CN100352926C - 编码opcA基因的核苷酸序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的至少一个多核苷酸序列：a)与编码包含SEQ ID NO：3或SEQID NO：5或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及发酵制备L-氨基酸的方法，其包括在特别是已产生L-氨基酸的棒状微生物中，a)除了扩增特别是过表达opcA基因之外，扩增特别是过表达编码tal基因，tkt基因，zwf基因或devB基因的至少一个核苷酸序列，b)在培养基或细菌细胞中浓缩所需L-氨基酸，及c)分离所需的L-氨基酸。

Description

编码opcA基因的核苷酸序列
本发明提供了编码opcA基因的核苷酸序列，和具有扩增的opcA基因的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸的方法。
现有技术
氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L-氨基酸如L-赖氨酸的菌株。一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良。
用于生物合成的戊糖磷酸循环的重要性是已知的。
因此，Oishi和Aida(农业和生物化学29，83-89(1965))已报道了产氨短杆菌的“己糖单磷酸逃避(shunt)”。Sugimoto和Shio(农业和生物化学51，101-108(1987))报道了黄色短杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的调节。Sugimoto和Shio(农业和生物化学5 1，1257-1263(1987))报道了黄色短杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的调节。
JP-A-09224661公开了黄色短杆菌MJ-223(FERM BP-1497)的称为zwf的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的核苷酸序列。JP-A-09224661描述了Zwf多肽的N-末端氨基酸序列为Met Val IlePhe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu。
但是目前还不能证实这一点。
发明目的
本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。
发明描述
氨基酸、尤其是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提到L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅是指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选为能复制的DNA，包含
(i)选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQID NO：9的一或多个核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，
(iv)(i)中中性功能有义突变。
本发明还提供了
权利要求4的多核苷酸，包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，
权利要求6的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的至少一个氨基酸序列的多肽，
含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，
以及作为宿主细胞的含有载体的棒状细菌。
本发明还提供了基本上包含一多核苷酸序列的多核苷酸，其可通过用含有相应于SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9的多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包含具有相应于SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：9的所述多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码OpcA蛋白的全长cDNA，以及分离与opcA基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码OpcA蛋白的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的多肽，特别是具有OpcA基因产物生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的多肽至少80％、特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明还提供了形成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基的新Zwf蛋白，这一翻译产物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：7所示。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的可分离的Zwf亚基的N-末端氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码opcA基因的核苷酸序列任选地与zwf基因一起是扩增的，尤其是过表达的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的增加，例如通过增加一或多个基因的拷贝数，通过用强启动子或编码具有升高的活性的相应酶(蛋白质)的基因或等位基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌尤其是棒杆菌属的代表菌。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
醋谷棒杆菌ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
黄色短杆菌ATCC 14067
乳发酵短杆菌ATCC 13869和
扩展短杆菌ATCC 14020
和从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709
黄色短杆菌FERM-P 1708
乳发酵短杆菌FERM-P 1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464
谷氨酸棒杆菌DSM5715
谷氨酸棒杆菌DM58-1
谷氨酸棒杆菌DSM12866
和从中获得的生产L-苏氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌ATCC21649
黄色短杆菌BB69
黄色短杆菌DSM5399
乳发酵短杆菌FERM-BP 269
乳发酵短杆菌TBB-10
和从中获得的生产L-异亮氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌ATCC 14309
谷氨酸棒杆菌ATCC 14310
谷氨酸棒杆菌ATCC 14311
谷氨酸棒杆菌ATCC 15168
产氨棒杆菌ATCC 6871
和从中获得的生产L-色氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌ATCC21 850和
谷氨酸棒杆菌KY9218(pKW9901)。
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码葡萄糖-6磷酸-脱氢酶(EC 2.7.1.11)的OpcA亚基的新opcA基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的opcA基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252：255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，84：2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohm和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。O′Donohue(来自谷氨酸棒杆菌的4个常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆和分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway，1997)描述了用Short等(核酸研究16：7583)描述的λZap表达系统克隆谷氨酸棒杆菌的基因。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19：259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74：5463-5467，1977)所述。
获得的DNA序列随后可用已知的算法或序列分析程序研究，如Staden的程序(核酸研究14，217-232(1986))，Butler的GCG程序(生物化学分析方法39，74-97(1998))，Pearson和Lipman的FASTA算法(美国科学院院报85，2444-2448(1988))或Altschul的BLAST算法(自然遗传学6，119-129(1994))，并与公共数据库中的存在的序列比较。核苷酸序列的公共数据库是例如欧洲分子生物学实验室(EMBL，德国海德堡)的数据库，或国家生物工程信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的数据库。
本发明提供了编码opcA基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4，是本发明的一部分，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得OpcA基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5表示。从OpcA基因产物的氨基酸序列得到的分子量约为34.7kDa。
SEQ ID NO：1还示出了zwf基因的编码区，得到的Zwf基因产物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。从Zwf基因产物的氨基酸序列得到的分子量约为57.5kDa。
以上述方式产生的基因文库可通过用已知序列如zwf基因(JP-A-09224661)的核苷酸探针杂交而进一步研究。在杂交反应中呈阳性的克隆的克隆的DNA随之测序以一方面给出所用探针的已知核苷酸序列，另一方面给出相邻的新DNA序列。
本发明还提供了编码opcA基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，其是本发明的组成部分，如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示。相应蛋白质的氨基酸序列已用上述方法从本发明的DNA序列衍生得到，OpcA基因产物的氨基酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：10所示。从OpcA基因的氨基酸序列得到的分子量约34.7kDa。
SEQ ID NO：6还示出zwf基因的编码区，得到的Zwf基因产物的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。从Zwf基因产物的氨基酸序列得到的分子量约为57.5kDa。
至少部分确定OpcA蛋白和Zwf蛋白的氨基酸序列的另一种方法包括经层析方法将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶蛋白纯化至均一。蛋白纯化和制备的方法和指导例如在Schleifer和Wensink的教科书：分子生物学实用方法(Springer Verlag，德国柏林，1981)，Harris和Angal的手册：蛋白质纯化方法实用途径(IRL出版社，英国牛津，1989)，Scopes的教科书：蛋白质纯化原理和实践，第3版(SpringerVerlag，美国纽约，1993)及通用教科书和手册中有描述。纯化的多肽的N-末端氨基酸序列可通过如Edman(生物化学档案22，475(1949))的N-末端测序方法确定。蛋白质测序的其他方法和指导例如如Smith：蛋白质测序方案：分子生物学方法，第64卷和112卷(Humana出版社，Totowa，美国新泽西，1996)，以及Kamp等：蛋白质结构分析：制备、鉴定和微测序(Springer Verlag，美国纽约，1997)。
以这种方式可示出葡萄糖-6-脱氢酶由两个亚基组成，其分子为约30kDa和约60kDa。OpcA亚基和OpcA蛋白的N-末端氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，Zwf亚基和Zwf蛋白的N-氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
通过遗传密码的简并性由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQID NO：6或SEQ ID NO：9产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751-757(1987))O’Regan等(基因77：237-251.(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术6：1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的氨基酸序列也是本发明的一部分。
最后，用产生自SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41：255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在opcA基因任选地与zwf基因一起过表达后，棒状细菌以改良方式生产L-氨基酸尤其是L-赖氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-赖氨酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶促活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reinscheid等(应用及环境微生物学60，126-132(1 994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO 96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学综述60：512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的opcA基因可借助于质粒过表达。
合适的质粒是在棒状细菌中复制的质粒。各种已知的质粒载体，如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64：549-554)，pEKExl(Eikmanns等，基因102：93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107：69-74(1991))是基于隐蔽质粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它质粒载体如基于pCG4(US-A 4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66，119-124(1990))或pAG1(US-A 5,158,891)的质粒载体可以同样方式使用。
图2所示大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2用作一个例子。在opcA基因和zwf基因掺入pEC-T18mob2的SphI/SalI裂解位点后，形成图3所示质粒pECzwfopcA。
其他合适的质粒载体是那些可通过整合进染色体而进行基因扩增的质粒载体，例如，由Reinscheid等(应用及环境微生物学60：126-132(1994))所述的用于复制或扩增hom-thrB操纵子的质粒载体。在这一方法中，将完整基因克隆进能在宿主(典型地是大肠杆菌)中复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可考虑的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，USA)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269：32678-84；US-A 5,487,993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，荷兰；Bernard等，分子生物学杂志，234：534-541(1993))，pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173：4510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41：337-342)。含有待扩增基因的质粒载体然后可经接合或转化转移进希望的谷氨酸棒杆菌菌株。接合方法例如如Schafer等(应用及环境微生物学60，756-759(1994))所述。转化方法例如如Thierbach等(应用微生物学及细菌学29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123，343-347(1994))所述。经“交换”事件而同源重组后，得到的菌株含有至少两个拷贝的所需基因。
另外，不仅是opcA基因任选地与zwf基因，而且特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的扩增或过表达，对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产可以是有益的。
因此，为生产L-赖氨酸，例如可同时过表达一或多种选自如下一组的基因：
·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，
·编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等(1990)，分子和普通遗传学224：317-324)
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)，
·编码酮基转移酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，德国海德堡)数据库的登录号AB023377)，
·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-9-224662)，
·编码三糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，或
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，
·zwal基因(DE 19959328.0；DSM13115)，或
·编码烯醇化酶的eno基因(DE 19941478.5)，
·编码转醛酶的tal基因(DSM 13263)。
对于氨基酸特别是L-赖氨酸的生产，除了任选地与zwf基因一起扩增opcA基因外，还有利的是同时弱化
