0581四聚体的结合亲和力，依据结合亲和力的变化确定结合的关键位点并进行虚拟突变，确定突变位点和方向，依据模拟计算结果进行E136P等突变体的设计，然后通过外源添加浓度梯度L-丝氨酸实验得到生物传感器的剂量响应曲线，最后验证突变体生物传感器的检测下限变化。
下述实施例中涉及的培养基和各测定方法等参照如下：
LB培养基(g/L)：蛋白胨10；酵母膏5；NaCl 10(固体培养基，琼脂粉20)；灭菌条件：121℃，20min。
菌体荧光强度和生物量的测定：将培养基中大肠杆菌4℃，4000g，离心5min收集菌体，使用预冷的PBS缓冲液洗涤2～3次，重悬并稀释于PBS缓冲液中(OD600＝0.2-0.8)。吸取200μL稀释后的菌液加至96孔板中，用多功能酶标仪测定荧光强度与菌体浓度。测定荧光强度时，酶标仪的参数设置为黄色荧光蛋白激发波长488nm，发射波长为590/9nm；测定菌体浓度时，酶标仪的参数设置为λ＝600。
大肠杆菌转化方法：以突变体E136P为例，将大肠杆菌感受态于冰上融化，在超净工作台中，取100pg-10ng含突变体E136P的质粒与感受态细胞混匀，于冰上放置30min。42℃水浴2min进行热休克后，置于冰上2min，将菌液加入900μL新鲜LB液体培养基中，37℃，220rpm培养1h。离心收集菌体，重悬后涂布于含Kan的固体LB平板上，于37℃培养箱中倒置过夜培养。
实施例1：模型分析及虚拟筛选
采用MOE分子模拟软件对野生型转录调控因子NCgl0581蛋白进行同源建模，根据GB/VI评分函数选择评分最好的中间模型作为最终模型，采用PyMOL和save v6.0软件对模型进行描述和分析。然后在MOE中将下载的L-丝氨酸二维结构通过能量最小化转化为三维结构。
使用MOE-Dock对构建的NCgl0581四聚体模型与底物L-丝氨酸进行分子对接，综合考虑蛋白与L-丝氨酸的相互作用、结合位点以及对接评分等因素筛选最有构象，并采用PyMOL分析结合模式。
通过LowMode模块下的残基扫描确定NCgl0581对L-丝氨酸亲和力的变化，确定突变体的构象空间，将符合能量学准则的突变体构象输出，从而依据结合亲和力的变化模拟突变构建虚拟突变体库，按照模拟计算结果指导的突变位点和突变方向设计E136P突变体。
实施例2：转录因子NCgl0581点突变为E136P
采用PCR方法进行定点突变，对转录因子NCgl0581(氨基酸序列见SEQID NO.1，核苷酸序列见SEQ ID NO.2)的E136位点进行定点突变，将第136位点的谷氨酸突变成脯氨酸。以菌株基因组为模板，选择点突变前500bp和后500bp为扩增目标，利用引物ncgl0581-F，ncgl0581-R扩增含点突变的同源臂基因片段。与经EcoR I和Xba I双酶切的质粒pK18mobsacB连接，构建回复突变质粒，转化入大肠杆菌感受态细胞中，于37℃过夜培养，对长出的转化子进行菌落PCR，送至上海生工生物工程有限公司进行测序；结果正确的为突变成功的菌株，E136P突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列见SEQ ID NO.4。
其中，用于E136P突变的引物如表1所示。
表1定点突变引物
实施例3：外源梯度实验验证突变体生物传感器L-丝氨酸检测范围的变化
生物传感器的构建：构建示意图如图1，生物传感器的一部分用于转录调控因子NCgl0581的表达，一部分连接受NCgl0581调控的启动子PSerE，并在之后连接eyfp，用于表征生物传感器结合L-丝氨酸从而调控eyfp的转录水平。启动子PSerE的核苷酸序列见SEQ IDNO.5，报告基因eyfp的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
基于NCgl0581的L-丝氨酸生物传感器(pDSer)的L-丝氨酸检测下限为50mM，当L-丝氨酸浓度低于50mM时荧光值基本保持不变，无法响应更低浓度的L-丝氨酸。以下通过外源添加实验验证基于NCgl0581E136P的突变体生物传感器对L-丝氨酸的响应浓度降低至25mM。
