CN107603932B - 一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法，包括如下步骤：1)获取谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型中所需的反应数据、代谢物数据和注释的基因数据，构建谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型，验证所述谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型的准确性；2)根据步骤1)中验证后的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型预测提高氨基酸产量需要对应调节的代谢通量及代谢通量的调节方式；3)根据所述需要调节的代谢通量及代谢通量的调节方式结合注释的基因数据确定靶基因，对靶基因进行遗传改造，构建工程菌。还提供了该方法在提高L‑脯氨酸产量上的应用，实验证明L‑脯氨酸产量有很大提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法及其应用。
背景技术
目前，微生物在解决人类的粮食、健康、资源和环境保护等问题中发挥重要且不可替代的作用。在现代发酵工业生产中，所有的原始菌种均需采用育种技术进行改良，以大幅度地提高发酵生产效率，降低发酵生产成本。20世纪90年代中期提出的代谢工程(Metabolic engineering)又称途径工程(Pathway engineering)，其定义为：“利用重组技术，对细胞的酶促反应、物质运输以及调控功能进行遗传操作，进而改良细胞生物活性的过程”，是对细胞内代谢途径网络系统分析的基础上进行有目的地改变，以更好地利用细胞代谢进行化学转化、能量转换合成和分子组装。
随着基因组及其相关技术的发展，几乎所有重要工业微生物模式菌株的全基因组序列都已经公布，微生物制造研究进入了后基因组时代。后基因组时代的微生物制造具有以下特点：1)源于微生物基因组的蛋白质组数据的积聚，使认识、理性设计、定向改变酶的性能更为容易；2)转录组学和代谢组学等数据的积聚有助于提高工业微生物抵御微生物制造过程中的恶劣环境的能力；3)从对微生物中个别基因或蛋白质功能的局部性研究，转移到以细胞内全部基因、mRNA、蛋白质以及代谢产物为研究对象的工业微生物生理研究；4)基于生物信息学的基因组规模基因调控网络、信号转导网络、蛋白质相互作用网络和代谢网络的构建、模拟与分析，逐步将代谢工程推入更为理性的系统代谢工程时代；5)采用合成生物学的技术精确控制代谢途径、合成目的蛋白，构建“人工细胞”，显著提高微生物制造效率。前已述及，由于基因与蛋白质倾向于成组地通过网状相互作用而影响微生物细胞功能，因此对工业微生物生理功能的理解和全局调控的研究必须构建并分析其相互作用的网络。这些分子和基因相互作用网络包括基因调控网络、信号转导网络、蛋白质相互作用网络和代谢网络等。其中，基于基因组注释的代谢网络将微生物细胞内所有生化反应构建为一个网络模型，反映了所有参与代谢过程的化合物之间以及所有催化酶之间的相互作用关系。
基因组规模代谢网络模型(Genome scale of metabolic model，GSMM)包含了所给定微生物细胞中发生的绝大部分生化反应。微生物细胞的代谢调控发生在基因-基因、基因-蛋白质、蛋白质-蛋白质、蛋白质-代谢物以及物理间相互作用等水平上。通过与其它组学数据，如转录组、蛋白质组等的整合，GSMM用以充分理解微生物细胞内的调控机制。因此，基因组规模代谢网络模型能提供一个高效平台，从全局水平理解微生物生理代谢功能。BIGG数据库表明，原核微生物的代谢网络包含了1000多个代谢物、1200多个基因和2000多个生化反应(以E.coli为例)；而真核微生物代谢网络模型包括1200多个代谢物、1000多个基因和1500多个生化反应(以S.cerevisiae为例)。基因组规模代谢网络模型一般包含约6％～15％(真核微生物)和25％(原核微生物)的开放阅读框(ORF)。目前，GSMM被广泛应用于定性与定量预测不同代谢或环境扰动条件下的细胞生长表型。包括：1)采用流平衡分析(Flux balance analysis，FBA)，预测不同营养物吸收速率、代谢副产物合成速率和细胞生长速率之间的全局性关系；2)预测不同类型培养基上细胞产率和比生长速率；3)基于基因-蛋白质-反应(Gene-protein-reaction，GPR)原则预测基因删除对细胞生长表型的影响；4)预测并构建微生物生长(或合成目标代谢产物)必需基因集；5)定量预测不同环境或代谢扰动下微生物的生长表型。
对工业菌株的研究和改造离不开对其细胞网络的了解和认识，谷氨酸棒状杆菌的基因转录调控和代谢网络也一直是人们关注的焦点。Ikeda等和Kalinowski等分别完成了谷氨酸棒状杆菌C.glutamicumATCC 13032菌株的基因组测序，将谷氨酸棒状杆菌的研究带入了系统生物学新纪元。Kjeldsen等(Kjeld
Kjeldsen,Jens Nielsen(2009)InSilico Genome-Scale Reconstruction andValidation of the CorynebacteriumglutamicumMetabolic Network.Biotechnol.Bioeng.,102:583–597.)和Yohei等(YoheiShinfuku,Natee Sorpitiporn,Masahiro Sono,Chikara Furusawa,TakashiHirasawa1and Hiroshi Shimizu(2009)Development and experimental verificationof a genome-scalemetabolic model for Corynebacterium glutamicum.MicrobialCell Factories,8:43)利用基因组注释数据库分别构建了含有约500个反应的谷氨酸棒状杆菌基因组规模代谢网络，但是该模型包括的反应数及代谢物数较少，且很多反应都是一步概括多步中间反应，不能全面准确地反映谷氨酸棒杆菌的生长代谢情况，也不利于发现代谢调节的制约点。因此，对谷氨酸棒杆菌代谢网络的进一步研究及应用代谢网络模型改良菌株对工业生产具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法及其应用，解决了现有谷氨酸棒杆菌基因组代谢网络模型不能全面反映菌体真实生长代谢情况，预测不够准确的问题，并根据其预测结果成功构建了提高L-脯氨酸产量的重组菌。
本发明的一个方面，提供一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法，包括如下步骤：
1)获取谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型中所需的反应数据、代谢物数据和注释的基因数据，构建谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型，验证所述谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型的准确性；
2)根据步骤1)中验证后的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型预测提高氨基酸产量需要对应调节的代谢通量及代谢通量的调节方式；
3)根据所述需要调节的代谢通量及代谢通量的调节方式结合注释的基因数据确定靶基因，对靶基因进行遗传改造，构建工程菌。
在上述方法中，步骤1)中所需的反应数据包括运输反应、生物量反应、交换反应、糖代谢反应、氨基酸代谢反应、维生素和辅因子代谢反应、复合脂类代谢反应、核苷酸代谢反应、脂类代谢反应、能量代谢反应、其它碳代谢反应。
本发明的另一个方面，还提供了以上所述方法在提高L-脯氨酸产量上的应用，步骤3)中所述靶基因为putA，所述遗传改造为在谷氨酸棒杆菌基因组中敲除putA基因。