·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 19950409.1，DSM13047)和/或
·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478，DSM12969)，或
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE 19951975.7；DSM 13114)，或
·zwa2基因(DE 19959327.2；DSM 13113)。
除opcA基因的过表达之外，消除非所需的副反应对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法(分批培养)，补料分批方法(补料方法)或重复补料分批方法(重复补料方法)培养以生产氨基酸特别是L-赖氨酸。已知的培养法由Chmiel所著教材(生物方法技术1.生物方法技术导论(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)，或由Storhas所著教材(生物反应器和外围设备(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用进行。
下述微生物已根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032/pECzwfopcA，保藏号DSM 13264。
SEQ ID NO：1还含有新的devB基因。本发明方法用于发酵制备氨基酸尤其是L-赖氨酸。
所附序列：
下述序列以序列表的形式附上：
SEQ ID NO：描述：
1    从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离的DNA序列
2    衍生自SEQ ID NO：1的Zwf蛋白的氨基酸序列
3    衍生自SEQ ID NO：1的OpcA蛋白的氨基酸序列
4    取自SEQ ID NO：1的ATCC13032的opcA基因
     的DNA序列
5    衍生自SEQ ID NO：4的OpcA蛋白的氨基酸序列
6    从谷氨酸棒杆菌ASO19分离的DNA序列
7    衍生自SEQ ID NO：6的Zwf蛋白的氨基酸序列
8    衍生自SEQ ID NO：6的OpcA蛋白的氨基酸序列
9    取自SEQ ID NO：6的ASO19的opcA基因的DNA
     序列
10   衍生自SEQ ID NO：9的OpcA蛋白的氨基酸序列
11   可被分离的来自ATCC13032的葡萄糖-6-磷酸脱
     氢酶的Zwf蛋白的N-末端的氨基酸序列
12   可被分离的来自ATCC13032的葡萄糖-6-磷酸脱
     氢酶的OpcA蛋白的N-末端的氨基酸序列
本发明包括如下附图：
图1：质粒pBOB102图。
图2：质粒pEC-T18mob2图。
图3：质粒pECzwfopcA图。
图中所采用的缩写有如下含义：
图1：
Neo r：新霉素/卡那霉素抗性
ColE1 ori：质粒ColE1的复制起点
CMV：巨细胞病毒启动子
lacP：lac操纵子的启动子
lacZ：β-半乳糖苷酶基因的5′末端(lacZa基因片段)
SV40 3′剪接：猴病毒40的3′剪接位点
SV40 polyA：猴病毒40的聚腺苷酸化位点
f1(-)ori：丝状噬菌体f1的复制起点
SV40 ori：猴病毒40的复制起点
图2和图3
Tet：四环素抗性基因
oriV：大肠杆菌的质粒编码的复制起点
RP4mob：质粒迁移的mob区
rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制起点
per：pGA1的控制拷贝数的基因
lacZ-alpha：β-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)
lacZalpha′：lacZα基因片段的5’末端
′lacZ-alpha：lacZα基因片段的3’末端
zwf：zwf基因
opcA：opcA基因
另外的缩写：
ApaI：限制酶ApaI的酶切位点
BamHI：限制酶BamHI的酶切位点
ClaI：限制酶ClaI的酶切位点
EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点
HindIII：限制酶HindIII的酶切位点
MstI：限制酶MstI的酶切位点
NheI：限制酶NheI的酶切位点
NsiI：限制酶NsiI的酶切位点
SalI：限制酶SalI的酶切位点
SacI：限制酶SacI的酶切位点
SpeI：限制酶SpeI的酶切位点
SphI：限制酶SphI的酶切位点
SspI：限制酶SspI的酶切位点
XbaI：限制酶XbaI的酶切位点
实施例
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。所用分子生物学技术例如质粒DNA分离、限制酶处理、连接、大肠杆菌的标准转化等(除非另有说明)如Sambrook等(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室，美国)所述。
实施例1构建谷氨酸棒杆菌AS019的基因文库
如O′Donohue(O′Donohue，M.(1997)，来自谷氨酸棒杆菌的4个常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆和分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway)所述，用λZap ExpressTM系统(Short等，(1988)核酸研究16：7583-7600)构建谷氨酸棒杆菌菌株ASO19的DNA文库。λZap ExpressTM系统购自Stratagene(Stratagene，11011 NorthTorrey Pines Rd.，La Jolla，加利福尼亚92037)并根据厂商指导使用。AS019-DNA用限制性内切酶Sau3A酶切并与BamHI处理的并去磷酸化的λZap ExpressTM臂连接。
实施例2 opcA和zwf基因的克隆和测序
1、zwf探针的构建
用zwf基因内部的放射性标记的寡核苷酸探测上述AS019λZapExpressTM文库。寡核苷酸用zwf基因内部的简并PCR引物产生。设计用于PCR扩增zwfDNA片段的简并核苷酸引物如下：
zwf1：5′ATYGAYCACTAY YTS GGY AAR GA 3′
zwf2：5′RAA WGG MAC RCC YKS CCA 3′
其中R＝A+G；Y＝C+T；W＝A+T；M＝A+C；S＝G+C；K＝T+G。
得到的PCR产物的估计大小约为480bp。
最佳PCR条件如下：
35个循环
94℃1分钟
60℃1分钟
72℃30秒
2.5-3.5mM MgCl2
100-150ng AS019基因组DNA
得到的PCR产物的序列分析证实产物是zwf基因的内部部分。序列分析用通用正向和反向引物和购自Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，UK)的T7测序试剂盒进行。
2、克隆
根据λZap ExpressTM系统方案(Stratagene，11011 North TorreyPines Rd.，La Jolla，加利福尼亚92037)筛选AS019λZap ExpressTM文库，然后对分离的克隆进行Southern印迹分析。DNA的Southern转移如Schleicher和Schuell方案手册所述用NytranTM作为膜(″Nytran，修饰的Nylon-66滤膜″(1987年3月)，Schleicher和Schuell，Dassel，德国)进行。用上述相同引物和最佳PCR条件产生的双链DNA片段用购自Amersham生命科学(Amersham Pharmacia生物技术英国有限公司，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)的MultiprimeTMDNA标记试剂盒根据厂商指导用α-32p-dCTP进行放射标记。预杂交、杂交和洗涤条件如Schleicher和Schuell方案手册所述。放射自显影根据Sambrook等的手册所述程序用AgFa Curix RPIL胶片进行。由此鉴定了几个zwf克隆，从一个称为pBOB102(图1)的克隆分离质粒DNA，并选择用于进一步分析。
3、测序
用Sanger等(美国科学院院报74，5463-5467(1977))的Sanger双脱氧链终止方法测序pBOB102的克隆的插入片段的序列。用购自Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，UK)的T7测序试剂盒和α-35S-dCTP应用该方法。根据Pharmacia克隆和测序指导手册(“T7测序TM试剂盒”，编号XY-010-00-19，Pharmacia Biotech，1994)，在50mA恒定电流下将样品在6％聚丙烯酰胺/尿素凝胶上于TBE缓冲液中电泳3-8小时。用得自Pharmacia Biotech的通用正向和M13反向引物进行初始序列分析：
通用正向引物：5′GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3′
M13反向引物：5′GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3′
随后从获得的序列设计内部引物，使得完整opcA基因被推导出。内部引物的序列如下：
内部引物1：5′TCA ACC CTG AGT CCA CC 3′
内部引物2：5′CTG ACC ACG AGC GGA GG 3′
内部引物3：5′ATG GTG ATC TGG ACG TG 3′
内部引物4：5′CTG GCG ACT TGG CTC GA 3′
内部引物5：5′CTT CCG GAT ACC ACC ACC 3′
获得的序列然后用DNA Strider程序(Marck(1988)，核酸研究16：1829-1836)版本1.0在苹果Macintosh计算机上分析。这一分析使得能分析如限制位点利用、开放读框分析和密码子利用的确定。获得的DNA序列和EMBL和Genbank数据库之间的检索用BLAST程序(Altschul等(1997)，核酸研究25：3389-3402)进行。用ClustalV和Clustal W程序(Higgins和Sharp，1988基因73：237-244)对比DNA和蛋白质序列。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。对该核苷酸序列的分析显示一957碱基对的开放读框，其被称为opcA基因。opcA基因编码319个氨基酸的蛋白，如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示。zwf基因的编码区也在SEQ ID NO：6中示出，Zwf蛋白的氨基酸序列由514个氨基酸组成，如SEQ ID NO：7所示。
实施例3从谷氨酸棒杆菌ATCC 13032制备基因组粘粒基因文库
来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离，并用限制酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。DNA片段用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)去磷酸化。得自Stratagene(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)，美国科学院院报84：2160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编码27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例4 ATCC 13032的opcA和zwf基因的分离和测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BanHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123：343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF”丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶(29∶1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)进行计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对该核苷酸序列的分析显示一957碱基对的编码区，其被称为opcA基因。包括其终止密码子的opcA基因如SEQ ID NO：4所示，opcA基因编码319个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示。
实施例5  谷氨酸棒杆菌ATCC13032的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的纯化和N-末端测序
1.菌株ATCC 13032的培养
为纯化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在Labfors发酵系统(Infors AG，Bottmingen，瑞士)中在30℃将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032在基本培养基中有氧培养。在30℃培养预培养物(Bacto脑心浸液培养基，Difco实验室，底特律，美国)15小时并用于接种2.5升基本培养基。该培养基含有如下组分(每升含量)：20g(NH4)2SO4，1g KH2PO4，1gK2HPO4，0.25g MgSO4·7H2O，10mg CaCl2，0.2mg生物素，30mg原儿茶酸，1mg FeSO4·7H2O，1mg MnSO4·H2O，0.1mg ZnSO4·7H2O，0.02mg CuSO4，0.002mg NiCl2·6H2O，1.2g HCl，0.2g聚乙二醇，75mgtritriplex II和100g葡萄糖。发酵过程中连续加入氢氧化钠以保持pH值为7.0。在指数生长期晚期收获细胞，用Beckman(Fullerton，USA)的Avanti J-25离心机和JA10转子在4℃、6400g离心15分钟，并在含10mM MgCl2的100mM TRIS-HCl pH7.5中洗涤后，沉淀在-20℃储存备用。
2.酶纯化
在破碎系统(破碎器S，BIOmatic，Rodgau-Hainhausen，德国)中进行细胞破坏。细胞先在由100mM TRIS-HCl，10mM MgCl2，0.75mM DTT和几种蛋白酶抑制剂的混合物(completeTM，Roche，德国曼海姆)组成的pH7.5缓冲液中重悬。细胞湿重与总悬浮液重量之比调整至0.3。每100毫升总悬浮液体积加入100毫升直径为0.1-0.25mm的玻璃珠(Fisher科学公司，Dusseldorf，德国)后，在5000rpm破碎细胞12分钟。通过冰冷却防止破碎过程中的升温。除去玻璃珠后用Beckman(Fullerton，USA)的L8-70M离心机和Ti45转子在4℃、235000g超离心90分钟。上清用作纯化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的粗提物。所有纯化步骤均用Beckman(Fullerton，USA)的Biosys2000系统进行。
粗提物加至含有Fractogel EMD DEAE-650(S)材料(Merck，Darmstadt)的XK50/30柱(Pharmacia，Freiburg，德国)，总柱床体积是500毫升。柱先用含30mM MgCl2和0.75mM DTT的50mMTRIS-HCl pH7.5平衡。加入粗提物后，柱用含144mM KCl的相同缓冲液洗涤。洗脱在95分钟内用144mM-320mM的KCl线性梯度进行。合并活性组分并用Varifuge 3.0R离心机(Heraeus，Hanau，德国)在1500g和4℃在centriprep30浓缩仪(Amicon，Beverly，USA)中浓缩。用含30mM MgCl2和0.75mM DTT的50mM TRIS-HCl pH7.5稀释调整KCl的浓度为40mM。之后将部分纯化的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶加至XK26/20柱(Pharmacia，Freiburg，德国)，该柱用65mlRed-Sepharose CL6B(Pharmacia，Freiburg，德国)填充。柱用含30mMMgCl2和0.75mM DTT的50mM TRIS-HCl pH7.5平衡。洗脱在590分钟内用0-800mM的KCl线性梯度以0.87ml/min的流速进行。
合并活性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组分后，以如上所述相同方式将KCl浓度降至10mM。之后将溶液加至含20ml 2′5′-ADP-seDharose基质(Pharmacia，Freiburg，德国)的XK16/20柱(Pharmacia，Freiburg，德国)。该柱与Red-Sepharose CL6B柱一样用相同缓冲液平衡。洗脱通过0-2mM NADP线性梯度进行。合并活性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组分并加至凝胶过滤柱。
使用直径1.6cm、柱床体积114ml的Superdex G200pg柱(Pharmacia，Freiburg，德国)进行凝胶过滤，洗脱经含30mM MgCl2、200mM KCl和0.75mM DTT的50mM TRIS-HCl pH7.5以1ml/min的流速进行。合并活性组分并在centriprep30浓缩仪(Amicon，Beverly，USA)中超滤。向纯化的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中加入50％(v/v)甘油后将其在-20℃储存。
在整个纯化过程中测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性和蛋白质浓度。
确定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定系统含有50mM TRIS-HCl pH7.5，10mM MgCl2，1mM NADP和200mM谷氨酸钾。反应通过加入4mM葡萄糖-6-磷酸起始，通过在30℃测定340nm处的吸收值的增加跟踪NADPH的形成。蛋白质浓度在考马斯亮蓝染色(Stoscheck，酶学方法182，50-68(1990))后分光光度法测定，使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。所有测量均用UV-160A光度计(Shimadzu，Kyoto，Japan)进行。
通过Laemmli(Laemmli，U.K.，自然227，680-685(1970))的变性不连续SDS凝胶电泳测试葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的纯度。用2′5′-ADP sepharose配体亲和材料进行第三个纯化步骤后，可获得分子量为ca.60kDa和30kDa的两种不同蛋白质。这两个蛋白质不能用凝胶过滤层析分离。这一制备物的比活性经测定为213U/mg蛋白质。
3.N-末端测序
根据Edman(Edman and Begg，欧洲生物化学杂志)的程序用Procise蛋白质测序系统(Applied Biosystems，Foster City，USA)进行纯化的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的N-末端测序。
对于60kDa蛋白质，获得如下N-末端序列：Xaa Xaa Xaa XaaXaa Pro Xaa Xaa Trp Xaa Asn Pro Leu Arg Asp，其也示于SEQ IDNO：11。