在完成定点突变的基础上，分别挑取含野生型NCgl0581及突变体E136P的JM109单菌落，接种至10mL LB(100μg/mL Kan)液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养。在经灭菌处理的24孔板中每孔添加950μL新鲜LB培养基，然后加入不同浓度的L-丝氨酸，控制其终浓度分别为0、25、50、75或100mM，最后每孔加入50μL过夜培养菌液，将孔板于37℃，220rpm摇床培养2h。
将培养基中大肠杆菌离心5min收集菌体，使用PBS缓冲液洗涤2-3次，重悬并稀释于PBS缓冲液中(OD600＝0.2-0.8)。吸取200μL稀释后的菌液加至96孔板中，用多功能酶标仪测定菌体浓度OD600及荧光强度，计算得到的荧光强度/OD600即为单位菌体荧光强度值。
实施例4：突变对L-丝氨酸检测范围的影响分析
将荧光强度/OD600为纵坐标，L-丝氨酸浓度为横坐标，使用OriginPro 8.5绘制生物传感器对L-丝氨酸剂量响应曲线，当剂量响应曲线呈现明显上升趋势时所对应的L-丝氨酸浓度定义为生物传感器的检测下限。根据响应曲线可以分别得到野生型NCgl0581及突变体E136P的检测范围等参数。
结果表明，当L-丝氨酸浓度达到50mM时，基于野生型NCgl0581的生物传感器开始产生响应，其检测下限为50mM；而基于突变体E136P的生物传感器在L-丝氨酸浓度为25mM时响应曲线开始呈现明显上升趋势，对L-丝氨酸的检测下限降低至25mM。通过实验验证结果可知，对转录因子NCgl0581与L-丝氨酸结合的关键位点进行E136P点突变，可以改变生物传感器的检测下限；而在该位点E136A、E136Y突变对L-丝氨酸响应浓度无影响(图2)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种转录因子NCgl0581突变体，其特征在于：所述突变体通过将氨基酸序列如SEQID NO.1所示序列的第136位谷氨酸突变为脯氨酸得到。
2.编码权利要求1所述转录因子NCgl0581突变体的核酸。
3.携带权利要求2所述核酸的表达载体。
4.表达权利要求1所述转录因子NCgl0581突变体的宿主细胞。
5.权利要求1所述转录因子NCgl0581突变体、权利要求2所述核酸、权利要求3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞在制备L-丝氨酸检测产品中的应用。
6.一种L-丝氨酸检测产品，其特征在于：所述检测产品中含有权利要求1所述转录因子NCgl0581突变体、权利要求2所述核酸、权利要求3所述表达载体或权利要求4所述宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的L-丝氨酸检测产品，其特征在于：所述L-丝氨酸检测产品包括生物传感器。
8.根据权利要求7所述的L-丝氨酸检测产品，其特征在于，所述生物传感器包括：转录因子NCgl0581突变体编码基因、启动所述转录因子NCgl0581突变体编码基因表达的启动子、启动子PSerE以及由其启动表达的报告基因。
9.一种L-丝氨酸的检测方法，其特征在于：包括将含有权利要求8所述生物传感器的宿主细胞与待测样品共孵育，并进行信号检测的步骤。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将含有不同浓度目标物的样品与含有所述生物传感器的宿主细胞共孵育，孵育完成后检测报告基因信号强弱；
S2、建立报告基因信号与目标物浓度的关系曲线；
S3、将样品替换为待测样品重复步骤S1，代入S2的关系曲线中计算目标物的含量。
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