以上所述的应用，步骤3)中所述靶基因还包括acn，所述遗传改造还包括增强谷氨酸棒杆菌基因组中acn基因的表达。
以上所述的应用，所述敲除putA基因的步骤包括：
1)以谷氨酸棒杆菌基因组为模板通过引物扩增所述putA基因的上游同源臂和下游同源臂，融合所述putA基因的上游同源臂和所述下游同源臂；
2)步骤1)中融合的所述上游同源臂和所述下游同源臂片段经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的载体pK18mobsacB连接；
3)步骤2)中的连接产物转化大肠杆菌，在含卡那霉素的培养基中筛选阳性转化子并验证，获得重组载体pK18mobsacB-ΔputA；
4)将重组载体pK18mobsacB-ΔputA转化谷氨酸棒杆菌，通过在含卡那霉素的培养基中正向筛选得到重组载体pK18mobsacB-ΔputA整合至染色体上的菌落，通过在含蔗糖的培养基中反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落并验证，获得敲除putA基因的重组菌CG413。
以上所述的应用，所述增强acn基因的表达包括替换acn基因的启动子Pacn，将所述acn基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列以及将所述acn基因的起始密码子TTG替换为ATG，具体包括：
1)以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板通过引物扩增acn基因启动子上游同源臂、Peftu启动子和acn基因起始区(包含RBS序列和起始密码子)、acn基因起始区下游同源臂，融合所述acn基因启动子上游同源臂、Peftu启动子、acn基因起始区和acn基因起始区下游同源臂；
2)步骤1)中融合的所述acn基因启动子上游同源臂、Peftu启动子、acn基因起始区和acn基因起始区下游同源臂片段经Hind III和EcoR I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接；
3)步骤2)中的连接产物转化大肠杆菌，在含卡那霉素的培养基中筛选阳性转化子并验证，获得重组载体pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A；
4)将重组载体pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A转化敲除putA基因的重组菌CG413，通过在含卡那霉素的培养基中正向筛选得到重组载体pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A整合至染色体上的菌落，通过在含蔗糖的培养基中反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落并验证，获得acn基因的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子Peftu，acn基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列，同时acn基因的起始密码子TTG替换为高表达强度的ATG的谷氨酸棒杆菌。
以上所述的应用，步骤1)中以P15和P16为引物PCR扩增putA基因启动子上游同源臂，以P17和P18为引物扩增putA基因下游同源臂，引物序列分别如下：
P15：5’-CCCAAGCTTGGTCAATGTCGGTGATGATCCT-3’
P16：5’-CCATGCGCAAAACGAGGTGGTTCTCCTTCAAGATCAG-3’
P17：5’-TGAAGGAGAACCACCTCGTTTTGCGCATG-3’
P18：5’-ACGCGTCGACACGGTCACGCCGTGCTCCA-3’。
以上所述的应用，步骤1)中以P21和P22为引物扩增acn启动子上游同源臂；以P23和P24为引物扩增Peftu启动子和acn基因起始区；以P25和P26为引物扩增acn基因起始区下游同源臂，引物序列分别如下：
P21：5’-CCGGAATTCAAAATCTGATTCCTTTGCA-3’
P22：5’-TTCGCAGGGTAACGGCCACTTCATTATCCTAACAGTACAA-3’
P23：5’-GTACTGTTAGGATAATGAAGTGGCCGTTACCCTGCGA-3’
P24：5’-AGTCACAGTGAGCTCCATTTCTATCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTG-3’
P25：5’-ATACAAAAGGAGGATAGAAATGGAGCTCACTGTGACTGAA-3’
P26：5’-CCCAAGCTTTGGTGGTGTGGGAGTCG-3’。
以上所述的应用，所述谷氨酸棒杆菌为含有定点突变的proB基因的谷氨酸棒杆菌，所述定点突变为将第149位的甘氨酸突变为天冬氨酸。
以上所述的应用，所述谷氨酸棒杆菌为过表达所述定点突变的proB基因的谷氨酸棒杆菌。
以上任一所述的应用中构建的L-脯氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌。
本发明的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型相比现有的模型具有如下优势：
(1)增加了反应数、代谢物数及注释的基因数，反应数达到1487个，代谢物数达到1194个，所注释的基因数达到了772个，一些特定的蛋白(如乙酰载体蛋白)和tRNAs都被加入本发明的基因组规模代谢网络模型，并且增加了中间反应数，如增加了细胞壁的合成部分及脂肪酸合成部分的中间反应，最大化反应通路的细节有利于发现代谢调节的制约点，使谷氨酸棒杆菌的代谢网络模型相比现有技术更加完整，为菌株改造提供理论基础。
(2)确定了(1)中增加反应的方向：对于新加入的不确定反应，必须确定其反应方向，我们通过四种方式查询其反应热力学参数：大肠杆菌的网络、BRENDA网站、SEED网站和eQuilibrator网站。因大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的细胞内pH值都是7.0，而酶的反应热力学常数ΔrG’和pH值相关，所以直接利用大肠杆菌的ΔrG’，对于谷氨酸棒杆菌特有的反应则通过查询BRENDA网站和SEED网站确定。
(3)增加氨基酸的反馈抑制模块：在模型中把一些受到反馈抑制净积累量为0的氨基酸的通量上限设为0，使模型更接近于谷氨酸棒杆菌野生型的实际生理代谢情况。
通过本发明的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型预测的结果，确定了靶基因putA，在谷氨酸棒杆菌基因组中敲除putA基因，使L-脯氨酸产量提高27.326％。根据预测结果还增强了acn基因的表达，使谷氨酸棒杆菌的L-脯氨酸产量进一步提高41.038％。本发明构建的L-脯氨酸工程菌发酵结束时的L-脯氨酸产量为10～120g/L，生产强度为0.1～2g/L/h。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型核心代谢途径示意图；
图2利用实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型定量预测谷氨酸棒杆菌的生长表型图；
图3实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型的数据的FBA数据(虚线框)与13C代谢流分析数据比较(实线框)；
图4OptForce算法结合实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型预测实现L-脯氨酸过量生产需调节的代谢流量图；
图5是以生物量为目标函数，P5CD和EX-pro-L(e)的鲁棒性分析；
图6是以L-脯氨酸为目标函数，P5CD和EX-pro-L(e)的鲁棒性分析；