对于30kDa蛋白质，获得如下N-末端序列：Met Ile Phe Xaa LeuPro Asp Xaa Xaa Xaa Gin Gln Ile Ser Lys，其也示于SEQ ID NO：12。
实施例6将zwf和opcA基因克隆进pGEM-T载体
用PCR扩增含有谷氨酸棒杆菌ATCC13032的完整zwf和opcA基因和两侧的上游和下游区的DNA片段。用从SEQ ID NO：1和SEQID NO：6设计的寡核苷酸引物进行PCR反应。根据Heery和Dunican(应用和环境微生物学59：791-799(1993))所述从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离基因组DNA并用作模板。所用引物为：
zwf正向引物：5′AGA ATC AGC ACG CTG CAT CAG 3′
opcA反向引物：5′AGT ATG GTG CGC GTA CTA 3′
PCR参数如下：
35个循环
95℃3分钟
94℃1分钟
47℃1分钟
72℃45秒
2.5mM MgCl2
约150-200ng DNA模板。
获得的PCR产物克隆进购自Promega公司的市售pGEM-T载体(pGEM-T Easy Vector System 1，目录号A1360，Promega UK，Southampton)，用大肠杆菌JM109(Yanisch-Perron等，基因33：103-119(1985))作为宿主。
实施例7  穿梭载体pEC-T18mob2的制备
根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。
该载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per(US-A5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))的复制区rep，质粒pAG1的赋予四环素抗性的tetA(Z)基因(US-A5,158,891；国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)基因文库登录号AF121000)，质粒pMB1(Sutcliffe，定量生物学冷泉港研讨会43，77-90(1979))的复制起点oriV，包括lac启动子和多克隆位点(mcs)的lacZα基因片段(Norrander等，基因26，101-106(1983))，以及质粒RP4(Simon等，(1983)生物/技术1：784-791)的mob区。
将构建的载体转化进大肠杆菌菌株DH5 α(Hanahan，DNA克隆实用方案，第I卷，IRL出版社，Oxford，华盛顿特区，美国)。通过将转化混合物在补加5mg/l四环素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)上铺板而选择携带质粒的细胞。用来自Qiagen的QIAprep SpinMiniprep试剂盒从转化子分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制随后琼脂糖凝胶电泳(0.8％)证实。
质粒命名为pEC-T18mob2并如图2所示。其以大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2的形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 13244。
实施例8葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在谷氨酸棒杆菌中的表达
随后以SphI/SalI片段从含zwf和opcA基因的pGEM T-载体(见实施例6)中分离完整的zwf和opcA基因，并克隆进大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2(见实施例7和图2)的lacZαSphI/SalI位点。这一穿梭载体含有两个SphI位点，第一个位于lacZo的多克隆位点内，第二个位于赋予四环素抗性的基因内。因此用四环素(Sigma-Aldrich，PO Box 2424，Wimbome，Dorset BH21 7YR，UK)作为选择压力，因为仅有那些含完整四环素抗性基因的克隆能生长。这一新的构建体命名为pECzwfopcA(图3)。用SacI(宝灵格曼海姆有限公司，德国)限制酶分析揭示zwf和opcA基因在pEC-T1 8mob2的lacZo基因中的正确方向，即在lac启动子的下游。用这一构建体转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032(美国典型培养物保藏中心，Manasa，VA，USA)，在补加1mM异丙基硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，0.02％5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃半乳糖苷(XGAL)和5mg/l四环素的Luria琼脂上选择电转化子。琼脂平板在30℃保温48小时。如O′Gara和Dunican所述(应用和环境微生物学61：4477-4479(1995))快速制备质粒，SacI限制证实所需克隆的存在。其中一个克隆命名为ATCC13032/pECzwfopcA。
实施例9  制备具有扩增的opcA基因的氨基酸生产菌
L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌DSM5715的描述见EP-B-0435132，L-苏氨酸生产菌株黄色短杆菌DSM5399的描述见EP-B-0385940。两个菌株均根据布达佩斯条约在德意志微生物保藏中心保藏。
根据Liebl等(FEMS微生物学通信53：299-303(1989))所述电穿孔方法，用质粒pECzwfopcA(实施例8)转化菌株DSM5715和DSM5399。在补加5mg/l四环素的LBHIS琼脂上进行转化子的选择，LBHIS琼脂包含18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl和18g/l Bacto-琼脂。在33℃保温2天。
以此方式获得的菌株称为DSM5715/pECzwfopcA和DSM5399/pECzwfopcA。
实施例10生产L-苏氨酸
实施例9中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5399/pECzwfopcA在适于生产苏氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的苏氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有四环素(5mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII：
NaCl                    2.5g/l
Bacto-肽胨              10g/l
Bacto-酵母膏            10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v)
pH调至pH7.4。
向培养基中加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。培养基MM：
CSL(玉米浆)          5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)   20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l
(NH4)2SO4            25g/l
KH2PO4               0.1g/l
MgSO4·7H2O          1.0g/l
CaCl2·2H2O          10mg/l
FeSO4·7H2O          10mg/l
MnSO4·H2O           5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)     0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)   0.1g/l
CaCO3    25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10rnl体积进行培养，加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
24小时后，用Biomek(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的苏氨酸量。
所得结果示于表1。
表1
 菌株     OD     L-苏氨酸g/L
 DSM5399     12.3     0.74
 DSM5399/pECzwfopcA     9.9     1.0
实施例11生产L-赖氨酸
实施例9中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pECzwfopcA在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有四环素(5mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10mi培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII：
NaCl          2.5g/l
Bacto-肽胨    10g/l
Bacto-酵母膏            10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)    2％(w/v)
pH调至pH7.4。
向培养基中加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。培养基MM：
CSL(玉米浆)             5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)      20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)    50g/l
(NH4)2SO4                25g/l
KH2PO4                  0.1g/l
MgSO4·7H2O             1.0g/l
CaCl2·2H2O             10mg/l
FeSO4·7H2O             10mg/l
MnSO4·H2O              5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)        0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)   0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)      0.1g/l
CaCO3                   25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
所得结果示于表2。
表2
 菌株     OD   L-苏氨酸g/L
 DSM5715     10.8   16.0
 DSM5715/pECzwfopcA     8.1   17.1
PCT                                             990213BT
原始表格(为递交)-2000年7月3日02:19:24PM打印
  0-10-1-1   PCT/RO/134(EASY)表关于保藏微生物或其他生物材料的说明(PCT细则13之二)使用如右栏程序制备 PCT-EASY版本2.90(2000年3月8日更新)
  0-2   国际申请号
  0-3   申请人或代理人文档号   990213 BT
  11-11-2   如下说明涉及的保藏微生物或其他生物材料见说明书页行 1824-30
  1-31-3-11-3-21-3-31-3-4   保藏事项保藏单位名称保藏单位地址保藏日期保藏编号 德意志微生物保藏中心德国不伦瑞克2000年1月26日DSMZ 13264
  1-4   补充说明   无
  1-5   本说明是为下列指定国作的   所有指定国
  1-6   单独提供说明下列说明将随后向国际局提供   无
  由受理局填写
  0-4   本页已经和国际申请一起收到(是或否)   是
  0-4-1   受权官员
                                            由国际局填写
  0-5   国际局收到本页日期
  0-5-1   受权官员
序列表
<110>国立爱尔兰大学，戈尔韦
    德古萨-于尔斯股份公司
    于利希研究中心有限公司
<120>编码opcA基因的核苷酸序列
<130>990213 BT
<140>
<141>
<160>12
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>6995
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<220>
<221>CDS
<222>(3658)..(5202)
<223>zwf
<220>
<221>CDS
<222>(5217)..(6173)
<223>opcA
<400>1
cacatttgaa ccacagttgg ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg 60
acgggtcaga ttaagcaaag actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca 120
attaacctaa gtcgtagatc tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc 180
ccggtttaac ccaggaagga ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca 240
ctgtacgcaa ttacccctct gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc 300
gtgtcctcgc tgcagacgct gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga 360
gcctggctcc ccttgcatac accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca 420
ccaactgggc aggccgtgac cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt 480
acatccagct ttacttgggt ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca 540
cctgggattc cttgacccca ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca 600
ccactggccc tcttggccag ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc 660
gtgagcgtgg cctattcgac ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca 720
tctacgtcat tgcttctgat ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca 780
tcgctggcac ccagcagctg ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca 840
tcgaagacaa cactgagatc gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg 900
gctggcagac cattgaggtt gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg  960
ctgaggctaa gaaggacacc aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct  1020
tcccagctcc aactatgatg aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg  1080
aggttgcagc aaccaagact gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg  1140
atgaggttat cgctcacacc cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat  1200
ggcaggtcaa gttcgatgag tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc  1260
gcctgaactc ccgtgagctt ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag  1320
atgagaaggg cgtcgcaact cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga  1380
cccttcctga gctgtggggc ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca  1440
agggctcccc ttccttcggc cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt  1500
acggccgtaa cctgcacttc ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca  1560
tttccctcca cggtggcacc cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca  1620
tgcgtcctgc agttcgtctt gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc  1680
acgactccat cggtctgggc gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg  1740
cactgcgcgc catcccaggt ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc  1800
aggcttgggc tgcagcactt gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc  1860
agaacgttcc tgttctggaa ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg  1920
gctacgtcct ggttgagggt tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct  1980
ccgaggttca gcttgcagtt aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc  2040
gcgttgtttc cgttccttgc atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt  2100
ccgttctgcc tgcagctgtg accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt  2160
ggtaccgctt cttgggcacc cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg  2220
cggattacca gaccctgttt gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg  2280
ccaaggactc cattaacggt taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat  2340
gattctccgg aattttattg ccccgggttg ttgttgttaa tcggtacaaa gggtcttaag  2400
cacatccctt acttgcctgc tctccttgag cacagttcaa gaacaattct tttaaggaaa  2460
atttagtttc atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga  2520
cgacctctcc cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc  2580
tgtagtcggt gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc  2640
ctacgacgct cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta  2700
cgccatgagc atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc  2760
ctccaacggc tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgctgaccg  2820
cgacgcaacc ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat 2880
gatcaagatc cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg 2940
catcagcgtt aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc 3000
gttcatcgag ggcatcaagc aggctgctgc aaacggccac gacgtctcca agatccactc 3060
tgtggcttcc ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat 3120
cggatccgat gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc 3180
ttacgctgtg tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca 3240
gcgcccactg tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt 3300
ttccgagctg gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt 3360
tctggagcag ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc 3420
tgtgttctcc cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga 3480
gaccgagggt gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc 3540
tcgcctgaag tagaatcagc acgctgcatc agtaacggcg acatgaaatc gaattagttc 3600
gatcttatgt ggccgttaca catctttcat taaagaaagg atcgtgacac taccatc    3657
gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac   3705
Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp
  1               5                  10                  15
ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg    3753
Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val
             20                  25                  30
atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc    3801
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
         35                  40                  45
att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg    3849
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
     50                  55                  60
gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac    3897
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
 65                  70                  75                  80
gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat    3945
Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn
                 85                  90                  95
gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt    3993
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
            100                 105                 110
gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc    4041
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile
        115                 120                 125
gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att    4089
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile
    130                 135                 140
cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc    4137
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly
145                 150                 155                 160
atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag    4185
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys
                165                 170                 175
cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc    4233
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val
            180                 185                 190
aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg    4281
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu
        195                 200                 205
ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag    4329
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln
    210                 215                 220
ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac csc gtc cag atc    4377
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile
225                 230                 235                 240
acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac    4425
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
                245                 250                 255
ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc    4473
Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu
            260                 265                 270
ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag    4521
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln
        275                 280                 285
ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac    4569
Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
    290                 295                 300
cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag    4617
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln
305                 310                 315                 320
ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct    4665
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
                325                 330                 335
gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct    4713
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser
            340                 345                 350
cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt    4761
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
        355                 360                 365
ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac    4809
Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
    370                 375                 380
cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc    4857
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile
385                 390                 395                 400
gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc    4905
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser
                405                 410                 415
aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc    4953
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
            420                 425                 430
tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc    5001
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
        435                 440                 445
ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac    5049
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn
    450                 455                 460
gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca    5097
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala
465                 470                 475                 480
tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt    5145
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly
                485                 490                 495
cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc    5193
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
        500                 505                 510
agg cca taa ttt aggggca aaaa atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc    5243
Arg Pro                      Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr
        515                                  520
acc cag caa att tcc aag acc cta act cga ctg cgt gaa tcg ggc acc    5291
Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr
525                 530                 535                 540
cag gtc acc acc ggc cga gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc    5339
Gln Val Thr Thr Gly Arg Val Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser
                545                 550                 555
gaa agc gat gtc gct gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc    5387
Glu Ser Asp Val Ala Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg
            560                 565                 570
gag cac cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca    5435
Glu His Pro Ser Arg Val Ile Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala
        575                 580                 585
gaa aac aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac gct ggt gct    5483
Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala
    590                 595                 600