图7是同时以生物量和L-脯氨酸为目标函数，P5CD和EX-pro-L(e)的鲁棒性分析；
图8是以生物量为目标函数，ACONTa(b)和EX-pro-L(e)的鲁棒性分析；
图9是以L-脯氨酸为目标函数，ACONTa(b)和EX-pro-L(e)的鲁棒性分析；
图10是同时以生物量和L-脯氨酸为目标函数，ACONTa(b)和EX-pro-L(e)的鲁棒性分析；
图11是重组质粒pWYE1403的示意图；
图12是菌株ATCC13032和其敲除putA菌株的生长情况；
图13是菌株ATCC13032和其敲除putA菌株的比生长速率分析；
图14是CG421中acn转录水平图；
图15是本发明实施例4中的发酵产物上清液的液相图谱；
图16是ATCC13032的摇瓶发酵过程曲线；
图17是CG415的摇瓶发酵过程曲线；
图18是CG413的摇瓶发酵过程曲线；
图19是CG421的摇瓶发酵过程曲线；
图20是CG430的摇瓶发酵过程曲线；
图21是CG430的发酵罐发酵过程曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、构建谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型
本实施例利用生物信息学网站(见表1)为工具对谷氨酸棒状杆菌的代谢网络进行初步分析，获取谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型中所需的反应数据、代谢物数据和注释的基因数据，再以基因-酶-反应关系为接口对转录调控网络和代谢网络进行集成，构建谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型。现有网络中的信息是以Excel的形式保存的，在进行数学模型的转换时，需要使用model＝xls2model()命令读取Excel中的信息，则MATLAB命令窗口就会显示出模型信息。
表1基因组规模代谢网络模型构建所需数据库
在最初得到的代谢网络模型中，会出现模拟出的生长速率为0的情况，采取的修正方法为：(一)查看此时的各个反应通量，从主要碳源开始，观察网络中碳的代谢流动途径，找到网络中的断点，分析产生断点的原因并修正；(二)查看各个生物组分前体物质能否合成。生长速率为0显示至少有一个生物前体物质不能够合成，实验中循环对每一个生物前体物质添加Demand反应并以每一个Demand反应为目标函数进行最优化计算，计算结果为0显示此前体物质不能合成，然后查看合成此前体物质的代谢通量流在哪里出现断点，或是否是培养基成分缺失导致等，进行修正(本实施例使用的主要模拟与分析工具参见DanielHyduke,Jan Schellenberger,Richard Que,Ronan Fleming,Ines Thiele,Jeffery Orth,Adam Feist,Daniel Zielinski,Aarash Bordbar,Nathan Lewi s,Sorena Rahmanian,Joseph Kang&Bernhard Palsson：COBRA Toolbox 2.0.Protocol Exchange(2011).doi:10.1038/protex.2011.234)。
本实施例经过一系列的连续分析，建立了具有1487个反应、1194个代谢物和772个基因的网络，其核心代谢途径如图1所示。
本实施例为获得谷氨酸棒杆菌一个完整的代谢网络模型，在模型建立过程中进行了如下操作：
(1)一些特定的蛋白(如乙酰载体蛋白)和tRNAs都被加入代谢网络模型。
(2)划分区室：在重构过程中划分出三个分开的区室：胞内、周质空间和胞外。在网络里的每个代谢物都被区分成在胞内、周质空间或胞外，每一个进入网络的物质都是从胞外经过周质空间到胞内的过程。
(3)增加代谢通路细节：在构建中最大化反应通路的细节，如增加了细胞壁的合成及脂肪酸的合成(见表2)，最大化反应通路的细节有利于发现代谢调节的制约点，为后续代谢工程改造预测提供坚实的理论基础。
表2增加的细胞膜的合成反应(部分)
(4)加入反应热力学：酶催化的反应需遵循反应热力学定率，对于新加入的不确定反应，必须确定其反应方向，我们有四个途径查询其反应热力学参数：大肠杆菌的网络、BRENDA网站、SEED网站和eQuilibrator网站。因大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的细胞内pH值都是7.0，而酶的反应热力学常数ΔrG’和pH值相关，所以直接利用大肠杆菌的ΔrG’，对于谷氨酸棒杆菌特有的反应(乳酸生成反应，见表3)则通过查询BRENDA网站和SEED网站确定。
表3新加入的反应(部分)
(5)增加氨基酸的反馈抑制模块：谷氨酸棒杆菌作为一个重要的氨基酸生产菌，其氨基酸的反馈抑制被研究的非常透彻。为更接近于谷氨酸棒杆菌野生型的实际生长情况，我们把一些受到反馈抑制净积累量为0的氨基酸的通量上限设为0，如L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸(见表4)。
表4氨基酸的外排反应(部分)
实施例2、谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型的验证
在模拟计算时，目前基于约束的优化算法是分析代谢网络最常用的分析方法。这些基于约束的算法一般由约束条件、决策变量和目标函数组成。例如Flux BalanceAnalysis(FBA，通量平衡分析)，假设生物体处于拟稳态状态下，即各中间代谢物的浓度保持不变。FBA的计算原理可用下面式子表示：
Maximize:CT·V
Subject to:S·V＝0
Vmin≤V≤Vmax
其中CT为目标函数值，表示为各反应通量的函数，S为m×n阶化学计量学矩阵，V表示反应通量向量，Vmax表示各个反应的通量上限，Vmin表示各反应的通量下限。
1.碳源生长表型分析
选取三种典型的碳源(如葡萄糖、果糖和蔗糖)，利用实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型定量预测谷氨酸棒杆菌的生长表型，结果如图2所示。以文献里的真实实验数据为x轴，利用本发明的代谢网络模型计算出的数据为y轴作图，其中点越接近于对角线y＝x，就证明越接近于实验值。以这些点对y＝x做线性回归，根据相关系数越接近于1数据越接近于y＝x可得，实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型在不同碳源的生长情况均与实验数据十分接近(见图2)。
2.生成代谢物分析
利用实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型定性分析谷氨酸棒杆菌可以生成并向胞外转运20种氨基酸以及琥珀酸、醋酸、丙酮酸、柠檬酸、乳酸、乙醇、α-酮戊二酸等有机酸。从生成代谢物的角度来看，利用实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型预测的代谢物生成情况与现有文献报道的实验结果相符。
3.胞内代谢通路分析
为进一步验证实施例1构建的基因组规模代谢网络模型，将FBA的结果与文献报道的13C代谢流分析的结果相比较，结果如图3所示。图3中实线框里的三组数据分别来自不同文献的野生型菌株13C代谢流分析数据，虚线框里的数据是实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型的预测数据。从图中可以看出实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型的数据接近于文献的实验值。
以上预测和分析验证表明，该模型已经能够比较准确的反映谷氨酸棒杆菌的实际生长和代谢表型，可以进一步进行较为复杂的计算。
实施例3、利用谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型预测L-脯氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-缬氨酸合成的改造靶点