tcc gag atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc gct gac aag ctc    5531
Ser Glu MetIle  Ile Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu
605                 610                 615                 620
cag tat gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct    5579
Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala
                625                 630                 635
tgg tgg cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga    5627
Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly
            640                 645                 650
cgc atc gca caa cga cgc atc act gat gct ttg tac gac cgt gat gac    5675
Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp
        655                 660                 665
gca cta gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc gac atg    5723
Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met
670                 675                 680
acg tgg gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg    5771
Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu
685                 690                 695                 700
gat cac cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca    5819
Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala
                705                 710                 715
agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg    5867
Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg
            720                 725                 730
ctg aaa gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca    5915
Leu Lys Val Pro Val Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro
        735                 740                 745
acc gat gag ttt ggt act cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc    5963
Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile
    750                 755                 760
gtt cgc acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc tat gac gct cat acc    6011
Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr
765                 770                 775                 780
ctt cag gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct    6059
Leu Gln Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala
                785                 790                 795
att ggt cgt cga agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac    6107
Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His
            800                 805                 810
atg gat cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc    6155
Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser
        815                 820                 825
gtc aag ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttgatgt    6203
Val Lys Leu Glu Thr Val
    830
agtacgcgca cgcgatactg aagatttggt tgcacaggct gcctccaaat tcattgaggt  6263
tgttgaagca gcaactgcca ataatggcac cgcacaggta gtgctcaccg gtggtggcgc  6323
cggcatcaag ttgctggaaa agctcagcgt tgatgcggct gaccttgcct gggatcgcat  6383
tcatgtgttc ttcggcgatg agcgcaatgt ccctgtcagt gattctgagt ccaatgaggg  6443
ccaggctcgt gaggcactgt tgtccaaggt ttctatccct gaagccaaca ttcacggata  6503
tggtctcggc gacgtagatc ttgcagaggc agcccgcgct tacgaagctg tgttggatga  6563
attcgcacca aacggctttg atcttcacct gctcggcatg ggtggcgaag gccatatcaa  6623
ctccctgttc cctcacaccg atgcagtcaa ggaatcctcc gcaaaggtca tcgcggtgtt  6683
tgattcccct aagcctcctt cagagcgtgc aactctaacc cttcctgcgg ttcactccgc  6743
aaagcgcgtg tggttgctgg tttctggtgc ggagaaggct gaggcagctg cggcgatcgt  6803
caacggtgag cctgctgttg agtggcctgc tgctggagct accggatctg aggaaacggt  6863
attgttcttg gctgatgatg ctgcaggaaa tctctaagca gcgccagctc taacaagaag  6923
ctttaacaag aagctctaac gaaaagcact aacaaactaa tccgggtgcg aaccttcatc  6983
tgaatcgatg ga                                                      6995
<210>2
<211>514
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400>2
Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp
  1               5                  10                  15
Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val
             20                  25                  30
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
         35                  40                  45
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
     50                  55                  60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu TrP Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
 65                  70                  75                  80
Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu phe Arg Glu Asn
                 85                  90                  95
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
            100                 105                 110
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile
        115                 120                 125
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile
    130                 135                 140
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly
145                 150                 155                 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys
                165                 170                 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val
            180                 185                 190
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His TyrLeu
        195                 200                 205
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln
    210                 215                 220
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile
225                 230                 235                 240
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
                245                 250                 255
Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu
            260                 265                 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln
        275                 280                 285
Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
    290                 295                 300
Prc Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln
305                 310                 315                 320
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
                325                 330                 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser
            340                 345                 350
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
        355                 360                 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
    370                 375                 380
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg  Phe Gly Ser
                405                 410                  415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
            420                 425                 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
        435                 440                 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn
    450                 455                 460
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala
465                 470                 475                 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly
                485                 490                 495
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
            500                 505                 510
Arg Pro
<210>3
<211>319
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400>3
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
  1               5                  10                  15
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
             20                  25                  30
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
         35                  40                  45
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
     50                  55                  60
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
 65                  70                  75                  80
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
                 85                  90                  95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>4
<211>960
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(957)
<223>opcA
<400>4
atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc acc cag caa att tcc aag acc    48
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
  1               5                  10                  15
cta act cga ctg cgt gaa tcg ggc acc cag gtc acc acc ggc cga gtg     96
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
             20                  25                  30
ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc gaa agc gat gtc gct gca gtt    l44
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
         35                  40                  45
acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc gag cac cca tct cgc gtg atc    192