一、利用谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型预测L-脯氨酸合成的改造靶点
1.利用OptForce对L-脯氨酸进行预测
采用OptForce算法结合实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型预测(Ranganathan S,Suthers PF,Maranas CD.OptForce:an optimization procedure foridentifying all genetic manipulations leading to targetedoverproductions.Comput Biol,2010,6(4):e1000744)能够促进L-脯氨酸积累的代谢工程改造靶点，预测结果中需要调节的代谢流量如图4所示。为实现代谢流调节，在相应代谢途径中选择两个基因靶点进行操作：a.敲除putA；b.提高acn的表达。
2.对putA(P5CD，网络中注释反应)的单点分析
在大肠杆菌中，脯氨酸脱氢酶(putA编码)催化L-脯氨酸的分解反应，可以将L-脯氨酸分解为大肠杆菌可利用的碳源或氮源，经同源序列比对，发现谷氨酸棒杆菌中存在PutA的同源蛋白(氨基酸序列同源性约为19.02％)。有文献报道谷氨酸棒杆菌可以利用L-脯氨酸作为碳源或者氮源，根据KEGG注释先假定其具有和大肠杆菌的PutA具有一样的功能，随即对其进行单点分析。分别以生物量(图5)、L-脯氨酸(图6)以及生物量和L-脯氨酸(图7)为目标函数，观察L-脯氨酸的外排通量和P5CD通量(1pyr5c[c]+2h2o[c]+nad[c]->glu-L[c]+h[c]+nadh[c])之间的鲁棒性关系。图5显示正常情况下L-脯氨酸的外排通量为0，图6显示若要最大化L-脯氨酸的外排通量必须使得P5CD的通量为0，L-脯氨酸的外排通量与P5CD的通量调节的理想模式图如图7所示。由此判断，敲除putA可以提高L-脯氨酸的产量。
3.对acn(ACONTa/ACONTb，网络中注释反应)的单点分析
顺乌头酸酶(acn编码)是TCA循环上的第二步反应催化酶，OptForce的结果显示增加的Acn通量可以增大L-脯氨酸的外排通量，随即对其进行单点分析，如图8所示。分别以生物量(图8)、L-脯氨酸(图9)以及生物量和L-脯氨酸(图10)为目标函数，观察L-脯氨酸的外排通量和ACONTa(b)通量(ACONTa：cit[c]<＝>acon-C[c]+h2o[c]，ACONTb：acon-C[c]+h2o[c]<＝>icit[c])之间的鲁棒性关系。图8显示正常情况下L-脯氨酸的外排通量为0，此时ACONTa(b)的通量在1左右，图9显示若要最大化L-脯氨酸的外排通量必须使得ACONTa(b)的通量增大到3左右，L-脯氨酸的外排通量与ACONTa(b)通量调节的理想模式图如图10所示。由此判断，若要增大L-脯氨酸的产量，可以适度提高acn基因的表达。
二、利用谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型预测L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-缬氨酸合成的改造靶点
采用OptForce算法结合实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型预测(Ranganathan S,Suthers PF,Maranas CD.OptForce:an optimization procedure foridentifying all genetic manipulations leading to targetedoverproductions.Comput Biol,2010,6(4):e1000744)能够促进L-谷氨酸积累的代谢工程改造靶点，预测结果中与已有文献报道一致的代谢靶点为：需要上调的靶点—异柠檬酸脱氢酶(icd)、谷氨酸脱氢酶(gdh)；需要下调的靶点—2-酮戊二酸脱氢酶(kgd)。
采用OptForce算法结合实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型预测(Ranganathan S,Suthers PF,Maranas CD.OptForce:an optimization procedure foridentifying all genetic manipulations leading to targetedoverproductions.Comput Biol,2010,6(4):e1000744)能够促进L-赖氨酸积累的代谢工程改造靶点，预测结果中与已有文献报道一致的代谢靶点为：需要上调的靶点—天冬氨酸激酶(lysC)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)、二氢甲基吡啶酸还原酶(dapB)、二氢甲基吡啶酸合成酶(dapA)和二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)；需要下调的靶点—高丝氨酸脱氢酶(hom)、异柠檬酸脱氢酶(icd)和顺乌头酸酶(acn)。
采用OptForce算法结合实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型预测(Ranganathan S,Suthers PF,Maranas CD.OptForce:an optimization procedure foridentifying all genetic manipulations leading to targetedoverproductions.Comput Biol,2010,6(4):e1000744)能够促进L-缬氨酸积累的代谢工程改造靶点，预测结果中与已有文献报道一致的代谢靶点为：需要上调的靶点—乙酰乳酸合酶(ilvBN)、酮醇酸还原异构酶(ilvC)、二羟酸脱水酶(ilvD)，需要下调的靶点—苏氨酸脱氨酶(ilvA)和丙酮酸脱氢酶(aceE)，需要敲除的靶点—3-甲基-2-氧丁酸羟甲基转移酶(panB)和泛酸-丙氨酸连接酶(panC)。
从代谢工程的角度来看，利用实施例1构建的基因组规模的代谢网络模型预测的改造靶点与现有文献报道的实验结果相符。
实施例4、谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型指导的L-脯氨酸的代谢工程改造
一、L-脯氨酸底盘菌的构建
根据L-脯氨酸的代谢调节网络，L-脯氨酸合成路径上的第一个酶5-磷酸谷氨酸激酶(proB编码)受终产物L-脯氨酸的反馈抑制调节，本实施例按照专利(CN101084312A)所述方法点突变ProB的第149位的甘氨酸为天冬氨酸，以野生型菌株ATCC13032为出发菌株，构建了可积累L-脯氨酸的底盘菌CG415。菌株的具体构建步骤如下：
1.染色体上proB基因的定点突变获得L-脯氨酸底盘工程菌CG415
染色体proB基因定点突变采用两步替换的方法，首先敲除proB基因，再在染色体上插入定点突变的proB基因。
1)敲除proB基因：先根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的proB基因及其上下游序列分别设计引物。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P1和P2为引物PCR扩增proB基因上游同源臂；以P3和P4为引物扩增proB基因下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P1和P4为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到918bp的含欲敲除基因proB的上下游同源臂的片段(SEQ ID NO：1)。其中，SEQ ID NO：1自5’末端第1-509位核苷酸为欲敲除基因proB的上游同源臂，SEQ ID NO：1自5’末端第510-918位核苷酸为欲敲除基因proB的下游同源臂。
纯化回收的PCR产物经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P5和P6为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1130bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行EcoR I和HindⅢ双酶切鉴定，得到918bp的为阳性。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-ΔproB构建成功，为将含欲敲除基因proB的上下游同源臂的片段(SEQ IDNO：1)插入载体pK18mobsacB的EcoR I和HindⅢ酶切位点间得到的载体。
上述所用的引物序列如下(5’→3’)：
P1：CCGGAATTCCAAGTTGGGCATTGAGGACG(EcoR I)(SEQ ID NO：6)
P2：CAGCAGGCCCGCGCTTCCGGATTCATGTCCGTAT(SEQ ID NO：7)
P3：GGACATGAATCCGGAAGCGCGGGCCTGCTGGTGGCGG(SEQ ID NO：8)
P4：CCCAAGCTTGGCCGCACGCTCCACG(HindⅢ)(SEQ ID NO：9)
P5：ATGTGCTGCAAGGCGATTAA(SEQ ID NO：10)
P6：TATGCTTCCGGCTCGTATGT(SEQ ID NO：11)
P7：ATCACCGCACTAAGGGGCAGTTCCA(SEQ ID NO：12)
P8：GGACGACCAGAGTTATTAACCGCAA(SEQ ID NO：13)
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-ΔproB电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以P7和P8为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，得到1200bp的为阳性，命名为CG405(WT-ΔproB)。
CG405(WT-ΔproB)经进一步序列测定分析，结果为ATCC13032染色体proB基因敲除成功，CG405构建成功。
2)插入定点突变的proB基因：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P1和P9为引物PCR扩增含G446A(第149位甘氨酸变为天冬氨酸)突变位点的proB基因上游片段，以P10和P4为引物扩增含G446A(第149位甘氨酸变为天冬氨酸)突变位点的proB基因下游片段。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P1和P4为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到2028bp的含有proB基因突变片段上下游同源臂的长片段(SEQ ID NO：2)。其中，SEQID NO：2自5’末端第1-509位核苷酸为proB基因上游片段，SEQ ID NO：2自5’末端第510-1609位核苷酸为点突变的proB基因，SEQ ID NO：2自5’末端第1610-2028位核苷酸为点突变的proB基因下游片段。
上述所用的引物序列如下(5’→3’)：
P9：GTCACCAAAATTCACATCGGTGGTTGCCACGGT(SEQ ID NO：14)
P10：ACCGTGGCAACCACCGATGTGAATTTTGGTGAC(SEQ ID NO：15)
纯化回收的PCR产物经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P5和P6为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2240bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行EcoR I和HindⅢ双酶切鉴定，得到2028bp的为阳性。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-proBG446A构建成功。
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-proBG446A电转化至谷氨酸棒杆菌CG405中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌。
以P7和P8为引物，对阳性菌进行PCR扩增鉴定，得到2310bp的为重组菌WT-proBG446A，命名为谷氨酸棒杆菌CG415(WT-proBG446A)。
经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为成功对谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体proB基因进行G446A点突变，谷氨酸棒杆菌CG415(WT-proBG446A)构建成功。proB基因的G446A点突变为将proB基因编码蛋白的第149位甘氨酸变为天冬氨酸。
2.含有质粒的产L-脯氨酸的重组菌CG409的构建
以菌株CG415的基因组DNA为模板，分别以P11和P12为引物PCR扩增proBG446A，得到1142bp的PCR产物为proBG446A片段(SEQID NO：3)。
将上述PCR产物经Xba I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pXMJ19(购自于Biovector Science Lab,Inc,货号SMD1168H)连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含氯霉素(20μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1338bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Xba I和HindⅢ双酶切鉴定，得到1142bp的为阳性，命名为重组质粒pWYE1403(pXMJ19-proBG446A)(图11所示)。
pWYE1403经进一步序列测定分析，该质粒为将proBG446A片段(SEQID NO：3)插入质粒pXMJ19的Xba I和HindⅢ酶切位点间得到的载体。
将质粒pWYE1403转化至上述构建的底盘工程菌CG415中，以P13和P14为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1338bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，L-脯氨酸工程菌CG409(WT-proBG446A/pXMJ19-proBG446A)构建成功。
上述所用的引物序列如下(5’→3’)：
P11：CCCAAGCTTAAAGGAGGACCGGAATGCGTGAG(HindⅢ)(SEQ ID NO：16)
P12：GATTCTAGATTACGCGCGGCTGGCGTAGT(Xba I)(SEQ ID NO：17)
P13：CAATTAATCATCGGCTCGTA(SEQ ID NO：18)
P14：ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(SEQ ID NO：19)
二、敲除putA基因
谷氨酸棒杆菌中PutA的功能还没有被验证，所以我们在野生型菌株ATCC13032中敲除putA基因，构建菌株ATCC13032ΔputA，通过以L-脯氨酸为唯一氮源的生长实验初步鉴定putA基因的功能。