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
     50                  55                  60
att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac aaa gtt gac gca gaa    240
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
 65                  70                  75                  80
gtc cgt atc ggt ggc gac gct ggt gct tcc gag atg atc atc atg cat    288
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
                 85                  90                  95
ctc aac gga cct gtc gct gac aag ctc cag tat gtc gtc aca cca ctg    336
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
            100                 105                 110
ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg cca ggt gaa tca cca    384
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc gca caa cga cgc atc    432
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
act gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca cta gaa gat cgt gtt gag    480
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
aac tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg gcg cgc ctt acc cag    528
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
            165                  170                  175
tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac cca cca cac agc gaa    576
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc agt acc tcg gtg gat    624
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc cgc    672
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca    720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc    768
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa    816
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct att ggt cgt cga agt gag tcc    864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac    912
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa    960
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>5
<211>319
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC1 3032
<400>5
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
  1               5                  10                  15
LeuThr Arg Leu Arg Glu  SeI Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
            20                  25                  30
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
         35                  40                  45
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
     50                  55                  60
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
 65                  70                  75                  80
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met IleIle Met His
                 85                  90                  95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
            l00                 105                 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        l15                 l20                 125
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro HiS  Ser Glu
            180                 185                 190
Ile  Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
         195                 200                 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met  Pro Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>6
<211>3038
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌AS019
<220>
<221>CDS
<222>(115)..(1 659)
<223>zwf
<220>
<221>CDS
<222>(1672)..(2628)
<223>opcA
<400>6
cctgaagtag aatcagcacg ctgcatcagt aacggcgaca tgaaatcgaa ttagttcgat  60
cttatgtggc cgttacacat ctttcattaa agaaaggatc gtgacactac cate gtg    117
                                                            Val
                                                              1
agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac ccg    165
Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp Pro
              5                  10                  15
cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg atc    213
Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val Ile
         20                  25                  30
ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att    261
Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile
     35                  40                  45
tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta    309
Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val
 50                  55                  60                  65
ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta    357
Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val
                 70                  75                  80
cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt    405
Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val
             85                  90                  95
tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat    453
Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp
        100                 105                 110
gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac    501
Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp
    115                 120                 125
aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca    549
Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro
130                 135                 140                 145
cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg    597
Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met
                150                 155                 160
gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct    645
Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro
            165                 170                 175
ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac    693
Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn
        180                 185                 190
gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc    741
Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly
    195                 200                 205
aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg    789
Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu
210                 215                 220                 225
ttt gag cca ctg tgg aac tcc aec tac gtt gac cac gtc cag atc acc    837
Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr
                230                 235                 240
atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc     885
Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly
            245                 250                 255
atc ggc gca ccg cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg     933
Ile Gly Ala Pro Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu
        260                 265                 270
gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg gca cgg     981
Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Ala Arg
    275                 280                 285
cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca    1029
Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro
290                 295                 300                 305
ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc    1077
Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly
                310                 315                 320
tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag    1125
Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu
            325                 330                 335
tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt    1173
Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg
        340                 345                 350
cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt    1221
Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly
    355                 360                 365
cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag    1269
Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln
370                 375                 380                 385
cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg    1317
Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val
                390                 395                 400
att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag    1365
Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys
            405                 410                 415
gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc    1413
Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser
        420                 425                 430
tac tca gaa tcc ttc act gsa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctc    1461
Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu
    435                 440                 445
att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag    1509
Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu
450                 455                 460                 465
gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg    1557
Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp
                470                 475                 480
gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca    1605
Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro
            485                 490                 495
aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg    1653
Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg
        500                 505                 510
cca taa tttaggggca aa atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc acc cag  1704
Pro                   Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln
    515                 520                 525
caa att tcc aag acc cta act cga ctg cgt gaa tcg ggc acc cag gtc    1752
Gln Ile Ser Lys Thr Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val
            530                 535                 540
acc acc ggc cga gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc gaa agc    1800
Thr Thr Gly Arg Val Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser
        545                 550                 555
gat gtc gct gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc gag cac    1848
Asp Val Ala Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His
    560                 565                 570
cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac    1896
Pro Ser Arg Val Ile Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn
575                 580                 585                 590
aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac gct ggt gct tcc gag    1944
Lys Val Asp Ala Glu Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu
                595                 600                 605
atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc gct gac aag ctc cag tat    1992
Met Ile Ile Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr
            610                 615                 620
gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg    2040
Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp
        625                 630                 635
cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc    2088
Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile
    640                 645                 650
gca caa cga cgc atc act gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca cta    2136
Ala Gln Arg Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu
655                 660                 665                 670
gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg    2184
Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asg Met Thr Trp
                675                 680                 685
gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac    2232
Ala Arg Leu Thr Gln Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His
            690                 695                 700
cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc    2280
Pro Pro His Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly
        705                 710                 715
agt acc tcg gtg gat ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa    2328
Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys
    720                 725                 730
gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca acc gat    2376
Val Pro Val Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp
735                 740                 745                 750
gag ttt ggt act cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc    2424
Glu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg
                755                 760                 765
acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag    2472
Thr Thr Gly Ser Ile Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln
            770                 775                 780
gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct att ggt    2520
Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly
        785                 790                 795
cgt cga agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat    2568
Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp
    800                 805                 810
cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag    2616
Pro Asp Leu Gly Tyr Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys
815                 820                 825                 830
ctg gaa acc gtc taaggagaaa  tacaacacta tggttgatgt agtacgcgca       2668
Leu Glu Thr Val
cgcatactga agatttggtt gcacaggctg cctccaaatt cattgaggtt gttgaagcag  2728
caactgccaa taatggcacc gcacaggtag tgctcaccgg tggtggcgcc ggcatcaagt  2788
tgctggaaaa gctcagcgtt gatgcggctg accttgcctg ggatcgcatt catgtgttct  2848
tcggcgatga gcgcaatgtc cctgtcagtg attctgagtc caatgagggc caggctcgtg  2908
aggcactgtt gtccaaggtt tctatccctg aagccaacat tcacggatat ggtctcggcg  2968
acgtagatct tgcagaggca gcccgcgctt acgaagctgt gttggatgaa ttcgcaccaa  3028
acggctttga                                                         3038
<210>7
<211>514
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌AS019
<400>7
Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp
  1               5                  10                  15
Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val
             20                  25                  30
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
         35                  40                  45
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
     50                  55                  60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
 65                  70                  75                  80
Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn
                 85                  90                  95
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
            100                 105                 110
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile
        115                 120                 125
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile
    130                 135                 140
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly
145                 150                 155                 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys
                165                 170                 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val
            180                 185                 190
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu
        195                 200                 205
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln
    210                 215                 220
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile
225                 230                 235                 240
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
                245                 250                 255
Gly Ile Gly Ala Pro Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu
            260                 265                 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Ala
        275                 280                 285
Arg Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
    290                 295                 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln
305                 310                 315                 320
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
                325                 330                 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser
            340                 345                 350
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
        355                 360                 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
    370                 375                 380
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile
385                 390                 395                 400
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser
                405                 410                 415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
            420                 425                 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
        435                 440                 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn
    450                 455                 460
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala
465                 470                 475                 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly
                485                 490                 495
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
            500                 505                 510
Arg Pro
<210>8
<211>319
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌AS019
<400>8
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