ATCC13032ΔputA的构建过程如下：先根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的putA基因及其上下游序列分别设计引物。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P15和P16为引物PCR扩增putA基因上游同源臂；以P17和P18为引物扩增putA基因下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P15和P18为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到1019bp的含欲敲除基因putA的上下游同源臂的片段(SEQ ID NO：4)。其中，SEQ ID NO：4自5’末端第1-509位核苷酸为欲敲除基因putA的上游同源臂，SEQ ID NO：4自5’末端第510-1019位核苷酸为欲敲除基因putA的下游同源臂。
纯化回收的PCR产物经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P5和P6为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1231bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Sal I和HindⅢ双酶切鉴定，得到1019bp的为阳性。经进一步序列测定验证，重组质粒pK18mobsacB-ΔputA构建成功，为将含欲敲除基因putA的上下游同源臂的片段(SEQ IDNO：4)插入载体pK18mobsacB的Sal I和HindⅢ酶切位点间得到的载体。
上述所用的引物序列如下(5’→3’)：
P15：CCCAAGCTTGGTCAATGTCGGTGATGATCCT(HindⅢ)(SEQ ID NO：20)
P16：CCATGCGCAAAACGAGGTGGTTCTCCTTCAAGATCAG(SEQ ID NO：21)
P17：TGAAGGAGAACCACCTCGTTTTGCGCATG(SEQ ID NO：22)
P18：ACGCGTCGACACGGTCACGCCGTGCTCCA(Sal I)(SEQ ID NO：23)
P19：CTAGGCCAATGGCTTGAGCTGCGGT(SEQ ID NO：24)
P20：GCTCCCGCTCCGACTCGCCACCCTC(SEQ ID NO：25)
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-ΔputA电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落。以P19和P20为引物，对菌落进行基因组DNA提取及PCR扩增鉴定，得到1365bp的为阳性，命名为ATCC13032ΔputA(WT-ΔputA)。
ATCC13032ΔputA(WT-ΔputA)经进一步序列测定分析，结果为染色体putA基因敲除成功，ATCC13032ΔputA(WT-ΔputA)构建成功。
以野生型菌株ATCC13032为对照菌株，进行菌株ATCC13032ΔputA以L-脯氨酸为唯一氮源的生长实验。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。
基本发酵培养基(氮源为L-脯氨酸)：葡萄糖40，L-脯氨酸20g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.001g/L，CuSO40.0002g/L，NiCl2·6H2O 0.00002g/L，生物素0.0002g/L，pH7.0-7.2，2％CaCO3，121℃高压灭菌20min。葡萄糖分开灭菌，115℃高压灭菌15min。MgSO4·7H2O，以及无机盐离子分开灭菌，121℃高压灭菌20min。维生素和L-脯氨酸采用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
生长实验具体步骤：
1)采用种子培养基培养谷氨酸棒杆菌至对数生长期，4℃，4000×g离心5min，收集菌体，弃去上清。采用基本发酵培养基洗涤菌体2次，重悬菌体，校正各菌株菌悬液的OD600至一致。
2)将各菌株的上述菌悬液等量接种于30mL以L-脯氨酸为唯一氮源的基本发酵培养基中，30℃，220r/min振荡培养36h，间隔一定时间取样，测定OD600。
各菌株生长曲线及比生长速率如图12，13所示，敲除putA的菌株比生长速率下降了19.023％，由此可初步证明PutA具有脯氨酸脱氢酶的活性。
在底盘菌CG415中敲除putA基因得到菌株CG413(WT-proBG446AΔputA)，其构建方法与与菌株ATCC13032ΔputA相同。
采用本实施例内容一所述的方法将质粒pWYE1403转化至工程菌CG413中得到的重组菌工程菌CG417(WT-proBG446AΔputA/pXMJ19-proBG446A)。
三、增强acn基因的表达
为进一步提高L-脯氨酸的积累，增强acn基因的表达，在CG413的基础上将acn的启动子Pacn替换为转录延伸因子的启动子Peftu，将acn基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列(AAAGGAGGA)，替换acn的初始密码子TTG为ATG，构建菌株CG421。具体步骤如下：
根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的Pacn上下游序列、acn起始区和Peftu启动子序列分别设计引物。
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P21和P22为引物扩增acn启动子上游同源臂；以P23和P24为引物扩增Peftu启动子和acn起始区；以P25和P26为引物扩增acn起始区下游同源臂。再以纯化的上述PCR产物为模板，以P21和P26为引物，采用重叠延伸PCR技术(SOE)扩增，得到1263bp的PCR产物，为含acn启动子上游同源臂、Peftu启动子、acn起始区和acn起始区下游同源臂片段(SEQ IDNO：5)。
其中，序列9自5’末端第1-400位核苷酸为被替换启动子Pacn的上游同源臂，序列9自5’末端第401-615位核苷酸为启动子Peftu和acn起始区，序列9自5’末端第617-1263位核苷酸为acn起始区下游同源臂。
将上述1263bp的PCR产物经Hind III和EcoR I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P5和P6为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1475bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并对质粒进行Hind III和EcoR I双酶切鉴定，得到1263bp的为阳性。
将阳性质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸插入载体pK18mobsacB中得到的重组质粒，命名为pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A。
上述所用的引物序列如下(5’→3’)：
P21：CCGGAATTCAAAATCTGATTCCTTTGCA(EcoRI)(SEQ ID NO：26)
P22：TTCGCAGGGTAACGGCCACTTCATTATCCTAACAGTACAA(SEQ ID NO：27)
P23：GTACTGTTAGGATAATGAAGTGGCCGTTACCCTGCGA(SEQ ID NO：28)
P24：AGTCACAGTGAGCTCCATTTCTATCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTG(SEQ ID NO：29)