  1               5                  10                  15
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
             20                  25                  30
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
         35                  40                  45
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
     50                  55                  60
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
 65                  70                  75                  80
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
                 85                  90                  95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu  Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>9
<211>960
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌AS019
<220>
atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc agt acc tcg gtg gat    624
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc cgc    672
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
gag gtg acs gat gct ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca    720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc    768
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa    816
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
tcc ggc aat gcc cea tcg ctg gtg gct att ggt cgt cga agt gag tcc    864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac    912
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa    960
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>10
<211>319
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌AS019
<400>10
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr
  1               5                  10                  15
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val
             20                  25                  30
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
         35                  40                  45
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
     50                  55                  60
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
 65                  70                  75                  80
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
                 85                  90                  95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu
            100                 105                 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
        115                 120                 125
Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145                 150                 155                 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln
                165                 170                 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
            180                 185                 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
        195                 200                 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
    210                 215                 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
                245                 250                 255
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu
            260                 265                 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
        275                 280                 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
    290                 295                 300
Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305                 310                 315
<210>11
<211>15
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400>11
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa  Pro  Xaa Xaa Trp Xaa Asn Pro Leu Arg Asp
  1               5                    10                  15
<210>12
<211>15
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032
<400>12
Met  Ile Phe Xaa Leu Pro Asp Xaa Xaa Xaa Gln Gln Ile Ser Lys
  1                5                  10                  15

Claims (15)

1、一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其编码由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽，其中所述多肽是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶OpcA亚基。
2、权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多肽的N-末端由SEQID NO：12的氨基酸序列组成。
3、权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ IDNO：4的核苷酸序列组成。
4、权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
5、分离的多核苷酸，其由与权利要求1或2的多核苷酸完全互补的核苷酸序列组成。
6、一种载体，其包含权利要求1-5任一项的多核苷酸。
7、权利要求1的分离的多核苷酸，其序列是SEQ ID NO：4的简并序列。
8、通过导入权利要求1-5任一项的多核苷酸或权利要求6的载体而转化的棒状细菌。
9、权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述棒状细菌是棒杆菌属。
10、权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述棒状细菌是谷氨酸棒杆菌种。
11、制备L-氨基酸的方法，其包括进行如下的步骤：
a)发酵权利要求8的棒状细菌，
b)浓缩培养基或细菌细胞中的所需产物，及
c)分离所需的L-氨基酸。
12、权利要求11的方法，其中戊糖磷酸循环的额外一或多个基因是过表达的。
13、权利要求12的方法，其中为实现过表达，通过用携带这些基因的质粒载体转化所述棒状细菌而增加基因的拷贝数。
14、权利要求11的方法，其中发酵这样的棒状细菌制备赖氨酸，所述棒状细菌中选自如下一组的一或多个基因同时过表达：
14.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
14.2编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因，
14.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
14.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
14.5编码酮基转移酶的tkt基因，
14.6编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，
14.7编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因，
14.8 zwal基因，
14.9编码烯醇化酶的eno基因，
14.10编码转醛酶的tal基因，
14.11 zwf基因。
15、权利要求11的方法，其中发酵这样的棒状细菌制备L-赖氨酸，所述棒状细菌中选自如下一组的一或多个基因同时弱化：
15.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，
15.2编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，
15.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，或
15.4 zwa2基因。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2238773T3 (es) * 1997-10-04 2005-09-01 Degussa Ag Procedimiento para la produccion microbiana de aminoacidos de las familias del aspartato y/o glutamato, y agentes utilizables en el procedimiento.
US7270984B1 (en) 1999-06-25 2007-09-18 Basf Aktiengesellschaft Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum
US6822084B1 (en) * 1999-06-25 2004-11-23 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding stress, resistance and tolerance proteins
US20060014259A9 (en) * 1999-07-09 2006-01-19 Kevin Burke Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
US6797509B1 (en) * 1999-07-09 2004-09-28 Degussa-Huls Ag Nucleotide sequences which code for the tal gene
US6713289B2 (en) 1999-10-05 2004-03-30 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the eno gene
DE19947791A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen
MXPA01011643A (es) * 2000-03-20 2003-02-27 Degussa Proceso para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con amplificacion del gen gnd.
US20050112733A1 (en) * 2000-03-20 2005-05-26 Degussa Ag Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
WO2001098472A1 (fr) * 2000-06-21 2001-12-27 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Nouvelle glucose-6-phosphate deshydrogenase
US20030017554A1 (en) * 2000-11-15 2003-01-23 Mechthild Rieping Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
DE10154180A1 (de) 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag gene die für genetische Stabilitäts-, genexpressions-und Faltungsproteine codieren
DE10155505A1 (de) * 2001-11-13 2003-05-22 Basf Ag Gene die für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Proteine codieren
DE10210527A1 (de) 2002-03-09 2003-09-18 Degussa Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien
US20070092951A1 (en) 2005-03-24 2007-04-26 Degussa Ag Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria
DE102005023829A1 (de) 2005-05-24 2006-11-30 Degussa Ag Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
CN102482649B (zh) * 2009-06-23 2014-09-03 江南大学 立体专一性羰基还原酶
CN104845923B (zh) * 2014-02-14 2018-03-23 中国科学院微生物研究所 生产l‑组氨酸的方法及其专用重组菌
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11370746B2 (en) 2018-03-23 2022-06-28 Cj Cheiljedang Corporation Granules comprising L-amino acid and method for preparing the same
WO2020051420A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Archer Daniels Midland Company Engineered strains of corynebacteria
CN116254242B (zh) * 2022-12-21 2024-01-30 江南大学 一种atp磷酸核苷转移酶突变体及产l-组氨酸的谷氨酸棒杆菌

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0924661A (ja) * 1995-07-11 1997-01-28 Ricoh Co Ltd デジタル複写機のネットワークシステム

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07121227B2 (ja) * 1986-10-17 1995-12-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JPH09224661A (ja) * 1996-02-23 1997-09-02 Mitsubishi Chem Corp グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ
WO2001000844A2 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production
US6962989B1 (en) * 1999-07-08 2005-11-08 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding novel proteins
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0924661A (ja) * 1995-07-11 1997-01-28 Ricoh Co Ltd デジタル複写機のネットワークシステム

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