P25：ATACAAAAGGAGGATAGAAATGGAGCTCACTGTGACTGAA(SEQ ID NO：30)
P26：CCCAAGCTTTGGTGGTGTGGGAGTCG(HindⅢ)(SEQ ID NO：31)
P27：TAATCAGTGGTCCCAAGCAAATCAT(SEQ ID NO：32)
P28：CGTCGATTGGGAACATCGCACAGGT(SEQ ID NO：33)
将序列测定正确的同源重组质粒pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A电转化至L-脯氨酸重组菌CG413中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P27和P28为引物进行PCR扩增鉴定，得到1052bp的为重组菌WT-proBG446A-RBS-acnT1A-Peftu::Pacn-ΔputA，命名为CG421。
经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将acn基因的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子Peftu，将acn基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列(AAAGGAGGA)，将acn基因的起始密码子TTG替换为高表达强度的ATG，谷氨酸棒杆菌CG421(WT-proBG446A-Peftu::Pacn-RBS-acnT1AΔputA)构建成功。
检验CG421中acn转录水平，如图14所示，结果显示acn转录水平提高了3.5倍。
采用本实施例内容一所述的方法将质粒pWYE1403转化至工程菌CG421中得到的重组菌CG430(WT-proBG446A-Peftu::Pacn-RBS-acnT1AΔputA/pXMJ19-proBG446A)。
四、L-脯氨酸工程菌在生成L-脯氨酸中的应用
1.不含质粒的L-脯氨酸工程菌的摇瓶发酵
以上实施例中工程菌发酵涉及的培养基及步骤如下：
摇瓶发酵采用的发酵培养基：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO420g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.001g/L，CuSO40.0002g/L，NiCl2·6H2O 0.00002g/L，生物素0.0002g/L，pH7.0-7.2，2％CaCO3，121℃高压灭菌20min。葡萄糖分开灭菌，115℃高压灭菌15min。MgSO4·7H2O，以及无机盐离子分开灭菌，121℃高压灭菌20min。维生素采用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。
种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。
摇瓶发酵具体步骤：
1)、种子液的获得
将上述工程菌CG415，CG413和CG421分别接种到种子培养基中，种子液培养条件为培养温度30℃，摇床转速为220r/min，培养时间12h，得到种子液，OD600可为20。
2)、发酵
将种子液按照体积百分含量为3％接种到发酵培养基(500mL挡板三角瓶装液量为30mL)中，30℃，220r/min，培养60h。间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2之间，根据残糖情况，补加浓度为400g/L的葡萄糖母液，控制发酵液残糖在5-10g/L。
收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。
3)、检测L-脯氨酸含量
采用高效液相法，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法)：取50μL上述上清液于2mL离心管中，加入200μLNaHCO3水溶液(0.5mol/L，pH 9.0)和100μL1％的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液(体积比)，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至25℃，加入650μLKH2PO4水溶液(0.01mol/L，pH 7.2±0.05，用NaOH水溶液调整pH，放置15min过滤后可进样，进样量为5μL。
所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH2PO4水溶液(pH 7.2±0.05，用40g/LKOH水溶液调整pH)，流动相B为55％乙腈水溶液(体积比)，流动相流速为1mL/min，洗脱过程如下表5所示，液相图谱见图15：
表5洗脱过程
以野生型菌株C.glutamicum ATCC13032为对照。
结果如表6所示。
表6为摇瓶发酵实验中L-脯氨酸工程菌CG415，CG413和CG421最大OD600，比生长速率和L-脯氨酸产量
表6工程菌摇瓶发酵的生长情况和L-脯氨酸产量
摇瓶发酵实验中，发酵60h，野生型菌株C.glutamicum ATCC13032未检测到L-脯氨酸的积累，其发酵过程如图16所示。底盘菌CG415的L-脯氨酸产量在24小时达到1.376g/L，随后下降，其发酵过程如图17所示。仅进行L-脯氨酸分解代谢途径改造的工程菌CG413的L-脯氨酸产量为1.752g/L，其发酵过程如图18所示。在此基础上，增加acn基因表达的工程菌CG421的L-脯氨酸产量为2.471g/L，其发酵过程如图19所示，与改造前菌株CG413相比提高了41.038％。
2.含有质粒的高产L–脯氨酸工程菌摇瓶发酵
1)、种子液的获得
将上述含有质粒的工程菌CG409，CG417和CG430分别按照本实施例步骤1中的1)的方法接种，但培养基需添加终浓度为10μg/ml氯霉素，培养条件一样。
2)、发酵
将种子液按照按照本实施例步骤1中2)的方法进行发酵。但发酵培养基需添加终浓度为10μg/ml氯霉素，并于发酵培养6h时加入终浓度为1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行目的基因的诱导表达。
3)、检测L-脯氨酸含量
按照本实施例步骤1中的3)的方法检测上清液中的L-脯氨酸含量。
以野生型菌株C.glutamicum ATCC13032为对照。
结果如表7所示。
表7为摇瓶发酵实验中L-脯氨酸工程菌CG409，CG417和CG430最大OD600，比生长速率和L-脯氨酸产量
表7工程菌摇瓶发酵的生长情况和L-脯氨酸产量
摇瓶发酵实验中，CG409的L-脯氨酸产量在24h达到11.256g/L。仅进行L-脯氨酸分解代谢途径改造的含有质粒的工程菌CG417的L-脯氨酸产量为15.488g/L。在此基础上，增加acn基因表达的含有质粒的工程菌CG430的L-脯氨酸产量为18.710g/L，与改造前菌株CG413相比提高了20.803％。其发酵过程如图20所示。
3.L-脯氨酸工程菌CG430发酵罐发酵生产L-脯氨酸
种子培养基具体如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。
发酵采用的发酵培养基具体如下：葡萄糖20g/L，硫酸铵20g/L，KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.001g/L，CuSO40.0002g/L，NiCl2·6H2O 0.00002g/L，生物素0.0002g/L，pH7.0-7.2。
1)、种子液的获得
将工程菌CG430接种到种子培养基中，种子液培养条件为培养温度30℃，摇床转速为220r/min，培养时间12h，得到种子液，OD600可为20。
2)、发酵
将种子液按照体积百分含量为10％接种到含有终浓度10μg/ml氯霉素的发酵培养基中。
采用的发酵罐为7.5L发酵罐(BioFlo115，NBS)：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料。发酵过程中通过蠕动泵补加800g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡糖糖的浓度为0-5g/L。通过加热套和冷却水控制发酵温度维持在32℃；通入空气提供溶氧，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。发酵连续进行60h。当OD600＝4-5时，加入IPTG(终浓度为0.4mmol/L)诱导重组质粒携带的基因表达。
收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。
3)、检测L-脯氨酸含量
按照本实施例步骤1中3)的方法检测上清液中的L-脯氨酸含量，结果如图21所示，可以看出，发酵60h，工程菌的L-脯氨酸的最高产量为66.427g/L，生产强度为1.107g/L/h。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法在提高L-脯氨酸产量上的应用，其特征在于，
所述方法包括如下步骤：
1)获取谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型中所需的反应数据、代谢物数据和注释的基因数据，构建谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型，验证所述谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型的准确性；
2)根据步骤1)中验证后的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型预测提高氨基酸产量需要对应调节的代谢通量及代谢通量的调节方式；
3)根据所述需要调节的代谢通量及代谢通量的调节方式结合注释的基因数据确定靶基因，对靶基因进行遗传改造，构建工程菌；
步骤3)中所述靶基因为putA和acn，所述遗传改造为在谷氨酸棒杆菌基因组中敲除putA基因和增强谷氨酸棒杆菌基因组中acn基因的表达，所述谷氨酸棒杆菌为含有定点突变的proB基因的谷氨酸棒杆菌，所述定点突变为将第149位的甘氨酸突变为天冬氨酸。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)中所需的反应数据包括运输反应、生物量反应、交换反应、糖代谢反应、氨基酸代谢反应、维生素和辅因子代谢反应、复合脂类代谢反应、核苷酸代谢反应、脂类代谢反应、能量代谢反应、其它碳代谢反应。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲除putA基因的步骤包括：
1)以谷氨酸棒杆菌基因组为模板通过引物扩增所述putA基因的上游同源臂和下游同源臂，融合所述putA基因的上游同源臂和所述下游同源臂；
2)步骤1)中融合的所述上游同源臂和所述下游同源臂片段经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的载体pK18mobsacB连接；
3)步骤2)中的连接产物转化大肠杆菌，在含卡那霉素的培养基中筛选阳性转化子并验证，获得重组载体pK18mobsacB-ΔputA；
4)将重组载体pK18mobsacB-ΔputA转化谷氨酸棒杆菌，通过在含卡那霉素的培养基中正向筛选得到重组载体pK18mobsacB-ΔputA整合至染色体上的菌落，通过在含蔗糖的培养基中反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落并验证，获得敲除putA基因的重组菌CG413。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中以P15和P16为引物PCR扩增putA基因启动子上游同源臂，以P17和P18为引物扩增putA基因下游同源臂，引物序列分别如下：
P15：5’-CCCAAGCTTGGTCAATGTCGGTGATGATCCT-3’
P16：5’-CCATGCGCAAAACGAGGTGGTTCTCCTTCAAGATCAG-3’
P17：5’-TGAAGGAGAACCACCTCGTTTTGCGCATG-3’
P18：5’-ACGCGTCGACACGGTCACGCCGTGCTCCA-3’。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述增强acn基因的表达包括替换acn基因的启动子Pacn、将所述acn基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列以及将所述acn基因的起始密码子TTG替换为ATG，具体包括：
1)以谷氨酸棒杆菌基因组DNA为模板通过引物扩增acn基因启动子上游同源臂、Peftu启动子和acn基因起始区、acn基因起始区下游同源臂，融合所述acn基因启动子上游同源臂、Peftu启动子、acn基因起始区和acn基因起始区下游同源臂；
2)步骤1)中融合的所述acn基因启动子上游同源臂、Peftu启动子、acn基因起始区和acn基因起始区下游同源臂片段经Hind III和EcoR I双酶切后，与经同样双酶切处理的同源重组载体pK18mobsacB连接；
3)步骤2)中的连接产物转化大肠杆菌，在含卡那霉素的培养基中筛选阳性转化子并验证，获得重组载体pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A；
4)将重组载体pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A转化敲除putA基因的重组菌CG413，通过在含卡那霉素的培养基中正向筛选得到重组载体pK18mobsacB-Peftu::Pacn-RBS-acnT1A整合至染色体上的菌落，通过在含蔗糖的培养基中反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落并验证，获得acn基因的启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源强启动子Peftu，acn基因的RBS替换为谷氨酸棒杆菌高表达基因的保守RBS序列，同时acn基因的起始密码子TTG替换为高表达强度的ATG的谷氨酸棒杆菌。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤1)中以P21和P22为引物扩增acn启动子上游同源臂；以P23和P24为引物扩增Peftu启动子和acn基因起始区；以P25和P26为引物扩增acn基因起始区下游同源臂，引物序列分别如下：
P21：5’-CCGGAATTCAAAATCTGATTCCTTTGCA-3’
P22：5’-TTCGCAGGGTAACGGCCACTTCATTATCCTAACAGTACAA-3’
P23：5’-GTACTGTTAGGATAATGAAGTGGCCGTTACCCTGCGA-3’
P24：5’-AGTCACAGTGAGCTCCATTTCTATCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTG-3’
P25：5’-ATACAAAAGGAGGATAGAAATGGAGCTCACTGTGACTGAA-3’
P26：5’-CCCAAGCTTTGGTGGTGTGGGAGTCG-3’。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为过表达所述定点突变的proB基因的谷氨酸棒杆菌。
8.如权利要求1至7中任一所述的应用中构建的L-脯氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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